ES2963514T3 - Imagenología modulada por pH de objetivos cercanos a una superficie sólida - Google Patents

Imagenología modulada por pH de objetivos cercanos a una superficie sólida Download PDF

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Abstract

Se proporcionan métodos para obtener imágenes de una muestra biológica, que implica el uso de modulación electroquímica del pH en combinación con etiquetas sensibles al pH para lograr imágenes localizadas con una alta resolución axial vertical. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Imagenología modulada por pH de objetivos cercanos a una superficie sólida
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a un método de imagenología para una muestra biológica, que implica la modulación electroquímica del pH y etiquetas sensibles al pH.
Antecedentes
El estudio de procesos biológicos específicos, tales como fenómenos relacionados con la membrana celular y el transporte basado en vesículas, puede facilitarse mediante la recopilación de imágenes de una capa muy delgada y bien definida de la muestra. Los métodos disponibles actualmente que pueden lograr esto incluyen la microscopía confocal, microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés) e imagenología fluorescente potenciada por resonancia de plasmón superficial (SPRF, por sus siglas en inglés). La microscopía confocal utiliza una abertura estenopeica para enfocar sólo una capa muy fina de la muestra objetivo. TIRF activa sólo los tintes cercanos a la superficie reflejando internamente la luz láser de modo que el campo evanescente sólo se extienda una corta distancia en la disolución. SPRF se basa en ondas evanescentes de plasmón de superficie para excitar los fluoróforos localizados en la interfase. La microscopía de fuerza atómica (AFM) también proporciona información topográfica en una región superficial pequeña y localizada. La microscopía electroquímica de barrido (SECM) se utiliza a menudo para sondear el comportamiento electroquímico local de interfase, además de la información topográfica.
Las aplicaciones biológicas comunes de estas técnicas de imagenología incluyen la observación de apoptosis y necrosis de las células, la unión de varios sustratos a las superficies de las células, y la unión de varios ligandos para capturar agentes, tales como proteínas, ADN, ARN, aptámeros, péptidos, polisacáridos u otras biomoléculas. Estas aplicaciones requieren una alta resolución vertical para capturar eficazmente la información de la región de interés localizada bien definida. Como resultado, las soluciones disponibles actualmente (por ejemplo, las tecnologías de imagenología mencionadas anteriormente) requieren conjuntos especiales de componentes ópticos y/o físicos, que normalmente se suministran como costosos sistemas independientes o equipos complementarios de alto costo.
El documento de patente WO 03/043402A2 divulga un método para la detección o cuantificación de un analito de ácido nucleico que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico, en donde dicha sonda de ácido nucleico está compuesta por un ácido nucleico derivatizado con dos tintes no idénticos unidos covalentemente, de los cuales al menos un tinte es fluorescente, y de los cuales un tinte es un tinte sensible al pH, en donde los colorantes están unidos al mismo nucleótido o a nucleótidos adyacentes de la sonda de ácido nucleico; (b) poner en contacto dicha sonda de ácido nucleico con un analito de ácido nucleico para permitir la hibridación de la sonda de ácido nucleico con el analito de ácido nucleico; (c) retirar de la mezcla la sonda de ácido nucleico no hibridada; y (d) medir la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico hibridada en una o más condiciones en las que se define el pH del medio.
El documento de patente US 2016/003766 A1 divulga un método que comprende la fijación de una proteína fluorescente sensible al pH en una superficie de un electrodo en presencia de un agente modulador de pH en disolución y el monitoreo de la fluorescencia de la proteína para determinar el pH en el electrodo.
Breve descripción de la invención
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de soluciones económicas que proporcionen una imagenología localizada que sea compatible con los instrumentos microscópicos existentes y que pueda utilizarse en una amplia gama de aplicaciones biológicas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1 de imagenología de una muestra biológica, en donde el método comprende
(a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde
la disolución amortiguada comprende un agente modulador de pH;
la superficie opcionalmente comprende microestructuras;
la muestra biológica etiquetada está acoplada a la superficie o a las microestructuras; y
las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través del cual se difunde el agente modulador de pH,
(c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente a la superficie del electrodo, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y
(d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 9 de imagenología de una muestra biológica, en donde el método comprende
(a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde
la superficie comprende un recubrimiento;
el recubrimiento comprende un agente modulador de pH;
el recubrimiento opcionalmente comprende microestructuras;
la disolución amortiguada opcionalmente comprende el agente modulador de pH;
la muestra biológica etiquetada está acoplada al recubrimiento o a las microestructuras; y
las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través del cual se difunde el agente modulador de pH en la disolución amortiguada, cuando está presente,
(c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente al recubrimiento, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y
(d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
Se establecen realizaciones adicionales en las reivindicaciones dependientes.
Otros aspectos, características y realizaciones se harán evidentes al considerar la descripción detallada y los dibujos adjuntos.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A es un esquema que ilustra un sistema para imagenología modulado por pH, en el que la modificación de pH no está en efecto.
La Figura 1A es un esquema que ilustra un sistema para imagenología modulado por pH, en el que la modificación de pH está en efecto.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el pH cambiante de una disolución mediante la oxidación/reducción de quinonas en una disolución amortiguadora de fosfato 1 mM en un electrodo de óxido de estaño indio. Los valores de pH se determinaron mediante un electrodo de detección de óxido de iridio precalibrado modelado en la superficie y el control de bucle cerrado alcanzó los valores de pH objetivo de una manera precisa y rápida.
La Figura 3A es un esquema que ilustra una configuración ejemplar de un sustrato de imagenología modulado por pH, en el que un agente modulador de pH está en disolución
La Figura 3B es un esquema que ilustra una configuración ejemplar de un sustrato de imagenología modulado por pH similar a la Figura 3A con estructuras topológicas de superficie adicionales.
La Figura 3C es un esquema que ilustra una configuración ejemplar de un sustrato de imagenología modulado por pH, en el que un agente modulador de pH está incrustado en una capa de recubrimiento.
