ES2329934T3

ES2329934T3 - Mejoras relativas a apositos para la piel.

Info

Publication number: ES2329934T3
Application number: ES06726369T
Authority: ES
Inventors: Jan Jezek; Lynne Patricia Watson
Original assignee: Insense Ltd
Current assignee: Insense Ltd
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2026-03-10
Also published as: CA2599287C; US20090081279A1; AU2006221794A1; KR20070112158A; EP1855731B1; WO2006095193A2; DE602006008280D1; AU2006221794B2; GB0505035D0; JP2008532605A; WO2006095193A3; CA2599287A1; ATE438417T1; DK1855731T3; CN101137403A; EP1855731A2

Abstract

Un apósito de piel adaptado, al activarse, para liberar uno o más S-nitrosotioles, en donde los uno o más Snitrosotioles se generan haciendo reaccionar juntos en el apósito reactivos que comprenden un nitrito y un tiol.

Description

Mejoras relativas a apósitos para la piel.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a apósitos para la piel para aplicación a una parte de un cuerpo humano o animal para tratamiento de la piel (para propósitos terapéuticos o cosméticos), y se refiere en particular (pero no exclusivamente) a apósitos de heridas para tratamiento de piel en peligro, particularmente lesiones de la piel, es decir cualquier interrupción en la superficie de la piel, sea causada por lesión o enfermedad, con inclusión de úlceras de la piel, quemaduras, cortes, pinchazos, laceraciones, traumatismos ciegos, lesiones de acné, forúnculos, etc. El término "apósito para la piel" abarca apósitos tales como parches, tiritas, vendajes y gasas, etc. para uso en conexión con el suministro transdérmico de agentes. El término incluye también material en forma amorfa o líquida. El término abarca apósitos para aplicación a superficies corporales en general, con inclusión de tejidos internos y externos, particularmente la piel con inclusión del cuero cabelludo. La invención está basada en las propiedades beneficiosas del óxido nítrico (NO).

Antecedentes de la invención Propiedades físicas y químicas del óxido nítrico

El óxido nítrico (NO) es una sustancia gaseosa inestable de vida corta. Su inestabilidad es debida al electrón no apareado del nitrógeno:

1

Como sustancia inestable con un electrón no apareado, el óxido nítrico puede describirse como un radical libre. Sin embargo, comparado con los radicales libres típicos (v.g. el radical hidroxilo o superóxido), cuya vida útil es del orden de milisegundos, el óxido nítrico es relativamente estable. Típicamente, se convierte en una especie química más estable en el transcurso de segundos después de su producción. Así, por ejemplo, sí el óxido nítrico se pone en contacto con el aire, reacciona rápidamente con el oxígeno para generar dióxido de nitrógeno (que es un gas de color pardo) como sigue:

(1)2NO+O_{2} \rightarrow 2NO_{2} \rightarrow N_{2}O_{4}

En ciertas condiciones, por ejemplo en estado gaseoso puro, NO puede almacenarse sin pérdidas importantes durante un tiempo muy largo. El mismo es también relativamente estable en soluciones acuosas desoxigenadas
puras.

El NO es un compuesto muy hidrófobo y su solubilidad en agua es por consiguiente limitada; la solubilidad máxima alcanzable en agua en condiciones normales es aproximadamente 1,7 mM, siendo la solubilidad similar a la del oxígeno.

En soluciones acuosas, la oxidación del óxido nítrico disuelto por el oxígeno disuelto tiene lugar como se muestra en el esquema de reacción siguiente. No obstante, dadas las constantes de velocidad y las bajas concentraciones de NO y O_{2} disueltos, esta reacción no es tan rápida como en el estado gaseoso, donde la concentración de oxígeno es muy alta. Sin embargo, la reacción se acelera en un ambiente heterogéneo que contenga agua y lípidos. En ambientes hidrófobos puros (v.g. membranas lipídicas) la reacción se acelera tanto como 300 veces. Una vez producido, el dióxido de nitrógeno reacciona rápidamente con otra molécula de óxido nítrico dando lugar a trióxido de dinitrógeno (N_{2}O_{3}). N_{2}O_{3} es un agente de nitrosación potente capaz de convertir tioles en nitrosotioles. Por hidratación, N_{2}O_{3} produce ácido nitroso que se disocia a nitrito. El nitrito se oxida en presencia de oxígeno a nitrato.

2

Óxido nítrico y radicales libres

Aunque el óxido nítrico puede describirse como un radical libre (véase arriba) el mismo es también un agente de barrido importante de otro radical libre potente denominado superóxido (O_{2}^{-}). La relación de óxido nítrico con superóxido da como resultado la generación de peroxinitrito:

3

El peroxinitrito es un oxidante y agente de nitración fuerte. Durante su corta vida, puede funcionar como un producto químico tóxico por oxidación, por ejemplo, de partes de las membranas celulares y destrucción consiguiente de la célula. El peroxinitrito es por tanto una herramienta útil en la lucha contra las bacterias infecciosas. Es de destacar que su potencia para deteriorar las células del hospedador es mínima debida a la rápida reacción de isomerización que convierte el peroxinitrato (sic) en nitrato:

4

Cualquier exceso de peroxinitrato se convierte así en una especie benigna (nitrato), que es ideal para la excreción en la orina. Esto impide una acumulación de peroxinitrato capaz de causar un daño importante a las células del hospedador.

S-nitrosotioles

Los S-nitrosotioles (a los que se hace referencia a veces simplemente como nitrosotioles) son compuestos capaces de liberar óxido nítrico. Los S-nitrosotioles pueden producirse por nitrosación de tioles utilizando N_{2}O_{3} (ecuación 4) o catión nitrosonio (ecuación 5) como el agente de nitrosación:

5

Si bien el proceso que utiliza N_{2}O_{3} como la especie de nitrosación es muy importante in vivo, el segundo proceso es útil para la producción de nitrosotioles in vitro. El catión nitrosonio puede generarse a partir de nitrito a pH ácido:

6

Los S-nitrosotioles pueden producirse por tanto fácilmente en laboratorio por mezcla de un tiol (v.g. glutatión) con una fuente de nitrito (v.g. nitrito de potasio) en solución ácida. La reacción transcurre a pH <6, aumentando la velocidad de la reacción con la acidez de la solución:

7

Los nitrosotioles pueden desprender óxido nítrico libre por descomposición espontánea:

8

La velocidad de descomposición varía considerablemente dependiendo de la cadena lateral del tiol. Por ejemplo, mientras que la nitrosocisteína puede descomponerse totalmente en unos minutos en condiciones normales, son necesarios horas/días para alcanzar 100% de descomposición del nitrosoglutatión. La descomposición se acelera generalmente en presencia de Cu^{2+} y Hg^{2+}.

WO 98/20015 describe un compuesto que comprende un grupo S-nitrosotiol enlazado por un resto de intercalación a un resto de mono-, di-, o trisacárido estabilizando el resto de intercalación el grupo S-nitrosotiol, con lo que se ralentiza su degradación. Se describen parches transdérmicos, en los que el S-nitrosotiol se encuentra en forma activa, es decir funcionando para generar óxido nítrico sin requerir activación.

Los nitrosotioles son también capaces de donar óxido nítrico directamente a otro grupo tiol. Este proceso, que se conoce como trans-nitrosación, es muy común in vivo:

9

El óxido nítrico en los sistemas biológicos Sintasa de óxido nítrico

La Sintasa de Óxido Nítrico (NOS) es la enzima que genera NO in vivo a partir de L-arginina:

10

Aparte de los sustratos (L-arginina y oxígeno), la enzima requiere la presencia de los cofactores nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADPH) y tetrahidrobiopterina (BB).

La enzima existe en tres isoformas diferentes. Cada isoforma sintetiza NO pero lo hace en condiciones distintas.

NOS1 (o nNOS) es la isoforma neural que puede encontrarse en las neuronas. El óxido nítrico generado por esta isoforma está implicado en la transmisión sináptica, el procesamiento de la información nerviosa a través de las lagunas entre las neuronas.

NOS2 (o iNOS) es una forma inducible que es producida por los macrófagos. NOS2 requiere varias horas para movilizarse, y la respuesta es debida a una lesión o proceso infeccioso. Esta enzima genera concentraciones extremadamente altas de NO, en parte para destruir bacterias y en parte para iniciar procesos de reparación de tejidos. Dicho de otro modo, cuando el cuerpo inicia una respuesta inflamatoria a una lesión, los macrófagos son atraídos al sitio de la lesión, donde producen localmente concentraciones elevadas de NO (100 a 1000 veces la normal). Al contrario que NOS1, que es activa en todo momento como parte de la neurotransmisión normal, debe existir algo anormal (una herida, deterioro tisular, hipoxia, infección bacteriana, etc.) para inducir iNOS.

