ES2328889A1 - Biosensor optico enzimatico. - Google Patents
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Abstract
Biosensor óptico enzimático, del tipo de los utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante absorción molecular, caracterizada porque comprende una lámina de poliacrilamida con una enzima que se oxida en presencia del analito a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular UV-visible diferente de la forma original, midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y relacionándose con la concentración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina. La invención que se presenta aporta la principal ventaja de permitir realizar la medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético en continuo de manera rápida, sencilla, fácilmente utilizable en la práctica habitual de un trabajo de campo con un coste económico reducido que abarate los costes.
Description
Biosensor óptico enzimático.
La presente memoria descriptiva se refiere, como
su título indica, a un biosensor óptico enzimático, del tipo de los
utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en
continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante
absorción molecular, caracterizado porque comprende una lámina de
poliacrilamida con una enzima que se oxida en presencia del analito
a una forma química que presenta un espectro de absorción molecular
UV-visible diferente de la forma original,
midiéndose este cambio en el espectro de absorción luminosa y
relacionándose con la concentración del analito, regenerando
posteriormente la enzima mediante tirosina.
En la actualidad son ampliamente conocidos en el
campo de la instrumentación para química diferentes analizadores
comerciales para la medida "in situ" de la
concentración de H_{2}O_{2} y/o ácido peracético. En función
del principio físico-químico en el que están basado
se pueden distinguir principalmente los basados en:
A - Valoración redox del peróxido con
MnO_{4}^{-} que realiza de forma automática. Se trata de un
dispositivo de valoración redox automático, que presenta una serie
de problemas de incertidumbre, necesidad de calibración continua y
estabilidad de los reactivos que hacen que su utilización no sea
muy habitual, especialmente para el trabajo de campo.
B - Absorción infrarroja directa del
H_{2}O_{2} en fase gas. Este tipo de dispositivos se puede
utilizar únicamente para medidas en fase gas pero tiene el gran
inconveniente de que no es aplicable en muestras líquidas por la
elevada interferencia que provoca el H_{2}O_{2}, lo cual impide
asimismo su uso de campo, restringiéndolo al entorno del
laboratorio.
Estos dispositivos, además, tienen el problema
añadido de que permiten la determinación "in situ" pero
únicamente en modo discontinuo del analito, lo cual hace que su uso
no sea viable cuando se requieran medidas en continuo.
Desde el punto de vista de sensores aptos para
la medida en continuo el más comúnmente conocido y utilizado es un
sensor amperimétrico, tal y como el descrito en la Patente ES
2242730 "Sensor electroquímico par la detección específica de
ácido peracético en soluciones acuosas usando procedimientos de
pulso amperimétrico" basado en la descarga directa del
H_{2}O_{2} o el ácido peracético sobre un electrodo,
generalmente de Au. Este dispositivo es el que tiene más éxito
comercial y el que ha mostrado mayor eficacia. Sin embargo presenta
todavía el inconveniente de que no se han obtenido hasta ahora
resultados satisfactorios en cuanto a fiabilidad y estabilidad, lo
cual le hace muy delicado para su trabajo en medidas de campo.
Se ha intentado buscar otras soluciones. Por
ejemplo la patente ES 2260710 "Biosensor óptico"
presenta un biosensor basado en la retención del bioreactivo en una
matriz constituida por alúmina porosa que adolece del problema de
que no especifica un procedimiento concreto de medida y
utilización.
Para solventar esta necesidad de disponer de
dispositivos para la medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido
peracético que permitan realizar medidas en continuo de manera
rápida, sencilla, y que sean asimismo fácilmente utilizable en la
práctica habitual de un trabajo de campo se ha ideado el biosensor
óptico enzimático objeto de la presente invención, el cual se basa
en los cambios que presenta el espectro de absorción
UV-visible de una enzima al pasar de su forma
original (o reducida, a partir de ahora Ez) a su forma oxidada (a
partir de ahora Ezox). El H_{2}O_{2} produce el paso de Ez a
Ezox, y una disolución de tirosina (u otro reductor químico, o
electroquímico alternativo) permite la regeneración de la Ez
original.
