ES2353616T3 - Método para la determinación de la concentración de un analito no volátil. - Google Patents

Abstract

Método para determinar la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso con el uso de un sensor óptico que contiene un colorante indicador luminiscente inmovilizado en al menos una de sus capas, cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario, y que se caracteriza por que además comprende: Medir la luminiscencia del sensor en seco en el lugar del usuario, sin el uso de medios de calibración, lo que da lugar a un valor de calibración en seco en el emplazamiento del usuario, y Deducir la concentración de analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación de húmedo a seco obtenida in situ en fábrica y deducida de un valor de calibración en húmedo in situ en fábrica y un valor de calibración en seco in situ en fábrica y el valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario.

Description

La invención se refiere a un método para la determinación de la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso que utiliza un sensor óptico, que contiene un colorante indicador luminiscente inmo

5 vilizado en al menos una de sus capas, cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de

10 muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario Estado de la técnica Los analizadores para la determinación de las sustancias no volátiles en un líquido (por ejemplo, las sustancias iónicas como el H+ (pH), Na+, K+, Ca++, Cl-, las molécu

15 las neutras o cargadas como la glucosa, urea o lactato) se utilizan en la tecnología de la fábrica, ambiental y médica. El diagnóstico clínico, en particular, se basa en un equipo analizador para la determinación de los así llamados “analitos de pacientes en estado crítico” en los fluidos

20 biológicos como la orina, el plasma, el suero y sobre todo la sangre entera. Dichos sistemas comprenden frecuentemente diversos elementos sensores para determinar los parámetros

respectivos. Dichos elementos sensores se podrán utilizar para una determinación única (un solo uso) o se reutilizarán para múltiples determinaciones (uso múltiple).

Los elementos sensores de este tipo utilizan a menudo tecnologías de detección electro-químicas o bien óptico- químicas para la determinación de los parámetros de gas, valores de pH, valores iónicos o bien valores del metabolitos en los diagnósticos clínicos. Preferiblemente en un “cartucho” se unen una pluralidad de elementos sensores para la determinación de diversos analitos (ver, por ejemplo, Ann. Biol. Clin. 61, 183-91, 2003).

El diagnóstico clínico requiere un nivel elevado de exactitud en los resultados de las mediciones. Además, una etapa de medición única debería aportar valores de medición para un gran número de sustancias. Además se espera que los resultados de la medición se presenten con un retraso mínimo y que el coste por valor de medición sea bajo. A menudo es preferible que las mediciones se realicen cerca del paciente, por ejemplo, “junto a la cama”, en el despacho del médico o en la unidad de cuidados intensivos.

Como consecuencia de ello, no se aceptan los procedimientos de calibración que requieren tiempo, que implican varios medios de calibración antes de realizar la medición real, en particular cuando se hace referencia a sensores “de un solo uso”. Puesto que el coste de los aparatos en miniatura y de los elementos sensores debe ser mínimo, los procedimientos que requieren aparatos caros, elementos sensores complejos, o bien muchos fluidos y otros elementos no

son los adecuados.

Los sensores electroquímicos pueden estar basados en uno de los múltiples principios de medición, como los principios de medición potenciométricos, amperométricos o conductométricos. Todos los principios requieren el uso de un electrodo de referencia y a menudo se aplican en configuraciones que requieren el contacto con un fluido de calibración húmedo antes de realizar la medición de la muestra desconocida.

La patente americana 4.734.184 (Burleigh y cols.) muestra un montaje de electrodos para controlar la concentración de una serie de gases e iones presentes en la sangre. Aunque el montaje se almacena en seco para promocionar un periodo de vida amplio, los electrodos son hidratados intensamente antes de ser utilizados.

La patente 4.654.127 (Baker y cols.) muestra un aparato sensor equipado con unos sensores selectivos según las especies y un depósito con diversas cámaras que puede girar, en el cual se encuentran las soluciones de muestra y la solución de calibración en cámaras separadas. Este dispositivo permite detectar muchas especies químicas. Además, estos sensores disponibles en el comercio se guardan en un envase con elevada humedad (prácticamente húmedos). Este método de envasado tiene el efecto de limitar el periodo de caducidad de estos dispositivos sensores.

La patente americana 5.112.455 (Cozette y cols.) muestra un dispositivo sensor dotado de un electrodo de referencia y al menos un sensor básicamente almacenado en seco,

capaz de exhibir una respuesta a los cambios en la concentración de una especie de analito preseleccionada antes de que el sensor adquiera una humedad totalmente equilibrada. Sin embargo, el sensor y el electrodo de referencia deben ponerse en contacto con un líquido calibrador antes de que los electrodos alcancen un estado de “humedad” equilibrado, para conseguir información analítica significativa a partir de dichos electrodos en estado sólido.

En JAMES K. TUSA, HUARUI HE “Critical care analyzer with fluorescent optical chemosensors for blood analytes” JOURNARL OF MATERIALS CHEMISTRY, vol. 15, 13 May 2005(200505-13), páginas 2640-2647, se resume la aplicación de sensores fluorescentes a sistemas diagnósticos in vitro.

Los sensores o los optodos utilizados en el analizador descrito por este documento se incorporan a un cartucho desechable. Para la medición del pH los iones hidrógeno de la sangre se unen a un colorante indicador fluorescente sensible al pH que se encuentra inmovilizado en la capa sensible de un optodo. El colorante indicador HPTS existe en dos estados, protonado y deprotonado, en unas cantidades relativas determinadas por el pH de su entorno local (en equilibrio con la muestra sanguínea), por lo que la luminiscencia depende de la concentración del analito. Cada cartucho desechable de un solo uso mide hasta ocho analitos tras una calibración puntual de la intensidad en su nivel de analito fisiológico respectivo, en combinación con un código de barras de la fábrica específico del lote con unos datos de calibración y expiración. Inmediatamente antes del

uso se comprueba la calibración de la fábrica con unos tampones de precisión y mezclas de gas.

Los sensores óptico-químicos se pueden basar en uno de los diversos principios de medición ópticos, como los principios de medición de la fluorescencia, absorbancia o reflectancia. Se aplican en una serie de configuraciones de medición diversas y, en contraste con los sensores electro- químicos, los sensores ópticos normalmente no requieren un electrodo o sensor de referencia.

Un sensor óptico-químico o bien óptico-bioquímico consiste normalmente en una o más capas de sustancias inorgánicas y/o bien orgánicas, preferiblemente poliméricas, que se aplican a un portador o sustrato transparente, con al menos una capa que contiene un colorante cuyas características ópticas (absorción, luminiscencia) varían con la concentración de un analito en particular contenido en un medio de muestreo. Los sensores óptico-bioquímicos contienen al menos un agente bioquímico o bien biótico de origen natural, por ejemplo un enzima. El portador puede ser plano, cilíndrico o de cualquier otra forma. Por ejemplo, las capas se pueden aplicar a los “pocillos” de las microplacas, en la punta de haces de fibra óptica o en las fibras ópticas individuales o en estructuras conductoras de la luz.

Un sensor óptico-químico es capaz de medir de forma reversible y a menudo continuada. Las excepciones a esta norma son ciertos sensores bioquímicos portadores de enzimas. Estos miden de forma no continua y a menudo consumen

un sustrato o reactivo (como el oxígeno), es decir, ellos o su sustrato o reactivo son consumidos o alterados y deben ser regenerados para posteriores mediciones. Puesto que generalmente los sensores tienen un tiempo de vida limitado, deben ser reemplazados en ciertos intervalos.

Se coloca un sensor óptico-químico en contacto directo con el medio de muestreo y, cuando se expone a la luz, aporta información legible ópticamente acerca de un analito de interés especial, que está presente en el medio de muestreo (por ejemplo, la concentración, actividad o la presión parcial).

La mayoría de los sensores óptico-químicos requieren varias mediciones de calibración con medios de calibración, de manera que las concentraciones de analito se encuentran distribuidas por todo el campo de medición. El número de mediciones de calibración requeridas depende de la exactitud de medición deseada en el margen de medición pertinente, de manera que la exactitud y el intervalo varíen según las diferentes aplicaciones. Por ejemplo, las mediciones de niveles de sodio fisiológico oscilan normalmente entre al menos 120 y 160 milimoles por litro y de ahí que requieran mediciones de calibración dentro de dicho intervalo.

Para minimizar el número de mediciones de calibración, al menos tanto como en lo que al usuario concierna, y para hacer que sean rápidas y simples, es posible obtener una o más de las características del sensor en el lugar de fabricación (por ejemplo, calibrando un lote de producción) y aportar los datos relevantes junto con los sensores de for

ma adecuada.

Los dispositivos más novedosos utilizan de forma ocasional el término “sensores sin calibración” en su documentación. En realidad no existe nada como un sensor sin calibración. Un sensor nuevo o bien recién diseñado o desarrollado se calibra al menos una vez o bien una o más de sus características se miden al menos una vez. Por ejemplo, es posible calibrar un lote de producción durante la fabricación del sensor y posteriormente fabricar sensores con justo esta conocida característica mediante técnicas de fabricación reproducibles. Además es posible calibrar al menos un sensor o un número representativo de sensores de un lote y asignar las características medidas a todos los sensores de este lote. Esto requiere una fabricación suficientemente reproducible en un lote y/o la fabricación reproducible de sensores entre lotes. También requiere la fabricación reproducible de cualquier instrumento o dispositivo de medición suministrado o endosado por el fabricante para realizar la medición. Dicha calibración en fábrica es cara y requiere tiempo, lo que precisa de un control extremadamente estricto de las características del sensor y el control concomitante de las características del dispositivo o instrumento de medición.

En este contexto se han propuesto una serie de soluciones, por ejemplo, medir la intensidad de la luminiscencia en una pluralidad de longitudes de onda, o bien medir el tiempo de extinción de los sensores ópticos mediante métodos de resolución del tiempo o de la fase. Tal como se ha

descrito a continuación, a menudo se aplican una multitud de métodos en un único sistema, debido a la escasez de moléculas indicadoras sensibles o receptivas a todos los analitos deseados dentro de sus márgenes de concentración respectivos.

Por ejemplo, dicho sistema “sin calibración” que utiliza sensores óptico-químicos se ha propuesto para “el análisis de diagnóstico inmediato” de los gases de la sangre (PO2 y PCO2) y del valor de pH de la sangre en Clin.Chim.Acta 307, 225-233, 2001. En este sistema, la determinación de PO2 se realiza midiendo el tiempo de extinción o la caída de la luminiscencia de un colorante luminiscente inmovilizado sobre una membrana. El PCO2 se determina – evitando el uso de un sensor óptico – por medio de la absorción infrarroja directa de CO2. El valor del pH se determina por colorimetría (usando el principio de absorbancia) por medio de la medición de la transmisión a todas las longitudes de onda de un colorante indicador colorimétrico del pH inmovilizado sobre una membrana una vez retirada la muestra. Dichos sistemas que emplean múltiples métodos son a menudo complejos y caros.

Como medir el contenido de oxígeno de una muestra de sangre por un método de extinción de la luminiscencia se ha descrito en la patente americana 5.564.419 (radiómetro). El método utiliza un luminóforo cuya luminiscencia se extingue en presencia de oxígeno. El PO2 de la muestra se determina midiendo el tiempo de caída o extinción de la luminiscencia.

En contraste con la medición del tiempo de extinción de la luminiscencia, la determinación de la intensidad de luminiscencia plantea mayores problemas en lo que se refiere a los parámetros de los componentes del sistema óptico. Para sensores que utilizan indicadores de luminiscencia con largos tiempos de extinción (>500 nanosegundos), los requisitos más novedosos respecto al establecimiento de la medición óptica son relativamente moderados.

Desafortunadamente existe un gran número de analitos, especialmente iones y metabolitos, para los cuales se dispone de sistemas indicadores o indicadores no simples con largos tiempos de extinción de la luminiscencia. A medida que aumenta el tiempo de vida de la luminiscencia del indicador la sensibilidad cruzada frente a sustancias de extinción bien conocidas, especialmente el O2, aumentará. Los indicadores con tiempos de extinción inferiores a 100 nano- segundos (ns) se ven menos afectados por dichos problemas. Sin embargo, la determinación exacta y sin calibración de dichos pequeños tiempos de extinción generalmente requiere instrumentación más costosa y compleja. La medicina moderna requiere cada vez más analizadores de bajo coste, miniaturizados y resistentes, que se puedan utilizar en análisis de diagnóstico inmediato o sea junto al paciente.

La determinación del valor del pH de una muestra de sangre mediante un método colorimétrico se sabe de la patente americana número 5.288.646 (radiómetro), donde se propone una medición fotométrica utilizando un colorante indicador colorimétrico del pH (no luminiscente) que se in

moviliza sobre una membrana situada en la pared de un “dispositivo de muestreo”. La medición de la transmisión usando múltiples longitudes de onda es costosa y requiere medidas para corregir las variaciones de las características de los componentes ópticos y de los recorridos de la luz. Puesto que la sangre absorbe la luz de la muestra se debe retirar de la vía o del recorrido de la luz antes de la medición, comprimiendo el conducto por ejemplo.

En el contexto de los indicadores de la luminiscencia se ha propuesto (ver patente americana nº 5.108.932 (Wolfbeis) iluminar a una longitud de onda, preferiblemente en el punto isosbéstico, y medir a dos longitudes de onda diferentes de la emisión luminosa. Trabajar con múltiples longitudes de onda o bien la detección en múltiples longitudes de onda con las características de los componentes ópticos bien conocidos requiere, no obstante, una tecnología más cara. En contraste con la medición de los valores del pH existe un gran número de analitos para los cuales no se dispone de indicadores de luminiscencia adecuados para métodos de múltiples longitudes de onda.

Medir la intensidad de luminiscencia en una amplia gama de longitudes de onda analíticas es especialmente ventajoso. En comparación con las tecnologías mencionadas antes, medir la intensidad de la luminiscencia tiene la ventaja de que establecer los componentes ópticos y electrónicos necesarios para la medición es relativamente simple y se puede llevar a cabo con componentes de bajo coste. Un inconveniente aquí es el hecho de que ciertos parámetros de los

componentes ópticos del sistema de medición y de cada uno de los sensores, que influyen en la intensidad de la luminiscencia, influye en el resultado de la medición. Aunque es posible básicamente construir sistemas ópticos y sensores con componentes estables y sensores cuyas características se determinan con precisión, esto resulta poco real a la vista de los requisitos mencionados y de los gastos implicados. Una solución del problema que en principio se conoce consiste en realizar una calibración puntual inmediatamente antes de la medición, en la cual se determinan los parámetros que dependen del sistema de medición individual y del elemento sensor individual y que influyen en la intensidad de la luminiscencia.

Según el estado de la técnica es posible, por ejemplo, en el caso de los sensores ópticos basados en la medición de la intensidad de la luminiscencia en una gama amplia de longitudes de onda analíticas, obtener una característica relativa (es decir, una característica que no dependa del sistema de medición individual) mediante mediciones de la calibración durante la fabricación y suministrar esta característica en forme de parámetros (coeficientes) de una ecuación matemática describiendo la curva característica junto con el sensor a utilizar en el sistema de medición en el lugar o emplazamiento del usuario. Los parámetros se podrán suministrar en forma de códigos de barras, o bien almacenar en medios de almacenamiento electrónico, magnético

o bien óptico. Para la determinación de la característica válida en el sistema de medición del usuario (es decir, la

característica efectiva) al menos se requiere una medición adicional e la intensidad de la luminiscencia. De acuerdo con el estado de la técnica esto se obtiene del modo siguiente: por medio de un medio de calibración que contenga al menos el analito que se va a medir en una concentración conocida, un valor de luminiscencia correspondiente a esta concentración conocida se ajusta en el sensor del sistema de medición del usuario y se mide la luminiscencia, lo que da un valor de calibración para el lugar del usuario. La característica relativa a la que se hace referencia en el valor de calibración en el lugar del usuario será la característica efectiva.

Para un sistema sensor óptico-químico simple, en el cual el indicador de la luminiscencia es excitado electrónicamente por irradiación con luz en una banda de absorción y la intensidad de la luz emitida en una banda de emisión se utiliza para la determinación del analito, se requiere al menos una medición de la calibración a efectuar en el emplazamiento del usuario.

Respecto a esta calibración en el lugar ocupado por el usuario, se conocen procedimientos y dispositivos de medición para elementos de medición que contienen uno o más sensores óptico-químicos y un medio de calibración.

