CN1461309A - 抑制性pas结构域蛋白(ipas)以及与血管形成和肿瘤进程有关的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种哺乳动物多肽指定的抑制性PAS结构域蛋白(IPAS)，该多肽可以用于抑制血管形成和/或肿瘤进程。本发明也涉及可能用于与血管形成或肿瘤进程有关的医疗条件处理中所用药剂中化合物的筛选方法。

Description

抑制性PAS结构域蛋白(IPAS)以及 与血管形成和肿瘤进程有关的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种哺乳动物多肽指定的抑制性PAS结构域蛋白(IPAS)，该多肽可以用于抑制血管形成和/或肿瘤进程。本发明也涉及可能用于与血管形成或肿瘤进程有关的医疗条件处理中所用药剂中化合物的筛选方法。
背景技术
在脊椎动物细胞线粒体中，氧作为终端电子受体，起着重要的生物学作用。在进化过程中，这些细胞已建立了检测氧浓度变化的方法，而且在这一过程中，获得了对低氧(hypoxia)如血管形成、红细胞发生和糖酵解作用等的生理适应性响应所涉及的基因表达进行有条件地调整的能力。这些基因包括血管内皮生长因子、促红细胞生成素、几种糖酵解酶以及氧化氮诱导合成酶，而且已经证实所有这些都含有低氧应答元件(hypoxia responsive elements，HREs)(请参阅Guillemin和Krasnow(1997)，Cell 89，9-12；Wenger和Gassmann(1997)，Biol.Chem.378，609-616)。在低氧条件下，这些应答元件可被异源双体络合物识别，该异源双体络合物包括低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和Arnt(芳烃受体细胞核易位蛋白)(Wang等人(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，5510-5514；Gradin等人(1996)，Mol.Cell.Biol.16，5221-5231)。这两类转录因子属于正在快速增长的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)PAS蛋白的家族(PAS是指Per，Arnt和Slim)。
一族螺旋-环-螺旋蛋白指定的Id已被认证为bHLH转录调节子的拮抗物。通常在异源双体结构中，bHLH蛋白与调节序列结合在一起，并起到活化与分化作用相关的基因表达的功能。异源双体通常包括一类A bHLH蛋白与一类B bHLH蛋白。通常，当存在过量的Id蛋白时，A bHLH类蛋白可通过与Id蛋白的异源二聚化而被滴定出来。
HIF-1α的调节不良或者过度活动，可能会引起一系列的病理条件，包括肿瘤进程15，16，7和炎性血管形成17。所以，有必要鉴定出那些可以作为HIF-1α负调节剂(negative regulator)的化合物，这些化合物有可能用于与血管形成和肿瘤进程有关的医疗条件。
附图说明
图1是老鼠的IPAS序列和表达，其中：
(a)是推论出的老鼠IPAS的氨基酸序列，而且示出了碱性螺旋-环-螺旋结构域、PAS A结构域和PAS B结构域；
(b)是IPAS和低氧诱导因子的结构特征的图示，而且在bHLH和PAS图形中示出了每一蛋白与IPAS的百分数特性，其中bHLH是指碱性螺旋-环-螺旋，PAS是指Per/Arnt/Sim，N-或C-TAD是指终端转活化(transactivation)结构域；
(c)是成年老鼠组织中IPAS表达的RNA印迹(Northern blot)分析；用32P-标记的IPAS cDNA探针与来自成年老鼠的各种组织的Poly(A)+RNA(4.5微克)进行杂交，RNA标记的位置示于右边，单位为千碱基(kb)；
(d)-(o)为原位杂交分析；用mIPAS(反义d，e，h，I，l和m)或mHIF-1α(f，g，j，k，n和o)的反义RNA探针对成年老鼠的角膜(d-g)、视网膜(h-k)和小脑(l-o)的片段进行杂交，图中可以见到亮色区域(d，f，h，j，l和n)和暗色区域(e，g，I，k，m和o)，图中C表示角膜，Ep表示上皮细胞，S表示黑质(substantia)propria，LE表示晶体(lens)上皮细胞，GC表示颗粒细胞层，INL表示内核层，R&C表示棒状和锥状，G表示颗粒层，P表示浦肯雅细胞(Purkinje cell)，M表示分子层。
图2所示的IPAS是低氧诱导因子的显性负调节子(negativeregulator)，其中：
(a)表示IPAS并没有转活化HRE驱动的报道基因。用HRE-荧光素酶报道基因共转染增加量的IPAS表达载体(CMV IPAS)，使其进入赫拉细胞株(HeLa cells)，该细胞株或者在正常氧(21％O2)条件下或者在低氧(1％O2)条件下，培养24小时，测定细胞荧光素酶表达；
