WO2006115234A1 - アレルギー原因物質の検出方法およびアレルギー抑制剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2006115234A1
WO2006115234A1 PCT/JP2006/308485 JP2006308485W WO2006115234A1 WO 2006115234 A1 WO2006115234 A1 WO 2006115234A1 JP 2006308485 W JP2006308485 W JP 2006308485W WO 2006115234 A1 WO2006115234 A1 WO 2006115234A1
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WO
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protein
derived
basophils
basophil
mammal
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PCT/JP2006/308485
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinjiro Imai
Original Assignee
Nisshin Seifun Group Inc.
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Filing date
Publication date
Application filed by Nisshin Seifun Group Inc. filed Critical Nisshin Seifun Group Inc.
Publication of WO2006115234A1 publication Critical patent/WO2006115234A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a substance that causes degranulation in mast cells or basophils derived from mammals, and a method for screening a substance that suppresses allergies.
  • Immunoglobulin E produced against various antigens (allergens) in mammalian blood can cause allergic diseases such as asthma, atopic dermatitis and food allergy.
  • IgE is an antibody that is present in a trace amount in serum, but causes allergic symptoms by binding to Fc receptors on the cell surface.
  • Fc receptor F c £ RI
  • Ka 10 lc M—li present on mast cells and basophils sensitizes cells by binding to IgE.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting an allergen causing substance quickly and reliably.
  • the present inventors expressed degranulation in mast cells or basophils by expressing a fusion protein of a protein secreted into granules in mast cells or basophils and a marker protein in these cells.
  • the inventors have found that it can be detected with sensitivity, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for detecting a substance that causes degranulation in a mast cell or basophil derived from a mammal comprising:
  • mammalian-derived mast cells or basophils into which a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into a mast cell or a basophil granule and a marker protein has been introduced And said method.
  • the introduced gene is a fusion gene in which a gene encoding a marker protein is linked downstream of a gene encoding a protein secreted in a condylar particle in a mast cell derived from a mammal or a basophil.
  • the method according to any one of (1) to (5).
  • Proteins secreted into the granules in the mast cells or basophils are chymase, carboxypeptidase, tryptase, MC P 1, MC P 2, MC P 4, MC P 7, MC
  • the method according to any one of (1) to (6), wherein the method is selected from the group consisting of P9,] 3-hexosaminidase and basogranuline.
  • Marker proteins are noreluciferase, anoleka liphosphatase, peroxidase,] 3-galactosidase,] 3 _darc mouth nidase, CAT (chloramphenicol lucacetyl transferase), equorin
  • GFP green fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • Granules in the mast cells or basophils Mammal-derived fertile cells or basophils into which a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into the marker protein is introduced, or
  • a vector comprising a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into a granule in the mast cell or basophil and a marker protein, and a mast cell or basophil derived from a mammal;
  • a vector comprising a gene that encodes a fusion protein of a protein secreted into a granule of the mast cell or basophil bud and a marker protein, and a mast cell or basophil derived from a mammal;
  • FIG. 1 shows a method for constructing a mast cell granule protein-luciferase fusion protein expression plasmid.
  • FIG. 2 shows a method for constructing a mast cell granule protein-luciferase fusion protein expression plasmid.
  • FIG. 3 shows the results of the luciferase activity confirmation test of the fusion protein in Example 4.
  • FIG. 4 shows a method for constructing a mast cell granule protein-alkaline phosphatase fusion protein expression plasmid. '
  • FIG. 5 shows the results of a test for confirming the activity of the phosphatase activity of the fusion protein in Example 7.
  • FIG. 6 shows the results of detecting 2,4-dinitrophenylated human serum albumin in Example 8.
  • the present invention relates to a method for detecting a substance that causes degranulation in mast cells or basophils derived from a mammal, and a method for screening a substance that inhibits degranulation.
  • the method of the present invention comprises a mammal-derived mast cell or a mammal-derived gene into which a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into a granule in a basophil and a marker protein has been introduced. It is characterized by using mast cells or basophils.
  • Mast cells are also called mast cells, and are cells that induce an immediate allergic reaction such as asthma and atopic dermatitis. Mast cells differentiate and mature from bone marrow progenitor cells by interleukin action, but due to differences in their degree of differentiation and morphological and pharmacological differences, mast cells in the connective tissue (CTMC: connectivetissuemastcell) around the blood vessels It is divided into mucosal mast cells (MMC: mucosalmastcell) which are increased by parasite infection and are T cell dependent. Both types of mast cells contain granules with a high affinity F c ⁇ receptor (F c ⁇ RI) of IgE on the cell membrane surface and containing chemical mediators such as histamine.
  • F c ⁇ receptor F c ⁇ RI
  • mast cells include mast cells derived from mammals such as humans, mice, monkeys, rabbits, inu, guinea pigs, rats, hidge, goats, and the like.
  • mouse-derived mast cells and human-derived mast cells are preferably used. Specifically, mouse MC / 9, mouse 10 P 2, mouse 10 P 12, mouse IIPO-1, human HMC-1, and human LAD 2 are listed.
  • Basophils are also called basophilic leukocytes and are a type of granulocytes.
  • Basophils are also called basophilic leukocytes and are a type of granulocytes.
  • FCERI F c ⁇ receptor
  • basophils examples include basophils derived from mammals such as humans, mice, monkeys, rabbits, inu, guinea pigs, rats, hidges, and goats.
  • mouse-derived basophils, rat-derived basophils and human-derived basophils are preferably used.
  • Mast cells derived from mammals or proteins secreted into granules in basophils are those that are expressed in cells and stored in granules.
  • proteins secreted into condylar grains in mast cells or basophils include chymase, carboxypeptidase, tryptase, kininogenase, MC P 1, MC P 2, MC P 4,
  • mast cell proteases MC P
  • MC P mast cell proteases
  • chymase such as Chymase 1 (MC P 5) and Chymase 2, Triptase 1 (Gen Bank accession number: NM0 1 20 34) and MCP 6 (G en B ank session number: NM0 1 0 7 8 1), etc., such as trypticase, carboxypeptidase (Gen Bank accession number: NM 00 7 7 5 3), MC P 1 (G en Bank accession number) Number: NM0 0 8 5 7 0), MC P 2, MC P 4 (G en Bank session number: NM0 1 0 7 7 9), MC P 7 and MC P 9 (G en Bank session number) : Mast cell protease such as NM 0 1 0 7 8 2) and bathograulin are used.
  • the marker protein is not particularly limited as long as it does not inhibit secretion and storage of the granule protein into the granule and degranulation when it is fused with the granule protein.
  • the marker protein those commonly used in this technical field can be used.
  • Marker enzyme, fluorescent protein and photoprotein Etc. can be used.
  • YF P ′ yellow fluorescent protein
  • luciferase in particular firefly luciferase, renilla luciferase, luminescent pacteriluciferase and equine, alkaline phosphatase, in particular secreted alkaline phosphatase, peroxidase, in particular horseradish peroxidase, Use GFP,] 3-galactosidase, glucuronidase and CAT.
  • a mast cell or basophil derived from a mammal into which a gene encoding a fusion protein of the granule protein and the marker protein is introduced is used.
  • the introduction of the gene encoding the fusion protein can be carried out by a method usually used in the art, and is not particularly limited. For example, it can be carried out by introducing a fusion gene of a gene encoding a granule protein and a gene encoding a single protein into mast cells or basophils derived from mammals.
  • the gene includes DNA and RNA, preferably DNA.
  • Fusion of the gene encoding the granule protein and the gene encoding the marker protein can be performed by a conventional gene recombination technique.
  • the gene that codes for the granule protein and the gene that codes for the marker protein are first cloned.
  • Each cloned gene is digested with restriction enzymes, and the fragments are ligated and incorporated into an appropriate vector.
  • the vector to be used is not particularly limited as long as it can express the fusion protein in the introduced cell. Vectors commonly used in mammalian cells can be used.
  • this vector is linked with a cis-element such as an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, and ribosome binding sequence (SD sequence) as required. May be.
  • a cis-element such as an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, and ribosome binding sequence (SD sequence) as required. May be.
  • the promoter include an SRa promoter, an SV40 promoter, an LTR promoter, a CMV promoter, an HSV-TK promoter, and the like.
  • the gene encoding the marker protein may be added to the C-terminal side of the gene encoding the granule protein, or may be added to the N-terminal side. At this time, stop codon should not appear between the gene coding for the strongest protein and the gene coding for the granule protein.
  • the distance between the gene encoding the single protein and the gene encoding the granule protein is not limited, and a linker may be included between the two. In order for the marker protein and the granule protein to be translated, the open reading frames of both genes should be matched. In addition, a base sequence may be present between both genes so that a specific amino acid is contained in the linker partial position.
  • the gene encoding a fusion protein is preferably a fusion gene in which a gene encoding a marker protein is linked downstream of a gene encoding a granule protein.
  • the gene encoding the fusion protein is linked to the 3 'end of the promoter region of the expression system.
  • the gene encoding the fusion protein can be introduced by a known method such as the ribofetasion method, the calcium phosphate method, and the electroporation method.
  • a known method such as the ribofetasion method, the calcium phosphate method, and the electroporation method.
  • the power to be explained in detail by referring to Examples'; Maniatis, T. et al., Molecular Cloning 2nd ed., A General techniques described in Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory u989), Innis,. A. et al., PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990) can be used.
