CN101213439A - 测定非挥发性分析物浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用光学传感器测定水性样品介质中的非挥发性分析物浓度的方法，所述光学传感器包含发光染料，在用户处利用单点校准法校准。为能使用户完全免去所有的校准介质，在用户处用与水性或血类样品介质接触的传感器获得发光测量值，该值参比于在工厂处获得的相对特性和在用户处获得的干校准测量值，由这些数据推断非挥发性分析物的浓度。

Description

测定非挥发性分析物浓度的方法

本发明涉及一种使用光学传感器测定存在于水性样品介质中的非挥发性分析物浓度的方法，所述光学传感器包含其发光取决于分析物浓度的发光指示剂染料，在用户处利用单点校准法校准。

技术领域

测定液体中的非挥发性物质(例如离子物质，如H⁺(pH)、Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺、Cl^-，中性或带电分子，如葡萄糖、尿素或乳酸)的分析仪应用于医学、环境和工业技术。临床诊断尤其严重地依赖用于测定生物流体(如尿液、血浆、血清，尤其是全血)中的所谓“危症护理分析物”的分析设备。这类系统经常包含不同的传感元件，用于测定各自的参数。这种传感元件可用于单一测定(单用途)，或重复用于多重测定(多用途)。

这种传感元件经常使用电化学传感技术或光化学传感技术，用于在临床诊断中测定气体参数、pH值、离子值或代谢值。优选地，测定不同分析物的多种传感元件被包裹成“套筒”(参见例如Ann.Biol.Clin.61，183-91，2003)。

临床诊断需要高度精确的检测结果。另外，单个检测步骤应提供大量物质的检测值。而且，期望检测结果以最小延迟提供，并且每个检测值的成本低。常常期望检测紧密邻近患者进行，例如“在床边”、在医生办公室或在危症监护病房。

因此，在实际检测前包含多种校准介质的耗时校准步骤将是不可接受的，尤其是在涉及“单用途”传感器的情况下。因为小型化装置和传感元件的成本必须保持得比较低，所以需要昂贵装置、复杂传感元件或多种流体和其它供应品的方法无法令人满意。

电化学传感器可基于几种不同测量原理之一，例如电势、电流或电导测量原理。所有原理都要求使用参比电极，经常应用于在测量未知样品前需要和湿校准液接触的配置中。

美国专利第4,734,184号(Burleigh)等)公开了一种用于监测血液中存在的大量气体和离子的浓度的电极装置。尽管该装置干贮以促进延长的保存期，但电极在使用前要彻底水合(润湿)。

美国专利第4,654,127号(Baker等)公开了一种装配有物质选择性传感器和可旋转多室容器的传感装置，校准溶液和样品溶液包含在可旋转多室容器中，但在分开的室中。多种化学物质可通过该装置检测。而且，这些商品化传感器在高湿度包装(即基本湿的)中储存。此包装方法具有限制这些传感装置的储存期限的作用。

美国专利第5,112,455号(Cozette等)公开了一种装配有参比电极和至少一种基本干贮的传感器的传感装置，所述传感器能够在传感器达到完全平衡的润湿之前对预先选定分析物的浓度变化表现出响应。但是，传感器和参比电极在电极达到平衡的“润湿”态之前必须接触校准液，以由这种固态电极获得有意义的分析信息。

光化学传感器可基于几种不同光学测量原理中的一种，例如荧光、吸光度或反射比测量原理。它们以众多非常不同的测量配置应用，与电化学传感器相反，光学传感器典型地不需要参比电极或参比传感器。

光化学传感器或光生物化学传感器典型地由一层或多层施加在透明载体或基质上的无机物和/或有机物、优选聚合物组成，至少一层含其光学特性(吸光度、发光)随样品介质中包含的特定分析物的浓度变化的染料。光生物化学传感器含至少一种生物化学物质或天然生物物质，例如酶。载体可为平的、圆柱状的或任意其它形状的。例如，所述层可应用于微量滴定板的“孔”、光纤维束的尖端或者单光纤或光导结构上。

光化学传感器通常能够可逆地并经常持续地测量。此常规的例外是携带某些酶的生物化学传感器。这些测量间断地并经常地消耗底物或反应物(例如氧)，即它们或其底物或反应物被消耗或改变，必须复原用于以后的测量。因为传感器一般具有有限的寿命，所以它们必须以一定的间隔被替换。

使光化学传感器与样品介质直接接触，当光化学传感器曝光时，提供有关样品介质中存在的特定目标分析物的光学可读取信息(例如浓度、活性或分压)。

大部分光化学传感器需要用校准介质进行几次校准测量，分析物浓度分布在整个测量范围内。需要的校准测量次数取决于相关测量范围中期望的测量精度、随不同应用变化的精度和范围。例如，血液中生理性钠水平的测量典型地覆盖每升至少120-160mM，因此需要在该范围内的校准测量。

至少就用户而论，为了最小化校准测量次数，并使它们快速和简单，可能在工厂处获得一个或多个传感器特性(例如通过校准生产批次或批量)，并提供相关数据连同适宜形式的传感器。

现有技术水平的装置偶尔在其文件中使用术语“免校准传感器”。实际上没有免校准传感器这种事。新传感器或新设计的或新开发的传感器至少校准1次，或者至少检测1次其一种或多种特性。例如，可能在传感器制造过程中校准生产批次，随后通过可重复的制造技术生产仅具有此已知特性的传感器。而且，可能校准至少1个传感器或1批中代表性数量的传感器，并将测量的特性指定给该批所有的传感器。这要求在1批中足以可重复地制造和/或在批间足以可重复地制造传感器。还要求可重复地制造生产商提供或授权的任意检测装置或设备，以实施测量。这种工厂校准既耗时又昂贵，需要对传感器特性极严谨的控制和伴随的对测量装置或设备的特性的控制。

在此背景下已提议了许多溶液，例如通过时间分辨法或相位分辩法测量多个波长的发光强度或检测光学传感器的发光衰变时间。如下所述，在单系统中非常经常地应用多种方法，原因是缺乏在其各自的浓度范围内对所有目标分析物响应的指示剂分子。

例如，一种使用光化学传感器的这种“免校准”系统在Clin.Chim.Acta 307，225-233，2001中被提议用于血气(PO₂和PCO₂)和血液pH值的“近患者检验”。在该系统中，通过检测固定在膜上的发光染料的发光衰变时间进行PO₂的测定。利用CO₂的直接红外吸收测定PCO₂，避免了使用光学传感器。通过多波长透射测定固定在膜上的比色pH指示剂染料和取出的样品以比色法(使用吸光度原理)测定pH值。使用多种方法的这种系统经常是复杂的和昂贵的。

由美国专利第5,564,419号(Radiometer)还知道通过发光猝灭法检测血样氧含量。该方法使用其发光在氧存在时被猝灭的发光团。样品的PO₂通过检测发光的衰变时间来测定。

与发光衰变时间的检测相比，就光学系统组件的参数而言，发光强度的检测具有更大的问题。对于使用具有长衰变时间(＞500纳秒)的发光指示剂的传感器来说，关于光学检测装置的现有技术水平要求是相当适中的。

不幸的是，对于大量的分析物，尤其是离子和代谢物，无法获得具有长发光衰变时间的简单指示剂或指示剂系统。随着指示剂发光寿命的增加，对众所周知的猝灭物(尤其是O₂)的横向灵敏度也将增加。衰变时间低于100纳秒(ns)的指示剂不受此问题影响，但是，这种短衰变时间的精确度和免校准测定通常需要更昂贵和复杂的设备。现代医学日益要求可紧邻患者使用的低成本、坚固和小型化的分析仪。

由美国专利第5,288,646号(Radiometer)知道通过比色法测定血样的pH值，其中提议使用固定在膜上的比色(不发光)pH指示剂染料进行光度检测，所述膜位于“取样装置”的通道壁上。使用多种分析波长的透射测定是昂贵的，需要校正光学元件特性和光路的变化的计量仪器。因为血液吸收光，所以样品在测量前必须被从光路中去除，例如通过用压力压通道。

在发光指示剂的范围内，已提议(参见美国专利第5,108,932号(Wolfbeis))在一个波长照射，优选在等消光点照射，并在两个不同的光发射波长测量。但是，在光学元件特性完全已知的情况下以多个波长工作或以多个波长测量需要较昂贵的技术。与pH值检测相反，对于大量分析物，无法获得适于多波长法的发光指示剂。

在一个宽波段分析波长测量发光强度特别有优势。与以上提及的技术相比，测量发光强度具有以下优势：检测必需的光学和电子元件的配置相对简单，可用低成本元件实现。在此方面的一个缺点是以下事实：影响发光强度的检测装置光学元件和单个传感器的某些参数将影响检测结果。尽管基本上有可能建立具有稳定元件的光学系统和传感器以及其特性被精确测定的传感器，但就以上要求以及涉及的费用和成本而言这是不切实际的。解决问题的方法大体上是已知的，在于临测量前进行单点校准，在所述校准中确定依赖于个体检测设备的配置和个体传感器元件并影响发光强度的参数。

按照现有技术水平，例如对基于以宽波段分析波长测量发光强度的光学传感器而言，有可能通过制造过程中的校准测量获得相对特性(即不依赖于个体检测系统的特性)，并以描述特性曲线的数学等式参数(系数)的形式提供此特性连同传感器，用于在用户处的检测系统。参数可以条码的形式提供，或储存在电子、磁性或光学存储介质上。为测定适用于用户检测系统的特性(即有效特性)，需要至少一次另外的发光强度检测。按照现有技术水平，该检测如下获得：利用含至少已知浓度的待测分析物的校准介质，在用户检测系统的传感器设定对应于此已知浓度的发光值，并检测发光，产生用户处的校准值。参比用户处校准值的相对特性将产生有效特性。

对于其中通过用吸收谱带中的光辐射电子激发发光指示剂并使用发射谱带中的发射光强度测定分析物的简单光化学传感器系统，需要在用户处实施至少一次校准测量。

关于此用户处校准，用于含一个或多个光化学传感器和校准介质的单用途检测元件的检测方法和装置是已知的。

在美国专利第5,080,865号(Leiner)中提出了一种单用途检测元件，其包含一个或多个电化学或光学传感器，并包括一种适于给定传感器的校准介质。在检测之前，将检测元件插入到分析仪中，进行校准检测，之后进行样品检测。如果使用采用一种或多种气体(例如O₂和CO₂)进行张力测量的液体，则可同时校准气体和离子传感器。将传感器储存在液体中具有以下优势：传感器已准备好在达到检测温度后立即使用。缺点是传感器储存于液体中时其“储存期限”被限于几个月。特别是对非常灵敏、携带酶的生物传感器就是这种情况。其它缺点在于以下事实：单用途检测元件必须保持在于储存期限中毫无损失的液体中，必须提供传送校准液的流体系统。

在美国专利第5,351,563号(Karpf)中提议将液体储存介质(其同时是pH和离子传感器的校准介质)整合入单用途检测元件中。储存介质被用水蒸气饱和的校准气体替换，此后进行校准和随后的样品检测。

美国专利第5,166,079号(Blackwood等)公开了一种用于竞争性免疫测定的方法和测试装置，所述竞争性测定使用用荧光部分标记的结合配偶体。在干态时，测试装置的试剂层包含目标分析物(例如抗原)的固定化结合配偶体(例如抗体)的免疫复合物和标记分析物的缀合物。实际上，在将样品施加于测定元件之前以光学方法读取存在于试剂层中的标记。当含目标分析物的液体样品已加至测试装置时，存在于样品中的分析物与试剂层中标记分析物的缀合物竞争固定化结合配偶体上的可用结合位点。标记的分析物由该处解离，被样品分析物以适宜地等于样品分析物和标记分析物的相对量的比率替换。试剂层的第二个读出信号在样品已施加时获得，该信号与样品中分析物的量成反比。获取第二个信号与第一个信号的比率，并与已知量的分析物的该比率对比，以确定样品中分析物的量。根据美国专利5,166,079，其中公开的方法允许补偿设备和元件与元件间试剂层厚度的变化，产生更好的精度。重要的是，美国专利5,166,079的方法是基于对所述层中荧光标记分析物的替换，该替换通过辐射探测，但样品中的分析物不能同样地影响荧光部分的荧光特性。