(b)和(c)中，IPAS抑制了低氧诱导因子中介的基因表达；IPAS表达载体、HRE荧光素酶报道子以及HIF-1α(b)或HLF(c)表达载体(分别为CMV HIF-1α或CMV HLF)被引入赫拉细胞株中；在正常氧(21％O2)条件下或者在低氧(1％O2)条件下培养24小时后，测定荧光素酶的活性；所得结果用诱导倍数来表示，该结果是与只用报道子基因转染的细胞株中荧光素酶的活性进行比较而得；图中显示的为平均值±SD；
(d)中IPAS并不影响HIF-1α和HLF蛋白质；赫拉细胞株用FLAG标记的IPAS表达质粒(1.0微克/21.5cm2碟)转染，并暴露在低氧条件下6小时。取所有的细胞提取物(50微克)，用HIF-1α(Novus)、HLF(Novus)和FLAG抗原决定部位(Sigma)的抗体，基本上按前面所述(参考文献6)，进行免疫印迹分析。
图3中显示了IPAS专一地弱化了低氧诱导mRNAs的表达，其中：
(a)中示出了在IPAS过度表达的细胞株中低氧诱导基因表达被削弱。将野生型(Hepa1c1c7)或IPAS稳定转染(Hepa IPAS)的老鼠肝癌细胞系，或者在正常氧条件(N)下，或者在低氧条件(H)下，培养24小时；分离出来自细胞的Poly(A)+RNA，并用放射性标记的老鼠IPAS、PGK1、VEGF和β-肌动蛋白cDNA探针进行杂交；
(b)中显示了在转录水平上低氧诱导基因表达被IPAS所抑制；采用或者不采用HIF-1α表达载体，将HRE荧光素酶报道子转染引入Hepa1c1c7或Hepa IPAS细胞中；所得的细胞或者在21％O2浓度下，或者在1％O2浓度下，进行培养，然后进行荧光素酶测定；将只单独用报道子基因转染的Hepa1c1c7细胞中的荧光素酶的含量作为对照，实验结果显示为与对照组进行比较所得的诱导倍数；
(c)中显示了IPAS抑制了HIF-1α/Arnt复合物与HRE的结合；正常氧或低氧条件所得的Hepa1c1c7和Hepa IPAS细胞的细胞核提取物，按EMS A法，用32P-标记的HRE寡核甘酸探针进行分析；图中星号表示在细胞核提取物中，组成型HRE-结合活性的位置；箭头表示低氧诱导HIF-1α/Arnt-DNA复合物的位置12；图中也示出了未标记的HRE(S)或不相关的序列(NS)的竞争性检定，以及抗HIF-1α抗体和抗Arnt抗体的超转变(supershift)形成；
(d)中显示IPAS并没有影响二恶英(dioxin)诱导的基因表达。采用或者不采用TCDD(10nM)处理Hepa1c1c7和Hepa IPAS细胞24小时，并将来自上述细胞的poly(A)+RNA用32P-标记的老鼠CY1A1、IPAS和β-肌动蛋白cDNA探针进行杂交；
(e)中IPAS对于TCDD中介的XRE-报道子基因表达没有影响。Hepa1c1c7和Hepa IPAS细胞用XRE-报道子质粒进行转染，并在采用或者不采用TCDD培养24小时后，检测荧光素酶的活性；用与不含配体的Hepa1c1c7细胞对照组进行比较，而将所得结果表征为荧光素酶活性的诱导倍数，图中所示为平均值±SD。
图4是IPAS定向(target)HIF-1α，形成非功能性的复合物，其中：
(a)中IPAS与HIF-1α发生物理相互作用。将体外翻译的GST-IPAS或GST与35S-标记的、体外翻译的Arnt或HIF-1α进行混合，并用抗GST抗体进行免疫沉淀。沉淀物(precipitant)先用SDS-PAGE、随后用放射自显影术进行分离；图中也示出了输入Arnt和HIF-1α的10％，以作为加载对照；
(b)中显示，HIF-1α的N-终端结构对于与IPAS的异源二聚化是必需的。将35S-标记的、体外翻译的IPAS，用HIF-1α各种片段的GAL4融合体进行培养，然后或者用抗GAL4抗体，或者用预免疫(preimmune)控制血清，进行免疫沉淀；沉淀下来的成分用SDSPAGE进行分析，由自放射显影术得到分析结果；图中，用输入IPAS的10％作为对照；
(c)和(d)中显示了体内IPAS和HIF-1α之间的相互作用。用图中所示的各种数量的GAL4-HIF-1α/1-330和VP16-IPAS(c)或者GAL4-IPAS和VP16-Arnt(d)的表达载体，与GAL4-驱动的报道基因一起，使COS7细胞转染。经24小时的培养后，测定细胞的荧光素酶活性，其结果通过与只用报道子基因转染的细胞中荧光素酶的含量进行比较而显示为诱导倍数(fold induction)；
(e)中显示出IPAS/HIF-1α异源双体未能结合到HRE上。将图中所示的体外翻译的IPAS、HIF-1α和Arnt的各种组合，或者非程序性的网织红细胞的溶胞产物，与32P-标记的HRE寡核苷酸探针混合，并用EMSA监视蛋白质-DNA复合物的形成。所得结果用自放射显影术予以可视化。
图5中显示了IPAS参与了抑制角膜上皮细胞中血管生成因子的产生，图中：
将老鼠角膜上皮细胞的初级培养物，或者用反义IPAS表达质粒，或者用空白载体(vector)，进行转染，并在正常氧(N，21％O2)条件下，或者在低氧(H，1％O2)条件下，培养24小时。将上述细胞中的所有RNA予以抽提，用放射标记的老鼠VEGF cDNA探针进行RNA印迹分析。来自正常氧和低氧条件的Hepa1c1c7细胞的全部RNA作为VEGF诱导的参比。图中也示出了18S RNA的大小，以作为加载参照。
