WO2015089683A1 - Método para la determinación microbiológica de trazas de antibióticos en muestras biológicas de bajo volumen - Google Patents

Método para la determinación microbiológica de trazas de antibióticos en muestras biológicas de bajo volumen Download PDF

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Loreto SANHUEZA CHAVEZ
Marcela Andrea WILKENS ANWANDTER
Claudio Aurelio LAURIDO FUENZALIDA
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Universidad De Santiago De Chile
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for the microbiological determination of antibiotic traces in low volume biological samples.
  • this methodology can be used for the determination of antibiotics in other biological fluids, such as urine, blood, synovial fluid, aqueous eye humor, etc.
  • an assay is known to determine levels of antibiotics in the blood (kanamycin and gentamicin) over a period of 40 minutes to 1.5 hours, using samples between 0.1-0.6 ml of serum.
  • the principle of determination is based on the measurement of the drop in pH in a culture containing a large inoculum of the organism under test.
  • the antibiotic inhibits bacterial growth, resulting in the inhibition of fermentation.
  • the degree of inhibition is reflected in the change of pH in the culture medium, which is related to the concentration of antibiotic added. See "Rapid microbiological assay of antibiotics in blood and other body fluids" by S. Faine and D.C. Knight in The Lancet, August 17, 1968, pages 375-378
  • An assay to determine antibiotic levels in cow's milk is also known, using the Delvotest SP-NT and the Copan Milk Test. These inhibitory assays consist of agar blisters or microplates containing Bacillus stearothermophiius spores and nutrients. With the addition of the milk under study, the spores germinate and produce carbonic acid. This acid causes the bromocresol purple indicator on the vial to change color from purple to yellow. Then, a yellow blister after incubation indicates a negative sample. The presence of antibiotics inhibits the growth of the bacteria and the color of the agar in the blister remains purple, indicating a positive result.
  • the Delvotest SP-NT and the Copan Milk Test were developed from the Delvotest SP and the Delvotest Milk Control Stations (MCS). See Validation and comparison of the Copan Milk Test and Delvotest SP-NT for the detection of antimicrobials in milk. Marie-Hannine Le Breton, Marie-Claude Savoy-Perroud, Jean-Marc Diserens. Analytica Chimica Acta 586 (1-2): 280-283, (2007).
  • Another known assay is based on the concentration-dependent variation of the antibiotic inhibitory effect in reference bacteria, B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 6538p and S. epidermidis ATCC 12228, seeded on agar. The results were expressed as average of the zone of inhibition (in mm) versus the antibiotic concentration. See Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics. Andrés F Zuluaga, Maria Agudelo, Carlos A Rodr ⁇ guez and Ornar Vesga. BMC Clinical Pharmacology 2009, 9: 1 doi: 0, 1186 / 1472-6904-9-1.
  • CN1858232 reveals a technology to detect antibiotic residues in agricultural products, being particularly a microbiological method to detect sulfa residues in edible animal tissue that comes in kit form.
  • the method comprises preparing a culture medium I and culture medium II; forming a culture medium with the culture medium I and the culture medium II, uses Bac ⁇ llus megaterium as a working microorganism, sheets of neomycin paper for quality control and synergistic solution of trimethoprim.
  • the technology is simple detection, high sensitivity, and long storage life of the kit.
  • EP0418113 refers to a microbiological test kit and method for detecting antibacterial compounds in a specimen, particularly useful for food or dairy industry.
  • Said method comprises the step of: a) mixing said species with a viable bacterium that exhibits improved sensitivity to said antibacterial compound to form a mixture; b) incubating said mixture under optimal growth conditions; c) diluting said mixture with an aqueous reagent solution that generates a specially selected signal to detect at least one metabolic marker that exists in said bacterium; d) incubating said mixture for sufficient time for said signal to be detected; d) measuring or detecting said signal in said mixture; e) comparing said signal to a free control specimen of said antibacterial compound that was simultaneously subjected to steps (a) to (d).
  • Figure 1 shows the% growth inhibition curves of S. aureus as a function of the concentration of five antibiotics tested in triplicate for each antibiotic. Points are average ⁇ standard deviation (SD).
  • Figure 2 shows the% growth inhibition curves of E. coli as a function of the concentration of five antibiotics tested. It can be seen that E. coli was less sensitive to all antibiotics tested. Therefore, the remaining experiments were performed using S. aureus (tested in triplicate for each antibiotic; the points are average ⁇ SD).
  • Figure 3 shows the curve resulting from the application of the equation of the 4PL curve to the minocycline antibiotic obtained from Figure 1. From it, the curve of Figure 4 was made.
  • Figure 4 shows the kinetics of minocycline injected into the cistern. It can be seen that the present method allows the quantification of minocycline concentrations to the order of 10-100 ng / ml.