因此，目前仍需要一种方法，其整合具有必需的长储存期限、可预知的和可重现的光响应以及“润湿”特性的传感装置、优选光化学传感器，该方法允许获得节省成本的和精确的分析物浓度测定。这种测定理想地在5分钟或以下、最优选在约1分钟内进行。

基本原理

为能够更好地理解本发明，将总结发光物质A的发光信号强度S、其浓度cA及给定检测系统的参数之间的关系，然后使用测定样品pH值的具有分子内电荷转移(ICT)染料的光学传感器的例子描述本领域已知的湿校准。

为与有关湿校准的公开等式相一致，用字母S指示发光强度。与其相反，本发明的描述将在等式及其推导中对发光强度使用字母L。

Parker等式描述了在给定激发波长(ex)和发射波长(em)时A物质的发光强度S及其浓度cA的关系：

(a)S＝I₀k_exek_emεΘdcA

其中I₀是光源强度，k_ex和k_em是激发侧或发射侧的光学元件的传输参数，e是检测器的灵敏度，全部都取决于光波长λ。依赖于发光物质的光物理参数是摩尔吸光系数ε、发光量子产率Θ和分析物浓度cA。d是含所述物质的介质中的平均光径长。

对于给定的A物质，参数I₀、k_ex、k_em、ε、Θ和d的乘积可合并成新参数k_A

(b)k_A＝I₀k_exek_emεΘd

得到

(c)S＝k_AcA

光学元件的特性(例如光源的强度和光谱、滤光片的光谱透射特性、检测器的光谱灵敏度等)和光学装置的特性(光径长)在一定限度内和随着时间而变化。这将使参数k_A在传感器之间和装置之间具有一定变化，这些变化也将随时间(运行持续时间)改变。在进行需要高度的精确性和可重复性的检测时这些变化必须被考虑进去。最小化这些变化是昂贵的，因此在考虑低成本检测系统的情况下在经济上是不可行的。

用于pH测定的众所周知的光化学传感器使用ICT染料羟基芘三磺酸(HPTA)(Ann.Biol.Clin.61，183-91，2003)。

传感器的校准曲线可得自pH值与质子化(AH)和去质子化(A-)染料物质浓度之间的质量作用定律的简单关系：

(d)pH＝pK+log(cA^-/cAH)

当在水性环境中接近470nm激发时，质子化形式于520nm不产生发光。染料的总浓度cD是各个染料物质浓度的和：

(e)cD＝cA^-+cHA

在高pH值(即pH＞pK+3)时，不存在质子化染料物质。因此，在高pH值时cD＝cA^-。

以由等式(e)产生的表达式cHA＝cD-cA^-替换等式(d)中的cHA，简化产生等式：

$\left(f\right),\frac{c{A}^{-}}{\mathrm{cD}}=\frac{1}{1+{10}^{\mathrm{pK}-\mathrm{pH}}}$

等式(f)等价于等式(g)

$\left(g\right),\frac{k_{A}c{A}^{-}}{k_A\mathrm{cD}}=\frac{1}{1+{10}^{\mathrm{pK}-\mathrm{pH}}}$

根据等式(c)还等价于等式(h)

$\left(h\right),\frac{S}{S_m}=\frac{1}{1+{10}^{\mathrm{pK}-\mathrm{pH}}}$

其中S表示给定pH值的发光强度，S_m表示没有质子化物质HA时的发光强度。最后，等式(h)移项得到传感器的校准曲线(公开于Ann.Biol.Clin.61，183-91，2003)。

$\left(i\right),=S=\frac{S_m}{1+{10}^{\mathrm{pK}-\mathrm{pH}}}$

校准曲线(等式i)是一个反曲函数，特征在于发光强度从低pH值到高pH值增加，拐点(染料的pK值)以生理pH中值为中心，其中S是随pH变化的相对发光强度，S_m是在高pH值时观察到的最大强度，pK是指示剂的质子解离常数的负对数。

对于pH解等式(i)得到

$\left(j\right),\mathrm{pH}=\mathrm{pH}-\log (\frac{S_m}{S}-1)$

由该式可知，如果参数S、S_m和pK是已知的，则可计算pH值。

为测定pH值，在用户处由与水性样品接触的传感器的发光测量值获得发光强度S。pK值通过工厂校准获得。用户处的S_m值是未知的，必须在用户处由与已知pH值的水性校准溶液接触的传感器的发光测量值确定。在用户处测定S_m的必要性由等式(g)显而易见。只有形成参数k_A的量相等时在分数的分子和分母中的参数k_A才相同。这些量可由(b)得出。如果在使用同一个测量配置测定S之前或之后不久测定S_m，则基本上保持相等性。

S_m例如可在用户处通过检测与高pH值水性校准介质接触的传感器的发光来测定。

优选地，通过检测与水性校准介质接触的传感器的发光强度S_cal以及通过由等式(k)计算S_m获得S_m，所述介质的pH值(pH_cal)接近由工厂校准已知的pK值：

(k)S_m＝S_cal(1+10^pK-pHcal)

US 6,211,359(He等)公开了用基于光诱导电子转移(PET)作用的发光指示剂测定钾的光学传感器的相似特性。US 6,211,359(He等)的等式6还可应用于其它离子的情况，此外还考虑了可能存在的干扰离子。US 6,211,359的等式7用于获得待测离子的浓度，与等式(j)类似。US 6,211,359的等式8利用单点校准用于得到未知的S_m值，与等式(k)类似。

US 6,171,866(He等)公开了用基于PET作用的发光指示剂测定钙的光学传感器的相似特性。US 6,211,359的等式6和US 6,171,866的等式4是等价的，例外之处是等式4未考虑干扰离子，浓度和K_d值以对数形式给出。

定义

为了防止由于先前公开的文件中各不相同的定义而出现误解，对众多基本概念给出以下定义。

分析物：在下文中分析物指在水性样品介质中要定性或定量测定的物质。术语非挥发性分析物将与挥发性分析物(即在标准条件下为气态的物质，例如O₂或CO₂)区别使用。非挥发性分析物包括例如离子物质，如H⁺(pH)、Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺、Cl^-，中性或带电分子，如葡萄糖或乳糖。光学传感器中分析物和发光染料之间的相互作用可为直接的或间接的。

“直接相互作用”指分析物接触到染料，两种物质实际上彼此反应。

“间接相互作用”指分析物不与发光染料直接接触，和/或染料的发光响应不是缘于化学或物理的分析物-染料相互作用。属于生物化学传感器类别的酶传感器提供了实例。就该实例而言，一种或多种酶与分析物反应，产生反应产物，该反应产物又与指示剂染料直接反应。在某些已知的生物传感器中，酶反应引起例如pH值改变，该改变可通过pH敏感性指示剂染料测定。实例可见于Biosensors&Bioelectronics 10，1995，653-659(Konicki等)。

另一类间接相互作用发生在基于荧光共振能量转移(FRET)原理(参阅下文)的测定中，按照该原理，分析物与接纳体染料相互作用，并检测供体染料的发光。

不管是否存在分析物和发光染料的直接或间接相互作用，与经典的pH吸收染料类似，这些发光染料随后被叫做发光指示剂染料。

除非具体提及，否则术语“分析物”连同其与发光染料的相互作用应包括如上定义的直接和间接相互作用两者。例如，如果使用为H⁺和pH敏感性染料的非挥发性分析物，则发生分析物和染料的直接相互作用。但是，如果葡萄糖是分析物，使用的酶传感器利用检测pH变化(在葡萄糖被酶转变时发生)的原理，则与染料相互作用的物质是H⁺，而不是葡萄糖。

因此，在本文中，类似于“分析物与指示剂染料反应”、“分析物与指示剂染料相互作用”、“分析物结合染料”的陈述和相似的陈述应包括如上定义的直接和间接的分析物-染料相互作用。

样品介质：样品介质典型地是具有溶解盐的水性溶液，其另外可包含有机组分、生物化学组分或生物组分。待测的样品介质可来自环境技术领域(水和废水样品)、生物技术领域和医学领域(血液、血清、血浆、尿样或其它体液样品)。

光学传感器：在本发明的应用中，术语“光学传感器”指样品介质和检测装置的光学元件之间的界面；具体地说，其指施加于透明载体或基质上的一层或多层无机物和/或有机物，优选聚合物，至少一层含其光学特性(吸光、发光)随样品介质中包含的特定分析物的浓度变化的染料。该界面也称为光极(optode或optrode)。

检测系统或检测装置的元件，例如光源、检测器、滤光片、电信号放大器和计算部件不是光学传感器的组成部分。

本发明涉及用于检测在标准条件下为非挥发性(非气态)的物质的光学传感器，所述物质例如为无机离子(例如H⁺、Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺、Cl^-、NO3^-、Fe²⁺等)、电中性或带电分子(例如乳糖、葡萄糖、尿素、肌酐、胺、醇)，它们优选溶解在水性样品介质中。

本发明不涉及用于检测在标准条件下为气态的物质(例如O₂、CO₂、SO₂等)的光学传感器。具体地说，本发明不涉及光学气体传感器，即在干态下和与气态样品介质接触的情况下对分析物(例如O₂、CO₂)的分压变化响应以光信号变化的传感器。本发明也不涉及用于溶解在水性样品中的这种挥发性分析物的传感器，所述水性样品与所述传感器接触。

但是，在用于非挥发性和挥发性分析物的独立传感器联合使用时，可使用本发明。但是，在此情况下，本发明仅在用于非挥发性分析物的传感器方面可用。

发光光学传感器：本发明优先涉及发光光学传感器。此传感器在至少一层中包含至少一种发光染料(也称为发光指示剂染料)。

干光学传感器：该术语涉及依照以上定义的光学传感器，其中组成传感器的所有传感器材料都是干的(即基本上无水)。该传感器在储存过程中和/或检测应用前处于该状态。为在功能上活化传感器，其必须接触水或含水的介质，例如水性活化介质、样品介质或校准介质。

湿光学传感器：该术语涉及依照以上定义的光学传感器，其接触水性介质，例如水性活化介质、样品介质或校准介质。

活性：离子物质的活性a是其浓度c及其活性系数的乘积。活性取决于离子强度。在低离子强度活性系数为1，因此c＝a。根据应用，技术人员将例如通过使用Debeye-Hückel等式计算适宜的其它值。如果在下文中提到浓度测定，则也包括活性测定。

测量系统：除了如上定义的光学传感器自身以外，该术语还涉及应用光学传感器所需要的所有光学、电子和机械元件，例如产生激发辐射的光源、检测测量辐射强度的检测器、滤光片、电子信号放大器、计算部件和测量池(例如传感器连接至其壁的比色皿、具有进口并可能具有出口以及具有传感器连接至其壁的测量通道的池或微量滴定板)。

测量装置或装置：是测量系统所有元件的总称。优选地，测量池(含光学传感器)不是装置的主要部分，但可与传感器一起被替换。

(响应)特性或特性函数：所述特性描述了测量辐射的检测强度(例如发光强度)和待测定分析物的浓度或活性之间的函数关系。

对于光学传感器而言，特性是非线性的，即在完整的动态检测范围内发光强度和分析物浓度之间的函数关系不能由直线以足够的精确度代表。根据需要的检测范围宽度和需要的精确度，对于某些应用有可能以直线代表特性的至少一部分。

通过检测传感器发光，确定具有不同已知浓度的待测定物质的一系列水性校准介质的特性，这些已知浓度分布在待测定分析物的预期浓度范围内。由这些检测的校准值获得表格或图形形式、优选为数学等式形式的特性。在实际检测中，使用和样品接触检测的发光强度和特性函数计算分析物的浓度。

有效特性：对给定传感器连同给定测量系统适用的特性。将由工厂处测量系统获得的有效特性参比由工厂处测量系统获得的校准值产生相对特性。

相对特性：指与具体测量系统无关的特性。参比于所获用户特定测量系统的校准值的相对特性提供了适用于用户特定测量系统的有效特性。典型地，相对特性(也参阅下文“有效特性”的定义)在工厂处获得，并可参比湿对干校准值(也参阅下文“湿对干关系”的定义)。

有效和相对特性可通过计算由一个转变为另一个，前提是：(a)对于适用有效特性的测量系统，至少一个校准值是已知的，(例如与已知分析物浓度的介质接触的传感器的测量辐射强度)，和(b)用于获得有效特性和相对特性的测量系统以相同方式建立。

