ES2324755B1 - Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida. - Google Patents
Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido de la proteína gp120 capaz de
inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del
virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en una secuencia
con al menos un 70% de homología con la región
C3-C5 de la proteína gp120 del virus.
Description
Polipéptido de la proteína gp120 capaz de
inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
La presente invención se refiere a un
polipéptido correspondiente a la región C3-C5 de la
proteína gp120 del virus del SIDA (el VIH) y al polinucleótido
codificante por dicho polipéptido, capaz de ofrecer un efecto
protector a las células frente a la infección por el VIH.
Las estrategias más comúnmente empleadas para
combatir el virus del SIDA (el VIH) fueron desarrolladas a
principios de los noventa. En general, estaban relacionadas con la
capacidad inhibitoria de al menos tres diferentes moléculas que
actuaban sobre una o dos enzimas vitales para el virus:
retrotranscriptasas y proteasas. La combinación de fármacos basados
en estas moléculas, conocida como terapia
anti-retroviral altamente activa (HAART), ha
mejorado el pronóstico de pacientes con SIDA. Sin embargo, la HAART
no es capaz de erradicar al virus, que se mantiene latente en el
interior celular, por lo que los distintos fármacos deben
administrarse continuamente. Este hecho, junto con los efectos
secundarios de dichos fármacos y la aparición de cepas resistentes
del virus hace necesario buscar alternativas a este tratamiento.
A finales de los noventa, se ideó como
tratamiento potencial para los pacientes de SIDA la generación de
células capaces de expresar genes con actividad antiviral (la
denominada inmunización intracelular). Así, se demostró por ejemplo
que un mutante dominante del gen gag (que codifica por una
proteína precursora de distintas proteínas del VIH) tenía actividad
antiviral (Trono, D., et al., Cell, 1989. 59(1):
113-20). Se han descrito otras estrategias basadas
en este enfoque, para interferir directamente en la replicación del
virus o eliminar las células infectadas. Además, la terapia génica
frente a VIH ha entrado en fase clínica empleando, entre otros, el
gen rev (la proteína Rev regula la expresión de genes que
codifican por proteínas estructurales del virus) o el gen
tat (la proteína tat es un
trans-activador de la transcripción). Estas y otras
terapias génicas han sido revisadas por Fanning, G. et al., J
Gene Med, 2003. 5(8): 645-53.
Diversas líneas en la lucha contra el SIDA se
han enfocado al bloqueo de las primeras fases del ciclo vital del
VIH, que comienza cuando la glicoproteína gp120 de su envuelta
reconoce al receptor CD4 de la superficie de membrana de algunos
tipos celulares. Para el progreso de la infección por VIH la diana
principal son los denominados linfocitos CD4+, aquellos que
presentan dicho receptor. En este caso, gp120 reconoce además a los
co-receptores CCR5 y CXCR4. La glicoproteína gp120
proviene del procesamiento del precursor g160, que es sintetizado
en el retículo endoplasmático de las células infectadas y que, por
la acción de proteasas del aparato de Golgi, produce tanto gp120
como gp41. Estas glicoproteínas de la envuelta del VIH se organizan
formando trímeros, de forma que cada complejo de la envuelta del
virus contiene tres unidades de la gp120 y otras tres de gp41. Una
vez que la gp120 interacciona con el receptor CD4, se induce un
cambio conformacional en gp41, que inserta una región hidrofóbica
en la membrana de la célula y permite fusionar la partícula viral
con la membrana celular para que su carga genética pase al interior
celular.
Tanto gp160, gp120, como gp41, han sido
empleadas para combatir la infección por VIH mediante células
transformadas (WO89/05349, WO94/22477) y anticuerpos contra el
virus (WO03/106496). En ciertos casos las estrategias se han
concentrado en inhibir la entrada del virus impidiendo su fusión con
la membrana celular, por ejemplo desarrollando moléculas que
interfieren en el cambio conformacional de gp41 (Kilby, J.M., et
al., Nat Med, 1998. 4(11): 1302-7). En
otros, el enfoque se ha centrado en impedir el procesado del
precursor gp160, pues éste es un paso crucial para la formación de
las partículas virales en las células infectadas.
Dentro de estas últimas estrategias, los
inventores habían diseñado anteriormente un vector retroviral que
contenía en su secuencia la quimera denominada CD4\varepsilon10.
Esta era una construcción génica que reunía la secuencia de CD4 y
la correspondiente a 10 aminoácidos de la señal de retención de
CD3\varepsilon en el retículo endoplasmático, siendo
CD3\varepsilon una de las cadenas peptídicas que forman parte del
complejo receptor de los linfocitos T (Mallabiabarrena, A. et
al., Nature, 1992. 357(6379): 593-6). El
péptido originado por expresión de la quimera CD4\varepsilon10 se
retenía en dicho retículo y este efecto provocaba la inhibición de
la replicación de VIH-1 al interaccionar con la
proteína viral gp160, reteniéndola en el retículo endoplasmático y
evitando su exportación al aparato de Golgi y por tanto su
procesamiento en gp120 y gp41 (San José, E. et al., Hum.
Gene. Ther., 1998. 9(9): 1345-57). De esta
manera, la expresión estable del gen CD4\varepsilon10 en las
células T transducidas las protegió de los efectos patogénicos del
virus. Además, la aplicación de esta estrategia a linfoblastos T de
pacientes seropositivos utilizando como vector para la transducción
partículas derivadas del virus Mo-MLV inhibió la
depleción de las poblaciones de linfocitos CD4+. Sin embargo estos
estudios no pudieron efectuarse en condiciones óptimas, pues el
vector utilizado no permitía un seguimiento del progreso de la
transducción y por otra parte el título viral de los sobrenadantes
de los cultivos de células transducidas (relacionado por tanto con
el número de vectores virales que se replican con éxito y son
capaces de extender la transducción) era bajo.
Los autores de la presente invención han
descubierto que, sorprendentemente, la transducción genética
estable de linfocitos T mediante vectores virales que contienen una
secuencia quimera o polinucleótido quimérico de ADN, denominada
CD4\varepsilon15, que codifica para el receptor de membrana CD4 y
para una señal de retención en el retículo endoplasmático de la
cadena CD3\varepsilon del complejo receptor de membrana de los
linfocitos, no sólo protege a estos linfocitos transducidos de los
efectos de la infección por VIH, sino que al mismo tiempo actúa
produciendo un factor antiviral que protege a otros linfocitos T no
transducidos.
Los inventores han utilizado vectores virales
bi-cistrónicos, logrando en los linfocitos T
transducidos la co-expresión de la quimera
CD4\varepsilon15 con la de la proteína fluorescente verde
mejorada (EGFP), debido a la inclusión en el vector de una
secuencia IRES (del inglés "Internal Ribosome Entry
Site"), que permite ligar la expresión de la quimera al de
la EGFP. La expresión de EGFP en células transducidas permite el
seguimiento de su número mediante citometría de flujo y
consecuentemente ha facilitado la demostración de que la expresión
de la quimera CD4\varepsilon15 en un pequeño porcentaje de los
linfocitos T de un cultivo celular es suficiente para proteger
frente a la infección por VIH tanto a las células transducidas como
a las no transducidas.