  • the minimum inhibitory concentration (IC) of the antibiotics minocycline, ciprofloxacin, kanamycin, tetracycline and oxacillin was determined by the 96-well plate microdilution method, in accordance with the protocol recommended by the Institute of Clinical Laboratory Standards, against ATCC Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli. ATCC 1129. Briefly, the bacteria were grown in Mueller-Hinton broth (MHB) overnight and diluted to 0.5 Me Farland (1.5 x 10 8 cells / mL). To the bacterial cultures, different antibiotics in 96-well plates were added in a final volume of 200 ⁇ L.
  • the plates were incubated at 37 ° C for 18 h and the absorbance was determined in an ELISA reader (Thermo Labsystems Multiskan model FC). The results were expressed as a percentage of inhibition in relation to the control contained in the spinal brain fluid and the bacterial culture. Of the two strains of microorganisms tested, Staphylococcus was chosen as the most sensitive to minocycline. The results show that it is possible, for example, to obtain determinations of minocycline in spinal fluid (CSF) up to the level of ng / mL.
  • CSF spinal fluid
  • CSF spinal fluid
  • EC 50 The value of x for the curve is half between the maximum and minimum parameters. It is called half of the maximum effective concentration.
  • Minocycline an antibiotic belonging to the tetracycline family, was used for the purpose of conducting pharmacokinetic studies in the CSF in Sprague-Dawley rats. Briefly, a 1 mg / mL MC solution was injected intra-CSF into normal rats, to subsequently take CSF samples at zero, 1, 10 and 18 hours. It can be seen that MC is detected at all times. At 18 hours it is still possible to detect it at a concentration of 69 ng / mL ( Figure 4).

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Abstract

Método para la determinación microbiológica de trazas de antibióticos en muestras biológicas de bajo volumen que comprende determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de un antibiótico seleccionado de minociclina, ciprofloxacina, kanamicina, tetraciclina y oxacilina contra Staphylococcus aureus. Se cultiva la bacteria, en caldo de Mueller-Hinton (MHB) durante toda la noche, para luego diluir dichos cultivos a 0,5 Mc Farland (1,5 x108 células/mL). Se agrega posteriormente, dichos antibióticos a placas de 96 pocillos en un volumen final de 200 μL y se incubaron a 37 °C durante 18 horas. Se determinó la absorbencia y se expresaron los resultados como porcentaje de inhibición en relación al control que contenía la muestra biológica a su vez seleccionada de orina, sangre, líquido sinovial, humor acuoso del ojo o líquido céfalo raquídeo (LCR), y el cultivo bacteriano. Se obtiene la curva que representa el porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano versus la concentración de antibiótico, y se ajusta mediante la curva "Four Parameter Logistic Curve (4PL)" obteniéndose los valores de la concentración de los antibióticos de la muestra biológica. El método permite determinar cantidades de antibiótico en la muestra biológica incluso en el nivel de ng/mL

Description

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN MICROBIOLÓGICA DE TRAZAS DE ANTIBIÓTICOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS DE BAJO VOLUMEN.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a un método para la determinación microbiológica de trazas de antibióticos en muestras biológicas de bajo volumen.
ARTE PREVIO
Numerosos estudios han confirmado el rol de la glía espinal en el desarrollo y persistencia del dolor crónico. En consecuencia con lo anterior, es posible plantear que la supresión farmacológica de la función glial en la médula espinal puede deprimir los mecanismos espinales del dolor. Diferentes fármacos han mostrado que, además de actuar como antibióticos (minociclina, amoxicilina, neomicina, ceftriaxona), presentan actividad anti- inflamatoria. Esto los convierte en fármacos útiles en estudios de dolor crónico. Usualmente, estos antibióticos son administrados en ratas que presentan cuadros de dolor crónico vía ¡ntratecal, a un compartimiento que en esos animales presenta un muy bajo volumen (del orden de 80-100 μί). Esta dificultad hace complicada la determinación de estos antibióticos por métodos clásicos, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), debido a que en este caso, la muestra debe ser limpiada de elementos presentes en el líquido céfalo raquídeo, tales como proteínas, péptidos u otros componentes que impiden su uso en la cromatografía HPLC. Por otro lado, no se podrían hacer estudios cinéticos de los antibióticos, debido a que una sola muestra para HPLC consumiría todo el líquido céfalo raquídeo de la rata.
Además, esta metodología puede ser utilizada para la determinación de antibióticos en otros fluidos biológicos, tales como orina, sangre, líquido sinovial, humor acuoso del ojo, etc.
Es probable también que, utilizando HPLC acoplado a Espectrometría de Masa, se pudieran detectar trazas de antibióticos en muestras biológicas u otras, pero el volumen necesario para la detección es alto (del orden de mL). El método microbiológico es muy simple y sensible, constituyendo una alternativa económica en comparación con las determinaciones realizadas por el método de HPLC.
