ES2318187T3 - Metodos y composiciones para dirigir proteinas a lisosomas secretores. - Google Patents
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Abstract
Entidad de fusión que dirige lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes que comprende: (a) un polipéptido que se localiza específicamente en los lisosomas secretores y es liberado con el contenido del gránulo en el medio extracelular tras la estimulación y degranulación de la célula y (b) un polipéptido marcador fluorescente.
Description
Métodos y composiciones para dirigir proteínas a
lisosomas secretores.
La presente invención hace referencia a métodos
y composiciones para dirigir proteínas a lisosomas secretores. La
presente invención da a conocer adicionalmente métodos a utilizar en
ensayos de cribado de fármacos, y métodos de purificación de
lisosomas secretores.
Los mastocitos son células secretoras
especializadas que liberan una serie de sustancias biológicamente
activas. Los mastocitos se hallaron residiendo en tejidos por todo
el organismo, particularmente en asociación con estructuras tales
como los vasos sanguíneos, nervios, y en proximidad a superficies en
contacto con el medio externo (ver Metcalfe y otros Physiol Rev.
77:1033-1079; 1997). La activación de los mastocitos
puede iniciarse al interaccionar un antígeno multivalente con su
anticuerpo IgE específico unido a la membrana celular a través de
su receptor de alta afinidad, Fc\varepsilonRI. Los mastocitos y
los basófilos juegan un papel central en las reacciones
inflamatorias y alérgicas (ver Williams y otros, J, Allergy Clin.
Immunol. 105:847-859, 2000). Es conocido que
liberan mediadores inflamatorios potentes tales como la histamina,
proteasas, factores quimiotácticos y metabolitos del ácido
araquidónico, que actúan sobre los vasos sanguíneos, el músculo
liso, el tejido conectivo, las glándulas mucosas y las células
inflamatorias.
Las vías para la biogénesis y exocitosis de los
gránulos de los mastocitos son todavía en gran parte desconocidas
(Griffiths G.M. y otros, Biochem Biophys Res Commun.
222(3):802-808, 1996; Masuda y otros, FEBS
Lett. 470:61-64, 2000; Baram, D. y otros, J.
Immunol. 167(7):4008-4016, 2001). Los
mastocitos contienen estructuras conocidas como lisosomas
secretores que son una mezcla de lisosomas y gránulos secretores
(Stinchcombe y Griffiths, J. Cell Biol.
146(1):1-6, 1999). El gránulo del mastocito
puede describirse como un lisosoma modificado, especializado para
fusionarse con la membrana plasmática y con otros gránulos
lisosomales tras la activación de un receptor. Aunque se hallan
lisosomas secretores similares en las células hematopoyéticas, los
conocimientos sobre los mecanismos por los cuales estas organelas
reciben y entregan su carga son escasos. Por ejemplo, Riesbeck y
otros (WO 98/42850) dan a conocer la focalización de proteínas de
los cuerpos de Weibel-Palade de la célula
endotelial. Los cuerpos de Weibel-Palade contienen
la molécula de adhesión P-selectina.
En los mastocitos y basófilos existen dos
categorías de mediadores inflamatorios, mediadores preformados y
mediadores de nueva formación. Los mediadores preformados,
almacenados en los gránulos citoplasmáticos de los mastocitos de
roedores o humanos, incluyen la histamina, proteoglicanos,
citoquinas, serine-proteasas, la carboxipeptidasa A
y pequeñas cantidades de sulfatasas y exoglicosidasas (Metcalfe y
otros, Physiol Rev. 77(4):1033-1079, 1997).
La histamina actúa sobre una serie de receptores (H1, H2, H3, H4) en
células y tejidos y es rápidamente metabolizada a nivel
extracelular. Los proteoglicanos pueden tener la función de
empaquetar la histamina y proteínas básicas en el interior de los
gránulos secretores, y en mastocitos humanos pueden estabilizar la
proteasa triptasa. Las proteasas neutras, las cuales explican la
mayor parte de la proteína del gránulo, sirven como marcadores de
los mastocitos. Los mediadores de nueva formación, habitualmente
ausentes en los mastocitos en reposo, están formados por
metabolitos del ácido araquidónico, principalmente el leucotrieno C
y la prostaglandina D. Estos mediadores se producen típicamente
durante la activación del receptor de IgE. En humanos, es de
particular interés la producción de factor de necrosis tumoral
(TNF), interleuquina (IL)-4, IL-5 e
IL-6.
Las proteasas son el principal constituyente
proteico de la exocitosis producida a partir de los mastocitos
activados (Huang y otros, J. Clin. Immunol.
18:169-183, 1998). Las triptasas, quimasas y
carboxipeptidasas son las tres principales familias de proteasas
almacenadas en los gránulos secretores de los mastocitos. Las
quimasas forman parte de la familia de las serine proteasas. Las
técnicas de localización inmunohistoquímica indican que sólo se
sintetizan en los mastocitos (Beil y otros, Histol Histopathol.
15(3):937-946, 2000). Las quimasas humanas,
de primates y canina generan angiotensina II (Ang II) a partir de
Ang I, mientras que las quimasas de ratón y rata degradan la Ang II
(Fukami y otros, Curr. Pharm, Des.
4(6):439-453, 1998). La quimasa también
degrada la matriz extracelular, y procesa la procolagenasa,
citoquinas inflamatorias y otros péptidos bioactivos. Como
resultado, la quimasa tiene funciones importantes en los tejidos
inflamados a través de sus actividades proteolíticas.
