ES2329556T3 - Ensayo de union utilizando un campo magnetico. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para obtener mediciones cinéticas durante un ensayo de unión, que comprende las etapas siguientes: (i) poner una molécula diana en contacto con su pareja de afinidad para formar un complejo de unión, estando inmovilizada la molécula diana sobre una partícula magnética y estando inmovilizada la pareja de afinidad sobre un material de soporte; y (ii) determinar el número de partículas magnéticas complejadas durante el ensayo, exponiendo el complejo a un campo magnético a intervalos de tiempo regulares durante el ensayo y midiendo la diferencia en la frecuencia resonante de un circuito sintonizado cuando el complejo se expone al campo magnético y cuando el mismo no se expone.

Description

Ensayo de unión utilizando un campo magnético.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para llevar a cabo un ensayo de unión, particularmente un inmunoensayo, utilizando partículas magnéticas como una marcación.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos son unos ensayos de unión de ligandos en los que se aprovecha el reconocimiento específico por parte de un anticuerpo del sitio específico de enlace de un analito. Normalmente, los inmunoensayos implican la inmovilización de un ligando (anticuerpo, otro proteína, hapteno, etc.) a una fase sólida que, a su vez, será reconocida por el analito que se debe determinar. La utilización de agentes detectores específicos marcados permite la detección y cuantificación posteriores del analito en una muestra acuosa. La cantidad de analito presente en la muestra es una función de la cantidad de agente detector marcado enlazado: inversamente proporcional en ensayos competitivos y directamente proporcional en ensayos no competitivos.

En la pasada década, se han producido muchos cambios en el diseño y formato de los inmunoensayos que han conllevado un aumento de su sensibilidad. Muchas innovaciones han consistido en la utilización de diferentes marcaciones, utilizadas para realizar un seguimiento de la reacción inmune. Originalmente, se utilizaron marcaciones radioisotópicas, pero posteriormente las mismas fueron sustituidas por marcaciones enzimáticas y fluorescentes/luminiscentes. Estos cambios solucionaron muchos de los inconvenientes de los isótopos en términos de estabilidad, almacenamiento de componentes marcados y facilidad de manejo. Los sistemas de inmunoensayo analítico actuales que utilizan marcadores fluorescentes o similares requieren equipos costosos y especializados y no resulta práctico integrarlos en sistemas portátiles. Los únicos sistemas portátiles disponibles actualmente utilizan tecnología de tira reactiva con marcaciones de color. Los mismos se utilizan principalmente en test de embarazo, en los que el resultado del test solo puede ser positivo o negativo. Generalmente, no resultan adecuados para su utilización en ensayos en los que se pretende determinar la concentración real de una especie.

La utilización de partículas ferromagnéticas como marcación en un inmunoensayo ha sido descrita en dos artículos de Kriz et al. (Biosensors and Bioelectronics, 1998; 13: 817-823 y Analytical Chemistry, 1996; 68: 1966-1970). Sin embargo, en estas técnicas las partículas ferromagnéticas se detectan mediante una sencilla bobina de medición que se coloca en un puente Maxwell a efectos de permitir la medición de la permeabilidad magnética de una muestra. A continuación, se utiliza la permeabilidad magnética como indicación para determinar el número de partículas dentro de la sustancia.

El documento de Hawkins et al., Review of Scientific Instruments: American Institute of Physics, New Cork, EE.UU.; Vol. 72 no. 1, parte 1/2, páginas 237-242, enero de 2001, da a conocer la determinación de la concentración de partículas paramagnéticas en una solución tampón detectando un cambio en la frecuencia de resonancia en un sistema de medición que comprende una bobina en un circuito de resonancia paralelo con un condensador.

La solicitud de patente europea EP-A-01303319.6 es una solicitud codependiente del solicitante, el contenido de la cual se incorpora a la presente memoria como referencia. Dicho documento describe un procedimiento de inmunoensayo que utiliza partículas magnéticas como marcación, siendo determinadas dichas partículas mediante la medición de frecuencia de resonancia.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que se pueden obtener mediciones cinéticas durante un ensayo de unión cuando se utilizan partículas magnéticas como marcación y se aplica un campo magnético en intervalos de tiempo regulares durante el curso de la reacción.