  • the detection method of the present invention comprises:
  • test substance When a test substance is brought into contact with mast cells or basophils introduced with a test substance added to the culture medium, the test substance cross-links F c ⁇ RI via IgE or directly. In this case, a degranulation reaction occurs and the fusion protein is released out of the cell.
  • FcRI and IgE By reacting cells with IgE, substances that form FCERI crosslinks can be detected via IgE.
  • F c ⁇ RI causes decrosslinking both when crossed through I g. And when directly cross-linked, but in the detection method of the present invention, F c E RI-I g E complex It is possible to detect both substances that form F c ⁇ RI cross-links to cause degranulation and substances that directly cross-link F c RI to cause degranulation.
  • the reaction between IgE and mast cells or basophils may be performed before the addition of the test substance, may be performed simultaneously, or may be performed after the addition of the test substance. More preferably, before adding the test substance.
  • the present invention also relates to a method for screening a substance that inhibits degranulation in mast cells or basophils derived from mammals.
  • the screening method comprises a mammal derived from a gene into which a fusion protein of a protein secreted into a mast cell derived from a mammal or a granule in a basophil and a marker protein is introduced. It is characterized by using mast cells or basophils.
  • the fusion protein is secreted into the granule.
  • degranulation in mast cells or basophils can be detected by detecting the fusion protein released outside the cell based on the marker protein. Therefore, in the presence of a substance that causes degranulation in mast cells or basophils, that is, an allergenic substance, the test is performed on the culture medium of mast cells or basophils into which the gene encoding the fusion protein of the present invention has been introduced.
  • the test substance When the substance is added and the release of the fusion protein is suppressed compared to the case where the test substance is not added, that is, when degranulation is suppressed, the test substance is degranulated.
  • It can be identified as a substance that inhibits allergic reaction, that is, a substance that suppresses allergic reaction, especially a substance that suppresses immediate allergic reaction. Therefore, the present invention
  • the rejuvenation method enables screening of therapeutic agents for allergic diseases.
  • Allergic disease is a general term for diseases that involve allergic reactions. More specifically, allergens have been identified, a deep link has been established between exposure to allergens and the development of lesions, and immunological treatment of the lesions. It can be defined that the mechanism is proved.
  • allergic diseases include bronchial asthma, allergic rhinitis, hay fever, and insect allergy.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps: a) a mast cell or basophil culture medium derived from a mammal into which the gene has been introduced; Adding a test substance in the presence of a substance that causes degranulation; and
  • a substance that causes degranulation in mast cells or basophils known substances can be used, and examples include mite antigen and pollen antigen.
  • Substances that cause degranulation in mast cells or basophils may be added before the addition of the test substance, may be added simultaneously, or may be added after the addition of the test substance However, it is preferably added at the same time as or after the test substance.
  • Ig M may be further reacted with the transduced mast cell or basophil to form a complex of F c ⁇ R I and I g I.
  • crosslinking of Fcf.RI through IgE is detectable.
  • F c ⁇ R I causes disentanglement both when cross-linked via I g ⁇ and when directly bridged.
  • a substance that inhibits F c ⁇ RI cross-linking through F c ⁇ RI — IgE complex to inhibit degranulation, and F c ⁇ RI direct cross-linking is inhibited to inhibit degranulation. Both inhibiting substances can be detected.
  • the reaction between Ig ⁇ and mast cells or basophils may be performed before the addition of the test substance, simultaneously or after the addition of the test substance. More preferably, before adding the test substance.
  • culturing of mast cells or basophils into which a gene encoding a fusion protein has been introduced can be carried out by a method commonly used in this technical field.
  • a method commonly used in this technical field For example: 1-2 0 vol% CO 2, for 1 hour to 1 0 0 day 5 ⁇ 4 5 ° C, 1 ⁇ 7 cultured with medium change daily as needed.
  • the cells are cultured for 1 to 3 63 under conditions of 5% C 0 2 and 3 7 while changing the medium every 2 to 3 days.
  • Media used include RPMI medium, MEM medium, BME medium, DME medium, ⁇ MEM medium, IMEM medium, ES medium, DM—160 medium, Fisher medium, F 12 medium and WE medium (published by Asakura Shoten) “The tissue culture society of Japan. Technology 3rd edition ”5 8 Basic media described on page 1), serum media (such as pups serum, chick fetus serum, etc.) added to these media, and commercially available serum-free media, etc. It is possible. Of these, a basal medium supplemented with serum components is preferred.
  • the medium contains amino acids (glutamin, alanyl glutamine, arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanin, threonine, tryptophan, tyrosine.
  • amino acids glutamin, alanyl glutamine, arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanin, threonine, tryptophan, tyrosine.
  • vitamins choline, chlorin chloride, so, etc
  • test substance added to the culture medium of mast cells or basophils is not particularly limited, but for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cells. Plant extracts, animal tissue extracts, plasma, allergen-causing substances (allergens) and the like are used, and these substances may be novel substances or known substances.
  • the fusion protein released to the outside by degranulation is detected by detecting the marker protein in the medium fraction.
  • Detecting a marker protein in a medium fraction means detecting a fraction excluding the marker protein contained in mast cells or basophils. That is, the cell fraction is separated from the culture medium, and marker 1 protein is detected in the remaining medium fraction. Separation of the cell fraction can be performed, for example, by centrifugation. , '
  • a person skilled in the art can appropriately detect the marker protein depending on the type of protein used. For example, when noluciferase is used as the marker protein, the wavelength emitted when luciferase catalyzes the reaction to produce luciferin and AMP from luciferin and ATP in the presence of magnesium. Is detected using a luminometer. For example, firefly luciferase activity is measured by the method of J. R. De W et al. (Meth. Enzyraol., 133, 3, 1986). Can.
  • CAT in the case of using (chloramphenicol transformers Feller Ze), [1 4 C] Kuroramufue Nicole substrate is Asechiru by CAT [1 4 C] ⁇ cetyl chloramphenicol phenylene Cole is produced. Extract this sample with ethyl acetate, develop it on a thin-layer silica gel plate, and measure the radioactivity of spots with different mobilities.
  • the marker protein can also be detected using a commercially available kit.
  • the present invention also provides a kit for detecting a substance that causes degranulation in a mast cell or basophil derived from a mammal, and a substance that inhibits degranulation in a mast cell or basophil derived from a mammal. It relates to kits for screening.
  • the kit of the present invention is a mast cell derived from a mammal into which a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into a granule in a basophil or a marker protein is introduced.
  • basophil or a betater containing a gene encoding a fusion protein of a protein secreted into a granule in the mast cell or basophil and a marker protein, and a mast cell derived from a mammal.
  • basophils or basophils.
  • kits of the present invention other elements can be additionally combined in addition to the betater containing the gene encoding the mast cells or basophils into which the gene has been introduced or a fusion protein.
  • a cell used as a control a test substance used as a control, a substrate or a reagent for detecting a marker protein can be combined.
  • mast cells or basophils into which the gene has not been introduced are useful for control experiments.
  • a test substance used as a control a substance known to cause degranulation (positive control) or a substance that has been confirmed not to cause degranulation (negative control) can be used.
  • substances that cause degranulation in mast cells or basophils derived from mammals that is, Allergen-causing substances (allergens) can be combined.
  • the kit of the present invention can be further packaged with a medium for culturing cells and a culture container. It is advantageous that the culture vessel has a shape that can be applied to high-throughput screening. Furthermore, an instruction manual for explaining the assembly method can be combined with the kit of the present invention.
  • RNA was extracted from MCZ 9 cells, and cDNA was prepared by reverse transcription reaction. The cDNA was subjected to PCR reaction in a cage. Amplification was performed on Chymase 1, MCP2, and MCP7, known as mouse granule proteins. Each PCR primer is shown in Table 1. Table 1
  • a PCR reaction solution in which amplification was confirmed was made into a vertical shape, and a PCR reaction was performed again using KO DD ash DNA polymerase.
  • a primer used at this time a primer shown in Table 2 containing a restriction enzyme recognition sequence was used for the purpose of facilitating insertion into a plasmid later. Table 2
  • the obtained amplified DNA is excised and purified by agarose electrophoresis, and then the fragments are analyzed. Inserted into Kuta p CR 4 and TA-cloned.
  • the obtained clone was confirmed for the entire sequence by DNA sequencing after confirming the inserted fragment by restriction enzyme mapping.
  • This plasmid was opened with restriction enzymes KpnI and EcoRI and purified by agarose electrophoresis.
  • the MCP 2 and MCP 7 regions were cut out from the previously cloned plasmid with K pnl- Eco RI and K pnl — Mu ni, purified, ligated, and E. coli was isolated. Transformed. After transformation, the plasmid was purified from each colony, and the presence or absence of the inserted fragment was confirmed. For the clones in which the insertion was confirmed, the inserted region and the sequence before and after the inserted region were sequenced.
  • the plasmid obtained from MC P 2 was named pMC P 0 3 (MC P 2-luciferase), and the plasmid obtained from MC P 7 was named pMC P 0 7 (MC P 7 luciferase).
  • Figure 2 shows the process of building these plasmids. Details of each process are as follows. '
  • each restriction enzyme manual That is, each DNA solution and the X 10 buffer attached to the enzyme, distilled water, and restriction enzyme were mixed and reacted usually at 37 ° C for 2 hours.