La Figura 3D es un esquema que ilustra una configuración ejemplar de un sustrato de imagenología modulado por pH similar a la Figura 3C con estructuras topológicas de superficie adicionales.
Descripción detallada
Antes de explicar en detalle cualquier realización, se entenderá que la presente divulgación no pretende limitarse en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en las siguientes figuras. Las realizaciones son capaces de tener otras configuraciones, y de que se practiquen o lleven a cabo de varias maneras.
La presente divulgación proporciona una solución técnica para realizar la imagenología de una muestra biológica con una ventana de imagenología muy pequeña cerca de una superficie que se puede añadir a las plataformas de imagenología existentes, tales como microscopios fluorescentes. La presente tecnología implica el uso de modulación electroquímica del pH para lograr una imagenología localizada de una muestra biológica etiquetada con una etiqueta sensible al pH. La presente tecnología puede lograr una alta resolución axial vertical, similar a la microscopía confocal o la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF).
Los términos “comprende(n)”, “comprender”, “incluye(n)”, “incluir”, “tener”, “tiene”, “contiene(n)”, “contener”, y variantes de los mismos, como se usan en la presente, son frases transitorias abiertas, términos o palabras que pretenden abarcar los elementos enumerados a continuación y sus equivalentes, así como elementos adicionales. Las formas singulares “uno”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Cuando se utiliza el término “comprender”, la presente divulgación también contempla otras realizaciones de “comprender”, “consistir en” y “consistir esencialmente en”, las realizaciones o elementos presentados en la presente, ya sea explícitamente establecidos o no.
Cualquier rango numérico recitado en la presente incluye todos los valores desde el valor inferior hasta el valor superior. Por ejemplo, si un rango de concentración se indica como 1 % a 50 %, se pretende que valores como 2 % a 40 %, 10 % a 30 %, o 1 % a 3 %, etc., se enumeren expresamente en esta memoria descriptiva. Estos son sólo ejemplos de lo que se pretende específicamente, y todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre e incluyendo el valor más bajo y el valor más alto enumerado deben considerarse expresamente establecidas en esta solicitud.
El modificador “aproximadamente” utilizado en relación con una cantidad incluye el valor indicado y tiene el significado dictado por el contexto (por ejemplo, incluye al menos el grado de error asociado con la medición de la cantidad en particular). También debe considerarse que el modificador "aproximadamente” divulga el rango definido por los valores absolutos de los dos extremos. Por ejemplo, la expresión “de aproximadamente 2 a aproximadamente 4” también divulga el rango “de 2 a 4”. El término “aproximadamente” puede referirse a más o menos 10 % del número indicado. Por ejemplo, “aproximadamente 10 %” puede indicar un rango de 9 % a 11 %, y “aproximadamente 1” puede significar de 0,9-1,1. Otros significados de “aproximadamente” pueden ser aparentes a partir del contexto, tal como redondear, así que, por ejemplo “aproximadamente 1” también puede significar de 0,5 a 1,4.
Las definiciones de grupos funcionales específicos y términos químicos se describen con más detalle más adelante. Para los propósitos de la presente divulgación, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la tabla periódica de los elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed., cubierta interior, y los grupos funcionales específicos se definen en general como se describe en la misma. Adicionalmente, los principios generales de la química orgánica, así como restos funcionales específicos y reactividad, se describen en Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith y March March's Advanced Organic Chemistry, 5a edición, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3a edición, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para la imagenología de una muestra biológica, que comprenden
(a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde
la disolución amortiguada comprende un agente modulador de pH;
la superficie opcionalmente comprende microestructuras;
la muestra biológica etiquetada está acoplada a la superficie o a las microestructuras; y
las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través del cual se difunde el agente modulador de pH,
(c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente a la superficie del electrodo, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y
(d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para la imagenología de una muestra biológica, que comprenden
(a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde
la superficie comprende un recubrimiento;
el recubrimiento comprende un agente modulador de pH;
el recubrimiento opcionalmente comprende microestructuras;
la disolución amortiguada opcionalmente comprende el agente modulador de pH;
la muestra biológica etiquetada está acoplada al recubrimiento o a las microestructuras; y
las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través del cual se difunde el agente modulador de pH en la disolución amortiguada, cuando está presente,
(c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente al recubrimiento, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y
(d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
La muestra biológica puede acoplarse a la superficie, recubrimiento o microestructuras como se describe en la presente a través de diversas interacciones físicas o químicas entre la muestra biológica y la parte correspondiente en la superficie, recubrimiento o microestructuras. Ejemplos de tales interacciones incluyen, pero no se limitan a, contacto, adherencia, enlace covalente, enlace de hidrógeno, enlace iónico, unión ligando-receptor y unión antígeno-anticuerpo. En algunas realizaciones, el acoplamiento puede ser en forma de contacto simple o adherencia. Por ejemplo, la muestra biológica puede colocarse en contacto físico con, o adherirse a, la superficie, recubrimiento, o microestructuras en los presentes métodos. La muestra biológica puede tener al menos una parte de su estructura acoplada a al menos una parte correspondiente en la superficie, recubrimiento o microestructuras.
La muestra biológica puede ser un tejido fijo, células, tales como células fijas y células vivas, vesículas extracelulares y biomoléculas con patrones de superficie, tales como proteínas, ADN, ARN y péptidos, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de tejido, una célula, una vesícula pequeña o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una célula.
La etiqueta sensible al pH divulgada en la presente se refiere a cualquier agente que produce una señal óptica, directa o indirectamente, en respuesta a un cambio del valor del pH. Las etiquetas sensibles al pH adecuadas incluyen, entre otras, un tinte fluorescente, una proteína fluorescente, una enzima y combinaciones de los mismos. La muestra biológica puede estar etiquetada con la etiqueta sensible al pH usando métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los métodos de etiquetado pueden incluir el uso de agentes de captura etiquetados conocidos, tales como anticuerpos, ADN, ARN, aptámeros, péptidos, lípidos y moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, los métodos de etiquetado pueden incluir la modificación química a través de un grupo funcional, tal como metoxi- o etoxi-, acetoxi- y triclorosilano, amina primaria o secundaria, éster de NHS, maleimida, azidas o tiol.