En células humanas, se han detectado genes que
codifican dos enzimas quimiotrípticas (quimasa y proteasa similar a
catepsina G) y una enzima carboxipeptidasa de mastocitos y al menos
dos genes que codifican péptidos triptasa. El gen que codifica la
quimasa está altamente relacionado con el gen que codifica la
catepsina G, una enzima aparentemente expresada en mastocitos, y
con los genes que codifican las granzimas. Los mastocitos mucosos
de tipo (MC) contienen triptasas, quimasa, proteasa similar a
catepsina G y carboxipeptidasa de mastocito. La función biológica
de las proteasas neutras de mastocitos, como la de los propios
mastocitos, no está totalmente aclarada. Por ejemplo, la activación
continua de mastocitos en el asma parece ser una característica de
esta enfermedad inflamatoria crónica.
En los mastocitos murinos se han dado a conocer
cinco quimasas (proteasa de mastocito murino
(MMCP)-1, -2, -3, -4 y -5), una carboxipeptidasa de
mastocito y dos triptasas (MMCP-6 y -7). En
roedores, la composición de proteasas de los distintos subgrupos de
mastocitos difiere. En ratas se ha hallado que dos isoformas de
quimasa, proteasa de mastocito de ratón (RMCP) I (Lagunoff y Pritzl
Arch. Biochem. Biophys. 173(2):554-563,
1976) y RMCP II (Kido y otros, Arch. Biochem. Biophys.
239(2):436-443, 1985) diferencian los
mastocitos de superficies mucosas (positivos para
RMCP-II) de otros mastocitos (positivos para
RMCP-I) (Gibson y Miller Immunology
58(1):101-104, 1986). Más recientemente, se
han aislado dos serine proteasas mediante amplificación PCR
("reacción en cadena de la polimerasa") a partir de mastocitos
de serosa de rata: la triptasa de rata (equivalente a la
MMCP-6) y una quimasa adicional denominada RMCP III
(Lutzelschwab y otros, J. Exp. Med.
185(1):13-29, 1997). Esta última proteasa es
el equivalente en rata de la MMCP-5 de ratón.
Los científicos han dado a conocer una proteína,
Rab37, que puede localizarse en la superficie de los gránulos de
los mastocitos cuando se fusiona con la proteína verde fluorescente
(GFP) y que se sobreexpresa en mastocitos derivados de médula ósea
(ver Masuda y otros FEBS Lett. 470:61-64, 2000).
Rab37 parece localizarse en la superficie citoplasmática de los
gránulos. Sin embargo, Masuda no muestra la utilización de Rab37
para dirigir los gránulos.
Hasta la presente invención, no se ha conocido
la utilización de una entidad de dirección para localizar proteínas
en los lisosomas secretores. El estado actual de la técnica utiliza
métodos indirectos para la detección del contenido del gránulo o la
actividad exocítica. Por ejemplo, se han estudiado los gránulos de
los mastocitos controlando su contenido con anticuerpos o midiendo
la actividad de enzimas tales como la hexosaminidasa (ver Schwartz
y otros, J. Immunol. 123:1445-1450, 1979; y
Dragonetti y otros J. Cell Sci. 113:3289-3298,
2000). Otros métodos indirectos hacen referencia a proteínas y sus
funciones en otros compartimentos secretores tales como el retículo
endoplasmático, el aparato de Golgi y la red
trans-Golgi (ver Donaldson y
Lippincott-Schwartz, Cell
101:693-696,2000). Por tanto, una entidad
focalizadora para localizar proteínas del núcleo interno de los
lisosomas secretores de los mastocitos es un avance significativo en
la investigación sobre mastocitos y en el descubrimiento de
fármacos.
Los métodos actuales que intentan cuantificar la
liberación de mediadores al producirse la degranulación de células
que contienen lisosomas secretores son largos y costosos (ver, por
ejemplo, Schwartz y otros, J. Immunol.
123:1445-1450, 1979 y Schulman y otros J. Immunol.
131:2936-2941, 1983). La presente invención supera
estos obstáculos de manera que no sólo se cuantifica el contenido
de los lisosomas secretores, sino que también se controla el
movimiento de lisosomas secretores en tiempo real.
Hasta la presente invención, no existían métodos
adecuados para realizar un cribado de alto rendimiento (HTS) para
cribar moduladores de los lisosomas secretores. El estado actual de
la técnica no permite el control directo de la degranulación
celular en el contexto de un HTS. Por ejemplo, Demo y otros
(Cytometry, 36(4):340-8, 1999) dan a conocer
ensayos que requieren diversas determinaciones bioquímicas y varias
etapas que consumen tiempo, energía y que presumiblemente poseen
una baja reproducibilidad debida a los reactivos utilizados
(histamina, triptasa, hexosaminidasa). Por ejemplo, es conocido que
la histamina tiene un reducido rango dinámico para cuantificación
en contexto de HTS. Se han usado otros métodos para controlar la
degranulación celular utilizando sondas fluorescentes tales como el
naranja de acridina (ver Love Histochemistry
62:221-225, 1979) pero estos ensayos carecen de
especificidad para el proceso de exocitosis y una relación
señal/ruido pobre. Un grupo ha dado a conocer una determinación
cuantitativa de la degranulación celular utilizando un ensayo de
unión de anexina-V mediante citometría de flujo
(ver Demo y otros Cytometry 36(4):340-8,
1999). Sin embargo, la citometría de flujo no es adecuada para el
formato HTS.
En la técnica actual se han dado a conocer
protocolos para obtener entidades enriquecidas subcelulares en
gránulos de mastocitos mediante fraccionamiento de homogeneizados
celulares en gradientes de Percoll o sacarosa (Lindmark y otros, J.
Leukocyte Biol. 66:634-643, 1994). De forma
ventajosa, la presente invención da a conocer métodos para
purificar lisosomas secretores con un grado de purificación superior
al que se consigue en la actualidad. El mayor grado de purificación
conseguido mediante la presente invención es crucial para los
estudios de proteómica dirigidos a la identificación de nuevas
dianas terapéuticas relacionadas con la activación celular.