  • TNAKA's DNALiGatioKitVer.2 was used. That is, the target DNA was mixed, the kit reaction mixture (so 1 n I) was added in an equal amount, and the mixture was allowed to stand at 16 for 30 minutes to ligate DNA.
  • KOD DNA polymerase was used (Demo SD et al., Cytometry, 1999, Aug, 1; 36 (4): 340-8, Taupenot L et al., AJ Cell Sci. 2002, Dec 15; 115 (Pt 24): 4827-41). Vertical DNA 0.5 ⁇ 1
  • TA cleaning For TA cleaning, a TO PO TA cleaning system manufactured by Invitrogen was used.
  • the PCR-amplified fragment used for TA cloning is a DNA amplified with KOD polymerase, re-amplified by PCR with KOD Dash DNA polymerase, and an adenyl group added to the DNA end. used. The method was implemented according to the company manual.
  • the plasmids pMCPO2, pMCPO3, and pMCPO7 prepared in Example 1 were transfected into mouse-derived mast cells MCZ9. Transfection was performed using the lipofection method. To 6-well plate, 0.5 ml of Opti-MEM® I serum-reducing medium was added. 6 ⁇ l of D MR I ⁇ —C reagent was added to the well, and the plate was rotated to mix gently. To the well, 0.5 ml of Opti-MEM® I serum-reducing medium containing 4 g of DNA was added. Turn the plate to mix. The complex was formed by incubation at room temperature for 15 to 45 minutes.
  • SX loecells / O .2 ml cells suspended in serum-free Opti-MEM medium were added. Mix gently and incubate at 37 ° C for 4-5 hours with 5% CO 2 . Each well was supplemented with 2 ml of growth medium containing 15% FBS. After 24 to 48 hours of transfection, the cells were assembled and the activity was measured.
  • MC / 9 cells are cultured using Dulbecco's MEM High Glueose medium (GIBCO), 37 ° C, 5% CO 2 , 100% wet conditions, carbon dioxide incubator. Went in. The medium was supplemented with 10% ushi fetal serum manufactured by ICN and 10% (V / V) of R at T-STI (GIB CO).
  • GEBCO Dulbecco's MEM High Glueose medium
  • ICN 10% ushi fetal serum manufactured by ICN and 10% (V / V) of R at T-STI (GIB CO).
  • Example 2 Using the transformant prepared in Example 2, expression of the fusion protein 48 hours after transfection was confirmed by Western plotting.
  • the cells were solubilized with a solubilizing solution for SDS electrophoresis and subjected to SDS electrophoresis.
  • the gel was separated from the gel support plate and electroblotted onto a PVDF membrane previously soaked in methanol. Electroblotting was performed using a Sartorius semi-drive mouthpiece. The method was carried out according to the company manual.
  • the PVDF membrane after the plotting was blocked with B 1 ock A (stock solution) for 30 minutes at room temperature, and incubated with the primary antibody for 2 hours at room temperature.
  • a goat anti-luciferase polyclonal antibody was used as the primary antibody.
  • 2 Incubation was carried out at room temperature for 1 hour together with the anti-anti-IgG G-HRP antibody as the next antibody.
  • light was emitted with an immunoblotting luminescence kit manufactured by Amersham Biotech. The method was carried out according to the company manual. Specific bands derived from the cells into which pMCPO2, pMCPO3, and pMCPO07 were introduced were confirmed in the vicinity of 9600. From this, it was confirmed that the target gene was expressed by gene transfer.
  • Transfusion 4 The luciferase activity of the fusion protein was measured 8 hours later.
  • 100 mM of calcium ionophore A 2 3 1 8 7 (manufactured by Alomone Labs) ethanol solution 5 ml was added. Cultivation was continued for 20 minutes at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were centrifuged at 500 rpm for 1 minute, the supernatant was separated, and this was used as the medium fraction.
  • the precipitate fraction (cells) was suspended in Cell Lysis Reagent (manufactured by promega), stirred, and centrifuged at 15 500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as the cell fraction.
  • Example 5 Construction of plasmids expressing C hyamse 1-alkaline phosphatase fusion protein and MC P 7-alkali phosphatase fusion protein Plasmids p MC P 0 2 and pMC P 0 obtained in Example 1 7 was cleaved with the restriction enzyme Eco RX ba I, and the vector region was purified by agarose electrophoresis. To this open vector, an alkaline phosphatase region (hereinafter referred to as ALP) gene-containing plasmid p SEAP 2 B asic (manufactured by BDB iosciences C 1 ontech) was added to the alkaline phosphatase region as Eco RI, X ba I.
  • ALP alkaline phosphatase region
  • the plasmids pMC P 14 and pMC P 15 prepared in Example 5 were transfected into mouse-derived mast cells MCZ9. The method was carried out in the same manner as in Example 2.
  • Mouse-derived mast cells MCZ 9 into which granule protein luciferase fusion protein expression plasmid was introduced by the method shown in Example 2 were used. 24 hours after the transflector Ekushi Yo down, cells were centrifuged (3 0 0 X g, 3 minutes), cells were suspended in by the Hare medium becomes 1 0 6 ce 1 1 s / m 1, where the M Onoclonal Mo use I g E anti — DNP (Yamasa soy sauce) final concentration 1 00 ng Zm 1 was added as follows. 2 4 hours incubation was continued, the cells were M odified T yrode 'sbuffer (MT ) (1 3 7 mM N a C l, 2. 7 mM KC 1.
  • MT M odified T yrode 'sbuffer
  • the cells were centrifuged at 300 X g for 1 minute, the supernatant was separated, and this was used as a sample.
  • the luciferase activity of the sample was measured with a luciferase measurement kit (Promega). The measurement results are shown in Table 5 and Fig. 6. Table 5
  • degranulation caused by 2,4-dinitrophenylated serum serum albumin can be detected by a mast cell into which a granule protein-luciferase fusion protein expression plasmid has been introduced.
