ES2328825T3 - Metodo para preparar xilitol con alto rendimiento usando microorganismos reciclados. - Google Patents
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Abstract
Un medio químicamente definido para el cultivo de una cepa del género Candida por fermentación, que comprende 1-10 g/l de urea, 1-10 g/l de difosfato potásico, 0,01-1 g/l de sulfato magnésico, 0,1-10 mg/l de MnSO4·4H2O, 0,1-10 mg/l de CoCl2·6H2O, 0,1-10 mg/l de NaMoO4·2H2O, 0,1-10 mg/l de ZnSO4·7H2O, 0,1-10 mg/l de AlCl3·6H2O, 0,1-10 mg/l de CuCl2·2H2O, 0,01-5 mg/l de H3BO3, 1-100 mg/l de FeSO4·7H2O, 0,1-10 mg/l de ácido ascórbico, 1- 100 mg/l de biotina, 1-100 mg/l de colina y 0,1-10 mg/l de piridoxina.
Description
Método para preparar xilitol con alto
rendimiento usando microorganismos reciclados.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para producir continuamente xilitol a partir de
xilosa, con elevada productividad, al reciclar un cultivo
concentrado de una cepa en un biorreactor con microfiltración por
vacío.
El xilitol fue descrito por vez primera por el
químico Emil Fisher en 1981 y es un alcohol de azúcar de cinco
carbonos que ha sido usado como edulcorante desde 1960. El xilitol
se halla en pequeñas cantidades en plantas naturales tales como
frutas, vegetales y setas y es un producto intermedio del
metabolismo de los hidratos de carbono en los mamíferos. Además, a
causa de su dulzor equivalente al de la sacarosa y de su calor de
disolución negativo, el xilitol imparte una sensación fría y
refrescante a la cavidad oral. Por lo tanto, el xilitol se usa como
un material para productos de repostería exentos de azúcar. En
particular, puesto que no se requiere insulina para que sea
metabolizado después de su ingesta, el xilitol puede ser utilizado
como un sustituto del azúcar para pacientes diabéticos.
El xilitol puede prevenir las caries al inhibir
el crecimiento de Streptococcus mutans, que es el responsable
de la caries dental, y, por consiguiente, se usa como un material
para pasta dentífrica. Además, el xilitol no participa en la
reacción de Maillard y es un monosacárido, y, por consiguiente, a
diferencia de la sacarosa, no puede experimentar inversión. Por lo
tanto, el xilitol no presenta riesgo de degeneración ni siquiera
cuando se utiliza en un ambiente ácido. Aún más, el xilitol tiene
un punto de ebullición bajo, de 95ºC, y, por consiguiente, puede
alcanzar su punto de ebullición sin desnaturalización. Por lo tanto,
cuando se utiliza como un revestimiento de azúcar, no se requiere
particularmente que el xilitol sea disuelto en agua.
A escala industrial, el xilitol se produce por
reducción química de un producto de hidrólisis de hemicelulosa
obtenida de plantas tales como abedules blancos, mazorcas de maíz,
etc., o por conversión biológica del producto de hidrólisis en
xilitol usando una cepa microbiana. Sin embargo, con respecto al
método de producción químico, son difíciles la separación y la
purificación de la xilosa o el xilitol procedente de otros productos
de hidrólisis derivados de fracciones de hemicelulosa, y el
rendimiento en xilosa o xilitol es tan pequeño como
50-60%. Además, surgen problemas tales como el
riesgo de una reacción a alta temperatura y alta presión y la
eliminación de residuos a causa del uso de un álcali. Para resolver
estos problemas, se ha presentado la producción de xilitol a escala
industrial utilizando una cepa microbiana (véase, por ejemplo,
Biotechnology Letters 22: 1625-1628, 2000). La
producción de xilitol utilizando una cepa microbiana es
económicamente eficaz y permite la conversión selectiva de xilosa
en xilitol, lo que facilita la separación y purificación del
xilitol. Sin embargo, presenta desventajas ya que la productividad
de xilitol es tan pequeña como 2,0-3,0
g/l-h y la cepa microbiana sólo puede ser utilizada
una vez. Por esta razón, una vez acabado el cultivo, las técnicas
para producción de xilitol convencionales implican procedimientos
preparativos para el recultivo, tales como el lavado y la
esterilización, lo que conduce a un aumento de los costes de
producción.