Específicamente, en el arte previo se conoce un ensayo para determinar niveles de antibióticos en la sangre (kanamicina y gentamicina) en un período de tiempo de 40 minutos a 1 ,5 horas, utilizando muestras de entre 0,1-0,6 mi de suero. El principio de la determinación está basado en la medición de la caída en el pH en un cultivo conteniendo un gran inoculo del organismo bajo ensayo. El antibiótico inhibe el crecimiento bacteriano, lo que resulta en la inhibición de la fermentación. El grado de inhibición se ve reflejado en el cambio de pH en el medio de cultivo, lo que se relaciona con la concentración de antibiótico agregado. Ver "Rapid microbiological assay of antibiotics in blood and other body fluids" de S. Faine y D.C. Knight en The Lancet, August 17, 1968, páginas 375-378
También es conocido un ensayo para determinar niveles de antibióticos en la leche de vaca, mediante el Delvotest SP-NT y el Copan Milk Test. Estos ensayos inhibitorios consisten de ampollas de agar o microplacas conteniendo esporas del Bacillus stearothermophiius y nutrientes. Con la adición de la leche bajo estudio, las esporas germinan y producen ácido carbónico. Este ácido causa que el indicador púrpura de bromocresol en la ampolla cambie de color de púrpura a amarillo. Entonces, una ampolla amarilla después de la incubación indica una muestra negativa. La presencia de antibióticos inhibe el crecimiento de la bacteria y el color del agar en la ampolla permanece de color púrpura, indicando un resultado positivo. Los Delvotest SP-NT y el Copan Milk Test fueron desarrollados a partir del Delvotest SP y del Delvotest Milk Control Stations (MCS). Ver Validation and comparison of the Copan Milk Test and Delvotest SP-NT for the detection of antimicrobials in milk. Marie-Héléne Le Bretón, Marie-Claude Savoy-Perroud, Jean-Marc Diserens. Analytica Chimica Acta 586 (1-2): 280-283, (2007).
Otro ensayo conocido está basado en la variación dependiente de la concentración del efecto inhibitorio de antibióticos en bacterias de referencia, B. subtilis ATCC 6633, S. aureus ATCC 6538p y S. epidermidis ATCC 12228, sembradas en agar. Los resultados se expresaron como promedio de la zona de inhibición (en mm) versus la concentración de antibiótico. Ver Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics. Andrés F Zuluaga, Maria Agudelo, Carlos A Rodríguez and Ornar Vesga. BMC Clinical Pharmacology 2009, 9:1 doi: 0, 1186/1472-6904-9-1.
Por otra parte, CN1858232 revela una tecnología para detectar residuos de antibiótico en productos agrícolas, siendo particularmente un método microbiológico para detectar restos de sulfa en tejido animal comestible que viene en forma de kit. El método comprende preparar un medio de cultivo I y medio de cultivo II; formar un medio de cultivo con el medio de cultivo I y el medio de cultivo II, utiliza Bacíllus megaterium como microorganismo de trabajo, láminas de papel de neomicina para control de calidad y solución sinérgica de trimetoprima. La tecnología es de detección simple, alta sensibilidad, y larga vida de almacenamiento del kit.
EP0418113 se refiere a un kit de ensayo microbiológico y método para detectar compuestos antibacterianos en un espécimen, particularmente útil para alimentos o industria láctea. Dicho método comprende la etapa de: a) mezclar dicha especie con una bacteria viable que exhibe sensibilidad mejorada a dicho compuesto antibacteriano para formar una mezcla; b) incubar dicha mezcla bajo condiciones de crecimiento óptimo; c) diluir dicha mezcla con una solución acuosa de reactivos que genera una señal especialmente seleccionada para detectar al menos un marcador metabólico que existe en dicha bacteria; d) incubar dicha mezcla por tiempo suficiente para que dicha señal sea detectada; d) medir o detectar dicha señal en dicha mezcla ; e) comparar dicha señal a un espécimen de control libre de dicho compuesto antibacteriano que fue simultáneamente sometido a las etapas (a) a (d).
Entonces, resultaría ventajoso un método microbiológico para determinar antibióticos en base a pequeñas cantidades de muestra (10-20 μΐ), sin necesidad de ninguna preparación previa, y además, la alta sensibilidad del método. Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las curvas de % de inhibición de crecimiento de S. aureus en función de la concentración de cinco antibióticos ensayados en triplicado para cada antibiótico. Los puntos son promedio ± desviación estándar (SD).
La Figura 2 muestra las curvas de % de inhibición de crecimiento de E. coli en función de la concentración de cinco antibióticos ensayados. Se puede observar que E. coli resultó menos sensible a todos los antibióticos ensayados. Por ello, los restantes experimentos se realizaron utilizando S. aureus (ensayados en triplicado para cada antibiótico; los puntos son promedio ± SD).