“湿对干关系”：就本申请而言，“湿对干关系”是允许使用均在用户处检测的用户处干校准值和发光测量值在用户处计算非挥发性分析物浓度的关系。“湿对干关系”典型地来源于工厂处的干和湿校准值，其获自使用来自生产批次或批量的代表数目的单个传感器进行的检测。然后，这些工厂处的干和湿校准值产生“湿对干关系”，其被视为对代表性传感器所来自的完整生产批次有效的关系。

“湿对干关系”例如可为相对特性，或相对特性和比值，和/或等等。联系某些典型的但非限制性的实例(参阅下文的实施例1、1.1.、1.2.、1.3.、2、2.1.和2.2.)和实施方案，以下说明书将表明如何能使用“湿对干关系”进行非挥发性分析物浓度的测定。

参阅实施例1，具体地说是实施例1.1.、1.2.和1.3.(下文)，“湿对干关系”包括参比于在工厂处获得的湿校准值和比值的相对特性。

参阅实施例2.1.(下文)，“湿对干关系”包括参比于在工厂处获得的干校准值的相对特性。

参阅实施例2.2.(下文)，“湿对干关系”包括参比于干校准值的相对特性，所述干校准值基于在工厂处获得的比值。

校准：指特性确定。在校准光学传感器时，使其与测量系统中的校准介质接触，该介质含不同的已知浓度的待测分析物。参比于校准介质中已知浓度分析物的传感器的光学可检测响应，例如发光强度，用作待测样品中未知浓度的分析物的参比值。

在样品测量前，传感器可为湿的或干的。如果是干的，则其必须由校准介质活化。在此情况下，校准介质也是活化介质。还有可能使用储存介质(如果提供的话)作为活化介质以及校准介质。其实例可见于US 5,080,865 A和US 5,658,451A。

单点校准：获得干传感器的发光测量值并视为校准值。由用给定测量系统获得的校准值和由以相同方式建立的测量系统获得的相对特性，可得到对给定测量系统有效的有效特性。

测量和计算：在测量期间，使光学传感器与含待测定浓度的分析物的样品介质接触。分析物的浓度参比光学传感器的有效特性由检测的传感器信号(例如发光强度)获得。

工厂处校准：在工厂处用专用的水性校准介质确定特性参数(如果使用下文提到的等式7，则例如为参数K_d和q)是众所周知的，不是本发明的主题。

如果已在工厂处使用合适的测量系统实施一些校准步骤，则在用户处可能仅需要1个校准步骤(单点校准)，前提是使用相同设计的测量系统。工厂处校准的必要条件是在工厂处获得的特性在传感器使用前一直不改变(或至少不以无法预见的方式改变)；改变例如可在运输期间或储存期间发生，原因在于温度作用或化学或物理老化或分解。

发光指示剂染料：在给定范围内，术语发光指示剂染料、发光染料或发光-光学染料指其发光响应(例如发光强度、发光衰变时间)通过直接或间接相互作用依赖于分析物的浓度或活性的所有物质。

典型地，发光指示剂染料固定在光学传感器中，优选地固定在至少一个传感器层中。

根据染料和染料系统的类型，分析物浓度导致的发光响应受到非常不同的化学-物理和/或光物理机制影响。最要的染料类型是：

A)PET染料

B)ICT染料

C)FRET系统(能量转移系统)

如上文已定义的，“直接相互作用”指分析物接触染料并与其反应。

“间接相互作用”指分析物不与发光染料直接接触和/或染料的发光响应不是缘于化学或物理的分析物-染料相互作用。

PET染料：其发光被光诱导的电子转移(PET)完全地或部分地猝灭的指示剂染料。发光猝灭将降低发光量子产率、发光强度和发光衰变时间。

在PET指示剂染料中发生由电子供体至电子激发的电子接纳体的电子转移。供体和接纳体经间隔体共价连接。间隔体的功能是电子去偶供体和接纳体。接纳体是发光物质。供体是能够(优选可逆地)结合分析物的受体。如果结合的物质是离子物质，则反应性组分也叫做离子载体。在热动力平衡反应中，分析物通过结合受体与指示剂染料可逆地反应。

由发光特性(例如发光强度、发光衰变时间)可推断分析物浓度，例如通过评价紫外(UV)、可见(VIS)或近红外(NIR)范围中的可见或用光检测器可测量的发射光强度。

PET指示剂染料具有不结合分析物S的至少一种A物质和结合分析物S的至少一种B物质，两种物质和分析物在一定时间后处于热动力平衡状态。B物质中的PET作用通过结合分析物完全地或部分地被封闭，导致B的发光强度具有最大值。A物质中的PET作用未被封闭，导致其发光强度最小。

因为PET指示剂染料的染料组分基本上仍未受分析物结合的影响，所以技术人员会通过以下事实识别PET指示剂染料：在给定化学环境中，两种物质的染料吸收和发射光谱就光谱位置而言基本上相当。因为总光谱来源于两种物质光谱的相加，所以分析物的结合将改变激发和发射光谱的发光强度。

实例可见于AP de Silva等，Coordination Chemistry Reviews 205，2000，41-57(PET染料的综述)，He等，Anal.Chem.75，2003，549-555，图2(Na⁺的PET指示剂染料)和J.Am.Chem.Soc.125，2003，1468-1469，图3(K⁺的PET指示剂染料))。

ICT染料：与PET指示剂染料相反，在ICT染料(ICT＝分子内电荷转移)中没有两个部分(染料和受体组分)的电子解偶。因为分析物的结合显著改变染料组分的发色团系统，所以技术人员将根据以下事实识别ICT染料：在给定化学环境中，两种物质的染料组分的吸收和发射光谱就光谱位置而言是不同的。因为总光谱来源于两种物质光谱的相加，所以分析物的结合将改变总光谱中两种组分光谱的相对比例。

实例可见于Molecular Probes，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Products，2002，第9版，第21章，图21.19(SNARF-4F)和图21.24(HPTS)。

FRET染料：FRET指示剂染料系统(FRET＝荧光能量共振转移)基本上由两种染料一发光供体染料和接纳体染料组成。供体染料的发光经非辐射能量转移被接纳体染料猝灭。发光猝灭改变发光强度和发光衰变时间。接纳体染料与分析物直接或间接反应，因此改变其吸收值(吸收光谱)和能量转移速率。由供体染料的发光强度可对分析物进行推断。发生FRET的其中一个条件是接纳体染料的至少一种物质的吸收光谱至少部分地与供体染料发射光谱重叠。FRET系统的一个优势在于以下事实：技术人员具有许多已知的、非发光指示剂染料(尤其是pH敏感型吸收染料)的选择，可经更灵敏的发光检测测定分析物。实例可见于US 5,232,858 A(Wolfbeis等)、US 5,942,189 A(Wolfbeis等)和Anal.Chim.Acta，1998，364，143-151(Huber等)。

发明目标

基于以上测定水性样品介质中的非挥发性分析物浓度或pH值的方法，本发明的目标是提出改善和简化，这些改善和简化允许在用户处测定非挥发性分析物的浓度(包括pH值)，无需使用校准介质。典型地，测量方法只基于使用仅一个激发和发射波长或谱带检测发光强度。

该目标通过提供以下几项实现：用与水性样品介质接触的传感器在用户处获得发光测量值，该测量值参比于在工厂处获得的湿对干关系(例如相对特性)和在用户处获得的干校准测量值，并由这些数据推断pH值和非挥发性分析物的浓度(包括pH值)。

因此，将首次实现基于测量发光强度的测量方法加校准步骤，其在用户处将不需要校准介质，即便仅使用1个激发和发射波长。本发明利用了以下令人惊讶的事实：可改造测定许多非挥发性(非气态)物质的光学传感器，以使用在干态表现出发光的发光染料(如果被适宜地激发的话)。

本发明的目标是如权利要求1定义的方法。优选的实施方案是从属权利要求的目标。

本发明的目标是一种使用光学传感器测定水性样品介质中存在的非挥发性分析物浓度的方法，所述光学传感器含发光指示剂染料，在用户处通过单点校准法来校准，所述方法包括

-在用户处检测干传感器的发光，获得用户处的干校准值，

-在用户处获得与水性样品介质接触的传感器的发光测量值，和

-由发光测量值、在工厂处获得的湿对干关系和用户处的干校准值推断非挥发性分析物的浓度。

具体地说，本发明的方法包括

a)在工厂处

i.由多个以相同方式制造的干传感器S_n选择代表性数量的干传感器S₀；

ii检测各个选定干传感器S₀的发光，获得工厂处的干校准值；

iii.随后，在与至少两种水性校准介质接触后检测各个选定传感器S₀的发光，所述校准介质具有不同已知浓度的非挥发性分析物，获得工厂处的湿校准值；

iv.由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值获得传感器S₀的湿对干关系，该湿对干关系被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的湿对干关系；

b)在用户处

i.检测多个以相同方式制造的传感器S_n中的干传感器S₁的发光，获得用户处的干校准值；

ii.获得与水性样品介质接触的传感器S₁的发光测量值；和

iii.由发光测量值、用户处的干校准值和在工厂处获得的湿对干关系计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

在本发明的第一种变更方法中，本发明的目标通过提供以下几项实现：

a)在工厂处

i.由以相同方式制造的大量干传感器S_n(即生产批次或批量，乃至如果生产工艺是高度可重复的，则针对一个种类的所有传感器)选择代表性数量的干传感器S₀；

ii检测各个选定干传感器S₀的发光，获得工厂处的干校准值；

iii.接着，对于每个选定的传感器S₀，使用至少两种具有不同已知浓度的非挥发性分析物的水性校准介质检测发光，所述校准介质随后与传感器接触，获得工厂处的湿校准值；

iv.由工厂处的湿校准值得到传感器S₀的相对特性，其被视为以相同方式制造的所有传感器S_n(即属于相同生产批次)的相对特性；

v.由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值得到比值，该比值被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的对应比值；以及

b)在用户处

i.测量以相同方式制造的多个传感器S_n中的一个干传感器S₁的发光，获得用户处的干校准值；

ii.用与水性样品介质接触的传感器S₁获得发光测量值；和

iii.由发光测量值、用户处的干校准值、相对特性和在工厂处获得的比值计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物浓度或pH值。

本发明的第一个变更与最初描述的已知方法的不同之处在于多出的几点。因此，在工厂处的校准当中，除了相对特性以外，还获得工厂处的干校准值和工厂处的湿校准值的比值。在用户处，在实际样品检测前仅需要1次干态传感器的检测，以便获得用户处的干校准值，该干校准值允许由样品的测量发光值连同均在工厂处针对整个生产批量的传感器测定的相对特性和比值，测定水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

在本发明的另一个变更中，特性得自工厂处的湿校准值，该湿校准值参比干校准值，因此获得参比于干校准值的相对特性，该变更与前述变更从步骤a)iv.起在以下范围内不同：

在工厂处

-由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值得到传感器S₀的相对特性，该相对特性被视为对相同方式制造的所有传感器S_n有效；和

在用户处

-由发光测量值、用户处的干校准值和相对特性计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

本发明的该变更还在许多方面与最初描述的已知方法不同。因此，在工厂处校准过程中，获得工厂处的干校准值，将该值输入到相对特性的计算中。在用户处，在实际样品检测前仅需要1次传感器干法测量，以便获得用户处的干校准值，使得可以由测量发光值连同在工厂处获得的相对特性和用户处的干校准值确定存在于水性样品介质中的非挥发性分析物的浓度。

在本发明的又一个变更中，由工厂处的干和湿校准值计算比值，然后由这些比值获得相对特性，该变更与上述变更从步骤a)iv.起在以下范围内不同：

在工厂处

-由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值计算比值；和

-由该比值获得传感器S₀的相对特性，该相对特性被视为对以相同方式制造的所有传感器S_n有效；和

在用户处

-由用户处的干校准值和发光测量值计算用户处的比值；和

-由用户处的比值和相对特性计算水性样品中存在的非挥发性分析物的浓度。

本发明的该变更还在许多方面与最初描述的已知步骤不同。因此，在工厂处校准期间，获得工厂处的干校准值，通过计算比值使工厂处的湿校准值与该干校准值相关联。由这些工厂处的比值获得相对特性。在用户处用干传感器进行发光测量，获得用户处的干校准值，通过计算用户处的比值使由与样品接触的传感器获得的发光测量值与该干校准值相关联。由用户处的比值和相对特性确定水性样品中存在的非挥发性分析物的浓度。

