CN110305933A - 一种快速检测药敏的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测药敏的方法，包括以下步骤：第一步，用营养肉汤和抗菌药物进行混合，配制成浓度呈梯度变化的抗菌药物稀释液；第二步，用超纯水配制待检测菌株的标准菌悬液，再用肉汤稀释后备用；第三步，在第一步配制的抗菌药物稀释液中分别加入等体积的经肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次滴加于质谱仪样品靶板上点样，点样完成后孵育2.0～5.0h；第四步，孵育完成后，弃肉汤，晾干，滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并判读结果。本发明方法前处理操作简单，能够更快速的直观地给出准确的药敏结果，给临床及时指导合理用药提供一定的参考。

Description

一种快速检测药敏的方法

技术领域

本发明涉及药敏检测领域，尤其是涉及一种快速检测药敏的方法。

背景技术

抗生素（即抗菌药）在临床上应用范围广泛，为人类疾病的预防和治疗作出了巨大贡献。近年来，随着抗生素种类的增多，临床对抗菌药物的依赖日益严重，由于抗生素不合理的利用甚至滥用，导致细菌产生耐药性，且耐药性逐渐增强的现象已严重威胁着人类的健康。各种多重耐药菌和泛耐药菌的检出率不断提升，甚至出现超级耐药菌，新药的研发速度已远远赶不上耐药菌的产生速度，这给临床的抗感染治疗带来了很大的挑战，目前，细菌耐药性已成为一个全球性的问题。

为使患者得到及时的治疗，需要快速检测出耐药菌（药敏）的种类。目前的检测方法有三种：稀释法、药敏板检测法和自动化仪器检测。

常用的稀释法是美国临床实验室标准化协会（Clinical and LaboratoryStandards Institute，即CLSI）推荐的肉汤稀释法，用肉汤将一定浓度的抗菌药物稀释成不同倍数的梯度浓度，倍数梯度浓度可为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、……、0.25μg/mL、0.12μg/mL，接种待检测菌株，35℃孵育18～24h后观察待检测菌的生长情况（即浑浊情况），根据生长情况确定结果。肉汤稀释法需要配制8个以上的抗菌药物稀释液，操作繁琐，耗材成本大，孵育耗时长，由于待测菌株种类繁多，肉汤稀释法无法满足大规模检测需求。

药敏板检测法只需将肉汤稀释后的标准菌悬液分别添加到每个药敏孔内，与药敏孔内封装的抗生素混合均匀后，孵育18～20h，机器或人工确定每种待测菌株的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，即MIC值），参照CLSI的相应标准确定待检测菌株对抗生素的耐药结果，鉴定结果有敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。药敏板检测法的耗时依然很长，患者不能得到及时治疗；同时由于药敏板上封装有多排抗生素，每种抗生素占据一排，在读取MIC值时容易因跳孔而出现误判现象，所以多用于实验室研究使用。

自动仪器检测是利用全自动微生物药敏检测设备进行检测，将待检测菌株配制成标准菌悬液，将标准菌悬液滴加到药敏卡的每个点样孔内，与点样孔内的抗生素进行混合后直接上机检测，10小时后出耐药结果。该检测方法虽然操作简单，相对缩短了检测时间，但是对需要进行抗菌感染治疗的患者而言其检测时间依然很长，使得患者不能得到及时治疗；同时现有全自动微生物药敏检测设备能够检测的抗菌药物种类非常有限，与自动检测设备配套的商业药敏卡中的药物浓度范围小，不利于耐药性的长期检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速检测药敏的方法，缩短了药敏检测时间，提高了检测效率，给临床及时指导合理用药提供一定的参考。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明所述的快速检测药敏的方法，包括以下步骤：

第一步，用营养肉汤和抗菌药物进行混合，配制成浓度呈梯度变化的抗菌药物稀释液；

第二步，用超纯水配制待检测菌株的标准菌悬液，再用肉汤稀释后备用；

第三步，在第一步配制的抗菌药物稀释液中分别加入等体积的经肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒孵育2.0～5.0h；

第四步，孵育完成后，弃肉汤，晾干，滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并判读结果。

其中所述第一步中抗菌药物稀释液的浓度梯度与CLSI推荐的待检测菌株的耐药、中介和敏感MIC值对应，第一步中抗菌药物稀释液的浓度梯度数量≥2个。

为保证孵育效果，所述第二步中标准菌悬液的浓度为0.4～4.0麦氏。

为保证孵育效果和质谱鉴定，所述第三步中每个混合液的点样体积为1μL～10μL。

本发明采用的方法学是基于质谱学的一种快速检测药敏的技术。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种基于蛋白质图谱鉴定微生物的软电离质谱技术，具有鉴定快速，操作简单，高通量，高分辨率，等优点。该技术在临床微生物检验领域已得到广泛的应用。