En algunas realizaciones, la etiqueta sensible al pH es un colorante fluorescente sensible al pH. Los tintes fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, pHrodo, Protonex, Oregon Green, LysoSensor Green, pHAb, fluoresceína, FAM, derivados de rodamina B, y SNARF.
Las proteínas fluorescentes adecuadas incluyen, pero no se limitan a, proteína verde fluorescente, proteína amarilla fluorescente y proteína cian fluorescente. En algunas realizaciones, la proteína fluorescente es proteína verde fluorescente (GFP).
Las enzimas adecuadas útiles como etiquetas sensibles al pH incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), glucosa oxidasa y fosfatasa alcalina.
El agente modulador de pH se refiere a un compuesto o una composición que sufre una reacción química en una disolución en respuesta a potenciales eléctricos o corrientes que causan un cambio en el valor de pH de la disolución. La reacción química puede ser una reacción redox, en la que se cambia el estado redox del agente modulador de pH. La oxidación electroquímica y/o la reducción de los agentes moduladores de pH mediante estímulo eléctrico pueden introducir cambios locales del pH a través del equilibrio entre la generación o el consumo de protones y la capacidad de amortiguación de la disolución amortiguadora. Esto puede generar una zona de modulación de pH con una distancia vertical muy corta, por ejemplo, de varios nm a varios ^m, desde la superficie del electrodo, lo que permite la imagenología de la muestra biológica sólo dentro del volumen de modulación de pH. En algunas realizaciones, los agentes moduladores de pH pueden incluir materiales que pueden realizar la transferencia de electrones acoplados con protones. Los agentes moduladores de pH adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de quinona, derivados de aminofenol, derivados de anilina, derivados de bencidina, derivados de hidracina, fenol-Ru(2,2'-bipiridina)32+y combinaciones de los mismos. Los agentes moduladores de pH adecuados también pueden incluir otros compuestos conocidos que tienen restos que responden al pH no ejemplificados anteriormente.
En algunas realizaciones, el agente modulador de pH es un derivado de quinona de cualquiera de las fórmulas (I)-(XII)
en donde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en: H; CnH2n+i; Cl F; I, Br, OM, NO2, OH, OCnH2n, OCnH2nOH, O(CnH2nO)yOH, O(CnH2nO)yOCnH2n+1, O(CnH2nO)yCOOH O(CnH2nO)yCOOM; COOH; COOM; COOCnH2n+1; CONHCnH2n+1; CON(CnH2n+1)2; SO3H; SO3M; NH2; NHCnH2n+1 N(CnH2n+1)2; NHCnH2nOH; NHCnH2nNH2; N(CnH2nOH)2; N(CnH2nNH)2; NHCOCnH2n+1; NCnH2nCOCnH2n+1 NCnH2nCOCnH2nOH; NCnH2nCOCnH2nNH2; NCnH2nCOCnH2nSH; SH; SCnH2n+1; SCnH2nOH; S(CnH2nO)yOH S(CnH2nO)yOCnH2n+1; S(CnH2nO)yCOOH; S(CnH2nO)yCOOM; OCnH2nSH; O(CnH2nO)ySH; O(CnH2nO)y SCnH2n+i CnH2n; CnH2nOCnH2n; CnH2nSCnH2n; CnH2nNHCnH2n; CnH2nN(CnH2n+1)CnH2n; CnH2n+1; CnH2nOH CnH2n+lOCnH2n; CnH2nOCnH2nOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOM; CnH2nCOOH; CnH2nCOOM CnH2nCOOCnH2n+i; CnH2nCONHCnH2n+1; CnH2nCONH(CnH2n+1)2; CnH2nSO3H; CnH2nSO3M; CnH2nNH2 CnH2nNHCnH2n+1; CnH2nN(CnH2n+1)2; CnH2nNHCnH2nOH; CnH2nNHCnH2nNH2; CnH2nN(CnH2nOH)2 CnH2nN(CnH2nNH2)2; CnH2nNHCOCnH2n+i; CnH2nNCnH2nCOCnH2nOH; CnH2nNCnH2nCOCnH2nNH2 CnH2nNCnH2nCOCnH2nSH; CnH2nSH; CnH2n+1SCnH2n; CnH2nSCnH2nOH; CnH2nS(CnH2nO)yOH; CnH2nS(CnH2nO)yOCnH2n+1 CnH2nS(CnH2nO)yCOOH; CnH2nS(CnH2nO)yCOOM; azúcares; péptidos; y aminoácidos, en donde
M es cualquier catión metálico o NH4+,
n es un número entero de 1 a 109, y
y es un número entero de 1 a 109.
En algunas realizaciones, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, y R8 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en CnH2nOH; CnH2nOCnH2nOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOM; CnH2nCOOH; CnH2nCOOM CnH2nCOOCnH2n+1; CnH2nCONHCnH2n+1; CnH2nCONH(CnH2n+1)2; CnH2nSO3H; CnH2nSO3M; CnH2nNH2; CnH2nNHCnH2n+1 CnH2nN(CnH2n+1)2; CnH2nNHCnH2nOH; CnH2nNHCnH2nNH2; CnH2nN(CnH2nOH)2; CnH2nN(CnH2nNH2)2 CnH2nNHCOCnH2n+1; CnH2nNCnH2nCOCnH2nOH; CnH2nNCnH2nCOCnH2nNH2; CnH2nNCnH2nCOCnH2nSH; CnH2nSH CnH2nSCnH2nOH; CnH2nS(CnH2nO)yOH; CnH2nS(CnH2nO)yOCnH2n+1; CnH2nS(CnH2nO)yCOOH; y CnH2nS(CnH2nO)yCOOM.
Los derivados de quinonas adecuados pueden contener varios grupos funcionales para ajustar su solubilidad, biocompatibilidad y propiedades electroquímicas. Otros ejemplos de derivados de quinonas adecuados son los descritos en US9766197, US9874538, US9910008, US10011549, US10041905, US20170010238,
y WO2017005587 (PCT/EP2016/065252).