El efecto protector de las propias células
transducidas se logra en parte porque la expresión de
CD4\varepsilon15 previene la maduración en la célula infectada
por VIH de la proteína precursora gp160, necesaria para originar las
proteínas gp120 y gp41 de la envuelta del virus; por lo que aunque
el gen del VIH que codifica por gp160 se expresa dentro de la
célula y se producen partículas del VIH éstas no son
infectivas.
Por su parte, el efecto protector sobre las
otras células no transducidas se debería a que la expresión en las
transducidas de la quimera conduce a la síntesis de un fragmento de
gp120, soluble, y que es secretado al medio. Este factor competiría
con la gp120 de la envuelta de las partículas de VIH en su unión al
receptor CD4, impidiendo la unión del virus a dichos receptores y
por tanto el desarrollo de su ciclo vital.
Se ha aceptado generalmente que, para que este
tipo de terapia sea eficaz, es necesario que las células a proteger
estén transducidas por los vectores que contienen el gen
"protector", por lo que es particularmente importante lograr
vectores con eficacia transductora cercana al 100%. La presente
invención ha mostrado inesperadamente que aunque sólo un porcentaje
minoritario (del 10% o menor) de las células de un cultivo estén
transducidas con la quimera CD4\varepsilon15, es posible lograr
una inhibición de la replicación del virus VIH de más de 100.000
veces en comparación con cultivos celulares en los que los vectores
virales no contenían la quimera.
Los análisis posteriores indicaban que el efecto
protector de las células transducidas sobre las no transducidas era
mediado por un factor antiviral soluble, liberado al medio por las
primeras. Asimismo, se comprobó que dicho factor sólo se liberaba
cuando las células transducidas eran infectadas por VIH. Este
hecho, unido a que el factor antiviral se liberaba por los
linfocitos T CD4+ no activados (la activación de los linfocitos T
se produce tras el reconocimiento de los antígenos por parte del
complejo receptor), y a que el efecto protector requería la
expresión de CD4\varepsilon15, indicaba que este factor es
diferente a otros factores antivirales tales como CAF (producido por
linfocitos CD8), interferones, quimioquinas, y al factor producido
por linfocitos CD4+ de pacientes seropositivos asintomáticos y en
los que la enfermedad no progresa.
La producción de un factor soluble secretado por
un porcentaje minoritario de células transducidas que es capaz de
proteger a las no transducidas presenta muchas ventajas sobre otros
métodos de terapia génica. Por tanto, los autores profundizaron en
la caracterización de dicho factor, demostrando que se trata de un
polipéptido con un peso molecular de alrededor de 30 KDa, lo que ya
indicaba que no se correspondía con el polipéptido codificado por la
quimera CD4\varepsilon15, que tiene 55 kDa.
La secuenciación parcial de este factor mostró
una identidad con una región de 7 aminoácidos de gp120, y se
comprobó asimismo que hibridaba con anticuerpos específicos frente
a las regiones constantes C3 y C4 de gp120, pero no con anticuerpos
frente a la región constante C1 (en gp120 se han definido 5
dominios cuya secuencia es prácticamente constante, de las que C2,
C3, C4, C5 están implicadas en la unión de gp120 al receptor CD4, y
5 regiones cuya secuencia es muy variable entre las distintas cepas
de VIH, de las que sólo V5 está implicada en dicha unión). Teniendo
en cuenta la posición en gp120 de la secuencia de 7 aminoácidos
idéntica a la secuencia parcial del factor, los inventores
consideraron probable que el mismo fuera un fragmento
correspondiente al tercio C-terminal de gp120.
Se realizaron seguidamente diversas
construcciones génicas para comprobar qué regiones de gp120 eran
necesarias para lograr el efecto protector
anti-VIH. Se pudo definir así que el factor
antiviral objeto de la presente invención corresponde a un
fragmento del extremo C-terminal de gp120 cuya
secuencia polinucleotídica es la SEQ ID NO:2.
Así, un primer aspecto de la invención se
refiere a un polipéptido (factor antiviral) capaz de inhibir el
ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en
una secuencia con al menos un 70% de homología con la región
definida por los dominios C3, V4, C4, V5 y C5 (en adelante región
C3-C5) de la proteína gp120 del virus. En
realizaciones sucesivamente más preferidas de este aspecto de la
invención el polipéptido tiene una homología de al menos el 80, 85,
90, 95, 96, 97, 98, 99% con la región C3-C5 de la
proteína gp120. En una realización aun más preferida de este aspecto
de la invención el polipéptido tiene la SEQ ID NO:1. En adelante
este polipéptido también será denominado como factor antiviral o
"polipéptido de la invención".
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un polinucleótido capaz de codificar el polipéptido de la
invención. En una realización preferida dicho polinucleótido tiene
la SEQ ID NO:2. Debido a la degeneración del código genético, por
la que cada aminoácido puede ser codificado por distintos codones
nucleotídicos, polinucleótidos distintos a SEQ ID NO:2 pueden dar
lugar al péptido de la invención. Consecuentemente, realizaciones
también preferidas de la invención comprenden polinucleótidos con
al menos un 50% de homología con la SEQ ID NO:2 y, en realizaciones
sucesivamente más preferidas, con al menos el 60, 70, 80, 85, 90,
95, 96, 97, 98, 99% de homología con la SEQ ID NO:2. En adelante
este polinucleótido también será denominado como
"polinucleótido de la invención".
Un tercer aspecto de la invención se refiere a
un vector que comprende al polinucleótido de la invención y además,
preferentemente, comprende al menos una secuencia control que
permita la expresión de dicho polinucleótido. En adelante este
vector será denominado como "vector de la
invención".
Un cuarto aspecto de la invención se relaciona
con una célula transfectada preferentemente adulta y más
preferentemente no germinal, capaz de producir el polipéptido de la
invención, caracterizada porque comprende al polinucleótido de la
invención o al vector de la invención. En una realización más
preferida de este aspecto de la invención, la célula transfectada es
una célula madre hematopoyética, preferentemente progenitora de
células linfáticas y, más preferentemente, de linfocitos T. En una
realización todavía más preferida las mencionadas células madre son
de origen humano. En adelante, estas célula(s) será(n)
denominada(s) como "célula(s)
transfectada(s) de la invención".
Un quinto aspecto de la invención se relaciona
con una composición farmacéutica para la elaboración de un
medicamento que comprende a cualquiera de los siguientes elementos
de la invención: i) el polipéptido de la invención, ii) el
polinucleótido de la invención, o iii) la célula transfectada de la
invención. En una realización preferida la composición farmacéutica
está dirigida al tratamiento o prevención frente al virus del SIDA
(VIH). En adelante, esta composición farmacéutica será denominada
como "composición farmacéutica de la invención".
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un
método de tratamiento o prevención contra el virus del SIDA que
comprende:
1) Transfectar células hematopoyéticas,
progenitoras de células linfáticas, o linfocitos T con el
polinucleótido de la invención o con el vector de la invención.
