JP2008532605A - 皮膚用包帯に関する改良 - Google Patents

Abstract

皮膚包帯は活性化に際して一つ又は複数のＳ−ニトロチオール、好ましくはＳ−ニトロソ−Ｌ−グルタチオンを放出するように適合されている。Ｓ−ニトロソチオールは自然分解して亜硝酸酸化物を生成し、これは組織、特に創傷治療に有益な効果を有する。
【選択図】 図６

Description

発明の技術分野

本発明は、ヒト又は動物の身体の一部へ皮膚の処置（治療又は美容目的）のために施す皮膚用包帯に関し、特に（但し、専らではなく）、障害が生じた皮膚、特に負傷か疾病かに拘らず、皮膚表面における何らかの障害、即ち皮膚潰瘍、火傷、切創、刺創、裂創、鈍的外創、座庖損傷、炎症等を含む皮膚損傷の処置のための創傷包帯に関する。用語「皮膚用包帯」とは、薬剤の経皮的到達に関連して使用するための眼帯、絆創膏、緊急絆、ガーゼなどの包帯を包含する。この用語は非晶質又は液体状の材料も含む。この用語は身体表面（一般に内部及び外部組織を含む）、特に、頭皮を含む皮膚へ施す包帯を包含する。本発明は酸化窒素（ＮＯ）の有益な特性に基いている。

酸化窒素の物理的及び化学的特性
酸化窒素（ＮＯ）は短寿命で不安定な気体状物質である。その不安定さは窒素の不対電子に起因している。

不対電子を有する不安定物質として、酸化窒素は遊離基として説明できる。しかしながら、寿命が数ミリセコンド程度の代表的な自由基（例：水酸基、スーパーオキシド）に比べると、酸化窒素は比較的に安定である。通常は、酸化窒素はその生成の数秒以内に、より安定な化学種へ変換される。従って例えば気体状酸化窒素が空気に接触すると、これは迅速に酸素と反応して以下のように二酸化窒素（褐色ガス）を生成する。

或る条件化では、例えば純粋な気体状態では、ＮＯは目立った喪失も無く非常に長時間に亘って保管することができる。ＮＯは純粋な脱酸素水溶液でも比較的に安定である。

ＮＯは非常に疎水性の化合物であるので、その水に対する溶解性は限定される。通常の条件化で達成可能な水に対する最大溶解度は約１．７ｍＭであり、この溶解度は酸素のそれと同様である。

水溶液では、下記の反応スキームに示すように、溶解した酸素による酸化窒素の溶解が生じる。溶解ＮＯ及びＯ_２の所定の速度定数及び低濃縮度にもかかわらず、この反応は、気体状態（酸素の濃縮度が非常に高い）におけるような迅速なものではない。しかしながら、この反応は水及び脂質を含有する異種環境においては促進される。純粋な疎水性環境（例えば脂質膜）では、反応は事実上３００フォールドに加速される。ひとたび生成されると、二酸化窒素は酸化窒素の他の分子と迅速に反応して三酸化二窒素（Ｎ_２Ｏ_３ ）を生じさせる。Ｎ_２Ｏ_３はチオールをニトロソチオールへ変換できる強力なニトロソ化剤である。水和すると、Ｎ_２Ｏ_３は亜硝酸を生成し、これは亜硝酸塩へ解離する。亜硝酸塩は酸素の存在下で硝酸塩へ酸化する。

酸化窒素及び自由基
酸化窒素は自由基として説明できる（上記参照）が、スーパーオキシド（Ｏ_２）と称される他の強力な自由基のスカベンジャーである。酸化窒素とスーパーオキシドとの反応は大量のペルオキシ亜硝酸をもたらす。

ペルオキシ亜硝酸は強力な酸化剤にして硝酸化剤である。これは、その短い寿命期間中に酸化により有害化学物質として例えば細胞膜の部分に作用して、ひいては細胞を殺傷する。従ってペルオキシ亜硝酸は感染バクテリアとの闘いには有益なツールである。重要なことには、ペルオキシ亜硝酸を硝酸塩へ変換する迅速な異性化反応に起因して、そのホストの細胞を損なう効能は最小限である。

過剰なペルオキシ亜硝酸は良性種（硝酸塩）となり、これは尿中の排出に理想的である。これはホストの細胞の深刻な損傷をもたらす能力のあるペルオキシ亜硝酸の蓄積を防止する。

Ｓ−ニトロソチオール
Ｓ―ニトロソチオール（単にニトロソチオールと称することもある）は酸化窒素を解放する能力をもつ化学物質である。Ｓ―ニトロソチオールは、ニトロソ化剤としてＮ_２Ｏ_３（式４）又はニトロソニウムカチオン（式５）を用いてチオールをニトロソ化して生成することができる。

ニトロソ化種としてＮ_２Ｏ_３を用いる処理は生体内で非常に重要であり、第２の処理は生体内ニトロソチオールの生成のために有益である。ニトロソニウムカチオンは酸性ｐＨにて亜硝酸から生成することができる。

従ってＳ−ニトロソチオールは、チオール（例：グルタチオン）を亜硝酸源（例：亜硝酸カリウム）と酸化溶液内で混合することにより実験室内で容易に生産することができる。この反応はｐＨ＜６にて進行し、反応速度は溶液の酸性度により増大する。

ニトロソチオールは自然分解により遊離酸化窒素へ解放される。

分解速度はチオールの側鎖に大きく依存して変動する。例えば、ニトロソシステインは標準状態では数分内に全体的に分解するが、ニトロソグルタチオンの１００％分解に達するには数時間／数日を要する。一般に、この分解はＣｕ^２＋及びＨｇ^２＋の存在により促進される。

ＷＯ９８／２００１５は、介在構成成分を介してモノ(mono-)、ジ(di-)、又は三糖類成分へ結合したＳ−ニトロソチオール基からなる化合物を開示しており、その介在構成成分はＳ−ニトロソチオール基を安定化してその分解を減速させる。経皮貼布が開示されており、これはＳ−ニトロソチオールを活性化形態、即ち活性化の必要性を伴わずに酸化窒素を生成する形態で用いる。

ニトロソチオールは酸化窒素を直接に他のチオール基にすることにも寄与する。この過程、所謂トランス−ニトロソ化は生体内では極く普通にみられる。

生体系内の酸化窒素
酸化窒素シンターゼ
酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）は生体内でＬアルギニンからＮＯを生成する酵素である。

基質（Ｌアルギニン及び酸素）は別として、酵素は、補酵素ニコチアミド アデニン ジヌクレオチド燐酸塩（ＮＡＤＰＨ）及びテトラヒドロバイオプテリン（ＢＨ^＋）の存在を必要とする。

酵素は三種類の異なるイソフォームで存在する。各々のイソフォームは、ＮＯを合成するが、この合成はそれぞれ異なる条件化でなされる。

ＮＯＳ１（又はｎＮＯＳ）は、ニューロン中に見られるニューラルイソフォームである。このイソフォームにより生成された酸化窒素は、複数のニューロンの間の間隙に跨る神経情報の処理であるシナプス伝達に関係している。

ＮＯＳ２（又はｉＮＯＳ）はマクロファージにより誘導された誘発形態である。ＮＯＳ２は流動するまで数時間を要し、その反応は傷又は感染過程に起因する。この酵素は非常に高濃縮のＮＯを生成し、これはある程度は細菌の殺菌に寄与し、また或る程度は組織修復処理に寄与する。換言すれば、身体が傷に対する炎症性反応を始めると、高濃縮のＮＯ（通常の１００乃至１０００倍）が局所的に生成される傷の部位へマクロファージが貼り付く。ＮＯＳ１とは異なり、標準的なニューロ伝達の一環として常に活性であって、何らかの異常（創傷、組織損傷、低酸素症、細菌性感染等）がｉＮＯＳを誘発する。

第三のイソフォームはＮＯＳ３（又はｅＮＯＳ）である。このイソフォームは常に活性であり、内皮細胞（血管及びリンパ管の内面を覆う細胞）内に見られる。ｅＮＯＳにより生成されたＮＯは血管の径を維持して、組織（皮膚、筋肉、神経及び骨）のかん流を最適レベルに維持する。更に、ｅＮＯＳ媒介ＮＯは、新たな血管の成長である新血管形成を引き起こす。これは皮膚の潰瘍又は創傷の治癒に特に重要である。