En la producción de xilitol usando una cepa del
género Candida, como fuente de carbono se utiliza xilosa o
un producto de hidrólisis de hemicelulosa compuesto principalmente
de xilosa. Como fuente de nitrógeno, se utiliza una fuente de
nitrógeno compleja que contiene diversas vitaminas, tal como
extracto de levadura, extracto de malta, harina de soja, etcétera.
Esto es debido a que las cepas del género Candida son
organismos auxótrofos relativamente complejos, por lo que apenas
producen xilitol en un medio químico sintético. A este respecto, el
uso de un medio complejo caro llega a ser un factor que contribuye
al coste aumentado del xilitol.
Por lo tanto, para resolver los problemas de la
producción de xilitol anteriormente descrita utilizando una cepa
microbiana, los presentes inventores desarrollaron un procedimiento
para producir xilitol a partir de un cultivo de una cepa microbiana
cultivada en un medio químicamente definido. De acuerdo con este
procedimiento, la cepa microbiana es concentrada y es reciclada una
vez aislada del cultivo. Este procedimiento para producción de
xilitol puede ser aplicado a un sistema de cultivo continuo
automatizado, lo que conduce a la reducción de los costes de
producción a causa de un procedimiento de cultivo simplificado y una
producción continua de xilitol. Los presentes inventores
completaron así el presente invento.
A la vista de estos problemas, el presente
invento proporciona un medio químicamente definido para el cultivo
de una cepa del género Candida que produce xilitol.
El presente invento también proporciona un
procedimiento para producir xilitol con alto rendimiento utilizando
una cepa microbiana, en el que se separan de un cultivo la cepa y un
producto de filtración del cultivo y se concentra la cepa para
reciclado.
De acuerdo con un aspecto del presente invento,
se proporciona un medio químicamente definido para el cultivo de
una cepa del género Candida por fermentación, que incluye
1-10 g/l de urea, 1-10 g/l de
difosfato potásico, 0,01-1 g/l de sulfato magnésico,
0,1-10 mg/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O,
0,1-10 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O,
0,1-10 mg/l de NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O,
0,1-10 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,1-10 mg/l de AlCl_{3}\cdot6H_{2}O,
0,1-10 mg/l de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O,
0,01-5 mg/l de H_{3}BO_{3},
1-100 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,1-10 mg/l de ácido ascórbico,
1-100 mg/l de biotina, 1-100 mg/l
de colina y 0,1-10 mg/l de piridoxina.
De acuerdo con otro aspecto del presente
invento, se proporciona un procedimiento para producir xilitol con
alto rendimiento por cultivo de una cepa del género Candida
con reciclado, que comprende las operaciones de:
(a) introducir la cepa en el medio químicamente
definido al que se ha añadido xilosa;
(b) cultivar la cepa en el medio de la operación
(a) que contiene xilosa, en un biorreactor;
(c) extraer el cultivo del biorreactor;
(d) introducir en el biorreactor un medio fresco
que contiene xilosa como el definido en la operación (a);
(e) separar la cepa y un producto de filtración
del cultivo que se extraen del cultivo, utilizando un sistema de
microfiltración por vacío o una centrífuga;
(f) reciclar la cepa al biorreactor; y
(g) recuperar el xilitol del producto de
filtración del cultivo.
La cepa del género Candida puede ser
Candida tropicalis o su cepa mutante.
El medio que contiene xilosa utilizado el
presente invento es el medio químicamente definido anteriormente
descrito (al que más adelante se hace simplemente referencia como
"medio químico"). Es preferible utilizar el medio químico con
vistas a la eficacia económica, tal como con vistas a los costes de
producción. En este momento, como fuente de carbono, se puede
utilizar xilosa o un producto de hidrólisis de hemicelulosa
compuesto principalmente de xilosa.