2) Injertar en un individuo diana una cantidad
terapéuticamente efectiva de células hematopoyéticas, progenitoras
de células linfáticas, o linfocitos T obtenidos en el paso
anterior.
En una realización preferida del método de
tratamiento o prevención, las células transfectadas provienen (i)
de un individuo sano histocompatible con el individuo diana y, más
preferentemente, (ii) del propio individuo diana, siendo éstas
células preferentemente embrionarias y más preferentemente
provenientes de cordón umbilical.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a
un método para la obtención o identificación de polipéptidos
capaces de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, donde la
transfección de células con el polinucleótido que codifica para
dicho polipéptido protege tanto a células transfectadas como no
transfectadas, que comprende:
- 1.
- transfectar células hematopoyéticas, preferentemente linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos T, con un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para el receptor CD4, secuencias con al menos un 60% de homología con CD4, preferentemente al menos 70, 80, 90, 95 o 98% y una segunda que codifica para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al menos 12 ó 13 amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15 (CD4\varepsilon15),
- 2.
- infectar las células de la etapa (1) con al menos una cepa del virus del SIDA, y
- 3.
- aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, preferentemente el polipéptido de la invención, de la fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de la etapa (2).
En una realización preferida de este aspecto de
la invención la señal de retención es un fragmento de
CD3\varepsilon, y en una realización aun más preferida el
fragmento tiene la secuencia la SEQ ID NO:3, variantes alélicas de
ésta SEQ ID NO:3, ó secuencias con al menos un 80% de homología con
SEQ ID NO:3, preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 0 95%.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a
un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico
que comprende la secuencia de CD4 y una secuencia que codifica para
una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 ó
13 aminoácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más
preferentemente de 15. En una realización preferida la señal de
retención es un fragmento de CD3\varepsilon, preferentemente dicho
fragmento tiene la SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un 80% de
homología con SEQ ID NO:3, y preferentemente al menos el 85, 90,
92, 93 ó 95%.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a
la transfección de células hematopoyéticas, preferentemente
linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos T, con un
polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico que
comprende al receptor CD4 y una secuencia que codifica para una
señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 o 13
amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más
preferentemente de 15. En una realización preferida, la señal de
retención es un fragmento de CD3\varepsilon, y preferentemente
dicho fragmento tiene la SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un
80% de homología con SEQ ID NO:3, más preferentemente al menos el
85, 90, 92, 93 ó 95%.
Un décimo aspecto de la invención se refiere al
uso del polipéptido, polinucleótido, vector o célula transfectada
de la invención para su uso como medicamento, preferentemente para
la elaboración de una vacuna frente al virus del SIDA.
El término "polinucleótido", tal y como se
emplea en la descripción, se refiere a una forma polimérica de
nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos. Este término está referido a la estructura
primaria de la molécula, incluyendo ADN y ARN tanto de cadena
sencilla como de doble.
El término "replicón" hace referencia en la
descripción a cualquier elemento génico, como por ejemplo un
plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta
como una unidad autónoma de replicación, esto es, que es capaz de
replicarse bajo su propio control, aunque dicha replicación pueda
ser inducida, inhibida y en definitiva regulada por agentes externos
al propio replicón. El término "vector" hace referencia en
esta descripción a un replicón al que se ha unido otro segmento
polinucleotidico, para realizar la replicación o expresión del
segmento unido.
El término "secuencias control" se refiere
en la descripción a secuencias de polinucleótidos que son
necesarias para la expresión de las secuencias codificantes a las
que están ligadas, como por ejemplo a la región
C3-C5. La naturaleza de las secuencias control varía
en función del organismo huésped: en procariotas éstas generalmente
comprenden un promotor, un sitio de unión a ribosoma y
terminadores; en eucariotas, generalmente comprenden promotores,
terminadores, un sitio de unión a ribosoma e inductores. Se
pretende que el término "secuencias control" incluya, como
mínimo, todos los elementos necesarios para la expresión de las
secuencias codificadas, y también pueda incluir componentes
adicionales, tales como las secuencias líder.
El término "región C3-C5"
se refiere en la descripción al fragmento de la secuencia
polipeptídica de la proteína gp120 del virus VIH que comprende los
dominios comúnmente definidos en el mismo como C3, V4, C4, V5 y C5,
siendo los dominios C aquellos cuya secuencia se encuentra muy
conservada al comparar distintas cepas del virus, y los dominios V,
aquellos cuya secuencia varía mucho al comparar distintas cepas del
virus. Igualmente al referirse a la secuencia polinucleotídica en
esta descripción el término "región C3-C5"
significa el fragmento de dicha secuencia que codifica por la
secuencia polipeptídica que comprende los dominios C3, V4, C4, V5 y
C5. Preferentemente, esta secuencia abarca desde la posición 328
hasta la 516 de la glicoproteína gp120 del virus del SIDA.
El término "transfección", tal y como es
empleado a lo largo de la descripción, se refiere a la acción de
introducir material genético foráneo en una célula. Esta
transfección podrá ser llevada a cabo por métodos sobradamente
conocidos en el estado de la técnica, tales como la
electroporación, transducción, microinyección, pistola de genes,
etc.
El término "transducción", se refiere a la
acción de introducir material genético foráneo en una célula
mediante un vector derivado de un virus, siendo por tanto un tipo
específico de transfección.
A lo largo de la descripción y de las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros
objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán
en parte de la descripción y en parte de la práctica de la
invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo
de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la
presente invención.
Figura
1
La figura 1A representa esquemáticamente los
vectores retrovirales pCIE15 y pD15, conteniendo la quimera
CD4\varepsilon15. Dicha quimera se ha representado comprendiendo
los dominios extracelular (EC), transmembrana (TM) e intracelular
(IC) del receptor CD4 de los linfocitos T, así como los 15
aminoácidos responsables de la retención en el retículo
endoplasmático de la cadena CD3\varepsilon del complejo
CD3/receptor de células T (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:3).
La figura 1B muestra cultivos celulares de MT2
(una línea de células T muy sensible a la infección con VIH) y de
la línea celular C10 (obtenida por transducción de MT2 con el
vector pCIEI5), tras ser infectados con la cepa NL4.3 del VIH.
Mediante contraste de fase, pudo observarse que a las 48 horas de
la infección con el VIH todas las células MT2 habían formado
sincitios, mientras las células C10 no habían formado ninguno.
La figura 1C izquierda muestra como la expresión
de CD4\varepsilon15 inhibía la formación de partículas infectivas
en la primera ronda de replicación del VIH. Así, en los cultivos de
C10 la dosis infectante del 50% de los cultivos celulares,
TCID_{50}/ml (del inglés "Tissue Culture Infective
Dose") fue menos de un tercio de la observada en cultivos de
MT2, aunque la liberación de la proteína p24 de la cápside del VIH
fuera similar entre ambos cultivos (figura IC derecha). A las 48
horas, cuando se había producido más de una ronda de replicación del
VIH, el efecto de la expresión de la quimera CD4\varepsilon15 era
más potente, de manera que el valor de TCID_{50}/ml de los
sobrenadantes de los cultivos de las células transducidas (C10) era
60 veces menor al de los cultivos de células no transducidas (MT2),
y la liberación de p24 era seis veces menor en los cultivos de
células C10 que en los de MT2 (figura 1C derecha).