Se han descrito mutantes sensibles al pH de la
proteína verde fluorescente (también denominados pHluorinas) como
medios para controlar la exocitosis y reciclaje de vesículas
secretoras en células nerviosas (Miesenböck, G. y otros, Nature
394:192-195, 1998). Cuando se unen a una proteína de
la membrana de la vesícula dichas pHluorinas se distribuyen entre
las vesículas secretoras y sinápticas.
Hallgren J. y otros (Biochemistry
39:13068-13077, 2000) han descrito una proteína de
fusión artificial que contiene la proteasa de mastocito murino 6
(mMCP-6) unida a través de una etiqueta 6xHis
N-terminal a un lugar enteroquinasa (EK) que
sustituye a su péptido de activación nativo. Esta triptasa de
mastocito murino se almacena de forma natural en los gránulos
secretores de los mastocitos formando complejos con proteoglicanos
heparina. Durante los procesos de inflamación alérgica, estos
complejos se liberan mediante la degranulación de mastocitos. Como
resultado de los estudios de Hallgren se ha hallado que esta
triptasa es activada de forma natural a través de una escisión
proteolítica por heparina en un pH ácido tras la exocitosis.
La presente invención hace referencia a métodos
para localizar lisosomas secretores en tiempo real dentro de una
célula utilizando una molécula focalizada. Dichos métodos son útiles
para diversos propósitos, incluyendo, sin limitación, el estudio
del movimiento y fusión de los lisosomas secretores, el control
directo de la exocitosis y el desarrollo de paneles celulares para
la activación celular y purificación de lisosomas secretores.
Con anterioridad a la presente invención, no
existían métodos directos para dirigir proteínas de lisosomas
secretores. Los lisosomas secretores de los mastocitos son organelas
especializadas que contienen proteasas, heparina, histamina y
diversas citoquinas. Anteriormente los lisosomas secretores han sido
estudiados mediante métodos indirectos, tales como el control de su
contenido con anticuerpos, o determinando la actividad de enzimas
tales como la hexosaminidasa.
La presente invención hace referencia a una
entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores de mastocitos,
basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células
caliciformes, que comprende: (a) un polipéptido que se localiza
específicamente en un lisosoma secretor y que es liberado con el
contenido del gránulo en el medio extracelular tras la estimulación
y degranulación de la célula y (b) un polipéptido marcador
fluorescente. La presente invención también hace referencia a una
entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores de mastocitos,
basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células
caliciformes, que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido que se localiza específicamente en un
lisosoma secretor y que es liberado con el contenido del gránulo en
el medio extracelular tras la estimulación y degranulación de la
célula y (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido marcador fluorescente.
La presente invención hace referencia
adicionalmente a una entidad de fusión que focaliza lisosomas
secretores, tal como se ha definido anteriormente, que comprende
una proteasa seleccionada del grupo formado por triptasas, quimasas
y carboxipeptidasas, preferentemente proteasa de mastocito murino 1,
-2, -3, -5, -6 y -7; proteasa de mastocito de rata I y proteasa de
mastocito de rata II; quimasas humanas; triptasas humanas; proteasa
similar a catepsina G; catepsina G; carboxipeptidasa A y
hexosaminidasa, más preferentemente proteasa de mastocito de rata
II según el nº de registro Gen Bank J02712.
La presente invención hace referencia
adicionalmente a una célula que comprende una entidad de fusión que
focaliza lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes de la presente
invención.
En una realización específica la molécula
fluorescente (polipéptido marcador fluorescente) es la proteína
verde fluorescente o la proteína roja fluorescente de Discosoma
sp. En una realización, la célula de la presente invención se
selecciona del grupo formado por: mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos y células caliciformes. En una
realización específica la célula es un mastocito.
En una realización particular, la presente
invención hace referencia a una línea celular que expresa una
entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores de mastocitos,
basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células
caliciformes, tal como se halla depositada en la American Type
Culture Collection ("Colección de cultivos tipo americana")
con el número de registro PTA-4571.
En una realización de la presente invención se
da a conocer un método para detectar y cuantificar la degranulación
que comprende: (a) incubar una célula que expresa una entidad de
fusión que focaliza lisosomas secretores de mastocitos, basófilos,
células hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes de
acuerdo con la presente invención en presencia de un activador
celular; (b) incubar la célula que expresa la entidad de fusión
localizadora de lisosomas secretores en ausencia del activador
celular; y (c) detectar y cuantificar la liberación de marcador en
el sobrenadante en presencia del activador celular en comparación
con la liberación de marcador en el sobrenadante en ausencia del
activador celular, en el que un incremento en la liberación de
marcador en el sobrenadante en presencia del activador celular
indica degranulación.
En otra realización de la presente invención se
da a conocer un método para detectar y cuantificar la inhibición de
la degranulación que comprende: (a) incubar una célula que expresa
una entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores de
mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o
células caliciformes de acuerdo con la presente invención, con una
célula o activador en presencia de una sustancia objeto de ensayo;
(b) incubar la célula que expresa la entidad de fusión de dirección
de lisosomas secretores con el activador celular en ausencia de la
sustancia objeto de ensayo; y (c) detectar y cuantificar un cambio
en la liberación de marcador en el sobrenadante en presencia de la
sustancia objeto de ensayo en comparación con la liberación de
marcador en el sobrenadante en ausencia de la sustancia objeto de
ensayo, en el que una disminución en la liberación de marcador en
el sobrenadante en presencia de la sustancia objeto de ensayo indica
inhibición de la degranulación.
En otra realización de la presente invención se
da a conocer un método para la detección y cuantificación de la
degranulación a nivel de la célula individual que comprende: (a)
incubar una célula que expresa una entidad de fusión que focaliza
lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes, de acuerdo con
la presente invención, en ausencia de un activador celular; (b)
detectar y cuantificar la cantidad de marcador en ausencia del
activador celular; (c) incubar la célula de la etapa (a) en
presencia de un activador celular; (d) detectar y cuantificar la
cantidad de marcador en presencia del activador celular; y (e)
detectar un cambio en la cantidad de marcador en la célula en
presencia del activador celular en comparación con la cantidad de
marcador en la célula en ausencia del activador celular, en el que
una disminución en la cantidad de marcador indica degranulación.