Para facilitar el crecimiento de la cepa, el
medio químico puede ser complementado con 1-200 mg/l
de ácido fólico, 1-100 mg/l de inositol,
1-100 mg/l de ácido nicotínico,
0,1-10 mg/l de ácido
p-aminobenzoico, 1-100 mg/l de
ácido pantoténico, 10-1000 mg/l de riboflavina y
1-100 mg/l de tiamina.
En el procedimiento de producción del presente
invento, la cepa se cultiva mediante un método de cultivo con
alimentación controlada o un método de cultivo discontinuo.
Con respecto al cultivo de la cepa mediante
alimentación controlada, es preferible que el medio sea gradualmente
complementado con la xilosa utilizada como fuente de carbono de
modo que la concentración de xilosa se mantenga en el nivel de
40-50 g/l (con respecto al medio). En este momento,
la agitación se lleva a cabo a una velocidad de
400-600 rpm.
Mientras tanto, mediante un sistema de
microfiltración por vacío o una centrífuga, se separa del cultivo
extraído la cepa y el producto de filtración del cultivo. En
particular, si se va a usar un sistema automatizado, es preferible
utilizar un sistema de microfiltración por vacío. El sistema de
microfiltración por vacío puede ser separadamente fijado al
biorreactor o ser instalado en el biorreactor.
La cepa separada del cultivo es concentrada y
reciclada. Preferiblemente, la cepa es concentrada hasta una
densidad de 10-100 g/l del medio.
A continuación, se describirán con mayor
detalle, con referencia a los dibujos adjuntos, realizaciones
preferibles de un procedimiento para producir xilitol con elevado
rendimiento de acuerdo con el presente invento.
Sin embargo, estas realizaciones se proporcionan
sólo como ilustraciones y, por lo tanto, el presente invento no se
limita a ellas ni está limitado por ellas.
En primer lugar, se describirá simplemente un
procedimiento de producción global del presente invento con
referencia a la Figura 4, que ilustra un biorreactor provisto de un
sistema de microfiltración por vacío.
En relación con la Figura 4, se cultiva una cepa
microbiana en un biorreactor 10. Se transfiere el cultivo
resultante a un sistema 30 de microfiltración mediante una bomba
peristáltica 20. En este momento, para facilitar la filtración, se
suministra aire a presión al sistema 30 de microfiltración a través
de una entrada inferior de aire (no mostrada). Durante el
suministro de aire, cuando se hace funcionar una bomba aspirante 40
conectada a elementos de fibra hueca (no mostrados) fijados a ambas
caras del sistema 30 de microfiltración, se origina una diferencia
de presiones por caída de presión en el sistema 30 de
microfiltración. Debido a la diferencia de presiones, el cultivo
puede pasar a través de los elementos de fibra hueca fijados a ambas
caras del sistema 30 de microfiltración. En este momento, la cepa,
que no ha pasado a través de los elementos de fibra hueca, se
concentra en las porciones inferiores de los elementos de fibra
hueca y se recicla luego al biorreactor 10 mediante la bomba
peristáltica 20 para su recultivo. Se transfiere un producto de
filtración del cultivo, que ha pasado a través de los elementos de
fibra hueca, a un depósito 50 para caldos mediante la bomba
aspirante 40 para obtener de este modo xilitol mediante un
procedimiento de purificación común.
Mientras tanto, una vez completada la filtración
en el sistema 30 de mirofiltración, se añade un poco de medio
fresco a los elementos de fibra hueca, en la dirección opuesta a la
dirección de flujo del cultivo, para separar la cepa de los
elementos de fibra hueca. Luego se recicla la cepa al biorreactor 10
mediante la bomba peristáltica 20 y se devuelven los elementos de
fibra hueca a sus condiciones primeras mediante un suministro de
aire. A continuación, se lleva de nuevo a cabo el cultivo en el
biorreactor 10 que contiene un medio fresco. Para referencia, el
número 11.
Se determina el estado del cultivo utilizando
una concentración de sustrato (xilosa), una concentración de
producto (xilitol) y una concentración de cepa convertidas en peso
seco. En este momento, se prefiere que la concentración de la cepa
sea medida utilizando un turbidímetro de acuerdo con un método de
curva patrón.