En la patente americana 5.080.865 (Leiner) se ha propuesto un elemento de medición de uso único que contiene uno o más sensores electroquímicos o bien ópticos e incluye un medio de calibración adecuado para el(los) sensor(es) indicado(s). Previamente a la medición se inserta el ele

mento de medición en el analizador y se realiza una medición de la calibración seguida de la medición de la muestra. Si se utiliza un líquido con uno o más gases (por ejemplo, O2 y CO2), los sensores iónicos y del gas se pueden calibrar al mismo tiempo. El almacenar los sensores en un líquido tiene la ventaja de que los sensores están preparados para ser utilizados justo después de haber alcanzado la temperatura de medición. El inconveniente es que la duración de los sensores está limitada a varios meses cuando se almacenan en un líquido. Este es el caso en particular para biosensores muy sensibles que transportan enzimas. Otro inconveniente reside en el hecho de que el elemento de medición de un solo uso debe sostener o almacenar el líquido sin pérdida durante el periodo de validez y que se necesita un sistema líquido para el transporte del líquido de calibración.

En la patente americana 5.351.563 (Karpf) se ha propuesto integrar un medio de almacenamiento líquido (que al mismo tiempo es un medio de calibración para sensores iónicos y del pH) en el elemento de medición desechable. El medio de almacenamiento es desplazado por un gas de calibración saturado con vapor de agua, y luego se realiza la calibración y posterior medición de la muestra.

La patente 5.166.079 (Blackwood y cols.) revela un método y un dispositivo para pruebas con el fin de realizar inmunoanálisis competitivos usando elementos de enlace que se marcarán con una grupo fluorescente. En el estado seco, la capa de reactivo del dispositivo de pruebas comprende un

inmunocomplejo de un elemento de enlace o unión inmovilizado (por ejemplo, un anticuerpo) para el analito (por ejemplo, antígeno) de interés y un conjugado de un analito etiquetado. En la práctica, la etiqueta que está presente en la capa reactiva se lee ópticamente antes de aplicar la muestra al elemento de valoración. Una vez se ha añadido el líquido de muestra que contiene el analito de interés al dispositivo de pruebas, el analito presente en la muestra compite con el conjugado de analitos marcado en la capa de reactivo por los puntos de unión disponibles sobre los elementos de unión inmovilizados. El analito marcado se disocia y es sustituido por el analito de muestra en una proporción más o menos igual a las cantidades relativas de analito de muestra y de analito marcado. Una segunda señal de lectura de la capa de reactivo se obtendrá cuando se aplique la muestra cuya señal es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. El porcentaje de la segunda señal respecto a la primera señal se comparará con el de cantidades conocidas de analito para determinar la cantidad de analito en la muestra. De acuerdo con la patente americana 5.166.079, el método revelado aquí permite compensar las variaciones en el instrumento y en el grosor de la capa reactiva de elemento a elemento y proporciona una mejor precisión. También es importante observar que el método de la patente americana 5.166.079 se basa en el desplazamiento del analito marcado fluorescente de la capa que es sometida a radiación, pero el analito en la muestra no influye en las propiedades fluorescentes del grupo fluores

cente como tal.

De acuerdo con ello, actualmente existe una necesidad de un método que integre un dispositivo sensor, preferiblemente un sensor óptico-químico, que tenga el requisito de un periodo largo de validez, una respuesta óptica predecible y reproducible y unas características de “humectación”, permitiendo dicho método obtener determinaciones precisas y eficaces desde el punto de vista económico de la concentración de analitos. Dichas determinaciones se realizan preferiblemente en cinco minutos o algo menos, más preferiblemente en un minuto. Principios básicos

Para permitir una mejor comprensión de la presente invención se resumirá la relación entre la intensidad S de la señal de luminiscencia de una especie luminiscente A, su concentración cA y los parámetros del sistema de medición indicado y luego se describirá la calibración en húmedo, técnicamente bien conocida, usando el caso de un sensor óptico con un colorante de transmisión de carga intramolecular (ICT) para la determinación del valor del pH de una muestra.

Para ajustarse a las ecuaciones publicadas respecto a la calibración en húmedo se ha utilizado la letra S para designar la intensidad de luminiscencia. En contraste con ello, la descripción de la invención utilizará la letra L para la intensidad de luminiscencia en las ecuaciones y su derivación.

La ecuación de Parker describe la relación entre la

intensidad de luminiscencia S de una especie A y su concentración cA cuando se dan la longitud de onda de excitación (ex) y la longitud de onda de emisión (em):

(a) S = IokexekemεΘd cA

donde Io es la intensidad de la fuente de luz, kex y kem son los parámetros de transmisión de los componentes ópticos en el lado de la excitación o emisión, y e es la sensibilidad del detector, todo dependiendo de la longitud de onda de la luz λ. Los parámetros fotofísicos que dependen de la especie luminiscente son el coeficiente de absorción molar ε, la eficiencia cuántica de luminiscencia Θ y la concentración de analito cA. d es longitud media del recorrido de la luz en el medio que contiene la especie.

Para una especie determinada A el producto de los parámetros Io, kex, e, kem, ε, Θ y d se puede combinar dando un parámetro nuevo kA

(b) kA = IokexekemεΘd

lo que resulta en

(c) S = kAcA

Las propiedades de los componentes ópticos (por ejemplo, la intensidad y el espectro de la fuente de luz, las propiedades de transmisión espectral de los filtros ópticos, la sensibilidad espectral de los detectores, etc.) y de los montajes ópticos (longitud de los recorridos de luz) varían con ciertos límites y con el tiempo. Esto hará que el parámetro kA tenga una cierta varianza entre sensores y

entre dispositivos que también cambiará con el tiempo (duración de funcionamiento). Estas varianzas se deben tener en cuenta cuando se realizan mediciones que requiere un grado elevado de exactitud y reproducibilidad. Minimizar estas varianzas cuesta dinero y por lo tanto no es factible económicamente si hablamos de sistemas de medición económicos.

Un sensor óptico-químico bien conocido para la determinación del pH utiliza el ácido hidroxi-pireno-sulfónico del colorante ICT (HPTA) (Ann.Biol.Clin.61, 183-91, 2003).

La curva de calibración del sensor se puede deducir de las relaciones simples de la ley de acción de masas entre el valor del pH y la concentración de las especies de colorantes protonadas (AH) y deprotonadas (A-):

(d) pH = pK + log (cA-/cAH)

Cuando se excita cerca de los 470 nm en un entorno acuoso, no se genera luminiscencia a 520 nm de la forma protonada. La concentración total cD del colorante es la suma de las concentraciones de cada una de las especies de colorantes:

(e) cD = cA-+ cHA

Para valores de pH altos (es decir, pH>pK+3), la especie colorante protonada no existe. Por consiguiente, para valores de pH altos cD=cA-.

La sustitución de cHA en la ecuación (d) por la expre

sión cHA=cD-cA-procedente de la ecuación (e) y la simplificación da lugar a la ecuación:

cA-1

(f) ___ = _______ 1+10pK-pH

cD

La ecuación (f) es equivalente a la ecuación (g)

kAcA- 1

(g) _____ = _______ kAcD 1+10pK-pH

y además equivalente a la ecuación (h) a la vista de la ecuación (c)

S

1

(h) ___ = _______ Sm 1+10pK-pH

donde S indica la intensidad de luminiscencia a un valor del pH determinado y Sm indica la intensidad de luminiscencia en ausencia de las especies protonadas HA. Finalmente, los reajustes de la ecuación (h) conducen a la curva de calibración del sensor (publicada en Ann. Biol. Clin. 61, 183-91, 2003)

Sm

(i) S = ______ 1+10pK-pH

La curva de calibración (ecuación i) es una función sigmoidal que se caracteriza por incrementar la intensidad de luminiscencia pasando de valores de pH bajos a altos y a un punto de inflexión (el valor pK del colorante) centrado en los valores centrales del pH fisiológico, donde S es la intensidad de luminiscencia relativa como una función del pH, Sm es la intensidad máxima vista para valores de pH elevados y pK es el log negativo de la constante de disociación del protón del indicador.

Al resolver la ecuación (i) para el pH obtenemos

(j) pH = pK – log [(Sm/S)-1]

a partir de la cual se puede calcular el valor del pH si se conocen los parámetros S, Sm y pK.

Para determinar el valor del pH se obtiene la intensidad de luminiscencia S en el lugar del usuario a partir del valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con la muestra acuosa. El valor del pK se obtiene de la calibración en fábrica. El valor Sm en el lugar del usuario es desconocido y debe ser determinado en el lugar del usuario a partir del valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con una solución de calibración acuosa

de pH conocido. La necesidad de la determinación del Sm en el lugar donde se encuentra el usuario es obvia a partir de la ecuación (g). Los parámetros kA en el numerador y denominador de la fracción son idénticos solamente si las cantidades que constituyen los parámetros kA son iguales. Estas cantidades pueden verse en (b). La igualdad se mantendrá esencialmente si se determina Sm poco antes o bien después de que S se determine usando uno y el mismo sistema de medición.

Por ejemplo, Sm se puede determinar donde se encuentra el usuario midiendo la luminiscencia del sensor en contacto con un medio de calibración acuoso con un pH elevado.

Preferiblemente Sm se obtiene midiendo la intensidad de luminiscencia Scal del sensor en contacto con un medio de calibración acuoso, cuyo pH (pHcal) se aproxime al valor del pK conocido de la calibración en fábrica, y mediante el cálculo de Sm a partir de la ecuación (k):

= Scal (1+10pK-pHcal)

(k) Sm

La patente americana 6.211.359 (He et al.) informa sobre características similares para los sensores ópticos que se emplean para determinar potasio con indicadores luminiscentes en base al efecto de transferencia de electrones fotoinducidos (PET). La ecuación 6 de la patente americana

6.211.359 (He et al.) también se puede aplicar en el caso de otros iones y además tiene en cuenta los iones de interferencia que podrían estar presentes. La ecuación 7 de la patente 6.211.359 se utiliza para obtener la concentración

del ión que se va a medir en analogía a la ecuación (j). la ecuación 8 de la patente 6.211.359 se utiliza para hallar el valor desconocido de Sm por medio de una calibración única en analogía a la ecuación (k).

La patente americana 6.171.866 (He et al.) informa sobre características similares para los sensores ópticos que se emplean para determinar calcio con indicadores luminiscentes en base al efecto de transferencia de electrones fotoinducidos (PET). La ecuación 6 de la patente americana

6.211.359 (He et al.) y la ecuación 4 de 6.171.866 son equivalentes a excepción de que la ecuación 4 no tiene en cuenta los iones de interferencia y que la concentración y el valor Kd se dan en forma logarítmica. Definiciones

Para prevenir malas interpretaciones debidas a diferentes definiciones en documentos anteriormente publicados, se dan las definiciones siguientes para una serie de conceptos esenciales. Analito: el término analito equivale a una sustancia en un medio de muestreo acuoso que se determina cuantitativa o cualitativamente. El término analito no volátil se utilizará para establecer una diferencia con los analitos volátiles, es decir, sustancias que son gaseosas en condiciones estándar como el O2 o el CO2. Los analitos no volátiles incluyen, por ejemplo, sustancias iónicas como el H+(pH), Na+, K+, Ca++, Cl-, las moléculas neutras o cargadas como la glucosa o el lactato. La interacción entre analito y colorante luminiscente en el sensor óptico puede ser directa o

indirecta.

“Interacción directa” significa que el analito llega al colorante y ambas especies reaccionan una con otra.

“Interacción indirecta” significa que el analito no entra en contacto directo con el colorante luminiscente y/o que la respuesta luminiscente del colorante no se debe a la interacción química o física del analito-colorante. Los ejemplos constan de unos sensores enzimáticos que pertenecen al grupo de los sensores bioquímicos. En este contexto, una o más enzimas reaccionan con el analito, dando lugar a un producto de reacción que en cambio reacciona directamente con el colorante indicador. En ciertos biosensores conocidos la reacción enzimática produce, por ejemplo, un cambio en el valor del pH que se puede determinar por medio de un colorante indicador sensible al pH. Los ejemplos se pueden hallar en Biosensors & Bioelectronics 10, 1995, 653659(Konicki y cols.).

Otro tipo de interacción indirecta tiene lugar en las valoraciones basadas en el principio de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) (cf.infra) según el cual el analito interacciona con un colorante aceptor y se mide la luminiscencia de un colorante dador.

Independientemente de que se produzca una interacción directa o indirecta del analito con el colorante luminiscente, y análogamente a los colorantes típicos de absorción del pH, estos colorantes luminiscentes se conocen como colorantes del indicador luminiscente.

A menos que se mencione específicamente, el término

“analito” en conexión con sus interacciones con el colorante luminiscente abarcará tanto las interacciones directas como indirectas. Por ejemplo, si el analito no volátil es H+ y se utiliza un colorante sensible al pH, se produce la interacción directa del analito y el colorante. Sin embargo, si la glucosa es el analito y se utiliza un sensor de enzimas empleando el principio de detección de un cambio del pH que ocurre cuando la glucosa se transforma enzimáticamente, la especie que interacción con el colorante es H+, no la glucosa.

Por lo tanto, en el contexto actual, las declaraciones como “el analito reacciona con el colorante indicador”, “el analito interacciona con el colorante indicador” “el analito está unido al colorante” y declaraciones similares abarcan tanto las interacciones directas como indirectas del analito-colorante.

Medio de muestreo: el medio de muestreo es típicamente una solución acuosa con sales disueltas, que puede contener además componentes orgánicos, bioquímicos o biológicos. Los medios de muestreo que se medirán pueden proceder del área de la tecnología ambiental (muestras de agua o de agua residual), de la biotecnología y de la medicina (sangre, suero, plasma, muestras de orina o muestras de otros fluidos corporales).

Sensor óptico: en el uso de la presente invención el término “sensor óptico” se refiere a la interfase entre un medio de muestra y los componentes ópticos de un dispositivo de medición; en particular, se refiere a una o más capas

de sustancias inorgánicas y/o orgánicas, preferiblemente poliméricas, sustancias aplicadas sobre un soporte o sus- trato transparente, con al menos una capa conteniendo un colorante, cuyas características ópticas (absorción, luminiscencia) varíen con la concentración de un analito, en particular, contenido en un medio de muestreo. Esta interfase también se conoce como optodo o bien optrodo.

Los componentes del sistema de medición o del dispositivo de medición como la fuente de luz, el detector, los filtros ópticos, los amplificadores de la señal electrónica y la unidad de evaluación no son parte del sensor óptico.

La presente invención se refiere a los sensores ópticos para la medición de sustancias que son no-volátiles (no gaseosas) en condiciones estándar, como los iones inorgánicos (por ejemplo, H+, Na+, K+, Ca++, Cl-, NO3-, Fe2+, etc.), las moléculas eléctricamente cargadas o neutras (por ejemplo, lactato, glucosa, urea, creatinina, aminas, alcoholes) disueltos en medios de muestreo preferiblemente acuosos.

La presente invención no hace referencia a los sensores ópticos para la medición de sustancias que son gaseosas en condiciones estándar como el O2, CO2, SO2, etc. En particular, no se refiere a los sensores ópticos de gas, es decir, a los sensores que en el estado seco y en contacto con un medio de muestreo gaseoso responden a un cambio en la presión parcial del analito (por ejemplo, O2, CO2) con un cambio en la señal óptica. La invención no se refiere tampoco a los sensores para aquellos analitos volátiles disueltos en una muestra acuosa que está en contacto con el

sensor.

Sin embargo, la presente invención se puede utilizar cuando sensores separados para analitos volátiles y no volátiles se utilizan en combinación. En este caso, no obstante, la invención se puede aplicar únicamente en relación con los sensores para analitos no volátiles.

Sensores ópticos de luminiscencia: la presente invención se refiere preferiblemente a los sensores ópticos de luminiscencia. Dichos sensores contienen al menos un colorante luminiscente (al que nos referimos como colorante indicador luminiscente) en al menos una capa.

Sensor óptico seco: el término se refiere a un sensor óptico conforme a la definición anterior, en el cual todos los materiales del sensor que constituyen el sensor están secos (es decir, básicamente libres de agua). El sensor está en este estado durante el almacenamiento y/o antes de la medición. Para activar funcionalmente el sensor deberá ponerse en contacto con agua o con un medio que contenga agua, por ejemplo, con un medio de activación acuoso, un medio de muestreo o un medio de calibración.

Sensor óptico húmedo: el término se refiere a un sensor óptico conforme a la definición anterior, que está en contacto con un medio acuoso, por ejemplo, un medio acuoso de calibración, muestreo o activación.

Actividad: la actividad a de una sustancia iónica es el producto de su concentración c y su coeficiente de actividad. La actividad depende de la resistencia iónica. Para una resistencia iónica baja el coeficiente de actividad es

1, y por consiguiente c=a. Dependiendo de la aplicación, el experto calculará un valor adecuado, por ejemplo, usando las ecuaciones de Debey-Hückel. Si a continuación se menciona la determinación de la concentración, también se incluye la determinación de la actividad.