En otra realización de la presente invención se
da a conocer un método para detectar y cuantificar la degranulación
a nivel de la célula individual que comprende: (a) incubar una
célula que expresa una entidad de fusión que focaliza lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes, de acuerdo con la presente
invención, en presencia de un activador celular; (b) detectar y
cuantificar la cantidad de marcador en presencia del activador
celular; (c) incubar la célula de la etapa (a) en presencia de un
activador celular y una sustancia objeto de ensayo; (d) detectar y
cuantificar la cantidad de marcador en presencia del activador
celular y de la sustancia objeto de ensayo; y (e) comparar la
cantidad de marcador en la célula en presencia de la sustancia
objeto de ensayo con la cantidad de marcador en la célula en
ausencia de la sustancia objeto de ensayo, en el que un aumento en
la cantidad de marcador en presencia de la sustancia objeto de
ensayo indica degranulación.
Figura 1. Expresión estable de
RMCP-DsREd en células RBL-2H3. Las
células se transfectaron mediante electroporación con el vector
RMCP-DsRED ("DsRED", proteína roja fluorescente
de Discosoma sp.). A continuación las células se sometieron
a selección con Geneticin® (G-418, GIBCO Invitrogen
Corp., Carlsbad, CA) durante 10 días. La Figura 1 muestra el
análisis FACS ("clasificación de células activadas por
fluorescencia") de la población RBL-2H3 control
en comparación con el pool seleccionado de células que expresan
RMCP-DsRED.
Figura 2. Análisis FACS del clon
RBL-RMCP/2C2. Se generaron clones individuales a
partir del pool celular que expresaba RMCP-DsRED.
Esta Figura muestra el análisis FACS de las células
RBL-2H3 parentales en comparación con el clon
RBL-RMCP/2C2.
Figura 3. Expresión estable de la proteína
recombinante RMCP-DsRED en células
RBL-2H3. Se transfectaron de forma estable células
RBL-2H3 con un vector de expresión para la proteína
DsRED sola o para la proteína de fusión RMCP-DsRED.
Tras el proceso de selección, se analizaron los clones individuales
mediante microscopia confocal para determinar la distribución
subcelular de la proteína recombinante. A) Muestra la imagen
confocal de células que expresan la proteína DsRED y su expresión
citoplasmática. B) Muestra la imagen confocal de células que
expresan la proteína de fusión RMCP-DsRED. La
fluorescencia punteada se correlaciona con la localización de los
gránulos o lisosomas secretores en mastocitos o basófilos.
Figura 4. La construcción
RMCP-DsRED dirige los gránulos y lisosomas
secretores en células RBL 2H3. Se trataron con la sonda
LysoTracker® células que expresaban de forma estable la proteína de
fusión RMCP-DsRED. El panel de la izquierda muestra
la localización intracelular de los gránulos y lisosomas secretores
utilizando la sonda LysoTracker®. El panel central muestra la
distribución de la proteína de fusión RMCP-DsRED. La
superposición de las imágenes de LysoTracker® y
RMCP-DsRED (panel de la derecha) muestra la
colocalización de RMCP-DsRED con los compartimentos
de los gránulos y lisosomas secretores.
Figura 5. RMCP-DsRED se libera
tras la estimulación con IgE de las células RBL 2H3. Se estimularon
células RBL 2H3 que expresaban de forma estable la proteína
RMCP-DsRED (clon RBL-RMCP/2C2) con
IgE y antígeno (DNP-HSA). La hexosaminidasa y la
histamina son dos marcadores de gránulo que son liberados de las
células minutos después de la estimulación. La cuantificación de la
fluorescencia liberada tras la estimulación muestra una rápida
liberación de la proteína de fusión RMCP-DsRED
seguida de una fase más lenta de liberación 90 minutos después de
la estimulación.
Figura 6. Análisis mediante citometría de flujo
de gránulos fluorescentes de clonas RBL-2H3 que
expresan de forma estable la proteína RMCP-DsRED.
Se sometieron células que expresaban DsRED sola (control) o
RMCP-DsRED a fraccionamiento subcelular en un
gradiente de Percoll. A continuación, se analizó la entidad que
contenía los gránulos y lisosomas secretores mediante citometría de
flujo de organelas. Las células que expresaban DsRED (panel de la
izquierda) no mostraban gránulos o lisosomas fluorescentes en
comparación con las células que expresaban
RMCP-DsRED (panel de la derecha).
Figura 7. Purificación de gránulos y lisosomas
secretores fluorescentes utilizando separación FACS. Se separaron
los gránulos y lisosomas secretores marcados con fluorescencia
seleccionados por análisis de puertas ("gated") en la Figura 6
(panel de la derecha), mediante citometría de flujo y se determinó
su contenido en hexosaminidasa. Se muestra la actividad
hexosaminidasa específica del sobrenadante postnuclear (PNS), de la
entidad gránulo/lisosomal aislada mediante gradiente de Percoll y
el material separado mediante FACS.
Figura 8. Visualización de células vivas de
células RBL-2H3 que expresan
RMCP-DsRED tras la estimulación con IgE. Se
visualizaron células RBL-RMCP/2C2 vivas mediante
microscopía confocal. Las células se visualizaron en el tiempo 0 y
a continuación se estimularon con IgE y antígeno
(DNP-HSA). Se incubaron las células durante 2 horas
y se tomaron imágenes en diversos puntos temporales. Se muestran los
puntos temporales: 15 minutos, 1 hora y 2
horas.
horas.
