ES2327018T3 - Composicion que contiene una enzima y un agente que estabiliza dicha enzima, y procedimiento para mejorar la estabilidad de una enzima y evitar su degradacion o para proteger y/o inmovilizar una enzima. - Google Patents
Composicion que contiene una enzima y un agente que estabiliza dicha enzima, y procedimiento para mejorar la estabilidad de una enzima y evitar su degradacion o para proteger y/o inmovilizar una enzima. Download PDFInfo
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Abstract
Composición que contiene por lo menos una enzima y por lo menos un agente destinado a evitar la degradación de dicha enzima encapsulada en el seno de vesículas multilamelares en forma de un apilamiento regular de bicapas concéntricas que comprenden por lo menos un agente tensoactivo, extendiéndose dichas bicapas desde el núcleo mismo de dichas vesículas hasta su periferia y estando separadas por un líquido intersticial.
Description
Composición que contiene una enzima y un agente
que estabiliza dicha enzima, y procedimiento para mejorar la
estabilidad de una enzima y evitar su degradación o para proteger
y/o inmovilizar una enzima.
La presente invención se refiere a una
composición que contiene una enzima y un agente destinado a evitar
la degradación de dicha enzima.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para mejorar la estabilidad de una enzima y evitar su
degradación así como a un procedimiento para proteger y/o
inmovilizar una enzima.
Ya sea en cosmética, en farmacia, en detergencia
o también en agroalimentación, la funcionalidad de un producto se
debe generalmente a la presencia de una molécula denominada materia
activa o agente activo. A título de ejemplo, se pueden citar las
vitaminas, usadas en agroalimentación y en farmacia, las enzimas
usadas en detergencia, los organo-fosforados usados
como insecticidas, o también los aromas y perfumes usados en la
higiene, la agroalimentación o la cosmética.
Una de las características esenciales de un
producto industrial o farmacéutico, además de su actividad y de su
eficacia, es su estabilidad, de manera que se obtiene un producto
que tiene una duración de vida suficiente. Desafortunadamente,
numerosas materias activas son unas moléculas particularmente
frágiles, cuya degradación bajo el efecto de las condiciones del
entorno es demasiado rápida para obtener la duración de vida deseada
del producto que lo contiene. Es el caso de ciertas vitaminas tales
como las vitaminas C, A o E, de muchas enzimas como por ejemplo las
proteasas, y más generalmente de muchas proteínas y moléculas
biológicas, o también en el campo de los insecticidas, del malatión
y de los piretrinoides y, de manera más general, de las moléculas
reductoras u oxidantes.
Se han elaborado numerosas estrategias para
evitar la degradación de estas moléculas activas frágiles. Estas
estrategias dependen de la naturaleza de la reacción que provoca la
degradación. Las reacciones incriminadas más frecuentemente son o
bien la hidrólisis, o bien la oxidorreducción. Otras reacciones más
específicas también tienen lugar, tal como la autoproteolisis en el
caso de las proteasas.
En el caso en el que el agua es una causa
directa o indirecta de la degradación, una simple solución consiste
en evitar el contacto de la molécula activa con un medio acuoso. Es
el caso, por ejemplo, de insecticidas disueltos en un disolvente
orgánico, y utilizados como aerosol. Desafortunadamente, esta
posibilidad no existe todavía, tal como por ejemplo para la
cosmética o la agroalimentación, que, por razones evidentes, no
pueden usar los disolventes orgánicos. Además, la tendencia actual,
por razones ecológicas y de salud pública, es la supresión del uso
de disolventes orgánicos en todas las ramas de la industria.
Cuando el agua es sólo una causa indirecta, por
ejemplo, por efecto de oxidación por el oxígeno disuelto, se puede
trabajar con un agua desgasificada. De manera más general, se puede
trabajar en atmósfera inerte, al mismo tiempo para la fabricación y
la conservación del producto final. Esta solución se usa
frecuentemente en agroalimentación, en la que los productos
líquidos enriquecidos con vitaminas están acondicionados o bien al
vacío, o bien bajo atmósfera inerte. Desafortunadamente, este método
permite limitar la degradación sólo hasta la apertura del
contenedor. Por lo tanto, no es aplicable en el caso de productos
que necesitan una larga duración de vida después de la
apertura.
apertura.
Las enzimas son unas proteínas que catalizan de
manera muy específica unas reacciones químicas. Se usan mucho
industrialmente, por ejemplo, en los detergentes para ropa para
degradar las proteínas (proteasas), los lípidos (lipasas) o los
residuos amiláceos (amilasas), facilitando así la limpieza. Estas
proteínas son en general inestables en disolución, y se usan por lo
tanto sobre todo en los detergentes para ropa en polvo. Su uso en
detergente líquido (para la ropa o la vajilla) es muy limitado
debido a su inestabilidad a largo plazo.
Asimismo, una tendencia actual es el uso de
enzimas en cosmética, por ejemplo unas proteasas para ayudar a la
desescamación de la piel, y por lo tanto a su renovación. En este
caso también la inestabilidad de las enzimas impide su uso
simple.
La inmovilización de enzimas es un tema muy
desarrollado, por lo menos en la investigación, siendo las
aplicaciones industriales no muy numerosas todavía. Los trabajos
sobre la encapsulación de enzimas forman parte del campo de la
bioencapsulación que comprende asimismo la encapsulación de
organismos "vivos" (levaduras, bacterias, etc.). En general,
se recurre a unos polímeros que forman una matriz que inmoviliza la
enzima.
En estos trabajos, se trata generalmente de
inmovilizar la enzima (o la levadura) para tenerla en forma
fácilmente manipulable, como por ejemplo unas microperlas que se
pueden extraer del medio de reacción, después de usar, mediante
simple filtración o tamizado según su tamaño. Por consiguiente, la
forma encapsulada de la enzima debe conservar su actividad. El
material de encapsulación debe ser suficientemente poroso para dejar
difundir el sustrato y los productos de reacción. Una revisión de
estos desarrollos se puede encontrar en "Bioencapsulation in
biotechnology, Biomat, Art. Cells & Immob. Biotech., 21,
291-298 (1993)".