Según un primer aspecto de la presente invención, un procedimiento para obtener mediciones cinéticas durante un ensayo de unión comprende las etapas siguientes:

(i)

poner una molécula diana en contacto con su pareja de afinidad a efectos de formar un complejo de unión, estando inmovilizada la molécula diana sobre una partícula magnética y estando inmovilizada la pareja de afinidad sobre un material de soporte; y

(ii)

determinar el número de partículas magnéticas complejadas durante el ensayo exponiendo el complejo a un campo magnético a intervalos de tiempo regulares durante el ensayo y midiendo la diferencia en la frecuencia de resonancia de un circuito sintonizado cuando el complejo se expone al campo magnético y cuando el mismo no se expone.

El procedimiento según la presente invención se puede utilizar para aumentar la velocidad de un ensayo de unión, por ejemplo un inmunoensayo. Sin que se desee estar vinculado por la teoría, este hecho parece el resultado de poner en contacto las respectivas parejas de unión, con una proximidad muy cercana, lo que permite que la reacción de enlace tenga lugar de forma más eficaz.

Descripción de las figuras

La presente invención se describe haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 ilustra una vista lateral (a) y una vista superior (b) de una tira de ensayo, en la que (1) representa una tira de tereftalato de polietileno con la superficie hidrofóbica situada en la parte superior, (2) representa una barra de plástico, (3) es una línea de cera y (4) es un reactivo de muestra/biológico;

La figura 2 muestra un generador de frecuencias, alimentación eléctrica y electroimanes;

La figura 3 muestra unos electroimanes que incluyen clavos;

La figura 4 es una representación gráfica del efecto de aumentar la intensidad de campo en el número de partículas paramagnéticas unidas al soporte;

La figura 5 es una representación gráfica de una curva de calibración que muestra la intensidad de campo magnético de un electroimán para una determinada tensión aplicada;

La figura 6 es una representación gráfica del enlazamiento en un ensayo para CK-MB;

La figura 7 es una representación gráfica de un ensayo para CRP;

La figura 8 es una ilustración gráfica que muestra el cambio de frecuencia en función del tiempo; y

La figura 9 es una representación gráfica que muestra una curva de calibración para el analito CKMB, establecida calculando los cambios de frecuencia durante un ensayo.

Descripción de la invención

El procedimiento según la presente invención se puede aplicar a cualquier forma de reacción de unión, en las que resulta deseable determinar la presencia o la concentración de un determinado analito. Una reacción de unión adecuada es una reacción de hibridización de ADN. En este caso, la molécula diana y su pareja de afinidad serán moléculas de ADN complementarias. También se puede utilizar un polinucleótido para enlazarse a otros agentes. Por ejemplo, dicho polinucleótido puede ser un aptámero, utilizado para enlazar, por ejemplo, a proteínas que se enlazan a ADN. Preferentemente, la reacción de unión es un inmunoensayo en el que se forma un complejo de unión anticuerpo/antígeno específico. Los procedimientos generales para llevar a cabo ensayos de unión, incluyendo reacciones de hibridización de ADN e inmunoensayos, resultarán evidentes para el experto en la materia. En Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons Inc., se documentan técnicas adecuadas para llevar a cabo los ensayos de unión.

Con respecto a un inmunoensayo, la molécula inmovilizada sobre la partícula magnética se puede enlazar a una pareja de afinidad que se enlaza directamente sobre un material de soporte. Alternativamente, la pareja de afinidad se puede enlazar indirectamente al soporte, por ejemplo a través de una afinidad distinta por una molécula inmovilizada sobre dicho soporte. En dicho ejemplo, la pareja de afinidad puede estar presente en una muestra acuosa que se pone en contacto con el soporte y las partículas magnéticas. La pareja de afinidad se enlaza a la molécula sobre el soporte y a la molécula sobre la partícula magnética, actuando como un puente entre el soporte y la partícula. Esta forma de realización se ilustra en el siguiente ejemplo 1. Las posibles variaciones resultarán evidentes para el experto en la materia.

Típicamente, las partículas magnéticas utilizadas son partículas paramagnéticas, aunque también se pueden utilizar partículas ferromagnéticas o cualquier otro tipo de partículas magnéticas. Las partículas paramagnéticas están disponibles a través de fuentes comerciales, presentan típicamente un diámetro de 2,8 \mum y consisten en un núcleo de material paramagnético recubierto por una capa adecuada de polímero sobre la que se puede inmovilizar una molécula utilizada en el ensayo de unión.

