ES2326948B1 - Metodo de deteccion de quinolonas en alimentos y materiales biologicos. - Google Patents
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Abstract
Método de detección de quinolonas en alimentos y
materiales biológicos.
Esta invención tiene por objeto un nuevo método
de ensayo microbiológico para la detección de la presencia o
ausenciade antibióticos de la familia de las quinolonas en muestras
biológicas tales como leche, huevo, carne, miel, pienso, suero y
orina. En la invención se ha ideado un nuevo método basado en la
inhibición del crecimiento del microorganismo Escherichia coli
ATCC 11303 en presencia de muestras contaminadas con residuos de
quinolonas. El ensayo se realiza en un formato de tubo lo que
permite el análisis de grandes series de muestras. La inhibición
del crecimiento es detectada a través de un indicador de
metabolismo. Este nuevo método de ensayo permite la detección de
las quinolonas en concentraciones inferiores o iguales a los
Límites Máximos de Residuos (LMRs) permitidos en alimentos
destinados al consumo humano en la Unión Europea.
Description
Método de detección de quinolonas en alimentos y
materiales biológicos.
La invención se encuadra en el sector
agroalimentario, más concretamente en el relativo a los métodos de
análisis.
La detección de residuos de medicamentos
veterinarios en alimentos y, especialmente de antibióticos, tiene
una gran importancia debido a sus repercusiones en la Salud
Pública, así como también sobre algunos procesos tecnológicos de
fermentación. El uso de este tipo de substancias en el sector
ganadero es habitual, tanto con fines terapéuticos como con objeto
de mejorar los rendimientos productivos. Estos tratamientos pueden
dar lugar a la presencia de antibióticos en los alimentos, que
incluso pueden encontrarse en concentraciones por encima de los
Límites Máximos de Residuo (LMR) establecidos según el Reglamento
(CEE) 2377/90 de la Unión Europea.
En la actualidad, es posible determinar
específicamente la presencia de residuos de antibióticos alimentos
mediante técnicas inmunoquímicas, de receptores biológicos o bien
instrumentales como el HPLC, pero no existe ningún método para la
detección de residuos de antibióticos en alimentos que reúna todos
los requisitos de un método ideal (amplio espectro de sensibilidad,
rapidez, coste asequible, no aparición de falsos negativos,
utilización por usuarios sin experiencia especifica, etc) En ese
sentido, por su sencillez y bajo coste, las técnicas basadas en la
inhibición del crecimiento microbiano son las más ampliamente
utilizadas. Dentro de este grupo, las técnicas de bioensayo en placa
del tipo del "test de las 4 placas" son las más extendidas.
Estas técnicas consisten, básicamente, en la puesta en contacto de
la muestra con una placa que contiene un microorganismo de ensayo,
los nutrientes necesarios para su crecimiento y un soporte sólido
en forma de agar. Cuando la muestra problema contiene un
antimicrobiano se formará un halo de inhibición del crecimiento del
microorganismo de ensayo que tiene que ser medido. Dentro de éstas
técnicas existen variantes en las que se combinan diferentes
microorganismos de ensayo (Bacillus subtilis, B. cereus.
Geobacilllus stearothermophilus, etc), diferentes medios de
crecimiento y diferentes condiciones de cultivo. Sin embargo, estas
técnicas microbiológicas presentan el inconveniente común de su gran
laboriosidad y la baja capacidad analítica, lo que limita su uso
sistemático como método de rutina tanto en laboratorios oficiales
como en los laboratorios de la industria alimentaria.
Esta limitación ha sido soslayada, parcialmente,
gracias a algunos métodos comerciales listos para usar basados en
el uso de Geobacillus stearothermophilus como diana de los
antibióticos y la medida de su actividad metabólica mediante un
indicador de color tipo ácido-base o de
oxido-reducción. El microorganismo de ensayo, el
medio de crecimiento y el indicador están contenidos en un tubo de
diferentes dimensiones. Cuando se añade la muestra al tubo
conteniendo los tres componentes y en las condiciones optimas de
crecimiento, el microorganismo será capaz de crecer modificando la
composición del medio que será detectado a través del indicador de
color. Si la muestra contiene un antimicrobiano el microorganismo
diana no será capaz de crecer y por lo tanto de modificar el medio
que mantendrá su color inicial. Se han descrito ejemplos de estos
ensayos en los documentos ES2263361, EP0005891, EP0611001.