La disolución amortiguada se refiere a una disolución acuosa u orgánica que puede mantener su valor de pH a un nivel casi constante y no interfiere con el funcionamiento de los instrumentos de imagenología. En algunas realizaciones, la disolución amortiguada es una disolución acuosa, tal como disolución amortiguadora de fosfato, disolución amortiguadora de citrato, disolución amortiguadora de acetato u otras disoluciones amortiguadoras utilizadas en aplicaciones biológicas.
En algunas realizaciones, la disolución amortiguada es una disolución en la que las funciones biológicas de la muestra biológica pueden ser detectadas o monitoreadas. Por ejemplo, la disolución amortiguada puede ser un medio para el cultivo celular.
En algunas realizaciones, la muestra biológica etiquetada con un etiqueta sensible al pH se acopla (por ejemplo, se pone en contacto) directamente con la superficie del electrodo. En algunas realizaciones, el electrodo comprende un recubrimiento en su superficie y la muestra biológica está acoplada (por ejemplo, en contacto con) el recubrimiento. El recubrimiento puede formar una capa que cubra una parte de la superficie del electrodo o toda la superficie del electrodo. En algunas realizaciones, la muestra biológica y la superficie del electrodo al que está acoplada la muestra biológica se sumergen en la disolución amortiguada. En algunas realizaciones, la muestra biológica y el recubrimiento en la superficie del electrodo al que se acopla la muestra biológica se sumergen en la disolución amortiguada.
En algunas realizaciones, la disolución amortiguada comprende un agente modulador de pH como se divulga en la presente. Por ejemplo, el agente modulador de pH puede disolverse homogéneamente en la disolución amortiguada.
En algunas realizaciones, el recubrimiento en la superficie del electrodo incluye un agente modulador de pH. Por ejemplo, el agente modulador de pH puede estar incrustado o inmovilizado en la capa de recubrimiento. La capa incrustada del agente modulador de pH puede ser una monocapa de moléculas pequeñas, o una capa de polímero, o una red de compuesto de metal/polímero reticulado 3-D. La capa puede estar unida covalentemente al o adsorbida físicamente en el electrodo. En algunas realizaciones, el electrodo o la capa incrustada de agente modulador de pH pueden ser ópticamente transparentes. En algunas realizaciones, se puede utilizar un polímero conductor como electrodo y capa de agente modulador de pH. Los polímeros conductores pueden ser, por ejemplo, polipirrol, politiofeno, polifluoreno o polianilina, etc.
En ciertas realizaciones, el agente modulador de pH puede estar unido covalentemente a la superficie del electrodo a través de un grupo funcional, tal como metoxi- o etoxi-, acetoxi- y triclorosilano, amina primaria o secundaria, éster de NHS, maleimida, azidas o tiol. En ciertas realizaciones, el recubrimiento en la superficie del electrodo comprende un polímero y el agente modulador de pH está integrado en el polímero como parte de una cadena principal del polímero o como una cadena lateral del polímero.
Como ejemplos no limitativos, los agentes moduladores de pH que pueden estar incrustados en la capa de recubrimiento se muestran en el Esquema 1. Los agentes moduladores de pH pueden funcionalizarse para una reacción redox para generar ácido (H3O+) o base (OH-). El panel (a) del Esquema 1 ilustra una monocapa de moléculas pequeñas funcionalizadas con grupos de fosfato, que pueden unirse a un electrodo de vidrio. El panel (b) del Esquema 1 ilustra el polímero conductor para electrodo o electrodo funcionalizado con quinona como grupo pendiente, lo que da como resultado un polímero con un espesor de película controlable. El panel (c) del Esquema 1 ilustra polímeros funcionalizados con grupos hidrófilos, que pueden mezclarse opcionalmente con los polímeros que están destinados a la funcionalización con agentes moduladores de pH para aumentar la permeación de agua, hidróxido e hidronio en el polímero, o copolimerizados con agentes moduladores de pH. Por ejemplo, los polímeros hidrófilos pueden incorporarse con los agentes moduladores de pH para aumentar la permeación de agua en la capa de polímero. La funcionalidad de modulación del pH y los grupos hidrófilos pueden combinarse en el mismo polímero (co-polimerizados). Alternativamente, dos polímeros, uno que contiene funcionalidad de modulación de pH y otro que contiene restos hidrófobos, pueden mezclarse físicamente.
En algunas realizaciones, tanto la disolución amortiguada como el recubrimiento en la superficie del electrodo incluyen un agente modulador de pH.
En los paneles (a) y (b) del Esquema 1, las formas oxidadas de los agentes moduladores de pH se muestran a la izquierda y las formas reducidas se muestran a la derecha, y la modulación del pH se puede lograr a través de liberación o la absorción de protones por los restos electroquímicamente activos en la capa incrustada del agente modulador de pH. Por ejemplo, para hacer que la capa de disolución cerca del electrodo sea más ácida en comparación con la disolución a granel, los agentes moduladores de pH en la capa se convierten de la forma reducida a la forma oxidada; para hacer más básico el pH de la capa de la disolución cerca del electrodo, los agentes moduladores de pH en la capa se convierten del estado oxidado al estado reducido. En ambos casos, un resto de quinona/hidroquinona se utiliza como un ejemplo no limitativo del grupo funcional con capacidad de modulación de pH. También se pueden utilizar otros agentes moduladores de pH adecuados que tengan grupos funcionales similares.
La señal óptica producida en el presente método puede ser una señal colorimétrica, tal como el cambio de color, una señal quimioluminiscente, tal como la emisión de quimioluminiscencia, o una señal fluorescente, tal como la emisión de fluorescencia. La producción y la intensidad de la señal óptica dependen de las etiquetas sensibles al pH de la muestra biológica. En algunas realizaciones, la señal óptica es la emisión de fluorescencia de las etiquetas sensibles al pH en respuesta a la modulación del pH, que puede ser detectada por un microscopio de fluorescencia conocido en la técnica. En realizaciones particulares, la señal óptica también puede referirse a la diferencia entre la salida óptica detectada (por ejemplo, intensidades de fluorescencia) en varias etapas del presente método. Por ejemplo, la señal óptica puede referirse al cambio en la intensidad de fluorescencia detectada antes y después de que se aplique un potencial o corriente al electrodo como se divulga en en la presente.