根据本发明，用于测定非挥发性分析物的光学传感器可与用于测定挥发性分析物(如O₂或CO₂)浓度的传感器组合使用，或者以接合传感器配置使用。气体传感器和用于非挥发性分析物的传感器例如可组合在单用途测量装置中，例如为传感器阵列的形式。气体传感器被认为是“免校准的”，条件是测量利用发光衰变时间进行。借助于校准气体，也有可能进行单点校准。

为利于理解本发明，湿校准尽管在本领域是已知的，但仍随后针对采用PET染料的光学传感器的案例更详细地描述。以下等式可直接用于PET pH指示剂染料。关于基于PET作用的用于Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺的指示剂染料，参见例如US 5,981,746 A、US 6,211,359 B1和US6,171,866 B1。

给定等式在某些限制下还可用于ICT pH指示剂染料，具体地说是用于这种染料：其中通过适宜地选择滤光器，可激发仅一种物质，或者其中可检测仅一种物质的发光。响应信号将根据分析物结合时测量的发光是增加还是降低而改变。原则上，给定等式还可应用于以下的ICT pH指示剂染料：其中通过适宜地选择滤光器，可特异性地不激发两种物质中的任一种，也不检测其发光，例如在光谱重叠时。在此情况下数学表达式的复杂性增加。

根据指示剂染料的热动力平衡常数K_d和分析物S的浓度，指示剂染料将具有不结合分析物S的A物质和结合分析物S的B物质。

可逆的结合由质量作用定律决定：

$\left(1\right),B\stackrel{K_d}{\↔}A+S$

解离常数K_d取决于温度和指示剂染料的物理-化学环境，通过等式2以第一近似值给出，

$\left(2\right),K_d=\frac{\mathrm{cA}\·\mathrm{cS}}{\mathrm{cB}}$

c代表浓度，下标d表示解离常数。K_d以mol/l给出。

因此，浓度cA和cB的比率由解离常数K_d和分析物S的浓度确定。

$\left(3\right),\frac{\mathrm{cB}}{\mathrm{cA}}=\frac{\mathrm{cS}}{K_d}$

pK_d值(等式4)是解离常数以10为底的负对数：

(4)pK_d＝-log(K_d)

PET指示剂的浓度cD(总浓度)是个体指示剂物质A和B的浓度的和。

(5)cD＝cA+cB

指示剂物质B的浓度对指示剂总浓度的比率是：

(6)V＝cB/cD

如果不存在A物质，则比率为1。如果两种物质的浓度相等，则比率为0.5。如果不存在B物质并只有A物质存在，则比率为0。

对于给定的激发和发射波长，PET指示剂的发光强度L是个体物质A和B的发射光强度L_A和L_B的和。

(7)L＝L_A+L_B

L_A和L_B与个体物质A和B的浓度cA和cB成比例，其中L_A＝k_A·CA，L_B＝k_B·cB。比例常数k_A和k_B对测量系统有效，即适用于以相同方式制造的一组传感器中的传感器与适宜测量装置的组合。

对于给定的激发和发射波长，比例常数k_A和k_B包括：

α)传感器参数，例如染料的总浓度cD、传感器中的有效光径长、受辐照面积、A物质和B物质的吸收值和发光量子产率；

β)个体测量系统的参数，例如光源强度、检测器的灵敏度和光学元件的透过率。

特别适合的PET指示剂的特征在于以下事实：k_B优选地大至k_A的至少10倍，甚至更优选地大至100倍，即不结合分析物的A物质的发光强度低至结合分析物的B物质的发光强度的该分数。在下文中，假定k_B＞k_A。根据PET机制，可发现k_A＞k_B的指示剂。如ICT指示剂的情况一样，技术人员因而应必须采用以下等式。

组合等式2、5和6，最终得到描述传感器特性的有效形式的等式：

$\left(8\right),L=L_m(1+\frac{q-1}{1+\mathrm{cS}/K_d})$

其中q＝k_A/k_B，L_m(m指最大强度)是在仅存在B物质时的测量发光强度。L_m还可用作换算因数。

对于给定的激发和发射波长以及对于给定的测量系统，等式8描述了作为分析物浓度函数的测量(有效)发光强度L。

以下考虑因素适用于参数q：

参数q代表比率k_A/k_B，因此代表纯A物质的强度对纯B物质的强度，

q.100是纯A物质的强度，为纯B物质强度的百分率。

以下考虑因素适用于换算因数L_m：

对于给定测量系统，L_mA是传感器的最低可测量强度。例如可通过使传感器与测量介质接触将传感器设定为最低强度，所述测量介质的分析物S浓度与K_d相比非常小(cS＜＜K_d)，这意味着平衡(参见等式1)完全移向左侧。典型地，如果cS小于K_d达10³-10⁴倍就足够了。

对于给定测量系统，L_mB是传感器的最高(最大)强度(其可用所述分析物实现)。例如可通过使传感器与测量介质接触将传感器设定为最大强度，所述测量介质的分析物S浓度与K_d相比非常高(cS＞＞K_d)，这意味着平衡(参见等式1)完全移向右侧。典型地，如果cS大于K_d达至少10³-10⁴倍就足够了。

在等式8中，L_m被看作是L_mB，即传感器的最大强度。

对特别有效的PET染料来说，q可趋向于0。这种染料是特别适合的，因为其A物质不发光，因此不需要考虑其干发光。对于其中通过使用适合的滤光器测量仅一种物质如B的ICT染料(参见上文描述)来说，q是0(因为不测量A的发光，无论其发光还是不发光)。因为q等于0，所以等式8读为L＝L_m(1-1/(1+cS/K_d))。如果检测A物质而不是B物质，则等式8读为L＝L_m(1-1/(1+K_d/cS))。其它等式必须相应地改变。

如果等式8除以常数(＞0)，例如除以L_m，则产生参比于常数值的相对特性L_rel。

$\left(9\right),L_{\mathrm{rel}}=1\·(1+\frac{q-1}{1+\mathrm{cS}/K_d})$

等式9中的L_rel可假定为q和1之间的数值。

参数K_d和q决定了特性形式，其与换算因数L_m无关。这些参数与以上段落α)和β)中提及的量无关，并可通过工厂处校准确定。参数L_m考虑了以上段落α)和β)中提及的量。

通过将相对特性L_rel(其可用工厂处测量系统通过工厂处校准来确定)乘以参数L_m(其可用用户处测量系统来确定)，获得对用户处测量系统有效的特性(有效特性)。

如果换算因数L_m指湿态传感器(湿传感器)，则其在下文将以下标W(L_mW)表示。如果其指干态传感器(干传感器)，则其在下文将以下标D(L_mD)表示。

换算因数L_mW与可用给定湿传感器在给定测量系统中测量的最大发光强度相同。L_mW在采用校准介质的湿校准中可直接测量，前提是选择的分析物浓度使得仅存在B物质。

对于pH传感器来说，还可用pH＝-log(aH⁺)和pK＝-log(K_d)将等式8写成等式10的形式。

$\left(10\right),L=L_{\mathrm{mW}}(1+\frac{q-1}{1-{10}^{\mathrm{pH}-\mathrm{pK}}})$

在下文中，上标^*用于涉及工厂处(工厂处校准)的所有量。

参数q和K_d例如通过以下步骤确定：

a)由多个以相同方式制造的传感器中选择至少一个传感器；

b)用选定传感器在工厂处测量n数目(其中如果应用等式8或10的话，则n至少为3，优选为5或以上)的水性校准介质的发光强度L_iW ^*，所述水性校准介质具有已知的分析物浓度cS_i ^*，这些浓度至少分布在预期的测量变量范围内，获得n个数据对(cS_i ^*、L_iW ^*；i＝1...n)；

c)例如通过已知的最小二乘法，使描述传感器特性的适宜数学等式(例如等式8或10)拟合n个数据对，获得参数q、K_d和L_mW ^*的值。

在工厂处获得的参数L_mW ^*取决于在工厂处使用的测量装置，与用户处的测量无关。

特别有利的是不用单个传感器而是用代表性数量的传感器确定参数q和K_d的情况。通过平均单个传感器的q和K_d值，获得这些参数的平均值，该值可被指定给以相同方式制造的多个传感器。

因此，有可能通过工厂处校准确定相对特性(为参数q和K_d或pK的形式)，并将其连同传感器一起提供给用户，例如以条码的形式。如果随后将来自以相同方式制造的一组传感器的传感器插入到用户处的测量装置中，则L_mW起初是未知的。其例如可以水性单点校准法直接测量。然后应知道描述有效特性的所有参数。

如果校准介质被实际检测中的样品替代，并测量与样品接触的发光强度L，则可通过求解cS或pH由等式8或10推断分析物浓度。

如果求解等式8的cS(设定L_m＝L_mW)，则人们可得到：

(11)cS＝K_d((q-1)/(L/L_mW-1)-1)

因为在用于直接测定L_mW的校准介质中必需的分析物浓度处于目标测量范围之外，所以直接测定L_mW经常不令人满意。

有利的是在处于预期样品分析物浓度范围中的分析物浓度实施单点校准。优选地，选择的分析物浓度使cB/cD比率(等式6)具有0.1-0.9的值，甚至更优选具有0.3-0.7的值。

采用在单点校准过程中于用户处使用与已知分析物浓度cS_cal的校准介质接触的湿传感器测量的强度值L_cal，以及由工厂校准知道的参数值q和K_d，由等式12计算L_mW。

$\left(12\right){,L}_{\mathrm{mW}}=L_{\mathrm{cal}}/(1+\frac{q-1}{1+c{S}_{\mathrm{cal}}/K_d})$

上述具有指示剂染料的光学传感器的常规校准方法的缺点源于以下事实：尽管大部分校准步骤已在工厂实施，但至少单点校准(用水性校准介质)仍必须在实际测量前于用户处实施。这需要获得和管理水性校准介质(操作、储存、分配、再订购、检查有效期等)。本发明的方法克服了此缺点，在本发明方法中，在用户处仅进行干校准步骤，而不进行湿校准步骤。

附图描述

在下文中，将借助图表和流程图更详细地描述本发明。

图1a-1c显示了对于本发明方法的不同副变更，作为pH值(在pH4.5-9.5的范围内)函数的发光强度，其换算为pH传感器的各个物质的L_mW＝1。

图2显示了作为离子浓度(mol/l)函数的发光强度，其换算为离子传感器的各个物质的L_mW＝1，横坐标为对数刻度。

图3显示了6个个体pH传感器的响应曲线(以相对发光强度L_rel换算，为时间t(秒)的函数)。

图4显示了与图3一致的换算的发光值，为pH值的函数。

图5显示了如同图4的图，差异在于相对特性(实线曲线)以线性关系L_rel＝u₁+u₂ pH表示。

图6显示了两组不同预处理的传感器的换算发光强度L_rel(实线和符号)，为时间t的函数。

图7a和图7b显示了发光染料A41的合成途径。

实施例1

(使用等式1-10的副变更1.1(图1a)、1.2(图1b)和1.3(图1c))

在阐述了下文描述的副变更1.1、1.2和1.3的图1a-1c中，作为pH值的函数(即采用H⁺为非挥发性分析物)显示了pH传感器的个体物质的发光强度，其换算至L_mW＝1。曲线A代表相对特性，是个体物质A和B的发光强度L_AW和L_BW的和。其由等式10获得，值7.4用于参数pK，值0.2用于参数q，并将等式10除以L_mW。最低强度(右侧)和最高强度(左侧)之间的比率是参数q的值。曲线B是B物质的相对发光强度，为pH值的函数。曲线C是A物质的相对发光强度，为pH值的函数。由曲线B和C可以看出，对于pH＜4.5的情况，基本上仅存在B物质，而对于pH＞9.5的情况，基本上只有A物质存在。曲线D是干传感器中个体物质A和B的发光强度L_AD和L_BD的和，其在传感器制造过程中为pH值的函数。为阐述目的，假定干态的B物质的发光强度大至湿态的1.25倍。根据染料和基质，其也可相等或更小。对于更高的pH值，干发光强度随着发光较强的B物质浓度的下降而下降，而发光较差的A物质的浓度增加。由曲线E可见，在有限的pH范围内(约pH7.0-7.8)，相对特性可由通式L_w＝a+b*pH的直线代表。在该范围之外，所述特性不能由线性函数以足够精确度近似。在各个图中以^*表示的测量值是工厂处值，无^*的值属于用户处值。