La figura 1D muestra imágenes de microscopía
electrónica que confirmaron que, tras un primer ciclo de
replicación, la formación de partículas virales está inhibida por
la expresión de la quimera CD4\varepsilon15: a las 48 horas tras
la infección con VIH las células MT2 mostraron gran cantidad de
partículas virales (puntos y círculos oscuros pequeños), mientras
que no pudo detectarse ninguno en las células C10.
La figura 1E muestra un "western blot" de
las proteínas totales de células MT2 y de distintos clones
provenientes de la transducción de MT2 (C10, Clon 2 y G11),
infectadas a alta multiplicidad de infección con la cepa NL4.3 de
VIH. A las 48 horas de dicha infección se lisaron alícuotas de los
cultivos celulares y los lisados se hibridaron con un anticuerpo
policlonal frente a gp160 y gp120. Pudo observarse que todas las
células sintetizaban el precursor gp160, pero gp120 sólo se
encontraba en las células no transducidas (MT2), indicando que en
las células transducidas la maduración de gp160 para originar gp120
se había bloqueado.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
La figura 2A muestra la concentración de p24 de
la cápside del VIH secretada al medio de cultivo, expresado en pg
de proteína por ml, para células MT2 (barras negras) y C10 (barras
blancas) infectadas con diferentes cepas de VIH (NL4.3, ME46, CLB23
y VISH 89.6).
La figura 2B muestra la progresión de la
secreción de p24 (pg/ml del medio de cultivo), en células PM1,
MOLT-4, MT2 y Jurkat infectadas con la cepa NL4.3,
para excluir el posible efecto clonal de la célula infectada sobre
la replicación del virus. En cada cultivo el porcentaje de células
transducidas con la quimera CD4\varepsilon15, determinado
mediante citometría de flujo fue distinto, según se muestra en la
figura.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Las figuras 3A y 3B muestran el efecto de la
proporción de células T transducidas con la quimera
CD4\varepsilon15 sobre la infección viral.
La figura 3A muestra los resultados del
seguimiento a distintos días tras la infección con el aislado
clínico 1936 del VIH (Días pi.) de mezclas de linfocitos T
transducidos con pCIE15 y no transducidos, indicándose en dicha
figura el de los transducidos en cada mezcla. El seguimiento se
realizó midiendo la concentración (pg/ml) de la proteína p24 del
VIH secretada al medio y el porcentaje de linfocitos CD4 respecto
al total de linfocitos CD4 y CD8. Una proporción de un 30% de
linfocitos transducidos es suficiente para inhibir en el cultivo el
progreso de la infección: a los 7 días la concentración de p24 en el
medio era 25 veces menor a la observada en cultivos sin linfocitos
transducidos (figura 3A izquierda) y el % de linfocitos CD4 apenas
había disminuido (figura 3A derecha).
La figura 3B muestra los resultados del
seguimiento a distintos días tras la infección con la cepa NI4.3
del VIH (Días p.i.) de mezclas de cultivos celulares de C10
(transducidos) y MT2, indicándose en dicha figura la proporción de
C10 en cada mezcla. El seguimiento se realizó midiendo la
concentración (pg/ml) de la proteína p24 del VIH secretada al medio
y el número de copias del ARN del VIH por célula. Los resultados
demostraron que la transducción de un 10% (\ding{117}) de las
células de un cultivo es suficiente para inhibir completamente el
progreso de la infección por el
VIH.
VIH.
La figura 3C muestra esquemáticamente un
experimento para demostrar que no es necesario el contacto
célula-célula para lograr el efecto protector de
las células transducidas sobre las no transducidas. Se crecieron
cultivos de células C10 o MT2 en pares de pocillos separados por
membranas, que permiten la difusión a su través de macromoléculas
pero no de células. Tras infectar cada cultivo con la cepa NL4.3 se
evaluó el progreso de la infección determinando la secreción de p24
(ng de proteína) en cada pocillo, así como la formación de
sincitios en las células (-, no detectados; +, detectables; ++,
abundantes; +++, se observa efecto citopático extenso). Se observó
que cuando el pocillo superior contenía el clon C10 (transducido) se
inhibía también la replicación de VIH en el cultivo de MT2 del
pocillo inferior, confirmando que no es necesario el contacto
célula a célula.
\newpage
Figura
4
La figura 4A muestra el resultado de la
separación electroforética de diversas fracciones de un cultivo de
células T transducidas con CD4\varepsilon15 e infectadas con
VIH-1 a alta multiplicidad de infección. Se señala
con una flecha la proteína de aproximadamente 30 KDa que sólo se
observó en la fracción con efecto protector frente a la infección
por VIH.
La figura 4B muestra un esquema de la proteína
gp160, indicándose las proteínas gp120 y gp41 que se originan por
rotura proteolítica en la zona indicada por la flecha. Se señala la
posición del heptapéptido SIMI, así como las zonas de interacción
con CD4 (*) y las de glicosilación (Y). Además, en esta misma
figura se muestran de manera esquemática los fragmentos I, II, III,
IV utilizados para demostrar la suficiencia de la expresión de la
región C3-C5 de gp120 para lograr el efecto
protector anti-VIH.
La figura 4C muestra el resultado de un ensayo
de protección de cultivos de células MT2 frente a la infección por
VIH, en el que se evaluó la progresión de la infección por VIH,
según la concentración (pg/ml) de la proteína p24 de su cápside
secretada al medio de cultivo por dichas células. El ensayo se
realizó añadiendo los sobrenadantes de distintos cultivos de
células COS transducidas con los fragmentos I, II, III, IV de gp120
(figura 4B), observándose el mayor efecto protector para los
sobrenadantes de células COS transducidas con el fragmento III.
La figura 4D muestra la concentración (pg/ml) de
p24 en el medio de cultivo de células T Jurkat transducidas con el
fragmento III de gp120 e infectadas con VIH a dos multiplicidades
de infección altas (0,1 y 0,5 partículas infecciosas/célula). El
progreso de la infección se inhibió marcadamente a los 5 días de la
misma en las células transducidas con el fragmento III.
Es sabido que la inhibición del corte o
maduración de los precursores de proteínas de la envuelta del virus
del SIDA da lugar a que dichas proteínas sean no funcionales, esto
es, sin capacidad para inducir la fusión a membrana celular de las
partículas víricas. A partir de este conocimiento, se desarrollaron
experimentos para interferir con el procesado proteolítico de dichos
precursores, mediante la creación de una secuencia de ADN quimera
(CD4\varepsilon15) que contenía la secuencia que codifica por el
receptor de membrana CD4 y por una señal de retención del receptor
de membrana CD3\varepsilon en el retículo endoplasmático, así
como secuencias reguladoras de la expresión). La transducción
mediante vectores virales que contienen dicha quimera produjo una
gran reducción en la liberación de partículas víricas infectivas y
la no aparición de éstas en el interior de las células infectadas,
observable por microscopía electrónica. Por otro lado y después de
un ciclo de infección, las células transducidas con
CD4\varepsilon15 y posteriormente infectadas por VIH liberaban
normalmente la proteína p24 de la envuelta del VIH (esta proteína se
usa como antígeno para la detección del virus por el método ELISA)
y sintetizaban gp160.