La Figura 1 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con alimentación controlada en
un medio químico del presente invento;
La Figura 2 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con alimentación controlada en
un medio complejo;
La Figura 3 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con reciclado por
centrifugación, esencialmente cultivadas en un medio químico del
presente invento;
La Figura 4 es un diagrama esquemático que
ilustra un aparato para producir xilitol con alto rendimiento
mediante reciclado celular de acuerdo con una realización
preferible del presente invento (biorreactor 10; bomba peristáltica
20; sistema 30 de microfiltración; membrana 32 de fibra hueca; bomba
aspirante 40; depósito 50 para caldos; soplante 60; entrada 11 de
aire; salidas 12 y 31 de aire);
La Figura 5 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con reciclado mediante
microfiltración por vacío, esencialmente cultivadas en un medio
químico del presente invento;
La Figura 6 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con reciclado mediante
microfiltración por vacío, esencialmente cultivadas en un medio
complejo; y
La Figura 7 es un gráfico que ilustra la
productividad de xilitol, con respecto al tiempo, de un cultivo de
células de Candida tropicalis con reciclado por
microfiltración presurizada, esencialmente cultivadas en un medio
químico del presente invento.
Ejemplo
Experimental
Se midieron las concentraciones de xilosa y
xilitol usando un cromatógrafo de alta eficacia para fases líquidas
(Shimadzu C-R6A, Japón) con detector de índice de
refracción (Shimadzu RID-6A, Japón) y provisto de
una columna Sugar-Pak I (Millipore, EE.UU.). En
este momento, se dejó que el agua utilizada como disolvente fluyera
a 70ºC con un caudal de 0,6 ml/min. Se estimó la densidad celular
midiendo la turbiedad a 600 nm utilizando un turbidímetro, y
comparando el valor con una curva patrón previamente preparada con
que se relaciona la turbiedad con el peso celular en estado seco.
Se midió la concentración del oxígeno disuelto utilizando un
electrodo para oxígeno disuelto (tipo polarográfico, Ingold,
Suiza).
Ejemplo
1
Cultivo de siembra: se introdujeron las
publicadas células KCTC 7221 de Candida tropicalis en 50 ml
de un medio de crecimiento contenido en un matraz de 250 ml de
capacidad y se cultivaron a 240 rpm y 30ºC durante 10 horas.
Cultivo principal: se introdujo y cultivó
el cultivo de siembra en un fermentador de 7 l de capacidad (Biotron
Ltd.) que contenía 2 l de un medio químico compuesto por 150 g/l de
xilosa, 5 g/l de urea, 5 g/l de difosfato potásico, 0,2 g/l de
sulfato magnésico, sales metálicas (7 mg/l de
MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 4 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 2
mg/l de NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 mg/l de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 mg/l de AlCl_{3}\cdot6H_{2}O, 2
mg/l de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,5 mg/l de H_{3}BO_{3} y
40 mg/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O) y vitaminas (5 mg/l de ácido
ascórbico, 10 mg/l de biotina, 25 mg/l de colina, 50 mg/l de ácido
fólico, 10 mg/l de inositol, 25 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de
ácido p-aminobenzoico, 5 mg/l de ácido pantoténico,
1 mg/ml de piridoxina, 100 mg/l de riboflavina y 25 mg/l de
tiamina). El cultivo con alimentación controlada fue llevado a cabo
de tal modo que, durante la fermentación, el medio de fermentación
fue continuamente complementado con 1 l de disolución que contenía
510 g de xilosa para que el volumen del cultivo final se mantuviera
en 3 l, es decir, para que la concentración total de xilosa añadida
se mantuviera en 270 g/l. Las condiciones de la fermentación fueron
las siguientes: velocidad de agitación de 400 rpm, pH de 5,0
durante toda la fermentación, temperatura de fermentación de 30ºC y
velocidad de suministro de aire de 1,0 vvm (volumen de aire por
volumen de líquido por minuto). Se midió la productividad de xilitol
con respecto al tiempo de fermentación, y los resultados se
muestran en la Figura 1. En relación con la Figura 1, se obtuvieron
240 g/l de xilitol a partir de 270 g/l de xilosa después de 120
horas de fermentación. Como resultado, el rendimiento en xilitol
con respecto a la xilosa fue 89% y la productividad de xilitol fue
2,0 g/l-h. Estos resultados muestran que, para la
producción de xilitol, se puede sustituir un medio convencional
para producir xilitol por un medio químicamente definido y
barato.