发明内容
本发明提供了一种模型，在该模型中，活化的HIF-1α被小的蛋白因子如IPAS进行负调节，形成非功能性的异源双体复合物。HIF-1α的这种调节模式可能有助于原位低氧信号的细调，正如在角膜VEGF生产中IPAS所显示的深刻的负影响。另一方面，IPAS的异位表达可能会压制低氧诱导的VEGF表达，并且到目前的试验为止，IPAS的负影响对于低氧信号来说是选择性的。因而，可以假定IPAS能够用作医疗各种血管疾病的药物设计中的靶(target)，如心血管损伤、中风以及糖尿病微脉管疾病等。
因而，一方面，本发明提供了一种选自如下的、离体的或独立的(isolated)核酸分子：
(a)含有SEQ ID NO：2中所述核苷酸序列的核酸分子；
(b)含有在严格的杂交条件下能够进行杂交的核苷酸序列的核酸
分子，所述核苷酸序列能够杂交到与(a)中所述核酸分子的多
肽编码区域互补的核苷酸序列上，并能对生物活性的哺乳动
物的IPAS多肽或其具有等同功能的修饰形式进行编码；以及
(c)含有如下所述核酸序列的核酸分子，所述核酸序列能够作为
遗传密码退化为(a)或(b)中所述的核苷酸序列，并能对生物活
性的哺乳动物的IPAS多肽或其具有等同功能的修饰形式进
行编码。
本发明的核酸分子包括cDNA、化学合成的DNA、PCR分离的DNA、基因组DNA及其组合。基因组DNA可以用本领域熟知的方法、用此处所述的IPAS cDNA筛选基因组文库而得到。本发明也包括由DNA转录而来的RNA。
术语“严格的杂交条件”(stringent hybridization condition)在本领域中从标准手册中是已知的(例如Ausubel等，supra)，并可以理解为从杂交到过滤是DNA在65℃下0.5M NaHPO4、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM EDTA中进行，并在68℃下用0.1Xssc/0.1％SDS洗涤。
在本发明优选的实施方式中，所述的核酸分子具有与序列表中SEQ ID NO：2相同的核苷酸序列。然而，本发明的核酸分子并非严格限制为SEQ ID NO：2所示的序列。相反，本发明也包括带有某些修饰如置换、小的缺失、插入或翻转等的核酸分子，然而这些核酸分子仍能对基本上具有本发明IPAS多肽生化活性的蛋白质进行编码。因而，本发明包括如此的核酸分子，其核苷酸序列至少有90％、优选至少有95％与序列表SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列相同。
本发明还包括这样的核酸分子，其核苷酸序列由于基因密码而退化为SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。三个核苷酸的序贯组，即密码子，为一个氨基酸编码。由于有64个可能的密码子，而只有20种天然氨基酸，所以大多数氨基酸是被多于一种的密码子编码。基因密码的这种天然的简并性(degeneracy)或重复性(redundancy)，是本领域所熟知的。因此，可以理解，序列表中所示的核苷酸序列，只是能够对IPAS多肽进行编码的、一个较大的但有限的序列组中的一个例子而已。
另一方面，本发明提供了一种被上述核酸分子所编码的、离体的或独立的、哺乳动物IPAS多肽。在优选的方式中，所说的多肽具有序列表SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列。然而，本发明的多肽并非严格限制为具有与序列表SEQ ID NO：3中完全相同氨基酸序列的多肽。相反，本发明也包括带有某些修饰如置换、小的缺失、插入或翻转等的多肽，然而这些多肽仍基本上具有本发明IPAS多肽的生化活性。因而，本发明包括如此的多肽，其氨基酸序列至少有90％、优选至少有95％与序列表SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列相同。
再一方面，本发明提供了一种包含上述核酸序列的载体。此处，术语“载体”是指任何外源性DNA的载体，其可用于将所述的DNA转移至宿主细胞，以使该宿主细胞对该外源性DNA进行复制和/或适当地表达。所说的载体可以是可复制的表达载体，其载有并能中介本发明的核酸序列的表达。此处，术语“可复制的”是指该载体在给定类型的宿主细胞中，能被复制到其被引入的宿主细胞中。载体的实例有病毒如噬菌体、黏粒(cosmid)、质粒和其他的重组载体。核酸分子按本领域熟知的方法插入到载体基因组中。
本发明还包括荷载有本发明载体的、培养后的宿主细胞。这样的宿主细胞可以是原核细胞、单细胞的真核细胞或者源自多细胞有机体的细胞。所以，宿主细胞可以是细菌细胞如E.coli细胞、来自酵母菌的细胞如Saccharomyces cervisiae或Pichia pastoris、或者哺乳动物细胞。将载体引入宿主细胞方法是标准方法，其对于熟悉重组DNA方法的技术人员是熟知的。本发明也包括制备哺乳动物IPAS多肽的方法，其包括将所说的宿主细胞在制备所说的多肽的条件下进行培养，并回收所说的多肽。