Típicamente, cada partícula magnética comprende una única molécula, permitiendo un cálculo directo de la concentración de moléculas. Los procedimientos para la inmovilización de una molécula sobre las partículas magnéticas resultarán evidentes para el experto en la materia. En el siguiente ejemplo 1 se detalla un ejemplo específico cuyas alternativas serán evidentes. Sin embargo, si se desea, las partículas pueden comprender más de una molécula. Típicamente, las partículas magnéticas tienen un diámetro de aproximadamente 0,5 \mum a 5 \mum, más preferentemente de 1 \mum a 3 \mum. Las nanopartículas, típicamente con un diámetro comprendido entre 5 nm y 300 nm, también entran dentro del alcance de la invención.

El ensayo de unión se llevará a cabo con la pareja de afinidad inmovilizada sobre un material de soporte adecuado. Los materiales de soporte adecuados resultarán evidentes para el experto en la materia sobre la base de los ensayos de unión convencionales, en particular los inmunoensayos. Los materiales de soporte adecuados incluyen materiales de soporte de vidrio, cerámica, plástico y silicio. En una forma de realización preferida, el material de soporte es un material basado en poliéster. Típicamente, el soporte es una superficie plana y lisa sobre la cual la pareja de afinidad se inmoviliza utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica, aunque pueden utilizarse otras configuraciones. En una forma de realización preferida, el material de soporte se encuentra en forma de microarray. Un microarray adecuado se da a conocer en el documento GB-A-2324866, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria como referencia.

El ensayo de unión se lleva a cabo en presencia de un campo magnético aplicado. El campo magnético se puede aplicar utilizando aparatos conocidos por el experto en la materia, particularmente un electroimán o un solenoide. El campo magnético se puede aplicar en forma constante o se puede variar aplicando una señal externa, tal como una forma de onda cuadrada, sinusoidal o de dientes de sierra.

Sorprendentemente, se ha descubierto que la variación del campo magnético aplicado proporciona mejores resultados en comparación con la aplicación constante de dicho campo magnético. Más particularmente, la variación del campo magnético produce la mayor disminución en el tiempo de reacción y hace aumentar la probabilidad de que se produzcan casos de unión adicionales, ya que las partículas magnéticas no están firmemente sujetas durante los periodos en los que la intensidad del campo magnético aplicado es baja, de tal modo que se pueden desplazar y exponen más sitios de enlace a las proteínas diana inmovilizadas.

El experto en la materia puede determinar por experimentación de rutina la frecuencia adecuada del campo magnético. Una frecuencia preferente es menor de 1 Hertz. En una forma de realización preferida, el campo magnético se aplica mediante un electroimán enrollado que comprende clavos metálicos a efectos de focalizar el campo magnético. En la figura 3 se muestra un electroimán adecuado que comprende clavos metálicos. El material de soporte se debe colocar sobre los clavos en el electroimán a efectos de focalizar el campo magnético.

En otra forma de realización preferida de la presente invención, se utilizan una o más bobinas planas para aplicar el campo magnético. Dichas bobinas se pueden depositar sobre la cara inferior del material de soporte, es decir la cara inversa a la que comprende las moléculas inmovilizadas (pareja de afinidad). Las bobinas pueden estar enlazadas al soporte utilizando tecnología de película gruesa o de película fina con la utilización de un material conductor, por ejemplo un metal, tal como reconocerá el experto en la materia. La frecuencia de resonancia de cada bobina se determina por su diámetro, el número de vueltas de dicha bobina y el material utilizado en su construcción. Sobre el soporte se pueden disponer bobinas individuales o diversas bobinas para una detección de analito individual o múltiple. Las moléculas biológicas (parejas de afinidad) se depositan sobre la cara inversa del soporte en una posición tal que se superponen a la bobina o bobinas. A continuación, pueden tener lugar una serie de acontecimientos de unión sobre el soporte que implican la incorporación de material magnético, paramagnético o superparamagnético (partículas con un tamaño de micrones o nanómetros).

Sorprendentemente, se ha descubierto que el ensayo se puede llevar a cabo para obtener mediciones cinéticas en lugar de llevar a cabo una lectura de punto final. Las mediciones cinéticas se obtienen utilizando y conectando y desconectando un imán permanente.