酸化窒素の生物学的効果
酸化窒素は生体組織における多数の効果を有する。これらの効果の機構の殆どは、酸化窒素の金属成分（代表的には鉄）又は鍵酵素のチノール基の何れかと他の蛋白質との相互作用に基いている。特定の酵素に依存して、このような相互作用は酵素の活性化又は抑制を導く。酵素の活性化に基く効果の一例は血管拡張効果であり、ここでは酸化窒素が酵素グアニル酸シクラーゼのヘム鉄と結合し、これは酵素の触媒部位を露呈させる構造変化をもたらす。 これはＧＴＰのｃＧＭＰへの触媒転換を導く。 この変換は、タンパク質リン酸化及び筋肉緩和(血管拡張)を導く全体的なカスケード反応を開始させる。

酸化窒素による酵素又は増殖因子の活性化に基く他の効果は、細胞分裂(増殖)及び細胞成熟の刺激と、細胞分化の刺激及び細胞受容体の形成、新生血管形成、創傷における線維芽細胞の形成及びそれによるコラーゲン生成の増進などを含む。要するに酸化窒素は、細胞の増殖と分化を調整する重要なものである。

それにも拘らず、酸化窒素は逆効果、即ち細胞死を引き起こす能力もある。これは通常は、必須酵素(例えばシトクロムcなどの呼吸鎖にかかわる酵素)の鉄硫黄クラスターの鉄へ結合するＮＯにより達成され、酵素阻害とその後の細胞死を導く。またＮＯは、細胞自然死若しくはプログラム細胞死と称される過程の原因となる遺伝子を刺激することを示す或る実験的な証拠もある。 細胞自然死は、新鮮な組織に置き換えられる老化細胞又は障害のある細胞の除去による成熟組織の日々の維持に関係する連続的な過程である。

基本的に重要な多数の過程のおける酸化窒素の係わり合いは、先に簡単に述べたように、この分子を健康な生きている組織の成長及び維持における重要なものにする。損傷組織の修復におけるその重要性は以下により詳細に概説する。

米国特許第６，１０３，２７５号は、亜硝酸塩、還元剤、及び特定の酸を結び付けることにより酸化窒素を発生させる生体適合系を開示している。亜硝酸塩と酸とは通常は使用時まで分離されて保持される。

創傷治癒における酸化窒素
ｉＮＯＳとｅＮＯＳとの両方は創傷治癒の修復機構における重要な役割を果たす。正常な創傷治癒過程の第１段階では、ＮＯがｉＮＯＳＳから生成され、その目的は(i)感染との闘い、(ii)不可逆な損傷をしている壊死組織の除去、及び（iii）新血管形成の開始である。これはしばしば創傷修復の炎症段階と称される。 通常、この段階は約１０日間続く。この段階の終わりまでには、肉芽組織は強健になる。ｉＮＯＳから次第に引き継がれるｅＮＯＳの活性の増大により血管新生が生じる。

ｅＮＯＳの活性化の増加は、更なる血管新生及び血管拡張をもたらし、治癒過程を継続させる。血管拡張は、修復組織への血液供給と損傷組織からの血液除去との両方を促進させる。後者は、代謝廃棄生成物を取り除いて浮腫を低減させることにより、そのようにしない場合に毛細血管を圧縮してしまう膨張を予防する。適切な血液供給がなければ、組織は低酸素のままでせいぜい緩慢に回復するであろう。更に、ｉＮＯＳは主に白血球によって生成されるので、血管拡張は感染から保護する必要のある領域への付加的な血液細胞の輸送を可能とする。

しかしながら糖尿病患者においては、ｅＮＯＳ活性はしばしば標準を大きく下回るので、これらの患者は正規の水準ではＮＯを生成することができず、ひいては創傷治癒が遅れる。ＮＯの利用可能性は、糖尿病患者においては、ＮＯを除去する超酸化物の生成、及びＮＯＳの拮抗阻害剤であるジメチルアルジニンの(腎臓機能障害に起因する)生成により更に低下する。

不充分な血管新生及び過剰な酸化的ストレス（即ち、超酸化物の高生成)も静脈性潰瘍の治癒におけるＮＯの有益な効果を制限する。

発明の概要
本発明は活性化により一つ又は複数のＳニトロソチオールを放出するのに適した皮膚用包帯を提供する。従って、この包帯は、それが活性化するまでは一つ又は複数のＳニトロソチオールを放出しないという意味においては、不活性である。それ故に、本発明は不活性包帯、即ち、一つ又は複数のＳニトロソチオールを放出するように機能しない形態の包帯に関する。しかしながら当該包帯は、以下に説明するように、一つ又は複数のＳニトロソチオールを放出する形態へ活性化することができる。この包帯は使用前には不活性状態に保たれており、使用する必要があるときに活性化される。

Ｓニトロソチオール（活性化により解放される)は自然に分解して、上述して８式に示したように、酸化窒素及びチオールの酸化形態を生成する。包帯は、活性化の際には、代表的には皮膚上（例えば創傷中へ放出される酸化窒素により処置すべき皮膚上又はその近傍が通例である）で使用されて酸化窒素供与体として機能し、放出されたＳニトロソチオールから酸化窒素を生成する。酸化窒素は、上述のように特に創傷治癒において有益な効果を組織に及ぼす。酸化窒素は血管拡張剤としても機能して、その付近の毛細血管を開放させる。この効果は、物質（例えばホルモン、鎮痛剤など）の経皮的投与を増大させ、その物質の投与及び体内摂取を促進する。従ってこの包帯は、代表的には合成包帯又はパッチ、絆創膏、救急絆、ガーゼ等を持たせ、また投与用の物質を包含させることにより、経皮的投与のための補助具として用いることができる。

酸化窒素はレイノー症候群として知られる症状を緩和する際に特に役立つであろう。

発明者の更なる関心事項は、動脈再狭窄(狭窄)及び/又は外科手術の後に起こる血栓症を処置又は防止する手段である。 経皮経管的血管形成（ＰＣＴＡ）中の内皮に対する物理的損傷又は内皮の除去は、ＰＣＴＡに続く際狭窄の高発生率の主要な要因である（Ｌａｎｇｆｏｒｄ他、Ｌａｎｃｅｔ ３４４，１４５８−１４６０）。

適宜なＳ−ニトロソチオールは以下を含む。即ちＳ−ニトロソグルタチオン(生理的に重要な種類であることから、好ましくはＳ−ニトロソＬグルタチオン）、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソカプトリル、Ｓ−ニトロソマーカプトエチルアミン、Ｓ−ニトロソ−３−マーカプトプロパノイック酸、Ｓ−ニトロソ−Ｄ−チオグルコース、及びＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−ペニシルラミンである。Ｓ−ニトロソグルタチオンは今のところ最も好ましいものである。というのは、その酸化窒素を生成する比較的に遅い分解速度が包帯内のＳ−ニトロソチオールの充分な安定性をもたらす結果、適宜な速度での酸化窒素の緩慢な解放は皮膚に役立つ。

包帯は一つ又は複数の包帯要素を含み、この包帯要素は代表的には一つ又は複数の試薬（Ｓ−ニトロソチオール又はその先駆物質のどちらか）を含み、これは包帯の活性化により包帯からＳ−ニトロソチオールを（おそらくは包帯における生成の後に）解放するように働く。使用に先立っては、包帯を不活性状態に保って、Ｓ−ニトロソチオールの時期尚早な解放を防止する。

包帯内の試薬を共に反応させることにより、一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールが好ましく生成される。

包帯は複数の試薬を包含しており、これらは包帯の活性化の際に包帯内で共に反応して、Ｓ−ニトロソチオールを生成して解放する。例えば包帯は亜硝酸塩（例：亜硝酸カリウム）、及びチノール（例：Ｌ−グルタチオン）を包含してもよい。酸性溶液内で結び付くと、試薬は共に反応して、上述の式７に記載したように、Ｓ−ニトロソチオールを生成する。複数の試薬は包帯の個別の要素内に適宜に与えられて、これらの要素は使用の必要が生じるまで別々に（例えば個別のパッケージに入れて）保持される。使用に際して包帯を活性化するためには、二つの包帯要素を接触状態(必要とあれば、水の供給源と陽子の存在下で)にして、次いで包帯から解放されたＳ−ニトロソチオールの包帯内における生成をもたらす。