本发明的另一重要方面是，本发明提供了鉴定药剂(agent)的筛选方法，该药剂可用于激活哺乳动物IPAS核酸分子的表达，所说的方法包括下列步骤：
(i)将侯选药剂与本发明的哺乳动物IPAS核苷酸分子接触，或者与哺乳动物IPAS多肽接触；以及
(ii)确定所说的侯选药剂是否能激活所说的哺乳动物IPAS核酸分子的表达，或者是否能刺激所说的多肽的生物活性。
根据本发明，为了进行筛选，可在IPAS基因的控制下，用具有报道基因的载体使合适的宿主细胞进行转化。报道基因的表达可在具有已知活性的药剂(即标准药剂)或者具有假定活性的药剂(即试验药剂或侯选药剂)的存在或不存在的情况下，进行测试。将试验药剂的存在下报道基因表达的变化，与标准药剂存在下所带来的变化进行比较。这样，可以鉴定出活性的药剂，并确定出其在本测试中的相对活性。
此处，术语“报道基因”是指能对基因产物进行编码的基因，该基因产物可用简单、便宜的方法或试剂予以鉴定，并可操作地连接到IPAS序列上。在本发明的筛选试验中，报道基因如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白质报道基因，可以用于测定转录活性(例如，可参阅Goeddel(ed.)，Methods Enzymol.，Vol.185，SanDiego：Academic Press，Inc.(1990)；也可参阅Sambrook，同上)。
此处，术语“药剂”是指生物物质或化学物质，如简单或复杂的有机分子、肽、蛋白质或寡核苷酸。按照本发明方法所鉴定出来的这样的药剂，可能用于抑制血管形成和/或肿瘤生长的制剂鉴定、开发和生产，包括用于与局部缺血的心血管损伤有关的血管形成疾病、中风或糖尿病微脉管疾病。
因而，本发明也提供了一种处理血管疾病或肿瘤生长的方法，包括将上述方法所鉴定出来的、有效量的药剂提供给接受者。术语“处理”是指对哺乳动物疾病的任何处理，包括：(i)防止疾病，即使得疾病的临床特征不再发展；(ii)抑制疾病，即使得临床特征的发展休止；和/或(iii)减轻疾病，即使得临床特征减退。术语“有效量”是指药剂量足以为所处理的疾病提供处理。这种有效量随病人、疾病和处理方法而变化。试验方法
在本说明书中，当术语“标准协议”和“标准方法”用于分子生物技术中时，应理解为在常规实验室手册中所记载的协议和方法，如《分子生物学的现代方法》，F.Ausubel等编，John Wiley and Sons，Inc.1994，或者Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约1989。质粒构建
将来自pT7T3D IPAS的EcoRI-NotI片段(GenBank Acc：AA028416)插入EcoRI-NotI消化的pcDNA3质粒(Invitrogen)，制得pcDNA3 IPAS。PCMV IPAS或pFLAG IPAS在pCMV4或pCMVFLAG质粒的相应位上分别含有HindIII-XbaI或BamHI-XbaI片段6。关于HRE荧光素酶、XRE荧光素酶和pCMV HIF-1α的描述请参阅别处12，20。PBluescript mHLF是Y.Fujii-Kuriyama博士的礼物，并被用于构建pCMV mHLF。为了构建pGST，一个用于体外翻译GST融合蛋白、GST cDNA和pgex-4T-3(Amersham Pharmacia Biotech)的多重克隆位的质粒，被PCR和BglII和HindIII连接子所放大，并被亚克隆为pSP72载体(Promega)的BglII-HindIII位。通过将PCR克隆的IPAS cDNA与BamHI和XhoI连接子插入到BamHI-XhoI消化的pGST，制得pGST IPAS。GAL4 HIF-1α/1-826，1-330，1-652，526-826已在前面有所描述6。为了构建pCMX GAL4-IPAS或pCMX VP-16IPAS，pcDNA3 IPAS的EcoRI-XbaI片段或BamHI-XbaI片段分别插入到pCMX GAL4的EcoRI-NheI位或pCMX VP16的BamHI-NheI位。PCMX VP16-Arnt是I.Pongratz的礼物。为了制备反义IPAS表达质粒，全长度的IPAS cDNA与EcoRI-BamHI连接子以翻转的方向插入到pcDNA3质粒的BamHI-EcoRI。细胞培养和转染
Hepa1c1c7、HeLa和COS7细胞来自ATCC。Hepa IPAS细胞是通过用pEFIRESpuro IPAS稳定转染Hepa1clc7、并用嘌呤霉素(5微克/毫升)选择而制得。在28cm2的培养板中，用脂质转染的方法进行瞬时转染。在荧光素酶的试验中，0.5微克的报道子质粒和标明量的表达质粒被转染。细胞低氧或TCDD处理如前所述12。RNA印迹分析和原位杂交分析