Ejemplo Comparativo
1
Cultivo de siembra: se introdujeron las
publicadas células KCTC 7221 de Candida tropicalis en 50 ml
de un medio de crecimiento contenido en un matraz de 250 ml de
capacidad y se cultivaron a 240 rpm y 30ºC durante 10 horas.
Cultivo principal: se introdujo y cultivó
el cultivo de siembra en un fermentador de 7 l de capacidad que
contenía 2 l de un medio complejo compuesto por 150 g/l de xilosa,
10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de difosfato potásico y 0,2
g/l de sulfato magnésico. El cultivo con alimentación controlada fue
llevado a cabo de tal modo que, durante la fermentación, el medio
de fermentación fue continuamente complementado con 1 l de
disolución que contenía 510 g de xilosa para que el volumen del
cultivo final se mantuviera en 3 l, es decir, para que la
concentración total de xilosa añadida se mantuviera en 270 g/l. Las
condiciones de la fermentación fueron las siguientes: velocidad de
agitación de 400 rpm, pH de 5,0 durante toda la fermentación,
temperatura de fermentación de 30ºC y velocidad de suministro de
aire de 1,0 vvm. Se midió la productividad de xilitol con respecto
al tiempo de fermentación, y los resultados se muestran en la Figura
2. En relación con la Figura 2, se obtuvieron 230 g/l de xilitol a
partir de 270 g/l de xilosa después de 108 horas de fermentación.
Como resultado, el rendimiento en xilitol con respecto a la xilosa
fue 85% y la productividad de xilitol fue 2,1
g/l-h.
Ejemplo
2
Una vez que se hubo llevado el cultivo a cabo en
el mismo medio químico que en el Ejemplo 1 hasta inmediatamente
antes de que se agotara la xilosa, se centrifugó el cultivo a 5000
rpm durante 20 minutos. Las células recogidas fueron introducidas
en 2 l de un medio químico fresco y fueron recultivadas. En este
momento, las condiciones de cultivo eran las mismas que en el
Ejemplo 1, y las concentraciones de xilosa y xilitol se midieron de
la misma manera que en el Ejemplo Experimental anterior.
2 l del cultivo primario contenían 218 g de
xilitol antes de la centrifugación. En este momento, la
productividad de xilitol era 2,3 g/l-h y el
rendimiento en xilitol con respecto a la xilosa era 74%. Como
resultado de un cultivo con 14 reciclados por centrifugación, se
obtuvieron 3076 g de xilitol a partir de 28 l de cultivo completo,
y la productividad y el rendimiento de xilitol fueron
respectivamente 5,4 g/l-h y 82% (véase la Figura
3).
La cantidad de producción, la productividad y el
rendimiento de xilitol después del cultivo con 14 reciclados por
centrifugación resultaron respectivamente aumentados en un factor de
14, un factor de 2,4 y un 8% en comparación con los valores del
cultivo primario.
A partir de los resultados anteriores, se puede
ver que la eficacia en la producción de xilitol mediante el
reciclado celular del presente invento es muy excelente con respecto
a la de un cultivo discontinuo convencional.
Ejemplo
3
Una vez que se hubo llevado el cultivo a cabo en
un biorreactor que contenía el mismo medio químico que en el
Ejemplo 1 hasta inmediatamente antes de que se agotara la xilosa, se
transfirió el cultivo a un sistema de microfiltración por vacío
fijado al biorreactor para separar las células empleadas y un
producto de filtración del cultivo. Las células empleadas fueron
recicladas al biorreactor que contenía 2 l de un medio químico
fresco y fueron recultivadas. Las condiciones de cultivo fueron las
mismas que en el Ejemplo 1 (véase la Figura 4).
En este momento, se dispuso el sistema de
microfiltración por vacío con membranas de fibra hueca (0,45 \mum
de porosidad; Mitsubishi Rayon, Japón) hechas de polietileno. Las
membranas de fibra hueca se fijaron a tubos de silicio de ambas
caras del sistema de microfiltración por vacío. Se llevó a cabo la
microfiltración a través de las membranas de fibra hueca, en un
vacío creado por una bomba. Se midió la concentración de xilitol de
la misma manera que en el Ejemplo Experimental anterior.