Para ello la invención comprende básicamente una
lámina, preferentemente de poliacrilamida, con enzima inmovilizada
en su interior, o en su superficie, dotada por un extremo de uno o
varios elementos emisores de luz con la longitud de onda apropiada,
y por el otro extremo con un elemento sensor de luz, también dentro
del espectro de luz deseado. Esta lámina de poliacrilamida con
enzima se pone en contacto con el analito a medir (peróxido de
hidrógeno y/o ácido peracético), produciéndose la oxidación de la
enzima a una forma química que presenta un espectro de absorción
molecular UV-visible diferente de la forma original.
Este cambio se refleja en la variación de medida indicada en el
elemento sensor de luz que está midiendo continuamente la luz que
atraviesa la lámina de poliacrilamida proveniente de los elementos
emisores de luz midiéndose este cambio en el espectro de absorción
luminosa y relacionándose con la con-
centración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina para continuar realizando medidas.
centración del analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina para continuar realizando medidas.
Obviamente el sensor requiere además de los
oportunos circuitos electrónicos de control de los elementos
emisores de luz y de proceso y medida de la señal proveniente del
elemento sensor de luz, de una bomba de doble canal para el paso de
la muestra y de una envolvente y soporte de los elementos.
El principal problema que resuelve esta
invención es que permite la determinación enzimática de peróxido de
hidrógeno de manera fiable y continua sin la necesidad de adicionar
ningún reactivo. Tan sólo es necesaria la muestra sobre la que se
va a llevar a cabo la determinación, ya que hace uso de las
propiedades de autoabsorción de la propia enzima inmovilizada sobre
un soporte de poliacrilamida.
Este biosensor óptico enzimático que se presenta
aporta múltiples ventajas sobre los sistemas disponibles en la
actualidad siendo la más importante que permite realizar la
medición de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético en continuo
de manera rápida, sencilla, fácilmente utilizable en la práctica
habitual de un trabajo de campo.
Es importante destacar que este biosensor puede
utilizarse tanto para medidas de peróxido de hidrógeno como de
ácido peracético.
Otra importante ventaja es que este sistema
permite llevar a cabo la reacción enzimática sin la necesidad de
adicionar ningún otro reactivo, tan sólo la muestra objeto de
análisis.
Además es necesario recalcar que esta invención
tiene un coste económico reducido que permite abaratar notablemente
los costes.
Otra ventaja de la presente invención es que el
procedimiento de medida permite obtener unos resultados altamente
fiables, no requiriendo de complejas ni frecuentes
calibraciones.
Para comprender mejor el objeto de la presente
invención, en el plano anexo se ha representado un ejemplo de
realización práctica preferencial de un biosensor óptico
enzimático.
En dicho plano la figura (1) muestra una vista
en perspectiva de un ejemplo de realización con dos elementos
emisores de luz.
La figura (2) muestra un diagrama de bloques del
ejemplo de realización con dos elementos emisores de luz.
La figura (3) muestra un diagrama de bloques de
una realización alternativa con un único elemento emisor de
luz.
\vskip1.000000\baselineskip
El biosensor óptico enzimático objeto de la
presente invención, esta formado básicamente, como puede apreciarse
en el plano anexo, por una lámina biosensora (1), preferentemente
de poliacrilamida, en la que se ha inmovilizado la enzima, dotada
por un extremo de uno o varios elementos emisores de luz (4, 5, 12)
con la longitud de onda apropiada, y por el otro extremo con un
elemento sensor de luz (6), también dentro del espectro de luz
deseado. En esta lámina biosensora (1) de poliacrilamida con enzima
se pone en contacto con el analito a medir (peróxido de hidrógeno
y/o ácido peracético), produciéndose la oxidación de la enzima a
una forma química que presenta un espectro de absorción molecular
UV-visible diferente de la forma original. Este
cambio se refleja en la variación de medida captada por el elemento
sensor de luz (6) que está midiendo continuamente la luz que
atraviesa la lámina biosensora (1) proveniente de los elementos
emisores de luz (4, 5, 12) midiéndose este cambio en el espectro de
absorción luminosa y relacionándose con la concentración del
analito, regenerando posteriormente la enzima mediante tirosina u
otro reductor químico, o electroquímico alternativo, para continuar
realizando
medidas.
medidas.