Sistema de medición: el término se refiere, a excepción del sensor óptico propiamente tal como se ha definido antes, a todos los componentes ópticos, electrónicos y mecánicos que se requieren para la aplicación del sensor óptico, como la fuente de luz que genera la radiación por excitación, el detector que mide la intensidad de la radiación de la medición, los filtros ópticos, los amplificado- res de la señal electrónica, la unidad de evaluación y la célula de medición (por ejemplo, una cubeta a cuya pared se acopla el sensor, una célula con una entrada y posiblemente una salida y un conducto de medición a cuya pared se acopla el sensor o bien una microplaca de valoración).

Dispositivo de medición o dispositivo: la totalidad de todos los componentes del sistema de medición. Preferiblemente, la célula de medición (que contiene el sensor óptico) no es una parte integral del dispositivo pero puede ser reemplazada con el sensor.

Característica (Respuesta) o función característica: la característica describe la relación funcional entre la intensidad medida de la radiación de medición (por ejemplo, la intensidad de luminiscencia) y la concentración o actividad del analito a determinar.

En el caso de los sensores ópticos la característica

es no lineal, es decir, la relación funcional entre la intensidad de luminiscencia y la concentración del analito en todo el margen de medición dinámico no puede ser representada por una línea recta con exactitud suficiente. Dependiendo de la anchura requerida del margen de medición y del grado requerido de exactitud puede ser posible para ciertas aplicaciones representar al menos partes de la característica mediante líneas rectas.

La característica se determina midiendo la luminiscencia del sensor para una serie de medios de calibración acuosos con diferentes concentraciones conocidas de la sustancia que se va a determinar, de manera que estas concentraciones conocidas se distribuyen por el margen esperado de concentraciones del analito a determinar. A partir de estos valores de calibración medidos se deduce la característica en forma de una tabla o un diagrama, preferiblemente en forma de una ecuación matemática. En la medición actual la concentración de analito se calcula usando la intensidad de luminiscencia medida en contacto con la muestra y la función característica.

Característica efectiva: la característica válida para un sensor determinado junto con un sistema de medición dado. Relacionando la característica efectiva obtenida por un sistema de medición de una zona de la fábrica con un valor de calibración obtenido por el sistema de medición de la zona de la fábrica se obtiene la característica relativa.

Característica relativa: significa una característica

independiente del sistema de medición específico. La carac

terística relativa relacionada con un valor de calibración obtenido para un sistema de medición específico del usuario proporciona la característica efectiva válida para el sistema de medición específico del usuario. Normalmente, la característica relativa se obtiene en la zona de la fábrica (ver la definición de “característica efectiva”) y se puede relacionar con un valor de calibración húmedo o seco (ver también la definición de “relación húmedo a seco”).

Las características efectiva y relativa pueden ser transformadas una en otra siempre que: a) que para el sistema de medición para el cual la característica efectiva es válida, al menos se conozca un valor de calibración (por ejemplo, la intensidad de la radiación de medición del sensor en contacto con un medio de concentración conocida de analito); y (b) que los sistemas de medición utilizados para obtener la característica efectiva y la característica relativa se construyan de forma similar.

“Relación húmedo a seco”: En el contexto de la presente aplicación, la “relación húmedo a seco” es una relación que permite calcular en el lugar en el que se encuentra el usuario la concentración del analito no volátil usando el valor de la calibración en seco en donde se encuentra el usuario y el valor de medición de la luminiscencia, ambos medidos en el lugar donde se encuentra el usuario. La “relación húmedo a seco” normalmente procede de los valores de calibración en seco y en húmedo de la zona de la fábrica que se obtienen a partir de mediciones usando un número representativo de sensores individuales de un lote de produc

ción. Estos valores de calibración en húmedo y en seco de la zona de la fábrica conducen luego a una “relación húmedo a seco” que se toma como una relación válida para el lote completo de producción del cual proceden los sensores representativos.

La “relación húmedo a seco” puede ser por ejemplo una característica relativa, o bien una característica relativa y un valor proporcional y/o algo similar. En relación con algunos ejemplos típicos pero no limitantes (ver ejemplos 1, 1.1, 1.2, 1.3, 2, 2.1, y 2.2, infra) y configuraciones, la especificación siguiente demostrará como la determinación de la concentración de un analito no volátil puede realizarse usando la “relación húmedo a seco”.

Con respecto al ejemplo 1, en particular los ejemplos 1.1, 1.2 y 1.3 (infra), la “relación húmedo a seco” comprende una característica relativa relacionada con un valor de calibración húmedo que se obtiene en la zona de la fábrica y un valor proporcional.

Con respecto al ejemplo 2.1 (infra), la “relación húmedo a seco” comprende una característica relativa relacionada con un valor de calibración seco que se obtiene en la zona de la fábrica.

Con respecto al ejemplo 2.2 (infra), la “relación húmedo a seco” comprende una característica relativa relacionada con un valor de calibración seco basado en los valores proporcionales obtenidos en la zona de la fábrica.

Calibración: equivale a la determinación de la carac

terística. Cuando se calibra un sensor óptico se pone en

contacto con un medio de calibración en un sistema de medición, cuyos medios contienen el analito que se va a medir en diferentes concentraciones conocidas. La respuesta medible ópticamente del sensor, por ejemplo, la intensidad de luminiscencia, relacionada con la concentración conocida de analito en el medio de calibración sirve como de valor de referencia para la concentración desconocida de analito en una muestra que se va a medir.

Calibración puntual: se obtiene un valor de medición de la luminiscencia del sensor seco y se toma como valor de calibración. A partir del valor de calibración obtenido con el sistema de medición indicado y la característica relativa obtenida de un sistema de medición construido del mismo modo se puede deducir la característica efectiva válida para el sistema de medición indicado.

Medición y evaluación: durante la medición el sensor óptico se pondrá en contacto con el medio de prueba, que contiene el analito en una concentración que se tiene que determinar. La concentración del analito se obtiene de la señal del sensor medida (por ejemplo, intensidad de luminiscencia) con respecto a la característica efectiva del sensor óptico.

Calibración en la zona de la fábrica: la determinación de los parámetros de la característica (si se utiliza la ecuación 7 citada a continuación, por ejemplo, los parámetros Kd y q) en la zona de la fábrica con el uso exclusivo de un medio de calibración acuoso es bien conocida y no es

un tema de la presente invención.

Si algunas etapas de calibración se llevan a cabo ya en la zona de la fábrica usando un sistema de medición adecuado, solamente se puede necesitar una etapa de calibración (calibración puntual) en la zona del usuario, siempre que se utilice un sistema de medición de idéntico diseño. Una condición necesaria para la calibración en la zona de la fábrica es que la característica obtenida en la zona de la fábrica no cambie hasta que se utilice el sensor (o al menos no cambie de un modo imprevisible); los cambios podrían producirse por ejemplo durante el transporte o durante el almacenamiento debido a efectos de temperatura o debido al envejecimiento químico o físico o a la descomposición.

Colorantes luminiscentes del indicador: en el contexto indicado el término colorante luminiscente del indicador, colorante luminiscente o colorante óptico de luminiscencia se refiere a todas las sustancias cuya respuesta luminiscente (por ejemplo, la intensidad de luminiscencia, el tiempo de extinción de la luminiscencia) depende de la concentración o actividad del analito por interacción directa

o indirecta.

Normalmente, el colorante indicador luminiscente se inmoviliza en un sensor óptico, preferiblemente en al menos una capa de sensor.

Dependiendo del tipo de colorante o del sistema de colorantes la respuesta luminiscente causada por la concentración de analito se ve afectada por mecanismos fotofísicos y/o químico-físicos muy diferentes. Los tipos más im

portantes de colorantes son:

A) Colorantes PET

B) Colorantes ICT

C) Sistemas FRET (sistemas de transmisión de energía)

Tal como se ha definido, la “interacción directa” significa que el analito llega al colorante y reacciona con él

La “interacción indirecta” significa que el analito no entra en contacto directo con el colorante luminiscente y/o que la respuesta luminiscente del colorante no se debe a la interacción química o física del analito-colorante.

Colorante PET: un colorante indicador cuya luminiscencia es total o parcialmente extinguida por la transferencia de electrones fotoinducida (PET). La extinción de la luminiscencia reducirá la eficiencia cuántica de la luminiscencia, la intensidad de la luminiscencia y el tiempo de extinción de la luminiscencia.

La transferencia de electrones en un colorante indicador PET tiene lugar desde un electrón dador hasta un electrón aceptor excitado electrónicamente. Los electrones dador y aceptor se unen mediante un enlace covalente por medio de un intermediario. La función del intermediario es desacoplar electrónicamente los electrones dador y aceptor. El electrón aceptor es una sustancia luminiscente. El electrón dador es un receptor que es capaz de unirse al analito, preferiblemente de un modo reversible. Si las sustancias unidas son sustancias iónicas el componente reactivo se llama también ionóforo. En una reacción de equilibrio termodinámico el analito reacciona reversiblemente con el

colorante indicador uniéndose al receptor.

Partiendo de las propiedades de luminiscencia (por ejemplo, la intensidad de luminiscencia, el tiempo de extinción de luminiscencia) se puede calcular la concentración del analito, por ejemplo, evaluando la intensidad visible o bien medible con fotodetectores, de la luz emitida en la gama ultravioleta (UV), visible (VIS) o casi infrarroja (NIR).

Los colorantes PET tienen al menos una especie A que no está unida al analito S, y al menos una especie B a la que está unida el analito S. Las dos especies y el analito están en un equilibrio termodinámico pasado un cierto tiempo. En la especie B el efecto PET es bloqueado total o parcialmente por la unión del analito, lo que hace que la intensidad de luminiscencia de B tenga un máximo. En la especie A, el efecto PET no es bloqueado, dando lugar a una intensidad de luminiscencia mínima.

Puesto que el componente del colorante PET no se ve esencialmente afectado por el enlace del analito, el experto reconocerá un colorante indicador PET por el hecho de que en un entorno químico determinado los espectros de absorción y emisión del colorante de ambas especies son esencialmente iguales en lo que se refiere a la posición espectral. Puesto que el espectro total es el resultado de una adición de los espectros de las dos especies el enlace del analito modificará la intensidad de luminiscencia del espectro de excitación y emisión.

Se pueden hallar ejemplos en AP de Silva y cols.,

Coordination Chemistry Reviews 205, 2000, 41-57 (Review of PET dyes), en He et al.,ANal. Chem. 75, 2003, 549-555, Figura 2 (Colorante PET para Na+) y en J.Am.Chem.Soc.125, 2003, 1468-1469, Fig. 3 colorante PET para K+)

Colorante ICT: en contraste a los colorantes PET no existe un desacoplamiento electrónico de las dos partes (componente colorante y componente receptor) en un colorante ICT (ICT=transferencia de carga intramolecular). Puesto que el enlace del analito cambia sustancialmente el sistema cromóforo del componente colorante, el experto reconocerá los colorantes ICT por el hecho de que en un entorno químico determinado los espectros de absorción y emisión del componente colorante de las dos especies son diferentes en lo que se refiere a la posición espectral. Puesto que el espectro total es el resultado de la adición de los espectros de las dos especies, la unión del analito modificará la proporción relativa de los dos componentes en el espectro total.

Se pueden hallar ejemplos en Molecular Probes, handbook of Fluorescent Probes and Research products, 2002, 9th ed.,Ch 21, Fig. 21.19(SNARF-4F) y Fig. 21.24(HPTS).

Colorante FRET: Los sistemas colorantes FRET (FRET = transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) consisten esencialmente en dos colorantes, un colorante dador luminiscente, y un colorante aceptor. La luminiscencia del colorante dador es extinguida por el colorante aceptor por la transferencia de energía sin radiación. La extinción de la luminiscencia cambia la intensidad de la luminiscen

cia y el tiempo de extinción de la luminiscencia. El colorante aceptor reacciona directa o indirectamente con el analito, modificando así sus valores de absorción (espectro de absorción) y la velocidad de la transferencia de energía. A partir de la intensidad de luminiscencia del colorante dador se pueden realizar inferencias respecto al analito. Una condición entre otras para que el FRET tenga lugar es que el espectro de absorción de al menos una especie del colorante aceptor coincida al menos parcialmente con el espectro de emisión del colorante dador. Una ventaja de los sistemas FRET reside en el hecho de que el experto tiene una opción de muchos colorantes no luminiscentes conocidos (especialmente los colorantes de absorción sensibles al pH) y que el analito puede ser determinado a través de la medición de la luminiscencia más sensible. Pueden hallarse ejemplos en la patente americana 5.232.858 A (Wolfbeis y cols.), en la patente americana 5.942.189 A(Wolfbeis y col- s.) y en Anal. Chim. Acta,1998,364,143-151 (Huber y cols.). Objeto de la invención

En base a los métodos anteriores para la determinación de la concentración de un analito no volátil o bien del valor del pH en un medio de muestreo acuoso, el objetivo de la presente invención consiste en proponer mejorías y simplificaciones que permitan la determinación de la concentración de un analito no volátil (incluyendo el valor del pH) en el lugar en el que se encuentra el usuario sin el uso de medios de calibración. Normalmente, el método de medición se basa exclusivamente en medir la intensidad de lu

miniscencia usando solamente una longitud de onda o banda de excitación y de emisión.

El método de la invención comprende: medir la luminiscencia del sensor seco en el lugar donde se encuentra el usuario, sin el uso de medio de calibración, obteniendo un valor de calibración seco del lugar del usuario y deduciendo la concentración del analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación húmedo a seco procedente de un valor de calibración húmedo del lugar de la fábrica y un valor de calibración seco del lugar de la fábrica, y el valor de calibración seco del lugar donde se encuentra el usuario.

Así por primera vez se realizará un método de medición más un procedimiento de calibración basado en medir la intensidad de luminiscencia, que no requerirá un medio de calibración en el lugar ocupado por el usuario incluso si solamente se utiliza una longitud de onda de excitación y de emisión. La invención utiliza el hecho sorprendente de que los sensores ópticos para la determinación de muchas sustancias no volátiles (no gaseosas) pueden ser manipulados para utilizar un colorante luminiscente que exhiba luminiscencia en el estado seco si se excita de forma adecuada.

El objeto de la invención es un método tal como se ha definido en la reivindicación 1. Las configuraciones preferidas son objetos de las reivindicaciones dependientes.

El objeto de la invención es un método para la determinación de la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso con el uso de un sen

sor óptico que contiene un colorante luminiscente y que se calibra en el lugar ocupado por el usuario por medio de una calibración puntual, que consiste en

- medir en el lugar donde se encuentra el usuario la luminiscencia del sensor seco obteniendo así un valor de calibración seco del lugar ocupado por el usuario,

- obtener en el lugar ocupado por el usuario un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de muestreo acuoso, y

- deducir la concentración del analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación húmedo a seco obtenida en el lugar de la fábrica, y el valor de calibración del lugar ocupado por el usuario.

En particular, el método de la invención consiste a) en el lugar de la fábrica

i. elegir un número representativo de sensores secos So a partir de una pluralidad de sensores secos Sn fabricados del mismo modo;

ii. medir la luminiscencia de cada uno de los sensores secos elegidos So, obteniendo los valores de calibración en seco del lugar de la fábrica;

iii. posteriormente medir la luminiscencia de cada uno de los sensores So en contacto con al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones diferentes del analito no volátil, dando lugar a valores de calibración en

húmedo en fábrica;

iv. obtener una relación húmedo a seco de los sensores So a partir de los valores de calibración húmedos en la fábrica y los valores de calibración en seco en la fábrica, de forma que la relación húmedo a seco se toma como la relación húmedo a seco para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo.

b) en el lugar donde se encuentra el usuario

i) medir la luminiscencia de un sensor seco S1 a partir de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo, dando lugar a un valor de calibración en seco en el lugar del usuario;

ii) obtener un valor de medición del sensor S1 en contacto con el medio de muestreo acuoso; y

iii) calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso a partir del valor de medición de la luminiscencia, el valor de calibración en seco en el lugar del usuario y la relación húmedo a seco obtenida en el lugar de la fábrica.

En una primera variante del método de la invención, el objetivo de la invención se lleva a cabo siempre que

i. se elija un número representativo de sensores So fabricados del mismo modo (es decir, a partir de un lote de producción o incluso si el proceso de producción es altamente reproduci

ble – para todos los sensores de una clase)

ii. se mida la luminiscencia de cada uno de los sensores secos elegidos So, obteniendo los valores de calibración en seco del lugar de la fábrica;

iii. posteriormente se mida la luminiscencia de cada uno de los sensores So usando al menos dos medios de calibración acuosos, concentraciones diferentes del analito no volátil, cuyos medios de calibración contacten posteriormente con los sensores, dando lugar a valores de calibración en húmedo en fábrica;

iv.

a partir de los valores de calibración en húmedo en el lugar de la fábrica se obtenga una característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo (es decir, perteneciendo al mismo lote de producción);

v.

a partir de los valores de calibración en húmedo en la fábrica y de los valores de calibración en seco en la fábrica se deduce un valor proporcional que se tomará como el valor proporcional correspondiente para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y que

b) en el lugar ocupado por el usuario

i) la luminiscencia se mida para un sensor seco S1 a partir de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo, dando lugar a un valor de calibración en

seco en el lugar del usuario;

ii) se obtenga un valor de medición de la luminiscencia

con el sensor S1 en contacto con el medio de muestreo

acuoso; y

iii) la concentración del analito no volátil presente en

el medio de muestreo acuoso o el valor del pH se calcule

a partir del valor de medición de la luminiscencia, el

valor de calibración en seco en el lugar del usuario,

la característica relativa y el valor proporcional obte

nido en el lugar de la fábrica.