代替的に、以下に説明するように、Ｓ−ニトロソチオールを解放する活性化の前に、試薬が包帯内で反応してＳ−ニトロソチオールを生成するようにしてもよい。不活性状態にとどめるために、Ｓ−ニトロソチオールは乾燥状態におかねばならない。包帯を湿らせると、Ｓ−ニトロソチオールが解放される。従って包帯は水に晒すこと（例えば湿気の多い創傷床との接触）により容易に活性化することができる。Ｓ−ニトロソチオールは上述のように亜硝酸塩とチオールとの反応により包帯内に生成されるのが通例である。

試薬の適宜な量は、所望の量のＳ−ニトロソチオールを生成するように容易に決めることができる。 一般に、各試薬の量は１−５０ｍＭの範囲内であることが好ましいと思われる。

特定の又は各々の包帯要素は、層の形態、例えばシート、スラブ、又は膜形態としてもよく、これは非晶質材料から生成できる。固定した形態又は形状は、ノズルを通過する際に絞られることを含めて三次元的に変形及び形状付けされてしまうので、包帯要素はそのような固定した形態又は形状を有さない。

特定の又は各々の包帯要素は、代表的にはポリマー・マトリックスの形態で担持体又は支持体を備えることが便利である。担持体は後述するように堅くてもよく、非晶質でもよい。

担持体又は支持体は水和されたヒドロゲルを含むことが都合がよい。水和されたヒドロゲルは、水和形態において一つ以上の水に基く又は水のゲルを意味する。その結果、水和されたヒドロゲルは包帯の活性化のための水供給源を含んでいる。水和されたヒドロゲルは、創傷部位から染み出す水及びその他の物質を吸収するように働くこともできるので、包帯が創傷部位からそのような物質を取り除くことによる有意義で有益な機能を果たすことを可能とする。水和されたヒドロゲルは湿気の供給源も提供するので、使用時に創傷部位を湿潤状態に維持して治癒を助けるように働くことができる。

適宜な水和されたヒドロゲルがＷＯ０３／０９０８００号に開示されている。水和されたヒドロゲルは親水性ポリマー材料を都合よく含む。 適宜な親水性ポリマー材料はポリアクリレート及びメタクリル酸を含んでおり、これは例えば以下を含む。即ち 工業所有権であるヒドロゲルの形態でＦｉｒｓｔ Ｗａｔｅｒ Ｌｔｄにより供給されており、ポリ−２−アクリラミド−２−メチルプロパン−スルホン酸（ｐｏｌｙ−ＡＭＰＳ）及び／又はその塩類（例えばＷＯ １／９６４２２に開示された如し）、多糖類、例えば多糖類ゴム、特にキサンタンゴム（例えば登録商標Ｋｅｌｔｒｏｌの下に入手可能なもの）、様々な砂糖、ポリカルボン酸(例えば、ＩＳＰヨーロッパから登録商標Ｇａｎｔｒｅｚ ＡＮ−１６９ＢＦの下に入手可能なもの)、ポリー(メチル・ビニル・エーテル共同無水マレイン酸) (例えば登録商標Ｇａｎｔｒｅｚ ＡＮ−１３９の下に入手可能であり、分子重量範囲が２０，０００乃至４０，０００のもの）、 ポリビニル・ピロリドン(例えばＰＶＰ Ｋ−３０及びＰＶＰ Ｋ−９０として知られている商業的に入手可能な等級のもの）、ポリエチレン・オキシド(例えば登録商標Ｐｏｌｙｏｘ ＷＳＲ−３０１の下に入手可能なもの)、ポリビニル・アルコール(例えば登録商標Ｅｌｖａｎｏｌの下に入手可能なもの)、架橋処理されたポリアクリル酸重合体(例えば登録商標Ｃａｒｂｏｐｏｌ ＥＺ−１の下に入手可能なもの)、セルロース及びヒドロキシプロピルを含む修飾セルロース（例えば登録商標Ｋｌｕｃｅｌ ＥＥＦの下に入手可能なもの)、ナトリウムカーボメチルセルロース(例えば登録商標Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｇｕｍ ７ＬＦ）及びヒドロキシエチル・セルロース(例えば登録商標Ｎａｔｒｏｓｏｌ ２５０ＬＲの下に入手可能なもの）である。

親水性ポリマーの材料の混合物をゲルで使用してもよい。

親水性ポリマー材料の水和されたヒドロゲルにおいて、親水性ポリマー材料はゲルの総重量に基く重量で以下の濃度で存在することが望ましい。即ち、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、更に好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％である。ゲルの総重量に基く重量で最大約４０％までのより多くの量を用いてもよい。

ポリ−ＡＭＰの水和されたヒドロゲル及びその塩類の使用によって得られた良好な結果は、ゲルの総重量の重量で約３０％の量にある。

親水性ポリマー材料の比較的高い濃度(重量で少なくとも２％）を含むゲルの使用によれば、包帯の使用中に、創傷に接触している間、ゲルは例えば血清浸出物からの水を吸収するように特に有効に機能する。 ゲルが水溶液系であるので、包帯の使用には、創傷の全体的な乾性を誘発する望ましくない影響がない。 これは包帯の使用中に皮膚を囲む閉鎖環境で水蒸気圧が維持されるためである。 従ってゲルは、湿気（例えば創傷滲出物）の除去のための吸収体として働くので、余分な湿気の有益な背景濃度を提供する。

高濃度ゲルを含む水和されたヒドロゲルの水吸収容量は、包帯に相当な量の浸出液を除去させて（それにつれて包帯が膨らむ）、創傷の治癒を助ける。慎重に処方されて準備された水和ゲルを使用することにより、創傷が望ましくない乾性状態になることが防止される。すぐに使える水和は、包帯と創傷との間の水溶性液体界面の迅速な構成を確実なものとして付着を防ぐ。そのような付着が生じると、包帯を交換する際に、包帯を容易に持ち上げることを妨げてしまう。創傷と包帯との間の良好な水溶性液体界面は、ゲルで輸送された有益な生産物を、利用可能な全ての面を通じて創傷へ入ることができるようにする点でも重要である。

水和されたヒドロゲル材料は、通常は材料の固体の層、シート又は膜であり、通常は架橋処理されており、機械的な補強構造を組み込んでもよい。層、シート又は膜の寸法及び形状は包帯の用途に合わせて選択することができる。特に適宜な厚さの範囲は０．０５乃至５ｍｍ、好ましくは０．５乃至３ｍｍである。

代替的に、水和ヒドロゲルは固定形態又は形状を持たない非晶質ゲルの形態として、ノズルを通過するときの狭窄を含めて、三次元的に変形して形状付けられてもよい。非晶質ゲルは、通常は架橋処理されていないか、或いは低レベルの架橋を有する。剪断薄層化非晶質ゲルを使用できるであろう。このようなゲルは、剪断応力を被るとき(例えば、ノズルを通して注がれるか狭窄されるとき)には液体であるが、静的なときは固まる。従ってゲルは、注ぐことができるか又は圧搾可能な成分の形態として、即ちピストン及びシリンダを含めて、通常は約３ｍｍ径のノズルにより、例えば圧縮性チューブか注射器状のディスペンサーから分与できるようにしてもよい。このようなゲルは表面層の形態に施すことができ、又は利用可能な空間を満たして創傷表面に接触する完全に適合可能なゲルとして創傷の窪みへ施すことができる。

非晶質ゲルの処方の典型的な例は、１５％ ｗ／ｗ ＡＭＰＳ（ナトリウム塩）、０．１９％ ポリエチレン・グリコール・ジアクリレイト、及び０．０１％ ヒドロキシシクロヘキシル・フェニール・ケトン、並びに容積１００％までの分析グレードＤＩ水である。試薬は完全に混合されて分解され、次いで約１００ｍＷ／ｃｍ^２を与えるＵＶ−Ａランプを用いて３０−６０秒に亘って重合して、要求されるヒドロゲルを形成する。これはプラスチック注射器に包含して、この注射器から非晶質ゲルを表面層としての対象部位へ分与するか、又は対象部位の窪みを充填する。

水和ヒドロゲルは担持体又は支持体として使用することが一般に好ましいが、担持体又は支持体は乾いた状態にある材料からなるものに代えて、代表的には乾燥ポリメリック・マトリックスで存在する試薬とすることができる。