Se proporcionan las definiciones siguientes para
facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados en la
presente invención:
Tal como se utiliza en la presente invención y
en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un",
"una", "la" y "él" incluyen referencia al plural a no
ser que el contexto indique claramente lo contrario.
El término "células" incluye células en
cualquier forma, incluyendo, sin limitación, células retenidas en
tejido, grupos celulares y células individuales aisladas.
Por "línea celular" se entiende células
capaces de crecimiento estable in vitro durante varias
generaciones.
Por "clon" se entiende una población de
células derivadas de una célula única o ancestro común por
mitosis.
Por "degranulación" se entiende movimiento
y exocitosis de lisosomas secretores.
Por "polipéptido" se entiende péptido o
proteína o variantes de los mismos.
Por "lisosoma secretor" se entiende una
organela de doble función que se utiliza tanto como lisosoma (para
la degradación) como para el almacenamiento de proteínas secretoras
de la célula y comparte varias características tanto con los
lisosomas convencionales como con los gránulos secretores, tales
como estructura y contenido.
Por "entidad de fusión direccionadora de
lisosomas secretores" se entiende una entidad que comprende: (a)
un polipéptido que se localiza específicamente en un lisosoma
secretor o una secuencia de nucleótidos que codifica dicho
polipéptido y (b) un polipéptido marcador o una secuencia de
nucleótidos que codifica dicho polipéptido marcador.
Por "entidad direccionadora de lisosomas
secretores" se entiende un polipéptido que se localiza
específicamente en un lisosoma secretor o una secuencia de
nucleótidos que codifica dicho polipéptido.
Por "variante" se entiende una secuencia,
tal como un polipéptido, que difiere de otra secuencia, pero retiene
propiedades esenciales de la misma, es decir, propiedades por las
cuales dicha secuencia es utilizada en la presente solicitud (por
ejemplo actividad proteasa). Por ejemplo, una variante de un
polipéptido puede diferir en su secuencia de aminoácidos en una o
más substituciones, adiciones y deleciones respecto al polipéptido
de referencia. En el término "variante" también se incluyen
fragmentos de una secuencia completa que retienen las propiedades
esenciales de la misma.
La presente invención supera varios de los
problemas asociados con la técnica y métodos previos para la
detección y control del contenido de los lisosomas secretores y su
actividad de exocitosis. Al transfectar células con una entidad que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
específica de los lisosomas secretores y una secuencia de
nucleótidos que codifica un polipéptido marcador fluorescente, la
presente invención permite el estudio del movimiento de lisosomas
secretores y la liberación del contenido de los lisosomas secretores
en tiempo real y la cuantificación de lisosomas secretores en
células vivas.
Entre las células que pueden utilizarse en la
presente invención se incluyen líneas celulares y células primarias
que poseen lisosomas secretores y comprenden mastocitos, basófilos,
células hematopoyéticas, melanocitos y células caliciformes. En una
realización, se designa como RBL-RMCP/2C2 (nº de
registro PTA-4571, depositada el 7 de agosto de
2002 en la American Type Culture Collection, 1081 University
Boulevard Manassas, VA 200110-2209, bajo los
términos del tratado de Budapest) una línea celular que expresa una
entidad que focaliza lisosomas secre-
tores.
tores.
La entidad de fusión que focaliza lisosomas
secretores de la presente invención se localiza en los lisosomas
secretores. La entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores
de la presente invención puede incluir constituyentes de los
lisosomas secretores tales como proteasas, por ejemplo, triptasas,
quimasas y carboxipeptidasas, incluyendo, sin limitación: proteasa
de mastocito de ratón, proteasa de mastocito de rata 1, -2, -3, -5,
-6 y -7; proteasa de mastocito de rata I y proteasa de mastocito de
rata II; quimasas humanas; triptasas humanas; proteasa similar a
catepsina G; catepsina G; carboxipeptidasa A y hexosaminidasa. En
una realización, la entidad que focaliza lisosomas secretores
comprende proteasa de mastocito de rata II.
La entidad de fusión que focaliza lisosomas
secretores de la presente invención puede incluir adicionalmente
cualquier polipéptido de interés o secuencia de nucleótidos que
codifique dicho polipéptido. En los métodos de cribado y detección
de la presente invención, el polipéptido o secuencia de nucleótidos
que codifica dicho polipéptido es un marcador, preferentemente una
molécula fluorescente, por ejemplo proteína roja fluorescente de
Discosoma sp. (DsRED) o proteína verde fluorescente
(GFP).
Como polipéptidos marcadores fluorescentes se
pueden incluir, sin limitación, moléculas luminiscentes (por
ejemplo luciferasa), enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano
picante, \beta-galactosidasa) y polipéptidos
fluorescentes (por ejemplo proteína roja fluorescente de
Discosoma sp. (DsRED) o proteína verde fluorescente
(GFP).
En los métodos terapéuticos de la presente
invención descritos más adelante, la entidad de fusión que focaliza
lisosomas secretores puede incluir adicionalmente cualquier
polipéptido terapéutico o secuencia de nucleótidos que codifica
dicho polipéptido de interés, incluyendo, sin limitación, enzimas,
citoquinas, factores de crecimiento y anticuerpos recombinantes
(cadenas simples).
La presente invención también da a conocer
métodos para identificar compuestos que modulan la degranulación
utilizando las entidades de fusión focalizadoras de lisosomas
secretores de la invención. Por ejemplo, una célula de la invención
que expresa una entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores
de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o
células caliciformes que comprende un polipéptido marcador se
incuba con un activador celular en presencia y ausencia de una
sustancia objeto de ensayo. Un cambio en la liberación de
fluorescencia en el sobrenadante en presencia de la sustancia objeto
de ensayo indicaría que la sustancia objeto de ensayo modula la
degranulación, por ejemplo, un aumento en la liberación de
fluorescencia en el sobrenadante indica degranulación. En una
realización preferente, la entidad de fusión que focaliza lisosomas
secretores comprende un polipéptido marcador fluorescente.