  • the method of the present invention can detect a substance that causes degranulation contained in a sample, and the more the substance, the larger the luminescence signal is detected, and the substance can be quantified. It was done. All publications, patents and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本発明により、迅速かつ確実にアレルギー原因物質を検出する方法が提供される。本発明は、哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質を検出する方法であって、哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカータンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された、哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする、前記方法に関する。

Description

明 細 書 ァレルギ一原因物質の検出方法およびァレルギ一抑制剤のスク リ一ユング方法 技術分野
本発明は、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こ す物質を検出する方法、 およぴァレルギ一を抑制する物質をスクリーニングする 方法に関する。 背景技術
ァレルギ一の診断およびァレルギ一原因物質の検出等に対するニーズは様々な 領域で非常に高い。 哺乳動物の血液中で様々な抗原 （アレルゲン） に対して産生 される免疫グロブリン E ( I g E ) は、 喘息、 ア トピー性皮膚炎および食物ァレ ルギ一等のアレルギー性疾患を引き起こすことが知られている。 I g Eは、 血清 中に微量に存在する抗体であるが、 細胞表面の F c受容体と結合することにより、 アレルギー症状を引き起こす。 例えば、 肥満細胞および好塩基球上に存在する高 親和性 F c受容体 （F c £ R I ) ( K a = 1 0 l c M—リ は、 I g Eとの結合に より細胞を感作し、 その I g E— F c ε R I複合体への抗原の結合、 それによる F c ε R Iの架橋の結果、 ァレルギ一症状が誘発される。 F c E R Iが架橋され ると、 肥満細胞の脱顆粒が誘発され、 細胞外に各種化学伝達物質が放出される。 架橋形成から脱顆粒反応までは僅かな時間で成される事から、 この反応は即時型 ァレルギ一反応と称される。
現在アレルギーの診断およびアレルギー原因物質等の検出は酵素抗体法 （Ε I Α ) 等により行われているが、 その工程は、 反応および洗浄等の繰り返しが必要 で、 短くても数時間を要しており、 その迅速簡便化が求められている。 また、 従 来の E L I S Α法を用いた場合、 実質的には脱顆粒を誘発しない立体構造が損な われたアレルゲンをも検出してしまい、 誤診断に繋がる可能性がある。 更に、 従 来の肥満細胞を用いたバイオアッセィ法の場合、 結合力の弱いァレルゲンは脱顆 粒の程度も弱く検出が困難であった。 ，'
一方、 脱顆粒により放出された化学伝達物質を直接検出することも考えられる が、 ヒスタ ミ ン等の化学伝達物質の定量は容易ではなく、 迅速な測定ができなレ、。 化学伝達物質の中には酵素も含まれており、 脱顆粒により細胞外に放出された酵 素の酵素活性を測定することも考えられるが、 当該酵素活性測定はその検出限界 が高く、 多量の脱顆粒が行われない限り検出が行えない。 発明の開示
本発明の課題は、 迅速かつ確実にアレルギー原因物質を検出する方法を提供す ることである。
本発明者らは、 肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質と マーカ一タンパク質との融合タンパク質をこれらの細胞において発現させること により、 肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を高感度で検出できることを見 いだし、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
( 1 ) 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質 を検出する方法であって、
哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球內の顆粒中に分泌されるタンパク質と マーカータンパク質との融合タンパク質をコ一ドする遺伝子が導入された、 哺乳 動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする、 前記方法。 ( 2 ) 下記の工程：
a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に被検物質を添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカ一タンパク質を検出する工程、
を含む、 （ 1 ) 記載の方法。
( 3 ) 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害する物質を スク リ 一ニングする方法であって、
哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質と マーカータンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された、 哺乳 動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする、 前記方法。
( 4 ) 下記の工程：
a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に、 該肥満細胞または好塩基球の脱顆粒を引き起こす物質の存在下、 被検物質を 添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカータンパク質を検出する工程、
を含む、 （ 3 ) 記載の方法。 ，'
( 5 ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球に I g E を反応させる工程をさらに含む、 （2 ) または （4 ) 記載の方法。
( 6 ) 前記導入された遺伝子が、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆 粒中に分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の下流にマーカータンパク質を コードする遺伝子が連結された融合遺伝子である、 （ 1 ) 〜 （ 5 ) のいずれかに 記載の方法。 ( 7 ) 該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質が、 キマー ゼ、 カルボキシぺプチダ一ゼ、 ト リプターゼ、 MC P 1、 MC P 2、 MC P 4、 MC P 7、 MC P 9、 ]3—へキソサミニダ一ゼおよぴバソグラヌ リ ンからなる群 から選択される、 （ 1 ) 〜 （6) のいずれかに記載の方法。
(8) マーカータンパク質が、 ノレシフェラーゼ、 ァノレカ リホスファタ一ゼ、 ペル ォキシダ一ゼ、 ]3—ガラク トシダーゼ、 ]3 _ダルク 口ニダーゼ、 CAT (ク ロラ ムフエニコ一ルァセチル ト ランスフェラ一ゼ） 、 ェクオリ ン、 GF P (緑色蛍光 タンパク質） 、 C F P (シアン蛍光タンパク質） および YF P (黄色蛍光タンパ グ質） からなる群から選択される、 （ 1 ) 〜 （ 7) のいずれかに記載の方法。
( 9 ) 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質 を検出するためのキッ トであって、
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒.中に分泌されるタンパク質とマーカータン パク質との融合タンパク質をコー ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来の肥 満細胞または好塩基球、 または
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカータン パク質との融合タンパク質をコ一 ドする遺伝子を含むべクタ一、 および哺乳動物 由来の肥満細胞または好塩基球、
を含む、 前記キッ ト。
( 1 0 ) 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害する物質 を検出するためのキッ トであって、
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカータン パク質との融合タンパク質をコー ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来の肥 満細胞または好塩基球、 または
該肥満細胞または好塩基球內の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカータン パク質との融合タンパク質をコ一 ドする遺伝子を含むべクター、 および哺乳動物 由来の肥満細胞または好塩基球、
を含む、 前記キッ ト。
本発明により、 迅速かつ確実にアレルギー原因物質を検出する手段、 ならびに ァレルギ一反応を抑制する物質をスク リ一-ングする手段が提供される。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 5— 1 2 3 6 6 4号および 特願 2 0 0 5— 2 9 8 7 2 5号の特許請求の範囲、 明細書および図面に記載され た内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 肥満細胞顆粒タンパグ質一ルシフェラ一ゼ融合タンパク質発現プラス ミ ドの構築方法を示す。
図 2は、 肥満細胞顆粒タンパク質一ルシフェラ一ゼ融合タンパク質発現プラス ミ ドの構築方法を示す。
図 3は、 実施例 4における融合タンパク質のルシフヱラーゼ活性確認試験の結 果を示す。
図 4は、 肥満細胞顆粒タンパク質一アル力 リホスファタ一ゼ融合タンパク質発 現プラスミ ドの構築方法を示す。 '
図 5は、 実施例 7における融合タンパク質のアル力 リ ホスファターゼ活性確認 試験の結果を示す。
図 6は、 実施例 8において、 2， 4ージニ トロフエニル化ヒ ト血清アルブミン を検出した結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
—実施形態において本発明は、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球におい て脱顆粒を引き起こす物質を検出する方法、 および脱顆粒を阻害する物質をスク リーニングする方法に関する。 本発明の方法は、 哺乳動物由来の肥満細胞または 好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカ一タンパク質との融合タン パク質をコ一ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基 球を用いることを特徴とする。
肥満細胞は、 マス ト細胞とも称され、 喘息やア トピー性皮膚炎等の即時型ァレ ルギー反応を誘起する細胞である。 肥満細胞は、 骨髄前駆細胞よ りインターロイ キン作用で分化成熟するが、 分化度合の違いと形態的 · 薬理学的な違いにより、 血管周囲に多い結合組織内肥満細胞 （C TMC ： c o n n e c t i v e t i s s u e m a s t c e l l ) と寄生虫感染で増加し T細胞依存性である粘膜內 肥満細胞 （MMC ： m u c o s a l m a s t c e l l ) とに分けられる。 両 タィプの肥満細胞と も細胞膜表面に I g Eの高親和性 F c ε 受容体 （ F c ε R I ) を有し、 ヒスタ ミ ン等の化学伝達物質を含有する顆粒を含む。 細胞の脱顆粒 反応は、 F c E R I に結合した I g Eが抗原で架橋され、 それにより受容体どう しが凝集するか、 あるいは受容体が直接架橋されることによ り起こる。 F C £ R I の架橋以外にも、 ァナフイ ラ トキシンである補体成分フラグメ ン ト、 c o m p o u n d 4 8 Z 8 0、 化学物質のカルシウムィオノホア等によっても脱顆粒が起 こる。 脱顆粒によ り、 顆粒に貯蔵されていたヒスタ ミ ン等の化学伝達物質が細胞 外に放出される。 肥満細胞と しては、 例えば、 ヒ ト、 マウス、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ等の哺乳動物に由来する肥満細胞が挙げられる。 本発明に おいては、 マウス由来肥満細胞およぴヒ ト由来肥満細胞が好適に用いられる。 具 体的には、 マウス MC/9、 マウス 1 0 P 2、 マウス 1 0 P 1 2、 マウス I I P O— 1、 ヒ ト HMC— 1およぴヒ ト LAD 2等が挙げられる。
好塩基球は、 好塩基性白血球とも称され、 顆粒球の一種である。 細胞膜表面に
I g Eに対する高親和性 F c ε受容体 （F C E R I ) を有し、 ヒスタミン等の化 学伝達物質を含有する顆粒を含む。 そして、 好塩墓球は、 F C E R I の架橋によ り脱顆粒を起こす。 これらの特徴は肥満細胞の特徴に似ているが、 顆粒の数およ ぴ形態、 ならびに顆粒含有物の種類や量が異なる。