La tercera isoforma es NOS3 (o eNOS). Esta isoforma es activa en todo momento y se encuentra en las células endoteliales (las células que revisten la superficie interna de los vasos sanguíneos y los conductos linfáticos). El NO producido por eNOS mantiene el diámetro del vaso sanguíneo a fin de que la perfusión de los tejidos (piel, músculo, nervios y hueso) se mantenga a niveles óptimos. Adicionalmente, el NO mediado por eNOS causa neovascularización, que es el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Éste es especialmente importante en la curación de úlceras o heridas en la piel.

Efectos biológicos del óxido nítrico

El óxido nítrico tiene una multitud de efectos en los tejidos vivos. El mecanismo de estos efectos está basado casi siempre en la interacción del óxido nítrico sea con componentes metálicos (típicamente hierro) o con grupos tiol de enzimas clave y otras proteínas. Dependiendo de la enzima particular, dicha interacción puede conducir a activación o inhibición de la enzima. Un ejemplo de un efecto basado en la activación de la enzima es el de la vasodilatación; el óxido nítrico se fija al hierro del hemo de la enzima guanilato-ciclasa, lo cual da como resultado un cambio de conformación dejando expuesto el sitio catalítico de la enzima. Esto conduce a una conversión catalítica de GTP en cGMP. Esta conversión inicia la cascada completa de reacciones que conducen a la fosforilación de la proteína y relajación muscular (vasodilatación).

Otros efectos basados en la activación de enzimas o factores de crecimiento por el óxido nítrico incluyen la estimulación de la división celular (proliferación) y la maduración celular, estimulación de la diferenciación celular y formación de receptores celulares, neovascularización, formación de fibroblastos en la herida y con ello el aumento de la formación de colágeno, etc. Resumidamente, el óxido nítrico es el punto central de regulación del crecimiento y la diferenciación celular.

Sin embargo, el óxido nítrico es capaz también de causar el efecto opuesto, es decir la muerte celular. Esto puede ocurrir típicamente por la fijación de NO al hierro de las agrupaciones hierro-azufre de enzimas vitales (v.g. las enzimas implicadas en la cadena respiratoria tales como el citocromo c), que conduce a la inhibición enzimática y la muerte celular subsiguiente. Existen también algunas pruebas experimentales que sugieren que NO puede estimular el gen responsable del proceso denominado apoptosis o muerte celular programada. La apoptosis es el proceso continuo implicado en el mantenimiento diario de los órganos maduros por eliminación de las células envejecidas o defectuosos que están siendo reemplazadas por células nuevas.

La implicación del óxido nítrico en un gran número de procesos de importancia fundamental, como se ha reseñado resumidamente arriba, hace que esta molécula sea el punto central en la regulación del crecimiento y mantenimiento de los tejidos vivos sanos. Su importancia en la reparación de los tejidos dañados es aún mayor, y se reseña brevemente en la sección siguiente.

US 6.103.275 describe un sistema biocompatible para generar óxido nítrico reuniendo un nitrito, un reductor y un ácido particular. El nitrito y el ácido se mantienen típicamente separados hasta el momento de su utilización.

WO 03/017989 describe una composición de apósito para la piel que comprende un donante de óxido nítrico junto con un precursor de nitrosotiol. Durante el uso del apósito, el donante y el precursor penetran en el sitio de la herida y generan óxido nítrico en la herida, que reacciona con el precursor en la herida para generar nitrosotioles in vivo.

El óxido nítrico en la curación de las heridas

Tanto iNOS como eNOS juegan un papel importante en la reparación de los mecanismos de curación de las heridas. En la primera etapa del proceso normal de curación de las heridas, se genera NO a partir de iNOS a fin de (I) combatir la infección, (II) eliminar de modo irreversible el tejido necrótico dañado, y (III) iniciar la neovascularización. A esto se hace referencia a menudo como la etapa inflamatoria de la reparación de las heridas. Típicamente, esta fase dura del orden de 10 días. Hacia el final de esta fase, el tejido de granulación es robusto. La neovascularización da como resultado el aumento de actividad de eNOS que reemplaza gradualmente a iNOS.

La actividad incrementada de eNOS causa neovascularización y vasodilatación ulteriores para continuar el proceso de curación. La vasodilatación aumenta el suministro de sangre tanto a los tejidos de reparación como lejos del tejido lesionado. Esto último elimina los productos metabólicos de desecho, reduce el edema, y previene el hinchamiento que en caso contrario comprimiría los capilares. En ausencia de un suministro adecuado de sangre, el tejido se mantendrá hipóxico y curará sólo lentamente, en todo caso. Además, dado que iNOS es producida en gran parte por los glóbulos blancos de la sangre, la vasodilatación permite el suministro de glóbulos blancos adicionales al área que precisa ser protegida contra la infección.

En los pacientes diabéticos, sin embargo, la actividad de eNOS es a menudo muy inferior a la normal, por lo que estos pacientes no pueden producir NO a niveles normales y la curación de las heridas se retarda por ello. La disponibilidad de NO se ve reducida también en los pacientes diabéticos por una producción incrementada de superóxido que arrastra el NO, y por la producción de dimetilarginina (debida a la disfunción renal), que es el inhibidor competitivo de NOS.

La vascularización insuficiente y el estrés excesivo por oxidación (es decir, producción elevada de superóxido) limitan también los efectos beneficiosos de NO en la curación de las úlceras venosas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un apósito para la piel adaptado, por activación, para liberar uno o más S-nitrosotioles, en donde el uno o más S-nitrosotioles se generan haciendo reaccionar juntas sustancias reaccionantes que comprenden un nitrito y un tiol en el apósito.

El apósito es por consiguiente inactivo, en el sentido de que no libera uno o más w S-nitrosotioles (sic) hasta que se activa. La invención se refiere por tanto a un apósito para la piel inactivo, es decir, un apósito en una forma en la cual el mismo no actúa para liberar uno o más S-nitrosotioles. Sin embargo, el apósito puede activarse, como se expone más adelante, para dar una forma en la cual el mismo actúa para liberar uno o más S-nitrosotioles. Antes de su utilización, el apósito se mantiene en condición inactiva, activándose cuando se requiere su utilización.

Los S-nitrosotioles se descomponen espontáneamente para producir óxido nítrico y la forma oxidada del tiol, como se ha expuesto anteriormente, y como se indica arriba en la ecuación 8. El apósito, una vez activado, típicamente durante su uso en la piel, funciona por tanto como un donante de óxido nítrico, generando óxido nítrico a partir del S-nitrosotiol liberado, típicamente en o en la proximidad de la piel a tratar, v.g. liberándose óxido nítrico en una herida. El óxido nítrico tiene efectos beneficiosos sobre los tejidos, particularmente en la curación de las heridas, como se ha expuesto anteriormente. El óxido nítrico funciona también como vasodilatador, haciendo que los capilares sanguíneos en su proximidad se dilaten. Este efecto puede mejorar el suministro transdérmico de materiales, v.g. hormonas, analgésicos, etc, por aceleración del suministro y absorción de los materiales. El apósito puede utilizarse por tanto como adyuvante para suministro transdérmico, típicamente por tener un apósito o parche, tirita, vendaje, gasa, etc. de material compuesto, que incluye también el material para suministro.

El óxido nítrico puede ser particularmente útil en el alivio de una condición conocida como el Síndrome de Raynaud.

Es también de interés para los inventores un medio de tratamiento o prevención de la restenosis (estrechamiento) y/o la trombosis de los vasos sanguíneos después de procedimientos quirúrgicos: el deterioro físico de, o la eliminación de, el endotelio durante la angioplastia transluminal percutánea (PCTA) es un factor contributivo importante en la incidencia elevada de la restenosis después de la PCTA (Langford et al., Lancet 344, 1458-1460).