2 l del cultivo primario contenían 194 g de
xilitol antes de la microfiltración. En este momento, la
productividad de xilitol era 2,0 g/l-h y el
rendimiento en xilitol con respecto a la xilosa era 72%. Como
resultado del cultivo con ocho reciclados por microfiltración, se
obtuvieron 2026 g de xilitol a partir de 16 l de cultivo completo,
y la productividad y el rendimiento de xilitol fueron
respectivamente 5,8 g/l-h y 87%. La cantidad de
producción, la productividad y el rendimiento de xilitol después del
cultivo con ocho reciclados por microfiltración resultaron
respectivamente aumentados en un factor de 10,4, un factor de 2,9 y
un 15% en comparación con los valores del cultivo primario (véase
la Figura 5).
Ejemplo Comparativo
2
Una vez que se hubo llevado el cultivo a cabo en
un biorreactor que contenía el mismo medio complejo que en el
Ejemplo Comparativo 1, bajo las mismas condiciones de cultivo que en
el Ejemplo 1, hasta inmediatamente antes de que se agotara la
xilosa, se transfirió el cultivo a un sistema de microfiltración por
vacío fijado al biorreactor para separar las células empleadas y un
producto de filtración del cultivo. Las células separadas fueron
recicladas al biorreactor que contenía 2 l de un medio complejo
fresco y fueron recultivadas. En este momento, el sistema de
microfiltración por vacío utilizado era el mismo que el del Ejemplo
3.
2 l del cultivo primario contenían 118 g de
xilitol antes de la microfiltración. En este momento, la
productividad de xilitol era 2,5 g/l-h y el
rendimiento en xilitol con respecto a la xilosa era 79%. Como
resultado del cultivo con siete reciclados por microfiltración, se
obtuvieron 972 g de xilitol a partir de 14 l de cultivo completo, y
la productividad y el rendimiento de xilitol fueron respectivamente
5,4 g/l-h y 85%. La cantidad de producción, la
productividad y el rendimiento de xilitol después del cultivo con
siete reciclados por microfiltración resultaron respectivamente
aumentados en un factor de 8,2, un factor de 2,2 y un 6% en
comparación con los valores del cultivo primario (véase la Figura
6).
A partir de los resultados del Ejemplo 3 y el
Ejemplo Comparativo 2 para comparación, se puede ver que un medio
químico es más adecuado para el cultivo con reciclado que un medio
complejo.
Ejemplo Comparativo
3
Una vez que se hubo llevado el cultivo a cabo en
el mismo medio químico y las mismas condiciones de cultivo que en
el Ejemplo 1 hasta inmediatamente antes de que se agotara la xilosa,
se separaron las células empleadas y un producto de filtración del
cultivo de la misma forma que en Ejemplo 3 usando un sistema de
microfiltración presurizado (0,65 \mum de porosidad; Amersham
Biosciences,
CFP-6-D-4MA). Se
reciclaron las células empleadas, y se recuperó el producto de
filtración del cultivo para medir la concentración de xilitol en el
producto de filtración del cultivo.
Como se muestra en la Figura 7, 2 l del cultivo
primario contenían 110 g de xilitol antes de la microfiltración. En
este momento, la productividad de xilitol era 2,3
g/l-h y el rendimiento en xilitol con respecto a la
xilosa era 73%. Como resultado del cultivo con dos reciclados por
microfiltración, se obtuvieron 179 g de xilitol a partir de 4 l de
cultivo completo, y la productividad y el rendimiento de xilitol
fueron respectivamente 2,7 g/l-h y 60%. La cantidad
de producción y la productividad de xilitol después del cultivo con
dos reciclados por microfiltración resultaron respectivamente
aumentadas en un factor de 1,6 y un factor de 1,2, pero el
rendimiento en xilitol se redujo un 13%, en comparación con los
valores del cultivo primario.
A partir de los resultados anteriores, se estima
que algunas células resultaron rotas por la presión en el sistema
de microfiltración presurizado.