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Las principales reacciones que conducen a la
pérdida de actividad de una enzima son la degradación química, la
pérdida de configuración espacial o la agregación de varias enzimas.
Los métodos usados típicamente para evitar o limitar los excesos de
estas degradaciones son la modificación química de la molécula y la
inmovilización.
La protección de enzimas frente a su
desnaturalización mediante encapsulación es menos corriente. En
efecto, dejando que las matrices polímeras usadas en la
inmovilización difundan los sustratos, éstas son demasiado porosas
para proteger realmente la enzima. Las principales reacciones de
degradación son las que alcanzan las proteínas. Se trata en
particular de hidrólisis específicas de las uniones entre
aminoácidos y de reacciones que conducen a una desnaturalización
mediante el cambio de conformación que no implica ninguna unión
covalente, pero que provoca una pérdida de actividad de la enzima,
mediante la modificación de la accesibilidad del sitio catalizador
por ejemplo. Así, en el artículo "Prolonged retention of
cross-linked trypsin in calcium alginate
microspheres, J. Microencapsulation, 14, 51-61
(1997)", se muestra que es necesario reticular previamente la
enzima mediante un glutaraldehído para asegurar su protección, lo
que induce una pérdida de 50% de su actividad.
En el caso de las enzimas, por ejemplo en los
detergentes líquidos o en las cremas cosméticas, no es posible usar
un disolvente no acuoso, al mismo tiempo por razones de seguridad y
de coste. La introducción de enzimas en este tipo de producto se
enfrenta por lo tanto a unas dificultades reales. Una solución, a
veces adoptada en cosmética, consiste en usar un envase
sofisticado, constituido por dos depósitos independientes,
conteniendo uno la molécula activa y conteniendo el otro el resto
de la preparación. La mezcla se efectúa extemporáneamente en el
momento del uso del producto, gracias a un sistema de doble bomba
dosificadora en el frasco. Esta solución es bastante costosa, y
poco cómoda de usar. Esta solución se ha realizado asimismo en el
caso de la cosmética para proponer unos productos de belleza que
contienen vitaminas.
Otro método consiste también en separar el
agente activo de su medio, pero de manera microscópica,
microencapsulándolo en unas microesferas de polímero, o
revistiéndolo, por ejemplo, mediante una técnica de revestimiento en
lecho fluidizado, en una matriz polímera. Esta técnica puede
resultar interesante, en particular para unos productos destinados
a ser incorporados en unas formas secas. Adolece del inconveniente
de necesitar la ruptura de la cáscara o del revestimiento polímero
para liberar el agente activo. Por lo tanto, está poco adaptada para
unos productos cosméticos en los que la liberación del agente
activo debe realizarse espontáneamente en el momento de la
aplicación del producto, o para unos productos alimenticios, que
deben liberar su agente activo en la boca.
Cuando la inestabilidad de la materia activa es
moderada, el uso de moléculas protectoras puede resultar
interesante. Es el caso de los agentes antioxidantes usados
ampliamente en las cremas cosméticas y en los productos
alimenticios. Generalmente, son simplemente añadidos a la
preparación, pero debido a la dilución, es necesario añadir una
cantidad más importante de lo necesario para obtener un efecto. Por
otro lado, como muchos aditivos, su uso tiende a estar cada vez más
reglamentado, y las dosis permitidas disminuyen.
Es conocido encapsular unos principios activos
en unas vesículas a base de tensoactivos.
Estas vesículas presentan generalmente una o
varias bicapas. Se hablará de vesículas unilamelares cuando están
constituidas por un núcleo acuoso rodeado de una bicapa de
tensoactivos y de vesículas paucilamelares o multilamelares cuando
presentan varias bicapas. Entre las vesículas multilamelares, se
distinguen las que se designarán a continuación como "vesículas
multilamelares o MLV de tipo clásico", y unas vesículas de
estructura muy particular que se designarán a continuación como
"vesículas multilamelares de estructura en cebolla". Estos dos
tipos de vesículas multilamelares se distinguen por tres
diferencias fundamentales:
El procedimiento de obtención de las MLV
clásicas usa generalmente una mezcla preliminar en medio disolvente
orgánico de los lípidos y otros componentes que constituyen la
envoltura de dichas MLV, y después la evaporación del disolvente
para obtener una película seca. Las vesículas se obtienen a
continuación mediante la rehidratación de esta película de lípidos
mediante una disolución acuosa que contiene el agente activo a
encapsular.
Las vesículas multilamelares de estructura en
cebolla se obtienen, a su vez, mediante el cizallado de una fase
lamelar cristal-líquido que comprende el agente
activo a encapsular.
Debido su modo de preparación, las MLV clásicas
son unos agregados de hojas multilamelares de tipo lipídico
reunidas en una membrana lipídica aproximadamente esférica. Esta
estructura aparece muy claramente en la fotografía proporcionada en
la patente US nº 4.975.282.
Los liposomas se obtienen más frecuentemente a
partir de las MLV clásicas descritas anteriormente, después de la
aplicación de un cizallado muy fuerte (mediante ultrasonidos o
prensa de French), que los transforman en vesículas unilamelares o
paucilamelares caracterizadas por la presencia de un núcleo
acuoso.
Las vesículas multilamelares de estructura en
cebolla se presentan, a su vez, en forma de un apilamiento regular
de bicapas concéntricas que parte del núcleo mismo de las vesículas
hasta su periferia.
En el interior de las vesículas multilamelares
clásicas, el número de hojas multilamelares, su número de capas, el
número de repliegues y su disposición son unas características que
dependen del modo de preparación y en particular de fenómenos
cinéticos que intervienen durante la rehidratación de la película
lipídica. La estructura interna de las vesículas no es uniforme en
el seno de una vesícula (zonas de poca curvatura, zonas de gran
curvatura, zonas multilamelares, zonas continuas). Por lo tanto,
dicha estructura no está en equilibrio termodinámico. Además, cada
vesícula tiene una constitución diferente, y por lo tanto no existe
ninguna uniformidad de estructura en toda la muestra.