乾いた状態は材料内に自由水が存在しないことを意味し、温度、圧力及び湿度の通常の雰囲気条件下のでは、大幅な即ち無視できないような水の蒸発散は起こらない。乾いた状態は乾燥状態を含み、これは極度に徹底した乾燥状態である。乾燥状態は不透湿性遮蔽体で閉ざされた環境へ収容されることにより保持される状態であって、材料は付加的な乾燥剤により水がないように綿密に保たれている。

材料は乾いた状態であるので、試薬は安定状態にあり、材料中に保持される。材料は長期間に亘って安定状態下で保管することができ、その中では試薬が安定を保っている。

材料が例えば水の供給源と接触により湿らされると、試薬は溶解して解放される。材料と水供給源との間に接触液体合流点を形成するのために充分な水が必要である。

試薬は通常は固形材料内に組み込まれており、材料中で分散される。固形材料は、試薬がそこに分散されている状態で、マトリクスを（好ましくは適度に均質に）含むのが通例である。

固形材料は好ましくは高分子材料を含む。

一つの好ましい高分子材料はポリビニル・アルコール（ＰＶＡ）を包括する。ＰＶＡは皮膚治療の使用のために都合のよい許容可能な特性（例えば無毒で存在する）を持つ。またＰＶＡは取り扱い及び使用が容易であるので、水におけるＰＶＡ溶液を乾燥させて容易に膜を形成でき、その膜は取り扱いが容易となる。ＰＶＡはまた入手が容易であり、しかも安価である。 架橋剤は、固形材料を例えば膜の形態に形成するには必要ではないが、選択的に架橋剤を採用してもよい。ＰＶＡは材料の物理的特性に影響する分子重量及び加水分解の程度に基く広範囲の様々なグレードを利用可能である。 特定の意図した使用についての望ましい特性を有する高分子製品を生産するように適宜なグレードのＰＶＡを選択することができる。 例えば、皮膚包帯における使用のために良好な結果が得られたＰＶＡは、分子重量が１００，０００乃至２００，０００の範囲であり、実質的に完全に加水分解され（９８−９９％が加水分解した)、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈのコード３６，３１６−２の形態で、非架橋形態である。

他の適宜な高分子材料はポリビニールピロリドン（ＰＶＰ）を含む。ＰＶＰの特性はＰＶＡのそれに非常に似ており、ＰＶＰも皮膚治療用に容認できる。ＰＶＰは様々な異なる分子重量の範囲で容易に入手可能です。 ＰＶＰの適宜なグレードを容易に選択することができる。 例えば、良好な結果が得られたときに使用したＰＶＰは、分子重量平均３６０，０００を有し、例えばＳｉｇｍａのコードＰＶＰ３６０の形態であり、非架橋形態である。

高分子材料の混合体を用いてもよい。

固体材料は、シート、層又は膜の都合の良い形状にあり、その厚さは代表的には０．０１乃至１．０ｍｍであり、好ましくは０．０５乃至０．５ｍｍの範囲である。

固体材料は、湿ったときに剛性を与える支持体を選択的に含む。

本発明の固体材料はポリマー（例えばＰＶＡ及び／又はＰＶＰの水溶液)の溶液と試薬を混合し、その混合体を乾燥させて固体材料を形成し、例えば成型処理により膜を形成する。適宜な技術は当業者にはよく知られている。

単独又は複数の高分子材料が膜の形成をもたらす適宜な量で使用され、濃縮の上限は通常は溶解度(一般に水の)の限界で定められ、濃縮度の下限は膜が形成されないポイントである。ＡｌｄｒｉｃｈのＰＶＡコード３６，３１６−２については、水における溶解度の限界は約６％ｗ／ｗであり、約５％の乾燥に先立ってのＰＶＡの濃縮がもたらされた。

水和されたヒドロゲル、特にポリ−ＡＭＰ（担体即ち支持体として一般に好ましい）を使用すると、チオールＬ-グルタチオンをポリ−ＡＭＰヒドロゲルに組み込む際に実践的な問題点が生じるので、これに代えて、この試薬は上述したように乾燥材料（例えば乾燥ＰＶＡポリメリック・マトリックス）を含む担体に与えられるのが一般的である。

従って、本発明の好ましい実施の形態では、水和されたヒドロゲル（好ましくはポリ−ＡＭＰ及び／又はその塩類）の層であって、亜硝酸塩（例えば亜硝酸カリウム）の供給源からなる第１の要素と、チオール(例えば、Ｌ−グルタチオン)を包含する乾燥ポリメリック・マトリクス（好ましくは乾燥ＰＶＡ）からなる第２の要素とを備える。第１の要素は上述のように水和されたヒドロゲルには皮膚の接触に有益な特性があるので、第１の要素を皮膚に接触させて用いて、この第１の要素の上に第２の要素を配置するようにしてもよい。使用に先立って、これらの要素が個別に保存されるならば、包帯は非活性状態に留まる。しかしながら、２つの要素が接触させられたとき、包帯の活性化の効果がある。第１の要素の水和ヒドロゲルにおける水は、適宜な水性環境を与えるように機能して、酸性であるＬ-グルタチオンと共に陽子の供給源として働き、反応のために必要な酸性環境を与える。

包帯の活性化に際し、亜硝酸塩が第１の要素（又は一次層）から第２の要素（又は二次層）へ拡散し始め、チオールは逆方向に拡散する。亜硝酸塩をチオールに酸性溶液で混合することはＳ−ニトロソチオールの遅い成長を生じる。チオールがＬ-グルタチオンであるならば、反応の生成物はＳ-ニトロソＬ-グルタチオンである。一旦生成されると、Ｓ−ニトロソチオールは包帯から周囲環境、例えば創傷床へ放出され、そこで分解して酸化窒素を生成し、重要な利点を与える。これらの反応は以下に示されるとおりである。

活性化包帯により発生するべき好ましい酸化窒素供与体はＳ−ニトログルタチオン（ＧＳＮＯ）である。グルタチオン及び亜硝酸塩を含有する水性環境におけるＧＳＮＯ生成速度はｐＨ に依存している。 速度はｐＨ７では無視できる程であるが、酸性のｐＨ（＜６）ではそれを観測できる。ｐＨ５(又はより低い)は、満足できる速度で反応を進行させるのに充分である。ポリ−ＡＭＰＳヒドロゲル(ナトリウム対イオンを有する)、第１の要素即ち一次層の好ましい材料のｐＨは約７であるので、陽子の供給源は、ＧＳＮＯ生産を進行させるためにｐＨ５又はそれ未満を達成するために必要である。 グルタチオン(第２の要素即ち二次層内に組み込まれている)がそれ自体で活性化包帯におけるＧＳＮＯの生成を許容するために陽子を提供できる酸性化合物であるので、陽子の付加的な供給源は不可欠ではない。

活性包帯におけるＧＳＮＯの生成は、活性化の約２時間後にピークになり（下記の例２参照）のＧＳＮＯの総量が試薬（亜硝酸塩とグルタチオン)の使用に起因して漸次に減少してＧＳＮＯの分解が遅くなる。活性化包帯のＧＳＮＯの開放率は、創傷床の代わりとして空のポリ−ＡＭＰＳ ヒドロゲルを用いてモデル化した（下記の例３参照）。

包帯は活性化に際して選択的に（可能であれば付加的に）陽子の供給源を含み及び／又は生成する。

例えば、酸、例えば乳酸、更に好ましくは酸性緩衝液、例えばクエン酸塩緩衝液、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液等は、第１及び第２包帯要素のうちの一方又は両方に含めてもよい。

陽子の付加的な供給源の組み込みは、活性化包帯の内側のＳ−ニトロソチオール生成速度の統制度を可能にする。生成速度は組み込まれた緩衝液により調整された包帯の活性度と共に増大する。従って、例えばＳ−ニトロソチオールの生成速度は、リン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）が陽子の供給源として組み込まれているのであれば、クエン酸緩衝液（ｐＨ３）の組み込みに比べて遅くなる。

選択的に、陽子の供給源は、ｐＨを例えば亜硝酸塩及びチオールの反応が起こる点まで低減させることにより、包帯を活性化させるのに用いることができる。例えば、亜硝酸塩及びチオールはｐＨ約７以上で共に保つことができた。活性化に際して、ｐＨが下降して反応を起し、一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを生成する。

