ES2324755B1 - Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida. - Google Patents

Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida. Download PDF

Info

Publication number
ES2324755B1
ES2324755B1 ES200700907A ES200700907A ES2324755B1 ES 2324755 B1 ES2324755 B1 ES 2324755B1 ES 200700907 A ES200700907 A ES 200700907A ES 200700907 A ES200700907 A ES 200700907A ES 2324755 B1 ES2324755 B1 ES 2324755B1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
sequence
hiv
cell
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
ES200700907A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2324755A1 (es
Inventor
Balbino Alarcon Sanchez
Irene Zaldivar Notario
Esther San Jose Martinez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to ES200700907A priority Critical patent/ES2324755B1/es
Priority to PCT/ES2008/070065 priority patent/WO2008122687A1/es
Publication of ES2324755A1 publication Critical patent/ES2324755A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2324755B1 publication Critical patent/ES2324755B1/es
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514CD4
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18Antivirals for RNA viruses for HIV
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08RNA viruses
    • C07K14/15Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/162HIV-1 ; HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, CD4-Binding site
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Polipéptido de la proteína gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en una secuencia con al menos un 70% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.

Description

Polipéptido de la proteína gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
La presente invención se refiere a un polipéptido correspondiente a la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus del SIDA (el VIH) y al polinucleótido codificante por dicho polipéptido, capaz de ofrecer un efecto protector a las células frente a la infección por el VIH.
Estado de la técnica anterior
Las estrategias más comúnmente empleadas para combatir el virus del SIDA (el VIH) fueron desarrolladas a principios de los noventa. En general, estaban relacionadas con la capacidad inhibitoria de al menos tres diferentes moléculas que actuaban sobre una o dos enzimas vitales para el virus: retrotranscriptasas y proteasas. La combinación de fármacos basados en estas moléculas, conocida como terapia anti-retroviral altamente activa (HAART), ha mejorado el pronóstico de pacientes con SIDA. Sin embargo, la HAART no es capaz de erradicar al virus, que se mantiene latente en el interior celular, por lo que los distintos fármacos deben administrarse continuamente. Este hecho, junto con los efectos secundarios de dichos fármacos y la aparición de cepas resistentes del virus hace necesario buscar alternativas a este tratamiento.
A finales de los noventa, se ideó como tratamiento potencial para los pacientes de SIDA la generación de células capaces de expresar genes con actividad antiviral (la denominada inmunización intracelular). Así, se demostró por ejemplo que un mutante dominante del gen gag (que codifica por una proteína precursora de distintas proteínas del VIH) tenía actividad antiviral (Trono, D., et al., Cell, 1989. 59(1): 113-20). Se han descrito otras estrategias basadas en este enfoque, para interferir directamente en la replicación del virus o eliminar las células infectadas. Además, la terapia génica frente a VIH ha entrado en fase clínica empleando, entre otros, el gen rev (la proteína Rev regula la expresión de genes que codifican por proteínas estructurales del virus) o el gen tat (la proteína tat es un trans-activador de la transcripción). Estas y otras terapias génicas han sido revisadas por Fanning, G. et al., J Gene Med, 2003. 5(8): 645-53.
Diversas líneas en la lucha contra el SIDA se han enfocado al bloqueo de las primeras fases del ciclo vital del VIH, que comienza cuando la glicoproteína gp120 de su envuelta reconoce al receptor CD4 de la superficie de membrana de algunos tipos celulares. Para el progreso de la infección por VIH la diana principal son los denominados linfocitos CD4+, aquellos que presentan dicho receptor. En este caso, gp120 reconoce además a los co-receptores CCR5 y CXCR4. La glicoproteína gp120 proviene del procesamiento del precursor g160, que es sintetizado en el retículo endoplasmático de las células infectadas y que, por la acción de proteasas del aparato de Golgi, produce tanto gp120 como gp41. Estas glicoproteínas de la envuelta del VIH se organizan formando trímeros, de forma que cada complejo de la envuelta del virus contiene tres unidades de la gp120 y otras tres de gp41. Una vez que la gp120 interacciona con el receptor CD4, se induce un cambio conformacional en gp41, que inserta una región hidrofóbica en la membrana de la célula y permite fusionar la partícula viral con la membrana celular para que su carga genética pase al interior celular.