好塩基球と しては、 例えば、 ヒ ト、 マウス、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ等の哺乳動物に由来する好塩基球が挙げられる。 本発明に おいては、 マウス由来の好塩基球、 ラッ ト由来の好塩基球およびヒ ト由来の好塩 基球が好適に用いられる。 具体的には、 ラッ ト R B L— 1、 ラッ ト RB L— 2 H
3、 マウス EML C e l l l i n e , ヒ ト KU 8 1 2およぴヒ ト KU 8 1 2 F 等が挙げられる。
哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質 (本明細書中、 顆粒タンパク質と称する場合もある） は、 細胞内で発現して顆粒 内に貯蔵されるものであれば特に制限されない。 肥満細胞または好塩基球内の顆 粒中に分泌されるタンパク質と しては、 例えば、 キマーゼ、 カルボキシぺプチダ —ゼ、 ト リプタ一ゼ、 キニノゲナーゼ、 MC P 1、 MC P 2、 MC P 4、 MC P 7および MC P 9等の肥満細胞プロテアーゼ （MC P) 、 ノくソグラヌ リ ン、 β — ダルコサミニダ一ゼ、 /3—へキソサミニダ一ゼ等が挙げられる。 好ましくは、 C h ym a s e 1 (MC P 5) および C h ym a s e 2等のキマーゼ、 ト リプ タ一ゼ 1 (G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM0 1 20 34) およぴ M C P 6 (G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM0 1 0 7 8 1 ) 等の ト リプタ ーゼ、 カルボキシぺプチダーゼ （G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM 00 7 7 5 3 ) 、 MC P 1 (G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM0 0 8 5 7 0) 、 MC P 2、 MC P 4 (G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM0 1 0 7 7 9) 、 MC P 7ならびに MC P 9 (G e n B a n kァクセッショ ン番号 ： NM 0 1 0 7 8 2) 等の肥満細胞プロテアーゼ、 ならびにバソグラヌ リ ンを用いる。 マーカ一タンパク質は、 上記顆粒タンパク質と融合させたときに、 顆粒タンパ ク質の顆粒中への分泌および貯蔵、 ならびに脱顆粒を阻害せず、 検出可能なもの であれば特に制限されない。 マーカータンパク質と しては、 当技術分野で通常用 いられるものを使用でき、 マ一カー酵素、 蛍光タンパク質および発光タンパク質 等を使用できる。 例えば、 ルシフェラーゼ、 アルカ リホスファターゼ、 ペルォキ シダ一ゼ、 /3—ガラク トシダーゼ、 —ダルク口ニダーゼ、 CAT (クロラムフ ェニコールァセチルトランスフェラ一ゼ） 、 GF P (緑色蛍光タンパク質） 、 C F P (シアン蛍光タンパク質） および YF P' (黄色蛍光タンパク質） 等が挙げら れる。 好ましくは、 ルシフェラーゼ、 特にホタルルシフェラ一ゼ、 ゥミシィタケ ルシフェラーゼ、 発光パクテリ アルシフェラ一ゼおよびェクオリ ン、 アルカ リ フ ォスファターゼ、 特に分泌型アルカ リ フォスファタ一ゼ、 ペルォキシダーゼ、 特 にホースラディ ッシュペルォキシダ一ゼ、 G F P、 ]3—ガラク トシダ一ゼ、 — グルクロニダーゼならびに CATを用いる。
本発明では、 上記顆粒タンパク質とマ一カータンパク質との融合タンパク質を コー ドする遺伝子を導入した哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いる。 該融合タンパク質をコ一 ドする遺伝子の導入は、 当技術分野で通常用いられる方 法によって実施でき、 特に制限されない。 例えば、 顆粒タンパク質をコードする 遺伝子とマ一力一タンパク質をコー ドする遺伝子との融合遺伝子を哺乳動物由来 の肥満細胞または好塩基球に導入することによ り実施できる。 本発明において遗 伝子には、 DNAぉょびRNAが包含され、 好ましく は DN Aである。
顆粒タンパク質をコ一 ドする遺伝子とマーカータンパク質をコードする遺伝子 の融合は、 通常の遺伝子組換え手法により行う ことができる。 例えば、 まず顆粒 タンパク質をコ一ドする遺伝子とマーカ一タンパク質をコー ドする遺伝子をそれ ぞれクローニングする。 クローユングされた各遺伝子を制限酵素で消化し、 その 断片を連結して、 適当なベクタ一に組み込む。 用いるベクタ一は導入する細胞内 で、 融合タンパク質を発現しう るものであれば特に限定されない。 哺乳動物細胞 において通常用いられるベクターを使用できる。 該ベクターには、 プロモーター および融合タンパク質をコー ドする遺伝子のほか、 所望によりェンハンサ一等の シスエレメ ン ト、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 リ ボソーム結合配列 （S D配列） 等が連結されていてもよい。 プロモーターと し ては、 例えば、 S R aプロモーター、 SV4 0プロモータ一、 LTRプロモータ ―、 CMVプロモ一ター、 H S V— TKプロモータ一等が挙げられる。
具体的には、 p c DNA l . 1、 p c DNA'l . 1 / Am p , p CDM8、 p R E P (インビトロジェン社製） 、 p HM6、 p H B 6 (ロシュダイァグノステ イ ツクス社製） 、 p KK 2 2 3— 3、 p G E X (アマシャムフアルマシアバイオ テク社製） 、 p E T— 3、 p E T— 1 1、 B l u e s c r i p t l l S K (十） 、 p B l u e s c r i p t l l S K (―) (ス トラタジーン社製） 、 p UC 1 9、 p T r x F u s (インビトロジェン社製） 、 p UC 1 1 8、 p S T V 2 8 (宝酒造社製） 、 pMAL— c 2 X (N e w E n g l a n d B i o L a b s社製） 、 p AG E 1 0 7 (Cytotechnology, 3 (2), 133-140 (1990) ; 特開平 3 - 2 2 9 7 9 ) 、 p A G E 1 0 3 (The Journal of Biochemistry, 101 (5)， 1307-1310 (1987) ) 、 p A M o、 p A M o A ( The Journal of Biologycal Chemistry, 268 (30), 22782-22787 (1993)) 、 p AM o P R S A (特開平 5— 3 3 6 9 6 3 ) 、 A S 3 - 3 (特開平 2— 2 2 7 0 7 5 ) 等を用いることができる。 マーカータンパク質をコー ドする遺伝子は、 顆粒タンパク質をコ一 ドする遺伝 子の C末端側に付加されてもよく、 N末端側に付加されてもよい。 この際、 マー 力一タンパク質をコー ドする遺伝子と顆粒タンパク質をコー ドする遺伝子の間に ス ト ップコ ドンが現れないよ うにする。 マ一力一タンパク質をコードする遺伝子 と顆粒タンパク質をコー ドする遺伝子の間の距離は限定されず、 両者の間にリ ン カーが含まれていてもよい。 マーカータンパク質と顆粒タンパク質が翻訳される ためには、 両遺伝子のオープンリーディングフレームを合わせるようにする。 ま た、 特定のアミノ酸がリ ンカ一部位に含まれるよ うな塩基配列を、 両遺伝子の間 に有していてもよい。 本発明において融合タンパク質をコー ドする遺伝子は、 好 ましくは顆粒タンパク質をコ一 ドする遺伝子の下流にマーカ一タンパク質をコー ドする遺伝子が連結された融合遺伝子である。 また、 融合タンパク質をコー ドす る遺伝子は、 発現系のプロ一モータ一領域の 3 '末端側に連結される。
融合タンパク質をコー ドする遺伝子の導入は、 公知の方法、 例えばリボフエタ シヨ ン法、 リ ン酸カルシウム法および電気穿孔法等によ り行う ことができる。 遺 伝子導入法については、 具体的には実施例を参照することによってその詳細が説 明される力';、 個々の技術と して、 Maniatis、 T. ら、 Molecular Cloning 2nd ed. , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory u989)、 Innis, . A. ら, PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)等に記載の一般的技術が使用可能である。
顆粒タンパク質とマ一カータンパク質の融合タンパク質をコー ドする遺伝子が 導入された肥満細胞または好塩基球では、 該融合タンパク質が顆粒中に分泌され る。 従って、 肥満細胞または好塩基球がアレルギー原因物質と接触することによ つて脱顆粒が起こると、 融合タンパク質が細胞外に放出される。 この放出された 融合タンパク質を、 マーカ一タンパク質に基づいて検出することによって、 肥満 細胞または好塩基球における脱顆粒を検出することができる。 そして、 被検物質 の存在下で脱顆粒が検出された場合、 または、 被検物質の不在下と比べて脱顆粒 が促進された場合は、 該被検物質を脱顆粒を引き起こす物質、 すなわちアレルギ —原因物質と して同定することができる。 また、 マーカータンパク質を定量する ことによ り、 脱顆粒の程度を定量することもできるので、 アレルギー原因物質を 定量すること もできる。 従って、 一実施形態において、 本発明の検出方法は、
a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に被検物質を添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカ一タンパク質を検出する工程、 を含む。
培養培地に被検物質を添加することにより遺伝子導入された肥満細胞または好 塩基球と被検物質とを接触させると、 被検物質が I g Eを介してまたは直接 F c ε R Iを架橋した場合は、 脱顆粒反応が起こり融合タンパク質が細胞外に放出さ れる。
遺伝子導入された肥満細胞または好塩基球にさらに I g Eを反応させ、 F c £ R I と I g Eとの複合体を形成させておく こともできる。 I g Eと細胞を反応さ せることにより、 I g Eを介して F C E R Iの架橋を形成する物質を検出するこ とができる。 F c ε R Iは、 I g Εを.介して架橘された場合および直接架橋され た場合の双方について脱架橋を引き起こすが、 本発明の検出方法では、 F c E R I - I g E複合体を介して F c ε R Iの架橋を形成して脱顆粒を引き起こす物質、 および F c £ R I を直接架橋して脱顆粒を引き起こす物質の双方を検出すること ができる。
I g Eと肥満細胞または好塩基球との反応は、 被検物質の添加の前に行っても よいし、 同時に行ってもよいし、 被検物質の添加の後に行ってもよいが、 好まし くは、 被検物質の添加の前に行う。
本発明はまた、.哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害 する物質をスク リーニングする方法に関する。 該スク リーニング方法は、 哺乳動 物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマ一カー タンパク質との融合タンパク質をコ一ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来 の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする。
顆粒タンパク質とマーカータンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子が 導入された肥満細胞または好塩基球では、 該融合タンパク質が顆粒中に分泌され る。 そして、 上記のとおり、 細胞外に放出された融合タンパク質を、 マーカ一タ ンパク質に基づいて検出することによって、 肥満細胞または好塩基球における脱 顆粒を検出することができる。 従って、 肥満細胞または好塩基球において脱顆粒 を引き起こす物質、 すなわちアレルギー原因物質の存在下、 本発明の融合タンパ ク質をコードする遺伝子が導入された肥満細胞または好塩基球の培養培地に被検 物質を添加したときに、 該被検物質を添加しない場合と比べて、 融合タンパク質 の細胞外への放出が抑制された場合、 すなわち脱顆粒が抑制された場合は、 該被 検物質を脱顆粒を阻害する物質、 すなわちアレルギー反応を抑制する物質、 特に 即時型アレルギー反応を抑制する物質として同定できる。 従って、 本発明のスク リ一ユング方法により、 ァレルギ一性疾患に対する治療薬をスクリ一ユングする ことができる。 アレルギー性疾患は、 アレルギー反応の関与する疾患の総称であ り、 より具体的には、 アレルゲンが同定され、 アレルゲンへの曝露と病変の発症 に深い結びつきが証明され、 その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義 することができる。 アレルギー性疾患としては、 例えば、 気管支喘息、 アレルギ 一性鼻炎、 花粉症、 および昆虫アレルギー等が挙げられる。