Este hecho confirmó la hipótesis de que
CD4\varepsilon15 no inhibe la expresión de los genes del VIH pero
si la infección de nuevas células, al bloquear el transporte y
maduración de las glicoproteínas de la envuelta del virus. De este
modo, se demuestra que la presencia de CD4\varepsilon15 previene
la formación de partículas infectivas en las células infectadas por
VIH y por tanto la extensión de la infección a otras células.
Asimismo, se encontró que la transducción con CD4\varepsilon15
tiene un efecto inhibidor de la replicación de VIH de amplio
espectro, puesto que impide la replicación de diferentes cepas de
VIH-1, VIH-2 y VISH (VISH es un
híbrido de laboratorio entre el virus de la inmunodeficiencia en
simios
- VIS - y el de la inmunodeficiencia humana, VIH), lo que incide en su potencial para la terapia génica.
- VIS - y el de la inmunodeficiencia humana, VIH), lo que incide en su potencial para la terapia génica.
Sin embargo, lo que resultó mucho más
interesante fue descubrir que la expresión de CD4\varepsilon15 en
células transducidas protegía también a las no transducidas. Así,
se comprobó que el efecto inhibitorio sobre la replicación del
virus en un cultivo celular se lograba incluso cuando sólo un 10% de
las células había sido transducido con la secuencia
CD4\varepsilon15. Este hallazgo es particularmente relevante
porque una de las barreras más importantes para la aplicación de
este tipo de terapias es la baja proporción de células
transfectadas con el gen protector que es posible lograr. Por el
contrario, la presente invención confiere un efecto protector tanto
en células transducidas como en no transducidas. Esta observación,
junto al hecho de que los linfocitos T conservaron normalmente su
función, hizo pensar en la presencia de un factor protector
soluble, secretado por las células transducidas, capaz de
trasladarse en el medio de cultivo y de interaccionar con las
células no transducidas para conferirles protección frente a la
infección. Estas características harían que la presente invención
pudiera emplearse como terapia génica eficaz en la lucha contra el
SIDA.
Hasta la fecha se habían descrito otros factores
anti-VIH, tales como CAF (del inglés "CD8
Antiviral Factor"), producido por linfocitos T CD8+
previamente activados (Barker, E., J Infect Dis, 1999.
179(3): S485-8.35) y que se ha catalogado
dentro de las defensinas, una familia de péptidos de bajo peso
molecular sin relación con otros factores antivirales. También se
había descrito el factor antiviral producido por células T CD4+ de
los pacientes seropositivos asintomáticos en los que la enfermedad
no progresa, o el producido por células T activadas por cepas de
VIH atenuadas, tales como las cepas defectivas en el gen
vif.
Ya antes de su caracterización, era evidente que
el factor producido por las células transducidas con
CD4\varepsilon15 no correspondía a ningún tipo de factor
antiviral descrito anteriormente: al ser producido por linfocitos T
CD4+ no podía tratarse del CAF, pues éste proviene de los
linfocitos T CD8+, y al ser expresado únicamente por células
transducidas con CD4\varepsilon15 difícilmente podía tratarse de
un interferón o una quimioquina. Asimismo, el hecho de que su
liberación al medio por los linfocitos T fuese independiente de la
estimulación de éstos, sugería que el factor no es una
citoquina.
citoquina.
Estas circunstancias, unidas al hecho de que el
factor se producía sólo cuando las células T transducidas eran
infectadas con VIH, hicieron suponer que debía ser inducido por el
virus o incluso expresado por el genoma de éste. Por otro lado, al
ser su liberación al medio de cultivo dependiente a la vez de la
expresión de CD4\varepsilon15 y de la infección por VIH, parecía
probable que CD4\varepsilon15 produjese alguna modificación en el
procesado o ensamblaje de los productos génicos del virus, y que
esta modificación resultase en la secreción del factor protector
codificado por el genoma de la célula infectada o por el del propio
virus.
Mediante el análisis de fracciones celulares de
linfocitos transducidos con CD4\varepsilon15 e infectados con VIH
se determinó que el factor soluble tenía un peso molecular de 30
KDa, y que presentaba homología con la proteína gp120. La expresión
de diferentes fragmentos del extremo C-terminal de
gp120 llevó a la conclusión de que el efecto protector conferido
por el factor se basaba en su homología con la región
C3-C5 de gp120 (figura 4C).
A continuación se detallan los materiales y
métodos que fueron empleados para el desarrollo de la presente
invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no
limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo
de manifiesto tanto la capacidad del factor para inhibir el ciclo
vital del virus del SIDA como los resultados de su
caracterización.
\vskip1.000000\baselineskip
Vectores retrovirales. La quimera
CD4\varepsilon15 se clonó en dos vectores retrovirales (figura
IA). El denominado pCIE 15 deriva del
pLZR-CMV-gfp que a su vez deriva
del virus de la leucemia murina de Moloney, Mo-MLV
(Yang, S., et al., Hum Gene Ther. 1999. 10(1):
123-32) y fue suministrado por el Dr. Antonio
Bernad del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, Madrid. El
vector pCIE15 incluye un promotor híbrido 5' LTR/CMV (las secuencias
LTR - del inglés "Long Terminal Repeat" - facilitan la
inserción de la secuencia en el genoma de la célula huésped y CMV
designa a un promotor del citomegalovirus), un sitio de clonación
múltiple donde se clona CD4\varepsilon15, un sitio IRES (del
inglés "Internal Ribosome Entry Site") del virus de la
encefalomiocarditis (Abad, J.L., et al., J Gene Med, 2002.
4(1): 27-37) para que la expresión de
CD4\varepsilon15 vaya ligada a la de la siguiente secuencia, que
codifica por la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP),
facilitando así el seguimiento de las células que expresan dicha
quimera mediante citometría de flujo, y una secuencia LTR en su
extremo 3'. El correspondiente vector sin la quimera se denominó
pCIE.
Por otro lado, el vector pD15 se generó a partir
del M387 (Schambach, A., et al., Mol Ther, 2000.
2(5): 435-45), un vector que contiene los
5'LTR y 3'LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo. Además de
por dichos LTR, la diferencia respecto a pCIE15 fue la inclusión de
un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis
del castor al inicio del 3'LTR.
Para la proliferación de ambos vectores se
cultivaron células Phoenix-Amph al 80% de
confluencia en placas de 10 cm, se transdujeron por el método de
precipitación en fosfato cálcico empleando 16 \mug de vector
retroviral, 2,25 \mug del plásmido pMD.G que codifica para la
proteína G del virus de la estomatitis vesicular, y 16 \mug del
plásmido pNGVL3-MLV que contiene el gen gag y
un grupo de genes del virus de la leucemia murina (MLV). A las 24
horas tras dicha transducción, se reemplazó el medio y a las 48
horas se filtró el sobrenadante del cultivo a través de una
membrana con un poro de 0,45 \mum para obtener sobrenadantes con
alta concentración de dichos vectores.