Tanto gp160, gp120, como gp41, han sido empleadas para combatir la infección por VIH mediante células transformadas (WO89/05349, WO94/22477) y anticuerpos contra el virus (WO03/106496). En ciertos casos las estrategias se han concentrado en inhibir la entrada del virus impidiendo su fusión con la membrana celular, por ejemplo desarrollando moléculas que interfieren en el cambio conformacional de gp41 (Kilby, J.M., et al., Nat Med, 1998. 4(11): 1302-7). En otros, el enfoque se ha centrado en impedir el procesado del precursor gp160, pues éste es un paso crucial para la formación de las partículas virales en las células infectadas.
Dentro de estas últimas estrategias, los inventores habían diseñado anteriormente un vector retroviral que contenía en su secuencia la quimera denominada CD4\varepsilon10. Esta era una construcción génica que reunía la secuencia de CD4 y la correspondiente a 10 aminoácidos de la señal de retención de CD3\varepsilon en el retículo endoplasmático, siendo CD3\varepsilon una de las cadenas peptídicas que forman parte del complejo receptor de los linfocitos T (Mallabiabarrena, A. et al., Nature, 1992. 357(6379): 593-6). El péptido originado por expresión de la quimera CD4\varepsilon10 se retenía en dicho retículo y este efecto provocaba la inhibición de la replicación de VIH-1 al interaccionar con la proteína viral gp160, reteniéndola en el retículo endoplasmático y evitando su exportación al aparato de Golgi y por tanto su procesamiento en gp120 y gp41 (San José, E. et al., Hum. Gene. Ther., 1998. 9(9): 1345-57). De esta manera, la expresión estable del gen CD4\varepsilon10 en las células T transducidas las protegió de los efectos patogénicos del virus. Además, la aplicación de esta estrategia a linfoblastos T de pacientes seropositivos utilizando como vector para la transducción partículas derivadas del virus Mo-MLV inhibió la depleción de las poblaciones de linfocitos CD4+. Sin embargo estos estudios no pudieron efectuarse en condiciones óptimas, pues el vector utilizado no permitía un seguimiento del progreso de la transducción y por otra parte el título viral de los sobrenadantes de los cultivos de células transducidas (relacionado por tanto con el número de vectores virales que se replican con éxito y son capaces de extender la transducción) era bajo.
Explicación de la invención
Los autores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, la transducción genética estable de linfocitos T mediante vectores virales que contienen una secuencia quimera o polinucleótido quimérico de ADN, denominada CD4\varepsilon15, que codifica para el receptor de membrana CD4 y para una señal de retención en el retículo endoplasmático de la cadena CD3\varepsilon del complejo receptor de membrana de los linfocitos, no sólo protege a estos linfocitos transducidos de los efectos de la infección por VIH, sino que al mismo tiempo actúa produciendo un factor antiviral que protege a otros linfocitos T no transducidos.
Los inventores han utilizado vectores virales bi-cistrónicos, logrando en los linfocitos T transducidos la co-expresión de la quimera CD4\varepsilon15 con la de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), debido a la inclusión en el vector de una secuencia IRES (del inglés "Internal Ribosome Entry Site"), que permite ligar la expresión de la quimera al de la EGFP. La expresión de EGFP en células transducidas permite el seguimiento de su número mediante citometría de flujo y consecuentemente ha facilitado la demostración de que la expresión de la quimera CD4\varepsilon15 en un pequeño porcentaje de los linfocitos T de un cultivo celular es suficiente para proteger frente a la infección por VIH tanto a las células transducidas como a las no transducidas.
El efecto protector de las propias células transducidas se logra en parte porque la expresión de CD4\varepsilon15 previene la maduración en la célula infectada por VIH de la proteína precursora gp160, necesaria para originar las proteínas gp120 y gp41 de la envuelta del virus; por lo que aunque el gen del VIH que codifica por gp160 se expresa dentro de la célula y se producen partículas del VIH éstas no son infectivas.
Por su parte, el efecto protector sobre las otras células no transducidas se debería a que la expresión en las transducidas de la quimera conduce a la síntesis de un fragmento de gp120, soluble, y que es secretado al medio. Este factor competiría con la gp120 de la envuelta de las partículas de VIH en su unión al receptor CD4, impidiendo la unión del virus a dichos receptores y por tanto el desarrollo de su ciclo vital.