La primera variante de la invención difiere en algunos puntos de los procedimientos conocidos descritos inicialmente. Por consiguiente durante la calibración en la fábrica se obtiene un valor proporcional del valor de calibración en seco en el lugar de la fábrica y del valor de calibración en húmedo del lugar de la fábrica además de la característica relativa. En el lugar ocupado por el usuario solamente se requiere una medición del sensor en un estado en seco previamente a la medición real de la muestra para obtener un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario, lo que permite que la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso sea determinada a partir del valor de luminiscencia medido de la muestra junto con la característica relativa y el valor proporcional, ambos determinados para el lote completo de producción de sensores en la fábrica.

Otra variante de la invención en la cual una caracte

rística se deriva de los valores de calibración en húmedo

en la fábrica, que hacen referencia al valor de calibración en seco, y por tanto se obtiene una característica relativa relacionada con el valor de calibración en seco, difiere de la variante antes mencionada, de la etapa a)iv. en adelante, siempre que en la fábrica

- se obtenga una característica relativa para los sensores So a partir de los valores de calibración en húmedo de la fábrica y de los valores de calibración en seco de la fábrica, cuya característica relativa resulta ser válida para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y

en el lugar en que se encuentra el usuario

- la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso se calcule a partir del valor de medición de la luminiscencia, el valor de calibración en seco del usuario y la característica relativa. Esta variante de la invención difiere también en una

serie de puntos de los procedimientos conocidos inicialmente descritos. Por consiguiente, durante la calibración en la fábrica se obtiene un valor de calibración seco en la fábrica, que se introduce en el cálculo de la característica relativa. En el lugar ocupado por el usuario solamente se requiere una medición en seco del sensor previamente a la medición real de la muestra con el fin de obtener un valor de calibración seco en el lugar del usuario, de manera que la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso se pueda determinar a partir del valor de medición medido junto con la característica rela

tiva obtenida en el lugar de la fábrica y el valor de calibración en seco en el lugar del usuario.

Otra variante de la invención en la cual se calculan los valores proporcionales a partir de los valores de calibración en seco y en húmedo de la fábrica y una característica relativa se deduce luego de estos valores proporcionales, difiere de las anteriores variantes, de la etapa a) iv en adelante, siempre que en el lugar de la fábrica

- los valores proporcionales se calculen a partir de los valores de calibración en húmedo de la fábrica y a partir de los valores de calibración en seco de la fábrica; y

- a partir de los valores proporcionales se obtenga una característica relativa de los sensores So, que resultará ser válida para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y

en el lugar ocupado por el usuario

- se calcule un valor proporcional en el lugar del usuario a partir del valor de calibración en seco en el lugar del usuario y el valor de medición de la luminiscencia; y

- la concentración del analito no volátil presente en la muestra acuosa se calcule a partir del valor proporcional en el lugar del usuario y la característica relativa. Esta variante de la invención difiere también de los

procedimientos conocidos descritos inicialmente en una se

rie de puntos. Por consiguiente durante la calibración en la fábrica se obtienen unos valores de calibración en seco en la fábrica con los cuales están relacionados los valores de calibración en húmedo de la fábrica por el cálculo de los valores proporcionales. La característica relativa se obtiene a partir de estos valores proporcionales en la fábrica. En el lugar ocupado por el usuario se realiza una medición de la luminiscencia con el sensor seco, lo que da lugar a un valor de calibración seco del lugar del usuario con el cual se relaciona el valor de medición de la luminiscencia obtenido del sensor en contacto con la muestra mediante el cálculo de un valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario. A partir del valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario y de la característica relativa se determina la concentración del analito no volátil presente en la muestra acuosa.

Conforme a la invención se puede utilizar un sensor óptico para la determinación del analito no volátil en combinación o en una configuración de sensores conjunta para la determinación de la concentración de los analitos volátiles, como el O2 o el CO2. Los sensores de gas y los sensores para analitos no volátiles se pueden combinar, por ejemplo, en un elemento de medición de un solo uso, por ejemplo en la forma de un arco o matriz de sensores. Los sensores de gas se consideran “libres de calibración” si la medición se realiza por medio del tiempo de extinción de la luminiscencia. Con ayuda de un gas calibrador es posible

tener una calibración puntual.

Para facilitar la comprensión de la invención, se ha descrito a continuación, con más detalle la calibración en húmedo para el caso de un sensor óptico con un colorante PET. Las ecuaciones siguientes se aplicarán inmediatamente a los colorantes del pH de PET. Para indicadores basados en el efecto PET, para Na+, K+, Ca++ , ver por ejemplo US

5.981.746 A, US 6.211.359 B1 y US 6.171.866 B1.

Las ecuaciones mostradas son aplicables también a los indicadores del pH ICT con algunas restricciones, específicamente a los colorantes donde mediante la elección adecuada de filtros especiales solamente se puede excitar una especie o bien donde solamente se puede medir la luminiscencia de una especie. El signo de las respuestas cambiará conforme a si la luminiscencia medida aumenta o disminuye cuando el analito está unido. En principio, las ecuaciones indicadas son también aplicables a los indicadores del pH ICT donde mediante la elección adecuada de filtros especiales ninguna de las dos especies puede ser específicamente excitada ni se puede medir la luminiscencia, por ejemplo, cuando los espectros se solapan. La complejidad de las expresiones matemáticas aumenta en este caso.

Dependiendo de la constante de equilibrio termodinámica Kd del colorante indicador y de la concentración del analito S el colorante indicador tendrá una especie A a la cual no está unida el analito S, y una especie B a la cual está unida el analito S.

La unión reversible se rige por la ley de acción de

masas:

(1) B Kd A + S

La constante de disociación Kd que depende de la temperatura y del entorno físico-químico del colorante indicador corresponde en una primera aproximación a la ecuación 2.

(2) Kd = cA . cS / cB donde c equivale a la concentración y el índice d es la constante de disociación. Kd se indica en mol/l.

El cociente de las concentraciones cA y cB se determina por medio de la constante de disociación Kd y la concentración del analito S.

(3) cB/CA = cS /Kd

El valor del pKd (ec. 4) es el logaritmo negativo en base 10 de la constante de disociación:

(4) pKd = -log(Kd)

La concentración cD(concentración total) del indicador PET es la suma de las concentraciones de cada una de las especies A y B.

(5) cD = cA + cB

La proporción de la concentración del indicador de especie B respecto a la concentración total del indicador es

(6) V = cB/cD

Si la especie A está ausente la proporción es 1.Si las concentraciones de las dos especies son iguales la proporción es 0,5. Si la especie B está ausente y solamente la especie A está presente la proporción es 0.

Para longitudes de onda de excitación y emisión la in

tensidad de la luminiscencia L del indicador PET es la suma de las intensidades LA y LB de la luz emitida de cada especie A y B

(7) L = LA + LB LA y LB son proporcionales a las concentraciones cA y cB de cada especie individual A y B, donde LA= kA.cA y LB=kB.cB. Las constantes de proporcionalidad kA y kB son válidas para un sistema de medición, que consiste en la combinación de un sensor, procedente de un grupo de sensores fabricados del mismo modo, con un dispositivo de medición adecuado.

Para las longitudes de onda de excitación y emisión, las constantes de proporcionalidad kA y kB comprenden: α) parámetros del sensor, como la concentración total CD del colorante, las longitudes efectivas del recorrido de luz dentro de los sensores, el área irradiada, los valores de absorción y la eficiencia cuántica de luminiscencia de las especies A y B; ß) parámetros del sistema de medición individual, como la intensidad de la fuente de luz, la sensibilidad de los valores de transmisión y del detector de los componentes ópticos.

Los indicadores PET que son especialmente adecuados se caracterizan por el hecho de que kB es preferiblemente mayor en al menos un factor 10, incluso más preferiblemente en un factor 11, que kA, es decir, que la intensidad de luminiscencia de la especie A – a la que no está unido el analito – es inferior en este factor a la intensidad de luminiscencia de la especie B – a la que está unido el anali

to. A continuación se considera que kB>kA. Dependiendo del mecanismo PET se podían hallar indicadores con kA >kB. Como en el caso de los indicadores ICT, el experto tenía que adaptar las ecuaciones siguientes de acuerdo con ello.

Combinando las ecuaciones 2, 5 y 6 finalmente se llega a una ecuación que describe la forma efectiva de la característica del sensor

(8) L = Lm [1+ (q-1)/(1+cS/Kd) donde q= kA/kB y Lm (m indica intensidad máxima) es la intensidad de luminiscencia medida, cuando solamente la especie B está presente. Lm se puede utilizar también como factor de gradación según una escala.

Para unas longitudes de onda de excitación y emisión dadas y para un sistema de medición dado la ecuación 8 describe la intensidad de luminiscencia (efectiva) medida L como una función de la concentración del analito.

Las siguientes consideraciones se aplican al parámetro

q:

El parámetro q representa el cociente kA/kB y por tanto la intensidad de la especie pura A frente a la intensidad de la especie pura B, qx100 es la intensidad de la especie pura A como un porcentaje de la intensidad de la especie pura B.

Las consideraciones siguientes se aplican al factor de gradación según una escala Lm:

Para un sistema de medición determinado LmA es la intensidad medible mínima de un sensor. Un sensor puede ajustarse por ejemplo a la intensidad mínima al ponerlo en con

tacto con un medio de medición cuya concentración de analito S sea muy pequeña en comparación con Kd (cS<<Kd), lo que significa que el equilibrio (ver ecuación 1) está totalmente desviado hacia el lado izquierdo. Normalmente será suficiente con que cS sea menor que Kd en un factor 103 a 104.

Para un sistema de medición determinado LmB es la intensidad máxima de un sensor (que se puede conseguir con el analito en cuestión). Un sensor puede ajustarse, por ejemplo, a la intensidad máxima al ponerlo en contacto con un medio de medición cuya concentración de analito S sea muy alta en comparación con Kd (cS>>Kd), lo que significa que el equilibrio (ver ecuación 1) está totalmente desviado hacia el lado derecho. Normalmente será suficiente con que cS sea mayor que Kd en al menos un factor 103 a 104.

En la ecuación 8 Lm se toma como LmB, es decir la intensidad máxima del sensor.

En el caso de colorantes PET especialmente eficientes q puede tender a cero. Dichos colorantes son particularmente adecuados puesto que su especie A no es luminiscente y su luminiscencia seca no necesita ser tenida en cuenta. En el caso de colorantes ICT, donde solamente una especie, por ejemplo, la B, se mide usando filtros espectrales adecuados 8ver descripción antes), q es cero (puesto que la luminiscencia de A no se mide, sea o no luminiscente). Puesto que q es igual a cero, la ecuación 8 equivale a L = Lm(11/(1+cS/Kd)). Si se mide la especie B, la ecuación 8 equivale a L= Lm(1-1/(1+Kd /cS)). Las otras ecuaciones deben mo

dificarse de acuerdo con ello.

Si la ecuación 8 se divide por una constante (>0), por ejemplo por Lm, se obtiene una característica relativa Lrel, relacionada con el valor de la constante.

(9) Lrel = 1 . [1+ (q-1)/(1+cS/Kd)]

Lrel en la ecuación 9 puede asumir valores entre q y 1.

Los parámetros Kd y q determinan la forma de la característica que depende del factor de gradación según una escala Lm. Estos parámetros son independientes de las cantidades citadas antes en los párrafos α) y ß), y se pueden determinar por la calibración en fábrica. El parámetro Lm tiene en cuenta las cantidades citadas antes en los párrafos α) y ß).

Multiplicando la característica relativa Lrel (que se puede determinar por la calibración en la fábrica con un sistema de medición in situ en la fábrica) por el parámetro Lm (que se puede determinar con un sistema de medición en el lugar en que se encuentra el usuario) se obtiene la característica válida para el sistema de medición en el lugar en que se encuentra el usuario (característica efectiva).

Si el factor de gradación según una escala Lm hace referencia a un sensor en el estado húmedo (sensor húmedo), se le marcará con el índice W (LmW). Si hace referencia a un sensor en el estado seco (sensor seco) se marcará con el índice D (LmD).

El factor de gradación según una escala LmW es idéntico a la intensidad de luminiscencia máxima que se puede medir con un sensor húmedo determinado en un sistema de medición determinado. LmW se puede medir directamente en una

calibración en húmedo con un medio de calibración siempre que la concentración de analito se elija de tal forma que solamente la especie B esté presente.

En el caso de sensores del pH la ecuación 8 se puede medir también en la forma de la ecuación 10 con pH =log(aH+) y pK= -log(Kd).

(10) L = LmW [1+ (q-1)/(1-10pH-pK)]

A continuación se utiliza el exponente * para todas las cantidades que se refieren a la fábrica in situ (calibración en la fábrica).

Los parámetros q y Kd se determinan, por ejemplo, según las etapas siguientes:

a) Selección de al menos un sensor entre una pluralidad de sensores fabricados del mismo modo;

b) Medición in situ en fábrica con el sensor elegido de las intensidades de luminiscencia LiW* con un número n (donde n es al menos 3, preferiblemente 5 o superior, si se aplica la ecuación 8 ó 10) de medios de calibración acuosos con concentraciones conocidas cSi* de analito, que se distribuyen al menos por toda la gama de variables de medición, dando lugar a n pares de datos (cSi*, LiW; i=1,….n);

c) Ajuste de una ecuación matemática adecuada que describe la característica del sensor (ecuaciones 8 ó 10) a los n pares de datos, por ejemplo, mediante métodos conocidos de mínimos cuadrados, lo que da lugar a valores para los parámetros q, Kd y LmW*.

El parámetro LmW* hallado en fábrica depende del dis

positivo de medición utilizado en la fábrica y es irrelevante para la medición en el lugar donde se encuentra el usuario.

Es realmente una ventaja que los parámetros q y Kd no se determinen con un único sensor sino con un número representativo de sensores. Haciendo la media de los valores q y Kd de cada uno de los sensores, se obtendrán los valores medios de estos parámetros, que se pueden asignar a la pluralidad de sensores fabricados de la misma manera.

Por consiguiente es posible determinar mediante una calibración en la fábrica la característica relativa (en forma de los parámetros q y Kd o pK) y suministrarlos junto con el sensor al usuario, por ejemplo, en forma de códigos de barras. Si luego se inserta un sensor de un grupo de sensores fabricados de la misma manera en un dispositivo de medición que se encuentra en el lugar del usuario, LmW se desconoce al principio. Se podría medir directamente en una calibración puntual acuosa. Se conocerían entonces todos los parámetros que describen la característica efectiva.

Si el medio de calibración es sustituido por la muestra en la medición actual y se mide la intensidad de luminiscencia L en contacto con la muestra, la concentración de analito se podrá deducir de las ecuaciones 8 ó 10 averiguando cS o el pH.

Si se resuelve la ecuación 8 para cS (ajuste=LmW) se obtiene:

(11) cS =Kd ((q-1)/L/LmW-1)-1)

Puesto que la concentración de analito necesaria en el me

dio de calibración para la determinación directa de LmW se encuentra dentro de la gama de medición de interés, a menudo se desea determinar LmW directamente.

Es realmente preferible realizar la calibración puntual para una concentración de analito que se encuentra en el margen esperado de la concentración de analitos de muestra. Preferiblemente la concentración de analito se elige de manera que el cociente cB/cD (ecuación 6) tiene un valor entre 0,1 y 0,9, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 0,7.

Con el valor de la intensidad Lcal medido en el lugar donde se encuentra el usuario durante la calibración puntual con el sensor húmedo en contacto con un medio de calibración de concentración de analito conocida cScal, y los valores q y Kd conocidos a partir de la calibración en fábrica se calcula LmW a partir de la ecuación 12:

(12) LmW = Lcal /[1+ (q-1)/(1+cScal/Kd)] Los inconvenientes del procedimiento anteriormente descrito para la calibración convencional de los sensores ópticos con un colorante indicador provienen del hecho de que, a pesar de que la mayoría de etapas de calibración se han llevado a cabo en la fábrica, al menos una calibración puntual (con un medio de calibración acuoso) debe realizarse en el lugar ocupado por el usuario antes de la propia medición. Esto requiere la adquisición y gestión de un medio de calibración acuoso (manipulación, almacenamiento, distribución, reordenación, comprobación de las fechas de caduci

dad, etc). Este inconveniente es superado por el método de la presente invención en el cual en el lugar ocupado por el usuario solamente se llevan a cabo etapas de calibración pero no etapas de calibración en húmedo. Descripción de los dibujos

A continuación la invención se describirá con más detalle con la ayuda de diagramas y dibujos esquemáticos.