来自8周大的C57B16老鼠各种组织的Poly(A+)RNAs(4.5微克)或Hepalclc7和Hepa IPAS细胞，用硫氰酸胍盐的方法制备，并接着进行寡dT-微球纯化(Dynal)；用mIPAS(nt 623-897)、mPGK1(nt426-771)、mVEGF3(nt 24-466)、mCYP1A1(nt 874-1199)和β-肌动蛋白(nt 930-1075)的32P-标记的cDNA探针进行RNA印迹分析。将来自老鼠角膜上皮细胞初级培养物或Hepa1c1c7细胞的全部RNA(20微克)全部分离出来，并用放射标记的mVEGF3 cDNA(nt 24-466)探针进行探测。如前所述21，用35S-标记的mIPAS或mHIF-1α反义RNA探针，对来自8周大小C57B16老鼠的组织切片进行原位杂交。电泳淌度位移分析
如前所述12，制备正常氧条件下或低氧条件下细胞的细胞核提取物。在缓冲液中，用32P-标记的HRE寡核苷酸，对10毫克的细胞核提取物进行培养，所述的缓冲液在10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 7.5)、60mM KCl、50mM NaCl、1mM MgCl2、1mM EDTA、5mM二硫苏糖醇(DTT)、5％甘油中含有0.1微克超声波降解的、变性的小牛胸腺DNA。体外翻译的蛋白质的各种组合(每个5微升)与HRE探针在溶液中进行混合，所述溶液含有10mM Hepes、100mM KCl、0.1mM EDTA、3mM MgCl2、4mM亚精胺、0.5mM二硫苏糖醇(DTT)、10％甘油、20ng/μl tRNA、1ng/μl鲑鱼精液DNA。所得蛋白质-DNA复合物在4％聚丙烯酰胺凝胶上、于0.5X TBE缓冲液(1XTBE；89mM三羟甲基氨基甲烷、89mM硼酸、5mM EDTA)。体外蛋白质相互作用分析
在兔子网织红细胞的溶胞产物(Promega)中，在存在或不存在35S-标记的蛋氨酸下，通过翻译，制备GST-融合的IPAS或HIF-1α各种片段的GAL4-融合。以加入的35S-标记的蛋氨酸为基准，测定GST-IPAS或GAL4-HIF-1α的蛋白质浓度。在室温下，用GST-IPAS或GAL4-HIF-1α培养等量的、35S-标记的、体外翻译的Arnt、HIF-1α或IPAS一个小时；随后，在室温下，用抗GST抗体(AmershamPharmacia Biotech)或抗GAL4抗体(Upstate Biotechnology)接合蛋白质A琼脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)，培养另外一个小时。经短暂的离心分离后，用SDS-PAGE对免疫共沉淀的蛋白质进行分析。老鼠角膜上皮细胞的分离
6周大小的健康C57B16/J老鼠用致命量的CO2杀死。摘除其眼睛，其角膜组织在补充有10％小牛血清的DME介质中，在立体显微镜下进行切片。角膜组织在无菌条件下切成小片，并用DMEM冲洗两次。该组织体置于涂敷有明胶的组织培养板上，在含10％小牛血清并补充有3ng/ml人类重组FGF-β的DMEM中进行培养。在5％CO2中培养8天后，成长至几乎汇合的角膜上皮细胞被胰蛋白酶化(trypsinized)。然后将单独的细胞悬浮液种植于21.5cm2的培养蝶上，细胞在前述同样的条件下成长。
实施例
               实施例1：IPAS序列的鉴定
从对应于选定数目的bHLH/PAS因子的PAS结构域的核苷酸序列中，利用HMMER1，8，3软件19，设计隐藏的马可夫模型(MarkovModel)轮廓。对GenBank( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的老鼠EST 数据库进行筛选，鉴定出含有bHLH(碱性螺旋-环-螺旋)PAS模体的、460bp的EST无性系(GenBank Acc：AA028416；SEQ ID NO：1)。
DNA序列分析表明，IPAS cDNA(SEQ ID NO：2)含有921核苷酸的开放阅读码框，可对307氨基酸的多肽进行编码(图1a；SEQ IDNO：3)。预测的多肽是指定的IPAS(抑制性PAS结构域蛋白)。
将该氨基酸序列与已知的bHLH PAS因子进行比对分析，表明其与N-终端的bHLH结构域中的HIF-1α4和HLF5具有较高的相似性(分别为75％和76％的相同度；见图1b)。明显地，IPAS缺少相当于HIF-1α和HLF的C-终端区域的序列，而在该序列中已经鉴别出两个转活化结构域(NTAD和CTAD)。
实施例2：在眼睛中IPAS mRNA被主要地表达
来自一系列老鼠组织的Poly(A+)RNA的RNA印迹分析表明，在眼睛中IPAS mRNA被主要地表达，在小脑和大脑中表达较少，而在其它检测的老鼠组织中没有明显地表达，这表明IPAS mRNA的表达是一种非常受组织限制的表达模式(见图1c)。
实施例3：在角膜的上皮细胞层中观察到IPAS的表达
为了表征IPAS基因在眼睛和小脑中的空间表达模式，进行原位杂交。在角膜的上皮细胞层中观察到大量的IPAS表达(见图1d和图1e)，而在神经节细胞、内核细胞和视网膜的棒状与锥形的细胞层中，表达较少(图1h和1i)。