S-nitrosotioles adecuados incluyen S-nitroso-glutatión (preferiblemente S-nitroso-L-glutatión, dado que ésta es la versión fisiológicamente importante), S-nitrosocisteína, S-nitroso-N-acetilcisteína, S-nitroso-captopril, S-nitrosomercaptoetilamina, ácido S-nitroso-3-mercaptopropanoico, S-nitroso-D-tioglucosa y S-nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina. Actualmente se prefiere S-nitrosoglutatión, debido a su velocidad de descomposición relativamente lenta para generar óxido nítrico, lo que da como resultado una estabilidad satisfactoria del S-nitrosotiol en el apósito y una liberación lenta como consecuencia del óxido nítrico a una velocidad apropiada para beneficios de la piel.

El apósito incluye uno o más componentes de apósito que incluyen uno o más reactivos (un S-nitrosotiol o precursores del mismo) que funcionan para liberar el S-nitrosotiol del apósito (posiblemente después de generación en el apósito) por activación del mismo. Antes de su utilización, el apósito se mantiene en condición inactiva para prevenir una liberación prematura del S-nitrosotiol.

El apósito incluye un nitrito, v.g. nitrito de potasio, y un tiol, v.g. L-glutatión como reactivos que reaccionan juntos en el apósito al activarse para generar y liberar S-nitrosotiol. Cuando se ponen juntos en una solución ácida, los reactivos reaccionan uno con otro para generar S-nitrosotiol, como se expone anteriormente en la ecuación 7. Los reactivos se proporcionan convenientemente en componentes separados del apósito que se mantienen aparte (v.g. en envases separados) hasta que se requiere su utilización. A fin de activar el apósito durante el uso, los dos componentes del apósito se ponen en contacto (en presencia de una fuente de agua y protones, en caso requerido), dando como resultado la producción en el apósito del S-nitrosotiol que se libera luego del apósito.

Alternativamente, los reactivos pueden reaccionar en el apósito para generar S-nitrosotiol antes de la activación para liberar S-nitrosotiol como se expone más adelante con mayor detalle. Con objeto de mantenerse en condición inactiva, el S-nitrosotiol debería estar en condición seca. Al humectarse el apósito, se libera el S-nitrosotiol. El apósito se activa por tanto fácilmente por exposición al agua; v.g. por contacto con un lecho de herida húmedo. El S-nitrosotiol se genera típicamente en el apósito por la reacción de nitrito y tiol, como se ha expuesto anteriormente.

Cantidades adecuadas de los reactivos pueden determinarse fácilmente para producir las cantidades deseadas de S-nitrosotioles. En general, cantidades de cada reactivo en el intervalo de 1-50 mM serán probablemente apropiadas.

El o cada uno de los componentes del apósito pueden encontrarse en la forma de una capa, v.g. en la forma de una hoja, placa o película, que puede producirse a partir de un material amorfo, que no tenga perfil o forma fijo alguno, que puede deformarse y conformarse en tres dimensiones, incluyendo la expresión a través de una tobera.

El o cada uno de los componentes del apósito comprende convenientemente un vehículo o soporte, típicamente en forma de una matriz de polímero. El vehículo puede ser sólido o amorfo, como se expone más adelante.

\newpage

El vehículo o soporte comprende convenientemente un hidrogel hidratado. Un hidrogel hidratado significa uno o más geles basados en agua o acuosos, en forma hidratada. Un hidrogel hidratado incluye por tanto una fuente de agua, para activación del apósito. Un hidrogel hidratado puede actuar también para absorber agua y otros materiales exudados de un sitio de herida, permitiendo que el apósito realice una función valiosa y útil por eliminación de dichos materiales de un sitio de herida. El hidrogel hidratado proporciona también una fuente de humedad, que puede actuar durante su utilización para mantener un sitio de herida húmedo, contribuyendo a la curación.

Hidrogeles hidratados adecuados se describen en WO 03/090800. El hidrogel hidratado comprende convenientemente material polímero hidrófilo. Materiales polímeros hidrófilos adecuados incluyen poliacrilatos y metacrilatos, v.g. como son suministrados por First Water Ltd. en forma de hidrogeles patentados, que incluyen ácido poli 2-acrilamido-2-metilpropano-sulfónico (poli-AMPS) y/o sales de los mismos, v.g. como se describe en WO 01/96422), polisacáridos, v.g., gomas de polisacáridos, particularmente goma de xantano (disponible bajo la Marca Comercial Keltrol), diversos azúcares, ácidos policarboxílicos (v.g. disponibles bajo la Marca Comercial Gantrez AN-169 BF de ISP Europe), poli(metil-vinil-éter-co-anhídrido maleico) (v.g. disponible bajo la Marca Comercial Gantrez AN-139, que tiene un peso molecular comprendido en el intervalo de 20.000 a 40.000), poli(vinilpirrolidona) (v.g. en la forma de los grados disponibles comercialmente conocidos como PVP K-30 y PVP K-90), poli(óxido de etileno) (v.g. disponible bajo la marca comercial Polyox WSR-301), poli(alcohol vinílico) (disponible v.g. bajo la Marca Comercial Elvanol), polímero poliacrílico reticulado Carbopol EZ-1), celulosas y celulosas modificadas, con inclusión de hidroxipropilcelulosa (disponible v.g. bajo la marca comercial Klucel EEF), carboximetilcelulosa sódica (v.g. disponible bajo la marca comercial Cellulose Gum 7LF) e hidroxietil-celulosa (disponible v.g. bajo la marca comercial Natrosol 250LR).

Mezclas de materiales polímeros hidrófilos pueden utilizarse en un gel.

En un hidrogel hidratado o material polímero hidrófilo, el material polímero hidrófilo está presente deseablemente en una concentración de al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, más preferiblemente al menos 5%, todavía más preferiblemente al menos 10%, o al menos 20%, deseablemente al menos 25% y aún más deseablemente al menos 30% en peso basado en el peso total del gel. Pueden utilizarse cantidades mayores aún, hasta aproximadamente 40% en peso basadas en el peso total del gel.

Se han obtenido resultados satisfactorios con el uso de un hidrogel hidratado de poli-AMPS y/o sales del mismo en una cantidad de aproximadamente 30% en peso, referidas al peso total del gel.

Cuando se utiliza un gel que comprende una concentración relativamente alta (al menos 2% en peso) de material polímero hidrófilo, el gel puede funcionar de modo particularmente eficaz para absorber agua durante el uso del apósito, v.g. a partir de exudados de suero mientras está en contacto con una herida. Dado que el gel es un sistema acuoso, el uso del apósito no tiene el efecto de inducir una sequedad global de la herida, que podría ser indeseable. Esto es debido a que la presión de vapor del agua se mantiene en el recinto cerrado que rodea la piel durante el uso del apósito. El gel funciona por tanto como una entidad absorbente para la eliminación de humedad, v.g. exudado de la herida, que proporciona también un nivel de fondo útil del exceso de humedad.

La capacidad de absorción de agua de un hidrogel hidratado, que incluye un gel de alta concentración, permite que el apósito contribuya a la curación de la herida por eliminación de cantidades sustanciales de exudados, hinchándose a medida que hace esto. Utilizando un gel formulado cuidadosamente que se hidrata fácilmente, se evita que la herida alcance un estado de sequedad inconveniente. La hidratación fácil asegura también la formación rápida de una interfase líquida acuosa entre el apósito y la herida, evitando con ello la adhesión, que en caso contrario podría interferir con el levantamiento fácil del apósito cuando debe reemplazarse. Una interfase líquida acuosa satisfactoria entre la herida y el apósito es también importante para permitir que cualesquiera productos beneficiosos arrastrados en el gel entren en la herida por toda la superficie disponible.

El material de hidrogel hidratado se encuentra típicamente en la forma de una capa, hoja o película sólida de material que está reticulada típicamente, y que puede incorporar una estructura mecánica reforzante. El tamaño y la forma de la capa, hoja o película pueden seleccionarse para adaptarse al uso propuesto del apósito. Espesores comprendidos en el intervalo de 0,05 a 5 mm, preferiblemente 0,5 a 3 mm son particularmente adecuados.

Alternativamente, el hidrogel hidratado puede encontrarse en la forma de un gel amorfo que no tiene un perfil o forma fijos, que puede deformarse y conformarse en tres dimensiones, con inclusión de la posibilidad de ser exprimido a través de una tobera. Los geles amorfos no están reticulados típicamente, o tienen niveles bajos de reticulación. Puede utilizarse un gel amorfo fluidificable por cizallamiento. Un gel de este tipo es líquido cuando se somete a esfuerzos de cizallamiento (v.g. cuando se vierte o se exprime a través de una tobera) pero se endurece en condiciones estáticas. Así pues, el gel puede encontrarse en la forma de un componente susceptible de vertido o exprimible que puede dosificarse, v.g. desde un tubo compresible o un dispensador de tipo jeringuilla, que comprende un pistón y un cilindro, típicamente con una tobera de aproximadamente 3 mm de diámetro. Un gel de este tipo puede aplicarse en la forma de una capa superficial, o en una cavidad de herida como un gel totalmente conformable que llena el espacio disponible y se mantiene en contacto con la superficie de la herida.