Figuras 1a a 1c muestran las intensidades de luminiscencia para LmW = 1 de cada especie individual de un sensor del pH como funciones del valor del pH (en el intervalo de 4,5 a 9,5) para diferentes sub-variantes del procedimiento conforme a la invención.

La figura 2 muestra las intensidades de luminiscencia para LmW = 1 de cada especie individual de un sensor iónico como funciones de la concentración iónica en mol/l con la abscisa graduada logarítmicamente.

La figura 3 muestra las curvas de respuesta (intensidad de luminiscencia relativa graduada Lrel como una función del tiempo t en seg.) de seis sensores de pH individuales

La figura 4 muestra los valores de luminiscencia de acuerdo con la figura 3 como funciones del valor del pH.

La figura 5 muestra un diagrama como en la figura 4 con la diferencia de que la característica relativa (curva sólida) está representada por la relación lineal Lrel=u1+u2pH

La figura 6 muestra las intensidades de luminiscencia Lrel de dos grupos de sensores con diferente pretratamiento

(línea sólida y símbolos) como funciones del tiempo t.

Las figuras 71 y 7b muestran la via sintética del co

lorante luminiscente A41.

Ejemplo 1

(con sub-variantes 1.1(fig.1a), 1.2(Fig.1b) y 1.3(Fig. 1c) usando las ecuaciones 1 a 10)

En las figuras 1a a 1c, que ilustran las sub-variantes 1.1, 1.2 y 1.3 descritas a continuación, las intensidades de luminiscencia que se representan respecto a LmW=1 de la especie individual de un sensor del pH (es decir, siendo H+ el analito no volátil) se muestran como funciones del valor del pH. La curva A representa la característica relativa y es la suma de las intensidades de luminiscencia LAW y LBW de cada especie A y B. Se ha obtenido a partir de la ecuación 10, con el valor 7.4 utilizado para el parámetro pK y el valor 0,2 utilizado para el parámetro q, y la ecuación 10 dividida por LmW. El cociente entre la intensidad mínima (lado derecha) y la intensidad máxima (lado izquierdo) es el valor del parámetro q. La curva B es la intensidad de luminiscencia relativa de la especie B como una función del valor del pH. La curva C es la intensidad de luminiscencia relativa de la especie a como una función del valor del pH. A partir de las curvas B y C se puede observar que para pH<4,5 solamente está presente una especie B, mientras que para el pH>9,5 solamente está presente una especie A. La curva D es la suma de las intensidades de luminiscencia LAD y LBD de cada una de las especies A y B en el sensor seco como funciones del valor del pH durante la fabricación de los sensores. Para la ilustración se ha asumido que la in

tensidad de luminiscencia de la especie B en el estado seco es mayor en un factor de 1,25 que en el estado húmedo. Dependiendo del colorante y de la matriz podía ser igual o menor. Hacia pH superiores la intensidad de la luminiscencia en seco disminuye con un descenso en la concentración de la especie luminiscente más intensa B mientras que la concentración de la especie A menos luminiscente aumenta. De la curva E se puede deducir que dentro de un margen de pH limitado (aprox. pH 7,0 a 7,8) se puede representar la característica relativa como una línea recta de fórmula general LW= a+b.pH. Fuera de este margen la característica no se puede calcular con suficiente exactitud mediante la función lineal. Los valores de medición donde aparece un * en las cifras individuales son valores in situ de la fábrica y los valores sin * pertenecen al lugar donde se encuentra el usuario.

La figura 2 ilustra las intensidades de luminiscencia calculadas respecto a LmW=1 de cada especie individual de un sensor iónico como funciones de la concentración iónica. La abscisa se representa logarítmicamente. Las curvas A a D son análogas a las de las figuras 1a a 1c. La curva A se obtenía a partir de la ecuación 8 con el valor 0,0176 para el parámetro Kd y el valor 0,18 para el parámetro q y la ecuación 8 dividida por LmW. Los valores se han elegido a partir de la tabla 1 de la patente americana 6.211.359. La ecuación 8 corresponde esencialmente a la ecuación 6 de la patente americana 6.211.359 con la diferencia de que la ecuación 8 no tiene en cuenta los iones que interfieren pa

ra mantener una presentación simple. La ecuación 8 corresponde también a la ecuación 4 de la patente americana

6.171.866 con la diferencia de que allí la presentación es logarítmica. A partir de la curva E puede verse que dentro de un margen limitado de concentraciones (cS=0,006-0,05 mol/l aprox.) la característica relativa puede ser representada por una línea recta de fórmula general LW=a+blog(cS). Fuera de este margen la característica no se puede aproximar con suficiente exactitud a una función lineal.

Debido a la definición de Lm (m indica intensidad máxima, es decir, la intensidad cuando solamente una especie B está presente) se ha descrito un caso especial en el ejemplo 1.1 que se indica a continuación. Los ejemplos 1.2 y 1.3 corresponden al caso general. Ejemplo 1.1 (fig.1a)

Sorprendentemente se ha averiguado que para los sensores fabricados del mismo modo y medidos con dispositivos del mismo tipo, el porcentaje

(13) RmD/W = LmD/LmW = LmD */LmW * es constante y puede ser determinado mediante una calibración in situ en la fábrica. Por tanto el factor de gradación según una escala LmW se puede determinar a partir de LmD/RmD/W. Por lo tanto, en el lugar ocupado por el usuario solamente se necesitará una calibración en seco puntual para la determinación del facto LmW y no se requerirá ningún medio de calibración. Esto significa que se obtiene una verdadera calibración en seco de un sensor óptico de luminiscencia en el lugar del usuario, de manera que los medios

de calibración líquidos para una calibración puntual se pueden dispensar todos juntos.

LMD*, respectivamente LmD, son los valores de intensidad máxima medidos con sensores secos in situ en la fábrica, respectivamente en el lugar ocupado por el usuario. Estos valores se pueden determinar si el colorante indicador del sensor se ajusta de manera que en el estado seco toda la masa del indicador está presente en forma de especie B, es decir, el colorante luminiscente está presente por completo como especie B con el porcentaje V=cB/cD (ecuación 6) igual a 1, puesto que cD=cA+cB (ecuación 5).

LmW *, respectivamente LmW, son los valores de intensidad máxima medidos in situ en la fábrica, respectivamente en el lugar ocupado por el usuario, con sensores húmedos. El valor LmW* se puede medir in situ en la fábrica con el sensor en contacto con un medio de calibración líquido y con la concentración de analito del medio de calibración ajustada de manera que después de la humectación y una vez alcanzado el equilibrio (ecuación 1 resp.2) esencialmente solo está presente la especie B, el porcentaje V=cB/cD (ec. 6) siendo el sensor en húmedo igual a 1. LmW se puede calcular a partir de la ecuación 13.

Una variante del método de la invención para un sensor óptico con un colorante indicador que puede estar presente como una especie A – libre de analito S – o como una especie B – a la cual se enlaza el analito S - , y cuya característica viene dada por la ecuación 8 o la ecuación 10, se caracteriza por el hecho de que durante la calibración en

la fábrica cuando el colorante indicador está totalmente presente en forma de especie B, se calcula un valor proporcional RmD/W (a partir de un valor de la intensidad LmD * sin medio de calibración acuoso, y un valor de intensidad LmW * con un medio de calibración acuoso), de manera que la ecuación 8 se transforma con LmW=LmD/RmD/W en

(14) L = (LmD/RmD/W )[1+ (q-1)/(1+cS/KD) y esa LmD se puede determinar en una calibración en seco, puntual, en el lugar del usuario, posteriormente, por ejemplo sin utilizar el medio de calibración acuoso.

Si los sensores son fabricados de tal manera que en el estado sólido solamente la especie B está presente, la intensidad medida en el estado seco será LmD. Tras la humectación y el equilibrio in situ en la fábrica con un medio de calibración líquido cuya concentración de analito se elige de manera que solamente una especie B está presente, RmD/W se podrá determinar directamente a partir de la ecuación 13.

La primera sub-variante conforme a la invención (Fig.1a) se caracteriza por que: en la etapa a)i.

los sensores So son seleccionados de manera que el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo del mismo está unido a la especie B y no a la especie A, en la etapa a)ii.

se obtienen los valores de calibración en seco LmD* in

situ en la fábrica,

en la etapa a)iii. durante al menos uno de los medios acuosos de calibración se elige la concentración del analito S de manera que después de la humectación y el equilibrio básicamente solo la especie B está presente y se miden los valores de calibración en húmedo in situ en la fábrica LmW*. en la etapa a)iv a partir de los valores de calibración en seco in situ en la fábrica LmD* y de los valores de calibración en húmedo in situ en la fábrica LmW* se calcula un valor proporcional RmD/W,

en la etapa b)i. se obtiene un valor de calibración en seco en el lugar del usuario LmD, y en la etapa b)iii. se calcula un factor de gradación según una escala LmW en el lugar ocupado por el usuario a partir de LmD y el valor proporcional RmD/W, y la concentración del analito no volátil se determina a partir del valor de luminiscencia medido, el factor LmW de gradación en el lugar donde se encuentra el usuario y la característica relativa.

Ejemplo 1.2(Fig.1b)

En el ejemplo 1.1, el cociente V de la concentración de la especie B – a la cual está enlazado el analito S – respecto a la concentración D total del indicador es 1. En otras palabras: en el estado en seco el colorante está presente por completo en forma de especie B.

Típicamente los sensores ópticos se fabrican de tal

manera que en el estado seco el cociente V=cB/cD tiene un valor entre 0,1 y 0,9 y preferiblemente se sitúa entre 0,3 y 0,7. Para cada valor del cociente V existe un valor RD/W que se puede utilizar para deducir la intensidad de luminiscencia en húmedo máxima LmW a partir de la intensidad LD medida en el estado seco. Si, tal como se muestra en el ejemplo 1.1, la cA tiende a cero, esencialmente solo la especie B está presente y la igualdad RD/W=RmD/W se mantiene.

En la modificación de la ecuación 13, se obtiene la ecuación 15 y de ella

(15) RD/W = LD/LmW = LD*/LmW * un cociente RD/W según el cual la característica relativa se puede relacionar con el valor de calibración en seco en el lugar donde se encuentra el usuario.

La segunda sub-variante conforme a la invención (ver fig. 1b) se caracteriza por que: en la etapa a)i. los sensores So son seleccionados de manera que el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo del mismo está unido a la especie B y no a la especie A, el cociente V=cB/cD con cD=cA+cB, es conocido y se encuentra entre 0,1 y 0,9, preferiblemente entre 0,3 y 0,7, en la etapa a)ii.

se obtienen los valores de calibración en seco LD* in situ en la fábrica, en la etapa a)iii.

durante al menos uno de los medios acuosos de calibración se elige la concentración del analito S de manera que después de la humectación y el equilibrio básicamente solo la especie B está presente y se miden los valores de calibración en húmedo in situ en la fábrica LmW*. en la etapa a)iv a partir de los valores de calibración en seco in situ en la fábrica LD* y de los valores de calibración en húmedo in situ en la fábrica LmW* se calcula un valor proporcional RD/W,

en la etapa b)i. se obtiene un valor de calibración en seco en el lugar del usuario LD, y en la etapa b)iii. se calcula un factor de gradación según una escala LmW en el lugar ocupado por el usuario a partir de LD y el valor proporcional RD/W, y la concentración del analito no volátil se determina a partir del valor de luminiscencia medido, el factor LmW de gradación en el lugar donde se encuentra el usuario y la característica relativa.

Ejemplo 1.3(Fig.1c)

En los ejemplos 1.1 y 1.2 descritos antes, la concentración del analito S para medir el valor de calibración en fábrica en húmedo LmW* se debe elegir de manera que solamente esté presente la especie B del indicador.

En la práctica frecuentemente no es deseable y en el caso de algunos sensores o analitos resulta un gran inconveniente o es totalmente imposible, fijar la concentración

de analito en un medio de calibración de manera que después de la humectación y el equilibrio (ecuaciones 1 ó 2) básicamente solamente la especie B esté presente, lo que permitirá la medición directa de LmW * (ver antes en a.iii). La razón de ello es que – para modificar el equilibrio por completo hacia la izquierda en la ecuación 1 – en algunos casos habría que conseguir concentraciones de analito muy altas (>1 mol/l).

Un sensor de Na+ para medir las concentraciones fisiológicas de Na+ tiene idealmente un valor de Kd de aproximadamente 0,150 mol/l, por ejemplo. Para cambiar el equilibrio (en las ecuaciones 1 y 2) hacia la izquierda de la ecuación, de manera que solo la especie B esté presente, la concentración de analito tendría que ser superior al valor Kd en un factor de 100, idealmente en un factor de 1000. Una concentración de analito resultante en el medio de calibración de 15 mol/l o superior no es práctica ni tampoco posible, debido a las limitaciones en solubilidad.

Otro ejemplo puede ser si tomamos un sensor de pH (con H+ como el analito no volátil) para la determinación de valores de pH fisiológico, que idealmente tiene un Kd de aproximadamente 3,4*10-8 (lo que corresponde a un valor de pK de 7,4). Para modificar el equilibrio (en las ecuaciones 1 y 2) hacia la izquierda de la ecuación, de manera que solo la especie B esté presente, la concentración de analito tendría que ser superior al valor Kd en un factor de 100, idealmente en un factor de 1000. Ajustando la concentración de analito (cH+) en el medio de calibración en 3,4*10-8 o

superior, lo que corresponde a un pH de 4,4 o inferior, no es ningún problema pero quizás no sea deseable si se tienen que evitar por algún motivo medios de calibración débilmente o fuertemente ácidos.

Cuando los valores de los parámetros q y Kd son conocidos (obtenidos a partir de la calibración in situ en la fábrica) la concentración cSi del analito en el medio de calibración líquido se podrá elegir de tal forma en la etapa a) iii del procedimiento que (después de la humectación) se establezca un cociente conocido V=cB/cD en el sensor en húmedo, que preferiblemente se situará en el intervalo entre 0,1 y 0,9, en particular entre 0,3 y 0,7. Tiene una ventaja especial si este cociente en estado húmedo (procedimiento etapa c) se elige de tal forma que es igual al cociente en estado seco (procedimiento etapa b).

Esta variante hará que se obtenga el valor de calibración en húmedo LiW *. Usando la ecuación 12 LmW * se puede calcular, por ejemplo, a partir de LiW *.

(16) LmW* = LiW* [1+ (q-1)/(1+cS1/Kd)]

La tercera sub-variante conforme a la invención (ver fig. 1c) se caracteriza por que: en la etapa a)i. los sensores So son seleccionados de manera que el colorante indicador está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo del mismo está unido a la especie B y no a la especie A, el cociente V=cB/cD con cD=cA+cB, es conocido y se encuentra entre 0,1 y 0,9, pre

feriblemente entre 0,3 y 0,7,

en la etapa a)ii.

se obtienen los valores de calibración en seco LD* in situ en la fábrica, en la etapa a)iii. la intensidad de luminiscencia se mide con los sensores So durante al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones distintas, conocidas, cSi del analito S, lo que da lugar a los valores de calibración en húmedo in situ en la fábrica LiW*, y en la etapa a)iv las características relativas y los valores de calibración en húmedo LmW * de los sensores So se obtienen a partir de los pares de valores LiW *, cSi conforme a la ecuación (16) y la característica relativa válida para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo se calcula a partir de ello, y a partir de los valores de calibración en seco LD* y de los valores de calibración en húmedo LmW* se calcula un valor proporcional RD/W, que dará lugar a en la etapa b)i. un valor de calibración en seco en el lugar del usuario LD, y en la etapa b)iii. se calcula un factor de gradación según una escala LmW en el lugar ocupado por el usuario a partir de LD y el valor proporcional RD/W, y la concentración del analito no volátil se determina a partir del valor de luminiscencia medido, el valor de calibración en seco LD, el valor proporcional RD/W

y la característica relativa.

Ejemplo 2

(con sub-variantes 2.1 y 2.2 sin utilizar las ecuaciones 1 a 10)

Es una ventaja de las ecuaciones teóricamente funcionales derivadas para la característica del sensor que éstas generalmente describan la forma de la curva característica en toda la gama de concentraciones de analito medibles con suficiente exactitud. Pero para la finalidad de la calibración en seco conforme a la invención no es absolutamente necesario utilizar las ecuaciones teóricamente derivadas anteriores.