En una forma de realización, el ensayo se lleva a cabo utilizando un sistema con dos imanes: uno debajo del material de soporte para atraer las partículas magnéticas a la superficie del soporte, y otro encima del soporte a efectos de arrastrar las partículas no enlazadas lejos de la superficie. Los imanes se pueden conectar de forma alternada, de tal modo que las partículas son arrastradas en una sola dirección en cada momento. Se puede disponer una bobina de detección para analizar la superficie y medir la cantidad de material magnético presente. Los imanes superior e inferior también se pueden disponer en un dispositivo que permita a dichos imanes desplazarse hacia el material de soporte o alejarse del mismo. Cuando el imán inferior está colocado en la proximidad del soporte, para ejercer el arrastre magnético, el imán superior se coloca lejos del soporte y no ejerce dicho efecto. A continuación, los imanes se pueden desplazar de tal modo que se alcanza la orientación opuesta. De este modo, se aplica un campo magnético variable a los componentes del ensayo. La medición del cambio de frecuencia cuando el imán superior ejerce su efecto máximo, es decir cuando está en la proximidad del soporte, permite realizar mediciones cuantitativas. El cambio de frecuencia se mide restando la frecuencia promedio de un blanco (sin analito) a la frecuencia promedio de la muestra. Si esto se lleva a cabo a intervalos regulares, por ejemplo cada 2 minutos, a lo largo de un período determinado, será posible establecer curvas de calibración para cada analito que se estudie.

La etapa final de ensayo es la determinación del número de partículas magnéticas enlazadas como complejo al soporte sólido. Las partículas genéticas se determinan midiendo la diferencia de frecuencia de resonancia de un circuito sintonizado cuando el complejo que comprende las partículas magnéticas enlazadas se expone a un campo magnético generado mediante una bobina y cuando dicho complejo no está expuesto a dicho campo magnético. Este aspecto de la presente invención se describe en la solicitud codependiente EP-A-01303319.6.

El ensayo se puede llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado. Por ejemplo, el material de soporte puede ser parte de una tira de ensayo (tira reactiva de diagnóstico), que se puede colocar sobre un imán cuando se lleva a cabo el ensayo de diagnóstico. Alternativamente, el material de soporte se puede sujetar dentro de un recipiente de reacción hermético apropiado. Las partículas magnéticas, paramagnéticas o superparamagnéticas se pueden disponer en suspensión en un tampón adecuado dentro del recipiente de reacción, y a continuación la muestra de ensayo biológica, incluyendo el analito que se desea medir, se puede introducir en el recipiente de reacción a través de un puerto de entrada. Los recipientes de reacción adecuados resultarán evidentes para el experto en la materia.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de tiras de ensayo de plástico

El material de soporte utilizado fueron transparencias de tereftalato de polietileno (PT), de fotocopiadora láser tipo A (Rank Xerox, Reino Unido). Se pegaron tiras de PT con un tamaño de 30 mm (longitud) x 5 mm (anchura) a barras de plástico (ACS, Reino Unido), tal como se muestra la figura 1a. Las tiras de PT se orientaron con la superficie hidrofóbica en la parte superior. Para impedir la dispersión de los reactivos aplicados a lo largo de la longitud de la tira de ensayo de PT en la dirección de la barra de plástico, se dispuso una línea de cera a través del PT, tal como se muestra la figura 1b.

Magnetoinmunoensayo

Se preparó solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,15 M, pH 7,2, del modo siguiente: se disolvieron 40 g de cloruro de sodio, 7,2 g de hidrógeno ortofosfato de disodio dihidrato, 1 g de cloruro de potasio y 1 g de dihidrógeno ortofosfato de potasio en 5 litros de agua destilada. El pH se ajustó a 7,2, según lo requerido.

Se diluyó anti-transferrina humana de conejo (Dako AIS, Dinamarca) 1:1000 en solución salina tamponada con fosfato (PBS). 1% glutaraldehído v/v diluido en PBS.

Solución de bloqueo: 1% albúmina de suero bovino p/v (BSA) y 1 M glicina p/v disueltos en PBS.

Transferrina humana: se preparó una solución stock de holo-transferrina humana en PBS, obteniéndose una concentración de 1 mg\cdotml^{-1}. A continuación, la solución stock se diluyó en 1% BSA/PBS hasta una concentración final de 1 \mug\cdotml^{-1}.

Anti-transferrina humana de oveja: se diluyó anti-transferrina humana de oveja 1:1000 en 1% BSA/PBS.

Partículas paramagnéticas (PMP): Dynabeads M-280 recubiertas de estreptavidina, y concentrador de partículas magnéticas (MPC) a través de Dynal, Noruega.

Tampón de lavado para las PMP: se disolvieron 0,16 g de dihidrógeno ortofosfato de sodio, 0,98 g de hidrógeno ortofosfato de disodio dihidrato y 8,10 g de cloruro de sodio en 1 l de agua destilada. El pH se ajustó a 7,4 utilizando ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, según se requiera.