图2图解了离子传感器的个体物质的发光强度，其换算至L_mW＝1，为离子浓度的函数。横坐标为对数刻度。曲线A-D类似于图1a-1c的曲线。曲线A得自等式8，值0.0176用于参数K_d，值0.18用于参数q，并将等式8除以L_mW。所述值取自US 6,211,359的表1。等式8基本对应于US 6,211,359的等式6，差异在于等式8未考虑干扰离子，以保持表达式简化。等式8还对应于US 6,171,866的等式4，差异在等式4中表达式是对数的。由曲线E可见，在有限的浓度范围内(cS＝约0.006-0.05mol/l)，相对特性可以通式L_w＝a+b·log(cS)的直线表示。在该范围之外，所述特性不能用线性函数以足够精确度近似。

由于L_m的定义(m指最大强度，即基本上仅存在B物质时的强度)，在以下的实施例1.1中描述了一种特别的情况，实施例1.2和1.3讨论一般情况。

实施例1.1(图1a)

令人惊奇的是，业已发现，对于以相同方式制造的并以相同类型的装置测量的传感器，比率

(13)R_mD/W＝L_mD/L_mW＝L_mD ^*/L_mW ^*是常数，可通过工厂处校准来确定。因此，换算因数L_mW可由L_mD/R_mD/W确定。因此，在用户处，为测定换算因数L_mW将只需要单点干校准，而不需要校准介质。这意味着在用户处获得了发光-光学传感器的真实干校准，使得用于单点校准的液体校准介质可一起省去。

L_mD ^*(相应地L_mD)是用干传感器于工厂处(相应地在用户处)测量的最大强度值。如果传感器的指示剂染料的装配方式使得干态时指示剂的全部量都以B物质的形式存在，即发光指示剂染料基本上完全作为B物质存在，则可确定这些值，比率V＝cB/cD(等式6)等于1，因为cD＝cA+cB(等式5)。

L_mW ^*(相应地L_mW)是用湿传感器于工厂处(相应地在用户处)测量的最大强度值。值L_mW ^*可在工厂处用与液体校准介质接触的传感器测量，所述校准介质的分析物浓度被调整得使润湿后并达到平衡时(等式1(相应地等式2))基本上只有B物质存在，湿传感器中的比率V＝cB/cD(等式6)等于1。然后可由等式13计算L_mW。

具有指示剂染料的光学传感器可表示为无分析物S的A物质或结合分析物S的B物质，其特性以等式8或等式10给出，对于此光学传感器，本发明的变更方法的特征在于以下事实：在工厂校准当中，当指示剂染料基本上完全以B物质形式存在时，计算比值R_mD/W(得自不用水性校准介质的强度值L_mD ^*以及采用水性校准介质的强度值L_mW ^*)，使得在L_mW＝L_mD/R_mD/W的情况下等式8变成：

$\left(14\right),L=\frac{L_{\mathrm{mD}}}{R_{\mathrm{mD}/W}}(1+\frac{q-1}{1+\mathrm{cS}/K_D})$

L_mD可在随后的用户处单点干校准中确定，即不使用水性校准介质。

如果传感器的生产方式使得在干态时仅存在B物质，则在干态时测量的强度将为L_mD。在工厂处用液体校准介质润湿和平衡后，可由等式13直接确定R_mD/W，其中选定所述液体校准介质的分析浓度，使得仅存在B物质。

因此，本发明的第一个副变更(图1a)的特征在于：

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中发光指示剂染料基本上完全作为B物质存在，分析物或分析物类似物与B物质结合，

在步骤a)ii.中

获得工厂处的干校准值L_mD ^*，

在步骤a)iii.中

对于至少一种水性校准介质，选择分析物S的浓度，使得在润湿和平衡后基本上只有B物质存在，并检测工厂处的湿校准值L_mW ^*，

在步骤a)iv.中

由工厂处的干校准值L_mD ^*和工厂处的湿校准值L_mW ^*计算比值R_mD/w，

在步骤b)i.中

获得用户处的干校准值L_mD，和

在步骤b)iii.中

由L_mD和比值R_mD/w计算用户处的换算因数L_mW，并由发光测量值、用户处的换算因数L_mW和相对特性确定非挥发性分析物的浓度。

实施例1.2(图1b)

在实施例1.1中，结合分析物S的B物质的浓度对指示剂总浓度D的比率V为1。换句话说：在干态时指示剂染料完全以B物质的形式存在。

典型地，光学传感器的制造方式使得干态时比率V＝cB/cD具有0.1-0.9的值，优选处于0.3-0.7之间。对于比率V的每个值，存在可用于由干态测量的强度L_D推断最大湿发光强度L_mW的值_RD/W。如果cA趋于0，如在实施例1.1中所阐述的，则基本上仅存在B物质，并保持等式R_D/H＝R_mD/w。

在等式13的变体中，人们由等式15

(15)R_D/W＝L_D/L_mW＝L_D ^*/L_mW ^*

获得比率R_D/W，通过该比率可使相对特性与用户处干校准值关联。

因此，本发明的第二个副变更(图1b)的特征在于：

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中指示剂染料以A物质和B物质的形式存在，分析物或其类似物结合B物质但不结合A物质，比率V＝cB/cD(cD＝cA+cB)是已知的，并处于0.1-0.9之间，优选处于0.3-0.7之间，

在步骤a)ii.中

获得工厂处的干校准值L_D ^*，

在步骤a)iii.中

对于至少一种水性校准介质，选择分析物S的浓度，使得在润湿和平衡后基本上只有B物质存在，并检测工厂处的湿校准值L_mW ^*，和

在步骤a)iv.中

由工厂处的干校准值L_D ^*和工厂处的湿校准值L_mW ^*计算比值R_D/w，

在步骤b)i.中

获得用户处的干校准值L_D，和

在步骤b)iii.中

由L_D和比值R_D/W计算用户处的换算因数L_mW，并由发光测量值、用户处的换算因数L_mW和相对特性确定非挥发性分析物的浓度。

实施例1.3(图1c)

在上述实施例1.1和1.2中，必须选择用于测量工厂湿校准值L_mW ^*的分析物S的浓度，使得仅存在指示剂的B物质。

设定校准介质中的分析物浓度，使得在润湿和平衡(等式1或2)后基本上仅存在B物质，允许直接测量L_mW ^*(参见上文a.iii下的内容)，这在实践当中经常无法令人满意，就某些传感器或分析物而言是十分不利的或不可能的。其理由在于：为了将平衡完全移向等式1的左侧，在某些情况下应必须达到非常高的分析物浓度(＞1mol/l)。

用于测量生理Na⁺浓度的Na⁺传感器理想具有例如约0.150mol/l的K_d值。为将平衡(在等式1和2中)移向左侧，使得基本上仅存在B物质，分析物浓度应必须高达K_d值的100倍，理想地达1000倍。在校准介质中获得15mol/l或更高的分析物浓度既不实际也不可能，原因在于溶解度限制。

作为另一个实例，采用pH传感器(用H⁺作为非挥发性分析物)测定生理pH值，其理想地具有约3.4*10^-8的K_d(相当于7.4的pK值)。为将平衡(在等式1和2中)移向左侧，使得基本上仅存在B物质，分析物浓度必须高达Kd值的100倍，理想地达1000倍。将校准介质中的分析物浓度(cH⁺)设定在3.4*10^-8或更高(相当于pH 4.4或以下)不存在问题，但是如果由于某些原因要避免弱酸性或强酸性校准介质则可能不合需要。

当参数值q和K_d已知时(由工厂处校准获得)，可选择液体校准介质中的分析物浓度CS_i，使得在工厂校准的过程步骤a)iii中，(在润湿后)在湿传感器中建立已知比率V＝cB/cD，该比率优选位于0.1-0.9的范围内，具体地说在0.3-0.7之间。特别有利的是选择该湿态比率(过程步骤c)使其等于干态比率(过程步骤b)的情况。

于是，该变更产生湿校准值L_iW ^*。例如可使用等式12由L_iW ^*计算L_mW ^*。

(16)L_mW ^*＝L_iW ^*(1+(q-1)/(1+cS_i/K_d))

因此，本发明的第三个副变更(图1c)的特征在于：

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中指示剂染料以A物质和B物质的形式存在，分析物或其类似物结合B物质但不结合A物质，物质浓度的比率V＝cB/cD(cD＝cA+cB)是已知的，处于0.1-0.9之间，优选处于0.3-0.7之间，

在步骤a)ii.中

获得工厂处的干校准值L_D ^*，

在步骤a)iii.中

用传感器S₀测量至少两种具有已知不同分析物S浓度CS_i的水性校准介质的发光强度，获得至少两个工厂处的湿校准值L_iW ^*，和

在步骤a)iv.中

由数值对L_iW ^*、cS_i获得传感器S₀的相对特性和湿校准值L_mW ^*，并由其计算对相同方式制造的所有传感器S_n有效的相对特性，

在步骤a)iv.中

由干校准值L_D ^*和湿校准值L_mW ^*计算比值R_D/W，获得

在步骤b)i.中

用户处的干校准值L_D，和

在步骤b)iii.中

由L_D和比值R_D/W计算用户处的换算因数L_mW，并由发光测量值、干校准值L_D、比值R_D/W和相对特性确定非挥发性分析物的浓度。

实施例2

(不使用等式1-10的副变更2.1和2.2)

理论上推导的传感器特性的函数等式的一个优势在于，它们通常以足够的精确度在可测量的分析物浓度的完整范围内描述特性曲线的形态。但是，为了按照本发明进行干校准，不是绝对地必须使用以上的理论推导的等式。

原则上，可使用替代的函数关系。至少在预期的分析物浓度范围内，特性曲线形态可例如由一次或二次多项式、对数函数、有理函数或这些函数的组合(例如L_w＝a+b·cS、L_w＝a+b·log(cS)、L_w＝a+b·cS+c·(cS)²或L_w＝a+b·pH、L_w＝a+b·log(pH)、L_w＝a+b·pH+c·(pH)²)足够精确地代表。作为实例提及的函数与理论推导函数(例如等式8或10)例如在以下情况下不同：其参数集(a、b、c)不含可用作类似于L_m的换算因数的特定参数，此外与等式8的q和K_d相比个体参数不反映传感器的具体特性。如果使用这种替代函数，且分析物浓度不可预期地处于理论范围之外，则存在特性值与测量值不足够紧密地关联的风险，因此导致假结果。如果所述函数在预期的分析物浓度范围内不能足够紧密地近似特性形态，则结果将是不精确的。

在以下条件下例如可使用替代函数：

-理论推导函数无法获得或已知不具有足够精确度；

-传感器的动态范围大于分析物浓度的预期范围，替代函数以足够的精确度代表了预期范围内的特性形态。

有两种不同的方法，这两种方法尽管在形式上和程序细节上不同，但基本上是等同的：

-通过干值标准化工厂处校准获得的特性(参见实施例2.1)，

-通过干值标准化工厂处校准获得的测量点(参见实施例2.2)。

存在于干传感器S₀中的指示剂物质A和B的给定比率V_D(等式6)将在干测量中产生强度L_D。

L_D是于给定比率V_D用干传感器测量的发光强度，两种指示剂物质A和B的浓度之间的比率对于以相同方式制造的多个传感器S_n中的每个干传感器都是相同的。

与液体介质(即校准介质或控制介质)或含浓度为cS_i的待测分析物S的样品接触，在润湿和平衡后于湿传感器中建立A物质和B物质的新比率V_iW，其中在湿传感器中建立的比率V_iW取决于样品中的分析物浓度cS_i和指示剂的解离常数K_d，并测量对应于比率V_iW的发光强度L_iW。