El uso de este tipo de métodos es muy extendido
en el análisis de residuos de antibióticos y sulfamidas en el
sector lácteo como una etapa inicial de cribado, debido a la
elevada sensibilidad del microorganismo diana a los residuos de la
familia de los betalactámicos y cefalosporinas que son ampliamente
utilizados en la terapéutica del ganado lechero. Las muestras
resultantes positivas a estos métodos son posteriormente
confirmadas con métodos instrumentales tipo HPLC. Los métodos de
inhibición del crecimiento microbiano en tubo se están utilizando
también en otros sectores como el cárnico y el de ovoproductos
principalmente como una herramienta de autocontrol de la industria
alimentaria. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de
estos métodos es que presentan una insuficiente sensibilidad a
algunos grupos de antibióticos cada vez más empleados en
terapéutica veterinaria, como por ejemplo el de la familia de las
quinolonas, siendo los umbrales de detección para esta familia de
sustancias más de 10 veces superiores a los Limites Máximos de
Residuo permitidos por la legislación.
El empleo de las quinolonas se ha incrementado
notablemente en las últimas décadas, tanto en el ámbito de la
medicina humana como veterinaria. El mecanismo de acción de estos
antibióticos se basa en la inhibición de la síntesis del ADN,
actuando sobre enzimas que intervienen en sus procesos de síntesis y
replicación. Se considera que su diana preferente son las enzimas
topoisomerasa II -también denominada DNA girasa- en microorganismos
Gram (-) y la topoisomerasa IV en Gram (+). Entre los compuestos
que forman parte del grupo de la quinolonas están las siguientes:
enrofloxacina, norfoxacina, ciprofloxacina, danofloxacina,
marbofloxacina, sarafloxacina, flumequina, ácido oxolinica, ácido
nalidixico y difloxacina.
Por otra parte, el "test de las 4 placas"
consta de una batería de placas que contienen diferentes
microorganismos diana y medios de detección, entre las que se
incluye una placa inoculada con E. coli ATCC 11303,
específica para la detección de quinolonas. Según diversos autores,
la sensibilidad de esta placa es adecuada a los niveles exigidos
por la legislación. Sin embargo, este método como se ha mencionado
anteriormente presenta los inconvenientes de su gran laboriosidad,
la necesidad de mantener cultivos bacterianos frescos y la baja
procesabilidad de muestras, lo cual supone un elevado esfuerzo y
coste económico para el laboratorio.
Por lo tanto sería deseable disponer de un
método analítico que permitiese detectar con fiabilidad quinolonas
en productos de origen animal, con una sensibilidad adecuada, de
fácil implementación por los laboratorios y baja laboriosidad, que
permitiese el análisis de numerosos muestras, así como posibilitar
su automatización.
La presente invención describe un sistema de
detección de quinolonas en alimentos y muestras biológicas, en
formato de tubo, que permite simplificar el análisis. Este método
incluye el microorganismo de ensayo Escherichia coli ATCC
11303 como diana para la detección, un medio adecuado de
crecimiento, un indicador de metabolismo microbiano y unas
condiciones optimas de realización del ensayo. En las condiciones
adecuadas de crecimiento el microorganismo de ensayo es capaz de
metabolizar los nutrientes del medio y como consecuencia modificar
el color del indicador de metabolismo de azul a amarillo. Cuando la
muestra contiene una o varias quinolonas, el microorganismo no será
capaz de crecer y por lo tanto el medio conservará el color azul
original. Además, se demuestra que el método descrito es capaz de
detectar los residuos de quinolonas específicamente y con unos
umbrales de detección adecuados a los requerimientos legislativos
de la Unión Europea en cuanto a los límites máximos de residuos
(LMR). Por otra parte, esta metodología puede ser aplicada al
análisis de rutina permitiendo el análisis de grandes series de
muestras, e incluso la automatización de los procesos de
análisis.