En principio se pueden utilizar las relaciones funcionales alternativas. La forma de la curva característica – al menos en toda la gama esperada de concentración de analito – se puede representar suficientemente y con exactitud, por ejemplo, mediante funciones polinomiales de primer

o segundo grado, mediante funciones logarítmicas, mediante funciones racionales o por combinaciones de estas funciones (por ejemplo, LW=a+b.cS, LW=a+b.log(cS), LW=a+b.cS+c.(cS)2,

o bien LW=a+b.pH, LW=a+b.log(pH), LW=a+b.pH+c.(pH)2). Las funciones citadas como ejemplos difieren de las funciones derivadas teóricamente (por ejemplo, ecuaciones 8 ó 10), por ejemplo, en que sus juegos de parámetros (a,b,c) no contienen un parámetro específico que se podría utilizar como un factor de gradación según una escala análoga a Lm, y además como los parámetros individuales, en contraste con q y Kd de la ecuación 8, no reflejan las propiedades específicas del sensor. Si se utilizan dichas funciones alterna

tivas y la concentración de analito se sitúa inesperadamente fuera del margen asumido, existe un riesgo de que los valores de la característica no se correlacionen íntimamente y lo suficiente con los valores de medición, llevando pues a resultados falsos. Si la función no se acerca suficientemente a la forma de la característica en todo el margen esperado de las concentraciones de analito, los resultados serán poco precisos.

Funciones alternativas podrían utilizarse, por ejemplo, si

- las funciones derivadas teóricamente no están disponibles o no se conocen con exactitud suficiente;

- la gama dinámica del sensor es mayor que la gama esperada de concentraciones de analito y la función alternativa representa la forma de la característica en la gama esperada con suficiente exactitud.

Existen dos métodos distintos los cuales son básicamente equivalentes aunque difieren en detalles del procedimiento:

-

normalizar la característica obtenida mediante la calibración in situ en la fábrica por el valor en seco (ver ejemplo 2.1)

-

normalizar los puntos medidos obtenidos mediante la calibración in situ en la fábrica por el valor seco (ver ejemplo 2.2) Un cociente determinado VD(ecuación 6) de las especies

A y B del indicador presentes en un sensor seco So dará lugar a una intensidad LD en una medición en seco.

LD es la intensidad de luminiscencia medida con el

sensor seco, en un cociente determinado VD, siendo el cociente entre las concentraciones de las dos especies A y B el mismo para todo sensor seco entre una pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo.

En contacto con un medio liquido, es decir un medio de calibración o control o la muestra que contiene el analito S que se va a medir en la concentración cSi, se ha establecido un nuevo cociente ViW de las especies A y B después de la humectación y el equilibrio en el sensor húmedo, donde el cociente ViW establecido en el sensor húmedo depende de la concentración cSi del analito en la muestra y de la constante de disociación Kd del indicador, y se mide una intensidad de luminiscencia LiW que corresponde al cociente ViW.

Por consiguiente LiW es la intensidad de luminiscencia medida con el sensor húmedo en contacto con una muestra que contiene el analito S en una concentración cSi que se va a determinar.

Y con el cociente VD correspondiente cada valor LiW/LD corresponde a una cierta concentración del analito en la muestra.

Los valores de los cocientes LiW/LD son básicamente independientes de los factores influyentes mencionados antes en α) y ß). Para determinar estos valores se deberán medir las intensidades LiW y LD con el mismo sensor y con el mismo dispositivo medidor.

Para un determinado valor VD en el sensor seco existe

una cierta relación funcional entre los valores del cocien

te LiW/LD y la concentración del analito en la muestra.

Ejemplo 2.1

En una variante preferida del método conforme a la invención se elige un número representativo de sensores secos So entre una pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo y se mide la intensidad LD* sin el uso de un medio de calibración acuoso. Posteriormente cada uno de los sensores So se pone en contacto con un número n de medios acuosos de calibración con concentraciones conocidas cSi de analito, que son distribuidas al menos por la gama esperada de la concentración que se va a medir, y se miden n intensidades de luminiscencia (LiW *;i=1…n), y se obtienen n pares de datos (cSiW *, LiW*; i=1..n).

Una función adecuada de fórmula general LW*=f(P1*…Pn*,cS ó pH)(por ejemplo, LW*=P1*+P2*.cS o bien LW*=P1*+P2*.pH) que describe la forma de la característica del sensor se ajusta a n pares de datos – al menos para parte de la gama de concentraciones de analito que se van a medir – en valores para los parámetros P1*..Pn* de una característica efectiva del sensor que se obtiene in situ en la fábrica.

A partir de la característica efectiva obtenida in si- tu en la fábrica se deduce la característica relativa mediante la gradación con el valor en seco LD*, es decir la característica se divide por el valor en seco LD*.

Por ejemplo: la característica efectiva in situ en la fábrica LW*=P1*+P2*.cS se divide por LD*, es decir se calculan los porcentajes p1=P1*/LD* y p2=P2/LD* y la característi

ca a escala es Lrel=(P1*+P2*.cS)/LD*=(p1+p2.cS).

En el lugar ocupado por el usuario se realiza una calibración en seco puntual (no se utiliza medio de calibración acuoso) usando un sensor seco S1 a partir de la pluralidad de sensores fabricados del mismo modo, lo que da una intensidad de luminiscencia LD.

Multiplicando la característica relativa Lrel por el valor de calibración en seco LD medido en el lugar ocupado por el usuario se obtiene la característica efectiva válida para el lugar ocupado por el usuario.

Continuando con el ejemplo anterior: la característica relativa Lrel=(p1+p2.cS) se multiplica por el valor de calibración en seco en el lugar del usuario LD, es decir, los parámetros p1 y p2 de la característica relativa se multiplican por el valor de calibración en seco LD medido en el lugar del usuario: P1=LD.p1 y P2=LD.p2; y la característica efectiva en el lugar ocupado por el usuario es LW=LD. (p1+p2.cS)=(LD.p1+LD.p2.cS)=(P1+P2.cS). Por consiguiente, la característica relativa en el lugar del usuario se relaciona con el valor de calibración en seco.

A partir de la característica efectiva del lugar ocupado por el usuario se obtiene la concentración del analito resolviendo la ecuación para cS (p pH) e introduciendo el valor LiW de la intensidad de luminiscencia medida en contacto con la muestra. En el ejemplo actual: cSi= (LiWP1)/P2.

Para poder obtener valores medios fiables de los pará

metros p1 a pn de la característica el experto puede selec

cionar un número representativo m de sensores. Teóricamente m=1 es posible, pero en la práctica m será un número más grande, dependiendo de la aplicación indicada, m será > 16, preferiblemente >40.

En una sub-variante preferida de la segunda variante se dispone que al menos se elijan m sensores y m valores de calibración en seco LD* in situ en fábrica y que después de la medición en seco se obtengan valores de calibración en húmedo LiW * de cada sensor usando al menos dos de n>2 diferentes medios de calibración acuosos, de manera que cada medio de calibración se utilice al menos una vez durante la calibración de todos los sensores seleccionados. Para cada sensor se deduce una característica efectiva de fórmula general LW*=f(P1*,….,Pn*, cS ó pH) de al menos dos de n>2 valores de calibración en húmedo LiW * y para cada sensor se calcule una característica relativa de fórmula general Lrel=f(p1,….,pn, cS ó pH) dividiendo la característica efectiva por el valor de calibración en seco LD*. Posteriormense te obtiene una característica relativa haciendo el promedio de los coeficientes p1 a pn de cada una de las características del sensor, y esta característica relativa se asigna a la totalida de los sensores Sn fabricados del mismo modo, es decir a un lote de producción de sensores.

Una subvariante de la segunda variante de la invención se caracteriza del modo siguiente: en el lugar de la fábrica

-al menos se seleccionan m sensores So entre una plura

lidad de sensores fabricados del mismo modo;

- la intensidad de luminiscencia se mide para cada sensor So sin medio de calibración acuoso, lo que da un valor de calibración en seco in situ en fábrica LD* para cada sensor;

-

para cada sensor seleccionado se miden las intensidades de luminiscencia cuando están en contacto con al menos 2 de n (n>2) medios de calibración acuosos diferentes, de manera que cada medio de calibración se utilice al menos una vez en la calibración de todos los sensores selccionados, lo que da lugar a dos valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LiW* para cada sensor;

-

para cada sensor seleccionado se ajusta una función adecuada de fórmula general LW*=f(P1*,….,Pn*, cS ó pH) que describa la forma de la característica del sensor a los pares de datos (cSi*, LiW*), lo que dará lugar a valores para los parámetros P1*….Pn* de una característica efectiva in situ en fábrica para cada sensor;

- por cada sensor seleccionado la característica efectiva in situ en fábrica se gradúa según una escala con el valor de calibración en seco in situ en fábrica correspondiente, lo que da lugar a los parámetros p1 a pn para la característica relativa de fórmula general Lrel=f(p1,….,pn, cS ó pH) de cada uno de los sensores;

- haciendo el promedio de los coeficientes de cada una de las características del sensor se obtiene una característica relativa que se asigna a la totalidad de

los sensores Sn fabricados del mismo modo.

en el lugar en que se encuentra el usuario

- Para un sensor S1 de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo se mide la intensidad de luminiscencia que da lugar a un valor de calibración en seco en el lugar del usuario LD;

- para el sensor S1 en contacto con el medio de muestreo acuoso se mide la intensidad de luminiscencia LiW;

-

la característica relativa obtenida in situ en fábrica se gradúa con el valor de calibración en seco del lugar del usuario LD y da lugar a valores para los parámetros P1 a Pn para la característica efectiva en el lugar del usuario, que tiene la fórmula general LW=f(P1,….,Pn, cS ó pH);

-

la concentración de analito se calcula resolviendo la ecuación de fórmula general LW=f(P1,….,Pn, cS ó pH) para cs o pH (cS ó pH =f(P1....Pn,LW) e introduciendo el valor de medición de la luminiscencia in situ en el usuario LiW.

Ejemplo 2.2

En una variante especialmente preferida de la invención también es posible la variación siguiente del procedimiento que se destaca en el ejemplo 2.1. Se calculan los primeros valores a partir de los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LiW con un número n de fluidos de calibración y el valor de calibración en seco in situ en fábrica LD* y la relación funcional entre estas proporciones de valores en húmedo frente al valor en seco y las concentraciones de analito o valores de pH se expresa en forma

de una tabla o de una función adecuada de fórmula general Lrel=f(u1,….,un, cS ó pH).

En esta variante del método conforme a la invención al menos se elige un sensor So seco de una pluralidad de sensores fabricados del mismo modo y se mide la intensidad de luminiscencia LD* sin un medio de calibración acuoso. Posteriormente el sensor se pone en contacto con una serie n de medios de calibración acuosos con concentraciones conocidas cSi de analito, distribuidas al menos por toda la gama esperada de concentraciones a medir, y se miden las intensidades de luminiscencia n LiW*; i=1…n), lo que da lugar a n pares de datos (cSiW*, LiW*; i=1..n).

Para cada uno de los sensores seleccionados So, se dividen las intensidades LiW* por LD* dando los valores proporcionales Ui*=LiW*/LD*; i=1…n y por consiguiente n pares de datos (cSi*, Ui*; i=1..n).

Luego una función adecuada de fórmula general Lrel=f(u1…un,cS ó pH) que describe la característica relativa del sensor (por ejemplo, Lrel=u1+u2.cS o Lrel=u1+u2.pH) se ajusta a los pares de datos obtenidos, lo que da lugar a valores para los parámetros ui..un de la característica relativa.

En el lugar ocupado por el usuario se realiza una calibración en seco puntual (no se utiliza medio de calibración acuoso) usando un sensor seco Sn que da una intensidad de luminiscencia LD que es el valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario; luego se pone el sensor en contacto con la muestra que contiene el analito S con

concentración (desconocida) cSi y una medición en húmedo, es decir, se realiza una medición donde el sensor está en contacto con la muestra acuosa y se obtiene la intensidad de luminiscencia LiW, es decir el valor de medición de la luminiscencia.

A partir del valor de la intensidad de la muestra LiW y del valor de la intensidad en seco LD se calcula un cociente Ui=LiW/LD. Usando el valor de la intensidad de la muestra relacionado con el valor de la intensidad en seco y la característica de la fórmula general Lrel=f (u1…un, cS ó pH) relacionada también con el valor en seco, se deduce la concentración del analito o el valor del pH.

La diferencia esencial entre la variante actual y la descrita en el ejemplo 2.1 es la siguiente: en 2.1 la característica efectiva en fábrica de fórmula general LW*= f(P1*,…Pn*,cS ó pH) se obtiene midiendo n valores de calibración con n medios de calibración acuosos, calculando los parámetros P1 a Pn* y deduciendo la característica relativa de fórmula general Lrel=f(p1…pn,cS ó pH) calculando a escala la característica efectiva con el valor en seco medido en fábrica, mientras que en 2.2 primero se gradúan los n valores de calibración en húmedo con el valor en seco medido en fábrica (es decir, los n valores de calibración en húmedo se dividen por el valor en seco LD* para obtener los n valores proporcionales y luego se deduce una característica relativa ajustando los n valores a la característica relativa de fórmula general Lrel=f(u1…un,cS ó pH) .

En otra configuración preferida de la invención se ha

propuesto que al menos se seleccionen m sensores in situ en fábrica y que se obtengan m valores de calibración en seco ti, con i=1 a m, y que a partir de cada sensor se tomen los valores de calibración en húmedo con al menos uno de 5 n>2 medios distintos de calibración acuosa, de manera que cada medio de calibración se utilice al menos una vez, de forma que se obtenga k>n valores de calibración en húmedo kij, con j=1 a n, y que los valores proporcionales kij,ti se calculen a partir de los pares individuales ti, kij y que la

10 característica relativa del sensor se deduzca a partir de estos valores. El número de sensores selccionados es m (m puede ser 1, normalmente es >1, y en la práctica es un número superior, como >16 o preferiblemente >40, dependiendo de la

15 aplicación, para conseguir valores medios representativos), con el índice i de los sensores seleccionados oscilando entre 1 y m. Existirán pues m valores de calibración en seco ti con i=1 a m. El número de diferentes medios de calibración acuosos es n>2, con el índice j de los medios de cali

20 bración acuosos oscilando entre 1 y n. Existen por tanto k>n valores de calibración en húmedo kij y k valores proporcionales kij/ti.

La tabla siguiente muestra los valores para 2,3 y 5 medios de calibración: 25

m sensores elegidos

m valores calibración en seco ti n medios de calibración k valores de calibración en húmedo kij k cocientes kij/ti

1.)m=1,n=2 ,k=2

1 t1 2 k11, k12 k11/t1, k12/t1

2.)m=3,n=3 ,k=9

3 t1,t2,t3 3 k11, k12, k13, k21,k22, k33, k31, k32,k33 k11/t1, k12/t1 k13/t1, k21/t2 k22/t2, k23/t2 k31/t3, k32/t3 k33/t3

3.)m=2,n=5 ,k=6

2 t1,t2 5 k11, k12, k13, k23,k24, k25 k11/t1, k12/t1 k13/t1, k23/t2 k24/t2, k25/t2

Una subvariante de esta variante de la invención se caracteriza por lo siguiente: en el lugar de la fábrica

5 - al menos se seleccionan m sensores So entre una pluralidad de sensores fabricados del mismo modo;

- por cada sensor seleccionado se mide la intensidad de luminiscencia sin medio de calibración acuoso, lo que da un valor de calibración en seco in situ en fábrica

10 LD* para cada sensor;

- para cada sensor seleccionado se miden las intensidades de luminiscencia cuando están en contacto con al menos uno de n (n>2) medios de calibración acuosos diferentes, de manera que cada medio de calibración se

15 utilice al menos una vez en la calibración de todos los sensores selccionados, lo que da lugar a al menos un valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LiW* para cada sensor;

- de los valores de calibración en húmedo y en seco in

situ en fábrica de cada uno de los sensores se calculan los valores proporcionales Ui*=LiW */LD*

- una función adecuada de fórmula general Lrel=f(p1,….,pn, cS ó pH) que describa la forma de la característica relativa del sensor se ajusta a los valores cociente Ui* de todos los sensores m, lo que da lugar a valores para los parámetros u1…un;

en el lugar en que se encuentra el usuario

-

para un sensor S1 en seco de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo se mide la intensidad de luminiscencia que da lugar a un valor de calibración en seco en el lugar del usuario LD;

-

para el sensor S1 en contacto con el medio de muestreo acuoso se mide la intensidad de luminiscencia LiW;

- el valor de medición de la luminiscencia LiW se gradua según una escala por el valor en seco LD, lo que da lugar a un valor cociente Ui y la concentración de analito se calcula introduciendo el valor Ui en la ecuación de fórmula general Lrel=f(u1,….,un, cS ó pH) y resolviendo la ecuación para cS ó pH (cS ó pH =f(u1….un.Lrel)).