Células. Las líneas celulares de
linfocitos CD4+ empleadas en los ensayos de infección (MT2, Jurkat,
PM1 y MOLT-4) se obtuvieron de la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas células fueron mantenidas
hasta su uso en suero fetal bobino inactivado. Las células
mononucleares periféricas para la obtención de linfocitos T fueron
aisladas a partir de donantes sanos empleando
Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences), resuspendidas
con fitohemaglutinina P (1 \mug/ml) e
interleuquina-2 (IL-2) recombinante
(100 U/ml) a 37ºC durante 48-72 horas, propagándose
posteriormente en medio de cultivo completo en presencia de 100
U/ml de IL-2. Para la producción de los vectores
virales se utilizó la línea celular Phoenix^{TM}, capaz de generar
retrovirus que no requieren las partículas "helper"
para su proliferación, suministrada por la ATCC (referencia
SD-3514).
Anticuerpos. El anticuerpo policlonal
frente a gp160, cedido por el Dr. Gustavo del Real (Centro Nacional
de Biotecnología del CSIC) se generó utilizando como antígeno toda
la proteína. El anticuerpo frente al receptor CD4 humano acoplado a
ficoeritrina se adquirió a Pharmingen.
Cepas e infección de VIH. La cepa NL4.3
del virus del SIDA (Adachi, A., et al., J Virol, 1986.
59(2): 284-91) fue cedida por el Dr. José
Alcamí (Instituto de Salud Carlos III, Madrid). La cepa 1936 es una
cepa clínica crecida en linfocitos T primarios. La cepa ME46 fue
obtenida a partir del "AIDS Resarch and Reference Reagent
Program", al igual que la cepa CBL23 de
VIH-2. La cepa quimérica VISH 89.6 fue cedida por
el Dr. Gerrit Koopman (Biomedical Primate Research Centre, Países
Bajos). Para la proliferación de las cepas de laboratorio se
utilizaron células MT2, determinando el título viral mediante el
método de dilución del punto final, tal y como se describe en
Adachi, A., et al., J Virol, 1986. 59(2):
284-91 y en San José, et al. Virology, 1997.
239(2): 303-14. Las preparaciones virales
obtenidas se añadieron a los distintos cultivos celulares durante 2
horas a 37ºC a las diferentes multiplicidades de infección tal y
como se indica en cada experimento. Las células fueron entonces
lavadas y cultivadas en nuevo medio. La replicación viral se
determinó según la secreción de la proteína p24 de la cápside del
VIH medida en el sobrenadante de los cultivos mediante
inmunoensayo. La carga viral se determinó también por el número de
moléculas del ARN codificado por el gen gag del VIH medida
por PCR reversa (RT-PCR), empleando los
oligonucleótidos SK431 y SK462 como cebadores de la reacción de PCR
(Amplicor HIV-1, Roche Diagnostics Systems).
Transducción celular. La transducción con
los vectores virales se realizó plaqueando 2x10^{6} células diana
por pocillo en placas de 6 pocillos y resuspendiéndolas en 4 ml de
sobrenadante conteniendo los vectores virales obtenido según se ha
descrito anteriormente, al que se le había añadido 4 \mu/ml de
polibreno. Para facilitar la transducción, se centrifugaron a 2000
rpm, 32ºC durante 90 minutos, y posteriormente se incubaron a 37ºC,
3 horas, diluyéndose por último en nuevo medio de cultivo. Para la
transducción de los linfoblastos T el protocolo seguido fue
esencialmente el mismo, excepto que las células se mantenían en
presencia de IL-2 (100 U/ml) y que se plaqueaban
10x10^{6} células por pocillo con 5 ml de sobrenadante. En todos
los casos, la transducción de las células diana se realizó en 2 o 3
rondas en intervalos de 24 horas, analizando después de la última
ronda la eficiencia de la transducción mediante citometría de
flujo.
Microscopía electrónica. Este análisis se
llevó a cabo fundamentalmente según se describe en Hockley, D.J.,
et al., J Gen Virol, 1988. 69 (Pt 10):
2455-69. Así, se infectaban 3x10^{6} células a
elevada multiplicidad de infección, y 48 horas después se fijaban
en glutaraldehido (2,5%) y paraformaldehido (1%) en tampón de
cacodilato sódico al 0.1M y pH 7.4. Se incubaban a temperatura
ambiente durante 30 minutos o a 4ºC durante la noche, se lavaban
tres veces en el mismo tampón, y posteriormente se fijaban en
tetróxido de osmio al 1% en agua. Se trataban entonces con ácido
tánico (0,15%) durante 1 minuto y acetato de uranilo acuoso (2%). A
continuación, se deshidrataban las células en etanol a 4ºC y se
embebían en resina epoxi (TAAD 812). Esta se cortaba en secciones
finas con una cuchilla de diamante, que eran finalmente fijadas en
acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen al microscopio
electrónico (Modelo JEM-1010).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para estudiar el potencial de la expresión de
CD4\varepsilon15 (figura IA) en el control de la replicación de
VIH y poder hacer un seguimiento simultáneo de las células
transducidas, se insertó dicha secuencia quimera en dos vectores
bi-cistrónicos diferentes. El vector pCIE15 contiene
un promotor híbrido de la expresión génica (LTR/CMV) que controla
la expresión de la quimera CD4\varepsilon15, la cual, al estar
seguida de una secuencia de señalización para entrada en el
ribosoma (TRES, del inglés "Internal Ribosome Entry
Site"), y la secuencia de la proteína fluorescente verde
mejorada (EGFP) se expresa siempre de forma ligada a la EGFP. Al
vector sin dicha quimera se le denominó pCIE. El otro vector
utilizado (pD15) fue similar, excepto porque su 5'LTR proviene del
virus del sarcoma mieloproliferativo y además cuenta al inicio del
3'LTR con un elemento regulador
post-transcripcional del virus de la hepatitis de la
marmota. Dado que este vector deriva del retrovirus M387, se
utilizó dicho retrovirus como vector control de pD15 sin
quimera.
Para generar células transducidas se utilizó la
línea celular MT2, una línea de células T muy sensible a la
infección con VIH. Tras su infección con partículas del vector
pCIE15, se obtuvo el clon de células transducidas C10. La infección
con VIH de células MT2 provocó la formación de sincitios, partículas
infectivas de VIH y liberación de la proteína p24 de la cápside a
las 24 horas tras la infección, afectando a todas las células del
cultivo a las 48 horas (figura 1B). Por el contrario, tras su
infección con VIH, las células C10 transducidas no formaron
sincitios (figura 1B) y el número de partículas infectivas generadas
tras un solo ciclo de replicación de VIH disminuyó a 1/3 respecto a
lo observado en el cultivo de células MT2 (figura 1C). Sin embargo
la síntesis y liberación de la proteína p24 al medio de cultivo no
se vio afectada tras 24 horas de infección.