El método de ensayo para la detección de
quinolonas en alimentos y materiales biológicos, objeto de esta
memoria, reivindica la utilización de Escherichia coli ATCC
11303 como microorganismo de ensayo acoplado a un medio de
crecimiento adecuado y a un indicador de metabolismo, en un formato
de tubo, que permita detectar una o varias quinolonas, entre otras
la enrofloxacina, ciprofloxacina, norfoxacina, y sarafloxacina, en
muestras biológicas, como por ejemplo leche, huevo, jugo de carne y
vísceras, miel, suero u orina. Este nuevo método comprende la
puesta en contacto de la muestra a analizar con el microorganismo
de ensayo, Escherichia coli ATCC 11303 y la provisión de las
condiciones de realización del ensayo en las que: en ausencia de
compuestos de la familia de las quinolonas la actividad metabólica
de dicho microorganismo suceda y pueda ser detectada; y en
presencia de compuestos de la familia de las quinolonas dicha
actividad metabólica sea inhibida y por tanto, no pueda ser
detectada.
El medio de crecimiento o de ensayo puede ser un
medio sólido, como por ejemplo un medio agar, o líquido, como por
ejemplo un caldo nutritivo, al que se añade el microorganismo de
ensayo, los nutrientes necesarios para soportar el crecimiento de
dicho microorganismo y un indicador ácido-base o de
oxido-reducción. Todos estos componentes pueden
opcionalmente ser añadidos al medio de ensayo por separado mediante
una disolución líquida, un liofilizado, en pastilla, en disco de
papel o bien encontrarse premezclados en un tubo listo para
usar.
Entre los nutrientes adecuados se incluyen
fuentes de carbono asimilables, fuentes de nitrógeno asimilables y
fuentes de factores de crecimiento y minerales.
El microorganismo de ensayo puede conservarse
dispersado en el medio sólido, por ejemplo un medio agar
solidificado, líquido, por ejemplo en un caldo nutritivo, o bien
puede conservarse en forma deshidratada o liofilizada.
El microorganismo de ensayo se añade
preferentemente al medio de crecimiento en forma de una suspensión
de células vegetativas. En función del tiempo de realización del
ensayo y del grado de sensibilidad a los distintos compuestos del
grupo de las quinolonas que se pretenda conseguir, dicho
microorganismo estará presente en una concentración de 10^{2} a
10^{6} UFC/mL.
El crecimiento del microorganismo de ensayo
puede detectarse visualmente a través del cambio de color del medio
de ensayo en el que se encuentra un indicador de la actividad
metabólica. Este puede ser un indicador de
oxido-reducción, preferentemente Negro Brillante o
un indicador ácido-base, preferentemente Púrpura de
Bromocresol. Opcionalmente la lectura del resultado del método de
ensayo puede obtenerse visualmente o mediante la medida con un
lector óptico de los cambios de color experimentados por el medio de
ensayo.
La sensibilidad y tiempo del ensayo pueden
modificarse por diversos medios: por ejemplo cambiando las
condiciones de ensayo, tales como la temperatura y tiempo de
incubación, el pH del medio de ensayo, variando al relación de
volúmenes del medio de detección y la muestra a analizar.
En relación con los formatos de ensayo, éstos
pueden ser de diferentes tamaños, entendiendo que la relación entre
la cantidad de medio de detección y de la muestra problema
determina la sensibilidad del método de ensayo. De esta forma
pueden utilizarse opcionalmente tubos de entre 3-100
mm de altura y 1-20 mm de sección trasversal,
placas de microtitulación, cubetas de espectrofotómetro o bloques
con hendiduras tubulares u otra forma, que alojen el medio de
ensayo. El volumen de medio de ensayo y de la muestra problema
podrá variar en función de la unidad de ensayo. Por ejemplo, cuando
la unidad de ensayo sea un tubo o una cubeta, el volumen del medio
de ensayo podrá oscilar entre 10 micro-L y 5 mL y
el volumen de muestra problema entre 10 micro-L y 2
mL. Dichos formatos de ensayo permiten realizar desde una a cientos
de unidades de ensayo simultáneamente.