因此，L_iW是用与样品接触的湿传感器测量的发光强度，所述样品含待测浓度cS_i的分析物S。

并因此在给定比率V_D的情况下，每个比值L_iW/L_D都对应于样品中某一浓度的分析物。

比值L_iW/L_D基本上与上文在α)和β)项下提及的影响因素无关。为确定这些比值，必须用同一个传感器并用相同测量装置测量强度L_iW和L_D。

对于干传感器中的给定值V_D，在比值L_iW/L_D和样品中的分析物浓度之间存在一定的函数关系。

实施例2.1

在本发明方法的一个优选变更中，由多个以相同方式制造的传感器S_n中选择代表性数量的干传感器S₀，在不用水性校准介质的情况下测量发光强度L_D ^*。随后，使每个传感器S₀与数量n的具有已知分析物浓度cSi的水性校准介质接触，所述已知分析物浓度cSi至少分布在预期的待测量浓度范围内，测量n个发光强度(L_iW ^*；i＝1...n)，产生n个数据对(cS_iW ^*，L_iW ^*；i＝1...n)。

通式为L_W ^*＝f(P₁ ^*，...P_n ^*，cS或pH)(例如L_W ^*＝P₁ ^*+P₂ ^*·cS或L_W ^*＝P₁ ^*+P₂ ^*·pH)的适宜函数描述了传感器特性的形态，使该函数拟合n个数据对，至少对待测分析物浓度范围的一部分产生在工厂处获得的有效传感器特性参数P₁ ^*，...P_n ^*的值。

通过以干值L_D ^*换算由在工厂处获得的有效特性获得相对特性，即将所述特性除以干值L_D ^*。

例如：将有效的工厂处特性L_W ^*＝P₁ ^*+P₂ ^*·cS除以L_D ^*，即计算比率p₁＝P₁ ^*/L_D ^*和p₂＝P₂ ^*/L_D ^*，换算过的特性是L_rel＝(P₁ ^*+P₂ ^*·cS)/L_D ^*＝(p₁+p₂·cS)。

在用户处使用来自以相同方式制造的多个传感器的干传感器S₁进行单点干校准(不用水性校准介质)，产生发光强度L_D。

将相对特性L_rel乘以在用户处测量的干校准值L_D，得到对用户处有效的有效特性。

继续以上实例：相对特性L_rel＝(p₁+p₂·cS)乘以用户处的干校准值L_D。即相对特性的参数p₁和p₂乘以在用户处测量的干校准值L_D：P₁＝L_D·p₁和P₂＝L_D·p₂；用户处的有效特性是L_W＝L_D·(p₁+p₂·cS)＝(L_D·p₁+L_D·p₂·cS)＝(p₁+p₂·cS)。因此，将用户处的相对特性参比干校准值。

通过求解等式的cS(或pH)，并输入与样品接触测量的发光强度值L_iW，由用户处的有效特性获得分析物浓度。在本实例中：cS_i＝(L_iW-P₁)/P₂。

为了能够获得特性参数P₁-P_n的可信平均值，技术人员可选择代表性数量m个传感器。理论上m＝1是可能的，但实际上m将是一个较大的数字，这取决于给定的用途，m将≥16，优选≥40。

在第二个变更的有利副变更中，提供：选择至少m个传感器，在工厂处获得m个干校准值L_D ^*，并在干测量后使用n≥2的不同水性校准介质中的至少两种由每个传感器获得湿校准值L_iW ^*，每个校准介质在所有选定传感器的校准过程中使用至少1次。对于每个传感器，由n≥2的湿校准值L_iW ^*中的至少两个获得通式L_W ^*＝f(P₁ ^*，...P_n ^*，cS或pH)的有效特性，并对于每个传感器，通过将有效特性除以干校准值L_D ^*计算为通式L_rel＝f(p₁，...P_n，cS或pH)的相对特性。随后，通过平均个体传感器特性系数p₁-p_n获得相对特性，该相对特性被指定给以相同方式制造的所有传感器S_n的总体，即生产批量的传感器。

因此，本发明的第二个变更的副变更(图1c)的特征如下：

在工厂处

-由大量以相同方式制造的多个传感器中选择至少m个传感器S₀；

-测量各个选定传感器S₀的无水性校准介质的发光强度，获得每个传感器的工厂处干校准值L_D ^*；

-对于各个选定传感器，当其与n(n≥2)种不同的水性校准介质中的至少2种接触时测量发光强度，每个校准介质在所有选定传感器的校准中使用至少1次，获得每个传感器的至少2个工厂处湿校准值L_iW ^*；

-对于各个选定传感器，使描述传感器特性形态的通式L_W ^*＝f(P₁ ^*，...P_n ^*，cS或pH)的适宜函数拟合数据对(cS_i ^*，L_iW ^*)，对每个传感器获得有效工厂处特性的参数P₁ ^*，...P_n ^*的值；

-对于每个选定传感器，有效工厂处特性以对应的工厂处干校准值L_D ^*换算，获得个体传感器的通式L_rel＝f(p₁，...p_n，cS或pH)的相对特性的参数P₁-P_n；

-通过平均个体传感器特性的系数获得相对特性，该相对特性被指定为以相同方式制造的所有传感器S_n的总体。

在用户处

-对于来自以相同方式制造的多个传感器S_n的传感器S₁，测量发光强度，获得用户处的干校准值L_D；

-对于与水性样品介质接触的传感器S₁，测量发光强度L_iW；

-在工厂处获得的相对特性以用户处的干校准值L_D换算，获得在用户处的有效特性的参数P₁-P_n的值，该有效特性具有通式L_W＝f(P₁，...P_n，cS或pH)；

-通过求解通式L_W＝f(P₁，...P_n，cS或pH)的等式的cS或pH(cS或pH＝f(P₁，...P_n，L_W))，并输入用户处的发光测量值L_iW，计算分析物浓度。

实施例2.2

在本发明的一个特别优选的变更中，以下在实施例2.1中所概述方法的变更也是可能的。由具有数目n的校准液的工厂处湿校准值L_iW ^*和工厂处干校准值L_D ^*计算第一个比值，湿值对干值的这些比率与分析物浓度或pH值之间的函数关系以表的形式表示，或以通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的适宜函数形式表示。

在本发明方法的此变更中，至少一个干传感器S₀选自以相同方式制造的多个传感器，不用水性校准介质测量发光强度L_D ^*。随后，使传感器与数目n的水性校准介质接触，所述水性校准介质具有已知的分析物浓度cSi，该分析物浓度cSi至少分布在待测浓度的预期范围内，测量n个发光强度(L_iW ^*；i＝1...n)，产生n个数据对(cS_iW ^*，L_iW ^*；i＝1...n)。

对于每个选定的传感器S₀，将测量的发光强度L_iW ^*除以L_D ^*，获得比值U_i ^*＝L_iW ^*/L_D ^*；i＝1...n，并因此获得n个数据对(cS_i ^*，U_i ^*；i＝1，...n)。

然后，使描述传感器相对特性的通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的适宜函数(例如L_rel＝u₁+u₂·cS或L_rel＝u₁+u₂·pH)拟合获得的数据对，获得相对特性的参数u₁-u_n的值。

在用户处，使用干传感器S_n进行单点干校准(不用水性校准介质)，获得发光强度L₀，其为用户处的干校准值；然后使传感器接触含具有(未知)浓度cS_i的分析物S的样品，并进行湿测量，即其中传感器与水性样品接触的测量，获得发光强度L_iW，即发光测量值。

由样品强度值L_iW和干强度值L_D计算比率U_i＝L_iW/L_D。使用参比干强度值的样品强度值U_i和也参比干值的通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的特性，通过求解cS或pH推断分析物浓度或pH值。

本变更和实施例2.1所述变更之间的基本差异如下：在2.1中，通过用n个水性校准介质测量n个校准值，计算参数P₁ ^*-P_n ^*，并通过以工厂处测量的干值换算有效特性得到通式L_rel＝f(p₁，...p_n，cS或pH)的相对特性，获得通式L_W ^*＝f(P₁ ^*，...P_n ^*，cS或pH)的有效工厂特性；而在2.2中，首先以工厂处测量的干值换算n个个体湿校准值(即n个湿校准值除以干值L_D ^*，获得n个比值)，然后通过将n个比值拟合为通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的相对特性，获得相对特性。

在本发明的另一个有利实施方案中，提议在工厂处选择至少m个传感器，获得m个干校准值t_i，i＝1-m，用n≥2种不同水性校准介质中的至少一种由每个传感器获得湿校准值，每个校准介质使用至少1次，使得获得k≥n个湿校准值k_ij，j＝1-n，由个体对t_i、k_ij计算比值k_ij/t_i，由这些比值获得传感器的相对特性。

选定传感器的数目是m(m可为1，典型地为＞1，实际上为较大的数，例如≥16，优选地≥40，取决于应用，以便获得代表性平均值)，选定传感器的下标i为1-m。因此，将有m个干校准值t_i，i＝1-m。不同的水性校准介质的数目为n≥2，水性校准介质的下标j为j＝1-n。因此，有k≥n个湿校准值k_ij和k个比值k_ij/t_i。

下表列出了2、3和5种校准介质的值：

	m个选定的传感器	m个干校准值ti	n种校准介质	k个湿校准值kij	k个比值kij/ti
						1.)m＝1，n＝2，k＝2	1	t1	2	k11，k12	k11/t1，k12/t1
2.)m＝3，n＝3，k＝9	3	t1，t2，t3	3	k11，k12，k13k21，k22，k33k31，k32，k33	k11/t1，k12/t1，k13/t1k21/t2，k22/t2，k23/t2k31/t3，k32/t3，k33/t3
						3.)m＝2，n＝5，k＝6	2	t1，t2	5	k11，k12，k13k23，k24，k25	k11/t1，k12/t1，k13/t1k23/t2，k24/t2，k25/t2

因此，本发明该变更的副变更的特征如下：

在工厂处

-由相同方式制造的多个传感器中选择至少m个传感器S₀；

-对于每个选定传感器，不用水性校准介质测量发光强度，获得每个传感器的工厂处干校准值L_D ^*；

-对于每个选定传感器，当其与n(n≥2)种不同的水性校准介质中的至少1种接触时测量发光强度，每个校准介质在所有选定传感器的校准中使用至少1次，获得每个传感器的至少一个工厂处的湿校准值L_iW ^*；

-由个体传感器的工厂处干和湿校准值计算比值U_i ^*＝L_iW ^*/L_D ^*；

-使描述相对传感器特性形态的通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的适宜函数拟合所有m个传感器的比值U_i ^*，获得参数u₁，...u_n的值；

在用户处

-对来自相同方式制造的多个传感器S_n的干传感器S₁测量发光强度，获得用户处的干校准值L_D；

-对于与水性样品介质接触的传感器S₁，测量发光强度L_iW，获得发光测量值；

-以干值L_Dj换算发光测量值L_iW，获得比值U_i，通过将比值U_i输入通式L_rel＝f(u₁，...u_n，cS或pH)的等式，并求解cS或pH(cS或pH＝f(u₁，...u_n，L_rel))，计算分析物浓度。

应指出的是，在用户处的实际样品测量中，仅最后3步必须实施，因为得自工厂处校准的值以合适形式和传感器一起提供，例如为以条码、磁性或电子码载体或ROM-Key编码的批特有校准信息。

在2.2中描述的变更具有某些优势，尤其是如果在工厂处校正中获得的特性参数不仅来自一个传感器S₀，而是更实际地来自统计学代表性数目的传感器，并指定给全体传感器。

实施例3

在该实施例中，描述了适于本发明的指示剂染料的化学合成、其与纤维素纤维的固定、干光学传感器片(disc)的制备以及使用如此获得的光学传感器进行的pH、Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺测量。

3.1.具有下式的pH敏感型发光染料A41的合成

化学物质

DCM(二氯甲烷)：Riedel de Haen 24233＞99％；TFA(三氟乙酸)：Fluka 91700＞98％；NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)：Fluka 56480＞97％；DIC(二异丙基碳二亚胺)：Fluka 38370＞98％；DMAP(4-二甲基氨基吡啶)：Fluka 39405＞98％；DIPEA(二异丙基乙胺)：Fluka 03440＞98％；乙腈：Merck-HPLC级；4-氨基甲基苯甲酸：Fluka：08400＞98％；SOCl₂：Fluka：88950＞99％；无水EtOH：Riedel de Haen：32221；TEA(三乙胺)：Merck：808352；SO₂Cl₂：Fluka：862212；一水合肼：Fluka：53850；邻苯二甲酸酐：Fluka：80020；盐酸酪胺：Fluka 93820＞97％；NMP(N-甲基吡咯烷酮)：Fluka：69116；4-Cl-1，8-萘二甲酸酐：Aldrich：19，149-3～95％。