更なる可能性として、活性化に際して、例えばオキシダーゼ酵素/基板系から包帯中に陽子が発生するであろう。適切な基質と酸素とのオキシダーゼ酵素触媒反応は、過酸化水素と酸を生成し、酸は、陽子を生成するように解離する。様々な酵素/基質対がＷＯ ０３／０９０８００号に開示されている。好ましいオキシダーゼ/基板系は、ブドウ糖オキシダーゼ及びブドウ糖である。 ブドウ糖オキシダーゼは、過酸化水素とグルコン酸を生成するように酸素でブドウ糖の酸化を促進する。 グルコン酸がグルコン酸塩負イオンと陽子を生成するように解離して、その結果、陽子の供給源として働くことができる。

酵素及び対応する基質は都合よく別々の包帯要素（上述の第１及び第２の要素に対応するか、或いは異なる）に組み込まれので、包帯の活性化に先立って接触することはない。しかしながら包帯の活性化に際しては、酵素と基質とは接触を可能にする連通状態になり、陽子の生成をもたらす。

基板は都合よく第１の要素即ち一次層に組み込まれ、酵素は、使用中に皮膚と接触しない要素、例えば上と称する第２の要素即ち二次層へ組み込むことが好ましい。従って、一つの好ましい配置では、第１の包帯要素即ち一次層が、ポリマーマトリックス（好ましくはポリマ−ＡＭＰＳ 水和ヒドロゲル）を含み、これは亜硝酸塩（好ましくはカリウム亜硝酸塩）の供給源とオキシダーゼ酵素（好ましくはブドウ糖)のために基板を含み、第２の包帯要素即ち二次層がポリマーマトリックス（好ましくは乾燥ＰＶＡ）を含み、これはチオール(好ましくはＬ−グルタチオン)及びオキシダーゼ酵素(好ましくはブドウ糖酸化酵素)を含む。

活性化に際しては、亜硝酸塩、及びブドウ糖は一次層から二次層へ拡散し始め、チオールは逆方向に拡散する。ポリマー・マトリクス内のブドウ糖オキシダーゼの移動性は非常に限られているので、酵素は通常は二次層内に閉じ込められてとどまる。 二次層内でブドウ糖をブドウ糖オキシダーゼに混合入している間、陽子の生成がもたらされ、亜硝酸塩のチオールとの混合は、Ｓ−ニトロソチオール生成をもたらす。二次層で発生した陽子は包帯の内側のＳ−ニトロソチオール生成速度を増大させる。一旦に生産されると、Ｓ−ニトロソチオールは包帯から周囲環境へ放出されて、ここで分解して酸化窒素を生成する。

更なる可能性として、包帯は三つの要素からなることもできる。第１の要素即ち一次層第１の包帯要素即ち一次層が、ポリマーマトリックス（好ましくはポリマ−ＡＭＰＳ ヒドロゲル）を含み、これは亜硝酸塩（好ましくはカリウム亜硝酸塩）の供給源とオキシダーゼ酵素（好ましくはブドウ糖)のために基板を含み、第２の包帯要素即ち二次層がポリマーマトリックス（好ましくは乾燥ＰＶＡ）を含み、これはチオール(好ましくはＬ−グルタチオン)と、第３の層即ち三次層は、ポリマーマトリックス（好ましくはポリマ−ＡＭＰＳ ヒドロゲル）を含み、これはオキシダーゼ酵素（好ましくはブドウ糖オキシダーゼ）を包含する。包帯は、全ての３つの層を一緒にすることによって、活性化することができる。 層が組み立てられる特定の順序は重要ではない。それにも拘らず、好ましい配置は、二次層が第一の層と第三の層との間に挟まれたものである。

活性化に際し、亜硝酸塩及びブドウ糖は一次層から二次層及び第三層へ、第二層の中に拡散し始め、チオールは二次層から遠くへ拡散する。ポリマー・マトリクスによるブドウ糖オキシダーゼの移動性が非常に限られているので、酵素は第三層の中に閉じこめられて殆ど残るであろう。第３層内でブドウ糖にブドウ糖オキシダーゼを混合すると、陽子の生成がもたらされ、亜硝酸塩とチオールの混合はＳ−ニトロソチオールの生成をもたらす。第３層内で発生した陽子は包帯全体に亘って広がり、包帯の内側のＳ−ニトロソチオール生産速度を上昇させる。一旦生産されると、Ｓ−ニトロソチオールは包帯から周囲環境へ放出されて、ここで分解して酸化窒素を生成する。この反応は以下に表されるとおりである。

活性化の際に包帯内で共に反応してＳ−ニトロソチオールを生成して放出する試薬を包含する包帯に代えて、包帯は、不活性状態におけるＳ−ニトロソチオール（場合により自然位で予め生成される）を、活性化の際に放出されるＳ−ニトロソチオールと共に包含してもよい。Ｓ−ニトロソチオール（好ましくはＳ−ニトロソ−Ｌ−グルタチオン）は上述のように包帯要素内に、好ましくは層の形体（例えばシート、スラブ又は膜の形態で適宜に設けられる）。包帯要素は代表的にはポリメリックマトリックスの形体で担持体又は支持体を適宜に含む。

非活性状態にとどめる目的で、Ｓ−ニトロソチオールは乾燥状態におかなければならない。担持体又は支持体も乾燥状態におき、Ｓ−ニトロソチオールは乾燥ポリメリックマトリックスに都合よく現れる。これは上述した通りであり、乾燥ＰＶＡを適宜に包含する。包帯が湿った際に、Ｓ−ニトロソチオールが放出される。従って包帯は、（例えば湿潤な創傷床に接触させて）浸水させることにより、容易に活性化される。

Ｓ−ニトロソチオールは、代表的には上述のように亜硝酸塩とチオールとの反応により包帯要素に都合よく予め発生する。

この種の一つの好ましい実施形態においては、包帯は予め発生しているＳ−ニトロソチオールを包含する乾燥ＰＶＡの層を含む。この層は、ＰＶＡ、亜硝酸塩の供給源（好ましくは亜硝酸カリウム)、及びチオール(好ましくはＬ−グルタチオン)から形成されている。この実施形態の代表的な例では、これらの添加物の両方が、ＰＶＡ溶液にその乾燥に先立って添加される。Ｓ−ニトロソチオール(好ましい場合においてはＧＳＮＯ）は乾燥段階中に層内に発生する。ニトロソチオールは水溶液ではかなり不安定であることが知られている。それにも拘らず、ＧＳＮＯはＰＶＡの乾燥層中では（特に湿気のない雰囲気中に保管されるなら）非常に安定していることが判明した。

湿った表面(例えば創傷床)に層を設けることにより、ＧＳＮＯを層から単純に放出させることができる。一旦放出されると、ＧＳＮＯは酸化窒素を発生させるように緩慢な分解を被る。層からのＧＳＮＯの放出は比較的急速である。このことは、湿った皮膚に層を施すことによって示すことができ、皮膚はその血管拡張のために急速な(約1分以内に)皮膚発赤をもたらす。発赤は完全に可逆であり、パッチを取り外した後、数分以内に消失する。

水和されたポリマー・マトリクス(好ましくはポリーＡＭＰＳヒドロゲル)から成る付加的な層は、酸化窒素供与体の周囲環境への放出を減速させるように、皮膚と乾燥ＰＶＡ層との間の遷移層として、この実施形態（及び一般的に他の実施形態）に用いることができる。水和されたポリマー・マトリクスは、包帯を活性化するための水の供給源として機能する。

包帯が選択的に水の供給源を含んでもよい。これは、ＷＯ２００４／１０８１７６で説明された包帯の第２の要素と同様にしてもよく、水和されたポリーＡＭＰのSヒドロゲルを都合よく含む。

好ましい実施例においては、包帯は非晶質である二つの要素からなる。 これらの要素は例えばゲル、準固体、ペースト、クリーム、ローション又は液体（例え水溶液）の形態とすることができる。水和されたヒドロゲルは上述のように都合よく使用できるであろう。

この種の実施形態においては、各要素は好ましくは試薬を含み、これが集められると、一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを解放する。好ましくは、一方の要素が亜硝酸塩を含み、他方がチオールを含んでいる。これに代えて、亜硝酸塩とチオールは、その反応を防ぐために充分に高いｐＨ、例えばｐＨ７よりも高いｐＨで一緒に保つことができ、第２の要素は酸性の供給源を含む。別の可能性は第１の要素が無水のＳ−ニトロソチオールを含み、第２の要素が水を含むことである。