La modulación de pH del método actual puede realizarse aplicando corriente o tensión al electrodo. En algunas realizaciones, el potencial eléctrico o la corriente utilizada en la presente para la modulación de pH puede definirse mediante una forma de onda capaz de ser modulada con base en un esquema de control de bucle abierto y/o circuito cerrado para cambiar el tamaño de la zona modulada de pH. Por ejemplo, el tamaño de la zona modulada de pH adyacente a la superficie del electrodo o el recubrimiento en el electrodo puede controlarse ajustando los parámetros de la forma de onda. En ciertas realizaciones, la altura de la zona (altura z) puede modificarse provocando un cambio en el número de etiquetas sensibles al pH activadas en la muestra biológica, y el cambio resultante en la señal óptica (por ejemplo, fluorescencia) puede analizarse durante el proceso de obtención de imágenes (análisis de tiempo). Por ejemplo, se puede realizar una medición de fluoróforos activados en la muestra biológica para una altura de zona de hasta aproximadamente 300 nm de la superficie del electrodo, seguida de la repetición de dicha medición de fluoróforos activados para una altura de zona de hasta aproximadamente 350 nm. A partir de estos resultados, se puede resolver la contribución de la señal de una porción de 50 nm (diferencia entre las dos mediciones).
En algunas realizaciones, la superficie del electrodo o el recubrimiento en la superficie del electrodo incluye microestructuras a las que puede acoplarse la muestra biológica (por ejemplo, por adherencia, unión química, u otras interacciones), definiendo un volumen entre la muestra biológica y la superficie (por ejemplo, entre la muestra biológica y las microestructuras en la superficie o el recubrimiento), a través del cual se difunde el agente modulador de pH. Por ejemplo, un agente modulador de pH disuelto en la disolución amortiguada puede difundirse a través de este volumen.
En ciertas realizaciones, el acoplamiento (por ejemplo, adherencia, unión química u otras interacciones) de la muestra biológica a la superficie o al recubrimiento con las microestructuras es en un grado más alto que el acoplamiento de la muestra biológica a la superficie o al recubrimiento sin las microestructuras. Por ejemplo, la microestructura puede promover la adhesión o la unión de la muestra biológica (tal como una célula) a la superficie del electrodo. En ciertas realizaciones, las microestructuras también pueden proporcionar una forma adicional de cambiar el área real de imagenología de la muestra biológica. Para la misma altura de la zona de modulación de pH, el área (o cantidad) de los fluoróforos activados en la muestra biológica puede ser diferente dependiendo de la altura de las microestructuras en donde está acoplada la muestra biológica. Por ejemplo, si la zona de modulación de pH tiene una altura de zona de hasta aproximadamente 500 nm y la altura de las microestructuras es de 450 nm, la señal real aportada por la muestra biológica puede ser de 50 nm. Si la altura de las microestructuras es de 400 nm, la contribución de la señal puede ser de 100 nm de la muestra biológica.
En ciertas realizaciones, la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie con las microestructuras es mayor que la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie del electrodo o el recubrimiento sin las microestructuras. Por ejemplo, al acoplar la muestra biológica (tal como una célula) a la superficie del electrodo o el recubrimiento después de la activación, puede haber un agotamiento localizado del agente modulador de pH, ya que la muestra biológica bloquea la difusión de la disolución amortiguada para traer nuevas moléculas redox para modular el pH. La microestructuración puede aumentar el tamaño de la zona de pH generada entre la muestra biológica y la superficie del electrodo. Al tener una superficie de electrodo microestructurada, la extensión de agotamiento se reduce, ya que hay más volumen entre la muestra biológica y la superficie del electrodo para suministrar el agente modulador de pH, manteniendo así la zona modulada de pH. Por lo tanto, las microestructuras pueden permitir una disponibilidad suficiente del agente modulador de pH para cambiar el pH de una zona adyacente a la superficie del electrodo.
Las unidades de control eléctrico adecuadas incluyen, pero no se limitan a, componentes electrónicos que tienen salida de fuente de corriente/tensión y entrada sensora, software que controla los parámetros eléctricos.
El electrodo puede incluirse en un sustrato, tal como un sustrato de vidrio, en el que se puede realizar la imagenología de la muestra biológica. Los sustratos adecuados incluyen aquellos con electrodos con patrones, incluido el electrodo de trabajo (WE) y/o el electrodo de detección (SE). Se utiliza al menos un electrodo (WE) en el método divulgado. Se puede utilizar opcionalmente un electrodo de detección en el método divulgado.
El contraelectrodo (CE) y el electrodo de referencia (RE) se utilizan generalmente en los presentes métodos para el control electroquímico. Estos electrodos pueden ser electrodos externos o electrodos incorporados al sustrato.
En algunas realizaciones, el método actual puede incluir una unidad de control de bucle cerrado. El monitoreo del pH real durante la modulación a través de la señal del electrodo de detección de pH puede permitir la implementación de un control de bucle cerrado, lo que permite un control de pH más rápido y preciso. Ejemplos de unidades de control de bucle cerrado adecuadas para controlar el pH cerca de la superficie del electrodo incluyen, pero no se limitan a, las descritas en US20170010238.
En algunas realizaciones, el sustrato es un portaobjetos de vidrio. Ejemplos de sustrato de portaobjetos de vidrio, electrodos y unidades de control incluyen los descritos en US991 0008.
En algunas realizaciones, el presente método comprende además someter a imagenología la muestra biológica en una matriz de módulos de control y/o de obtención de imágenes, en donde cada módulo comprende un ciclo independiente de (a)-(d) como se divulgó en la presente. Las tecnologías de matriz adecuadas incluyen, pero no se limitan a, la matriz complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS), la matriz de electrodos, la matriz de transistores de película delgada (TFT), y otras conocidas en la técnica Entre los ejemplos de matrices adecuadas se incluyen las matrices de múltiples sitios, como se describen en US981 0688.