従って、 一実施形態において本発明のスク リ ーニング方法は、 下記の工程： a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に、 該肥満細胞または好塩基球の脱顆粒を引き起こす物質の存在下、 被検物質を 添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカ一タンパク質を検出する工程、
を含む。
肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質としては、 公知のも のを使用でき、 例えば、 ダニ抗原や花粉抗原が挙げられる。 肥満細胞または好塩 基球において脱顆粒を引き起こす物質は、 被検物質の添加の前に添加してもよい し、 同時に添加してもよいし、 被検物質の添加の後に添加してもよいが、 好まし くは、 被検物質の添加と同時または後に添加する。
遺伝子導入された肥満細胞または好塩基球にさらに I g Eを反応させ、 F c ε R I と I g Εとの複合体を形成させておいてもよい。 そうすることにより、 I g Eを介した F c f . R Iの架橋の形成を阻害する物質を検出することができる。 F c ε R Iは、 I g Εを介して架橋された場合および直接架橘された場合の双方に ついて脱架橘を引き起こす。 本発明では、 F c ε R I — I g E複合体を介した F c ε R Iの架橋形成を阻害して脱顆粒を阻害する物質、 および F c ε R Iの直接 架橋を阻害して脱顆粒を阻害する物質の双方を検出することができる。
I g Εと肥満細胞または好塩基球との反応は、 被検物質の添加の前に行っても よいし、 同時に行ってもよいし、 被検物質の添加の後に行ってもよいが、 好まし くは、 被検物質の添加の前に行う。
本発明において、 融合タンパク質をコ一ドする遺伝子が導入された肥満細胞ま たは好塩基球の培養は、 当技術分野で通常用い'られる方法によって実施できる。 例えば、 ：！〜 2 0体積％ C O 2、 5〜 4 5 °Cで 1時間〜 1 0 0 日間、 必要に応じ て 1〜 7 日毎に培地交換しながら培養する。 好ましくは、 5 % C 0 2、 3 7 の 条件で、 2〜 3 日毎に培地交換しながら 1〜 3 6 3間培養する。
用いる培地としては、 R P M I培地、 M E M培地、 B M E培地、 D M E培地、 α M E M培地、 I M E M培地、 E S培地、 D M— 1 6 0培地、 F i s h e r培地、 F 1 2培地および W E培地等 （朝倉書店発行 「日本組織培養学会編 組織培養の 技術第三版」 5 8 1頁に記載の基礎培地） 、 これらの培地に血清成分 （仔ゥシ血 清、 ゥシ胎児血清等） 等を添加したもの、 並びに市販の無血清培地等が用いられ る。 これらのうち、 基礎培地に血清成分を加えたものが好ましい。
さらに培地中には必要に応じて、 他の成分と して、 アミ ノ酸類 （グルタミ ン、 ァラニルグルタ ミ ン、 アルギニン、 ヒスチジン、 イソロイシン、 ロイシン、 メチ ォニン、 フエ二ルァラニン、 スレオニン、 ト リプトファン、 チロシン、 ノくリ ン、 ァラニン、 ァスパラギン、 ァスパラギン酸、 グルタ ミン酸、 プロ リ ン、 セリ ンお ょぴグリ シン等） 、 ビタ ミ ン類 （ コ リ ン、 塩化コ リ ン、 ソ、。ン トテン酸カルシゥム、 葉酸、 ピリ ドキサール、 リボフラビン、 チアミ ン、 イノシトール、 ニコチンアミ ド、 グルタ ミ ン、 ビタ ミ ン Aおよびビタ ミン B 1 2等） 、 サイ トカイン類 （ィン ターロイキン等） 、 成長促進剤 （アルブミン、 ゥシ脳下垂体抽出物、 ニヮ ト リ胚 抽出液、 イ ンスリ ン、 トランスフェリ ン、 亜セレン酸ナ ト リ ウム、 メルカプトェ タ ノール、 ピルビン酸ナト リ ウム、 ヒ ドロ コルチゾンおよびエタノールァミ ン 等） 、 抗生物質 （ペニシリ ン、 ス ト レプトマイシン、 ネオマイシンおよびァクチ ノマイシン等） 、 安定化剤 （例えば、 酸化防止剤等） および p H調整剤 （例えば、 炭酸水素ナ ト リ ウム、 H E P E S、 炭酸ナト リ ウムおよびリ ン酸ナ ト リ ウム等） 等を含有させることができる。
肥満細胞または好塩基球の培養培地に添加する被検物質と しては、 特に制限さ れないが、 例えば、 ペプチ ド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞.抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿、 アレルギー原因 物質 （ア レルゲン） 等が用いられ、 これら物質は新規な物質であってもよいし、 公知の物質であってもよい。
本発明の検出方法およびスク リ一ニング方法では、 培地画分中のマーカータン パク質を検出することによ り、 脱顆粒により細胞外に放出された融合タンパク質 を検出する。 培地画分中のマーカータンパク質を検出するとは、 肥満細胞または 好塩基球中に含まれるマ一カータンパク質を除いた画分について検出を行う こと を意味する。 すなわち、 培養培地から細胞画分を分離し、 残った培地画分につい てマーカ一タンパク質の検出を行う。 細胞画分の分離は、 例えば、 遠心分離によ つて実施できる。 ，'
マーカータンパク質の検出は、 当業者であれば、 用いたタンパク質の種類に応 じて、 適宜実施できる。 例えば、 マーカ一タンパク質と して、 ノレシフェラーゼを 用いた場合は、 マグネシウム存在下、 ルシフェラーゼがルシフェリ ンと A T Pか ら酸化ルシフヱリ ンと A M Pをつく る反応を触媒する際に発する波長 5 6 0 n m の光をルミ ノメータ一を使って検出する。 例えば、 ホタルルシフェラーゼ活性は、 J . R . D e W e t らの方法 （Meth. Enzyraol. , 133, 3 , 1986) により測定す ることができる。 マ一カータンパク質として、 C A T (クロラムフエニコールト ランスフェラーゼ） を用いた場合は、 基質の [ 1 4 C ] クロラムフエ二コールが C A Tによりァセチル化されて [ 1 4 C ] ァセチルクロラムフエ二コールが産生 されるので、 このサンプルを酢酸ェチルで抽出し、 薄層シリカゲルプレート上に 展開後、 移動度の異なるスポッ トの放射活性を測定する。 また、 マーカ一タンパ ク質の検出は、 市販のキッ トを使用して実施することもできる。
本発明はまた、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き 起こす物質を検出するためのキッ ト、 および哺乳動物由来の肥満細胞または好塩 基球における脱顆粒を阻害する物質をスクリーニングするためのキッ トに関する。 本発明のキッ トは、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌さ れるタンパク質とマーカータンパク質との融合タンパク質をコ一ドする遺伝子が 導入された、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球、 あるいは該肥満細胞また は好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマ一カータンパク質との融合タ ンパク質をコードする遺伝子を含むベタター、 および哺乳動物由来の肥満細胞ま たは好塩基球、 を含むことを特徴とする。
本発明のキッ トには、 前記遺伝子が導入された肥満細胞または好塩基球、 ある いは融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベタターに加えて、 その他の要素 を付加的に組み合わせることができる。 例えば、 対照と して用いる細胞、 対照に 用いる被験物質、 マーカ一タンパク質を検出するための基質や試薬を組み合せる ことができる。 具体的には、 前記遺伝子が導入されていない肥満細胞または好塩 基球は、 対照実験に有用である。 また対照に用いる被験物質としては、 脱顆粒を 引き起こす作用が知られている物質 （陽性対照） 、 または脱顆粒を引き起こさな いことが確認されている物質 （陰性対照） を用いることができる。 哺乳動物由来 の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害する物質をスクリ一ユングする ためのキッ 卜においては、 さらに哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球におけ る脱顆粒を引き起こす物質、 すなわちアレルギー原因物質 （アレルゲン） を組み 合わせることができる。
本発明のキッ トには更に細胞の培養のための培地、 および培養容器をパッケ一 ジすることができる。 培養容器は、 ハイスル一,プッ トスク リーニングに適用でき る形状とするのが有利である。 更に本発明のキッ トには、 アツセィ方法を説明す るためのイ ンス トラクションマニュアルを組み合せることもできる。 実施例
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に限 定されず、 様々な実施形態が可能であり、 本明細書および図面に開示の思想に従 つたものであるかぎり、 すべての実施形態を包含することが理解されるべきであ る。
[実施例 1 ] 肥満細胞顆粒タンパク質一ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現す るプラスミ ドの構築
( 1 ) マウス由来肥満細胞様細胞 MCZ 9細胞より全 R N Aを抽出し、 逆転写反 応により c DN Aを作成した。 この c DNAを铸型にP C R反応を行った。 増幅 はマウス顆粒タンパク質として知られている C h ym a s e 1、 MC P 2、 M C P 7を対象とした。 それぞれの P CRプライマ一を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000014_0001
増幅が確認された P C R反応液を铸型に、 再度、 KO D D a s h DNAポ リメラ一ゼを用いて P CR反応を行った。 このとき使用したプライマーとしては、 後にプラスミ ドに揷入し易くする目的で制限酵素認識配列を含む表 2に示すブラ イマ一を用いた。 表 2
Figure imgf000014_0002
各工程の詳細は以下のとおりである。
a ) 増幅断片の T Aクローニング
得られた増幅 DNAは、 ァガロース電気泳動で切り出し精製した後、 断片をべ クタ一 p CR 4に挿入し、 T Aクロ一エングした。
b ) 得られたクローンの配列確認
得られたクローンは、 制限酵素マッピングによ り揷入断片を確認後、 DNAシ ーケンシングにより全配列の確認を行った。
( 2) クローユングしたプラスミ ドのインサー ト領域についてシーケンシングを 行い、 配列の確認を行った。 T Aクローユングした C h y m a s e 1遺伝子挿 入プラスミ ドを制限酵素消化後、 C h ym a s e 1領域を含む D N A断片をァ ガロース電気泳動で切り出し精製した。 この精製断片を p G L 3 B a s i cべク ターにライゲ一シヨ ンし、 これを用いて大腸菌を形質転換した。 形質転換後各コ ロニ一からプラスミ ドを精製し、 挿入断片の有無を確認し、 挿入が確認されたク ローンについては挿入領域および揷入領域前後の配列のシーケンシングを行った。 得られたプラスミ ドを pMC P O 1 と命名した。 このプラスミ ドから C h ym a s e 1領域とこれの下流に連結されたルシフェラーゼ領域を制限酵素 K p n I、 X b a Iで切り出し、 ァガロース電気泳動で精製した。 この精製断片を p c DN A 3. 1ベクターの K p n I、 X b a I領域にライゲ一シヨ ンし、 これを用いて 大腸菌を形質転換した。 形質転換後各コロニーからプラスミ ドを精製し、 揷入断 片の有無を確認し、 挿入が確認されたクローンについては挿入領域および挿入領 域前後の配列のシーケンシングを行った。 得られたプラスミ ドを pMC P 0 2と 命名した。 プラスミ ド構築の過程を図 1に示す。
このプラスミ ドを制限酵素 K p n I、 E c o R Iで開列し、 ァガロース電気泳 動で精製した。 このべクタ一に、 先にクローニングしておいたプラスミ ドから M C P 2、 MC P 7の領域をそれぞれ K p n l— E c o R I、 K p n l — Mu n i で切り出し精製後、 これをライゲーシヨンし、 大腸菌を形質転換した。 形質転換 後各コロニーからプラス ミ ドを精製し、 揷入断片の有無を確認し、 挿入が確認さ れたクローンについては揷入領域および挿入領域前後の配列のシ一ケンシングを 行った。 MC P 2由来よ り得られたプラスミ ドを pMC P 0 3 (MC P 2—ルシ フェラーゼ） 、 MC P 7由来より得られたプラスミ ドを pMC P 0 7 (MC P 7 ールシフェラーゼ） と命名した。 これらプラスミ ド構築の過程を図 2に示す。 各 工程の詳細は以下のとおりである。 '
a ) 制限酵素消化
各制限酵素マニュアルに従い実施した。 すなわち、 各 DNA溶液と酵素に添付 の X 1 0バッファー、 蒸留水、 制限酵素を混合し、 通常 3 7 °Cで 2時間反応させ た。
b ) 消化後の DNA断片精製 .