Un ejemplo típico de una formulación de gel amorfo es: 15% p/p AMPS (sal de sodio), 0,19% de diacrilato de polietilenglicol y 0,01% de hidroxiciclohexil-fenil-cetona, completándose el volumen hasta 100% con agua destilada de grado analítico. Los reactivos se mezclan y disuelven concienzudamente, y se polimerizan luego durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 60 segundos, utilizando una lámpara UV-A que suministra aproximadamente 100 mW/cm^{2}, para formar el hidrogel requerido. Éste puede estar contenido en jeringuillas de plástico desde las cuales puede dispensarse luego el gel amorfo desde una jeringuilla al sitio diana, como una capa superficial o para rellenar una cavidad.

Si bien se prefiere generalmente utilizar un hidrogel hidratado como el vehículo o soporte, el vehículo o soporte puede comprender en su lugar material en condición seca, estando presente típicamente el reactivo en una matriz de polímero seca.

Condición seca significa que no existe cantidad alguna de agua libre en el material, de tal manera que no puede producirse pérdida alguna significativa o apreciable de agua por evaporación en las condiciones ambientales normales de temperatura, presión y humedad. Condición seca incluye una condición desecada, que es una condición secada adicionalmente a fondo. Condición desecada significa una condición mantenida por almacenamiento en un ambiente cerrado por una barrera impermeable a la humedad, en la cual el material se mantiene escrupulosamente exento de agua por medio un desecante añadido.

Dado que el material se encuentra en condición seca, el reactivo se mantiene en condiciones estables y está retenido en el material. El material puede almacenarse en condiciones adecuadas durante un periodo de tiempo prolongado, manteniéndose el reactivo estable en el mismo.

Cuando el material se humedece, v.g. por contacto con una fuente de agua, el reactivo se solubiliza y se libera. Se requiere agua suficiente para formar una unión líquida de contacto entre el material y una fuente de agua.

El reactivo se incorpora típicamente en el material sólido, dispersándose en todo el material. El material sólido comprende típicamente una matriz con el reactivo dispersado en ella, preferiblemente de una manera razonablemente homogénea.

El material sólido comprende preferiblemente un material polímero.

Un material polímero preferido comprende poli(alcohol vinílico) (PVA). El PVA tiene propiedades convenientes y aceptables para uso en el tratamiento de la piel, v.g. el hecho de carecer de toxicidad. El PVA es asimismo fácil de manipular y utilizar, formando fácilmente una película por secado de una solución de PVA en agua, siendo la película resultante fácil de manipular. El PVA está además disponible fácilmente y es barato. No se requiere reticulación para formar un material sólido, v.g. en la forma de una película, aunque puede emplearse opcionalmente reticulación. El PVA está disponible en una amplia gama de calidades basadas en peso molecular y grado de hidrólisis, lo que afecta a las propiedades físicas del material.

Los grados apropiados de PVA pueden seleccionarse fácilmente para producir un producto polímero que tiene las propiedades deseadas para un uso particular propuesto. Por ejemplo, para uso en apósitos de piel, se han obtenido resultados satisfactorios por el uso de PVA con un peso molecular en el intervalo de 100.000 a 200.000, hidrolizado sustancialmente por completo (98-99% de hidrólisis), v.g. en la forma del código 36.316-2 de Aldrich, en forma no reticulada.

Otro material polímero adecuado comprende polivinilpirrolidona (PVP). Las propiedades de PVP son muy similares a las de PVA, y PVP es también aceptable para uso en tratamiento de la piel. PVP está disponible fácilmente en un intervalo de pesos moleculares diferentes. Los grados apropiados de PVP pueden seleccionarse fácilmente. Por ejemplo, se han obtenido resultados satisfactorios utilizando una PVP que tiene un valor medio de peso molecular de 360.000, v.g. en la forma del código PVP 360 de Sigma, en forma no reticulada.

Pueden utilizarse mezclas de materiales polímeros.

El material sólido se encuentra convenientemente en la forma de una hoja, capa o película, teniendo típicamente un espesor comprendido en el intervalo de 0,01 a 1,0 mm, preferiblemente en el intervalo de 0,05 a 0,5 mm.

El material sólido puede incluir opcionalmente un soporte para proporcionar rigidez cuando se encuentra húmedo.

El material sólido de la invención se fabrica convenientemente por mezcla de una solución de un polímero (v.g. una solución acuosa de PVA y/o PVP) y reactivo, y secado de la mezcla para producir un material sólido, v.g. formando una película por un procedimiento de colada. Métodos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El material o materiales polímeros se utilizan convenientemente en cantidades apropiadas que dan como resultado la formación de una película, viniendo dictado típicamente el límite superior de concentración por el límite de solubilidad (generalmente en agua) y siendo el límite inferior de concentración el punto para el cual no se forma una película. Para el código de PVA 36.316-2 de Aldrich, el límite de solubilidad en agua es aproximadamente 6% p/p, dando como resultado una concentración de PVA en la película antes del secado de aproximadamente 5%.

\newpage

Si bien se prefiere generalmente el uso de un hidrogel hidratado, particularmente poli-AMPS, como vehículo o soporte, se presentan dificultades prácticas en la incorporación del tiol L-glutatión en un hidrogel de poli-AMPS, por lo que este reactivo se proporciona en su lugar generalmente en un soporte que comprende material seco como se ha expuesto anteriormente, v.g. una matriz seca de polímero de PVA.

Así pues, en una realización preferida la invención comprende un primer componente que comprende una capa de hidrogel hidratado, preferiblemente poli-AMPS y/o sales del mismo, que contiene una fuente de nitrito, v.g. nitrito de potasio, y un segundo componente que comprende una matriz de polímero seca, preferiblemente PVA seco, que contiene un tiol, v.g. L-glutatión. El primer componente puede utilizarse en contacto con la piel, dado que el hidrogel hidratado tiene propiedades beneficiosas para contacto con la piel, como se ha expuesto anteriormente, estando situado el segundo componente encima del primer componente. Con tal que los componentes se mantengan separados antes de su utilización, el apósito se mantiene en condición no activada. En cambio, cuando los dos componentes se ponen en contacto, esto tiene el efecto de activar el apósito. El agua contenida en el hidrogel hidratado del primer componente funciona para proporcionar un ambiente acuoso adecuado, actuando el L-glutatión, que es ácido, como fuente de protones, proporcionando el entorno ácido necesario para la reacción.

Al activarse el apósito, el nitrito comienza a difundirse desde el primer componente (o capa primaria) en el segundo componente (o capa secundaria), y el tiol se difunde en la dirección opuesta. La mezcladura del nitrito con el tiol en solución ácida da como resultado una generación lenta de N-nitrosotiol. Si el tiol es L-glutatión, entonces el producto de reacción es S-nitroso-L-glutatión. Una vez producido, el S-nitrosotiol se libera del apósito al ambiente circundante, v.g. a un lecho de herida, en el cual se descompone para producir óxido nítrico, con los efectos beneficiosos consiguientes. Estas reacciones son como se ilustra a continuación:

11

El donante de óxido nítrico preferido a generar por el apósito activado es S-nitrosoglutatión (GSNO). La tasa de producción de GSNO en ambiente acuoso que contiene glutatión y nitrito es dependiente del pH. Mientras que la tasa es insignificante a pH 7, la misma puede observarse a pH ácido (<6). Es suficiente pH 5 (o inferior) para impulsar la reacción hacia delante a una velocidad satisfactoria. El pH del hidrogel de poli-AMPS (con contraión sodio), el material preferido del primer componente o capa primaria, es aproximadamente 7, y es necesaria por tanto una fuente de protones a fin de conseguir pH 5 o inferior para impulsar hacia delante la producción de GSNO. EL glutatión (incorporado en el segundo componente o capa secundaria) es en sí mismo un compuesto ácido capaz de donar protones que permiten la generación de GSNO en el apósito activado, por lo que no es esencial una fuente de protones adicional.