Se ha aceptado generalmente que, para que este tipo de terapia sea eficaz, es necesario que las células a proteger estén transducidas por los vectores que contienen el gen "protector", por lo que es particularmente importante lograr vectores con eficacia transductora cercana al 100%. La presente invención ha mostrado inesperadamente que aunque sólo un porcentaje minoritario (del 10% o menor) de las células de un cultivo estén transducidas con la quimera CD4\varepsilon15, es posible lograr una inhibición de la replicación del virus VIH de más de 100.000 veces en comparación con cultivos celulares en los que los vectores virales no contenían la quimera.
Los análisis posteriores indicaban que el efecto protector de las células transducidas sobre las no transducidas era mediado por un factor antiviral soluble, liberado al medio por las primeras. Asimismo, se comprobó que dicho factor sólo se liberaba cuando las células transducidas eran infectadas por VIH. Este hecho, unido a que el factor antiviral se liberaba por los linfocitos T CD4+ no activados (la activación de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento de los antígenos por parte del complejo receptor), y a que el efecto protector requería la expresión de CD4\varepsilon15, indicaba que este factor es diferente a otros factores antivirales tales como CAF (producido por linfocitos CD8), interferones, quimioquinas, y al factor producido por linfocitos CD4+ de pacientes seropositivos asintomáticos y en los que la enfermedad no progresa.
La producción de un factor soluble secretado por un porcentaje minoritario de células transducidas que es capaz de proteger a las no transducidas presenta muchas ventajas sobre otros métodos de terapia génica. Por tanto, los autores profundizaron en la caracterización de dicho factor, demostrando que se trata de un polipéptido con un peso molecular de alrededor de 30 KDa, lo que ya indicaba que no se correspondía con el polipéptido codificado por la quimera CD4\varepsilon15, que tiene 55 kDa.
La secuenciación parcial de este factor mostró una identidad con una región de 7 aminoácidos de gp120, y se comprobó asimismo que hibridaba con anticuerpos específicos frente a las regiones constantes C3 y C4 de gp120, pero no con anticuerpos frente a la región constante C1 (en gp120 se han definido 5 dominios cuya secuencia es prácticamente constante, de las que C2, C3, C4, C5 están implicadas en la unión de gp120 al receptor CD4, y 5 regiones cuya secuencia es muy variable entre las distintas cepas de VIH, de las que sólo V5 está implicada en dicha unión). Teniendo en cuenta la posición en gp120 de la secuencia de 7 aminoácidos idéntica a la secuencia parcial del factor, los inventores consideraron probable que el mismo fuera un fragmento correspondiente al tercio C-terminal de gp120.
Se realizaron seguidamente diversas construcciones génicas para comprobar qué regiones de gp120 eran necesarias para lograr el efecto protector anti-VIH. Se pudo definir así que el factor antiviral objeto de la presente invención corresponde a un fragmento del extremo C-terminal de gp120 cuya secuencia polinucleotídica es la SEQ ID NO:2.
Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido (factor antiviral) capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que consiste esencialmente en una secuencia con al menos un 70% de homología con la región definida por los dominios C3, V4, C4, V5 y C5 (en adelante región C3-C5) de la proteína gp120 del virus. En realizaciones sucesivamente más preferidas de este aspecto de la invención el polipéptido tiene una homología de al menos el 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% con la región C3-C5 de la proteína gp120. En una realización aun más preferida de este aspecto de la invención el polipéptido tiene la SEQ ID NO:1. En adelante este polipéptido también será denominado como factor antiviral o "polipéptido de la invención".
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido capaz de codificar el polipéptido de la invención. En una realización preferida dicho polinucleótido tiene la SEQ ID NO:2. Debido a la degeneración del código genético, por la que cada aminoácido puede ser codificado por distintos codones nucleotídicos, polinucleótidos distintos a SEQ ID NO:2 pueden dar lugar al péptido de la invención. Consecuentemente, realizaciones también preferidas de la invención comprenden polinucleótidos con al menos un 50% de homología con la SEQ ID NO:2 y, en realizaciones sucesivamente más preferidas, con al menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de homología con la SEQ ID NO:2. En adelante este polinucleótido también será denominado como "polinucleótido de la invención".