Proceso de imagenología representativo
Una ilustración esquemática del método actual se muestra en las Figuras 1A y 1B. En lugar de utilizar un ajuste óptico o físico especial, se utiliza una unidad de control eléctrico simple con sustrato con patrón de electrodo. Cuando la modulación del pH no está en efecto (Figura 1A), los tintes sensibles al pH en la muestra biológica (por ejemplo, la célula) no se activan y no se observa ninguna señal óptica. Cuando se aplica un potencial al electrodo de trabajo (Figura 1B), se crea una zona de modulación de pH adyacente a la superficie del electrodo, activando así los tintes sensibles al pH dentro de la zona para producir una señal óptica (por ejemplo, fluorescencia).
La oxidación/reducción electroquímica reversible de los agentes moduladores de pH, tales como derivados de la quinona, derivados de hidracina o agua, puede inducir un cambio rápido del pH en una región local. Se ha demostrado que el pH puede ser modulado con derivados de quinona en el rango de 3 a 10. El límite de modulación de pH puede depender del pKa, del potencial de oxidación/reducción de los agentes moduladores de pH específicos y de su concentración. La Figura 2 muestra la modulación del pH bajo demanda por la oxidación de 2,5-dimetilhidroquinona en el electrodo de óxido de indio-estaño en disolución amortiguadora de fosfato 1mM. Cuando se aplica corriente anódica al electrodo, la producción de protones supera la capacidad amortiguadora y el pH de la disolución se vuelve más ácido. Este es un ejemplo para el caso de uso de imagenología selectiva de un tinte sensible al pH que tiene una fluorescencia óptima a pH ácido, tal como pHrodo o Protonex.
En caso de que los agentes moduladores de pH se inmovilicen a la capa de recubrimiento, la cantidad de agentes moduladores de pH puede ser un factor limitativo y puede introducir un límite de duración de tiempo entre 1 |js y 1 min. En este caso, un esquema de modulación basado en pulsos puede ser más apropiado. Un único pulso de tensión o corriente puede generar una ventana de modulación de pH que puede durar temporalmente, lo que puede permitir una imagenología de tiempo único con una duración corta. Si el proceso redox de los agentes moduladores de pH seleccionados es reversible, como es el caso de las quinonas, por ejemplo, la realización de múltiples rondas de imagenología puede ser posible a través de los ciclos de oxidación/reducción.
El grosor de la zona de modulación del pH puede controlarse ajustando la capacidad de amortiguación de la disolución y los parámetros de control eléctrico. Una mayor capacidad de disolución amortiguadora dará como resultado una zona de modulación más delgada, al igual que la rampa de corriente asociada con el impulso eléctrico o el tiempo transcurrido entre el inicio del impulso y el inicio de la recolección de imágenes, entre otros factores. De esta manera, la imagenología modulada por pH puede permitir que cualquier microscopio de fluorescencia existente produzca imágenes similares a la microscopía TIRF o la microscopía confocal enfocada en el volumen muy cercano al sustrato. En principio, la imagenología modulada por pH se puede utilizar junto con cualquiera de estas técnicas para mejorar aún más la capacidad de imagen al añadir control dinámico del entorno de imagenología a través del control de pH.
Las Figura 3A-3D muestran configuraciones ejemplares de los diferentes esquemas experimentales. La Figura 3A muestra el caso en donde el agente modulador de pH se añade a la disolución. En este caso, se puede llevar a cabo una modulación continua del pH durante un tiempo más largo. Sin embargo, para la imagenología de células vivas, pueden utilizarse agentes moduladores de pH biocompatibles que no interfieran con las funciones fisiológicas de las células.
La Figura 3C muestra el caso de usar una capa de recubrimiento que tiene agentes moduladores de pH incrustados. En este escenario, el contacto directo entre los agentes moduladores de pH y la muestra biológica objetivo puede minimizarse (en comparación con tener el agente modulador de pH disuelto en toda la disolución amortiguada) y los efectos adversos de los agentes moduladores de pH, si los hubiera, pueden reducirse.
Como se muestra en la Figura 3B y Figura 3D, el sustrato puede tener estructuras topológicas adicionales (por ejemplo, microestructuras) a través de nano y/o micro-fabricación o química de la superficie, etc. Estas características pueden introducir una adhesión más fuerte de la muestra biológica al sustrato del electrodo, actuar como una señal de señalización adicional para la biología celular, y actuar como otra fuente de control de la variación estructural de 3D.
La modulación del pH se puede basar en la difusión, y el tiempo para el imagenología y la combinación específica de parámetros eléctricos se puede utilizar para controlar la altura por encima del electrodo desde el que se captura la imagen. Al tomar varias imágenes durante un período de tiempo, se puede generar un modelo 3-D de los objetos cercanos a la superficie del electrodo. En algunas realizaciones, se puede utilizar una estimulación de tipo pulso, y se pueden aplicar múltiples pulsos de modulación de pH para obtener un conjunto de imágenes que se toman a lo largo del tiempo para un monitoreo de lapso de tiempo a largo plazo.
Ventajas
El presente método implica el uso de modulación electroquímica de pH en combinación con tintes sensibles al pH para lograr una imagenología localizada de la muestra biológica, tales como muestras de tejido, células y vesículas pequeñas con una alta resolución axial vertical, similar a la microscopía confocal o la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Los agentes moduladores de pH, ya sea en disolución o en una capa delgada en la superficie de los electrodos, pueden oxidarse o reducirse electroquímicamente para generar una zona de modulación de pH que cubra una distancia de entre nanómetros y micrómetros de la superficie. En realizaciones particulares, la fluorescencia de tintes sensibles al pH dentro de la zona de modulación del pH que contiene una parte del objeto de imagenología puede contribuir a la señal. Por lo tanto, el presente método puede emplearse para visualizar temporalmente sólo un corte delgado de la muestra cerca de la superficie del electrodo mediante la toma de imágenes durante el período de modulación de pH activo.