Se han descrito, en particular en la solicitud
WO 96/31194 unos liposomas de tipo clásico paucilamelar constituidos
por algunas capas que rodean un núcleo acuoso, en los que se
encuentran asociados una molécula y su estabilizante.
Unas composiciones en las que un agente activo
se encuentra encapsulado en unas vesículas multilamelares de
estructura de cebolla, constituidas, desde su centro hasta su
periferia, por una sucesión de capas lamelares separadas por un
medio líquido se encuentran ya descritas en diferentes patentes
referenciadas a continuación. Estas vesículas se pueden obtener
mediante un procedimiento que comprende la preparación de una fase
lamelar cristal-líquido y su transformación
mediante la aplicación de un cizallado. Dicho procedimiento se
describe en particular en la patente WO 93/19735 procedente de la
patente francesa FR 2 689 418 o WO 95/18601 incluidos en la
presente memoria a título de referencia.
Según la patente francesa FR 2 689 418, esta
transformación se puede realizar durante una etapa de cizallado
homogéneo de la pasta cristal-líquido, lo que
conduce a unas vesículas también denominadas
micro-cápsulas de tamaño controlado. Sin embargo,
actuando sobre la formulación de la fase lamelar
cristal-líquido, en particular sobre la naturaleza
de los tensoactivos que entran en su composición, la transformación
de esta fase cristal-líquido en vesículas se puede
obtener mediante simple solicitación mecánica, en particular durante
la mezcla de los constituyentes.
El solicitante ha descrito diferentes
aplicaciones de este tipo de vesículas. Se citará, en particular, la
solicitud internacional WO 95/19707 que describe unas composiciones
olorosas en las que un producto oloroso se encuentra incorporado en
el seno de dichas vesículas multilamelares, siendo el efecto de
dicha encapsulación aumentar la remanencia del olor, debido a la
ralentización de la evaporación. Se citará asimismo la solicitud
francesa FR 2 735 658 que describe unas composiciones de uso
alimentario en las que un producto o un aditivo de uso alimentario
se encuentra incluido en el seno de dichas vesículas multilamelares,
teniendo como efecto esencial obtener una liberación controlada
particularmente ventajosa del producto encapsulado, permitiendo la
presencia de la vesícula multilamelar además proteger, antes de su
introducción en las composiciones, las moléculas frecuentemente
frágiles que se encuentran incorporadas en ellas.
Sin embargo, dicha composición, incluso si
aporta en ciertos casos un efecto ya sustancial sobre la
estabilización de las moléculas frágiles, puede resultar
insuficiente para unas moléculas particularmente sensibles o de las
cuales se busca obtener una estabilización particularmente aumentada
frente a un entorno a priori desfavorable,
Así, los inventores de la presente invención han
descubierto ahora que la acción de protección de moléculas frágiles
ya observada en el caso particular de ciertos productos del campo
alimentario, podía aumentar considerablemente mediante la
incorporación en el seno de las vesículas multilamelares de
estructura en cebolla de un agente destinado a estabilizar estas
moléculas frágiles. Dicha presentación del par producto
activo/agente estabilizante permite obtener una estabilización
aumentada, y por lo tanto una duración de vida de los productos que
incorporan el agente activo aumentada con unas concentraciones
claramente más bajas en agente estabilizante, lo cual constituye
una ventaja considerable de la presente invención.
La presente invención resulta interesante en
todos los campos en los que se busca proteger un agente activo
frente a una acción de degradación. Se aplica en este caso a las
enzimas.
La invención proporciona un medio
particularmente eficaz que permite asegurar al mismo tiempo la
función de inmovilización de una enzima y su protección frente al
medio exterior con vistas a mejorar su estabilidad.
Así, la presente invención ofrece una solución
particularmente económica y eficaz a los problemas relacionados con
la estabilización de las enzimas con, además, todas las ventajas
relacionadas con la técnica de encapsulación usada:
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\vtcortauna
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Así, según una de sus características
esenciales, la invención se refiere a unas composiciones que
contienen por lo menos una enzima y por lo menos un agente
destinado a evitar la degradación de dicha enzima encapsulada en el
seno de unas vesículas multilamelares en forma de un apilamiento
regular de bicapas concéntricas que comprenden por lo menos un
agente tensoactivo, extendiéndose dichas bicapas desde el núcleo
mismo de dichas vesículas hasta su periferia, y estando separadas
por un líquido intersticial.
Mediante la expresión "estructura en
cebolla" se entiende, tal como se ha expuesto anteriormente, una
estructura multilamelar, en la que las vesículas de forma
sustancialmente esférica están constituidas por una sucesión de
bicapas concéntricas, desde el centro hasta la periferia de las
vesículas, razón por la cual se usa el nombre de estructura en
cebolla por analogía, para calificar dichas estructuras.
Estas estructuras se pueden demostrar mediante
examen microscópico de las composiciones. La observación se realiza
usando un microscopio óptico en luz polarizada, en el que es visible
una fase lamelar, birrefringente. Se manifiesta mediante una
textura característica, relacionada con la presencia de defectos
(juntas de granos) entre los campos de fase orientados de forma
diferente. En el caso de la fase concentrada de vesículas, la
textura está caracterizada por su carácter uniforme y fino,
relacionado con el tamaño de las vesículas. En la fase dispersada
de vesículas, éstas son visibles en forma de puntos más o menos
resueltos (en función del tamaño), ligeramente birrefringentes. La
birrefringencia se observa sólo cuando la dispersión no está
demasiado diluida. Por lo tanto, si la dispersión está
relativamente diluida, habrá que proceder a una operación previa de
concentración para demostrar claramente la birrefringencia
característica de la presencia de las vesículas de estructura en
cebolla.
El principio de la invención consiste en usar
las vesículas como unos micro-recipientes que
contienen la molécula (enzima) a proteger, y que impiden que se
produzca la reacción de degradación. Para ello, el papel de la
vesícula es doble: por un lado aislar la molécula activa de su
entorno, y por otro lado aportar los aditivos necesarios para la
estabilización, lo cual resulta particularmente interesante para las
moléculas sensibles. Una de las ventajas principales de la vesícula
es confinar la molécula frágil y su protección en un pequeño
volumen, mucho menor que el volumen total de la preparación, y por
lo tanto evitar así el efecto de dilución, permitiendo por ello el
uso de una cantidad más baja de molécula protectora.