ァガロースゲル電気泳動で分離し、 Q I AG E N社製キッ トを使用してゲルか ら精製した。 すなわち、 目的 D N Aを含んだゲルを加熱融解し、 DNAをシリカ 膜に結合させた。 シリカ膜をエタノールを含む溶液等で洗浄した後、 蒸留水で溶 出した。
c ) DNAライゲーシヨ ン
T AK A R A社製 D N A l i g a t i o n K i t V e r . 2を使用した。 すなわち、 目的 D N Aを混合し、 キッ トの反応混合液 （ s o 1 n I ) を等量加 え、 1 6でで 3 0分間静置することにより DN Aをライゲーショ ンした。
d) 形質転換
T O Y O B O社製 C o mp e t e n t C e l l E . c o 1 i DH 5 a、 あるいは I n v i t r o g e n社製 I n v a F ' を使用した。 融解した 1 0〜 5 0 m 1 コンビテン トセルを氷上で D N Aと 30分間混合して静置し、 4 2 °Cで 5 0秒間ヒー トショ ック後、 氷上に戻し、 2分後 3 7 °Cに暖めておいた S O C培地 を 4 5 Om l添加し、 3 7 °Cで 1時間インキュベー トした。 この溶液をサークル グロ一培地 Am p +プレー トに 1 00m l Zp 1 a t e展開し、 3 7 で 1 6時 間培養した。
e ) 培養
プラスミ ド精製の目的での培養は培地サークルグロ一を用いて実施した。 プラ スミ ド産生の選択圧にはアンピシリ ン耐性を利用し、 終濃度 1 00 m g/m 1の アンピシリ ンを用いた。 培養は試験管振盪器で、 3 7°Cで 8〜 1 6時間行った。 f ) P C R
K O D DNAポリ メラ一ゼを使用した （Demo SDら、 Cytometry, 1999， Aug, 1;36(4) :340 - 8 、 Taupenot L ら 、 A. J. Cell Sci. 2002, Dec 15;115(Pt 24) :4827-41) 。 铸型 DNA 0.5μ1
プライマ一対（lOpmol/μΙ) 2μ1
2raM dNTP 5μ1
25mM MgS04 2μ1
X10 buffer 5μ1
蒸留水 34.5 1
計 4 μ1
この溶液を 94 °Cで 3分間インキュベー ト後、 5 /zZm lの KOD 1 m l を 添加した。 反応サイクルは、 9 4°C 3 0秒間、 6 0°C 2秒間、 74 °C 3 0 秒間と した。 以上のステップを 3 5回繰り返し最後に 74°Cで 9. 5分間反応さ せた。 g ) TAクローニング
T Aクロ一ニングはインビトロジェン社製 TO PO TAク ロ一ニングシステ ムを用いた。 T Aクローニングに用いる P C R増幅断片は、 KODポリ メラ一ゼ で増幅した DNAを铸型に、 KOD D a s h D N Aポリ メ ラーゼによる P C Rで再増幅し、 DN A末端にアデ二ル基を付加したものを使用した。 方法は同社 マニュアルに従い実施した。
[実施例 2] 顆粒タンパク質一ルシフヱラーゼ融合タンパク質発現プラスミ ドの トランスフエクシヨ ン
実施例 1で作成したプラスミ ド pMC P O 2、 pMC P O 3、 pMC P O 7を マゥス由来肥満細胞 MCZ 9に トランスフヱクシヨ ンした。 トランスフエクショ ンはリポフエクシヨ ン法を用いて実施した。 6—ゥエルプレー トに 0. 5m lの O p t i —MEM (登録商標） I血清低減培地を添加した。 ゥエルに 6 μ 1 の D MR I Ε— C試薬を添加し、 プレー トを回して軽く混合した。 ゥエルに 4 gの D N Aを含む O p t i — MEM (登録商標） I血清低減培地 0. 5 m l を添加し た。 プレー トを回して混合した。 室温で 1 5〜 4 5分間インキュベーショ ンして 複合体を形成させた。 各ゥュルに、 血清を含まない O p t i — MEM培地に懸濁 した S X l o e c e l l s /O . 2m l の細胞を添加した。 軽く混合し、 4〜 5 時間にわたり、 5 %C O 2の条件で 3 7 °Cにてインキュベー ト した。 各ゥエルに 1 5 %の F B Sを含む增殖用培地 2 m 1 を添加した。 トランスフエクシヨ ン 24 〜 4 8時間後に細胞をアツセィ して活性を測定した。
MC/ 9細胞の培養は、 D u l b e c c o ' s MEM H i g h G l u e o s e培地 （G I B C O社製） を使用し、 3 7 °C、 5 % C O 2、 1 0 0 %湿潤条 件下、 炭酸ガスインキュベータ一内で行った。 培地には I CN社製ゥシ胎児血清 1 0%、 および R a t T - S T I (G I B CO社製） 1 0% ( V/ V) を添 加した。
[実施例 3] 融合タンパク質の発現確認
実施例 2で作成した形質転換体を用い、 トランスフエクシヨ ン 4 8時間後にお ける融合タンパク質の発現をウェスタンプロ ッティング法によ り確認した。 細胞 を S D S電気泳動用可溶化液で可溶化し、 S D,S電気泳動した。 ゲルはゲル支持 プレー トから分離し、 予めメタノールに浸しておいた PVD F膜にエレク トロブ ロ ッテイングした。 エレク トロブロ ッテイングはザルト リ ウス社製セミ ドライブ 口 ッタ一を使用した。 方法は同社マニュアルに従い実施した。
プロ ッティ ング後の P VD F膜は、 B 1 o c k A (原液） を用いて室温 3 0分 間ブロッキングし、 一次抗体と と もに室温で 2時間インキュベー ト した。 一次抗 体にはャギ抗ルシフェラーゼポリ クローナル抗体を用いた。 P B Sで洗浄後、 2 次抗体と しての抗ャギ I g G— HR P抗体とともに室温 1時間ィンキュベ一トし、 洗浄後 Am e r s h a m B i o t e c h社製ィムノブロッティング発光キッ ト で発光を行った。 方法は同社マニュアルに従い実施した。 p MC P 0 2、 p MC P 0 3、 p MC P 0 7を遺伝子導入した各細胞由来の特異的バンドがそれぞれお よそ 9 6 0 0 0付近に確認された。 このことから遺伝子導入によりそれぞれ目的 遺伝子が発現していることが確認された。
[実施例 4 ] 融合タンパク質のルシフエラーゼ活性確認
トランスフエクシヨ ン 4 8時間後における融合タンパク質のルシフェラ一ゼ活 性を測定した。 0. 5 m 1 の細胞培養液に 1 0 0 mMのカルシウムィオノフォア A 2 3 1 8 7 (A l o m o n e L a b s社製） ェタノ一ル溶液 5 m 1 を添加し た。 3 7 °C、 5 % C O 2下で 2 0分間培養を継続した。 細胞を 5 0 0 0 r p mで 1分間遠心分離し、 上清を分離し、 これを培地画分とした。 沈殿画分 （細胞） を C e l l L y s i s R e a g e n t ( p r o m e g a社製） で懸濁し、 攪拌 後 1 5 0 0 0 r p m、 5分間遠心分離し、 上清を細胞画分とした。 両画分のルシ フェラ一ゼ活性をルシフェラ一ゼ測定キッ ト （ p r o m e g a社製） により測定 した。 測定結果 （蛍光カウント/分） を表 3および図 3に示す。 表 3
Figure imgf000018_0001
以上から、 顆粒タンパク質一ルシフェラーゼ融合タンパク質発現プラスミ ドを 導入した肥満細胞により、 カルシウムィオノフォアによって引き起こされた脱顆 粒を検出できることが示された。
[実施例 5 ] C h y a m s e 1—アルカリフォスファタ一ゼ融合タンパク質お よび MC P 7—アルカ リ フォスファターゼ融合タンパク質発現プラスミ ドの構築 実施例 1で得られたプラスミ ド p MC P 0 2および pMC P 0 7を制限酵素 E c o R X b a Iで開裂し、 べクター領域を'ァガロース電気泳動で精製した。 この開列ベクターに、 市販のアルカリフォスファターゼ （以下 A L Pと呼ぶ） 遺 伝子含有プラス ミ ド p S E A P 2 B a s i c (B D B i o s c i e n c e s C 1 o n t e c h社製） からアル力リフォスファターゼ領域を E c o R I、 X b a Iで切り出し、 精製後これをライゲーシヨ ンし、 大腸菌を形質転換した。 形質 転換後各コロニーからプラスミ ドを精製し、 挿入断片の有無を確認し、 挿入が確 認されたクローンについては挿入領域および挿入領域前後の配列のシーケンシン グを行った。 シーケンシングは目的配列と完全に一致した。 pMC P 0 2由来よ り得られたプラスミ ドを PMC P 1 4 (C h ym a s e 1— AL P) 、 p MC P 0 7由来よ り得られたプラスミ ドを p MC P 1 5 (MC P 7— AL P) と命名 した。 構築の過程を図 4に示す。
[実施例 6 ] 顆粒タンパク質一 A L P融合タンパク質発現プラスミ ドの トランス フエク ショ ン
実施例 5で作成したプラスミ ド pMC P 1 4、 pMC P 1 5をマウス由来肥満 細胞 MCZ 9に トランスフ： ϋクショ ンした。 方法は実施例 2と同様の方法により 実施した。
[実施例 7 ] 融合タンパク質の A L Ρ活性確認
トランスフエクシヨ ン 4 8時間後における A L P融合タンパク質の A L P活性 を測定した。 0. 5 m 1 の細胞培養液に 1 00 mMのカルシウムィオノフォア A