El presente método puede permitir llevar a cabo la imagenología enfocada en superficie con un microscopio fluorescente regular simplemente utilizando una unidad de modulación electroquímica de pH y portaobjetos. Además, el tamaño de la ventana de imagenología puede ser controlado por parámetros no ópticos, tales como entradas eléctricas, microestructura, concentración del agente modulador de pH y concentración de la disolución amortiguadora, etc. Además, la modulación del pH puede proporcionar un control adicional sobre las interacciones bioquímicas. Por ejemplo, algunas enzimas tienen dependencia del pH en sus actividades; los grupos protectores de un grupo funcional en una molécula también pueden ser controlados por el pH; la especificidad, la sensibilidad y la reproducibilidad de la detección basada en anticuerpos en suero se pueden mejorar mediante la realización de la prueba en diversas condiciones de pH, que se pueden ampliar a las aplicaciones de inmunotinción.
En algunas realizaciones, se pueden emplear agentes moduladores de pH biocompatibles, tales como los adecuados para una imagenología de células vivas. Los agentes moduladores de pH biocompatibles pueden incluir modificación química o pueden inmovilizarse en el electrodo, lo que puede minimizar la interacción directa de dichos agentes con la muestra biológica que se somete a imagenología.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método de imagenología de una muestra biológica, que comprende (a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde la disolución amortiguada comprende un agente modulador de pH; la superficie opcionalmente comprende microestructuras; la muestra biológica etiquetada está acoplada a la superficie o a las microestructuras; y las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través de la cual se difunde el agente modulador de pH, (c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente a la superficie del electrodo, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y (d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente modulador de pH es un derivado de quinona, un derivado de aminofenol, un derivado de anilina, un derivado de bencidina, un derivado de hidracina, fenol-Ru(2,2'-bipiridina)32+, o una combinación de los mismos, y en donde preferiblemente el agente modulador de pH es un derivado de quinona de cualquiera de las fórmulas (I)-(XII)
    en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en: H; CnH2n+1; Cl F; I, Br, OM, NO2, OH, OC.H2., OCaHaaOH, O(CnH2nO)yOH, O(CnH2nO)yOCnH2n+1, O(CnH2nO)yCOOH O(CnH2nO)yCOOM; COOH; COOM; COOCnH2n+1; CONHCnH2n+1; CON(CnH2n+1)2; SO3H; SOsM; NH2; NHCnH2n+1 N(CnH2n+1)2; NHCnH2nOH;NNHCnH2nNH2; N(CnH2nOH)2; N(CnH2nNH)2; NHCOCnH2n+1; NCnH2nCOCnH2n+1 NCnH2nCOCnH2nOH; NCnH2nCOCnH2nNH2; NCnH2nCOCnH2nSH; SH; SCnH2n+1; SCnH2nOH; S(CnH2nO)yOH S(CnH2nO)yOCnH2n+1; S(CnH2nO)yCOOH; S(CnH2nO)yCOOM; OCnH2nSH; O(CnH2nO)ySH; O(CnH2nO)ySCnH2n+1 CnH2n; CnH2nOCnH2n; CnH2nSCnH2n; CnH2nNHCnH2n; CnH2nN(CnH2n+1)CnH2n; CnH2n+1; CnH2nOH; CnH2n+1OCnH2n CnH2nOCnH2nOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOM; CnH2nCOOH; C.H2.COOM; CnH2nCOOCnH2n+1 CnH2nCONHCnH2n+1; CnH2nCONH(CnH2n+1^ CnH2nSO3H; CnH2nSO3M; CnH2nNH2; CnH2nNHCnH2n+1; CnH2nN(CnH2n+1)2 CnH2nNHCnH2nOH; CnH2nNHCnH2nNH2; CnH2nN(CnH2nOH)2; CnH2nN(CnH2nNH2)2; CnH2nNHCOCnH2n+1 CnH2nNCnH2nCOCnH2nOH; CnH2nNCnH2nCOCnH2nNH2; CnH2nNCnH2nCOCnH2nSH; CnH2nSH; CnH2n+1SCnH2n CnH2nSCnH2nOH; CnH2nS(CnH2nO)yOH; CnH2nS(CnH2nO)yOCnH2n+1; CnH2nS(CnH2nO)yCOOH; CnH2nS(CnH2nO)yCOOM azúcares; péptidos; y aminoácidos, en donde M es cualquier catión metálico o NH4+, n es un número entero de 1 a 109, y y es un número entero de 1 a 109.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la etiqueta sensible al pH es un tinte fluorescente, una proteína fluorescente, una enzima, o una combinación de los mismos, en donde preferiblemente la etiqueta sensible al pH es un tinte fluorescente seleccionado del grupo que consiste en pHrodo, Protonex, Oregon Green, LysoSensor Green, pHAb, fluoresceína, FAM, derivados de rodamina B y SNARF, o una proteína fluorescente, o una enzima seleccionada del grupo de HRP, glucosa oxidasa y fosfatasa alcalina.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la señal óptica es una señal colorimétrica, una señal quimioluminiscente, o una señal fluorescente.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el potencial en (c) está definido mediante una forma de onda capaz de ser modulada con base en un esquema de control de bucle abierto y/o circuito cerrado para cambiar el tamaño de la zona modulada de pH.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el acoplamiento entre la muestra biológica a las microestructuras en (b) es en un grado más alto que el acoplamiento de la muestra biológica a la superficie sin la microestructura, o en donde la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie con las microestructuras es mayor que la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie sin la microestructura.
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, que además comprende someter a imagenología la muestra biológica en una matriz de módulos de control y/o de obtención de imágenes, cada módulo comprendiendo un ciclo independiente de realización de (a)-(d), en donde la matriz de módulos de control y/o de obtención de imágenes es una matriz de semiconductores complementarios de óxido metálico (CMOS), una matriz de electrodos, o una matriz de transistores de película fina (TFT).