Como activadores celulares se incluyen, sin
limitación: IgE y un antígeno multivalente, acetato de forbol
miristato, ionomicina, receptores tipo toll y receptores de
proteasa. En una realización de la invención los activadores
celulares se seleccionan entre el grupo formado por: IgE y un
antígeno multivalente, acetato de forbol miristato e
ionomicina.
En otra realización, la presente invención da a
conocer métodos para incrementar la pureza de las preparaciones de
lisosomas secretores utilizando entidades de fusión focalizadoras de
lisosomas secretores de la invención. Preferentemente, se fracciona
una línea celular transfectada con una entidad de fusión que
focaliza lisosomas secretores de la invención que comprende un
polipéptido fluorescente mediante métodos conocidos en la técnica
(por ejemplo gradiente de Percoll o de sacarosa) para obtener
entidades subcelulares enriquecidas en lisosomas secretores. A
continuación, la entidad enriquecida en lisosomas secretores se
purifica adicionalmente utilizando el método de clasificación de
células activadas por fluorescencia (FACS).
En otra realización, la presente invención da a
conocer métodos para el estudio de la maduración, biosíntesis,
diferenciación celular, migración y activación in vivo de los
lisosomas secretores, utilizando una entidad que focaliza lisosomas
secretores de acuerdo con la presente invención que comprende además
un gen indicador.
En otra realización, la presente invención da a
conocer métodos para el estudio y cuantificación de la exocitosis
(degranulación) en tiempo real, a nivel de la célula individual
utilizando una entidad de fusión que focaliza lisosomas secretores
de acuerdo con la presente invención, que comprende preferentemente
un polipéptido marcador fluorescente, en los que la detección y
cuantificación se realizan utilizando microscopía confocal o
fluorescente utilizando, por ejemplo, un sistema Cellomics
ArrayScan® (Cellomics Inc., Pittsburg, PA). En estos métodos, por
ejemplo, se detecta la fluorescencia antes y después de la
estimulación de una célula transfectada con un marcador
fluorescente y una entidad que focaliza lisosomas secretores, en el
que una reducción en la fluorescencia indica degranulación. Por
tanto, estos métodos pueden utilizarse para cribar compuestos que
inhiben la liberación de lisosomas secretores.
En otra realización, la presente invención da a
conocer métodos para la administración de polipéptidos terapéuticos
in vivo utilizando una entidad de fusión que focaliza
lisosomas secretores de acuerdo con la presente invención que
comprende un polipéptido terapéutico. En una realización, una línea
celular transfectada con una entidad de fusión que focaliza
lisosomas secretores se encierra en un dispositivo de
inmunoaislamiento y se implanta en un individuo.
Los métodos de cribado de la presente invención
pueden adaptarse a un cribado de alto rendimiento (HTS) y a un
cribado ultrarrápido de alto rendimiento (UHTS). El HTS y el UHTS
pueden utilizar, por ejemplo, un sistema robótico modular Zymark
Allegro^{TM} (Zymark Corp., Hopkinton, MA) para dispensar
reactivos, tampones, y compuestos de ensayo en placas de
microtitulación negras de 96 ó 384 pocillos (de Dynex (Dynex
Technologies, Denkendorf, Alemania) o Corning (Corning Costar,
Cambridge, MA), respectivamente).
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras
variantes de la presente invención serán fácilmente evidentes para
aquellos con una experiencia ordinaria en la técnica.
La secuencia de codificación de RMCP II se
obtuvo de GenBank (nº de registro J02712; Benfey y otros JBC
262:5377, 1987). Se clonó RMCP II mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Como fuente de ARN, se utilizó la línea celular
(nº de registro CRL-2256, American Type
CultureCollection (ATCC), Manassas, VA) de la leucemia basofílica
de rata (RBL-2H3). Se realizó la reacción de la
transcriptasa inversa (síntesis de primera cadena de ADNc)
utilizando el sistema de amplificación Superscript^{TM} de GIBCO
BRL (nº de catálogo 18089-011, GIBCO BRL,
Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) según las instrucciones del
fabricante. La amplificación PCR se realizó sobre la primera cadena
de ADNc (de la etapa anterior) utilizando los oligonucleótidos:
| 5'-TCAGATCTCGAGATGCAGGCCCTACTATTCCTG-3' | (identificador de secuencia nº 1) y |
| 5'-CTGCAGAATTCGGCTACTTGTATTAATGACTGCAT-3' | (identificador de secuencia nº 2) |
Las condiciones de PCR fueron las siguientes:
94ºC (30 seg.)- 62ºC (30 seg.) - 72ºC (50 seg.). El producto de
PCR se purificó y digirió con las enzimas de restricción XhoI y
EcoRI. Estos lugares de restricción son proporcionados por los
oligonucleótidos. A continuación se clonó el fragmento en los mismos
lugares del vector pDsRED1-N1 de Clontech (nº de
catálogo 6921-1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto,
CA). Esta estrategia de clonación da lugar a un ADNc de la longitud
completa de la RMCP II en marco con el extremo
N-terminal del ADNc de la proteína fluorescente
DsRED. La identidad de la secuencia del vector recombinante,
RMCP-DsRED, se confirmó mediante secuenciación de
ADN.
Se transfectaron células RBL-2H3
(8x10^{6}) con el vector RMCP-DsRED (45 \mug)
mediante electroporación (Guillemot y otros JCB
110:2215-2225, 1997). Las condiciones de la
electroporación fueron 300 V y 960 \muF en un volumen de 800
\muL. La línea celular transfectada se denominó
RBL-RMCP/2C2. Las células transfectadas se
transfirieron al medio de cultivo adecuado y se incubaron durante 48
h. A continuación se seleccionaron los clones positivos mediante la
adición de 1 mg/mL de Geneticin® activa (GIBCO BRL, Invitrogen
Corp., Carlsbad, CA). Diez días después de la transfección, se
analizaron las células mediante clasificación de células activada
por fluorescencia (FACS). Tal como se observa en la Figura 1, se
detectó una población de células positiva para fluorescencia roja.