Anti-oveja de burro biotinilada: se diluyó anti-oveja de burro biotinilada para recubrir las partículas paramagnéticas en PBS.

Tampón final de suspensión para las PMP: PBS/1% albúmina de suero bovino/4% polietilenglicol (PBS\BSA\PEG): 1% BSA p/v, 4% PEG p/v se disolvieron en PBS.

Alimentación eléctrica de laboratorio de salida dual de la serie "PL", generador de función Júpiter 500 y electroimanes de 50 mm (12 V), todos a través de Farnell Electronic Company, Leeds, Reino Unido.

Para ayudar a la focalización del campo magnético, los clavos se mecanizaron in situ para colocarlos en los electroimanes.

Procedimiento

i. Preparación de PMP de estreptavidina

Para cada tira de ensayo, se resuspendieron 10 \mul de PMP en un tubo de tampón de lavado homogeneizándolos por agitación durante 1 minuto, y a continuación se colocaron en un concentrador de partículas magnéticas (MPC) durante 2 minutos. Esto provocó que las partículas paramagnéticas fueran atraídas y fijadas sobre la parte lateral del tubo por el imán del MPC. Se eliminó el sobrenadante. El procedimiento se repitió tres veces.

El procedimiento de recubrimiento se llevó a cabo tal como se recomienda en el manual de Dynal (Dynal, 1996). Las partículas paramagnéticas de estreptavidina se mezclaron con anti-oveja de burro biotinilada (1,5 \mug de proteína por 10^{7} partículas paramagnéticas), y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con agitación bidireccional (utilizando el mezclador de muestras Dynal MX2, Dynal, Noruega). A continuación, las partículas paramagnéticas recubiertas se lavaron 4 veces en 1% BSA/PBS utilizando el MPC y se resuspendieron en PBS\BSA\PEG.

ii. Magnetoinmunoensayo

Procedimiento de lavado en fase sólida: a menos que se indique lo contrario, el término "lavado" se utiliza para describir el lavado de fases sólidas con 3 x 3 ml de agua destilada seguido de 1 x 3 ml de PBS utilizando una pipeta Pasteur. Temperatura de incubación: a menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente.

Se mezclaron 25 \mul de anti-transferrina humana de conejo con 10 \mul de 1% glutaraldehído (v/v) y la mezcla se aplicó a cada tira de ensayo. A continuación, las tiras de ensayo se incubaron durante una noche a 4ºC. Tras el lavado, las tiras de ensayo se incubaron en solución de bloqueo durante 1 hora. A continuación, las tiras de ensayo se lavaron y se incubaron con 20 \mul de transferrina humana durante 30 minutos. Tras el lavado, se aplicaron 30 \mul de anti-transferrina humana de oveja y se incubaron en cada tira de ensayo durante 30 minutos, y se repitió la etapa de lavado. A continuación, se aplicaron 10 \mul (6,7 x 10^{5}) de partículas paramagnéticas recubiertas a cada tira de ensayo y se incubaron correspondientemente sobre una electroimán (véase a continuación). Se llevó a cabo una etapa final de lavado consistente en 4 x 3 ml de agua destilada + 0,02% Tween 20 utilizando una pipeta Pasteur para eliminar las partículas paramagnéticas no enlazadas.

Se utilizó un electroimán para proporcionar un campo magnético. Dicho campo era un campo permanente, o bien se hizo variar aplicando una señal externa, tal como una forma de onda cuadrada, sinusoidal o en dientes de sierra. Además, se colocaron clavos metálicos en el electroimán para focalizar el campo magnético (figura 3). La mejora de la interacción de enlace biológica fue indicada por el número mayor de partículas paramagnéticas que se enlazaron a la fase sólida en un tiempo determinado en determinadas condiciones magnéticas. Se investigaron las variables siguientes:

-

Campo magnético permanente

-

Onda cuadrada

-

Onda sinusoidal

-

Onda en dientes de sierra

-

Intensidad de campo

-

Adición de "clavos" al electroimán

-

Compensación desde cero

La detección y cuantificación de las partículas paramagnéticas se llevó a cabo utilizando un microscopio óptico. Esto se utilizó con el fin de eliminar posibles variables adicionales introducidas por el magnetómetro.