El efecto protector de la expresión de la
quimera CD4\varepsilon15 se potenció claramente después del
primer ciclo de replicación de VIH, por lo que en células C10
apenas se detectó producción de partículas virales y síntesis de
p24 a las 48 horas de la infección por VIH (figura ID). Mediante
Tisis de las células transducidas de distintos clones originados
por transducción de MT2 (C10, 2 y G11) infectadas con VIH, y
posterior detección mediante técnicas inmunológicas ("western
blot") pudo comprobarse que dichas células continuaban
sintetizando el precursor gp160, pero éste no era procesado para
originar gp120 (figura 1E).
Este experimento demostró que la transducción
con CD4\varepsilon15 impide que se extienda la infección por VIH
al prevenir su transmisión célula a célula a través de los
sincitios y virus-a-célula al
inhibir la formación de partículas infectivas.
\newpage
Ejemplo
2
Para excluir posibles influencias de la cepa
viral, se infectaron cultivos de MT2 (figura 2A, barras blancas) y
del clon transducido C10 (figura 2A, barras negras) a una
multiplicidad de infección de 0,0001 con distintas cepas de VIH:
NL4.3, ME46, la cepa de laboratorio CBL-23 del
VIH-2 y la cepa VISH 86.9 (híbrido entre el VIS y
el VIH). En todos los casos se apreció que la transducción con
CD4\varepsilon15 inhibía la liberación de p24, siendo
particularmente intensa tras varias rondas de replicación,
alcanzando la inhibición 5 a 6 órdenes de magnitud (figura 2A).
Asimismo, para excluir posibles influencias del
clon celular, se procedió a la transducción con pCIE15 y pD15 de
células T de las líneas PM1, MOLT4, Jurkat y MT2, y se infectaron
con la cepa NL4.3 del VIH-1 a baja multiplicidad.
Tras la infección con NL4.3, se midió la liberación de la proteína
p24 al medio de cultivo tras la infección (Dias p.i) y determinó el
porcentaje de células infectadas en cada experimento fue
determinado por citometría de flujo. La comparación de células
transducidas con los vectores correspondientes sin la quimera
CD4\varepsilon15 mostró que la inhibición de la replicación del
VIH no dependía de la línea celular, ni del vector (figura 2B).
Especialmente interesante resultó la observación
de que se lograba una protección frente a la infección por VIH
incluso cuando sólo una minoría de las células del cultivo estaba
transducida con la quimera. Así, cuando únicamente el 20% de las
células PM1 estaban transducidas con pCIE15, se observó una
reducción de 10 veces en la liberación de la proteína p24 de la
cápside del VIH al medio. Un efecto similar se observó cuando sólo
un 56% de las células Jurkat estaban transducidas con pD15. La
inhibición más intensa de la replicación del VIH se observó en la
línea celular MT2, en la que, cuando únicamente el 33% de las
células del cultivo estaban transducidas (figura 2B, gráfica MT2),
se observaba una reducción de 100.000 veces en la liberación de p24
al medio a los 7 días tras la infección con VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La expresión de CD4\varepsilon15, al inhibir
un paso tardío en la replicación del VIH (la maduración de su
envuelta) sólo debería tener efecto en las mismas células que
expresan la quimera, sin embargo los resultados muestran que la
expresión de CD4\varepsilon15 en un porcentaje minoritario de las
células de un cultivo es suficiente para proteger a las otras
células de la infección por VIH (ver también ejemplo 2). Así,
cuando se procedió a la infección con VIH-1 de
células T primarias transducidas con el vector pCIE15 y se
mezclaron en distintas proporciones con células T no transducidas,
e igualmente cuando se mezclaron células T de la línea MT2 (no
transducidas) y del clon C10 (transducidas con pCIE15) y se
infectaron las mezclas con la cepa NL4.3, la replicación del VIH se
bloqueó de forma casi completa. Esta inhibición se pudo observar
incluso cuando sólo un 30% del cultivo provenía de las células que
expresaban la quimera. Del mismo modo, el porcentaje de células T
CD4+ en el cultivo primario de células T activadas con
fitohemaglutinina e interleuquina-2 (que contiene
tanto células T CD4 como CD8,) aumentó hasta asemejarse al de los
cultivos no infectados con VIH, debido a que se redujo su
mortalidad. Cuando los porcentajes de células transducidas eran
menores (7% y 15%) el efecto inhibidor fue dependiente de la dosis,
es decir a mayor porcentaje de células transducidas, mayor
inhibición de la infección por VIH (figura 3A, derecha).
Aunque estos ensayos sugerían la existencia de
un efecto protector en células no transducidas, podía aducirse que
la medida mediante citometría de flujo del porcentaje de células
que expresaban la proteína EGFP quizá estaba subestimando el número
de células transducidas. Para excluir esta posibilidad se
analizaron los efectos de infectar mezclas de cultivos de células
C10 (transducidas) y de sus células parentales MT2 (no
transducidas), con la cepa NL4.3 del VIH. Así, tras la infección de
las mezclas de distintas proporciones de ambos tipos celulares, se
evaluó la replicación del VIH analizando la liberación de p24
(cuantificada en pg/ml del medio) y estimando la carga viral (figura
3B, izquierda). Los resultados muestran como la expresión de la
quimera CD4\varepsilon15 en tan sólo un 10% de la población
celular protegió completamente frente a la replicación del VIH a
toda la población, demostrando de forma evidente el efecto
protector de esta expresión en las células no transducidas.
Para asegurar que la protección de las células
no transducidas por parte del factor no requería contacto célula a
célula se realizaron experimentos con placas que contienen pares de
pocillos separadas por membranas con un poro de 0.4 pm y que por
tanto permiten la difusión a su través de macromoléculas pero no de
las células (figura 3C). Se crecieron cultivos de C10 o de MT2 en
los pocillos superiores y sólo de MT2 en los pocillos inferiores.
Posteriormente se infectaron ambos tipos de cultivos con
VIH-1 y se evaluó su replicación determinando la
liberación de la proteína p24 de su cápside, así como la formación
de sincitios en las células. Se observó que cuando el pocillo
superior contenía el clon C10 se reducía la replicación de VIH en
el cultivo de MT2 del pocillo inferior de forma muy intensa,
confirmando que no es necesario el contacto célula a célula.
\newpage
Ejemplo
4
Se centrifugaron cultivos de células T
transducidas con CD4\varepsilon15 e infectadas con
VIH-1 a alta multiplicidad de infección. El
sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación y el pellet,
correspondiente a la fracción particulada, se sometió a nuevo
fraccionamiento por ultracentrifugación en gradientes de iodixanol.