在角膜的上皮细胞中，通过原位杂交检测到较低的HIF-1αmRNA表达(图1f和1g)，表明在这些细胞中，IPAS的表达明显地超过HIF-1α的表达。在观测到IPAS表达的相同视网膜层中，也观测到HIF-1α的表达(图1j和1k)。在小脑中，IPAS的表达被限制在Purkinje细胞层(图1l和1m)，而HIF-1α在其切片中没有显示任何局部的表达(图1j和1k)。在大脑的某些区域中，相对于背景，IPAS和HIF-1αmRNA均只观察到弱的发散信号(数据没有示出)。
 实施例4：在赫拉细胞中IPAS的辅表达
                降低了低氧诱导报道基因的表达
IPAS与低氧诱导转录因子的结构相似性，以及在老鼠角膜中IPAS和HIF-1α的共区域化(colocalization)，提示我们研究在低氧细胞响应的转录控制中IPAS的作用。在赫拉细胞株(HeLacells)中，在存在或者不存在瞬间表达的IPAS的情况下，我们用低氧响应元件(HRE)驱动的荧光素酶报道基因进行瞬间的转染实验。在低氧(1％O2)条件下，对上述细胞进行培养，诱发了报道基因4.2倍的活化，表明了内源性低氧诱导因子的诱导转活化功能(图2a)。IPAS的辅表达(coexpression)降低了赫拉细胞中低氧诱导报道基因，而以低氧依赖的方式将荧光素酶的表达刺激到较高水平(分别见图2b和c)，这表明对于内源性低氧诱导因子的功能而言，IPAS起着显性付调节子的作用。IPAS对于HIF-1α和HLF的低氧诱导蛋白质稳定化没有任何作用(图2d)，而在现有技术中已经证实这一点是HIF-1α和HLF功能活化的重要步骤6，7，8。所以，在低氧诱导转录因子中介的信号转导作用(signal transduction)中，IPAS似乎抑制了更多的下游步骤。
实施例5：IPAS中介低氧诱导报道基因表达的向下调节，
         即IPAS削弱了HIF-1α和HRE之间的相互作用
为了进一步研究在低氧细胞中，IPAS在调节HIF中介的信号时的作用，我们通过老鼠肝细胞瘤Hepa1c1c7细胞的稳定转染，来制备可稳定地过度表达IPAS的细胞。通过RNA印迹分析，证实了在稳定转染的细胞中IPAS mRNA的表达，而Hepa1c1c7母细胞没有显示出任何可检测的内源性IPAS表达(图3a)。在低氧条件下培养的野生型Hepa1c1c7细胞，显示出mRNA编码磷酸甘油酯激酶1(PGK1)和血管内皮生长因子(VEGF)明显增加的表达(图3a)，二者在许多细胞系中9，10已经显示出可在低氧条件下被诱导。作为对低氧条件的响应，Hepa IPAS细胞显示出这些基因诱导水平的降低(在PGK1和VEGF活化中分别降低45％和48％；见图3a)。IPAS中介的低氧诱导基因表达的向下调节，似乎是在转录水平上，因为瞬间转染的、HRE所驱动的报道子基因的低氧活化，在Hepa IPAS细胞中明显地比在野生型细胞中低(图3b)。在Hepa IPAS细胞中，在HIF-1α的瞬间过度表达后，报道子基因的活化被进一步抑制，表明IPAS削弱了HIF-1α和HRE之间的生产性相互作用。
实施例6：IPAS削弱了HIF-1α/Arnt复合物的DNA结合活性
按Gradin等人12所述进行淌度位移分析。不论是在正常氧还是低氧条件下的Hepa IPAS细胞的细胞核提取物中，HIF-1α/Arnt异源双体复合物的HRE专一的DNA结合活性，均比相应的野生型细胞的细胞核提取物低(图3c)。
实施例7：IPAS的负调节对于HIF中介的信号具有选择性
我们检测了IPAS的负调节对于HIF中介的信号是否具有选择性。在应答生物异源化学物质时，芳烃受体(AhR)可以传达基因调整，而且它也是bHLH/PAS转录因子家族中的一员，与HIF-1α共同享有双聚化作用的参与因子Arnt11。用2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)培养野生型的Hepa1c1c7，主要诱导AhR靶基因细胞色素P-4501A1(CYP1A1)的mRNA表达。与低氧诱导基因表达相反，在Hepa IPAS细胞中，TCDD诱导的CYP1A1 mRNA表达不受干扰，这表明其诱导响应与在野生型细胞中所观察到的类似(图3d)。与这些数据相一致的是，不论是在野生型还是在IPAS过度表达的Hepa细胞中，均观察到生物异源物质应答元件(XRE)所驱动的报道子基因非常近似水平的活化12(图3e)，该活化与配体刺激的AhR/Arnt异源双体复合物有关。总之，IPAS似乎优先地定向HIF-1α而起到低氧诱导基因表达的显性负调节子的作用。
实施例8：IPAS的抑制作用被与HIF-1α的直接相互作用所中介
本实施例是测试IPAS的抑制作用是否被与HIF-1α或Arnt的直接相互作用所中介。辐射标记的、体外翻译的HIF-1α或Arnt与谷胱苷肽S-转移酶-(GST-)IPAS融合蛋白进行培养，并用抗GST抗体(Amersham Pharmacia Biotech)进行免疫沉淀分析。GST-IPAS与HIF-1α共沉淀，但不与Arnt共沉淀，表明在IPAS与HIF-1α之间存在专一的物理相互作用。
实施例9：HIF-1α的N-终端部分决定了与IPAS的物理相互作用