Resultados

Los experimentos iniciales demostraron que tuvo lugar el enlace de partículas paramagnéticas a una superficie plástica recubierta utilizando el analito (transferrina) como agente de puenteo en un campo magnético. El número de partículas que se enlazaban a la superficie dependía de la intensidad del campo aplicado. La figura 4 muestra el aumento del número de partículas paramagnéticas que se enlazan como resultado de aumentar la intensidad del campo de un campo magnético constante aplicado.

La intensidad del campo magnético se determinó utilizando una sonda de Hall y se obtuvo una curva de calibración que relacionaba la tensión aplicada al imán y la intensidad de campo medida. Esto se muestra en la figura 5. Otros experimentos sobre el efecto de variar la intensidad del campo magnético aplicado dieron resultados variables. Se investigaron tres tipos de formas de onda: onda cuadrada, onda sinusoidal y onda en dientes de sierra. Inicialmente, el medidor de frecuencia se ajustó de tal modo que la amplitud de la forma de onda fuera de 0 voltios a una tensión que se correspondía con la intensidad de campo determinada.

La forma de onda en dientes de sierra dio lugar a números crecientes de partículas con la intensidad del campo para todos los tiempos de incubación, pero globalmente esta forma de onda dio lugar al número más bajo de partículas paramagnéticas enlazadas. La onda cuadrada da lugar al mayor número de partículas paramagnéticas enlazadas, particularmente para tiempos de incubación mayores. La intensidad del campo pareció tener menos efecto en comparación con las formas de onda en dientes de sierra. De forma interesante, una onda sinusoidal dio lugar a un enlazamiento creciente hasta una intensidad de campo determinada, para disminuir posteriormente a medida que aumentaba la intensidad de campo. Los mejores resultados se obtuvieron utilizando clavos en el electroimán, aunque esto también dio lugar a un elevado número de blancos.

La compensación de las formas de onda aplicadas se mostró también como una variable importante del ensayo. El número de partículas que se enlazaban aumentó en gran medida cuando el campo magnético variable permanecía positivo a lo largo de todo el ciclo.

Ejemplo 2 Ensayo CK-MB - utilizando partículas paramagnéticas con un tamaño de micrones

Se investigó el desarrollo de un ensayo directo de 5 minutos para la subunidad de creatina-quinasa (CK- MB). El anticuerpo de captura fue un anticuerpo monoclonal de ratón y el anticuerpo de detección fue un anticuerpo policlonal de cabra. En este ensayo, el anticuerpo de cabra se inmovilizó sobre el material de soporte.

Se investigaron un amplio abanico de condiciones para recubrir el material de soporte a efectos de maximizar la cantidad de proteína inmovilizada. Dichas condiciones incluyen:

-

Incubación durante una noche a 4ºC.

-

Incubación a temperatura ambiente durante 4 horas.

-

Irradiación de la fase sólida durante 15 minutos utilizando un transiluminador antes de aplicar la proteína.

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Todas las condiciones anteriores se probaron con y sin glutaraldehído en el tampón de recubrimiento y utilizando una serie de diluciones del anticuerpo: 1/200, 1/500 y 1/1000.

Después de la preparación del material de soporte, el ensayo se llevó a cabo en 2 etapas (indirecto) y también como una única etapa (directo). En el ensayo indirecto, la adición de antígeno y anticuerpo marcado se llevó a cabo de forma separada. En cambio, el ensayo directo incorporó una incubación simultánea de antígeno y anticuerpo marcado.

En las investigaciones iniciales, se utilizó un anti-HRP de ratón secundario marcado con enzima para poner de manifiesto que el ensayo funcionaba. Más tarde, éste se sustituyó por partículas paramagnéticas recubiertas con anti-CK-MB de ratón, con incubación sobre el electroimán con clavos para focalizar el campo en las 2 condiciones siguientes:

1.

Periodo de incubación de 5 minutos en un campo permanente (500 mA/282 mT)

2.

Periodo de incubación de 5 minutos - imán 1 min conectado, 1 min desconectado durante 5 min (500 mA/282 mT).

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Resultados

La combinación de las siguientes etapas/condiciones dio lugar a una buena respuesta diferencial (comparada con el control), tal como se muestra la figura 6.

Recubrimiento

Irradiación de las barras durante 15 minutos con iluminador de UV con superficie activa hacia la fuente de UV.

\quad

Recubrimiento con 25 \mul de anti-CKMB (1/1000) y 10 \mul 1% glutaraldehído. Incubación a temperatura ambiente durante 4 horas.

Bloqueo

1 hora con 50 l 1% BSA/1M glicina/PBS.