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un vector que comprende al polinucleótido de la invención y además, preferentemente, comprende al menos una secuencia control que permita la expresión de dicho polinucleótido. En adelante este vector será denominado como "vector de la invención".
Un cuarto aspecto de la invención se relaciona con una célula transfectada preferentemente adulta y más preferentemente no germinal, capaz de producir el polipéptido de la invención, caracterizada porque comprende al polinucleótido de la invención o al vector de la invención. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la célula transfectada es una célula madre hematopoyética, preferentemente progenitora de células linfáticas y, más preferentemente, de linfocitos T. En una realización todavía más preferida las mencionadas células madre son de origen humano. En adelante, estas célula(s) será(n) denominada(s) como "célula(s) transfectada(s) de la invención".
Un quinto aspecto de la invención se relaciona con una composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento que comprende a cualquiera de los siguientes elementos de la invención: i) el polipéptido de la invención, ii) el polinucleótido de la invención, o iii) la célula transfectada de la invención. En una realización preferida la composición farmacéutica está dirigida al tratamiento o prevención frente al virus del SIDA (VIH). En adelante, esta composición farmacéutica será denominada como "composición farmacéutica de la invención".
Un sexto aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento o prevención contra el virus del SIDA que comprende:
1) Transfectar células hematopoyéticas, progenitoras de células linfáticas, o linfocitos T con el polinucleótido de la invención o con el vector de la invención.
2) Injertar en un individuo diana una cantidad terapéuticamente efectiva de células hematopoyéticas, progenitoras de células linfáticas, o linfocitos T obtenidos en el paso anterior.
En una realización preferida del método de tratamiento o prevención, las células transfectadas provienen (i) de un individuo sano histocompatible con el individuo diana y, más preferentemente, (ii) del propio individuo diana, siendo éstas células preferentemente embrionarias y más preferentemente provenientes de cordón umbilical.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método para la obtención o identificación de polipéptidos capaces de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, donde la transfección de células con el polinucleótido que codifica para dicho polipéptido protege tanto a células transfectadas como no transfectadas, que comprende:
1.
transfectar células hematopoyéticas, preferentemente linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos T, con un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para el receptor CD4, secuencias con al menos un 60% de homología con CD4, preferentemente al menos 70, 80, 90, 95 o 98% y una segunda que codifica para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al menos 12 ó 13 amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15 (CD4\varepsilon15),
2.
infectar las células de la etapa (1) con al menos una cepa del virus del SIDA, y
3.
aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA, preferentemente el polipéptido de la invención, de la fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de la etapa (2).
En una realización preferida de este aspecto de la invención la señal de retención es un fragmento de CD3\varepsilon, y en una realización aun más preferida el fragmento tiene la secuencia la SEQ ID NO:3, variantes alélicas de ésta SEQ ID NO:3, ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 0 95%.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico que comprende la secuencia de CD4 y una secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 ó 13 aminoácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15. En una realización preferida la señal de retención es un fragmento de CD3\varepsilon, preferentemente dicho fragmento tiene la SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, y preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 ó 95%.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a la transfección de células hematopoyéticas, preferentemente linfoblásticas, y más preferentemente linfocitos T, con un polinucleótido capaz de codificar para un polipéptido quimérico que comprende al receptor CD4 y una secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 o 13 amino ácidos, preferentemente entre 14 y 16 y aun más preferentemente de 15. En una realización preferida, la señal de retención es un fragmento de CD3\varepsilon, y preferentemente dicho fragmento tiene la SEQ ID NO:3 ó secuencias con al menos un 80% de homología con SEQ ID NO:3, más preferentemente al menos el 85, 90, 92, 93 ó 95%.
Un décimo aspecto de la invención se refiere al uso del polipéptido, polinucleótido, vector o célula transfectada de la invención para su uso como medicamento, preferentemente para la elaboración de una vacuna frente al virus del SIDA.
Definiciones
El término "polinucleótido", tal y como se emplea en la descripción, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término está referido a la estructura primaria de la molécula, incluyendo ADN y ARN tanto de cadena sencilla como de doble.