Según una variante ventajosa de la invención,
las vesículas tienen unas dimensiones comprendidas entre 0,1 y 50
\mum, preferentemente entre 0,2 y 10 \mum.
Dichas estructuras se obtienen ventajosamente
mediante la incorporación de la enzima y del agente destinado a
estabilizarla en una fase lamelar cristal-líquido
que comprende por lo menos un agente tensoactivo y después la
transformación mediante la aplicación de un cizallado, de esta fase
cristal-líquido lamelar en una fase densa de
vesículas multilamelares de pequeño tamaño.
Este cizallado podrá ser un cizallado homogéneo,
lo que presenta la ventaja de conducir a unas vesículas de tamaño
perfectamente homogéneo. Sin embargo, una simple agitación mecánica
podrá resultar suficiente para conducir a la formación de las
vesículas multilamelares de la invención.
Según la patente francesa FR-2
689 418, esta transformación se puede realizar durante una etapa de
cizallado homogéneo de la fase cristal-líquido, lo
que conduce a unas vesículas o microcápsulas de tamaño controlado.
Sin embargo, actuando sobre la formulación de la fase lamelar
cristal-líquido, en particular sobre la naturaleza
de los tensoactivos que entran en su composición, la transformación
de esta fase cristal-líquido en vesículas se puede
obtener mediante simple solicitación mecánica, en particular durante
la mezcla de los constituyentes.
Tal como se desprende en particular de los
ejemplos ilustrativos de la invención, la elección de los agentes
tensoactivos que se pueden utilizar para formar las membranas de las
vesículas multilamelares de la invención es muy amplio. Sin
embargo, se elegirán estos agentes tensoactivos en función del campo
de uso de la composición prevista. En numerosos casos, la
aplicación prevista comprende unas obligaciones que limitan la
elección de los tensoactivos. Se trata frecuentemente de
obligaciones legislativas o relacionadas con unas normas. Así, en
el campo de la cosmética, el catálogo de la INCI (International
Nomenclature of Cosmetic Ingredients) proporciona la lista de los
productos permitidos, en el caso de la agroalimentación se refiere a
la lista positiva de los aditivos permitidos, o en el de la
farmacia, a la farmacopea.
La formulación hace intervenir ventajosamente
una mezcla de moléculas tensoactivas. Se usan generalmente por lo
menos dos tensoactivos diferentes que tienen unos balances
hidrófilo-lipófilo diferentes, lo que permite
regular en continuo las propiedades de las bicapas y controlar así
la aparición de la inestabilidad que dirige la formación de las
vesículas multilamelares.
Según una variante particularmente ventajosa de
la invención, se usará una mezcla de dos agentes tensoactivos
denominados respectivamente agente tensoactivo lipófilo, que
presenta un balance hidrófilo-lipófilo (HLB)
comprendido entre 3 y 7, y agente tensoactivo hidrófilo, que
presenta un HLB comprendido entre 8 y 15.
Según otra variante ventajosa de la invención,
las membranas de las vesículas contienen por lo menos un agente
tensoactivo polímero o un polímero que presenta unas propiedades
anfífilas.
Es el caso, por ejemplo, de los poloxámeros, y
otros derivados copolímeros del óxido de etileno y del óxido de
propileno eventualmente modificados por adición de cadenas
hidrófobas.
Se pueden citar a título de ejemplos no
exhaustivos la familia de los Pluronic® y Lutrol® (BASF), los
hidroxiestearatos de polietileno (Solutol® de BASF o MYRJ® de
ICI).
La invención se aplica en particular a unas
enzimas sensibles a unas reacciones más específicas tales como la
autoproteolisis en el caso de las proteasas.
Un campo en el que la invención encuentra unas
aplicaciones particularmente interesantes es el de la cosmética y
de la dermatología en los que numerosos agentes activos son
conocidos por su fragilidad.
Otro campo en el que la invención encuentra una
aplicación particularmente interesante es el de los medicamentos
para los cuales las nociones de fragilidad de la molécula, y de
limitación de los aditivos permitidos son todavía más pertinentes
que en la cosmética.
El agente destinado a estabilizar la enzima se
elegirá en función de la naturaleza de esta enzima y del tipo de
degradación que se busca evitar, teniendo en cuenta además el tipo
de aplicación prevista.
Es el caso asimismo cuando el producto activo ve
su estabilidad modificada por una variación de pH susceptible, por
ejemplo, de provocar una reacción de hidrólisis o también de
modificar el potencial redox del producto activo. Se elegirá
entonces encapsular un agente estabilizante que permite modificar
localmente el pH, de manera que se incrementa la estabilidad del
producto activo.
Cuando se desea mejorar la estabilidad de un
producto activo sensible a la oxidación, la vesícula contiene
ventajosamente un producto conocido por sus propiedades
antioxidantes debido a sus propiedades reductoras o debido a su
acción para disminuir el riesgo de oxidación por efecto quelante,
por ejemplo por efecto quelante de las trazas de iones metálicos
catalizadores de la oxidación contenidos en el medio, o mediante la
acción sobre el pH del medio cuando el potencial redox depende del
pH.
Así, se citarán de manera no exhaustiva a título
de agentes antioxidantes:
el ácido ascórbico y sus derivados,
el ácido cítrico y sus derivados (también usados
como quelantes),
el ácido glutámico, los glutamatos y sus
derivados,
el ácido
etilen-diamina-tetraacético (EDTA)
(quelante),
el ácido láctico y sus derivados (usado asimismo
para ajustar el pH),
el ácido tártrico y sus derivados (usado
asimismo para ajustar el pH y como agente quelante),
la benzofenona,
los bioflavonoides,
el
butilhidroxi-hidroxianisol,
el
butilhidroxi-hidroxitolueno,
el caroteno y sus derivados,
el clorobutanol,
los galatos de propilo, de octilo o de
dodecilo,
el sulfito de sodio o de potasio, y los
compuestos emparentados tales como el bisulfito o el
pirosulfito,
los tocoferoles (alfa, delta o gamma) y sus
derivados,
de manera general todos los aditivos
alimentarios de las clases E3xx y E22x de la clasificación europea
de los aditivos alimentarios.