PMP

Dilución de CK-MB 1:1000 (100 \mug/l) en 1% BSA/PBS/1M glicina. Mezcla de 10 \mul de PMP recubiertas con 10 \mul de CK-MB. El anticuerpo se enlazó de forma cruzada utilizando trietanolamina.

Ensayo

Incubación en electroimán: 1 minuto conectado, 1 minuto desconectado, durante 5 minutos. Campo máximo (500 mA/282 mT).

Lavado con 2 x 2 ml de PBS, 1 x 1 ml de dH_{2}O. Secado y lectura en el magnetómetro.

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Ejemplo 3 Ensayo CRP - utilizando partículas paramagnéticas con un tamaño de nanómetros (ferrofluido)

Se utilizaron partículas paramagnéticas con un tamaño de nanómetros en un sistema de ensayo para medir la proteína C-reactiva (CRP). Dado que las partículas paramagnéticas no se podían contar mediante microscopia, se llevó a cabo un experimento inicial a efectos de investigar la susceptibilidad magnética del ferrofluido en el magnetómetro. Esto se comparó con la susceptibilidad de las partículas paramagnéticas con un tamaño de micrones. Se puso de manifiesto que, para una determinada masa de material paramagnético, el ferrofluido da lugar a una mayor respuesta en el magnetómetro.

Desarrollo del ensayo

Sabiendo que el ferrofluido se podía detectar en el magnetómetro, se investigó el desarrollo de un ensayo de 5 minutos competitivo. El ensayo tenía que ser competitivo, ya que se utilizaba un antígeno marcado. En el ensayo, el anti-CRP se inmovilizó sobre el material de soporte y el antígeno de muestra y el antígeno marcado compitieron por un número limitado de sitios de enlace de anticuerpo inmovilizados sobre el material de soporte.

Tal como en el ensayo CK-MB, se investigó un amplio abanico de condiciones para recubrir el material de soporte a efectos de maximizar la cantidad de proteína inmovilizada. Dichas condiciones incluyen:

-

Incubación durante una noche a 4ºC.

-

Incubación a temperatura ambiente durante 4 horas.

-

Irradiación de la fase sólida durante 15 minutos utilizando un transiluminador antes de aplicar la proteína.

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Todas las condiciones anteriores se probaron con y sin glutaraldehído en el tampón de recubrimiento y utilizando una serie de diluciones del anticuerpo: 1/200, 1/500 y 1/1000, 1/5000.

El ensayo se llevó a cabo mezclando antígeno de ensayo con antígeno marcado (el ferrofluido de CRP). Esto se llevó a cabo para diluciones de 1/50 y 1/500 de un suero de reserva con una elevada concentración de CRP. El ferrofluido se diluyó a 1/3. la incubación de 5 minutos sobre el electroimán se llevó a cabo en presencia de clavos para focalizar el campo magnético a una intensidad de campo de 282 mT.

Resultados

De todas las diferentes combinaciones de condiciones de ensayo investigadas, las condiciones descritas a continuación dieron los mejores resultados. Dichos resultados se muestran en la figura 7. El ensayo se repitió en dos días distintos; el gráfico muestra la respuesta en los dos días (R1 y R2) y una respuesta promedio. Las condiciones utilizadas en el ensayo fueron:

Recubrimiento

Irradiación de las barras durante 15 minutos con iluminador de UV con superficie activa hacia la fuente de UV. Dilución de anti-CRP 1:500 en PBS. Aplicación de 25 l de anti-CRP y 10 \mul de PBS. Incubación a temperatura ambiente durante 4 horas.

Bloqueo

Bloqueo en 1% BSA/PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.

Ferrofluido

Dilución de estándares de CRP 1:500 en 1% BSA/PBS. Mezcla de 10 \mul de CRP-ferrofluid (diluido 1/3) con 10 \mul de CRP. Incubación sobre el electroimán durante 5 minutos, campo permanente, intensidad máxima de campo (500 mA, 282 mT).

Lavado con 3 x 2 ml de PBS. Lectura en magnetómetro cuando esté seco.

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Ejemplo 4 Ensayo CK-MB - medición cuantitativa

Este experimento se llevó a cabo para establecer curvas de calibración para diversas concentraciones de analito, a efectos de proporcionar resultados cuantitativos.

Se utilizaron discos de poliéster con un diámetro de 1,5 cm. Los mismos se activaron del modo siguiente:

-

Inmersión en metanol durante 1 minuto e irradiación con UV durante 10 minutos.

-

Lavado en metanol.