本发明借助该特性，用营养肉汤配制呈倍数梯度浓度的抗生素，加入定量菌悬液混匀后直接在靶板上孵育，根据CLSI推荐的参考标准及质谱鉴定判读结果，非敏感菌株有鉴定结果，敏感菌株的鉴定结果为不可信。本发明方法前处理操作简单，能够更快速的直观地给出准确的药敏结果，给临床及时指导合理用药提供一定的参考。

附图说明

图1是本发明实施例1的药敏检测质谱图。

图2是本发明实施例2的药敏检测质谱图。

图3是本发明实施例3的药敏检测质谱图。

图4是本发明实施例4的药敏检测质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明。

本发明所用的化学试剂均为市售产品，本发明所用的营养肉汤为MH肉汤，本发明所用的是基质辅助激光飞行时间质谱仪（例如：Autof ms 1000），本发明所用的超纯水经过高温、高压灭菌。

实施例1 采用本发明方法检测肺炎克雷伯菌（肺炎克雷伯菌来源于某医院肺炎住院患者A，检测前用血琼脂平板培养该患者的肺炎克雷伯菌）对美罗培南的耐药性，具体方法为：

第一步，根据CLSI推荐的肺炎克雷伯菌对美罗培南的分界点值标准，用MH肉汤配制呈倍数梯度的美罗培南稀释液，具体浓度依次为4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，用不含美罗培南的MH肉汤作空白对照样；空白对照样和美罗培南稀释液配制时间可控制在20min以内；

第二步，在用超纯水配制肺炎克雷伯菌的标准菌悬液，配制时向比浊管内加入超纯水，挑取血琼脂平板培养基中的肺炎克雷伯菌菌株于超纯水内，配制浓度为0.5麦氏的标准菌悬液；再用MH肉汤将标准菌悬液稀释至10⁵cfu/mL左右，备用；第二步可控制在5min以内；

第三步，在第一步配制的美罗培南稀释液中分别加入等体积的经MH肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，每个混合液的点样体积6μL，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒内孵育3.5h；

第四步，孵育完成后，用吸水纸吸弃每个样品靶板上点样孔内多余的MH肉汤，室温晾干样品靶板，向每个点样孔内滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并进行结果判读，肺炎克雷伯菌对美罗培南的质谱鉴定结果如图1所示。

结果表明，由于空白对照样不含美罗培南，肺炎克雷伯菌在MH肉汤中生长，因而空白对照样出现质谱峰，有菌株的鉴定结果。当美罗培南的浓度为2μg/mL 和4μg/mL时，均未出现质谱峰，即美罗培南对肺炎克雷伯菌的生长有抑制作用，当美罗培南的浓度为1μg/mL时出现质谱峰，与CLSI推荐的MIC值对应，表明该患者的肺炎克雷伯菌为敏感菌株，该患者可以用美罗培南进行治疗。

实施例2 采用本发明方法检测肺炎克雷伯菌（肺炎克雷伯菌来源于某医院肺炎住院患者B，检测前用血琼脂平板培养该患者的肺炎克雷伯菌）对美罗培南的耐药性，具体方法为：

第一步，根据CLSI推荐的肺炎克雷伯菌对美罗培南的分界点值标准，用MH肉汤配制倍数梯的美罗培南稀释液，具体浓度依次为4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL，用不含美罗培南的MH肉汤作空白对照样；空白对照样和美罗培南稀释液配制时间可控制在20min以内；

第二步，在用超纯水配制肺炎克雷伯菌的标准菌悬液，配制时向比浊管内加入超纯水，挑取血琼脂平板培养基中的肺炎克雷伯菌菌株于超纯水内，配制浓度为0.5麦氏的标准菌悬液，再用MH肉汤将标准菌悬液稀释至约为10⁵cfu/mL，备用；第二步可控制在5min以内；

第三步，在第一步配制的美罗培南稀释液中分别加入等体积的经MH肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，每个混合液的点样体积为6μL，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒内孵育3.5h；

第四步，孵育完成后，用吸水纸吸弃每个样品靶板上点样孔内多余的MH肉汤，室温晾干样品靶板，向每个点样孔内滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并进行结果判读，肺炎克雷伯菌对美罗培南的质谱鉴定结果如图2所示。

结果表明，由于空白对照样不含美罗培南，肺炎克雷伯菌在MH肉汤中生长，因而空白对照样出现质谱峰，有菌株的鉴定结果。当美罗培南的浓度为2μg/mL 和4μg/mL时，均出现质谱峰，表明美罗培南对该患者的肺炎克雷伯菌生长无抑制作用，该肺炎克雷伯菌为非敏感菌株，即患者B已经对美罗培南产生了耐药性。

由实施例1、2可知，本发明检测方法可将肺炎克雷伯菌对美罗培南的耐药性检测缩短在四个小时以内，缩短了患者等待治疗的时间，为临床及时指导合理用药提供参考。

实施例3 采用本发明方法检测金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌来源于某医院肺炎住院患者C，检测前用血琼脂平板培养该患者的金黄色葡萄球菌）对苯唑西林的耐药性，具体方法为：