Se debería advertir que en la medición real de la muestra en el lugar del usuario solamente se tienen que llevar a cabo las tres últimas etapas, puesto que los valores resultantes de la calibración in situ en la fábrica se suministran con el sensor en forma adecuada, por ejemplo como información de la calibración específica

del lote codificada en un código de barras, un soporte de código electrónico o magnético o una clave ROM.

La variante descrita en 2.2 tiene ciertas ventajas, especialmente si los parámetros de la característica se obtienen en una calibración in situ en la fábrica no solamente a partir de un sensor So, sino, más realmente, a partir de un número de sensores representativo estadísticamente y asignado a la totalidad de sensores.

Ejemplo 3

En este ejemplo se describen la síntesis química de los colorantes indicadores adecuados para la presente invención, su inmovilización frente a las fibras de celulosa, la preparación de los discos del sensor óptico y las mediciones del pH, Na+, K+ y Ca++ usando los sensores ópticos así obtenidos.

3.1 Síntesis del colorante luminiscente sensible al pH A41 con la fórmula Sustancias químicas

DCM(diclorometano): Riedel de haen 24233>99%; TFA(ácido triflúoracético):Fluka 91700>98%;NHS (Nhidroxisuccinimida);Fluka 56480>97%; DIC(diisopropilcarbodiimida);Fluka 38370>98%; DMAP (4-dimetilaminopiridina):

Fluka 39405>98%;DIPEA (diisopropieletilamina):Fluka 03440>98%;acetonitrilo: grado Merck-HPLC; ácido 4aminometilbenzoico:Fluka: 08400>98%;SOCl2: Flu- ka:88950>99%;EtOH abs.:Riedel de Haen: 32221;TEA (trietilamina):Merck:808352; SO2Cl2: Fluka:862212; monohidrato de hidrazina: Fluka:53850; anhídrido ftálico: Fluka:80020; clorhidrato de tiramina: Fluka 93820>97%; NMP(Nmetilpirrolidona): Fluka: 69116; anhídrido 4-cloro-1,8naftálico: Aldrich: 19,149-3 – 95%

La vía sintética se muestra en las figuras 7a y 7b.

Clorhidrato de éster etílico 4-aminometilbenzoico (1):

20,0 g (132 mM) de ácido 4-aminometilbenzoico se suspenden en 200 ml de etanol (EtOH) abs. y se enfrian con hielo. 28,0 g (17 ml) de cloruro de tionilo (236 mM) se añaden gota a gota. La mezcla clara se refluye luego durante 3 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se evapora el EtOH. Se añaden 50 ml de tolueno/EtOH 1/1 y se evaporan tres veces. El residuo se seca hasta tener 27 g de (1). Ester etílico de ácido 4-cloro-naftalimidil-metilbenzoico (2):

20,0 g (93,2 mM) de clorhidrato de éster etílico de ácido 4-aminometilbenzoico, 21,68 g (93,2 mM) de anhídrido 4-cloro-1,8-naftálico y 19,78 g de trietilamina (195,5 mM) en 400 ml de DMF se calientan a 90ºC y se agitan durante la noche. Tras enfriar a temperatura ambiente se añaden 100 ml de H2O para precipitar el producto deseado. El éster etílico de ácido 4-cloro-naftalimidil-metilbenzoico (2) se re-

cristaliza del EtOH. Producto:15,8g.

El HPLC (Vydac 10-90-15) muestra un único pico a t=14,04 y el pico de masa

MH+=394,8 (M=393,82) se halla en el espectro de masas MALDI TOF. Ftalamida de tiramina(3):

29,6 g(200 mM) de anhídrido ftálico, 34,73 g de clorhidrato de tiramina (200 mM) y 27,7 ml de trietilamina (200 mM) se calientan a 115ºC durante 4 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se vierte en 1,5 l de agua helada. El precipitado (3) se filtra y lava con agua. Producto: 45g. Ftalamida de diclorotiramina(4):

15,35 g(57 mM) de ftalamida de tiramina (3) se añaden lentamente y por partes a 24,75 g (170 mM) de cloruro de sulfurilo hirviendo y 75 ml de CHCl3. El reflujo sigue hasta que la mezcla está totalmente clara. Luego la solución se agita abiertamente a temperatura ambiente durante la noche para eliminar el cloruro de sulfurilo. El disolvente se retira por evaporación y el producto crudo (4) se recristaliza de 75 ml de MeOH. Producto: 7,2 g. Diclorotiramina(5):

7,2 g de ftalimida de diclorotiramina (4) y 1,6 ml de monohidrato de hidrazina se refluyen en 170 ml de EtOH abs. durante la noche. Tras enfriar a temperatura ambiente, el precipitado se filtra. El producto crudo (5) no se purifica para una síntesis ulterior. A-040:

Una mezcla de 1,5 g(7,26 mM) de diclorotiramina (5),

2,85 g de éster etílico de ácido 4-cloronaftalimidilmetilbenzoico (2) y 4 ml de DIPEA se calientan en 150 ml de NMP a 90ºC durant 4 días.

Tras enfriar a temperatura ambiente, se añaden 1,5 l de agua y 7 ml de ácido acético (AcOH). El precipitado se filtra y disuelve en 400 ml de CHCl3. La capa orgánica se extrae tres veces con NaOH 0,5N y la capa de NaOH se acidifica con HCl 6N. La capa de agua se extrae con acetato de etilo y la capa orgánica que contiene el colorante se seca sobre MgSO4. El disolvente se elimina por evaporación.

Finalmente el A-040 crudo se purifica a través de una cromatografía de columna de gel de sílice de secado instantáneo. Gradiente: éter de petróleo

Éter de petróleo/acetato de etilo 9/1; éter de petróleo/acetato de etilo 8/2; éter de petróleo/acetato de etilo 7/3; éter de petróleo/acetato de etilo 1/1

La HPLC (Vydac:10-90-15) muestra un único pico a t=13.42 min y el pico de masa M=563 (M=563) se halla por la medición MALDI TOF. A-041:

A-040 se disuelve en 50 ml de acetonitrilo y 50 ml de NaOH 1N. La solución se calienta a 60ºC y se agita durante 1 hora. Luego la solución se acidifica con HCl y se efectúa la extracción con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo que contiene el colorante se lava con agua tres veces. Después de secar la capa orgánica sobre MgSO4, el di

solvente se retira por evaporación. Producto: 350 mg.

82 La HPLC (Vydac:10-90-15) presenta un único pico a t=11,3 min y el pico del espectro de masa MH+=535,4 (M=534,4) se encuentra mediante la medición MALDI TOF.

3.2 Síntesis del colorante luminiscente sensible al Na+

ácido 4-(4’-(4’’-C-[15-crown-5]-3’’-metoxifenil-etilamino]1’,8’’-naftilamidil-metil)benzoico

Los sensores de Na+ utilizados se han descrito en la patente americana 5.952.491 (Leiner y cols.).

En Anal.Chem. 75, 549-555, 2003 He y cols., “A fluorescent chemo sensor for sodium based on photo induced electron transfer” se puede hallar una descripción exacta de la preparación del indicador de PET sensible a Na+ así como el espectro y los datos de medición de los sensores.

3.3 Síntesis del colorante luminiscente sensible al K+

Los sensores de K+ utilizados se describen en la patente americana 6.211.369 (He et al.). En J.Am.Chem. Soc. 125, 1468-1469, 2003 “A fluorescent sensor with high selectivity and sensitivity for potassium in water” de He et al., se puede hallar una descripción exacta de la preparación del indicador de PET sensible a K+ así como el espectro y los datos de medición de los sensores.

3.4 Síntesis del colorante luminiscente sensible al Ca++

El colorante sensible a Ca++ se prepara tal como se ha descrito en la patente americana 6.171.866 (He et al.).

3.5 Preparación de fibras de celulosa con grupos amino

Las fibras de celulosa con grupos amino se preparan tal como se describe en SU 1.028.677, CA 99.177723b.

3.6 Inmovilización de los colorantes sensibles al pH, Na+,

K+ y Ca++ en fibras de celulosa con grupos amino

La inmovilización de los cuatro colorantes sobre fibras de amino celulosa se lleva a cabo de forma análoga al ejemplo 18 en la patente americana 6.211.359 (He et al.).

3.7 Establecer un porcentaje conocido de las especies A y B

Para establecer un porcentaje o una proporción conocida V (ecuación 6) de las especies A y B, después de la inmovilización de los colorantes, las fibras que llevan el indicador se lavan con un medio acuoso que contiene el analito relevante en la concentración adecuada, de manera que una vez alcanzado el equilibrio (ecuaciones 1 y 2) se establece el cociente deseado de las concentraciones de especie A y B. Posteriormente se lavan las fibras mediante un contacto breve con agua desionizada y se secan, lo que no varía el cociente establecido de los dos tipos de especies.

Alternativamente también es posible fabricar primero los sensores y lavarlos con un medio acuoso que contenga el analito relevante en la concentración adecuada, de manera que se alcance el equilibrio (ecuaciones 1 y 2), se establezca el porcentaje deseado de concentraciones de las especies A y B, y luego se secan los sensores.

Para establecer un cierto porcentaje de especies A y B es posible, en el caso de sensores del pH, equilibrar los sensores o las materias primas (por ejemplo fibras que transportan el indicador, partículas etc.) con ácidos, bases o tampones con pH conocido.

En el caso de sensores iónicos, los sensores pueden

ser equilibrados con soluciones acuosas que contengan el

ión que se va a determinar en la concentración adecuada. Alternativamente, es posible en el caso de los colorantes de PET descritos en las patentes americanas

5.952.491

(Leiner y cols.), 6.211.359 (He y cols.),

6.171.866

(He y cols.) establecer con ácidos (por ejemplo, HCl) o soluciones tamponadas un cierto porcentaje de las dos especies A y B en ausencia del ión que se va a determinar. Esto es posible porque los átomos de nitrógeno enlazados aromáticamente de la fracción de ionóforo son pHactivos. El valor del pH de los átomos de N enlazados aromáticamente es aproximadamente 5, por ejemplo. En contacto con los líquidos ácidos el nitrógeno es protonado y se elimina el efecto PET. La luminiscencia de la especie protonada corresponde a la luminiscencia de la especie B, a la que está ligada el analito (ión que se va a determinar). Por consiguiente, es posible en el caso de ciertos indicadores de luminiscencia para cationes metálicos que tienen grupos

o fracciones pH-activas de ionóforo, establecer un cociente predeterminado de la especie débilmente o fuertemente luminiscente por medio de protones. El protón actúa como análogo del analito.

3.8 Fabricación de sensores ópticos (discos sensores) sensibles al H+(pH), Na+, K+ y Ca+

La fabricación de los cuatro sensores se llevaba a cabo de forma análoga al ejemplo 19 en la patente americana

6.211.359 (He y cols.). 0,5 g (25 µm) de polvo de celulosa tamizado con un co

lorante inmovilizado del ejemplo 3.7 se suspenden en 9,5 g

de una solución de copolímero hidrofílico de poliéterpoliuretano al 10% en un 90% de etanol-agua durante 16 horas. Dichos copolímeros de poliéter-poliuretano se pueden obtener, por ejemplo, de CardioTech International, Inc. Woburn, MA, U.S.A. La dispersión homogénea resultante se reviste de una lámina de poliéster (lámina de Melinex, ICI America) con un grosor final de 10 µm. La lámina se reviste de un 3% de negro de humo en una solución del 10% de copolímero de poliéter-poliuretano en un 90% de etanol-agua con un espesor seco de 5 µm. Luego se perforan los discos pequeños de 3 mm de diámetro.

Los métodos de preparación de los discos sensores han sido descritos por M.J.P.Leiner y P. Hartmann en Sensors y Actuators B, 11(1993), 281-189 (“Theory and Practice in optical pH sensing”).

3.9 fabricación de cubetas de medición desechables que contienen una serie de sensores ópticos sensibles al H+(pH), Na+, K+ y Ca++

Los discos sensores del ejemplo 3.8 se incorporan a cubetas de medición de plástico desechables. Las cubetas consisten en unas piezas inferior y superior moldeadas por inyección, un conducto para el paso de calibrantes y muestra, unas aberturas sellables de entrada y salida. La parte de la base tiene unas cavidades cilíndricas para la incrustación de los discos sensores. Tras la incorporación de los discos sensores sensibles a H+(pH), Na+, K+ y Ca++ a las cavidades, las piezas superior e inferior se pegan juntas para formar la cubeta final de medición. La iluminación del

colorante respectivo y la recogida de la luz de luminiscencia de longitud de onda más larga se realizan a través de la base de la cubeta.

Tras el montaje, las cubetas desechables se colocan durante varios días en recipientes cerrados que contienen un desecante apropiado para permitir que los sensores se sequen al nivel deseado de humedad. Después del secado, se sellan las aberturas de entrada y salida y las cubetas se guardan en recipientes cerrados junto con un desecante apropiado hasta su uso.

Alternativamente, también es posible sellar las aberturas de entrada y salida justo después del montaje de las cubetas desechables y almacenar las cubetas en unos paquetes que contienen desecante. En dicho caso, el secado tiene lugar a través del material de sellado y/o a través de los materiales plásticos. Debido a la baja permeabilidad del agua de los plásticos, el proceso de secado se prolongará (semanas).

Los métodos para preparar cubetas de medición desechables han sido descritos por M.J.P. Leiner en Sensors and Actuators B.29(1995), 269-173 (“Optical sensors for in vitro blood gas analysis”).

3.10 Mediciones en seco y en húmedo de cubetas desechables en un dispositivo de medición

Para la medición, se introducen cubetas desechables en una cámara de medición termostatada impermeable a la luz. Las aberturas de entrada y salida están conectadas a un sistema fluídico para permitir el paso de las soluciones

acuosas que tengan diferentes valores de pH y/o diferente concentración de iones alcalinos.

Para cada conducto (sensor) el sistema de medición óptico consiste en un LED azul como fuente de luz, un foto- diodo como el detector, los filtros ópticos para seleccionar las longitudes de onda, una disposición óptica para dirigir la luz de excitación a la capa de colorante del sensor y para conducir la luz de emisión al fotodetector así como un dispositivo para la señalización electrónica. Al final de la excitación se utiliza un filtro de interferencia (transmisión de picos a 480 nm) y al final de la emisión un filtro de corte de 520 nm.

3.11 Resultados de la medición con sensores de pH

En la figura 3 las curvas de respuesta (intensidad de luminiscencia como una función del tiempo) de seis sensores individuales de pH – elegidos de una pluralidad de sensores fabricados del mismo modo – se muestran como funciones del tiempo t (medido en segundos) en el estado en seco y durante la fase de equilibrio con fluidos acuosos. Los valores de intensidad se miden en intervalos de tiempo de 2 segundos.

Para este grupo de sensores (ver apartado 3.7) el material que lleva el indicador (fibras de celulosa) se lava con HCl (pH~3) antes de introducirlo en la capa de sensor. Así solamente la especie B está presente en los sensores secos de este grupo. El cociente V=cB/cD es por lo tanto igual a 1 en el sensor en seco (ecuación 6).

Después de la inserción de los sensores, que se alma

cenan en contacto con un medio gaseoso seco, en el dispositivo de medición, son termostatados a 37ºC (no se muestra), iluminados, y se mide la intensidad de luminiscencia (esto es el intervalo de tiempo de 0-60 s). Luego el medio gaseoso es reemplazado por el fluido acuoso (diferente para cada sensor). Durante el intervalo de tiempo 60-240 s tiene lugar el equilibrio de los sensores al valor del pH del fluido.

Las intensidades medidas con diferentes sensores en seco son distintas (no se muestran). Para explicar mejor la presentación las curvas de respuesta de la figura 3 se calculan a escala de manera que los valores medios de las intensidades en seco tienen el valor de 1.15. Este valor de

1.15 representa el cociente RmD/W (de la ecuación 13).

Calcular a escala en este contexto significa: los valores de intensidad medidos a intervalos de 2 segundos se multiplican por un factor (=1,15/promedio de las intensidades en seco durante el intervalo de tiempo de 0-60s).

Se utilizan dos grupos de fluidos de muestra. El grupo con los valores de pH 7.18, 7.41, 7.59 consiste en fluidos de electrolito acuosos que se utilizan típicamente para fines de control y calibración en la determinación de los parámetros sanguíneos (ver, por ejemplo, US 6.174.728).

El grupo con valores de pH 6,84, 7,15, 7,18 consiste en tampones HEPES con valores fisiológicos de Na+, K+, Ca++ y Cl-.

Durante el intervalo de tiempo de 60-240s dos procesos

tienen lugar a la vez, es decir, la humectación y el equilibrio al pH del fluido.