La Figura 3 muestra la curva resultante de la aplicación de la ecuación de la curva 4PL al antibiótico minociclina obtenido de la Figura 1. A partir de ella, se confeccionó la curva de la Figura 4.
La Figura 4 muestra la cinética de minociclina inyectada en la cisterna magna. Se puede observar que el presente método permite la cuantificación de las concentraciones de minociclina hasta el orden de 10-100 ng/ml.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo
La concentración inhibitoria mínima (CI ) de los antibióticos minociclina, ciprofloxacina, kanamicina, tetraciclina y oxacilina, se determinó por el método de microdiluciones en placas de 96 pocilios, de acuerdo con el protocolo recomendado por el Instituto de Normas de Laboratorio Clínico, contra ATCC Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Escherichia coli. ATCC 1129. Brevemente, las bacterias se cultivaron en caldo de Mueller-Hinton (MHB) durante la noche y se diluyeron a 0,5 Me Farland (1 ,5 x108 células/mL). A los cultivos bacterianos, se le añadió diferentes antibióticos en placas de 96 pocilios en un volumen final de 200 μL·. Las placas se incubaron a 37°C durante 18 h y se determinó la absorbancia en un lector de ELISA (Termo Labsystems Multiskan modelo FC). Los resultados fueron expresados en porcentaje de inhibición en relación al control que contenía el líquido cerebro espinal y el cultivo bacteriano. De las dos cepas de microorganismos probadas, se eligió a Staphylococcus por ser el más sensible a la minociclina. Los resultados muestran que es posible, por ejemplo, obtener determinaciones de minociclina en líquido céfalo raquídeo (LCR) hasta el nivel de ng/mL.
También se obtuvo una curva que representa el porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano versus la concentración de antibiótico aplicada a cada pocilio. Posteriormente, mediante un ajuste de curva llamada "Four Parameter Logistic Curve (4PL)", se obtuvieron los valores de la concentración de los antibióticos de la muestra biológica.
Ejemplo
Extracción de Líquido Céfalo Raquídeo (LCR): Este fue obtenido por una punción transcutánea en la cisterna magna. Las inyecciones de minociclina fueron realizadas por esa misma ruta.
Ajuste de curvas: La curva llamada Four Parameter Logistic Curve (4PL), fue aplicada al antibiótico minociclina obtenido de la Figura 1 :
y= (max-min)/1 +(x/EC50) Λ H'"s,ope+min, resolviendo para x:
x= EC5o((-max+y)/(min-y;Afí HÍ"sfopeJ
donde:
min= Parte inferior de la curva
max= Parte superior de la curva
EC50= El valor de x para la curva es la mitad entre los parámetros máximo y mínimo. Es llamada la mitad de la concentración efectiva máxima.
Hillslope= Caracteriza la pendiente de la curva en su punto medio.
Con lo anterior se generó la Figura 4.
Minociclina (MC), antibiótico perteneciente a la familia de las tetraciclinas, se utilizó con el propósito de realizar estudios farmacocinéticos en el LCR en ratas Sprague- Dawley. Brevemente, se inyectó por vía intra LCR a ratas normales una solución de MC de 1 mg/mL, para posteriormente tomar muestras de LCR a tiempo cero, 1 , 10 y 18 horas. Se puede observar que MC es detectada en todos los tiempos. A las 18 horas es posible todavía detectarla a una concentración de 69 ng/mL (Figura 4).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para la determinación microbiológica de trazas de antibióticos en muestras biológicas de bajo volumen que comprende determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) de un antibiótico seleccionado de minociclina, ciprofloxacina, kanamicina, tetraciclina y oxacilina contra Staphylococcus aureus, al cultivar dichas bacterias, separadamente, en caldo de Mueller-Hinton (MHB) durante la noche, para luego diluir dichos cultivos en 0,5 Me Farland (1 ,5 x108 células/mL), y agregar posteriormente, dichos antibióticos e incubar a 37°C durante 18 h para luego determinar la absorbancia y expresar los resultados en porcentaje de inhibición en relación al control que contenía la muestra biológica a su vez seleccionada de orina, sangre, líquido sinovial, humor acuoso del ojo o líquido céfalo raquídeo (LCR), y el cultivo bacteriano; obtener la curva que representa el porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano versus la concentración de antibiótico, y ajustar mediante curva "Four Parameter Logistic Curve (4PL)" para obtener los valores de la concentración de los antibióticos de la muestra biológica.
2. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho antibiótico es minociclina.
3. El método de la reivindicación 1 , en donde la muestra biológica es líquido cerebro espinal
4. El método de la reivindicación 3, en donde la muestra biológica de líquido de cerebro espinal es obtenido por punción transcutánea en la cisterna magna de una rata.
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