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A título de ejemplo, la vitamina C y sus
derivados son bien conocidos por su sensibilidad a la oxidación. Se
ha demostrado claramente que se podía.
El agente destinado a estabilizar el producto
activo puede pertenecer asimismo a la membrana de la vesícula, si
tiene propiedades anfífilas.
Existen casos en los que el agente estabilizante
desempeñará asimismo la función de agente tensoactivo que participa
en la formulación de las membranas de las vesículas. Dichos ejemplos
se proporcionarán más adelante en relación con la estabilización de
las enzimas.
Se usará como agente estabilizante, de manera
general, o bien un aditivo conocido por estabilizar o proteger las
proteínas, designado a continuación como aditivo protector no
específico de las enzimas, o bien un agente específico destinado a
estabilizar específicamente una enzima.
Así, en el caso de las proteasas, un inhibidor
de proteasas permitirá evitar la autoproteolisis.
Según una primera variante, en la que se usa un
aditivo protector no específico, éste se selecciona ventajosamente
de entre los productos conocidos por actuar sobre la conformación de
la enzima. A título de ejemplo de dichos productos, se citarán en
particular unos iones cuyo efecto es aumentar la fuerza iónica y
fijarse sobre ciertos sitios cargados de la enzima o de las
moléculas susceptibles de empezar unas uniones débiles con la
proteína.
El experto en la materia comprenderá fácilmente
que los iones más eficaces son los iones relativamente grandes, por
ejemplo unos iones amonios y amonios cuaternarios en lo que se
refiere a los cationes y unos sulfatos, fosfatos, carboxilatos y
poliácidos carboxílicos en lo que se refiere a los aniones. El
experto en la materia comprenderá fácilmente que su elección para
obtener la mejor eficacia deberá referirse a unos iones
suficientemente grandes o ligados a una molécula suficientemente
grande.
Entre los iones particularmente interesantes
para estabilizar las enzimas, se citarán el ión calcio muy conocido
por intervenir específicamente en la reactividad de muchas enzimas,
en particular de las proteasas.
En la variante según la cual se usan unas
moléculas específicas estabilizadoras, se elegirán ventajosamente
unas moléculas que se refieren a unas funciones susceptibles de
unirse a la enzima, por ejemplo unas moléculas que tienen la
posibilidad de formar unas uniones hidrógenos con la enzima. Entre
estas moléculas, se citarán en particular los alcoholes y los
polioles, ventajosamente unos polioles asociados a un derivado del
boro, en particular a un ión borato, unas aminas etoxiladas y unos
óxidos de aminas. Se podrá asimismo elegir recurrir a unos
tensoactivos que comprenden varios óxidos de etileno. Dichos
tensoactivos entrarán en la formulación de las membranas de las
vesículas de la invención y participarán en la estabilización de las
enzimas.
Por lo tanto, se podrán citar a título de
agentes destinados a estabilizar unas enzimas incorporadas en el
seno de estas vesículas, unos tensoactivos y unas moléculas
anfífilas que contienen las funciones siguientes o sustituidas por
los grupos siguientes:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Los agentes estabilizantes de las enzimas se
seleccionarán ventajosamente de entre los derivados polímeros que
contienen unas funciones de uno de los tipos anteriores, en
particular:
- \lozenge
- los polisacáridos modificados o no tales como:
- *
- agarosa,
\newpage
- *
- goma de guar,
- *
- carragenanos,
- *
- ácido algínico y alginato,
- *
- pectina,
- *
- quitosano,
- \lozenge
- las polivinilpirrolidonas, eventualmente sustituidas,
- \lozenge
- las celulosas y derivados de celulosas (alquiladas o funcionalizadas),
- \lozenge
- los poliacrilatos,
- \lozenge
- los polivinilalcoholes (PVA) y los derivados parcialmente hidrolizados de los polivinilacetatos,
- \lozenge
- las poliacrilamidas,
- \lozenge
- las poliamidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos realizados por los inventores de la
presente invención demuestran que la presencia en las vesículas
multilamelares que incorporan una enzima, como agente destinado a
evitar la degradación de dicha enzima, o bien de un tensoactivo o
de una molécula anfífila que presenta por lo menos una función
nitrogenada, o bien de un polímero que presenta asimismo una
función nitrogenada, permite mejorar considerablemente la
estabilización de la enzima.
Cuando se recurre como agente de estabilización
de una enzima a un agente tensoactivo que comprende por lo menos
una función nitrogenada, se elegirá preferentemente un agente
tensoactivo, en el que la función nitrogenada pertenece a la cabeza
polar de dicho agente tensoactivo.
Según esta variante en la que las funciones
nitrogenadas pertenecen a la cabeza polar del tensoactivo, la cola
hidrófoba está ventajosamente constituida por una o varias cadenas
carbonadas. Se puede definir por lo tanto independientemente la
naturaleza de la parte hidrófoba que no varía mucho de un
tensoactivo a otro: por lo menos una (dos en general) cadena
alquilo de 1 a 22 carbonos, lineal o ramificada, simple o
sustituida, eventualmente que contiene un residuo cíclico o
aromático, saturada o que contiene una o varias insaturaciones,
eventualmente sustituida por otras funciones. La o las cadenas que
forman la parte hidrófoba del agente tensoactivo pueden estar o
bien directamente unidas al átomo de nitrógeno de la función
nitrogenada, o bien, llegado el caso, unidas a uno de los
sustituyentes del nitrógeno.
Cuando se recurre, para estabilizar una enzima,
al uso de un polímero que contiene por lo menos una función
nitrogenada, se seleccionará ventajosamente de entre la lista
siguiente:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso específico en el que se busca
estabilizar una enzima evitando su autoproteolisis, se
co-encapsula ventajosamente un inhibidor de
proteasa, por ejemplo el EDTA, el fenilmetanosulfonilfluoruro, la
3,4-dicloroisocumarina, la quimostatina.