El término "replicón" hace referencia en la descripción a cualquier elemento génico, como por ejemplo un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como una unidad autónoma de replicación, esto es, que es capaz de replicarse bajo su propio control, aunque dicha replicación pueda ser inducida, inhibida y en definitiva regulada por agentes externos al propio replicón. El término "vector" hace referencia en esta descripción a un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleotidico, para realizar la replicación o expresión del segmento unido.
El término "secuencias control" se refiere en la descripción a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para la expresión de las secuencias codificantes a las que están ligadas, como por ejemplo a la región C3-C5. La naturaleza de las secuencias control varía en función del organismo huésped: en procariotas éstas generalmente comprenden un promotor, un sitio de unión a ribosoma y terminadores; en eucariotas, generalmente comprenden promotores, terminadores, un sitio de unión a ribosoma e inductores. Se pretende que el término "secuencias control" incluya, como mínimo, todos los elementos necesarios para la expresión de las secuencias codificadas, y también pueda incluir componentes adicionales, tales como las secuencias líder.
El término "región C3-C5" se refiere en la descripción al fragmento de la secuencia polipeptídica de la proteína gp120 del virus VIH que comprende los dominios comúnmente definidos en el mismo como C3, V4, C4, V5 y C5, siendo los dominios C aquellos cuya secuencia se encuentra muy conservada al comparar distintas cepas del virus, y los dominios V, aquellos cuya secuencia varía mucho al comparar distintas cepas del virus. Igualmente al referirse a la secuencia polinucleotídica en esta descripción el término "región C3-C5" significa el fragmento de dicha secuencia que codifica por la secuencia polipeptídica que comprende los dominios C3, V4, C4, V5 y C5. Preferentemente, esta secuencia abarca desde la posición 328 hasta la 516 de la glicoproteína gp120 del virus del SIDA.
El término "transfección", tal y como es empleado a lo largo de la descripción, se refiere a la acción de introducir material genético foráneo en una célula. Esta transfección podrá ser llevada a cabo por métodos sobradamente conocidos en el estado de la técnica, tales como la electroporación, transducción, microinyección, pistola de genes, etc.
El término "transducción", se refiere a la acción de introducir material genético foráneo en una célula mediante un vector derivado de un virus, siendo por tanto un tipo específico de transfección.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1
Las partículas virales formadas en células transducidas con la quimera CD4\varepsilon15 no son infectivas
La figura 1A representa esquemáticamente los vectores retrovirales pCIE15 y pD15, conteniendo la quimera CD4\varepsilon15. Dicha quimera se ha representado comprendiendo los dominios extracelular (EC), transmembrana (TM) e intracelular (IC) del receptor CD4 de los linfocitos T, así como los 15 aminoácidos responsables de la retención en el retículo endoplasmático de la cadena CD3\varepsilon del complejo CD3/receptor de células T (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:3).
La figura 1B muestra cultivos celulares de MT2 (una línea de células T muy sensible a la infección con VIH) y de la línea celular C10 (obtenida por transducción de MT2 con el vector pCIEI5), tras ser infectados con la cepa NL4.3 del VIH. Mediante contraste de fase, pudo observarse que a las 48 horas de la infección con el VIH todas las células MT2 habían formado sincitios, mientras las células C10 no habían formado ninguno.
La figura 1C izquierda muestra como la expresión de CD4\varepsilon15 inhibía la formación de partículas infectivas en la primera ronda de replicación del VIH. Así, en los cultivos de C10 la dosis infectante del 50% de los cultivos celulares, TCID_{50}/ml (del inglés "Tissue Culture Infective Dose") fue menos de un tercio de la observada en cultivos de MT2, aunque la liberación de la proteína p24 de la cápside del VIH fuera similar entre ambos cultivos (figura IC derecha). A las 48 horas, cuando se había producido más de una ronda de replicación del VIH, el efecto de la expresión de la quimera CD4\varepsilon15 era más potente, de manera que el valor de TCID_{50}/ml de los sobrenadantes de los cultivos de las células transducidas (C10) era 60 veces menor al de los cultivos de células no transducidas (MT2), y la liberación de p24 era seis veces menor en los cultivos de células C10 que en los de MT2 (figura 1C derecha).