En el gradiente formado, se seleccionaron las fracciones que
contenían el factor soluble mediante experimentos de protección de
células MT2 frente a la infección por VIH. Estas fracciones se
fraccionaron nuevamente por ultracentrifugación en gradiente,
obteniéndose 11 fracciones en las que se realizaron nuevos ensayos
de protección. Mediante separación por electroforesis en geles de
poliacrilamida de dichas fracciones se pudo identificar una
proteína con un peso molecular de aproximadamente 30 KDa que sólo
aparecía en la fracción protectora (figura 4A, señalada por la
flecha). Se secuenció parcialmente dicha proteína y se encontró una
identidad con un heptapéptido de la glicoproteína gp120 del virus
VIH (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:4, que fue denominado como
SIMI -ver figura 4B). Estas mismas 11 fracciones se separaron por
electroforesis en geles de poliacrilamida y se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa, hibridándose dichas membranas con
anticuerpos específicos frente a distintas regiones de gp120 y con
una mezcla de sueros de pacientes seropositivos (técnica de
"Western blot"). Se encontró que las proteínas que hibridaban
con estos anticuerpos y sueros y que correspondían al factor
protector (pues se detectaron únicamente en la fracción
protectora), hibridaban asimismo con anticuerpos específicos que
reconocen las regiones C3, C4 y V3 de gp120, respectivamente, pero
no con los anticuerpos específicos para la región C1. Se comprobó
mediante la misma técnica que este factor no hibridaba con
anticuerpos frente a las proteínas p24 (cápside del VIH) y p17
(matriz del VIH).
Teniendo en cuenta tanto que el heptapéptido que
presentaba homología con la secuencia SIM1 del factor se encontraba
en la región V4 de gp120, como el peso molecular de dicho factor y
su reactividad frente a anticuerpos anti-C3 y
anti-C4, pero no a anticuerpos
anti-C1, se planteó la posibilidad de que fuera un
fragmento correspondiente al tercio C-terminal de
gp120. Se diseñaron por tanto diversos vectores para la expresión
de fragmentos de gp120 que contenían toda la secuencia de las
regiones C3 a C5 de gp120 y que se diferencian en la presencia o no
de la región V3 y de la secuencia N-terminal de
gp41 (estos fragmentos se denominaron I, II, III y IV; véase la
figura 4B). La inclusión en ciertas construcciones de esta
secuencia N-terminal se debió al hecho de que con
los datos disponibles no era posible distinguir si el factor
antiviral procedía del procesamiento de gp120 ó del procesamiento
del precursor gp160 (en este último caso incluiría parte del
extremo N-terminal de pg41). El vector de expresión
fue el pSR\alpha-leader HA, que contiene una
secuencia líder para dirigir los distintos fragmentos (I, II, III o
IV -ver figura 4B) de gp120 al retículo endoplasmático, permitiendo
su secreción, y una secuencia que codifica por un epítopo HA
fusionada al extremo N-terminal de dichos
fragmentos, que permite su detección usando un anticuerpo
anti-HA. Las construcciones se usaron para
transducir células COS, recogiéndose muestras del cultivo celular a
las 48 horas de la transducción. Estas muestras se centrifugaban y
se realizaron ensayos de protección de células MT2 frente a la
infección por VIH utilizando los sobrenadantes de dichas
centrifugaciones.
El resultado fue que la construcción que
codificaba por el fragmento III de gp120, es decir la
correspondiente a la región C3-C5, fue la que
confirió protección en el ensayo (figura 4C). La transducción de
células T Jurkat con el fragmento III y posterior infección con VIH
a dos multiplicidades de infección altas (0,1 y 0,5 partículas
infecciosas/célula) demostró que la expresión de dicho fragmento
era suficiente para la protección frente a VIH (Figura 4D). Se
confirmó por tanto que el factor antiviral es un fragmento del
extremo C-terminal de gp120 que corresponde a la
secuencia C3-C5.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido de la proteína gp120
capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.7
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la Inmunodeficiencia
Adquirida (SIDA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(189)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región C3-C5 de la
proteína gp120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Inmunodeficiencia
Adquirida (SIDA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido que codifica para la
región C3-C5 de la proteína gp120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de direccionamiento a
retivulo endoplasmático
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
Claims (22)
1. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital
del virus del SIDA (VIH) que comprende una secuencia con al menos
un 70% de homología con la región C3-C5 de la
proteína gp120 del virus.
2. Polipéptido según la reivindicación anterior
que comprende una secuencia con al menos un 90% de homología con la
región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.
3. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital
del virus del SIDA (VIH) según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde la región C3-C5 es la SEQ ID NO:
1.
4. Polinucleótido capaz de codificar por un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
5. Polinucleótido según la reivindicación
anterior cuya secuencia es la SEQ ID NO:2.
6. Vector que comprende un polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.
7. Vector según la reivindicación 6 que además
comprende al menos una secuencia control que permite la expresión
de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a
5.
8. Célula transfectada capaz de producir un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3
caracterizada porque comprende:
- a.
- un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, 6
- b.
- un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7.
9. Célula transfectada según la reivindicación
anterior donde dicha célula es una célula madre hematopoyética o
progenitora de células linfáticas.
10. Célula transfectada según la reivindicación
8 donde dicha célula es un linfocito T.
11. Célula transfectada según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10 donde dichas células son de origen
humano.
12. Composición farmacéutica para la elaboración
de un medicamento para el tratamiento o prevención frente al virus
del SIDA (VIH) que comprende:
- a.
- un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o
- b.
- un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, o
- c.
- un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o
- d.
- una célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. Método para la obtención o identificación de
un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones
1-2 que comprende:
- a.
- transfectar células hematopoyéticas, linfoblásticas, ó linfocitos T, con un polinucleótido quimérico que comprende la secuencia del receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 amino ácidos.
- b.
- infectar las células de la etapa (a) con al menos una cepa del virus del SIDA, y
- c.
- aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA de la fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de la etapa (b).
14. Método según la reivindicación anterior
donde la señal de retención en el retículo endoplasmático es un
fragmento de CD3\varepsilon de al menos 12 amino ácidos.
15. Método según la reivindicación 13 donde el
fragmento de CD3\varepsilon tiene la secuencia seleccionada del
grupo:
- a.
- la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
- b.
- secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
\newpage
16. Polinucleótido quimérico para llevar a cabo
el método según la reivindicación 13 que comprende la secuencia que
codifica para el receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica
para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al
menos 12 amino ácidos.
17. Polinucleótido quimérico según la
reivindicación anterior donde la señal de retención en el retículo
endoplasmático es un fragmento de CD3\varepsilon.
18. Polinucleótido quimérico según la
reivindicación anterior donde el fragmento de CD3\varepsilon
tiene la secuencia seleccionada del grupo:
- a.
- la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
- b.
- secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
19. Célula transfectada hematopoyética,
linfoblástica ó linfocito T, para llevar a cabo el método según
cualquiera de las reivindicaciones 13-15 que
comprende un polinucleótido quimérico según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18.
20. Uso de un polipéptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de una vacuna.
21. Uso de un polinucleótido según cualquiera de
las reivindicaciones de 4 a 5 para la elaboración de una
vacuna.
22. Uso de una célula transfectada según
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la elaboración de
una vacuna.
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|---|
| SAN JOSÉ, E., MUÑOZ-FERNÁNDEZ, M. A., ALARCÓN, B. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus Type-1 replication. Human Gene Therapy. Junio 1998, Vol. 9, N$^{o}$ 9, páginas 1345-1357. ISSN 1043-0342. * |
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