2 3 1 8 7 (A l o mo n e L a s社製） ェタノール溶液 5 m 1 を添加した。
3 7°C、 5 % C O 2下で 2 0分間培養を継続した。 細胞を 5 0 0 0 r p mで 1分 間遠心分離し、 上清を分離しこれを培地画分と した。 沈殿画分 （細胞） を C e 1 1 L y s i s R e a g e n t (p r om e g a社製） で感濁し、 攪拌後 1 5 0 00 r p m, 5分間遠心分離し、 上清を細胞画分と した。 両面分の A L P活性 を AL P測定キッ ト （BD B i o s c i e n c e s C l o n t e c h社製、 G r e a t E s c A P e S EA P C h e m i l u m i n e s c e n c e D e t e c t i o n K i t ) によ り測定した。 測定結果 （蛍光力ゥント/分） を表 4および図 5に示す。 表 4
Figure imgf000019_0001
以上から、 顆粒タンパク質一 AL P融合タンパク質発現プラスミ ドを導入した 肥満細胞によ り、 カルシウムィオノフォアによって引き起こされた脱顆粒を検出 できることが示された。 ，：
[実施例 8〗 2 , 4—ジニ トロフヱニル化ヒ ト血清アルブミ ンの検出
実施例 2に示す方法で顆粒タンパク質ールシフユラーゼ融合タンパク質発現プ ラスミ ドを導入したマウス由来肥満細胞 MCZ 9を使用した。 トランスフエクシ ヨ ンの 24時間後、 細胞を遠心分離し （ 3 0 0 X g、 3分） 、 細胞を 1 06 c e 1 1 s /m 1 となるよ う培地で懸濁し、 ここに M o n o c l o n a l Mo u s e I g E a n t i — D N P (ャマサ醤油製）を終濃度 1 00 n g Zm 1 となる ように添加した。 2 4時間培養を継続し、 細胞を M o d i f i e d T y r o d e ' s b u f f e r (MT) ( 1 3 7 mM N a C l 、 2. 7 mM K C し 1 . 8 mM C a C l 2、 1 m M M g C l 2、 5 . 6 m M g l u c o s e、 2 0 mM H E P E S、 0. 1 % B S A、 p H 7. 4 ) で 2回遠心洗浄した ( 3 0 0 X g、 3分） 。 細胞を 1 0 6 c e 1 1 s /m 1 となるよう同バッファー で懸濁し、 2 4ゥヱルプレートに 1 m 1 Zゥヱルで分注した。 ここに、 各種濃度 の 2， 4 —ジニ トロフエニル化ヒ ト血清アルブミ ン （D N P— H S A、 シグマ社 製） を 1 O ra 1ノゥヱル添加し、 よく混合し （最終濃度 3 0 0 0〜 4 6 . 9 p g /m l ) , 3 7 °Cで、 3 0分間培養を継続した。 細胞を 3 0 0 X gで 1分間遠心 分離し、 上清を分離し、 これをサンプルとした。 サンプルのルシフヱラ一ゼ活性 をルシフェラーゼ測定キッ ト （P r o m e g a社製） により測定した。 測定結果 を表 5及び図 6に示す。 表 5
Figure imgf000020_0001
以上の結果から、 顆粒タンパク質一ルシフヱラーゼ融合タンパク質発現プラス ミ ドを導入した肥満細胞により、 2 , 4 —ジニトロフエニル化ヒ ト血清アルブミ ンによって引き起こされた脱顆粒を検出できることが示された。 すなわち、 本発 明の方法によって試料中に含まれる脱顆粒を引き起こす物質を検出することがで き、 また当該物質が多いほど大きな発光シグナルが検出され、 当該物質の定量も 可能であることが示された。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書中にとり入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質を 検出する方法であって、
哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質と マーカータンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された、 哺乳 動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする、 前記方法。
2 . 下記の工程：
a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に被検物質を添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカ一タンパク質を検出する工程、
を含む、 請求の範囲第 1項記载の方法。
3 . 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害する物質をス クリーニングする方法であって、
哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質と マーカ一タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された、 哺乳 動物由来の肥満細胞または好塩基球を用いることを特徴とする、 前記方法。
4 . 下記の工程：
a ) 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球の培養培地 に、 該肥満細胞または好塩基球の脱顆粒を引き起こす物質の存在下、 被検物質を 添加する工程、 および
b ) 培地画分中のマーカータンパク質を検出する工程、
を含む、 請求の範囲第 3項記載の方法。
5 . 前記遺伝子が導入された哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球に I g Eを 反応させる工程をさらに含む、 請求の範囲第 2'項または第 4項記載の方法。
6 . 前記導入された遺伝子が、 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球内の顆粒 中に分泌されるタンパク質をコ一ドする遺伝子の下流にマーカータンパク質をコ 一ドする遺伝子が連結された融合遺伝子である、 請求の範囲第 1項〜第 5項のい ずれか 1項記載の方法。
7. 該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質が、 キマーゼ、 カルボキシぺプチダーゼ、 ト リプターゼ、 MC P 1、 MC P 2、 MC P 4、 MC
P 7、 MC P 9、 ]3—へキソサミニダーゼおよびバソグラヌ リ ンからなる群から 選択される、 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項記載の方法。
8. マーカータンパク質が、 シフェラーゼ、 ァノレカ リ ホスファターゼ、 ぺノレオ キシダーゼ、 ]3—ガラク トシダ一ゼ、 —ダルク口ニダーゼ、 CAT (クロラム フエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ） 、 ェクオリ ン、 G F P (緑色蛍光タ ンパク質） 、 C F P (シアン蛍光タンパク質） および YF P (黄色蛍光タンパク 質） からなる群から選択される、 請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれか 1項記載 の方法。
9. 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球において脱顆粒を引き起こす物質を 検出するためのキッ トであって、
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカ一タン パク質との融合タンパク質をコー ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来の肥 満細胞または好塩基球、 または
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカ一タン パク質との融合タンパク質をコー ドする遺伝子を含むベクタ一、 および哺乳動物 由来の肥満細胞または好塩基球、
を含む、 刖記キッ ト。
1 0. 哺乳動物由来の肥満細胞または好塩基球における脱顆粒を阻害する物質を スク リーニングするためのキッ トであって、
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカ一タン パク質との融合タンパク質をコ一 ドする遺伝子が導入された、 哺乳動物由来の肥 満細胞または好塩基球、 または
該肥満細胞または好塩基球内の顆粒中に分泌されるタンパク質とマーカ一タン パク質との融合タンパク質をコー ドする遺伝子を含むべクター、 および哺乳動物 由来の肥満細胞または好塩基球、
を含む、 ¾リ記キッ ト。
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016212A2 (en) * 2002-08-14 2004-02-26 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeting secretory lysosomes

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