En relación con las condiciones de realización
del ensayo, la temperatura de ensayo puede estar entre 30 y 45ºC,
con mayor preferencia entre 35 y 39ºC. El pH del medio de ensayo
entre 5 y 8; y el tiempo de ensayo entre 2 y 24 horas.
La incubación puede realizarse en un baño
termoestático, estufa microbiológica o en cualquier otro tipo de
incubador convencional.
Para complementar la descripción, aunque de
forma ilustrativa y no limitativa, se acompaña la presente memoria
de los siguientes ensayos preferentes:
\vskip1.000000\baselineskip
Unidad de ensayo: Tubo para fotómetro de 1,5
mL.
Medio de ensayo: Preparar una disolución de 10 g
de peptona, 2.5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 5 g de
dextrosa y 1000 mL de agua destilada. La disolución final se
esterilizó a 121ºC durante 20 min y se conservó a
2-15ºC hasta su uso.
Indicador de metabolismo: Se añadió una
disolución de indicador Negro Brillante a una concentración final
de 10 mg por 1000 mL.
Microorganismo de ensayo: Al medio de ensayo se
añadió un volumen de una suspensión de células vegetativas de
Escherichia coli ATCC 11303 para obtener una concentración
final de 10^{4} células/mL.
Realización del ensayo: Una vez realizada la
mezcla de todos los componentes (medio de detección) se añadieron
800 micro-L de dicha mezcla a cada tubo o cubeta de
poliestireno transparente y 300 micro-L de muestra,
que consistió en jugo de carne al que se le añadieron ninguna o
varias concentraciones de diferentes quinolonas (ver Figura 1).
Condiciones de realización del ensayo: Los tubos
tapados con una lamina adhesiva con la mezcla del medio de
detección y la muestra problema fueron incubados a 40ºC durante 18
horas.
Lectura de los resultados: Tras 18 horas de
incubación se procedió a la realización de una lectura visual de
los resultados y a continuación una doble lectura en un
espectrofotómetro a 590 y 650 nm. Las unidades de ensayo que habían
sido inoculadas con muestras que no contenían antibiótico o una baja
concentración cambiaron de color desde el
azul-oscuro original hasta adquirir una coloración
amarillo-naranja. Aquellas unidades de ensayo cuyas
muestras habían sido contaminadas artificialmente con quinolonas no
cambiaron de color o lo hacían ligeramente. Aquellas unidades de
ensayo cuyo resultado fue negativo a la lectura visual
correspondieron con valores de la lectura fotométrica inferiores a
0.8 unidades de densidad óptica (ver Figura 1). Por ejemplo, la
muestra de jugo de carne contaminado con 50 ug/L de enrofloxacina
presentó un resultado negativo tanto visual como fotométricamente,
mientras que la misma muestra contaminada con 100 ug/L de
enrofloxacina presentó un resultado positivo con los dos sistemas
de lectura de los resultados.
En la figura 1 muestran los umbrales de
sensibilidad del método inventado para 4 quinolonas (Enrofloxacina,
norfloxacina, sarafloxacina y ciprofloxacina) en jugo de carne y
realizado de acuerdo a la descripción del ensayo preferente número
1. La figura representa en abcisas la concentración de cada
quinolona añadida en el jugo de carne analizado, expresada en
micro-g/L. En ordenadas se representan los cambios
de densidad óptica de cada unidad de ensayo como consecuencia de la
actividad metabólica del organismo diana. La línea horizontal
punteada representa el punto de corte a partir del cual se puede
considerar que la muestra analizada es significativamente diferente
de una muestra negativa en cuanto a presencia de quinolonas.