Con el fin de reforzar la función de
confinamiento desempeñada por la vesícula, puede ser ventajoso
añadir en su formulación uno o unos polímeros o moléculas de alto
punto de fusión, que reforzarán la estanqueidad de la vesícula.
Este refuerzo de estanqueidad se puede obtener asimismo mediante
cualquier medio que permite disminuir el intercambio con el medio
de dispersión final, en particular envolviendo la vesícula con un
polímero o una cera, eventualmente una cera autoemulsificable. Así,
la invención se refiere asimismo según una variante ventajosa a
unas composiciones en las que las vesículas comprenden además por lo
menos un agente destinado a reforzar su estanqueidad, siendo este
agente encapsulado en unas vesículas o constituyendo un
revestimiento externo de estas mismas vesículas.
Según una variante particularmente ventajosa de
la invención, se podrá elegir como agente destinado a estabilizar
el producto activo un agente que mejora simultáneamente la
estanqueidad de la vesícula.
En resumen, la invención consiste en usar la
microvesícula multilamelar como un medio de confinamiento de una
enzima y unos aditivos que permiten su estabilización, eventualmente
reforzando su estanqueidad.
Según otro de sus aspectos, la invención se
refiere asimismo al procedimiento de preparación de una composición
tal como la definida anteriormente, que comprende las etapas
siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Este cizallado será ventajosamente un cizallado
homogéneo tal como se enseña en la patente FR 2 689 418.
La transformación de la fase lamelar
cristal-líquido en vesículas multilamelares de
estructura en cebolla podrá ser facilitada actuando sobre la
elección de los tensoactivos. Se podrá, en particular, elegir como
se ha indicado anteriormente un tensoactivo que presenta un alto HLB
y un agente tensoactivo que presenta un bajo HLB.
Por otro lado, ciertos tensoactivos están
particularmente adaptados para favorecer esta transformación. Así,
es el caso, por ejemplo, de los poloxámeros, y otros derivados
copolímeros del óxido de etileno y del óxido de propileno
eventualmente modificados por adición de cadenas hidrófobas. Estos
compuestos son particularmente interesantes puesto que aportan al
mismo tiempo la adaptación de las propiedades elásticas de la
membrana de tensoactivos y su estabilización por efecto estérico.
Se pueden citar a título de ejemplos no exhaustivos la familia de
los Pluronic® y Lutrol® (BASF), los hidroxiestearatos de polietileno
(Solutol® de BASF o MYRJ® de ICI).
Por último, según un último aspecto, la
invención se refiere asimismo a un procedimiento para mejorar la
estabilidad de un producto activo y evitar su degradación,
caracterizado porque consiste en encapsular dicho producto activo
en el seno de unas vesículas multilamelares tales como las definidas
anteriormente, que presentan una estructura en cebolla y
constituidas, desde su periferia hasta su centro, por membranas en
forma de bicapas concéntricas que comprenden por lo menos un agente
tensoactivo, estando dichas membranas separadas por un líquido
intersticial, incorporando dichas vesículas en su seno por lo menos
un agente destinado a evitar la degradación de dicho producto
activo.
Por las razones expuestas anteriormente, la
invención encuentra una aplicación particularmente interesante en
la estabilización y/o la inmovilización de las enzimas.
Así, la invención se refiere más particularmente
a un procedimiento para proteger y/o inmovilizar una enzima según
el cual se encapsula dicha enzima en el seno de las vesículas
multilamelares de estructura en cebolla tales como las definidas
anteriormente, conteniendo dichas vesículas en su seno por lo menos
un agente tal como el definido anteriormente destinado a evitar la
degradación de dicha enzima.
Los excelentes resultados obtenidos en lo que se
refiere a la estabilización de una enzima, cuando ésta se encuentra
incorporada en el seno de una vesícula multilamelar que comprende
por lo menos un agente estabilizante seleccionado de entre los
tensoactivos, las moléculas anfífilas y los polímeros, que contiene
por lo menos una función susceptible de unirse a dicha enzima, han
estando claramente relacionados con la existencia de una unión por
la cual la enzima se encuentra de alguna forma complejada a uno de
los constituyentes de las membranas de la vesícula. Estos
resultados han sugerido que una interacción del mismo tipo podría
producirse entre la superficie de una vesícula multilamelar que
incorpora en sus membranas dicho agente estabilizante. Esta
hipótesis se ha podido confirmar porque se ha podido constatar
asimismo un claro efecto de estabilización de una enzima cuando
ésta se encuentra en contacto en el seno de una composición con unas
vesículas multilamelares de estructura en cebolla cuya formulación
es tal que sus membranas comprenden por lo menos un producto
estabilizante seleccionado de entre las moléculas anfífilas, los
tensoactivos y los polímeros, que contienen por lo menos una
función susceptible de unirse a dicha enzima.
Por lo tanto, según otro aspecto de la presente
invención, se refiere asimismo a un procedimiento para proteger y/o
inmovilizar una enzima según la cual se pone dicha enzima en
presencia de vesículas multilamelares de estructura en cebolla, es
decir, de vesículas constituidas, desde su periferia hasta su
centro, por membranas en forma de bicapas concéntricas que
comprenden por lo menos un agente tensoactivo, estando dichas
membranas separadas por un líquido intersticial, incorporando
dichas vesículas en su seno por lo menos un compuesto denominado
agente estabilizante, que contiene por lo menos una función
susceptible de unirse a dicha enzima. Este agente estabilizante se
selecciona de entre las moléculas anfífilas, los tensoactivos y los
polímeros citados anteriormente como agente que tiene un efecto
estabilizante sobre una enzima encapsulada.
\newpage
Los ejemplos siguientes proporcionados a título
puramente ilustrativo de la invención muestran cómo ha sido posible
según la invención mejorar la estabilidad de diferentes activos
supuestamente frágiles.