La enzima a utilizar puede ser cualquiera que
presente una diferencia suficientemente apreciable en el espectro
de absorción molecular UV-visible entre la forma
original y la oxidada, siendo elegida preferentemente de las
metaloproteínas, y siendo dentro de este grupo especialmente
indicada la enzima peroxidasa.
La lámina biosensora (1) está soportada por una
pieza inferior (3) constituida por una lámina preferentemente de
vidrio tratado para que sea reflectante y compatible con la lámina
biosensora (1), preferentemente mediante un depósito de AlN_{3}.
A ambos lados de la lámina biosensora (1) se encuentran sendas
piezas laterales (2) similares a la (3) pero más estrechas y
asimismo recubiertas para que sean reflectantes y compatibles con
la lámina biosensora (1), preferentemente mediante un depósito de
AlN_{3}.
La lámina biosensora (1) es de poliacrilamida y
contiene la enzima (Ez) inmovilizada en su interior mediante un
procedimiento de polimerización con entrampamiento realizado
directamente sobre el hueco que deja el conjunto constituido por
las piezas (3) y (2). Sobre un lateral de la lámina biosensora (1)
se adaptan los elementos emisores de luz (4, 5, 12) y sobre el otro
lateral se adapta el elemento sensor de luz (6) que mide la señal
proveniente de los elementos emisores de luz (4, 5, 12) una vez han
atravesado la lámina biosensora (1).
Sobre este conjunto se adapta una pieza metálica
(7) de cierre que contiene las conducciones de entrada (8) y salida
(9) de la muestra ubicadas sobre la lámina biosensora (1) y
conectadas a una bomba de doble canal para el paso de la
muestra.
Obviamente el sensor requiere además de los
oportunos circuitos electrónicos de control (10, 13) de los
elementos emisores de luz (4, 5, 12) y circuito electrónico de
proceso y medida (11) de la señal proveniente del elemento sensor
de luz (6).
Los elementos emisores de luz (4, 5, 12) son
preferentemente del tipo Diodo Electro Luminiscente (LED), mientras
que el fotodiodo (6) es preferentemente del tipo de Diodo
Fotosensible o fotodiodo.
En una realización preferente de la invención se
utilizan simultáneamente dos elementos emisores de luz (4, 5)
diferentes, uno de ellos que emite a 425 nm y el otro a 450 nm,
respectivamente, siendo la primera la longitud de onda analítica y
la segunda la de referencia.
\newpage
En una realización alternativa de la invención
se utiliza un único elemento emisor de luz (12), utilizando un
circuito electrónico de control específico (13) que utilice
modulación de frecuencia para generar las dos longitudes de onda en
el mismo elemento emisor de luz (12).
Completa el dispositivo un juego de válvulas
electromecánicas, para la inyección de la muestra y la limpieza de
la lámina sensora, una tarjeta de adquisición de datos y un sistema
informático para el almacenamiento, tratamiento y presentación de
datos, preferentemente en la forma de ordenador portátil o
similar.
Claims (17)
1. Biosensor óptico enzimático, del tipo de los
utilizados para determinaciones analíticas cuantitativas y en
continuo de peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético mediante
absorción molecular, caracterizado porque comprende una
lámina biosensora (1) con una enzima sobre la que se añade el
analito a medir, dotada por un extremo de uno o varios elementos
emisores de luz (4, 5, 12), y por el otro extremo con un elemento
sensor de luz (6) dentro del espectro correspondiente a los
elementos emisores de luz (4, 5, 12).
2. Biosensor óptico enzimático, según la
anterior reivindicación, caracterizado porque la lámina
biosensora (1) está soportada por una pieza inferior (3)
constituida por una lámina preferentemente de vidrio con un
recubrimiento reflectante compatible con la lámina biosensora (1),
y tiene adyacentes sendas piezas laterales (2) similares a la pieza
inferior (3) pero más estrechas y asimismo con un recubrimiento
reflectante compatible con la lámina biosensora (1).