Ejemplo
4
Se llevó a cabo el cultivo en el mismo medio de
cultivo y las mismas condiciones de cultivo que en el Ejemplo 1
mientras se variaba el volumen del medio de cultivo dentro del
intervalo de 2-5 l. Las células fueron concentradas
hasta diferentes densidades en un sistema de microfiltración por
vacío y fueron luego recicladas.
Las células concentradas fueron introducidas en
medios químicos frescos (2 l para cada uno) y fueron cultivadas de
nuevo durante 8 horas. Se midieron la productividad total y la
productividad específica de xilitol de acuerdo con la densidad
celular, y los resultados se resumen más adelante en la Tabla 1.
En este momento, se calculó la productividad
total de xilitol dividiendo por 8 horas la concentración del
xilitol acumulado durante 8 horas, y se calculó la productividad
específica de xilitol dividiendo la productividad total por la
densidad de las células utilizadas.
Como resultado, cuando la densidad celular fue
35 g/l se obtuvieron los resultados más excelentes en términos de
productividad de xilitol (10,2 g/l-h) y de
rendimiento (85%).
A partir de la Tabla 1, se puede ver que el
cultivo de células concentradas con reciclado mediante
microfiltración por vacío puede proporcionar una productividad de
xilitol 5 veces mayor y un rendimiento en xilitol un 10% mayor con
respecto a un cultivo común que produce 97 g/l de xilitol durante 48
horas por término medio (productividad total de 2,0
g/l-h).
Como resulta evidente de la descripción
anterior, el presente invento proporciona un procedimiento para
producir continuamente xilitol a partir de xilosa con elevado
rendimiento al cultivar una cepa microbiana en un medio
químicamente definido, concentrar la cepa en un biorreactor con
microfiltración por vacío o en una centrífuga, y reciclar la cepa
concentrada.
Por lo tanto, a diferencia de un procedimiento
de fermentación común, se puede aplicar el procedimiento de
producción del presente invento a un sistema de producción
automatizado y se puede disminuir el coste ocasionado por los
procedimientos preparativos antes del cultivo, lo que permite la
producción de xilitol barato a gran escala.
Claims (6)
1. Un medio químicamente definido para el
cultivo de una cepa del género Candida por fermentación, que
comprende 1-10 g/l de urea, 1-10 g/l
de difosfato potásico, 0,01-1 g/l de sulfato
magnésico, 0,1-10 mg/l de
MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 0,1-10 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,1-10 mg/l de
NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,1-10 mg/l de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,1-10 mg/l de
AlCl_{3}\cdot6H_{2}O, 0,1-10 mg/l de
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,01-5 mg/l de
H_{3}BO_{3}, 1-100 mg/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,1-10 mg/l de ácido
ascórbico, 1-100 mg/l de biotina,
1-100 mg/l de colina y 0,1-10 mg/l
de piridoxina.
2. Un procedimiento para producir xilitol con
alto rendimiento por cultivo de una cepa del género Candida
con reciclado, que comprende las operaciones de:
(a) introducir la cepa en un medio como el
reivindicado en la reivindicación 1, al que se ha añadido
xilosa;
(b) cultivar la cepa en el medio de la operación
(a) que contiene xilosa, en un biorreactor;
(c) extraer el cultivo del biorreactor;
(d) introducir en el biorreactor un medio fresco
que contiene xilosa como el definido en la operación (a);
(e) separar la cepa y un producto de filtración
del cultivo que se extraen del cultivo, utilizando un sistema de
microfiltración por vacío o una centrífuga;
(f) reciclar la cepa al biorreactor; y
(g) recuperar el xilitol del producto de
filtración del cultivo.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
que la cepa del género Candida es Candida tropicalis
o su cepa mutante.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, en
que el cultivo se lleva a cabo mediante un cultivo con alimentación
controlada o un cultivo discontinuo.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
que, en el cultivo con alimentación controlada, el medio es
gradualmente complementado con xilosa de modo que la concentración
de xilosa se mantenga en 40-50 g/l con respecto al
medio.
6. El procedimiento de la reivindicación 2, en
que la cepa separada es concentrada hasta una densidad de
10-100 g/l y es reciclada.
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