二つの非晶質要素は、包帯を身体表面に施すことが望まれるときまで別々に保たれる。好都合なことに、それらは、非晶質要素を送達することができるノズルを有する容器内に詰めることができる。好ましくは、二つの要素が二区画分注器（両方の要素を同時に送達するように作動可能であるものが好ましい）内に詰められる。

好ましい実施の形態は二つの包帯要素を含み、一方は亜硝酸塩を含み、他方はチオール、例えば、グルタチオンを包含する。 二つの要素は、上述のように、様々な物質的な形態を採ることができる。 しかしながら、現在のところ好ましい組み合わせは以下の例である。

包帯は、皮膚接触層を選択的に含むか又はこの皮膚接触層と共に使用され、この皮膚接触層は好ましくは、ポリ−ＡＭＰＳ及び/又はその塩類の水和されたヒドロゲルを含む。

包帯は、この包帯をヒト又は動物の皮膚へ公知の方式で粘着させる被覆又は外層を選択的に含むか、或いはその被覆又は外層と共に使用される。

本発明による包帯は皮膚の治療領域（例えば大きさや形状が異なる創傷）について大きさや形状が異なる範囲で製造することができる。特定の包帯についての試薬の適切な量は実験により容易に決定することができる。

包帯の要素は使用前には、無菌で密封された不浸水透性の容器内に適宜に保管される。例えば要素が乾いた物質を含む場合は、乾燥物質は容器内に包含されていることが好ましい。

使用中には、包帯の一つ又は複数の要素は、そのパッケージから取り出して適切な状態でヒト又は動物の皮膚上、例えば創傷又は他の美容或いは治療目的の処置をすべき皮膚の領域へ配置される。 包帯は上述のように経皮送達の補助としても使用できるであろう。 包帯は、複数の要素の包帯の場合は要素を接触させることにより、また乾燥包帯の場合は水の供給源（例えば創傷からの水）に接触させることにより活性化し、一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールの包帯からの放出（おそらく活性化の後の包帯における発生の後）がもたらされる。Ｓ−ニトロソチオールは自然に分解して酸化窒素を生成し、これは組織に有益な効果を有しており、血管拡張も引き起こす。

他の観点では、本発明は治療及び／又は美容目的で体表面上又はその近傍で酸化窒素を発生させる方法を提供し、この方法は、包帯内で亜硝酸塩とチオールとを反応させて一つ又は複数のＳ−ニトロソオールを生成し、これは酸化窒素を届けるために自然に分解する。

本発明について以下の例及び添付図面を参照して例示の手法で更に説明する。

例
材料及び方法
化学薬品及び他の材料
水（伝導度＜１０μＳｃｍ^−１、何れも分析試薬等級であるＦｉｓｈｅｒ又はＳａｎｙｏ Ｆｉｓｔｒｅｅｍ ＭｕｌｔｉＰｕｒｅ）
ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパン スルホン）ナトリウム塩，５０％水溶液，ヒドロゲル モノマー−Ｌｕｂｒｉｚｏｌ，ＡＭＰＳ ２４０５
ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパン スルホン）アンモニウム塩，５０％水溶液，ヒドロゲル モノマー−Ｌｕｂｒｉｚｏｌ，ＡＭＰＳ ２４１１
１−ヒドロキシ チクロ ヘキシル フェニール ケトン（９９％），光開始剤−Ａｌｄｒｉｃｈ：４０５６１−２
Ｅ ｂｅｃｒｙｌ １１（ＰＥＧ ４００ ダイアクリルレイト）；架橋剤−ＵＣＢ化学薬品
亜硝酸カリウム（＞９８％）−Ｆｌｕｋａ：６０４１７
Ｌ−グルタチオン，還元（＞９９％）−Ｓｉｇｍａ：Ｇ４２５１
グルコース−Ｆｉｓｈｅｒ−分析等級，コードＧ０５００６１
グルコース オキシダーゼ−生体触媒−Ｇ６３８Ｐ（〜７０Ｕ／ｍｇ 固体）
ＰＶＡ（ポリビニル・アルコール，Ｍ_ｒ＝１２４，０００乃至１８６，０００，９８−９９％ 加水分解）−Ａｌｄｒｉｃｈ：３６３１６−２
ポリ−ＡＭＰＳ ヒドロゲル 処方
成分を以下に記載した基本的手順に従って表１に示される組み合わせ及び量に混合した。
アンモニウムＡＭＰＳ及び／又はナトリウムＡＭＰＳの原液（製造者により供給されたまま）を２５０ｍｌ ポリプロピレン ねじぶた付き反応瓶へ前置ゲル流体の基体として分与した。グルコース オキシダーゼ及び（必要とあらば）添加物は混合体へ添加されて完全に溶解させた。個別の容器内では光開始剤粉末を液体架橋剤に分散させて、光開始剤を架橋剤へ溶かすために緩やかに暖めた。次いでこの溶液を前置ゲル流体に混合した。 ゲルを投与するために、完全なプレゲル流体を底が平坦なトレーに１乃至２ｍｍの深さに注ぎ込んだ。 ゲルを１ＫＷランプから垂直距離１５ｃｍで２５秒間のＵＶ照射で設定した。ゲルは使用する前に冷めた。

ＰＶＡ層の処方
ＰＶＡ（５％ Ｗ／Ｗ）の原液溶液を水で処方した。亜硝酸カリウム及び／又はＬ−グルタチオンをＰＶＡ溶液に添加して必要な濃度（表２参照）に達しさせた。この溶液をペトリ-皿へ分与して（６０ｃｍ^２上に１２ｇ）、一夜に亘って４０℃で乾燥させた。

Ｓ−ニトロソグルタチオン濃度の測定
水溶液内のＳ−ニトロソグルタチオン濃度の測定
以下の試薬を処方した。

試薬１：Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４，０．１ Ｍ）
試薬２： グリース試薬: ２０ｍｇのＮ−(１−ナフチル)エチレンアイアミン デヒドクロリド（ＮＡＤＤ）＋２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した５００ｍｇのスルファニルアミド（注意：この溶液は光に敏感であるので、できる限り暗所に保管すべきである
試薬３:ＤＭＳＯにおける塩化第二水銀（１０ｍＭ）（５ｍＬのＤＭＳＯにおける１３．５８ｍｇのＨｇＣｌ_２）
以下に記載する六段階の手順を続けた。

１．１．５ｍＬの試薬１をプラスチックキュベットに分与した。

２．２００μＬのサンプル（即ち、その中のＧＳＮＯ濃度が定まっているサンプル）
３．１．１７μＬの試薬２を添加
４．３０μＬの試薬３添加し、水溶液を良好な混合にする。

５．最終的な混合体の４９６ｎｍにおける吸収を１０分間読み取る。

試薬混合体におけるＧＳＮＯの濃度は、ＧＳＮＯについてのモル吸収係数＝１２，５００Ｍ^−１ｃｍ^−１を用いて吸収の読み取りから計算することができる。

ヒドロゲル内のＳ−ニトロソグルタチオン濃度の測定
以下の試薬を処方した。

試薬１：Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４，０．１ Ｍ）
試薬２： グリース試薬: ２０ｍｇのＮ−(１−ナフチル)エチレンアイアミン デヒドクロリド（ＮＡＤＤ）＋２ｍＬのＤＭＳＯに溶解した５００ｍｇのスルファニルアミド（注意：この溶液は光に敏感であるので、できる限り暗所に保管すべきである
試薬３:ＤＭＳＯにおける塩化第二水銀（１０ｍＭ）（５ｍＬのＤＭＳＯにおける１３．５８ｍｇのＨｇＣｌ_２）
以下に記載する五段階の手順を続けた。

１． ２５ｍＬの試薬１と８２５μＬの試薬２とを２５０ｍｌポリプロピレンポットへ投与した。

２． ほぼ正確に３００ｍｇのゲルを量り、これを試薬混合体に浸した。３０分間に亘って緩やかに振動させながら放置した。

３． ２．６ｍＬの試薬混合体をポリプロピレンポットからプラスチック キュべットへ移した。

４． ２５μＬの試薬３を添加した。

５． ４９６ｎｍにおける混合体の吸収を１０分間読み取った。

試薬混合体におけるＧＳＮＯの濃度は、ＧＳＮＯについてのモル吸収係数＝１２，５００Ｍ^−１ｃｍ^−１を用いて吸収の読み取りから計算することができる。これは次いで、ゲルにおけるＧＳＮＯの初期の濃度の計算に用いることができる。