La producción de GSNO en el apósito activado alcanza su máximo a partir de 2 h después de la activación (véase Ejemplo 2 más adelante), después de cuyo momento la cantidad total de GSNO disminuye gradualmente debido a la utilización de los reactivos (nitrito y glutatión) y la descomposición lenta del GSNO. La velocidad de liberación de GSNO desde el apósito activado se modelizó utilizando una pieza de hidrogel de poli-AMPS en blanco como sustituto del lecho de herida (véase el Ejemplo 3 más adelante).

El apósito puede incluir y/o generar opcionalmente por activación una fuente (posiblemente adicional) de protones.

Por ejemplo, un ácido, v.g. ácido láctico más preferiblemente un tampón ácido, v.g. tampón citrato, tampón citrato-fosfato, etc., puede incluirse en uno de los componentes primero y segundo del apósito, o en ambos.

La incorporación de la fuente adicional de protones permite un grado de control sobre la velocidad de producción de S-nitrosotiol en el apósito activado. La tasa de producción aumenta con la acidez del apósito regulada por el tampón incorporado. Así, por ejemplo, la tasa de producción de S-nitrosotiol será más lenta si se incorpora tampón de fosfato (pH 5,5) como fuente de protones comparada con la incorporación del tampón de citrato (pH 3).

Opcionalmente, la fuente de protones puede utilizarse para activar el apósito por reducción del pH hasta un punto en el cual puede producirse la reacción de, v.g. nitrito y tiol. Por ejemplo, nitrito y tiol podrían mantenerse juntos a un pH superior, por ejemplo 7,0. Al activarse, el pH disminuye a fin de generar uno o más S-nitrosotioles.

Como posibilidad adicional, pueden generarse protones en el apósito durante la activación, v.g. por un sistema enzima oxidasa/sustrato. Una enzima oxidasa cataliza la reacción de un sustrato apropiado con oxígeno para producir peróxido de hidrógeno y un ácido, que se disocia para producir protones. Diversos pares enzima/sustrato se describen en WO 03/090800. El sistema preferido oxidasa/sustrato es glucosa-oxidasa y glucosa. La glucosa-oxidasa cataliza la oxidación de la glucosa por el oxígeno para producir peróxido de hidrógeno y ácido glucónico. El ácido glucónico se disocia para producir gluconato y un protón y puede servir por tanto como la fuente de protones:

12

La enzima y el sustrato correspondiente se incorporan convenientemente en componentes separados del apósito (que pueden corresponder a o ser diferentes de los componentes primero y segundo expuestos anteriormente) de tal modo que los mismos no están en contacto antes de la activación del apósito. Sin embargo, al activarse el apósito, la enzima y el sustrato se ponen en comunicación permitiendo el contacto, lo que da como resultado la generación de protones.

El sustrato se incorpora convenientemente en el primer componente o capa primaria, y la enzima se incorpora preferiblemente en un componente que no está en contacto con la piel durante el uso, v.g. el segundo componente o capa secundaria a que se ha hecho referencia anteriormente. Así pues, en una configuración preferida, el primer componente del apósito o capa primera comprende una matriz de polímero (preferiblemente hidrogel hidratado de poli-AMPS) que contiene una fuente de nitrito (preferiblemente nitrito de potasio) y el sustrato para la enzima oxidasa (preferiblemente glucosa), y el segundo componente del apósito o capa secundaria comprende una matriz de polímero (preferiblemente PVA seco) que contiene un tiol (preferiblemente L-glutatión) y la enzima oxidasa (preferiblemente glucosa-oxidasa).

Como resultado de la activación, el nitrito y la glucosa comienzan a difundirse desde la capa primaria a la capa secundaria, y el tiol se difunde en la dirección opuesta. La movilidad de la glucosa-oxidasa en la matriz de polímero es muy limitada, por lo que la enzima se mantendrá típicamente confinada en la capa secundaria. Mientras que la mezcladura de glucosa con la glucosa-oxidasa en la capa secundaria da como resultado la generación de protones, la mezcladura del nitrito con el tiol da como resultado la generación de S-nitrosotiol. Los protones generados en la capa secundaria aumentan la tasa de producción de S-nitrosotiol en el apósito. Una vez producido, el S-nitrosotiol se libera del apósito al ambiente circundante en el cual se descompone para producir óxido nítrico.

Como una posibilidad adicional, el apósito puede comprender tres componentes: un primer componente o capa primaria que comprende una matriz de polímero (preferiblemente hidrogel de poli-AMPS) que contiene una fuente de nitrito (preferiblemente nitrito de potasio) y el sustrato para la enzima oxidasa (preferiblemente glucosa); un segundo componente o capa secundaria que comprende una matriz de polímero (preferiblemente PVA desecado) que contiene un tiol (preferiblemente L-glutatión); y un tercer componente o capa terciaria que comprende una matriz de polímero (preferiblemente hidrogel de poli-AMPS) que contiene la enzima oxidasa (preferiblemente glucosa-oxidasa). El apósito puede activarse reuniendo las tres capas. El orden particular en el cual se ensamblan las capas no es crítico. Sin embargo, la disposición preferida es aquélla en la cual la capa secundaria está estratificada entre la capa primaria y la terciaria.

Al activarse, el nitrito y la glucosa comienzan a difundirse desde la capa primaria a la capa secundaria y la terciaria, y el tiol se difunde a partir de la capa secundaria. La movilidad de la glucosa-oxidasa en la matriz de polímero es muy limitada, por lo que la enzima se mantendrá en su mayor parte confinada en la capa terciaria. Mientras que la mezcladura de la glucosa con la glucosa-oxidasa en la capa terciaria da como resultado la generación de protones, la mezcladura del nitrito con el tiol da como resultado la generación de S-nitrosotiol. Los protones generados en la capa terciaria se extienden a través de todo el apósito y aumentan la tasa de producción de S-nitrosotiol en el apósito. Una vez producido, el S-nitrosotiol se libera del apósito al ambiente circundante en el cual se descompone para producir óxido nítrico. Las reacciones son como se representa a continuación:

13

En lugar del apósito que incluye reactivos que reaccionan entre sí en el apósito por activación para generar y liberar S-nitrosotiol, el apósito puede incluir S-nitrosotiol (posiblemente pre-generado in situ) en condición inactiva, liberándose el S-nitrosotiol por activación del apósito. El S-nitrosotiol (preferiblemente S-nitroso-L-glutatión) se proporciona convenientemente en un componente del apósito como se ha expuesto anteriormente, preferiblemente en la forma de una capa, v.g. en la forma de una hoja, placa o película. El componente del apósito comprende convenientemente un vehículo o soporte, típicamente en la forma de una matriz de polímero.

Con objeto de mantenerse en condición inactiva, el S-nitrosotiol debe encontrarse en estado seco. El vehículo o soporte debería encontrarse también en estado seco, estando presente convenientemente el S-nitrosotiol en una matriz de polímero desecada. Esto es como se ha descrito anteriormente, y comprende convenientemente PVA desecado. Al humedecerse el apósito, se libera el S-nitrosotiol. El apósito se activa por tanto fácilmente por exposición al agua, en contacto con un lecho de herida húmedo.

El S-nitrosotiol se pre-genera convenientemente en el componente del apósito, típicamente por reacción de nitrito y tiol como se ha expuesto anteriormente.

En una realización preferida de este tipo, el apósito comprende una capa de PVA desecado que contiene S-nitrosotiol pre-generado, La capa está formada por PVA, una fuente de nitrito (preferiblemente nitrito de potasio) y un tiol (preferiblemente L-glutatión). En un ejemplo típico de esta realización, los dos aditivos citados se añaden a la solución de PVA antes del secado. El S-nitrosotiol (GSNO en el caso preferido) se genera dentro de la capa durante el paso de secado. Se sabe que los nitrosotioles son inestables en soluciones acuosas. Sin embargo, se encontró que GSNO era muy estable en la capa desecada de PVA, especialmente si se mantenía en una atmósfera exenta de humedad.

El GSNO puede liberarse de la capa simplemente por aplicación de la capa a una superficie húmeda (v.g. lecho de herida). Una vez liberado, el GSNO sufre una descomposición lenta para generar óxido nítrico. La liberación de GSNO de la capa es relativamente rápida. Esto puede demostrarse por aplicación de la capa sobre una piel húmeda, que da como resultado un enrojecimiento rápido (dentro de aproximadamente 1 minuto) de la piel debido a la vasodilatación dérmica. El enrojecimiento es totalmente reversible y desaparece en varios minutos después de la retirada del parche.