3. Biosensor óptico enzimático, según las
anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la lámina
biosensora (1) es de poliacrilamida.
4. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la
enzima es una del grupo de las metaloproteínas.
5. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la
enzima es peroxidasa.
6. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el
tratamiento reflectante compatible con la lámina biosensora (1)
incorporado en la pieza inferior (3) y en las piezas laterales (2)
es un depósito de AlN_{3}.
7. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la
lámina biosensora (1) contiene una enzima inmovilizada en su
interior mediante un procedimiento de polimerización con
entrampamiento realizado directamente sobre el hueco que deja el
conjunto constituido por las piezas laterales (3) e inferior
(2).
8. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el
elemento sensor de luz (6) mide la señal proveniente de los
elementos emisores de luz (4, 5, 12) situados en la parte opuesta
una vez han atravesado la lámina biosensora (1).
9. Biosensor óptico enzimático, según cualquiera
de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque
sobre el conjunto formado por la lámina biosensora (1) y las piezas
laterales (2), soportadas en la pieza inferior (3), se adapta una
pieza metálica (7) de cierre que contiene las conducciones de
entrada (8) y salida (9) de la muestra ubicadas sobre la lámina
biosensora (1) y conectadas a una bomba de doble canal para el paso
de la muestra.
10. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado
porque el sensor incorpora los oportunos circuitos electrónicos de
control (10, 13) de los elementos emisores de luz (4, 5, 12) y
circuito electrónico de proceso y medida (11) de la señal
proveniente del elemento sensor de luz (6).
11. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado
porque los elementos emisores de luz (4, 5, 12) son del tipo Diodo
Electro Luminiscente (LED).
12. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado
porque el fotodiodo (6) es del tipo de Diodo Fotosensible o
fotodiodo.
13. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado
porque se utilizan simultáneamente dos elementos emisores de luz
(4, 5) diferentes, uno de ellos que emite a 425 nm y el otro a 450
nm respectivamente, siendo la primera la longitud de onda analítica
y la segunda la de referencia.
14. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones 1 a la 10,
caracterizado porque se utiliza un único elemento emisor de
luz (12), unido a un circuito electrónico de control específico
(13) que utilice modulación de frecuencia para generar las dos
longitudes de onda en el mismo elemento emisor de luz
(12).
(12).
15. Biosensor óptico enzimático, según
cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado
porque comprende un juego de válvulas electromecánicas, para la
inyección de la muestra y la limpieza de la lámina sensora, una
tarjeta de adquisición de datos y un sistema informático para el
almacenamiento, tratamiento y presentación de
datos.
datos.
16. Procedimiento de uso de un biosensor óptico
enzimático, según cualquiera de las anteriores reivindicaciones,
caracterizado porque comprende un primer paso en el que a la
lámina biosensora (1) de poliacrilamida con enzima se añade el
analito a medir, produciéndose a continuación el paso de la
oxidación de la enzima a una forma química que presenta un espectro
de absorción molecular UV-visible diferente de la
forma original, para a continuación reflejarse este cambio en una
variación de la medida captada por el elemento sensor de luz (6)
que está midiendo continuamente la luz que atraviesa la lámina
biosensora (1) proveniente de los elementos emisores de luz (4, 5,
12), procediendo a continuación a un paso de medida de este cambio
en el espectro de absorción luminosa y de relación con la
concentración del analito, para finalizar con un paso de
regeneración de la enzima mediante tirosina u otro reductor químico,
o electroquímico alternativo, para a continuación volver a comenzar
de nuevo el proceso de medida de una manera cíclica.
17. Uso del biosensor óptico enzimático para la
analítica del peróxido de hidrógeno y/o del ácido peracético.
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| VANESA SANZ, SUSANA DE MARCOS, JAVIER GALBAN. "Hidrogen peroxide and peracetic acid determination in waste water using a reversible reagentless biosensor". Analytica Chimica acta. 2007. Vol. 583, páginas 332-339. * |
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|---|---|
| ES2328889B1 (es) | 2010-10-18 |
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