\vskip1.000000\baselineskip
Unidad de ensayo: Como soporte de ensayo se
utilizaron placas de microtitulación formadas por 96 microtubos o
pocillos, lo que permitió realizar hasta 96 unidades de ensayo
independientes en cada ciclo de análisis.
Medio de ensayo: Preparar una disolución de 10 g
de peptona, 2.5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 5 g de
dextrosa y 1000 mL de agua destilada. La disolución final se
esterilizó a 121ºC durante 20 min y se conservó a
2-15ºC hasta su uso.
Indicador de metabolismo: Se añadió una
disolución de indicador Negro Brillante a una concentración final
de 20 mg por 1000 mL.
Microorganismo de ensayo: Al medio de ensayo se
añadió un volumen de una suspensión de células vegetativas de
Escherichia coli ATCC 11303 para obtener una concentración
final de 10^{5} células/mL.
\newpage
Realización del ensayo: Una vez realizada la
mezcla de todos los componentes descritos (medio de detección) se
añadieron 200 micro-L de dicha mezcla y 50
micro-L de muestra problema a cada pocillo de una
placa de microtitulación. La muestra aplicada consistió en jugo de
carne o leche desnatada de vaca a los que se les añadieron ninguna
o varias concentraciones de diferentes quinolonas (ver Tablas 1 y
2).
Condiciones de realización del ensayo: La placa
de microtitulación con la mezcla del medio de detección y las
muestras problema tapadas con una lamina adhesiva y fueron
incubadas a 37ºC durante 16 horas.
Lectura de los resultados: Tras 16 horas de
incubación se procedió a la realización de una lectura visual de
los resultados y a continuación una doble lectura en un fotómetro a
590 y 650 nm. Las unidades de ensayo que habían sido inoculadas con
muestras que no contenían antibiótico o una baja concentración de
éste cambiaron de color desde el azul-oscuro
original hasta adquirir una coloración
amarillo-naranja. Aquellas unidades de ensayo cuyas
muestras habían sido contaminadas artificialmente con quinolonas no
cambiaron de color o lo hacían ligeramente. Aquellas unidades de
ensayo cuyo resultado fue negativo a la lectura visual
correspondieron con valores de la lectura fotométrica inferiores a
0,8 unidades de densidad óptica (ver Tablas 1 y 2). Por ejemplo, la
muestra de jugo de carne contaminado con 50 ug/L de enrofloxacina
presentó un resultado negativo tanto visual como fotométricamente,
mientras que la misma muestra contaminada con 100 ug/L de
enrofloxacina presentó un resultado positivo con los dos sistemas
de lectura de los resultados (Tabla 1). Por su parte, la muestra de
leche contaminada con 50 ug/L de enrofloxacina presentó un resultado
negativo tanto visual como fotométricamente, mientras que la misma
muestra contaminada con 100 ug/L de enrofloxacina presentó un
resultado positivo con los dos sistemas de lectura de los
resultados (Tabla 2).
En la tabla 1 se muestran los umbrales de
sensibilidad del método inventado para 7 quinolonas (Enrofloxacina,
norfloxacina, sarafloxacina, ciprofloxacina, marbofloxacina,
danofloxacina y difloxacina) en jugo de ternera y realizado de
acuerdo a la descripción del ensayo preferente número 2. En la tabla
se representan las diferentes concentraciones de cada una de las
quinolonas evaluadas, expresada en micro-g/L y los
resultados en densidad óptica de cada unidad de ensayo junto con
los resultados correspondientes a la interpretación visual de 4
analistas independientes.
En la tabla 2 se muestran los umbrales de
sensibilidad del método inventado para 3 quinolonas (Enrofloxacina,
ciprofloxacina y marbofloxacina) en leche y realizado de acuerdo a
la descripción del ensayo preferente número 2. En la tabla se
representan las diferentes concentraciones de cada una de las
quinolonas evaluadas, expresada en micro-g/L y los
resultados en densidad óptica de cada unidad de ensayo junto con
los resultados correspondientes a la interpretación visual de 4
analistas independientes.