Una capa adicional consistente en un material polímero hidratado (preferiblemente hidrogel de poli-AMPS) puede utilizarse en esta realización (y generalmente en otras realizaciones) como capa de transición entre la piel y la capa de PVA desecado para ralentizar la liberación del donante de óxido nítrico al ambiente circundante. La capa de polímero hidratado funciona también como fuente de agua para activar el apósito.

El apósito puede incluir opcionalmente una fuente de agua. Ésta puede ser similar al segundo componente del apósito descrito en WO 2004/108176, y comprende convenientemente un hidrogel de poli-AMPS hidratado.

En una realización preferida, el apósito comprende dos componentes que son amorfos. Los componentes pueden encontrarse en la forma de v.g. un gel, semi-sólido, pasta, crema, loción o líquido, v.g. una solución acuosa. Pueden emplearse convenientemente hidrogeles hidratados, como se ha expuesto anteriormente.

En realizaciones de este tipo, cada componente comprende preferiblemente un reactivo que, cuando se reúnen, se activan para liberar uno o más S-nitrosotioles. Preferiblemente, un componente contiene un nitrito y el otro contiene un tiol. Alternativamente, el nitrito y el tiol pueden mantenerse juntos a un pH suficientemente alto para impedir la reacción de los mismos, v.g. a un pH superior a 7, conteniendo el segundo componente una fuente de acidez. Otra posibilidad es que un componente contenga S-nitrosotiol anhidro y el segundo componente contenga agua.

Los dos componentes acuosos se mantienen separados hasta que se desea aplicar el apósito a una superficie del cuerpo. Convenientemente, aquéllos están envasados en un recipiente que tiene una tobera, a través de la cual pueden suministrarse los componentes amorfos. Preferiblemente, los dos componentes están envasados en un dispensador de dos compartimientos, que puede operar preferiblemente para suministrar ambos componentes simultáneamente.

Realizaciones preferidas comprenden dos componentes de apósito, conteniendo uno nitrito, y conteniendo el otro tiol, v.g. glutatión. Los dos componentes pueden adquirir una gran diversidad de formas materiales, como se ha expuesto anteriormente. Sin embargo, actualmente se prefieren los ejemplos de combinaciones siguientes:

14

Así pues, el apósito incluye opcionalmente, o se utiliza con, una capa de contacto con la piel, que comprende preferiblemente un hidrogel hidratado de poli-AMPS y/o sales del mismo, como se ha mencionado arriba.

El apósito incluye opcionalmente, o se utiliza con, un recubrimiento o capa externa para adherir el apósito a la piel de un humano o animal de manera conocida.

Apósitos de acuerdo con la invención pueden fabricarse en una gama de tamaños y formas diferentes para tratamiento de áreas de la piel, v.g. heridas de tamaños y formas diferentes. Cantidades apropiadas de reactivos para un apósito particular pueden ser fácilmente determinadas por experimento.

Los componentes del apósito se guardan convenientemente antes de su uso en envases estériles, cerrados herméticamente e impermeables al agua, v.g. envases de papel metalizado de aluminio laminado. En el caso de componentes que comprenden material seco, se incluye deseablemente un material desecante en los envases.

Durante el uso, el componente o componentes del apósito se retiran de sus envases y se aplican en el orden apropiado sobre la piel de un humano o animal, v.g. sobre una herida u otra región de piel a tratar para propósitos cosméticos o terapéuticos. El apósito puede utilizarse también como adyuvante para suministro transdérmico, como se ha indicado arriba. El apósito se activa, en el caso de apósitos de componentes múltiples, reuniendo los componentes, y en el caso de apósitos secos por contacto con una fuente de agua (v.g. procedente de una herida), dando como resultado la liberación por el apósito de uno o más S-nitrosotioles (posiblemente después de generación en el apósito después de la activación). Los S-nitrosotioles se descomponen espontáneamente para producir óxido nítrico, que tiene efectos beneficiosos sobre los tejidos y causa asimismo vasodilatación.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de generación de óxido nítrico para propósitos terapéuticos y/o cosméticos en o en la proximidad de una superficie corporal, comprendiendo el método hacer reaccionar un nitrito y un tiol en un apósito para generar uno o más S-nitrosotioles que se descomponen espontáneamente para suministrar el óxido nítrico.

La invención se describirá a continuación, a modo de ilustración, en los ejemplos que siguen, y con referencia a los dibujos que se adjuntan, en los cuales:

La Figura 1 es un gráfico de concentración de S-nitrosoglutatión (en mM) en función del tiempo (en minutos) que muestra el efecto del pH sobre la tasa de producción y descomposición subsiguiente de S-nitrosoglutatión en soluciones que contienen nitrito de potasio (5 mM) y L-glutatión (5;

La Figura 2 es un gráfico de concentración de GSNO (en mM) en función del tiempo (en horas), que muestra el perfil de concentración de S-nitrosoglutatión en un apósito después de activación del apósito en el tiempo cero;

La Figura 3 es un gráfico de concentración de GSNO (en mM) en función del tiempo (en horas) que muestra el perfil de concentración de S-nitrosoglutatión en un apósito y en un hidrogel en blanco colocado bajo el apósito después de la activación del apósito en el tiempo cero;

la Figura 4 es un gráfico de concentración de GSNO (en mM) en función del tiempo (en horas) que muestra el perfil de concentración de S-nitrosoglutatión en diversas capas de apósito después de la activación del apósito en el tiempo cero;

la Figura 5 es un gráfico de concentración de GSNO (en mg) en función del tiempo (en horas) que muestra la liberación de S-nitrosoglutatión a partir de una capa de PVA seco en una capa de transición de hidrogel y subsiguientemente en otra capa de hidrogel después de la activación del apósito en el tiempo cero; y

la Figura 6 es una ilustración esquemática de una realización de apósito de una herida de acuerdo con la invención.

Ejemplos Materiales y Métodos Productos químicos y otros materiales

\quad: Agua (conductividad menor que 10 \muScm^{-1}; cualquier calidad de reactivo analítico, Fisher o Sanyo Fistream MultiPure)

\quad: AMPS (sal de sodio del ácido 2-acrilamido-2-metilpropano-sulfónico, solución acuosa al 50%, hidrogel monómero-Lubrizol AMPS 2405

\quad: AMPS (sal de amonio del ácido 2-acrilamido-2-metilproano-sulfónico, solución acuosa al 50%, hidrogel monómero-Lubrizol, AMPS 2411

\quad: 1-hidroxi-ciclo-hexil-fenil-cetona (99%); fotoiniciador-Aldrich; 40561-2

\quad: Ebecryl 11 (diacrilato de PEG400); reticulador - UCB Chemicals

\quad: Nitrito de potasio (>98%) - Fluka: 60417

\quad: L-Glutatión, reducido (>99%) - Sigma: G4251

\quad: Glucosa-Fisher-grado analítico, código G050061

\quad: Glucosa-oxidasa-Biocatalysts-G638P (\sim 70 U/mg sólido)

\quad: PVA (poli(alcohol vinílico), Mr = 124.000 a 186.000, 98-99% hidrolizado)-Aldrich: 36316-2.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación del hidrogel de poli-AMPS

Los componentes se mezclaron en las combinaciones y cantidades indicadas en la Tabla 1, siguiendo el procedimiento básico expuesto a continuación:

\quad: Se dispensaron soluciones stock (tal como fueron suministradas por el fabricante) de AMPS de amonio y/o AMPS sódico en una botella de reacción de 250 ml de polipropileno, con tapón roscado como base del fluido pre-gel. Se añadieron a la mezcla glucosa-oxidasa y el o los aditivos (en caso requerido) y se dejó que se disolvieran completamente. En un recipiente separado se dispersó el polvo de fotoiniciador en el reticulador líquido y la mezcla se calentó suavemente para disolver el fotoiniciador en el reticulador. Esta solución se mezcló luego en el fluido de pre-gel. Para colar los geles, el fluido de pre-gel completo se vertió en una bandeja de fondo plano, hasta una altura de 1-2 mm. Los geles se solidificaron por irradiación UV desde una lámpara de 1 kW a una distancia vertical de 15 cm durante 25 segundos. Los geles se dejaron enfriar antes de su utilización.