  8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es un tejido fijo, una célula única, una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula fija y una célula viva, una vesícula, una proteína, un péptido, ADN, ARN, o una combinación de los mismos.
  9. 9. Un método de imagenología de una muestra biológica, que comprende (a) etiquetar la muestra biológica con una etiqueta sensible al pH para formar una muestra biológica etiquetada, (b) sumergir la muestra biológica etiquetada y una superficie de un electrodo en una disolución amortiguada que tenga un valor de pH, en donde la superficie comprende un recubrimiento; el recubrimiento comprende un agente modulador de pH; el recubrimiento opcionalmente comprende microestructuras; la disolución amortiguada opcionalmente comprende el agente modulador de pH; la muestra biológica etiquetada está acoplada al recubrimiento o a las microestructuras; y las microestructuras, cuando están presentes, definen un volumen entre la muestra biológica y la superficie, a través de la cual se difunde el agente modulador de pH en la disolución amortiguada, cuando está presente, (c) aplicar un potencial o una corriente al electrodo, con lo cual el agente modulador de pH provoca un cambio en el valor de pH en una zona adyacente al recubrimiento, haciendo que la etiqueta sensible al pH dentro de la zona produzca una señal óptica, y (d) detectar la señal óptica, lo que permite la imagenología de la muestra biológica etiquetada.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el agente modulador de pH es un derivado de quinona, un derivado de aminofenol, un derivado de anilina, un derivado de bencidina, un derivado de hidracina, fenol-Ru(2,2'-bipiridina)32+, o una combinación de los mismos, y en donde preferiblemente el agente modulador de pH es un derivado de quinona de cualquiera de las fórmulas (I)-(XII)
    en donde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan de forma independiente del grupo que consiste en: H; CnH2n+i; Cl; F; I, Br, OM, NO2, OH, OC.H2., OCaHaaOH, O(CnH2nO)yOH, O(CnH2nO)yOCnH2n+1, O(CnH2nO)yCOOH; O(CnH2nO)yCOOM; COOH; COOM; COOCnH2n+1; CONHCnH2n+1; CON(CnH2n+1)2; SO3H; SOsM; NH2; NHCnH2n+1; N(CnH2n+1)2; NHCnH2nOH; NHCnH2nNH2; N(CnH2nOH)2; N(CnH2nNH)2; NHCOCnH2n+1; NCnH2nCOCnH2n+1; NCnH2nCOCnH2nOH; NCnH2nCOCnH2nNH2; NCnH2nCOCnH2nSH; SH; SCnH2n+1; SCnH2nOH; S(CnH2nO)yOH; S(CnH2nO)yOCnH2n+1; S(CnH2nO)yCOOH; S(CnH2nO)yCOOM; OCnH2nSH; O(CnH2nO)ySH; O(CnH2nO)ySCnH2n+1; CnH2n; CnH2nOCnH2n; CnH2nSCnH2n; CnH2nNHCnH2n; CnH2nN(CnH2n+1)CnH2n; CnH2n+1; CnH2nOH; CnH2n+1OCnH2n; CnH2nOCnH2nOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOH; CnH2nO(CnH2nO)yCOOM; CnH2nCOOH; CnH2nCOOM; CnH2nCOOCnH2n+1; CnH2nCONHCnH2n+1; CnH2nCONH(CnH2n+1)2; CnH2nSO3H; CnH2nSO3M; CnH2nNH2; CnH2nNHCnH2n+1; CnH2nN(CnH2n+1)2; CnH2nNHCnH2nOH; CnH2nNHCnH2nNH2; CnH2nN(CnH2nOH)2; CnH2nN(CnH2nNH2)2; CnH2nNHCOCnH2n+1; CnH2nNCnH2nCOCnH2nOH; CnH2nNCnH2nCOCnH2nNH2; CnH2nNCnH2nCOCnH2nSH; CnH2nSH; CnH2n+1SCnH2n; CnH2nSCnH2nOH; CnH2nS(CnH2nO)yOH; CnH2nS(CnH2nO)yOCnH2n+1; CnH2nS(CnH2nO)yCOOH; CnH2nS(CnH2nO)yCOOM; azúcares; péptidos; y aminoácidos, en donde M es cualquier catión metálico o NH4+, n es un número entero de 1 a 109, y y es un número entero de 1 a 109.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la etiqueta sensible al pH es un tinte fluorescente, una proteína fluorescente, una enzima, o una combinación de los mismos, y en donde preferiblemente la etiqueta sensible al pH es un tinte fluorescente seleccionado del grupo que consiste en pHrodo, Protonex, Oregon Green, LysoSensor Green, pHAb, fluoresceína, FAM, derivados de rodamina B y SNARF, o una proteína fluorescente, o una enzima seleccionada del grupo de HRP, glucosa oxidasa y fosfatasa alcalina.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el recubrimiento comprende un polímero y el agente modulador de pH está integrado en el polímero como parte de una cadena principal del polímero o como una cadena lateral del polímero.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el potencial en (c) está definido mediante una forma de onda capaz de ser modulada con base en un esquema de control de bucle abierto y/o circuito cerrado para cambiar el tamaño de la zona modulada de pH, o en donde el acoplamiento de la muestra biológica al recubrimiento con la microestructura en (b) es en un grado más alto que el acoplamiento de la muestra biológica al recubrimiento sin la microestructura, o en donde la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie con las microestructuras es mayor que la concentración del agente modulador de pH en el volumen entre la muestra biológica y la superficie sin la microestructura.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 9, que además comprende someter a imagenología la muestra biológica en una matriz de módulos de control y/o de obtención de imágenes, cada módulo comprendiendo un ciclo independiente de realización de (a)-(d), en donde la matriz de módulos de control y/o de obtención de imágenes es una matriz de semiconductores complementarios de óxido metálico (CMOS), una matriz de electrodos, o una matriz de transistores de película fina (TFT).
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la muestra biológica es un tejido fijo, una célula única, una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula fija y una célula viva, una vesícula, una proteína, un péptido, ADN, ARN, o una combinación de los mismos.
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