Se aislaron los clones individuales de la población celular mediante
FACS y se amplificaron. Tal como se observa en la Figura 2,
RBL-RMCP/2C2 en una clona positiva que expresa la
proteína de fusión RMCP/DsRED.
Se analizó la localización subcelular de la
proteína RMCP-DsRED del clon
RBL-RMCP/2C2 mediante microscopía confocal. Se
utilizó como control una clona celular que expresa el vector pDsRED
solo. Como se muestra en la Figura 3, las células transfectadas con
el vector control pDsRED expresan la proteína DsRED en el citoplasma
(fluorescencia difusa). Por el contrario, la fusión
RMCP-DsRED muestra una expresión punteada en
proximidad con la membrana plasmática. Este patrón se correlaciona
con la localización de los gránulos en los mastocitos o los
basófilos. La sonda LysoTracker® (Molecular Probes, nº de catálogo.
L-7526) es una amina débilmente básica que se
acumula selectivamente en los compartimentos celulares con un pH
interno bajo entre los que se incluyen los lisosomas y los gránulos
de núcleo denso (Sreyer, JA y otros, Nature
388:474-478, 1997). Tal como se observa en la
Figura 4, en el clon RBL-RMCP/2C2, la sonda
LysoTracker® se colocaliza con la proteína de fusión
RMCP-DsRED. Este resultado confirma que la proteína
de fusión RMCP-DsRED focaliza los gránulos.
Los mastocitos y basófilos responden a la
estimulación con IgE y antígeno con una liberación rápida (en
minutos) de su contenido de los gránulos hacia el medio
extracelular. Un ensayo estándar en este campo es estimular la
línea celular RBL-2H3 con una molécula IgE
específica de antígeno y a continuación se reticula el receptor IgE
mediante la adición del antígeno correspondiente (Roa M. y otros. J.
Immunol. 159: 2815-2823, 1997). Típicamente, para
controlar la degranulación, se utilizan como marcadores la
liberación de histamina y \beta-hexosaminidasa
(Schwartz LB y otros. J. Immunol. 123: 1445-1450,
1979). Tal como era esperable, cuando se estimulan las células
RBL-RMCP/2C2 con IgE anti-DNP
(dinitrofenilo) de ratón seguido de la estimulación con
DNP-HSA (antígeno DNP unido a albúmina sérica
humana) éstas liberan tanto histamina como
\beta-hexosaminidasa a los pocos minutos (Figura
5). Tal como se muestra en la Figura 5, las células
RBL-RMCP/2C2 también liberan fluorescencia roja
tras la estimulación. La liberación de fluorescencia se determinó en
el sobrenadante del cultivo celular (en un formato de placa de 96
pocillos) en los tiempos indicados utilizando un lector de
fluorescencia para placas LJL. La cinética de liberación de
histamina, \beta-hexosaminidasa y fluorescencia es
la misma.
Se fraccionaron homogeneizados celulares en
gradientes de Percoll o sacarosa para obtener entidades subcelulares
enriquecidas en gránulos de mastocitos (Kruger P.G. y otros., Exp.
Cell Res. 129:83-93, 1980). Utilizando la línea
celular RBL-RMCP/2C2 la entidad rica en gránulos se
purificó de forma adicional mediante FACS. Tal como se muestra en
la Figura 6, se detectó una población fluorescente bien diferenciada
en la entidad de gránulos aislada de las células
RBL-RMCP/2C2 en comparación con una línea celular
control. A continuación se separó la población positiva
(seleccionada mediante análisis de puertas ("gated")) de la
entidad total mediante clasificación de organelas (Fialka I. y
otros, J. Biol. Chem. 274:26233-26239, 1999). Tal
como se muestra en la Figura 7, la actividad específica
hexosaminidasa aumentó significativamente tras el proceso de
clasificación. Por tanto, esta etapa contribuyó a un incremento
sustancial en la pureza de la entidad de gránulos.
Las células RBL-RMCP/2C2 vivas
se visualizaron mediante microscopía confocal. Las células se
sensibilizaron con IgE anti-DNP, se visualizaron en
el tiempo 0 y a continuación se estimularon con antígeno
(DNP-HSA). Se incubaron las células durante un
tiempo total de 2 horas y se tomaron imágenes a puntos temporales
diferentes. En la Figura 8 se muestran los puntos temporales 15
minutos, 1 hora y 2 horas. Tal como se muestra en la Figura 8, puede
observarse la degranulación en tiempo real a nivel de la célula
individual.
Se siembran las células en placas de 96 pocillos
a una densidad de 2x10^{4} células por pocillo y se incuban
durante la noche. A continuación se lavan las células dos veces con
medio de cultivo y se incuban durante 2 horas a 37ºC en medio de
cultivo que contiene la sustancia objeto de ensayo (concentraciones
entre 1 mM y 1 pM) y 1 \mug/mL de anticuerpo monoclonal IgE
anti-DNP (clona SPE7, Sigma). A continuación se
lavan las células dos veces con tampón de Tyrode (HEPES 10 mM, pH
7,4, NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1,4 mM, MgCl_{2} 1 mM,
glucosa 5,6 mM, 0,1% BSA) y a continuación se estimulan con 100
ng/mL en tampón de Tyrode durante 1 hora. Se analiza la liberación
de fluorescencia roja en alícuotas (100 \muL) del sobrenadante del
cultivo. La fluorescencia roja se detecta en un bioanalizador LJL
(LJL Biosystems, Sunnyvale, CA) fijado a 530 nm para la excitación y
580 nm para la emisión.