第一步，根据CLSI推荐的金黄色葡萄球菌对苯唑西林的分界点值（即耐药值、中介值和敏感值）标准，用MH肉汤和苯唑西林进行混合，配制成浓度呈梯度变化的苯唑西林稀释液：4μg/mL、2μg/mL，用不含苯唑西林的MH肉汤作空白对照样；第一步可控制在20min以内；

第二步，用超纯水配制金黄色葡萄球菌的标准菌悬液，配制时向比浊管内加入超纯水，挑取血琼脂平板培养基中的金黄色葡萄球菌菌株于超纯水内，配制浓度为0.5麦氏的标准菌悬液；再用MH肉汤将标准菌悬液稀释至10⁵cfu/mL，备用；第二步可控制在5min以内；

第三步，在第一步配制的苯唑西林稀释液中分别加入等体积的经MH肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，每个混合液的点样体积均为6μL，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒内孵育4.0h；

第四步，孵育完成后，用吸水纸吸弃每个样品靶板上点样孔内多余的MH肉汤，室温晾干样品靶板，向每个点样孔内滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并进行结果判读，金黄色葡萄球菌对苯唑西林的质谱鉴定结果如图3所示。

结果表明，由于空白对照样不含苯唑西林，金黄色葡萄球菌在MH肉汤中生长，因而空白对照样出现质谱峰，有菌株的鉴定结果。当苯唑西林的浓度为4μg/mL时，未出现质谱峰，表明苯唑西林对该患者的金黄色葡萄球菌生长有抑制作用；当苯唑西林的浓度为2μg/mL时，出现质谱峰，质谱鉴定结果与CLSI推荐的MIC值对应，说明该患者的金黄色葡萄球菌为敏感菌株，患者C可以用苯唑西林治疗。

实施例4 采用本发明方法检测金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌来源于某医院肺炎住院患者D，检测前用血琼脂平板培养该患者的金黄色葡萄球菌）对苯唑西林的耐药性，具体方法为：

第一步，根据CLSI推荐的金黄色葡萄球菌对苯唑西林的分界点值（即耐药值、中介值和敏感值）标准，用MH肉汤和苯唑西林进行混合，配制成浓度呈梯度变化的苯唑西林稀释液：4μg/mL、2μg/mL，用不含苯唑西林的MH肉汤作空白对照样；第一步可控制在20min以内；

第二步，用超纯水配制金黄色葡萄球菌的标准菌悬液，配制时向比浊管内加入超纯水，挑取血琼脂平板培养基中的金黄色葡萄球菌菌株于超纯水内，配制浓度为0.5麦氏的标准菌悬液；再用MH肉汤将标准菌悬液稀释至10⁵cfu/mL，备用；第二步可控制在5min以内；

第三步，在第一步配制的苯唑西林稀释液中分别加入等体积的经MH肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，每个混合液的点样体积均为6μL，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒内孵育4.0h；

第四步，孵育完成后，用吸水纸吸弃每个样品靶板上点样孔内多余的MH肉汤，室温晾干样品靶板，向每个点样孔内滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并进行结果判读，金黄色葡萄球菌对苯唑西林的质谱鉴定结果如图4所示。

结果表明，由于空白对照样不含苯唑西林，金黄色葡萄球菌在MH肉汤中生长，因而空白对照样出现质谱峰，有菌株的鉴定结果。当苯唑西林的浓度为4μg/mL时，仍出现质谱峰，表明苯唑西林对该患者的金黄色葡萄球菌生长无抑制作用，此菌株为非敏感菌株，即此菌株已经对苯唑西林产生了耐药性。

由实施例3、4可知，本发明检测方法可将金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性检测缩短在五个小时以内，缩短了患者等待治疗的时间，为临床及时指导合理用药提供参考。

Claims (4)

1.一种快速检测药敏的方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，用营养肉汤和抗菌药物进行混合，配制成浓度呈梯度变化的抗菌药物稀释液；

第二步，用超纯水配制待检测菌株的标准菌悬液，再用营养肉汤稀释后备用；

第三步，在第一步配制的抗菌药物稀释液中分别加入等体积的经营养肉汤稀释的标准菌悬液混匀，得到的混合液按照抗菌药物稀释液的浓度梯度依次在质谱仪样品靶板上点样，点样完成后将质谱仪样品靶板放入孵育湿盒孵育2.0～5.0h；

第四步，孵育完成后，弃肉汤，晾干，滴加质谱鉴定前处理试剂，结晶后用质谱仪进行微生物鉴定并判读结果。

2.根据权利要求1所述的快速检测药敏的方法，其特征在于：所述第一步中抗菌药物稀释液的浓度梯度与所述第二步中待检测菌株的耐药、中介和敏感MIC值相对应；第一步中抗菌药物稀释液的浓度梯度数量≥2个。

3.根据权利要求1所述的快速检测药敏的方法，其特征在于：所述第二步中标准菌悬液的浓度为0.4～4.0麦氏单位。

4.根据权利要求1所述的快速检测药敏的方法，其特征在于：所述第三步中每个混合液的点样体积为1μL～10μ。