例１： Ｌ−グルタチオン及び亜硝酸カリウムを含む水溶液系におけるＧＳＮＯ生成/劣化の速度におけるｐＨの影響
亜硝酸カリウム（５ｍＭ）及びＬ−グルタチオン（５ｍＭ）を含む溶液におけるＧＳＮＯ生成とその後の分解の速度の効果は、ｐＨ３（リン酸クエン酸塩緩衝体，０．１Ｍ）、ｐＨ５(リン酸クエン酸塩緩衝体，０．１Ｍ）、及びｐＨ７(燐酸塩緩衝体，０．１Ｍ)で検討した。 その結果を図１に示す。ｐＨ７ではＧＳＮＯの生成は全く観察されなかった。 ｐＨ３と比べてｐＨ５ではＧＮＳＯの初期生成は、より遅かった。 生成されたＧＳＮＯの安定性はｐＨ３ｔｐと比べると、ｐＨ５で僅かに高いように見えた。

例２:（緩衝されていない）活性ヒドロゲル包帯におけるＳ−ニトロソグルチオンの生成
活性化包帯におけるＧＳＮＯの濃度プロファイルは、陽子の付加的な供給源がない状態で測定した。包帯の１次層は亜硝酸カリウム（３０ｍＭ）を含むポリ−ＡＭＰＳヒドロゲルから成る。二次層はＬ−グルタチオン（３０ｍＭ）を包含する乾燥ＰＶＡ（５％）から成る。包帯の中に組み込まれている陽子の付加的な供給源はなかった。これらの層を包帯を活性化するために一緒にし、その結果を図２に示す。包帯の中に発生したＧＳＮＯの濃度は約２時間後にピークに達した。次いでＧＳＮＯの緩慢な分解に起因して、ＧＳＮＯの濃度の遅い安定した衰退があった。ＧＳＮＯは活性化の４８時間後にも包帯中に測定可能であった。

例３：空のヒドロゲルへの活性化ヒドロゲル包帯（それに組み込まれた陽子の付加的な供給源はない）からのＳ−ニトロソグルタチオンの放出
包帯の１次層は亜硝酸カリウム（３０ｍＭ）を包含するポリ−ＡＭＰＳヒドロゲルから成る。二次層はＬ-グルタチオン（３０ｍＭ）を包含する乾燥ＰＶＡ（５％）から成る。包帯の中に組み込まれた陽子の付加的な供給源はなかった。包帯は、１次層と二次層とを一緒にすることによって活性化した。活性化包帯は空のヒドロゲル片（３０％ ポリ−ＡＭＰＳ）に置いた。包帯の内部のＧＳＮＯ生成とその空のヒドロゲルへの緩やかな放出を測定し、その結果を図３に示す。

活性化包帯におけるＧＳＮＯの濃度は包帯の活性化の約２時間後にピークに達した。次いでＧＳＮＯの緩慢な分解に起因して、ＧＳＮＯの濃度の遅い安定した衰退があった。空のヒドロゲル中への活性化包帯からのＧＳＮＯの緩慢な漸進的な放出が示された。空のヒドロゲルにおけるＧＳＮＯの濃度は約２５時間に亘って包帯中でほぼ均衡していた。

例４：空のヒドロゲルへの活性化ヒドロゲル包帯（それに組み込まれた陽子の付加的な供給源としてのグルコース酵素／グルコース系を有する）からのＳ−ニトロソグルタチオンの放出
包帯は３つの層からなる。即ち、１次層は、亜硝酸カリウム（３０ｍＭ）及びグルコース（５％ ｗ／ｗ）を包含するポリ−ＡＭＰＳヒドロゲルのポリマー・マトリクスから成る。 ２次層はＬ-グルタチオン（３０ｍＭ）を包含する乾燥ＰＶＡ（５％）から成る。３次層はグルコース酵素(０．０３５％ ｗ／ｗ）を包含するポリ−ＡＭＰＳヒドロゲルのポリマー・マトリクスから成る。 包帯は、３つの層の全てを２次層が１次層と３次層との間に挟まれる配置で一緒にすることにより活性化した。活性化包帯は空のヒドロゲル片（３０％ ポリ−ＡＭＰＳ）に置いた。包帯内部のＧＳＮＯの生成とその空のヒドロゲルへの漸進的な放出を測定し、その結果を図４に示す。

包帯中と空のヒドロゲル中とのＧＳＮＯの濃度プロファイルは、陽子の付加的な供給源がないときに観測されたものと非常に類似していた（例３参照）。活性化包帯におけるＧＳＮＯの濃度は、包帯の活性化の約２時間後にピークに達した。ＧＳＮＯの緩慢な分解に起因して、ＧＳＮＯの濃度の遅い安定した衰退があった。空のヒドロゲル中への活性化包帯からのＧＳＮＯの緩慢な漸進的な放出が示された。

例５：予め生成されたＳ−ニトロソグルタチオンを包含する乾燥ＰＶＡからのＳ−ニトロソグルチオンの放出
Ｓ−ニトロソグルタチオンを包含する乾燥ＰＶＡ層は、９ｍＬのＰＶＡ溶液（５％ ｗ／ｗ）を１ｍＬのＬ−グルタチオン（３００ｍＭ）及び１ｍＬの硝酸カリウム（３００ｍＭ）に混合することによって処方された。この混合体はペトリ皿（６０ｃｍ^２）において４０℃で５時間に亘って乾燥させた。これはｃｍ^２あたり約８ｍｇのＳ−ニトロソグルタチオンを包含する乾燥膜をもたらした。この膜からのＳ−ニトロソグルタチオンの放出は、空のポリ−ＡＭＰＳ（３０％ ｗ／ｗ）ヒドロゲルの２つの層に１ｃｍ^２の膜を置き、特定の時間点（膜を施した後の２時間、６時間、及び２４時間後)の３つの層の全てでＧＳＮＯを測定することにより示された。 第１のヒドロゲル層(即ち、ＧＳＮＯを包含する膜に接触したもの)は転位層として機能したが、第２のヒドロゲル(転位層の下)は、創傷床などの周囲の環境を模擬するのに用いた。ＧＳＮＯの放出速度は図５に示す。

ＧＳＮＯはＧＳＮＯ包含膜から転移層へ迅速に放出され、このＧＳＮＯ濃度は約２時間でピークに達した。ＧＳＮＯは数時間後に下部ヒドロゲル中で検出可能であり、その濃度は漸増を続けた。系全体で検出可能なＧＳＮＯの総量は、ＧＳＮＯの緩慢な分解のために徐々に減退していた。

図６は本発明による皮膚包帯を概略的に示す。

図示の包帯は層状構造であって、対象の皮膚１２へ粘着するのに適した絆創膏の形態の選択的な外層又は被覆１０を含み、創傷１４を被覆する。被覆１０は第１の要素即ち１次層１８と第２の要素即ち２次層１６を包囲している。

第１の要素１８は上述の表１に指定した亜硝酸塩ゲルの形態で、亜硝酸カリウムを組み込むポリ−ＡＭＰＳヒドロゲルの層を含む。第２の要素１６は上述の表２に指定したようにグルタチオン層の形態でＬ−グルタチオンを組み込む乾燥ＰＶＡの層を含む。

包帯は、初めは個々の要素がそれぞれの密封無菌パッケージの中に個別に収納されている状態で複合系として供給される。使用に必要があるとき、包帯の要素は、パッケージから取り出して、適切な方法と手順で図示のように最終的な包帯を与えるように創傷に施す。 第１の要素と第２の要素とが一緒にされると、これはゲルを活性化する。

活性化すると、亜硝酸塩が１次層から２次層への拡散を始め、チオールは逆方向へ拡散する。亜硝酸塩をチオールと混合すると、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ)が生成される。ＧＳＮＯが生成されると、これは包帯から周囲の環境へ放出されて、ここで酸化窒素を生成するように分解する。

例６：酸化窒素の搬送系
ＧＮＳＯはＮＯを放出するために容易に分解するので、長期間保存には適さない。二つの包帯要素の使用及び構成の分配は、投与されたときに混合してＳ−ニトロソグルタチオン生成反応を開始する試薬の個別の保管を可能とする。