为了证实HIF-1α的结构域对于与IPAS的相互作用是必需的，我们培养了各种融合到GAL4最小DNA结合域上的HIF-1α片段(见Kallio等人，参考文献18)，并对体外翻译所产生的IPAS进行放射标记，然后对该物质用抗GAL-4抗体进行免疫沉淀(UpstateBiotechnology)。GAL4-HIF-1α/1-826(全长度)、/1-330以及/1-652均能明显地与IPAS共沉淀，而GAL4-HIF-1α/526-826和GAL4 DBD则不能。总之，HIF-1α的N-终端结构主要包括bHLH/PAS模体，其决定了与IPAS之间的物理相互作用(图4b)。作为对这些观察的支持，使用GAL4-HIF-1α/1-330和VP16-IPAS的哺乳动物双杂交实验，也表明了在这些细胞的IPAS和HIF-1α的N-终端结构之间也存在相互作用(图4c)。另一方面，与下拉实验(pull down assay)的结果类似，GAL4-IPAS和VP16-Arnt没有显示任何相互作用(图4d)。实施例10：IPAS抑制了HIF-1α/Arnt复合物的DNA结合活性
为了阐述IPAS/HIF-1α的功能，用HRE寡核苷酸探针和体外翻译的蛋白质进行电泳淌度位移分析。IPAS/HIF-1α异源双体，以及HIF-1α或IPAS自身，因结合到HRE上而变为无效。因而，在中介HRE控制下的基因表达时，IPAS/HIF-1α复合物似乎是惰性的。而且，HIF-1α/Arnt复合物的DNA结合活性被IPAS的存在所抑制，但不被控制翻译的产物所抑制(图4e)，表明IPAS/HIF-1α复合物可能在功能上支配HIF-1α/Arnt DNA结合复合物。
实施例11：反义IPAS引入到角膜细胞中刺激了
          VEGF基因的表达和其低氧诱导性
在角膜上皮细胞等细胞中，在低氧信号传递和大量表达时，IPAS显性的负调节功能的意义何在？正常角膜的特点是完全没有血管；保持透明对于角膜是至关重要的。通过过夜的眼睛闭合，角膜的环境可以做到足够低氧，以激发低氧诱导的基因表达13，14。然而，尽管还不明白其机理，但通常要防止形成新血管。
考虑到IPAS可以负调节低氧响应的VEGF表达，我们试图阐述IPAS对于角膜中低氧诱导的VEGF表达的作用。为此，用反义IPAS表达质粒(或空白对照载体)来转染角膜上皮细胞的初级培养物，以控制IPAS水平，并在低氧刺激下或没有低氧刺激下培养24小时，之后用RNA印迹分析监控VEGF mRNA的表达，并与肝癌细胞系进行对比。与现有技术相比10，12，经低氧处理后，肝癌细胞系显示出较高的VEGF诱导(图5)。与此形成强烈对照的是，用对照载体转染的角膜细胞，经低氧处理后，显示出较低的VEGF基础表达水平和其温和的诱导，这可能标志着角膜血管形成较少的机理。值得注意的是，在角膜细胞中导入反义IPAS，使得VEGF基因的基础表达和低氧诱导都得以恢复(图5)，表明IPAS可能在抑制角膜尤其是在低氧条件下血管形成的VEGF表达方面，有着重要的作用。
参考文献
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             80                  85                  90cgt cat ggt act cac cgc cga ggg aga cat ggc tta cct gtc gga aaa  339Arg His Gly Thr His Arg Arg Gly Arg His Gly Leu Pro Val Gly Lys
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 50                  55                      60Arg Met His Arg Leu Cys Ala Ala Gly Gly Lys Arg Gly Arg Ala Thr65                  70                      75              80Gly Arg Leu Leu Pro Glu Gly Pro Gly Gly Phe Arg His Gly Thr His
             85                      90              95Arg Arg Gly Arg His Gly Leu Pro Val Gly Lys Cys Gln Gln Ala Pro
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    115                     120             125Thr Pro Gly Thr Asn Phe Ser Leu Glu Leu Ile Gly His Ser Ile Phe
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            165                 170                 175His Phe Ser Leu Arg Met Lys Ser Thr Leu Thr Ser Arg Gly Arg Thr