La figura 1D muestra imágenes de microscopía electrónica que confirmaron que, tras un primer ciclo de replicación, la formación de partículas virales está inhibida por la expresión de la quimera CD4\varepsilon15: a las 48 horas tras la infección con VIH las células MT2 mostraron gran cantidad de partículas virales (puntos y círculos oscuros pequeños), mientras que no pudo detectarse ninguno en las células C10.
La figura 1E muestra un "western blot" de las proteínas totales de células MT2 y de distintos clones provenientes de la transducción de MT2 (C10, Clon 2 y G11), infectadas a alta multiplicidad de infección con la cepa NL4.3 de VIH. A las 48 horas de dicha infección se lisaron alícuotas de los cultivos celulares y los lisados se hibridaron con un anticuerpo policlonal frente a gp160 y gp120. Pudo observarse que todas las células sintetizaban el precursor gp160, pero gp120 sólo se encontraba en las células no transducidas (MT2), indicando que en las células transducidas la maduración de gp160 para originar gp120 se había bloqueado.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2
La expresión de CD4\varepsilon15 inhibe la replicación de distintas cepas de VIH en distintas líneas celulares
La figura 2A muestra la concentración de p24 de la cápside del VIH secretada al medio de cultivo, expresado en pg de proteína por ml, para células MT2 (barras negras) y C10 (barras blancas) infectadas con diferentes cepas de VIH (NL4.3, ME46, CLB23 y VISH 89.6).
La figura 2B muestra la progresión de la secreción de p24 (pg/ml del medio de cultivo), en células PM1, MOLT-4, MT2 y Jurkat infectadas con la cepa NL4.3, para excluir el posible efecto clonal de la célula infectada sobre la replicación del virus. En cada cultivo el porcentaje de células transducidas con la quimera CD4\varepsilon15, determinado mediante citometría de flujo fue distinto, según se muestra en la figura.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3
La expresión de CD4\varepsilon15 en un porcentaje minoritario de células ejerce un efecto protector en las células no transducidas al originar la secreción al medio de un factor proteico soluble
Las figuras 3A y 3B muestran el efecto de la proporción de células T transducidas con la quimera CD4\varepsilon15 sobre la infección viral.
La figura 3A muestra los resultados del seguimiento a distintos días tras la infección con el aislado clínico 1936 del VIH (Días pi.) de mezclas de linfocitos T transducidos con pCIE15 y no transducidos, indicándose en dicha figura el de los transducidos en cada mezcla. El seguimiento se realizó midiendo la concentración (pg/ml) de la proteína p24 del VIH secretada al medio y el porcentaje de linfocitos CD4 respecto al total de linfocitos CD4 y CD8. Una proporción de un 30% de linfocitos transducidos es suficiente para inhibir en el cultivo el progreso de la infección: a los 7 días la concentración de p24 en el medio era 25 veces menor a la observada en cultivos sin linfocitos transducidos (figura 3A izquierda) y el % de linfocitos CD4 apenas había disminuido (figura 3A derecha).
La figura 3B muestra los resultados del seguimiento a distintos días tras la infección con la cepa NI4.3 del VIH (Días p.i.) de mezclas de cultivos celulares de C10 (transducidos) y MT2, indicándose en dicha figura la proporción de C10 en cada mezcla. El seguimiento se realizó midiendo la concentración (pg/ml) de la proteína p24 del VIH secretada al medio y el número de copias del ARN del VIH por célula. Los resultados demostraron que la transducción de un 10% (\ding{117}) de las células de un cultivo es suficiente para inhibir completamente el progreso de la infección por el
VIH.
La figura 3C muestra esquemáticamente un experimento para demostrar que no es necesario el contacto célula-célula para lograr el efecto protector de las células transducidas sobre las no transducidas. Se crecieron cultivos de células C10 o MT2 en pares de pocillos separados por membranas, que permiten la difusión a su través de macromoléculas pero no de células. Tras infectar cada cultivo con la cepa NL4.3 se evaluó el progreso de la infección determinando la secreción de p24 (ng de proteína) en cada pocillo, así como la formación de sincitios en las células (-, no detectados; +, detectables; ++, abundantes; +++, se observa efecto citopático extenso). Se observó que cuando el pocillo superior contenía el clon C10 (transducido) se inhibía también la replicación de VIH en el cultivo de MT2 del pocillo inferior, confirmando que no es necesario el contacto célula a célula.