<110> Boehringer Ingelheim
Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS PARA DIRIGIR LISOSOMAS
SECRETORES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9/251 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A asignar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-08-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/403,464
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-14
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagatctcg agatgcaggc cctactattc ctg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagaatt cggctacttg tattaatgac tgcat
\hfill35
Claims (15)
1. Entidad de fusión que dirige lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes que comprende: (a) un
polipéptido que se localiza específicamente en los lisosomas
secretores y es liberado con el contenido del gránulo en el medio
extracelular tras la estimulación y degranulación de la célula y (b)
un polipéptido marcador fluorescente.
2. Entidad de fusión que dirige lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes que comprende: (a) una secuencia
de nucleótidos que codifica un polipéptido que se localiza
específicamente en los lisosomas secretores y es liberado con el
contenido del gránulo en el medio extracelular tras la estimulación
y degranulación de la célula y (b) una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido marcador fluorescente.
3. Entidad de fusión que dirige lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes según la reivindicación 1 o 2, en
la que el polipéptido que se localiza específicamente en los
lisosomas secretores comprende una proteasa seleccionada del grupo
formado por: triptasas, quimasas y carboxipeptidasas.
4. Entidad de fusión que dirige lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipéptido que se localiza
específicamente en los lisosomas secretores de mastocitos,
basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células
caliciformes se selecciona del grupo formado por: proteasa de
mastocito murino -1, -2, -3, -4, -5, -6 y -7; proteasa de mastocito
de rata I y proteasa de mastocito de rata II; quimasas humanas,
triptasas humanas; proteasa similar a catepsina-G;
catepsina G; carboxipeptidasa A y hexosaminidasa.
5. Entidad de fusión que dirige lisosomas
secretores de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos o células caliciformes según la reivindicación 4, en la
que la proteasa es la proteasa de mastocito de rata II según el
número de registro GenBank J02712.
6. Célula que comprende una entidad de fusión
que dirige lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Célula según la reivindicación 6, en la que
la molécula fluorescente es la proteína verde fluorescente o la
proteína roja fluorescente de Discosoma sp.
8. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 6 o 7, en la que la célula se selecciona del grupo
formado por: mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas,
melanocitos y células caliciformes.
9. Célula según la reivindicación 8, en la que
la célula es un mastocito.
10. Célula que expresa una entidad de fusión que
dirige lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes según la
reivindicación 6, que está depositada en la American Type Culture
Collection y se le ha asignado el número de registro
PTA-4571.
11. Método para detectar y cuantificar la
degranulación que comprende: (a) incubar una célula que expresa una
entidad de fusión que dirige lisosomas secretores de mastocitos,
basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o células
caliciformes, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en
presencia de un activador celular; (b) incubar la célula que
expresa la entidad de fusión que dirige lisosomas secretores en
ausencia del activador celular; y (c) detectar y cuantificar la
liberación de marcador en el sobrenadante en presencia de activador
celular en comparación con la liberación de marcador en el
sobrenadante en ausencia de activador celular, de manera que un
incremento en la liberación de marcador en el sobrenadante en
presencia del activador celular indica degranulación.
12. Método para detectar y cuantificar la
inhibición de la degranulación que comprende: (a) incubar una célula
que expresa una entidad de fusión que dirige lisosomas secretores
de mastocitos, basófilos, células hematopoyéticas, melanocitos o
células caliciformes, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a
10, con un activador celular en presencia de una sustancia objeto
de ensayo; (b) incubar la célula que expresa la entidad de fusión
que dirige lisosomas secretores con un activador celular en
ausencia de la sustancia objeto de ensayo; y (c) detectar y
cuantificar un cambio en la liberación de marcador en el
sobrenadante en presencia de la sustancia objeto de ensayo en
comparación con la liberación de marcador en el sobrenadante en
ausencia de la sustancia objeto de ensayo, de manera que una
disminución en la liberación de marcador en el sobrenadante en
presencia de la sustancia objeto de ensayo indica inhibición de la
degranulación.
13. Método para detectar y cuantificar la
degranulación a nivel de la célula individual que comprende: (a)
incubar una célula que expresa una entidad de fusión que dirige
lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes, según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en ausencia de un
activador celular; (b) detectar y cuantificar la cantidad de
marcador en ausencia de un activador celular; (c) incubar la célula
de la etapa (a) en presencia de un activador celular; (d) detectar
y cuantificar la cantidad de marcador en presencia del activador
celular; y (e) detectar un cambio en la cantidad de marcador en la
célula en presencia del activador celular en comparación con la
cantidad de marcador en la célula en ausencia de activador celular,
de manera que una disminución en la cantidad de marcador indica
degranulación.
14. Método para detectar y cuantificar la
degranulación a nivel de la célula individual que comprende: (a)
incubar una célula que expresa una entidad de fusión que dirige
lisosomas secretores de mastocitos, basófilos, células
hematopoyéticas, melanocitos o células caliciformes, según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en presencia de un
activador celular; (b) detectar y cuantificar la cantidad de
marcador en presencia de activador celular; (c) incubar la célula
de la etapa (a) en presencia de un activador celular y una sustancia
objeto de ensayo; (d) detectar y cuantificar la cantidad de
marcador en presencia de activador celular y la sustancia objeto de
ensayo; y (e) comparar la cantidad de marcador en la célula en
presencia de la sustancia objeto de ensayo con la cantidad de
marcador en la célula en ausencia de la sustancia objeto de ensayo,
de manera que un aumento en la cantidad de marcador en presencia
del compuesto objeto de ensayo indica degranulación.
15. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que el activador celular se
selecciona del grupo formado por: IgE y un antígeno multivalente,
acetato de forbol miristato, ionomicina, receptores tipo toll y
receptores proteasa, preferentemente seleccionado del grupo formado
por: IgE y un antígeno multivalente, acetato de forbol miristato e
ionomicina.
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