TABLA 1 Composición de los hidrogeles utilizados en el estudio

15

16

Preparación de las capas de PVA

Se preparó una solución stock de PVA (5% p/p) en agua. Se añadieron nitrito de potasio y/o L-glutatión a la solución de PVA para alcanzar la concentración requerida (véase tabla 2). La solución se dispensó luego en una cápsula Petri (12 g en 60 cm^{2}) y se secó a 40ºC durante una noche.

TABLA 2 Composición de las capas de PVA utilizadas en el estudio. La composición se refiere a las mezclas basadas en PVA antes del secado

17

Medida de la concentración de S-nitrosoglutatión Medida de la concentración de S-nitrosoglutatión en soluciones acuosas

Se prepararon los reactivos siguientes:

Reactivo 1:: tampón de fosfato de Na (pH 7,4, 0,1 M)

Reactivo 2:: reactivo de Griess: 20 mg de dihidrocloruro de N-(1-naftil)etilenodiamina (NADD) + 500 mg de sulfanilamida disuelta en 2 ml de DMSO. (Nota: Esta solución es fotosensible y debe mantenerse en la oscuridad todo lo posible)

Reactivo 3:: cloruro mercúrico (10 mM) en DMSO (13,58 mg de HgCl_{2} en 5 ml de DMSO)

\vskip1.000000\baselineskip

Se siguió luego el procedimiento de 6 pasos expuesto a continuación:

1.: Dispensar 1,5 ml del Reactivo 1 en una cubeta de plástico

2.: Añadir 200 \mul de la muestra (es decir la muestra en la cual la concentración de GSNO debe determinarse)

3.: Añadir 1,17 ml de agua destilada

4.: Añadir 100 \mul del Reactivo 2

5.: Añadir 30 \mul del Reactivo 3 y proporcionar una mezcladura satisfactoria a la solución

6.: Leer la absorbancia de la mezcla resultante a 496 nm en 10 min.

\vskip1.000000\baselineskip

La continuación de GSNO puede calcularse a partir de la lectura de absorbancia utilizando el coeficiente de absorción molar para GSNO = 12.500 M^{1}cm^{-1}.

Medida de la concentración de S-nitrosoglutatión en los hidrogeles

Se prepararon los reactivos siguientes:

Reactivo 1:: tampón de fosfato de Na (pH 7,4, 0,1M)

\vskip1.000000\baselineskip

Se siguió luego el procedimiento en 5 pasos expuesto a continuación:

1.: Dispensar 25 ml de Reactivo 1 y 825 \mul de Reactivo 2 en un vaso de polipropileno de 250 ml.

2.: Pesar con precisión aproximadamente 300 mg del gel y sumergirlo en la mezcla de reactivos. Incubar mientras se agita moderadamente con sacudidas durante 30 min.

3.: Transferir 2,6 ml de la mezcla de reactivos desde el vaso de polipropileno a una cubeta de plástico

4.: Añadir 25 \mul de Reactivo 3

5.: Leer la absorbancia de la mezcla resultante a 496 nm en 10 min.

\vskip1.000000\baselineskip

La concentración de GSNO en la mezcla de reactivos puede calcularse a partir de la lectura de absorbancia utilizando el coeficiente de absorción molar para GSNO = 2500 M^{-1}cm^{-1}. Éste puede utilizarse luego para calcular la concentración original de GSNO en el gel.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Efecto del pH sobre la tasa de producción/degradación de GSNO en sistemas acuosos que contienen L-glutatión y nitrito de potasio

La tasa de la producción de GSNO y la descomposición subsiguiente en soluciones que contienen nitrito de potasio (5 mM) y L-glutatión se estudió a pH 3 (tampón citrato-fosfato, 0,1 M), pH 5 (tampón citrato-fosfato, 0,1 M), y pH 7 (tampón de fosfato, 0,1 M). Los resultados se muestran en la Figura 1. No se observó producción alguna de GSNO a pH 7. La producción inicial de GSNO era más lenta a pH 5 comparada con pH 3. La estabilidad del GSNO producido parecía ser ligeramente mayor a pH 5 comparada con la exhibida a pH 3.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación de S-nitrosoglutatión en un apósito de hidrogel activado (sin tamponar)

Se midió el perfil de concentración de GSNO en el apósito activado en ausencia de fuente adicional de protones. La capa primaria del apósito consistía en un hidrogel de poli-AMPS que contenía nitrito de potasio (30 mM). La capa secundaria estaba constituida por PVA desecado (5%) que contenía L-glutatión (30 mM). No había fuente adicional alguna de protones en el apósito. Las capas se reunieron para activar el apósito, y los resultados se muestran en la Figura 2. La concentración de GSNO generada en el apósito alcanzaba el máximo al cabo de aproximadamente 2 horas. Se produjo luego una disminución lenta y continua en la concentración de GSNO debido a su descomposición lenta. El GSNO era todavía apreciable en el apósito 48 horas después de la activación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Liberación de S-nitrosoglutatión por un apósito de hidrogel activado (sin fuente adicional alguna de protones incorporada) en un hidrogel en blanco

La capa primaria del apósito estaba constituida por hidrogel de poli-AMPS que contenía nitrito de potasio (30 mM). La capa secundaria estaba constituida por PVA desecado (5%) que contenía L-glutatión (30 mM). No se incorporó fuente adicional alguna de protones en el apósito. El apósito se activó reuniendo la capa primaria y la secundaria. El apósito activado se aplicó sobre una pieza de hidrogel en blanco (30% poli-AMPS). Se midió la generación de GSNO en el apósito y su liberación gradual en el hidrogel en blanco, y los resultados se muestran en la Figura 3.

La concentración de GSNO en el apósito activado alcanzaba el máximo aproximadamente 2 horas después de la activación del apósito. Se produjo luego una disminución uniforme y lenta en la concentración de GSNO debida a su descomposición lenta. Se demostró una liberación gradual lenta de GSNO por el apósito activado al hidrogel en blanco. La concentración de GSNO en el hidrogel en blanco alcanzaba casi el equilibrio con la existente en el apósito aproximadamente al cabo de 25 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Liberación de S-nitrosoglutatión por un hidrogel activado (con sistema glucosa-oxidasa/glucosa como fuente adicional de protones incorporada) en un hidrogel en blanco

El apósito se componía de tres capas: la capa primaria estaba constituida por una matriz de polímero de hidrogel de poli-AMPS que contenía nitrito de potasio (30 mM) y glucosa (5% p/p). La capa secundaria estaba constituida por PVA desecado (5%) que contenía L-glutatión (30 mM). La capa terciaria estaba constituida por una matriz de polímero de hidrogel de poli-AMPS que contenía glucosa-oxidasa (0,035% p/p). El apósito se activó reuniendo las tres capas en la configuración en la que la capa secundaria está estratificada entre las capas primaria y terciaria. El apósito activado se aplicó sobre una pieza de hidrogel en blanco (30% poli-AMPS). Se midieron la generación de GSNO en el apósito y su liberación gradual en el hidrogel en blanco, presentándose los resultados en la Figura 4.

El perfil de concentración de GSNO en el apósito y en el hidrogel en blanco era muy similar al observado en ausencia de fuente adicional de protones (véase el Ejemplo 3). La concentración de GSNO en el apósito activado alcanzaba el máximo aproximadamente dos horas después de la activación del apósito. Se produjo luego una disminución continua y lenta en la concentración de GSNO debida a su descomposición lenta. Se demostró una liberación gradual y lenta de GSNO desde el apósito activado en el hidrogel en blanco.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Liberación de S-nitrosoglutatión por la capa de PVA desecado que contenía S-nitrosoglutatión pre-generado

Se preparó una capa de PVA seco que contenía S-nitrosoglutatión por mezcla de 9 ml de solución de PVA (5% p/p) con 1 ml de L-glutatión (300 mM) y 1 ml de nitrito de potasio (300 mM). La mezcla se secó en una cápsula Petri (60 cm^{2}) a 40ºC durante 5 horas. Esto dio como resultado una película seca que contenía aproximadamente 8 mg de S-nitrosoglutatión por cm^{2}. La liberación de S-nitrosoglutatión por esta película se demostró por colocación de 1 cm^{2} de la película sobre dos capas de poli-AMPS en blanco (30% p/p) de hidrogel y medida de GSNO en las tres capas en momentos determinados (2 h, 6 h y 24 h después de la aplicación de la película). Mientras que la primera capa de hidrogel (es decir, la capa que estaba en contacto con la película que contenía GSNO) servía como la capa de transición, el segundo hidrogel (bajo la capa de transición) se utilizó para mimetizar el ambiente circundante tal como un lecho de herida. La tasa de liberación de GSNO se muestra en la Figura 5.