Claims (10)
1. Método para detectar una o más quinolonas
presentes en una muestra biológica basado en la inhibición de la
actividad metabólica del microorganismo Escherichia coli
cepa ATCC 11303, medible mediante un indicador y que comprende:
a) la puesta en contacto de dicha muestra
biológica con el microorganismo de ensayo y el indicador de
crecimiento metabólico, en un soporte o unidad de ensayo,
b) la provisión de las condiciones de
realización del ensayo en las que en ausencia de compuestos
antimicrobianos de la familia de las quinolonas la actividad
metabólica de dicho microorganismo de ensayo suceda y pueda ser
detectada mediante un indicador; y en presencia de compuestos
antimicrobianos de la familia de las quinolonas dicha actividad
metabólica sea inhibida y por tanto, no pueda ser detectada.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medio de ensayo puede ser un medio
sólido, como por ejemplo un agar, o líquido, como por ejemplo un
caldo nutritivo, al que se le añade el microorganismo de ensayo
Escherichia coli cepa ATCC 11303, los nutrientes necesarios
para soportar el crecimiento de dicho microorganismo y un indicador
de la actividad metabólica.
3. Método según la reivindicación 2,
caracterizado porque todos o parte de los componentes
citados pueden ser añadidos al medio de ensayo por separado
mediante una solución liquida, un liofilizado, en una pastilla o en
un disco de papel.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el
microorganismo del ensayo se añade al medio de ensayo
preferentemente en una concentración de entre 102 a 106 UFC/mL, lo
que permite modificar el tiempo de realización del ensayo y su
sensibilidad a las distintas quinolonas.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el indicador de
la actividad metabólica puede ser un indicador
ácido-base o uno o varios indicadores redox.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es capaz de
detectar en menos de 24 horas la presencia de enrofloxacina,
sarafloxacina y ciprofloxacina a 100 micro-g/L.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el volumen de
medio de ensayo está comprendido entre 10 micro-L y
5 mL y el volumen de muestra a poner en contacto con el medio de
ensayo está comprendido entre 10 micro-L y 2
mL.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la temperatura
óptima de ensayo está comprendida entre 30 y 45ºC, con mayor
preferencia entre 35 y 39ºC.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque utiliza como
soporte para el medio de ensayo un tubo de entre
3-100 mm de altura y 1-20 mm de
sección trasversal, una placa de microtitulación, una cubeta de
espectrofotómetro o un bloque con hendiduras tubulares u otra forma,
que alojen el medio de ensayo.
10. Método según las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque la lectura de los
resultados puede obtenerse visualmente o mediante la medida
fotométrica de los cambios de color experimentados por el medio de
ensayo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200703357A ES2326948B1 (es) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | Metodo de deteccion de quinolonas en alimentos y materiales biologicos. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200703357A ES2326948B1 (es) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | Metodo de deteccion de quinolonas en alimentos y materiales biologicos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326948A1 ES2326948A1 (es) | 2009-10-21 |
| ES2326948B1 true ES2326948B1 (es) | 2010-07-26 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200703357A Expired - Fee Related ES2326948B1 (es) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | Metodo de deteccion de quinolonas en alimentos y materiales biologicos. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2326948B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1338338A1 (en) * | 1995-07-12 | 2003-08-27 | Charm Sciences Inc. | Test apparatus, system and method for the detection of test samples |
| EP1987156A1 (en) * | 2006-02-24 | 2008-11-05 | DSMIP Assets B.V. | Rapid detection of antimicrobial drug residues |
-
2007
- 2007-12-10 ES ES200703357A patent/ES2326948B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PELLEGRINI, G.E., et al. Electrochemical sensor for the detection and presumptive identification of quinolones and tetraccycline residues in milk. Analytica Chimica Acta, 2004, vol 520, páginas 13-18. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2326948A1 (es) | 2009-10-21 |
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