\newpage
Figura 4
El factor proteico protector es homólogo a la región C3-C5 de la proteína gp120 del VIH
La figura 4A muestra el resultado de la separación electroforética de diversas fracciones de un cultivo de células T transducidas con CD4\varepsilon15 e infectadas con VIH-1 a alta multiplicidad de infección. Se señala con una flecha la proteína de aproximadamente 30 KDa que sólo se observó en la fracción con efecto protector frente a la infección por VIH.
La figura 4B muestra un esquema de la proteína gp160, indicándose las proteínas gp120 y gp41 que se originan por rotura proteolítica en la zona indicada por la flecha. Se señala la posición del heptapéptido SIMI, así como las zonas de interacción con CD4 (*) y las de glicosilación (Y). Además, en esta misma figura se muestran de manera esquemática los fragmentos I, II, III, IV utilizados para demostrar la suficiencia de la expresión de la región C3-C5 de gp120 para lograr el efecto protector anti-VIH.
La figura 4C muestra el resultado de un ensayo de protección de cultivos de células MT2 frente a la infección por VIH, en el que se evaluó la progresión de la infección por VIH, según la concentración (pg/ml) de la proteína p24 de su cápside secretada al medio de cultivo por dichas células. El ensayo se realizó añadiendo los sobrenadantes de distintos cultivos de células COS transducidas con los fragmentos I, II, III, IV de gp120 (figura 4B), observándose el mayor efecto protector para los sobrenadantes de células COS transducidas con el fragmento III.
La figura 4D muestra la concentración (pg/ml) de p24 en el medio de cultivo de células T Jurkat transducidas con el fragmento III de gp120 e infectadas con VIH a dos multiplicidades de infección altas (0,1 y 0,5 partículas infecciosas/célula). El progreso de la infección se inhibió marcadamente a los 5 días de la misma en las células transducidas con el fragmento III.
Exposición detallada de modos de realización
Es sabido que la inhibición del corte o maduración de los precursores de proteínas de la envuelta del virus del SIDA da lugar a que dichas proteínas sean no funcionales, esto es, sin capacidad para inducir la fusión a membrana celular de las partículas víricas. A partir de este conocimiento, se desarrollaron experimentos para interferir con el procesado proteolítico de dichos precursores, mediante la creación de una secuencia de ADN quimera (CD4\varepsilon15) que contenía la secuencia que codifica por el receptor de membrana CD4 y por una señal de retención del receptor de membrana CD3\varepsilon en el retículo endoplasmático, así como secuencias reguladoras de la expresión). La transducción mediante vectores virales que contienen dicha quimera produjo una gran reducción en la liberación de partículas víricas infectivas y la no aparición de éstas en el interior de las células infectadas, observable por microscopía electrónica. Por otro lado y después de un ciclo de infección, las células transducidas con CD4\varepsilon15 y posteriormente infectadas por VIH liberaban normalmente la proteína p24 de la envuelta del VIH (esta proteína se usa como antígeno para la detección del virus por el método ELISA) y sintetizaban gp160.
Este hecho confirmó la hipótesis de que CD4\varepsilon15 no inhibe la expresión de los genes del VIH pero si la infección de nuevas células, al bloquear el transporte y maduración de las glicoproteínas de la envuelta del virus. De este modo, se demuestra que la presencia de CD4\varepsilon15 previene la formación de partículas infectivas en las células infectadas por VIH y por tanto la extensión de la infección a otras células. Asimismo, se encontró que la transducción con CD4\varepsilon15 tiene un efecto inhibidor de la replicación de VIH de amplio espectro, puesto que impide la replicación de diferentes cepas de VIH-1, VIH-2 y VISH (VISH es un híbrido de laboratorio entre el virus de la inmunodeficiencia en simios
- VIS - y el de la inmunodeficiencia humana, VIH), lo que incide en su potencial para la terapia génica.