En el intervalo de tiempo de 230-240s estos procesos ya habrán terminado. La intensidad de luminiscencia en este intervalo es la intensidad húmeda de la muestra.

A partir de la forma de las curvas se puede observar que la cinética del proceso de equilibrio depende ciertamente del tipo de muestra.

En el diagrama de la figura 4 se representan los valores de luminiscencia a escala frente a los valores del pH en el eje de abscisas.

Los símbolos triangulares indican que en el ejemplo la especie B protonada está presente exclusivamente en el estado en seco. Los triángulos oscuros, las líneas a trazos, respectivamente, indican los valores de calibración en seco LmD* y LmD. En el estado en seco no existe dependencia del pH. El triángulo claro indica el valor de calibración en húmedo LmW* cuando solamente está presente la especie pro- tonada B.

Los símbolos cuadrados indican las intensidades LiW* de los sensores individuales después del equilibrio, calculados a escala a partir de los valores en seco. La línea gruesa es la característica relativa conforme a la ecuación 10, con LmW* igual a 1. Los parámetros q y pK de la característica son el resultado del ajuste de la ecuación 10 a los datos de medición representados por los símbolos cuadrados por el método de mínimos cuadrados. El método proporciona el resultado de:

q=0,17, pK=7,08.

Con la especie B presente las intensidades en seco LmD* y LmD son mayores en un factor RmD/W=1,15 que las intensidades en húmedo LmW* y LmW.

De acuerdo con el ejemplo 1.1, la característica relativa (ecuación 10) viene dada por los parámetros LmW=1, 1=0,17, pK=7,08, con el cociente RmD/W=1,15.

El diagrama de la figura 5 corresponde al de la figura 4, y la diferencia reside en que la ecuación Lrel=u1+u2.pH se utiliza para representar la característica relativa (línea sólida). Por motivos de comparación, la característica relativa de la figura 4 aparece como una línea a trazos.

De acuerdo con el ejemplo 2.2, la característica relativa viene dada por los parámetros u1=3,59 y u2=-0,42. Entre los límites de pH 6,3-7,6 la forma de esta característica se aproxima a la de la figura 4.

La figura 6 muestra las intensidades de luminiscencia Lrel de dos grupos de sensores con pre-tratamiento diferente (grupo a: líneas sólidas, grupo b: símbolos). En el grupo a (ver ejemplo 3.7) el portador del indicador (fibras de celulosa) se lava con HCl (pH~3) antes de ser introducido en la capa sensor. Como consecuencia de ello solamente la especie B está presente en el tampón de fosfato en seco (pH ~7,4) antes de su introducción en la capa de sensor. Por lo tanto se obtiene un cociente V=cB/cD (ecuación 6) de las dos especies en los sensores secos de este grupo.

Tras la inserción de los sensores almacenados en con

tacto con un medio gaseoso seco en el dispositivo de medi

ción éstos son termostatados a 37ºC (no mostrado), iluminados con luz azul, y la intensidad de luminiscencia se mide como una función del tiempo a intervalos de 2 segundos. En el intervalo de tiempo de 0-60 s los sensores se secaban. En el intervalo de 60-70 s el medio gaseoso es reemplazado por el fluido de muestra (no se realizan mediciones durante este tiempo). En el intervalo de tiempo de 70-200 s tiene lugar la humectación y el equilibrio del pH.

Los procesos de humectación y equilibrio de los 3 sensores de cada grupo se efectúan con fluidos acuosos de electrolitos (valores de pH 7.18, 7.41, 7.59) que normalmente se utilizan para fines de control y calibración en dispositivos para determinar los parámetros sanguíneos (descritos en US 6.174.728).

Las intensidades medidas de los diferentes sensores en seco son distintas (no mostradas). Las intensidades medidas de cada curva en la figura 6 se normalizan en dos etapas.

Etapa 1: se efectúa el promedio de los últimos 10 valores medidos en cada sensor en seco. Luego todos los valores medidos de la curva se dividen por el valor medio.

Etapa 2, grupo a: se efectúa el promedio de los últimos 10 valores medidos en el sensor húmedo de la curva con pH 7,41. Luego las tres curvas del grupo a se dividen por este valor medio.

Etapa 2, grupo b: las tres curvas del grupo b se tratan de forma análoga al grupo a.

A partir de la presentación elegida se puede ver que después del equilibrio las intensidades relativas de ambos

grupos son esencialmente las mismas y se correlacionan con los valores del pH de los fluidos de muestra. Además es evidente que (tal como se esperaba) que la intensidad seca del grupo a es mayor que la del grupo b:

5 ambos grupos tienen la misma cantidad de colorante indicador; en el grupo a el colorante está presente en la especie fuertemente luminiscente B, mientras que en el grupo b existe una mezcla de especies fuertemente y débilmente luminiscentes.

10 Tabla 1: contiene las intensidades medidas en seco y en húmedo del grupo a, tal como se representan en la figura 6. En los sensores del pH en seco de este grupo solamente está presente la especie B. Los cocientes de intensidad en húmedo/seco se obtienen dividiendo los valores medidos en húme

15 do por el valor medido en seco correspondiente (por ejemplo 463944/172253=2,69).

Tabla 1

pH

Intensidad medida en seco Intensidad medida en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

7.18

463944 172253 2,69

7.41

475324 146897 3,24

7.59

460287 125670 3.66

Tabla 2: contiene los valores en húmedo del grupo a, tal

20 como se representan en la figura 6, normalizados por el valor en seco. Los valores medidos en seco son normalizados respecto a 1 (por ejemplo, 463944/463944=1). Los valores medidos en húmedo normalizados se obtienen dividiendo los valores medidos en húmedo de la tabla 1 por el valor seco

correspondiente de la tabla 1) por ejemplo

172253/463944=0,371). Los cocientes de intensidad en se-

co/húmedo se obtienen dividiendo el valor normalizado en

seco por los valores normalizados en húmedo (por ejemplo,

1/0,371=2,69).

Tabla 2

pH

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

7.18

1 0,371 2,69

7.41

1 0,309 3,24

7.59

1 0,273 3.66

Una comparación de la tabla 1 y 2 demuestra que se obtienen cocientes equivalentes seco/húmedo, independiente

10 mente de si los cocientes se obtienen directamente dividiendo los valores medidos en húmedo por los valores medidos en seco o si los valores medidos en húmedo son normalizados primero por los valores en seco y los cocientes son luego calculados dividiendo.

15 La normalización permite la comparación en forma gráfica entre las curvas medidas o los datos medidos de los sensores con intensidad de luminiscencia diferente.

Tabla 3: contiene los valores en húmedo del grupo b, tal

20 como se representan en la figura 6, normalizados por el valor en seco. En los sensores del pH en seco de este grupo ambas especies A y B están presentes.

Tabla 2

pH

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

7.18

1 0,503 1,99

7.41

1 0,399 2,51

7.59

1 0,338 2,96

3.12 Resultados de la medición con sensores de Na+

Tabla 4: Intensidades normalizadas en seco y húmedo de sensores para determinar la concentración iónica de Na+ en muestras acuosas.

Tabla 4

cNa+ mmol/l)

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

122

1 0,290 3,45

143

1 0,310 3,13

155

1 0,338 2,96

3.13 Resultados de la medición con sensores de K+

Tabla 5: Intensidades normalizadas en seco y húmedo de sensores para determinar la concentración iónica de K+ en muestras acuosas.

Tabla 5

cK+ mmol/l)

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

3,0

1 0,346 2,89

4,9

1 0,383 2,61

5,9

1 0,401 2,49

15 3.14 Resultados de la medición con sensores de Ca++

Tabla 6: Intensidades normalizadas en seco y húmedo de sensores para la determinación óptica de la luminiscencia

95 de Ca++ en muestras acuosas.

Tabla 6

cCa++ mmol/l)

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

1.55

1 0,317 3,15

1,23

1 0,345 2,90

0,84

1 0,359 2,79

3.16 Resultados de la medición con sensores de Cl-

Tabla 7: Intensidades normalizadas en seco y húmedo de

sensores para la determinación de la concentración del ión

Cl-en muestras acuosas.

Tabla 7

cClmmol/l)

Intensidad normalizada en seco Intensidad normalizada en húmedo Cociente Intensidad en seco/húmedo

88

1 0,386 2,59

106

1 0,352 2,84

119

1 0,321 3,12

Los sensores de Cl- utilizados se han descrito en la 10 patente americana 6.613.282 (Huber).

Claims (14)

1. Método para determinar la concentración de un analito no volátil presente en un medio de muestreo acuoso con el uso de un sensor óptico que contiene un colorante indicador luminiscente inmovilizado en al menos una de sus capas, cuya luminiscencia depende de la concentración del analito y que es calibrado en el emplazamiento del usuario por medio de una calibración simple, de manera que se obtenga un valor de medición de la luminiscencia del sensor en contacto con el medio de muestreo acuoso en el lugar o emplazamiento del usuario, y que se caracteriza por que además comprende:

Medir la luminiscencia del sensor en seco en el lugar del usuario, sin el uso de medios de calibración, lo que da lugar a un valor de calibración en seco en el emplazamiento del usuario, y

Deducir la concentración de analito no volátil a partir del valor de medición de la luminiscencia, una relación de húmedo a seco obtenida in situ en fábrica y deducida de un valor de calibración en húmedo in situ en fábrica y un valor de calibración en seco in situ en fábrica y el valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que comprende c) in situ en fábrica

i.

elegir un número representativo de sensores

secos So

a partir de una pluralidad de senso

res secos Sn

fabricados del mismo modo;

ii.

medir la luminiscencia de cada uno de los sen

sores secos elegidos So, obteniendo los valo

res de calibración en seco in situ en fábrica;

iii. posteriormente medir la luminiscencia de cada uno de los sensores So en contacto con al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones diferentes del analito no volátil, dando lugar a valores de calibración en húmedo en fábrica;

iv. obtener una relación húmedo a seco de los sensores So a partir de los valores de calibración húmedos en la fábrica y los valores de calibración en seco en la fábrica, de forma que la relación húmedo a seco se toma como la relación húmedo a seco para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo.

b) en el lugar donde se encuentra el usuario

i. medir la luminiscencia de un sensor seco S1 a partir de la pluralidad de sensores Sn fabricados del mismo modo, dando lugar a un valor de calibración en seco en el lugar del usuario;

ii. obtener un valor de medición del sensor S1 en contacto con el medio de muestreo acuoso; y

iii. calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio de muestreo acuoso a partir del valor de medición de la luminiscencia, el valor de calibración en seco en el lugar del usuario y la relación húmedo a

seco obtenida in situ en fábrica.

3.

Método conforme a la reivindicación 2, por el cual la relación húmedo a seco comprende una característica relativa y un valor proporcional y además

en la etapa a) iv. Obtener a partir de los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica la característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y deducir el valor proporcional de los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica y de los valores de calibración en seco in situ en fábrica, cuyo valor proporcional se toma como el valor proporcional para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor de luminiscencia, el valor de calibración en el lugar ocupado por el usuario, la característica relativa y el valor proporcional obtenido in situ en fábrica.

4.

Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fá

brica LmD*

en la etapa a) iii. elegir la concentración del analito S para al menos uno de los medios de calibración acuosos de manera que después de la humectación y el equilibrio solamente esté presente la especie B y medir los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, en la etapa a)iv. calcular un valor proporcional RmD/W a partir de los valores de calibración en seco y en húmedo in situ en fábrica LmD* y LmW* en la etapa b)i. obtener un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LmD, y en la etapa b)iii. calcular un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LmD y el valor proporcional RmD/W y determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

5.

Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una especie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, y el cociente V de la concentración (cB) de la especie B relativo a la concentración total (cD) del colorante luminiscente (V=cB/cD), donde cD es la suma de la concentración (cA) del colorante luminiscente presente en forma de especie A y la concentración

(cB) del colorante luminiscente presente en forma de especie B, siendo conocidos y estando entre 0,1 y 0,9, preferiblemente entre 0,3 y 0,7. en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* en la etapa a) iii. elegir la concentración del analito S para al menos uno de los medios de calibración acuosos de manera que después de la humectación y el equilibrio solamente esté presente la especie B y medir los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, en la etapa a)iv. calcular un valor proporcional RmD/W a partir de los valores de calibración en seco y en húmedo in situ en fábrica LD* y LmW* en la etapa b)i. obtener un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LD, y en la etapa b)iii. calcular un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LD y el valor proporcional RmD/W y determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

6.

Método conforme a la reivindicación 3, que comprende en la etapa a)i. seleccionar sensores So, en los cuales el colorante luminiscente está presente en forma de una especie A y una es

pecie B, el analito o un análogo de analito unido a la especie B pero no a la especie A, y el cociente V de la concentración (cB) de la especie B relativo a la concentración total (cD) del colorante luminiscente (V=cB/cD), donde cD es la suma de la concentración (cA) del colorante luminiscente presente en forma de especie A y la concentración (cB) del colorante luminiscente presente en forma de especie B, siendo conocidos y estando entre 0,1 y 0,9, preferiblemente entre 0,3 y 0,7. en la etapa a) ii. obtener los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* en la etapa a) iii. medir la intensidad de luminiscencia de los sensores So para al menos dos medios de calibración acuosos con concentraciones conocidas cSi del analito S dando lugar a al menos dos valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LiW*, y en la etapa a)iv. obtener las características relativas y los valores de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW * de los sensores So a partir de los pares de valores LiW*, cSi conforme a LmW*= LiW *(1+(q-1)/(1+cSi/Kd)), donde los valores q y Kd son conocidos, y se obtienen por ejemplo de la calibración in situ en fábrica, y calcular a partir de ello la característica relativa válida para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo, y calcular un valor proporcional RD/W a partir de los valores de calibración en seco in situ en fábrica LD* y los valores

de calibración en húmedo in situ en fábrica LmW*, que dan en la etapa b)i. un valor de calibración en seco en el lugar ocupado por el usuario LD, y en la etapa b)iii. un factor de gradación a escala para el usuario LmW a partir de LD y el valor proporcional RmD/W y permiten determinar la concentración de analito no volátil a partir del valor de luminiscencia, el factor de gradación a escala en el lugar ocupado por el usuario LmW y la característica relativa.

7.

Método conforme a la reivindicación 2, que comprende en la etapa a) iv. Obtener a partir de los valores de calibración en húmedo y en seco in situ en fábrica una característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor de luminiscencia, el valor de calibración en el lugar ocupado por el usuario y la característica relativa obtenida in situ en fábrica.

8.

Método conforme a la reivindicación 2, que comprende en la etapa a) iv. Calcular los valores proporcionales de los valores de calibración en húmedo y en seco in situ en fábrica; y obtener una característica relativa de los sensores So, que se tome como característica relativa para todos los sensores Sn fabricados del mismo modo; y en la etapa b) iii. Calcular un valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario a partir del valor de calibra

ción en seco en el lugar ocupado por el usuario y del valor de luminiscencia; y calcular la concentración del analito no volátil presente en el medio acuoso de muestreo a partir del valor proporcional en el lugar ocupado por el usuario y la característica relativa.

9.

Método conforme a la reivindicación 7 o bien 8, que se caracteriza por que al menos m sensores son seleccionados in situ en fábrica y se obtienen m valores de calibración en seco ti con i=1 a m, y por que se toman al menos uno de n>2 medios de calibración acuosos distintos, utilizándose cada medio de calibración al menos una vez, de manera que se obtienen k>n valores de calibración en húmedo kij con j=1 a n, y que los valores proporcionales kij/ti se calculan a partir de los valores individuales ti, kij y se deduce la característica relativa del sensor a partir de esos valores proporcionales.

10.

Método conforme a la reivindicación 5 o bien 6, que se caracteriza por que para el ajuste de un cociente conocido, predeterminado V =cB/cD de las especies A y B, con cD=cA+cB, en los sensores Sn, el sustrato que lleva el indicador o el sensor se lava con un medio de lavado acuoso, que contiene el analito o un análogo de analito en una concentración adecuada, habiendo establecido el cociente predeterminado después del equilibrio y habiéndolo fijado mediante el secado del sustrato portador del indicador o el sensor.

11.

Método conforme a la reivindicación 10, que se caracte

riza por que para sensores de pH se utilizan ácidos, bases

o tampones con pH conocidos como medio de lavado.

12. Método conforme a la reivindicación 10 ó 11, que se caracteriza por que para cada sensor en seco de una plurali

5 dad de sensores Sn fabricados del mismo modo, el cociente de las especies A y B es esencialmente el mismo y constante todo el tiempo.

13. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se caracteriza por que los sensores ópticos se

10 guardan en estado en seco in situ en fábrica y en el lugar del usuario.

14. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que se caracteriza por que al menos un sensor óptico se emplea para la determinación de un analito no volátil en

15 combinación o en una configuración conjunta de sensores para determinar la concentración de analitos volátiles, como el O2 o el CO2.