        180                 185                 190Leu Asn Leu Lys Ala Ala Thr Trp Lys Val Leu His Cys Ser Gly His
    195                 200                 205Met Arg Ala Tyr Lys Pro Pro Ala Gln Thr Ser Pro Ala Gly Ser Pro
210                 215                 220Arg Ser Glu Pro Pro Leu Gln Cys Leu Val Leu Ile Cys Glu Ala Ile225                 230                 235                 240Pro Gln Leu Pro Phe His Asp Gly Ala Thr Leu Gly Leu Pro Gln Glu
            245                 250                 255Lys Thr Pro Ile Ser Thr Leu Phe Thr Pro Leu Trp Lys Ala Leu Leu
        260                 265                 270Cys Leu Val Lys Arg Trp Pro Val Gln Val Leu Gln Gly Lys Gly Thr
    275                 280                 285Glu Ser Ser Leu Pro Ser Trp Val Leu Trp Ala Leu Asn Arg Lys Asn
290                 295                 300Cys Pro Gly305

Claims (14)

1、一种选自如下的独立的核酸分子：
(a)包括序列表SEQ ID NO：2中所述的核苷酸序列的核酸分子；
(b)包括在严格的杂交条件下能够进行杂交的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列能够杂交到与(a)中所述核酸分子的多肽编码区域互补的核苷酸序列上，并能对生物活性的哺乳动物的IPAS多肽或其具有等同功能的修饰形式进行编码；以及
(c)包括如下所述核酸序列的核酸分子，该核酸序列能够作为遗传密码退化为(a)或(b)中所述的核苷酸序列，并能对生物活性的哺乳动物的IPAS多肽或其具有等同功能的修饰形式进行编码。
2、一种能被权利要求1所述的核酸分子编码的、独立的、哺乳动物的IPAS多肽。
3、如权利要求2所述的、独立的、哺乳动物的IPAS多肽，其具有序列表SEQ ID NO：3中所述的氨基酸序列。
4、含有权利要求1所述的核酸序列的载体。
5、一种可复制的表达载体，其载有并能够调节权利要求1所述核酸序列的表达。
6、一种包藏有如权利要求4或5所述载体的、培养的宿主细胞。
7、一种制备制备哺乳动物IPAS多肽的方法，包括将如权利要求6所说的宿主细胞在制备所述多肽的条件下进行培养，并回收所说的多肽。
8、一种鉴定用于激活哺乳动物IPAS核酸分子表达的药剂的方法，所说的方法包括下列步骤：
(i)将侯选药剂与权利要求1所述的哺乳动物IPAS核苷酸分子接触；以及
(ii)测定所说的侯选药剂是否能激活所说的哺乳动物IPAS核酸分子的表达。
9、一种鉴定用于抑制血管形成和/或肿瘤生长的药剂的方法，所说的方法包括下列步骤：
(i)将侯选药剂与权利要求1所述的哺乳动物IPAS核苷酸分子接触；以及
(ii)测定所说的侯选药剂是否能激活所说的哺乳动物IPAS核苷酸分子的表达，所说的激活作为药剂能否用于抑制血管形成和/或肿瘤生长的指示。
10、一种鉴定用于刺激哺乳动物IPAS多肽生物活性的药剂的方法，所说的方法包括下列步骤：
(i)将侯选药剂与权利要求2或3所述的哺乳动物IPAS多肽接触；以及
(ii)测定所说的侯选药剂是否能刺激所说的多肽的生物活性。
11、一种鉴定用于抑制血管形成和/或肿瘤生长的药剂的方法，所说的方法包括下列步骤：
(i)将侯选药剂与权利要求2或3所述的哺乳动物IPAS多肽接触；以及
(ii)测定所说的侯选药剂是否能刺激所说的多肽的生物活性，所说的刺激作为药剂能否用于与血管形成和/或肿瘤生长有关的医疗条件处理的指示。
12、利用如权利要求8-11之一所述方法鉴定出来的药剂在制备处理血管形成疾病或肿瘤生长的制剂方面的用途。
13、一种处理血管形成疾病或肿瘤生长的方法，包括使用按照权利要求8-11之一所述方法鉴定出来的药剂的有效量。
14、权利要求12或13所述方法的应用，其中所说的血管形成疾病与局部缺血心血管损伤、中风以及糖尿病微脉管疾病有关。
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