-

Inmersión en glutaraldehído polimerizado durante 30 minutos (5 ml de 5% glutaraldehído, 500 \mul de NaOH 0,1M).

-

Inmersión en metanol durante 1 minuto.

Se añadió anticuerpo de captura diluido (1/1000 a 5,56 \mug/ml) a tampón de bicarbonato 0,1 M, pH 9,7, que contenía un 2% de metanol y un 0,5% de glutaraldehído. Esto se aplicó a los discos (35 \mul). A continuación, el disco se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavó en PBS y se bloqueó en 1% BSA/glicina/PBS durante 1 hora.

\newpage

Las partículas paramagnéticas se prepararon del modo siguiente:

-

Dilución de CKMB de cabra (1/1000 a 5,73 \mug/ml) en tampón de fosfato Na 0,1M, pH 5,8.

-

Lavado de PMP 280 (10 \mul por muestra) 2-3X en el tampón anterior.

-

Mezcla de 30 \mul de CKMB de cabra + 10 \mul de PMP (por disco), incubación durante 10 min a temperatura ambiente en un Dynal Sample Mixer con agitación suave.

-

Finalmente, 3 lavados en PBS con 1% BSA = 0,1% Tween 20.

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Se utilizaron las siguientes soluciones de CKMB:

1.

1/1000 (250 ng/ml)

2.

1/2000 (125 ng/ml)

3.

1/4000 (62,5 ng/ml)

4.

1/8000 (31,25 ng/ml)

5.

1/16000 (15,6 ng/ml)

6.

1/32000 (7,8 ng/ml)

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A continuación, se inyectaron 0,9 ml de CKMB apropiadamente diluidos en el recipiente de reacción (los recipientes de control reciben PBS/BSA) y se añadieron 100 \mul de PMP marcadas (diluidas 1/10 en PBS) a cada recipiente de reacción (se llevaron a cabo ensayos por triplicado). Las soluciones se mezclaron y la frecuencia se determinó inmediatamente (tiempo 0). El campo magnético se aplicó utilizando un imán superior y un imán inferior (respectivamente encima o debajo de la superficie de soporte), desplazándose cada imán alternativamente hacia el soporte o alejándose del mismo a efectos de aplicar el campo magnético. La frecuencia se determinó cada dos minutos cuando el imán inferior se encontraba a la máxima distancia con respecto al soporte.

El cambio de la frecuencia se determinó según la siguiente ecuación: diferencia absoluta de [(lectura promedio de frecuencia de la muestra) - (lectura promedio de frecuencia del blanco)]. Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9.

Claims (17)

1. Procedimiento para obtener mediciones cinéticas durante un ensayo de unión, que comprende las etapas siguientes:

(i)

poner una molécula diana en contacto con su pareja de afinidad para formar un complejo de unión, estando inmovilizada la molécula diana sobre una partícula magnética y estando inmovilizada la pareja de afinidad sobre un material de soporte; y

(ii)

determinar el número de partículas magnéticas complejadas durante el ensayo, exponiendo el complejo a un campo magnético a intervalos de tiempo regulares durante el ensayo y midiendo la diferencia en la frecuencia resonante de un circuito sintonizado cuando el complejo se expone al campo magnético y cuando el mismo no se expone.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el material de soporte se encuentra en un recipiente de reacción y el ensayo se lleva a cabo en una suspensión líquida.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el número de partículas magnéticas complejadas está determinado mediante una bobina de detección.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula diana es un anticuerpo.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la pareja de afinidad es un anticuerpo o antígeno.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la pareja de afinidad es un antígeno.

7. Procedimiento según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en el que la pareja de afinidad está inmovilizada sobre el material de soporte a través de un anticuerpo intermediario.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula diana es un polinucleótido.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 8, en el que la pareja de afinidad es un polinucleótido.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el campo magnético se aplica constantemente.

11. Procedimiento según cualquiera de las limitaciones 1 a 9, en el que el campo magnético aplicado es variable.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el campo magnético se modifica aplicando una señal externa con una forma de onda cuadrada, sinusoidal o en dientes de sierra.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el campo magnético se modifica aplicando una forma de onda cuadrada.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el campo magnético es proporcionado mediante un electroimán que comprende unos clavos metálicos para focalizar el campo magnético.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el campo magnético es proporcionado mediante un electroimán enrollado.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que se utiliza una pluralidad de electroimanes enrollados.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cualquier partícula magnética no enlazada es eliminada de la superficie del material de soporte, utilizando un imán colocado por encima de la superficie del material de soporte.