合成途径示于图7a和7b。

盐酸4-氨基甲基苯甲酸乙酯(1)：

将20.0g(132mM)4-氨基甲基苯甲酸悬浮在200ml无水乙醇(EtOH)中，并用冰冷却。滴加28.0g(17ml)(236mM)亚硫酰氯。然后回流澄清的混合物3小时。在冷却至室温后，蒸发EtOH。加入50ml甲苯/EtOH 1/1，蒸发3次。干燥残余物，得到27g(1)。

4-Cl-萘二甲酰亚胺-甲基苯甲酸-乙酯(2)：

将20.0g(93.2mM)盐酸4-氨基甲基苯甲酸乙酯、21.68g(93.2mM)4-Cl-1，8-萘二甲酸酐和19.78g三乙胺(195.5mM)的400ml DMF溶液加热至90℃，并过夜搅拌。在冷却至室温后，加入100ml H₂O，以沉淀目标产物。由EtOH重结晶4-Cl-萘二甲酰亚胺-甲基苯甲酸乙酯(2)。产量：15.8g。

HPLC(Vydac 10-90-15)显示出于t＝14.04的单峰，用maldi tof质谱观察到质量峰MH⁺＝394.8(M＝393.82)。

酪胺苯邻二甲酰亚胺(3)：

将29.6g(200mM)邻苯二甲酸酐、34.73盐酸酪胺(200mM)和27.7ml三乙胺(200mM)加热至115℃达4小时。在冷却至室温后，将混合物倾入1.51冰水中。过滤沉淀物(3)，用水清洗。产量：45g。

二氯酪胺苯邻二甲酰亚胺(4)：

将15.35g(57mM)酪胺苯邻二甲酰亚胺(3)缓慢并分部地加入到24.75g(170mM)煮沸的磺酰氯和75ml CHCl₃中。继续回流，直至混合物变澄清。然后，于室温过夜敞开搅拌溶液，以去除磺酰氯。通过蒸发去除溶剂，粗产物(4)由75ml MeOH重结晶。产量：7.2g。

二氯酪胺(5)：

在170ml无水EtOH中过夜回流7.2g二氯酪胺苯邻二甲酰亚胺(4)和1.6ml一水合肼。在冷却至室温后，滤出沉淀物。粗产物(5)不用纯化就用于下一步合成。

A-040：

将1.5g(7.26mM)二氯酪胺(5)、2.85g 4-氯萘二甲酰亚胺甲基苯甲酸乙酯(2)和4ml DIPEA在150ml NMP中的混合物加热至90℃达4天。

在冷却至室温后，加入1.51水和7ml乙酸(AcOH)。滤出沉淀物，并溶解在400ml CHCl₃中。用0.5N NaOH提取有机层3次，用6N HCl酸化NaOH层。用乙酸乙酯提取水层，含染料的有机层经MgSO₄干燥。溶剂通常蒸发去除。

最后，粗品A-040经干快速硅胶柱层析纯化。

梯度：石油醚

石油醚/乙酸乙酯9/1；石油醚/乙酸乙酯8/2；石油醚/乙酸乙酯7/3；石油醚/乙酸乙酯1/1

HPLC(Vydac：10-90-15)显示了于t＝13.42分钟的单峰，通过maldi tof测量观察到质量峰M＝563(M＝563)。

A-041：

将A-040溶解在50ml乙腈和50ml 1N NaOH中。溶液加温至60℃，并搅拌1小时。然后，用HCl酸化溶液，并用乙酸乙酯提取。用水清洗含染料的乙酸乙酯层3次。在经MgSO₄干燥有机层后，通过蒸发去除溶剂。产量：350mg。

HPLC(Vydac：10-90-15)显示了于t＝11.3分钟的单峰，通过malditof测量观察到质量峰MH⁺＝535.4(M＝534.4)。

3.2.Na⁺敏感型发光染料4-{4′-[4″-C-[氮杂-15-冠-5]-3″-甲氧基苯基-乙氨基]-1′，8′-萘胺-甲基}苯甲酸的合成

使用的Na⁺传感器描述于US 5,952,491(Leiner等)。

Na⁺敏感型PET指示剂染料制备的准确描述以及传感器的光谱和测量数据可见于Anal.Chem.75，549-555，2003 He等，“A fluorescentchemo sensor for sodium based on photo induced electron transfer”。

3.3.K⁺敏感型发光染料的合成

使用的K⁺传感器描述于US 6,211,369(He等)。

K⁺敏感型PET指示剂染料制备的准确描述以及传感器的光谱和测量数据可见于出版物J.Am.Chem.Soc.125，1468-1469，2003，支持信息，He等，“A fluorescent sensor with high selectivity and sensitivityfor potassium in water”。

3.4.Ca⁺⁺敏感型发光染料的合成

Ca⁺⁺敏感型指示剂染料如US 6,171,866(He等)所述制备。

3.5.氨基纤维素纤维的制备

氨基纤维素纤维如SU 1,028,677、CA 99.177723b所述制备。

3.6.pH、Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺敏感型指示剂染料在氨基纤维素纤维上的固定

类似于US 6,211,359(He等)中的实施例18进行全部4种染料与氨基纤维素纤维的固定。

3.7.建立相应的指示剂物质A和B的已知比率

为了建立A物质和B物质的已知比率V(等式6)，在固定指示剂染料后，用含合适浓度的相关分析物的水性介质清洗携带指示剂的纤维，使得在达到平衡(等式1和2)后建立期望的指示剂物质A和B的浓度比率。随后，通过与去离子水短暂接触淋洗纤维并干燥，这不改变两种指示剂物质的已确立比率。

或者，还有可能先生产整个传感器，用含适宜浓度的相关分析物的水性介质清洗传感器，使得在达到平衡(等式1和2)后建立期望的指示剂物质A和B的浓度比率，随后干燥传感器。

为建立A物质和B物质的某一比率，例如对pH传感器而言，有可能用具有已知pH的酸、碱或缓冲液平衡传感器或原料(例如携带指示剂的纤维、颗粒等)。

对于离子传感器而言，可用含适宜浓度的待测离子的水性溶液平衡原料(相应的传感器)。

或者，对于US 5,952,491(Leiner等)、US 6,211,359(He等)、US6,171,866(He等)描述的PET指示剂染料而言，有可能在没有待测离子的情况下，用酸(例如HCl)或pH缓冲溶液建立两种物质A和B的某一比率。这是有可能的，因为离子载体部分的自动结合的氮原子是pH活性的。自动结合的N原子的pK值例如约为5。与酸性液体接触时氮被质子化，PET作用被消除。质子化物质的发光对应于结合分析物(待测离子)的B物质的发光。因此，对用于金属阳离子的具有pH活性离子载体部分的某些发光指示剂，有可能利用质子建立弱和强发光指示剂物质的预定比率。质子用作分析物-类似物。

3.8.H⁺(pH)、Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺敏感型光学传感器(传感器片)的制造

类似于US 6,211,359(He等)的实施例19进行4种传感器的制造。

将具有实施例3.7的固定化指示剂的、筛分过的0.5g(25μm)纤维素粉悬浮在9.5g的10％亲水性聚醚-聚尿烷-共聚物的90％乙醇-水溶液中持续16小时。这种聚醚-聚尿烷共聚物可得自例如CardioTechInternational，Inc.Woburn，MA，U.S.A。获得的均匀分布物包被在聚酯薄片(Melinex foil，ICI America)上，最终的干层厚度为10μm。该薄片用在10％聚醚-聚尿烷共聚物的90％乙醇-水溶液中的3％炭黑涂层，涂层干厚度为5μm。然后穿出3mm直径的小片。

制备传感器片的方法由M.J.P.Leiner和P.Hartmann描述于Sensors and Actuators B，11(1993)，281-189(“Theory and Practice inoptical pH sensing”)。

3.9.含H⁺(pH)、Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺敏感型光学传感器阵列的一次性测量室的制造

把实施例3.8的传感器片放入到一次性塑料测量室中。所述室由注射成型的顶部和底部、传送校准物和样品的通道、可密封的进口和出口组成。底部具有圆柱腔，用于镶嵌传感器片。将H⁺(pH)、Na⁺、K⁺和Ca⁺⁺敏感型传感器片放入腔中后，底部和顶部粘合在一起，形成最终的测量室。相应指示剂染料的照射和较长波长发光的收集通过所述室的底部进行。

在组装后，一次性室在含适宜干燥剂的密闭容器中放置几天，以使传感器进一步干燥，降至期望的湿度水平。在干燥后，密封进口和出口，将所述室连同适宜的干燥剂储存于密闭容器中，直至使用。

或者，还有可能在组装一次性室后立即密封进口和出口，并将所述室储存在含干燥剂的密封包装中，直至使用。在此情况下，干燥通过密封材料和/或通过塑料材料发生。由于塑料的低水透过性，所以干燥过程将耗时更长(即几周)。

制作一次性测量室的方法由M.J.P.Leiner描述于Sensors andActuators B，29(1995)，269-173(“Optical sensors for in vitro blood gasanalysis”)。

3.10.测量装置中一次性室的干和湿测量

为进行测量，将一次性室放入到不透光的恒温测量室中。将进口和出口连接至射流系统，以允许通入具有不同pH值和/或不同碱离子浓度的水性溶液。

对于每个通道(传感器)，光学测量系统都由作为光源的蓝色LED、作为检测器的光电二极管、用于选择波长的滤光器、用于将激发光导入传感器的指示剂染料中并将发射光导入光检测器中的光学装置以及用于电子信号加工的装置组成。在激发结束时使用干涉滤光片(峰值传输为480nm)，在发射结束时使用520nm截止滤光片。

3.11.采用pH传感器的测量结果

在图3中，显示了6个个体pH传感器在干态时以及在采用水性流体的平衡期当中作为时间t(以秒测量)函数的响应曲线(作为时间函数的发光强度)，所述pH传感器选自以相同方式制造的多个传感器。以2秒的时间间隔测量强度值。

对于该组传感器(参见3.7项)，用HCl(pH约为3)清洗携带指示剂(纤维素纤维)的材料，然后把其放入传感器层中。因此，在该组的干传感器中仅存在B物质。因此，在干传感器中比值V＝cB/cD等于1(等式6)。

在将与干燥气态介质接触储存的传感器放入到测量装置中后，将它们于37℃恒温(未显示)，照射并测量干发光强度(此时间间隔为0-60秒)。然后，用水性液体(每个传感器不同)替换气态介质。在时间间隔60-240秒当中，发生传感器对流体pH值的平衡。

用不同干传感器测量的强度是不同的(未显示)。为明晰表达式，换算图3的响应曲线，使得显示的干强度平均值具有值1.15。该值1.15代表(等式13的)比值R_mD/W。

在此背景下的换算指：以2秒间隔测量的强度值乘以因数(＝＝1.15/在时间间隔0-60秒内的干强度平均值)。

使用2组样品流体。

具有pH值7.18、7.41、7.59的组别由水性电解液组成，所述电解液典型地用于血液参数测量中的控制和校准用途(参见例如US6,174,728)。

具有pH值6.84、7.15、7.18的组别由具有生理值的Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺和Cl^-的HEPES缓冲液组成。

在时间间隔60-240秒内，同时发生两个步骤，即润湿和对流体pH值的平衡。

在时间间隔230-240秒当中，这些步骤基本上已结束。在此间隔中的发光强度是样品的湿强度。

由曲线形态可观察到，平衡步骤的动力学实际上取决于样品类型。

在图4的曲线图中，将图3的换算过的发光值对横坐标上的pH值作图。

三角形符号表示在实例中质子化的B物质独自以干态存在。实心三角形(相应地虚线)表示干校准值L_mD ^*和L_mD。于干态时没有pH依赖性！空心三角形表示仅存在质子化B物质时的湿校准值L_mW ^*。