Estos ejemplos se refieren asimismo a las
figuras 1 y 2:
- la figura 1, proporcionada haciendo referencia
al ejemplo 1, ilustra la estabilización de la tripsina por
encapsulación en unas vesículas multilamelares de estructura en
cebolla que contienen, a título de agente estabilizante, un agente
tensoactivo que contiene una función amonio;
- la figura 2, proporcionada haciendo referencia
al ejemplo 2, ilustra la estabilización de la tripsina por
encapsulación en una vesícula multilamelar de estructura en cebolla
que incorpora un tensoactivo de la familia de los ésteres
cuaternarios.
En los ejemplos siguientes, salvo que se indique
lo contrario, las proporciones son en porcentajes en peso.
Para demostrar el efecto de estabilización en
las enzimas, se mide la actividad de una enzima encapsulada en
función del tiempo de envejecimiento, por comparación con la enzima
simplemente puesta en disolución en las mismas condiciones de
envejecimiento. Siendo la enzima encapsulada inaccesible, es
necesario liberarla previamente para poder medir su actividad. El
experimento comprende por lo tanto cuatro etapas:
- \bullet
-
\vtcortauna
- *
- encapsular la enzima y dispersar unas vesículas que contienen la enzima
- *
- disolver a la misma concentración que la enzima de control
- *
- envejecer la dispersión de vesículas y la disolución de control
- *
- liberar la enzima de las vesículas
- *
- medir la actividad enzimática de la muestra ensayada y de la muestra de control.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad enzimática se evalúa mediante un
método clásico de seguimiento de la reacción de degradación de un
sustrato característico de la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima usada es la tripsina, que es una
serina proteasa (como las proteasas usadas en los detergentes). Su
masa es de 23.000 g/mol y su tamaño está comprendido entre 20 y 40
\ring{A} (entre 20 y 40.10^{-10} m).
Acondicionada en forma lifolizada, se solubiliza
en un tampón en forma de una disolución al 4% en masa. Esta
disolución al 4% se usa en las preparaciones.
Para las mediciones, las muestras de control se
preparan tomando 50 \mul (50 mg) de esta disolución para 5 g de
disolución final, es decir, un contenido en enzima en la disolución
final de 0,04% en masa.
El contenido másico de enzima en las vesículas
es de 0,15%. Salvo que se indique lo contrario, las vesículas se
preparan mediante el mezclado a temperatura ambiente de los
tensoactivos y después la incorporación de la disolución acuosa de
enzima. Se obtiene así una pasta viscosa, de textura birrefringente
característica (observación al microscopio óptico en luz
polarizada). Esta pasta se dispersa mediante la adición lenta de
agua con agitación a temperatura ambiente.
Para las mediciones de la actividad, todas las
dispersiones de vesículas tienen un contenido de 2% de vesículas.
El contenido de enzima de la dispersión de vesículas es por lo tanto
de 0,04%.
Es un tampón fosfato de composición:
- \quad
- NaCl: 8 g/l
- \quad
- KCl: 0,2 g/l
- \quad
- Na_{2}HPO_{4}: 1,15 g/l
- \quad
- KH_{2}PO_{4}: 0,2 g/l
El pH está comprendido entre 7,5 y 8.
Se usa como sustrato el
N-benzoil-L-arginil-etil-éster
(BAEE) que es un sustrato usado habitualmente para estudiar la
actividad de la tripsina en la medida en la que se sabe que su
descomposición es catalizada por la tripsina. El producto de
reacción absorbe en el UV.
Se realiza de la siguiente manera:
- e1.
- Destrucción de las vesículas:
Se extraen 25 \mul de muestra y se añaden 20
\mul de disolución de tritón X100 (Sigma) al 10%. Se deja actuar
durante aproximadamente 30 segundos.
- e2.
- Medición de la actividad enzimática:
Se extraen 37 \mul de disolución de sustrato a
0,024 moles/l, se añaden 950 \mul de tampón y 22,5 \mul de
muestra. Se sigue la cinética durante 10 minutos a una longitud de
onda de 253 nm y a 20ºC.
El envejecimiento de las muestras se efectúa en
estufa, a la temperatura de 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Agentes tensoactivos usados:
- \quad
- Polisorbato 60: Polioxietileno (20) sorbitán monoestearato.
- \quad
- DODMAB: bromuro de dimetildioctadecilamonio.
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación:
- \bullet
- 15% de disolución acuosa de enzima.
- \bullet
- 35% de agua.
- \bullet
- 25% de DODMAB.
- \bullet
- 25% de polisorbato 60.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación:
Los tensoactivos y la disolución de enzima se
mezclan groseramente a temperatura ambiente, y después la mezcla se
introduce en una célula de tipo Couette procediendo según la patente
WO 93/19735.
El cizallado se realiza a 25ºC durante 20
minutos, a un índice comprendido entre 50 y 100 s^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
La degradación de la enzima se sigue mediante
espectroscopía UV.
La figura 1 representa las variaciones de la
actividad enzimática durante el tiempo para la enzima encapsulada,
en comparación con las variaciones observadas para la enzima libre.
La actividad inicial se fija arbitrariamente en 100 para el trazado
de la curva.
La figura 1 demuestra claramente la
estabilización de la enzima debido a su encapsulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procede como en el ejemplo 1. El tensoactivo
usado en este ejemplo pertenece a la familia de los ésteres
cuaternarios. Se trata del: N,N-di("acil"
oxi-2-etil),
N-hidroxi-2-etilo,
metosulfato de N-metil-amonio, en
disolución en el isopropanol comercializado por CECA con la marca
Noxamium 920.
Formulación (en porcentaje en peso)
| Disolución acuosa de enzima | 15% |
| Agua | 35% |
| Noxamium 920 | 50% |
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de las vesículas es análoga a la
del ejemplo 1.
La figura 2 representa las variaciones de la
actividad enzimática a lo largo del tiempo para la enzima
encapsulada en comparación con las variaciones observadas para la
enzima libre. La actividad inicial está arbitrariamente fijada en
100.
Esta figura demuestra claramente la
estabilización de la enzima debido a su encapsulación.
Claims (17)
1. Composición que contiene por lo menos una
enzima y por lo menos un agente destinado a evitar la degradación
de dicha enzima encapsulada en el seno de vesículas multilamelares
en forma de un apilamiento regular de bicapas concéntricas que
comprenden por lo menos un agente tensoactivo, extendiéndose dichas
bicapas desde el núcleo mismo de dichas vesículas hasta su
periferia y estando separadas por un líquido intersticial.
2. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque dichas vesículas tienen unas dimensiones
comprendidas entre 0,1 y 50 \mum, preferentemente entre 0,2 y
10 \mum.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque las bicapas de dichas vesículas
comprenden una mezcla de dos agentes tensoactivos denominados
respectivamente agente tensoactivo lipófilo, que presenta un
balance hidrófilo-lipófilo (HLB) comprendido entre 3
y 7, y agente tensoactivo hidrófilo, que presenta un HLB
comprendido entre 8 y 15.
4. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizada porque las bicapas de las vesículas
contienen por lo menos un agente tensoactivo polímero o un polímero
que presenta unas propiedades anfífilas.
5. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizada porque dicho agente destinado a evitar
la degradación de dicha enzima es un agente estabilizante conocido
por estabilizar las proteínas, actuando sobre la conformación de la
enzima, en particular un ión, por ejemplo un ión calcio.
6. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizada porque dicho agente estabilizante es un
agente que contiene unas funciones susceptibles de unirse a dicha
enzima.
7. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizada porque dicho agente destinado a
estabilizar dicha enzima se selecciona de entre los agentes
tensoactivos y las moléculas anfífilas que contienen las funciones
siguientes o sustituidas por los grupos siguientes:
- \bullet
- amonios cuaternarios,
- \bullet
- aminas y etanolamina,
- \bullet
- moléculas que contienen una función fosfato, en particular fosfolipídicas,
- \bullet
- sales y ésteres de ácidos grasos,
- \bullet
- sales de poliácidos,
- \bullet
- alcoholes,
- \bullet
- glicerol y sus ésteres (los glicéridos),
- \bullet
- polioles tales como poliglicéridos, polietilenglicol, y polipropilenglicol,
- \bullet
- azúcares tales como sorbitol, glucosa, lactosa, y sacarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 7, caracterizada porque dicho agente destinado a
estabilizar dicha enzima es un polímero, seleccionado de entre el
grupo constituido por:
- -
- los polisacáridos modificados o no tales como la agarosa, la goma de guar, los carragenanos, el ácido algínico y los alginatos, la pectina, el quitosano,
- -
- las polivinilpirrolidonas, eventualmente sustituidas,
- -
- celulosa y derivados de celulosa tal como los derivados alquilados o funcionalizados,
- -
- los poliacrilatos,
- -
- los polivinilalcoholes (PVA) y los derivados parcialmente hidrolizados de los polivinilacetatos,
- -
- las poliacrilamidas,
- -
- las poliamidas.
\newpage
9. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizada porque dicho agente destinado a evitar
la degradación de dicha enzima es un componente que comprende por lo
menos una función nitrogenada, en particular un agente tensoactivo
o un polímero.
10. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque dicho agente
destinado a evitar la degradación de dicho agente activo presenta
un carácter anfífilo que le confiere una función activa en la
formulación de las bicapas de dichas vesículas.
11. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque dichas
vesículas comprenden además por lo menos un agente destinado a
reforzar su hermetismo, siendo dicho agente encapsulado en el seno
de dichas vesículas o constituyendo un revestimiento externo de
dichas vesículas.
12. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque dicha enzima es
una proteasa.
13. Procedimiento de preparación de una
composición según una de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- -
- preparar una fase lamelar cristal-líquido que comprende por lo menos un agente tensoactivo y que incorpora por lo menos una enzima y un agente destinado a evitar la degradación de dicho agente activo,
- -
- transformar dicha fase cristal-líquido en vesículas multilamelares de estructura en cebolla, mediante cizallado o solicitación mecánica, en particular mediante la mezcla de los constituyentes de dicha fase lamelar cristal-líquido.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicho cizallado es un cizallado
homogéneo.
15. Procedimiento para mejorar la estabilidad de
una enzima y evitar su degradación, caracterizado porque
consiste en encapsular dicha enzima en el seno de vesículas
multilamelares tales como las definidas en una de las
reivindicaciones 1 a 12 u obtenidas según el procedimiento de una de
las reivindicaciones 13 ó 14, estando dichas vesículas en forma de
un apilamiento regular de bicapas concéntricas que comprenden por lo
menos un agente tensoactivo, extendiéndose dichas bicapas desde el
núcleo mismo de dichas vesículas hasta su periferia y estando
separadas por un líquido intersticial, incorporando dichas vesículas
en su seno por lo menos un agente destinado a evitar la degradación
de dicha enzima.
16. Procedimiento para proteger y/o inmovilizar
una enzima, caracterizado porque consiste en poner dicha
enzima en presencia de vesículas multilamelares en forma de un
apilamiento regular de bicapas concéntricas que comprenden por lo
menos un agente tensoactivo, extendiéndose dichas bicapas desde el
núcleo mismo de dichas vesículas hasta su periferia y estando
separadas por un líquido intersticial, incorporando dichas vesículas
en su seno por lo menos un agente destinado a evitar la degradación
de dicha enzima tal como se define en una de las reivindicaciones 5
a 10 o en encapsular dicha enzima en el seno de vesículas
multilamelares tal como se define en una de las reivindicaciones 1
a 11 u obtenidas según el procedimiento de una de las
reivindicaciones 14 ó 15, incorporando dichas vesículas en su seno
por lo menos un agente destinado a evitar la degradación de dicha
enzima tal como se define en una de las reivindicaciones 5 a 10.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, caracterizado porque dicha enzima es una proteasa.
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|---|---|---|---|
| FR9715073A FR2771635A1 (fr) | 1997-12-01 | 1997-12-01 | Procede perfectionne pour eviter la degradation d'un principe actif |
| FR9715073 | 1997-12-01 | ||
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|---|---|---|---|
| ES98958288T Expired - Lifetime ES2327018T3 (es) | 1997-12-01 | 1998-12-01 | Composicion que contiene una enzima y un agente que estabiliza dicha enzima, y procedimiento para mejorar la estabilidad de una enzima y evitar su degradacion o para proteger y/o inmovilizar una enzima. |
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