第１の要素は以下のように処方した。粘着性及び伸展性を付加するために用いられた基部担持体はヒドロゲル基物質であり、商品名Ｐｌｅｘａｊｅｌ ＡＳＣ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｇｕａｒｄｉａｎ Ｉｎｃ．）である。これにリン酸緩衝生理食塩水を１／２０から１０×の濃縮原液で稀釈した（Ｓｉｇｍａ，Ｄ１４０８）。亜硝酸カリウム（Ｆｌｕｋａ， ６０４１７）を６０ｍＭの最終的な濃度を与えるために添加して溶解を可能にした。

第２の要素は以下のように処方した。Ｌ−グルタチオン（還元形Ｓｉｇｍａ，Ｇ４２５１）を６０ｍＭに等しい最終的な濃度を与えるようにプロピレン・グリコール（Ｆｌｕｋａ ８２２８１）に縣濁した。

両方の要素は別々に保管した。Ｖｅｒｓｄｉａｌ Ｉｎｃから二重ディスペンサーを入手し、これは二つのチャンバからの分配容積の可変調整が可能である。 サンプルは、それらの各々の隔絶されたチャンバから分配されたときのみ互いに接触する。

二つの別々に保管された試薬から発生したＮＯの効果を示すために、前腕皮膚の表面に対する血流をレーザドップラーを用して検査した。Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＲＴ４組織血流及び温度モニタ並びにそれに関連する皮膚プローブを皮膚レーザドップラーフラックスの測定のために用いた。二つのプローブを主静脈及び動脈を避けるように約５−１０ｃｍ離した位置で皮膚に取り付けた。この機器を平坦な応答を確実にするために１分間稼動した。チャンバの一方は亜硝酸塩で、他方はＬ−グルタチオンで満たされた。調整として、チャンバの第２のセットは水で満たした。亜硝酸塩とL-グルタチオンは使用の直前に等量で混合した。この混合体は、プロピレン・グリコール中のＬ−グルタチオン粒子が亜硝酸塩ヒドロゲル水溶液中で確実に溶解するように攪拌した。次に、最大の血管拡張効果に達したことを示すプラトーが観測されるまで、皮膚レーザドップラーフラックスを測定した。

表１は、二要素系を使用すると、皮膚への血管拡張効果があることを示す。Ｌ−グルタチオンと亜硝酸塩との混合体についてのＬＤＦ値は、２分(ポスト サンプル適用)後に上昇を始め、ＮＯ生成及び経皮伝達の速度を示す。水の調整は平坦なままであり、これは血流が亜硝酸塩／ＧＳＨ反応に起因して増加していることを示す。約１５０ＬＤＦユニットの最大反応は強い応答であると見なされる。

図１はＳニトロソグルタチオン（ｍＭ）の濃度対時間（分）のグラフであり、亜硝酸カリウム（５ｍＭ）及びＬ−グルタチオン（５ｍＭ）を包含する溶液内のＳ−ニトロソグルタチオンの生成速度及びそれに続く分解におけるｐＨの影響を示す。 図２は時刻０における包帯の活性化に続く包帯内のＳ−ニトロソグルタチオンの濃度プロファイルを示すＧＳＮＯ濃度（ｍＭ）対時間（時間）のグラフである。 図３は時刻０における包帯の活性化に続く包帯内及び包帯の下に位置する空のヒドロゲル内のＳ−ニトロソグルタチオンの濃度プロファイルを示すＧＳＮＯ濃度（ｍＭ）対時間（時間）のグラフである。 図４は時刻０における包帯の活性化に続く様々な包帯層内のＳ−ニトロソグルタチオンの濃度プロファイルを示すＧＳＮＯ濃度（ｍＭ）対時間（時間）のグラフである。 図５は時刻０における包帯の活性化に続く乾燥ＰＶＡから遷移ヒドロゲル層及びそれに続くヒドロゲルの他の層へのＳ−ニトロソグルタチオンの放出を示すＧＳＮＯ濃度（ｍＭ）対時間（時間）のグラフである。 図６は本発明による創傷包帯の一実施例の概略図である。

Claims (33)

1. 活性化の際に一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを放出するように適合された包帯。
2. 一つ又は複数の包帯要素を含む請求項１の包帯。
3. 一つ又は各々の前記包帯要素が層の形態である請求項２の包帯。
4. 一つ又は各々の前記包帯要素が担持体又は支持体を含む請求項２又は３の包帯。
5. 前記担持体又は支持体がポリマー・マトリクスを含む請求項４の包帯。
6. 前記ポリマー・マトリクスが水和ヒドロゲルを含む請求項５の包帯。
7. 前記水和ヒドロゲルがポリ−２アクリラミド−２−メチルプロパン スルホン酸（ポリ−ＡＭＰＳ）及び／又はその塩類を含む請求項６の包帯。
8. 前記ポリマー・マトリクスが乾燥ポリマーを含む請求項５の包帯。
9. 前記ポリマーがポリビニル・アルコールを含む請求項８の包帯。
10. 前記一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールは包帯内の試薬を一緒にさせて反応させることにより発生する請求項１乃至９の何れか一項に記載の包帯。
11. 前記試薬が亜硝酸塩及びチオールを含む請求項１０の包帯。
12. 前記亜硝酸塩が亜硝酸カリウムを含む 請求項１１の包帯。
13. 前記チオールがグルタチオン、好ましくはＬ−グルタチオンを含む請求項１１又は１２の包帯。
14. 前記試薬は活性化の際に包帯中で一緒に反応して前記一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを生成して放出する請求項１０乃至１３の何れか一項に記載の包帯。
15. 前記包帯が亜硝酸塩を包含する第１の包帯要素とチオールを包含する第２の包帯要素とからなる請求項１４の包帯。
16. 第１の包帯要素が水和ヒドロゲルを含み、且つ第２の包帯要素が乾燥ポリマー・マトリクスを含む請求項１５の包帯。
17. 水和ヒドロゲルがポリ−ＡＭＰＳ及び／又はその塩類を含み、乾燥ポリマー・マトリクスが乾燥ポリビニル・アルコールを含む請求項１６の包帯。
18. 前記包帯は活性化の際に陽子の供給源を含む及び/又は生成する請求項１４乃至１７の何れか一項に記載の包帯。
19. 一つ又は複数の包帯要素に酸又は酸性バッファを含む請求項１８の包帯。
20. 酸化酵素酵素及びその基体を含む請求項１８又は１９の包帯。
21. 前記酵素がグルコース オキシダーゼであり、前記基体がグルコースである請求項２０の包帯。
22. 請求項１５,１６，又は１７に従属するときに、第１の包帯要素が前記基体を含む請求項２０又は２１の包帯。
23. 第２の包帯要素が酵素を含む請求項２２の包帯。
24. 酵素が第３の包帯要素に包含されている請求項２２の包帯。
25. 前記一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを放出する活性化の前に、前記試薬が前記包帯内で一緒に反応して一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを生成する請求項１０乃至１３の何れか一項に記載の包帯。
26. Ｓ−ニトロソチオールを乾燥して不活性な状態で包含する請求項２５の包帯。
27. Ｓ−ニトロソチオールが、乾燥ポリマー・マトリクスを包含する包帯要素内に存在している請求項２６の包帯。
28. 前記包帯要素が乾燥ポリビニル・アルコールを包含する請求項２７の包帯。
29. 前記Ｓ−ニトロソチオールがＳ−ニトロソグルタチオンを包含する請求項１乃至２８の何れか一項に記載の包帯。
30. 非晶質である二つの要素を包含する請求項１乃至２９の何れか一項に記載の包帯。
31. ポリ−ＡＭＰＳ及び／又はその塩類の水和ヒドロゲルを包含する皮膚接触層を含むか、又はその皮膚接触層と共に使用する請求項１乃至３０の何れか一項に記載の包帯。
32. 一つ又は各々の前記包帯要素が使用に先立って各々のパッケージに保管されている請求項１乃至３１の何れか一項に記載の包帯。
33. 治療法及び／又は美容の目的のために体表面上又は体表面近傍に酸化窒素を生成する方法であって、亜硝酸塩とチオールとを包帯内で反応させて、一つ又は複数のＳ−ニトロソチオールを発生させ、このＳ−ニトロソチオールが自然分解して酸化窒素を放出する方法。

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