方形符号表示平衡后个体传感器的强度L_iW ^*，其通过干值换算。实线是依据等式10的相对特性，其中L_mW ^*等于1。

通过最小二乘法使等式10拟合方形符号表示的测量数据，获得特性的参数q和pK。近似产生结果：q＝0.17，pK＝7.08。

至于存在的B物质，干强度L_mD ^*和L_mD大于湿强度L_mW ^*和L_mW至R_mD/W＝1.15的倍数。

按照实施例1.1，相对特性(等式10)以参数L_mW＝1、q＝0.17、pK＝7.08给出，比率R_mD/W＝1.15。

图5的曲线图对应于图4的曲线图，差异在于等式L_rel＝u₁+u₂·pH用于表示相对特性(实线)。为对比原因，图4的相对特性显示为虚线。

按照实施例2.2，相对特性以参数u₁＝3.59和u₂＝-0.42给出。在有限的pH范围6.3-7.6中，该特性的形状近似于图4的特性形状。

图6显示了具有不同预处理的两组传感器的发光强度L_rel(组a：实线；组b：符号)。在组a(参见实施例3.7)中，指示剂的载体(纤维素纤维)在被放入到传感器层当中之前用HCl(pH约为3)清洗。结果在该组的干pH传感器中仅存在B物质。在组b(参见实施例3.7)中，指示剂的载体(纤维素纤维)在被放入到传感器层当中之前用磷酸盐缓冲液(pH约为7.4)清洗。因此，两种指示剂物质的比率V＝cB/cD(等式6)在该组的干传感器中实现。

在将与干气态介质接触储存的传感器放入到测量装置中后，将它们恒温至37℃(未显示)，用蓝光照射，并以2秒的时间间隔测量作为时间函数的发光强度。以0-60秒的时间间隔干燥传感器。在60-70秒的间隔内用样品液体替换气态介质(在该时间内未进行测量)。以时间间隔70-240秒发生润湿和传感器对样品pH值的平衡。

每组3个传感器的润湿和平衡用水性电解液(pH值7.18、7.41、7.59)进行，所述电解液典型地在血液参数测量装置中用于控制和校准用途(描述于US 6,174,728)。

不同干传感器的测量强度是不同的(未显示)。图6中每条曲线的测量强度以2步标准化。

步骤1：平均每个干传感器测量的最后10个值。然后将曲线的所有测量值除以平均值。

步骤2，组a：平均pH值7.41曲线的湿传感器测量的最后10个值。然后将组a的全部3条曲线除以该平均值。

步骤2，组b：组b的3条曲线类似于组a处理。

由选定的表达式可见，在平衡后，两个组的相对强度基本相同，与样品流体的pH值相关。

而且，显然(正如所料)，组a的干强度大于组b的干强度：两组具有相同量的指示剂染料；在组a中，染料以强发光B物质存在，而在组b中，有强和弱发光物质的混合物。

表1：含组a的测量的干和湿强度，如图6所示。在该组别的干pH传感器中，仅存在B物质。通过将测量湿值除以对应的测量干值，获得湿/干强度比率(例如463944/172253＝2.69)。

pH	测量的干强度	测量的湿强度	干/湿强度比
				7.18	463944	172253	2.69
7.41	475324	146897	3.24
				7.59	460287	125670	3.66

表1

表2：含组a的湿值，如图6所示，其通过干值被标准化。干值被标准化为1(例如463944/463944＝1)。通过将表1的测量湿值除以表1的对应干值获得标准化湿值(例如172253/463944＝0.371)。通过将标准化干值除以标准化湿值获得干/湿强度比值(例如1/0.371＝2.69)。

pH	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				7.18	1	0.371	2.69
7.41	1	0.309	3.24
				7.59	1	0.273	3.66

表2

表1和表2的对比表明，获得等同的干/湿比值，与是否通过将测量湿值除以测量干值获得该比值无关，或与是否首先通过干值标准化测量湿值然后通过除以标准化值计算比值无关。

标准化允许以图形形式对比具有不同发光强度的传感器的测量曲线或测量数据。

表3：包含如图6中提出的组b的湿值，其通过干值标准化。在该组别的干pH传感器中，A物质和B物质都存在。

pH	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				7.18	1	0.503	1.99
7.41	1	0.399	2.51
				7.59	1	0.338	2.96

表3

3.12.Na⁺传感器的测量结果

表4：用于测定水性样品中Na⁺离子浓度的传感器的标准化干强度和湿强度。

cNa+[mmol/l]	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				122	1	0.290	3.45
143	1	0.319	3.13
				155	1	0.338	2.96

表4

3.13.K⁺传感器的测量结果

表5：用于测定水性样品中K⁺离子浓度的传感器的标准化干强度和湿强度。

cK+[mmol/l]	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				3.0	1	0.346	2.89
4.9	1	0.383	2.61
				5.9	1	0.401	2.49

表5

3.14.Ca⁺⁺传感器的测量结果

表6：用于发光-光学测定水性样品中离子化Ca⁺⁺的传感器的标准化干强度和湿强度。

cCa++[mmol/l]	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				1.55	1	0.317	3.15
1.23	1	0.345	2.90
				0.84	1	0.359	2.79

表6

3.16.Cl^-传感器的测量结果

表7：用于测定水性样品中Cl^-离子浓度的传感器的标准化干强度和湿强度。

cCl-[mmol/l]	标准化的干强度	标准化的湿强度	干/湿强度比
				88	1	0.386	2.59
106	1	0.352	2.84
				119	1	0.321	3.12

表7

使用的Cl^-传感器描述于美国专利第6,613,282号(Huber)。

Claims (14)

1.用光学传感器测定水性样品介质中存在的非挥发性分析物浓度的方法，所述光学传感器包含发光指示剂染料，并在用户处利用单点校准法校准，所述发光指示剂染料的发光依赖于分析物浓度，所述方法包括：

在用户处检测干传感器的发光，获得用户处的干校准值，

在用户处获得与水性样品介质接触的传感器的发光测量值，并由发光测量值、在工厂处获得的湿对干的关系和用户处的干校准值推断非挥发性分析物的浓度。

2.权利要求1的方法，所述方法包括：

a)在工厂处

i.由多个以相同方式制造的干传感器S_n中选择代表性数量的干传感器S₀；

ii.检测各个选定干传感器S₀的发光，获得工厂处的干校准值；

iii.随后，在与至少两种水性校准介质接触后检测各个选定传感器S₀的发光，获得工厂处的湿校准值，所述水性校准介质具有已知不同浓度的非挥发性分析物；

iv.由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值获得传感器S₀的湿对干关系，该该湿对干关系被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的湿对干关系；

b)在用户处

i.检测来自以相同方式制造的多个传感器S_n的干传感器S₁的发光，获得用户处的干校准值；

ii.获得与水性样品介质接触的传感器S₁的发光测量值；和

iii.由发光测量值、用户处的干校准值和由工厂处获得的湿对干关系计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

3.权利要求2的方法，其中所述湿对干关系包括相对特性和比值，所述方法还包括：

在步骤a)iv.中

由工厂处湿校准值获得传感器S₀的相对特性，该相对特性被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的相对特性；并由工厂处湿校准值和工厂处干校准值得出比值，该比值被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的比值；和

在步骤b)iii.中

由发光测量值、用户处的干校准值、相对特性和在工厂处获得的比值计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

4.权利要求3的方法，所述方法包括

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中发光指示剂染料基本上完全作为B物质存在，分析物或分析物类似物与B物质结合，

在步骤a)ii中

获得工厂处的干校准值L_mD ^*，

在步骤a)iii.中

选择至少一种水性校准介质的分析物S的浓度，使得在润湿和平衡后基本上只有B物质存在，并检测工厂处的湿校准值L_mW ^*，

在步骤a)iv.中

由工厂处的干校准值L_mD ^*和工厂处的湿校准值L_mW ^*计算比值R_mD/W，

在步骤b)i.中

获得用户处的干校准值L_mD，和

在步骤b)iii.中

由L_mD和比值R_mD/W计算用户处的换算因数L_mW，并由发光测量值、用户处的换算因数L_mW和相对特性测定非挥发性分析物的浓度。

5.权利要求3的方法，所述方法包括

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中发光指示剂染料以A物质和B物质的形式存在，分析物或分析物类似物结合B物质但不结合A物质，B物质浓度(cB)相对于发光指示剂染料总浓度(cD)的比率V(V＝cB/cD)是已知的，处于0.1-0.9之间，优选处于0.3-0.7之间，其中cD是以A物质形式存在的发光指示剂染料的浓度(cA)和以B物质形式存在的发光指示剂染料的浓度(cB)的和，

在步骤a)ii.中

获得工厂处的干校准值L_D ^*，

在步骤a)iii.中

选择至少一种水性校准介质的分析物S的浓度，使得在润湿和平衡后基本上只有B物质存在，并检测工厂处的湿校准值L_mW ^*，

在步骤a)iv.中

由工厂处的干校准值L_D ^*和工厂处的湿校准值L_mW ^*计算比值R_D/_W，

在步骤b)i.中

获得用户处的干校准值L_D，和

在步骤b)iii.中

由L_D和比值R_D/W计算用户处的换算因数L_mW，并

由测量发光值、用户处的换算因数L_mW和相对特性确定非挥发性分析物的浓度。

6.权利要求3的方法，所述方法包括

在步骤a)i.中

选择传感器S₀，其中发光指示剂染料以A物质和B物质的形式存在，分析物或其类似物结合B物质但不结合A物质，B物质浓度(cB)相对于发光指示剂染料总浓度(cD)的比率V(V＝cB/cD)是已知的，处于0.1-0.9之间，优选处于0.3-0.7之间，其中cD是以A物质形式存在的发光指示剂染料的浓度(cA)和以B物质形式存在的发光指示剂染料的浓度(cB)的和，

在步骤a)ii.中

获得工厂处的干校准值L_D ^*，

在步骤a)iii.中

检测传感器S₀对至少两种水性校准介质的发光强度，所述水性校准介质具有已知不同的分析物S浓度cS_i，获得至少两个工厂处的湿校准值L_iW ^*，和

在步骤a)iv.中

由数值对L_iW ^*、cS_i获得传感器S₀的相对特性和工厂处的湿校准值L_mW ^*，并

由其计算对相同方式制造的所有传感器S_n有效的相对特性，及

由工厂处的干校准值L_D ^*和工厂处的湿校准值L_mW ^*计算比值R_D/W，获得

在步骤b)i.中

用户处的干校准值L_D，和

在步骤b)iii.中

由L_D和比值R_D/W计算用户处的换算因数L_mW，并

由发光测量值、用户处的换算因数L_mW和相对特性测定非挥发性分析物的浓度。

7.权利要求2的方法，所述方法包括

在步骤a)iv中

由工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值获得传感器S₀的相对特性，该相对特性被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的相对特性；和

在步骤b)iii.中

由发光测量值、用户处的干校准值和在工厂处获得的相对特性计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

8.权利要求2的方法，所述方法包括

在步骤a)iv中

计算工厂处的湿校准值和工厂处的干校准值的比值；并

由该比值获得传感器S₀的相对特性，该相对特性被视为以相同方式制造的所有传感器S_n的相对特性；和

在步骤b)iii.中

由用户处的干校准值和发光测量值计算用户处的比值；并

由用户处的比值和相对特性计算水性样品介质中存在的非挥发性分析物的浓度。

9.权利要求7或8的方法，所述方法的特征在于，在工厂处选择至少m个传感器，并获得m个干校准值t_i，其中i＝1-m，以及用n≥2种不同水性校准介质中的至少1种由每个传感器获得湿校准值，每种校准介质使用至少1次，使得获得k≥n个湿校准值k_ij，j＝1-n，并由各对t_i、k_ij计算比值k_i/t_i，由这些比值得出传感器的相对特性。

10.权利要求5或6的方法，其特征在于，为在传感器S_n中建立A物质和B物质的预定已知比率V＝cB/cD，其中cD＝cA+cB，用水性清洗介质清洗携带指示剂的基质或传感器，所述水性清洗介质包含适宜浓度的分析物或分析物类似物，预定比率在平衡后建立，并通过干燥携带指示剂的基质或传感器固定。

11.权利要求10的方法，其特征在于，对于pH传感器，使用具有已知pH值的酸、碱或缓冲液作为清洗介质。

12.权利要求10或11的方法，其特征在于，对于多个以相同方式制造的传感器S_n的每个干传感器，A物质和B物质的比例基本相同，并随时间推移恒定。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于，光学传感器以干态储存于工厂处和用户处。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其特征在于，用于测定非挥发性分析物的至少一种光学传感器与用于测定挥发性分析物如O₂或CO₂的浓度的传感器组合使用，或者以接合传感器配置使用。

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