Se liberaba rápidamente GSNO a partir de la película que contenía GSNO en la capa de transición en la que la concentración de GSNO alcanzaba el máximo aproximadamente al cabo de 2 horas. GSNO era detectable en el hidrogel del fondo varias horas después y su concentración seguía aumentando gradualmente. La cantidad total de GSNO detectable en el sistema completo disminuía gradualmente debido a la descomposición lenta del GSNO.

La Figura 6 ilustra esquemáticamente un apósito de piel de acuerdo con la invención.

El apósito ilustrado es de construcción estratificada y comprende una capa externa opcional o recubrimiento 10 en la forma de un emplasto adecuado para adherirse a la piel 12 de un individuo, a fin de cubrir una herida 14. El recubrimiento 10 incluye un primer componente o capa primaria 18 y un segundo componente o capa secundaria 16.

El primer componente 18 comprende una capa de hidrogel de poli-AMPS que incorpora nitrito de potasio, en la forma de un gel de nitrito, como se especifica anteriormente en la Tabla 1. El segundo componente 16 comprende una capa de PVA desecado que incorpora L-glutatión, en la forma de una capa de glutatión como se especifica anteriormente en la Tabla 2.

El apósito se suministra inicialmente como un sistema multipartito, con los componentes individuales envasados por separado en envases estériles respectivos herméticamente cerrados. Cuando se requiere su utilización, los componentes del apósito se retiran de los envases y se aplican a una herida de manera y orden apropiados para producir el apósito final, como se muestra. Cuando se reúnen los componentes primero y segundo, se activa el gel.

Al activarse el gel, el nitrito comienza a difundirse desde la capa primaria a la secundaria y el tiol se difunde en la dirección opuesta. La mezcladura del nitrito con el tiol da como resultado la generación de S-nitrosoglutatión (GSNO). Una vez producido, el GSNO se libera del apósito al ambiente circundante, donde se descompone para producir óxido nítrico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Un sistema de suministro para la generación de óxido nítrico

GSNO no es adecuado para almacenamiento a largo plazo debido a que se descompone fácilmente para liberar NO. La utilización de una configuración dual de almacenamiento y dispensación de los componentes del apósito permite el almacenamiento separado de las sustancias reaccionantes que, una vez dispensadas, se mezclan para iniciar la reacción a fin de generar S-nitrosoglutatión.

El primer componente se preparó como sigue: el vehículo base utilizado para aportar viscosidad y susceptibilidad de extensión era un material basado en hidrogel, denominado comercialmente Plexajel ASC (United Guardian Inc.). En éste, se diluyó solución salina tamponada con fosfato en relación 1/20 a partir de un stock concentrado 10x (Sigma, D1408). Se añadió nitrito de potasio (Fluka, 60417) para dar una concentración final de 60 mM y se dejó disolver.

El segundo componente se preparó como sigue: se suspendió L-glutatión (forma reducida, Sigma, G4251) en propilenglicol (Fluka 82281) para dar una concentración final equivalente a 60 mM.

Se guardaron ambos componentes por separado. Se obtuvo un dispensador dual de Versdial Inc., que permite el control variable de los volúmenes de dispensación desde las dos cámaras. Las muestras se pusieron en contacto una con otra solamente cuando se dispensaron desde sus cámaras aisladas respectivas.

Para demostrar el efecto del NO generado a partir de los dos reactivos guardados por separado, se investigó el flujo sanguíneo a la superficie de la piel del antebrazo utilizando Doppler láser. Se utilizó un monitor de flujo sanguíneo y temperatura tisular Moor Instruments DRT4 con sondas de piel asociadas para medir el flujo Doppler láser de la piel. Se fijaron dos sondas a la piel, posicionadas para evitar las venas y arterias principales, con una separación aproximada de 5-10 cm. El instrumento se mantuvo en funcionamiento durante 1 minuto para asegurar una respuesta plana. Una de las cámaras se llenó con nitrito y la otra con L-glutatión. Como control, se llenó un segundo juego de cámaras con agua. El nitrito y el L-glutatión se mezclaron inmediatamente antes de su utilización, en cantidades iguales. La mezcla se agitó para asegurar que las partículas de L-glutatión en el propilenglicol se disolvieran en el hidrogel acuoso de nitrito. Se midió luego el flujo Doppler láser de la piel hasta que se observó una meseta, lo que indicaba que se había alcanzado el efecto de vasodilatación máximo.

La Tabla 1 demuestra el efecto de vasodilatación en la piel, cuando se utiliza el sistema de dos componentes. El valor LDF para la mezcla de L-glutatión y nitrito comienza a aumentar al cabo de 2 minutos (después de la aplicación de la muestra) indicando la velocidad de producción de NO y transmisión dérmica. El control de agua se mantiene plano, indicando así que el aumento en el flujo de sangre es debido a la reacción nitrito/GSH. La respuesta máxima de aproximadamente 150 unidades LDF se considera una respuesta fuerte.

TABLA 1

19

Claims

1. Un apósito de piel adaptado, al activarse, para liberar uno o más S-nitrosotioles, en donde los uno o más S-nitrosotioles se generan haciendo reaccionar juntos en el apósito reactivos que comprenden un nitrito y un tiol.

2. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el apósito comprende uno o más componentes de apósito.

3. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el o cada uno de los componentes del apósito se encuentra en forma de una capa.

4. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el o cada uno de los componentes del apósito comprende un vehículo o soporte.

5. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el vehículo o soporte comprende una matriz de polímero.

6. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la matriz de polímero comprende un hidrogel hidratado.

7. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el hidrogel hidratado comprende poli(ácido 2-acrilamido-2-metilpropano-sulfónico) (poli-AMPS) y/o sales del mismo.

8. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la matriz de polímero comprende un polímero desecado.

9. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el polímero comprende poli(alcohol vinílico).

10. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nitrito comprende nitrito de potasio.

11. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el tiol comprende glutatión, preferiblemente L-glutatión.

12. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual los reactivos reaccionan juntos en el apósito al activarse para generar y liberar los uno o más S-nitrosotioles.

13. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el apósito comprende un primer componente de apósito que comprende un nitrito y un segundo componente de apósito que comprende el tiol.

14. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual el primer componente del apósito comprende un hidrogel hidratado y el segundo componente del apósito comprende una matriz de polímero desecada.

15. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el hidrogel hidratado comprende poli-AMPS y/o sales del mismo, y la matriz de polímero desecada comprende poli(alcohol vinílico) desecado.

16. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el cual el apósito incluye y/o genera al activarse una fuente de protones.

17. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 16, que incluye un ácido o tampón ácido en uno o más componentes del apósito.

18. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, que incluye una enzima oxidasa y sustrato para la misma.

19. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual la enzima es glucosa-oxidasa y el sustrato es glucosa.

20. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 dependiente de la reivindicación 13, 14, 15, en el cual el primer componente del apósito incluye el sustrato.

21. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual el segundo componente del apósito incluye la enzima.

22. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 20, en el cual la enzima está incluida en un tercer componente del apósito.

23. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el cual los reactivos reaccionan juntos en el apósito para generar los uno o más S-nitrosotioles antes de la activación para liberar los uno o más S-nitrosotioles.

24. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 23, que incluye S-nitrosotiol en condición seca, inactiva.

25. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 24, en el cual el S-nitrosotiol está presente en un componente del apósito que comprende una matriz de polímero desecada.

26. Un apósito de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el componente del apósito comprende poli(alcohol vinílico) desecado.

27. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el S-nitrosotiol comprende S-nitrosoglutatión.

28. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende dos componentes que son amorfos.

29. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye o para uso con una capa de contacto con la piel que comprende un hidrogel hidratado de poli-AMPS y/o sales del mismo.

30. Un apósito de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el o cada uno de los componentes del apósito se guarda en un envase respectivo antes de ser utilizado.

31. Un método para generar óxido nítrico para propósitos cosméticos sobre o en la proximidad de una superficie del cuerpo, comprendiendo el método hacer reaccionar un nitrito y un tiol en un apósito para generar uno o más S-nitrosotioles que se descomponen espontáneamente para suministrar el óxido nítrico.