Sin embargo, lo que resultó mucho más interesante fue descubrir que la expresión de CD4\varepsilon15 en células transducidas protegía también a las no transducidas. Así, se comprobó que el efecto inhibitorio sobre la replicación del virus en un cultivo celular se lograba incluso cuando sólo un 10% de las células había sido transducido con la secuencia CD4\varepsilon15. Este hallazgo es particularmente relevante porque una de las barreras más importantes para la aplicación de este tipo de terapias es la baja proporción de células transfectadas con el gen protector que es posible lograr. Por el contrario, la presente invención confiere un efecto protector tanto en células transducidas como en no transducidas. Esta observación, junto al hecho de que los linfocitos T conservaron normalmente su función, hizo pensar en la presencia de un factor protector soluble, secretado por las células transducidas, capaz de trasladarse en el medio de cultivo y de interaccionar con las células no transducidas para conferirles protección frente a la infección. Estas características harían que la presente invención pudiera emplearse como terapia génica eficaz en la lucha contra el SIDA.
Hasta la fecha se habían descrito otros factores anti-VIH, tales como CAF (del inglés "CD8 Antiviral Factor"), producido por linfocitos T CD8+ previamente activados (Barker, E., J Infect Dis, 1999. 179(3): S485-8.35) y que se ha catalogado dentro de las defensinas, una familia de péptidos de bajo peso molecular sin relación con otros factores antivirales. También se había descrito el factor antiviral producido por células T CD4+ de los pacientes seropositivos asintomáticos en los que la enfermedad no progresa, o el producido por células T activadas por cepas de VIH atenuadas, tales como las cepas defectivas en el gen vif.
Ya antes de su caracterización, era evidente que el factor producido por las células transducidas con CD4\varepsilon15 no correspondía a ningún tipo de factor antiviral descrito anteriormente: al ser producido por linfocitos T CD4+ no podía tratarse del CAF, pues éste proviene de los linfocitos T CD8+, y al ser expresado únicamente por células transducidas con CD4\varepsilon15 difícilmente podía tratarse de un interferón o una quimioquina. Asimismo, el hecho de que su liberación al medio por los linfocitos T fuese independiente de la estimulación de éstos, sugería que el factor no es una
citoquina.
Estas circunstancias, unidas al hecho de que el factor se producía sólo cuando las células T transducidas eran infectadas con VIH, hicieron suponer que debía ser inducido por el virus o incluso expresado por el genoma de éste. Por otro lado, al ser su liberación al medio de cultivo dependiente a la vez de la expresión de CD4\varepsilon15 y de la infección por VIH, parecía probable que CD4\varepsilon15 produjese alguna modificación en el procesado o ensamblaje de los productos génicos del virus, y que esta modificación resultase en la secreción del factor protector codificado por el genoma de la célula infectada o por el del propio virus.
Mediante el análisis de fracciones celulares de linfocitos transducidos con CD4\varepsilon15 e infectados con VIH se determinó que el factor soluble tenía un peso molecular de 30 KDa, y que presentaba homología con la proteína gp120. La expresión de diferentes fragmentos del extremo C-terminal de gp120 llevó a la conclusión de que el efecto protector conferido por el factor se basaba en su homología con la región C3-C5 de gp120 (figura 4C).
A continuación se detallan los materiales y métodos que fueron empleados para el desarrollo de la presente invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no limitan la invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo de manifiesto tanto la capacidad del factor para inhibir el ciclo vital del virus del SIDA como los resultados de su caracterización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de realización de la invención Materiales y métodos
Vectores retrovirales. La quimera CD4\varepsilon15 se clonó en dos vectores retrovirales (figura IA). El denominado pCIE 15 deriva del pLZR-CMV-gfp que a su vez deriva del virus de la leucemia murina de Moloney, Mo-MLV (Yang, S., et al., Hum Gene Ther. 1999. 10(1): 123-32) y fue suministrado por el Dr. Antonio Bernad del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, Madrid. El vector pCIE15 incluye un promotor híbrido 5' LTR/CMV (las secuencias LTR - del inglés "Long Terminal Repeat" - facilitan la inserción de la secuencia en el genoma de la célula huésped y CMV designa a un promotor del citomegalovirus), un sitio de clonación múltiple donde se clona CD4\varepsilon15, un sitio IRES (del inglés "Internal Ribosome Entry Site") del virus de la encefalomiocarditis (Abad, J.L., et al., J Gene Med, 2002. 4(1): 27-37) para que la expresión de CD4\varepsilon15 vaya ligada a la de la siguiente secuencia, que codifica por la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), facilitando así el seguimiento de las células que expresan dicha quimera mediante citometría de flujo, y una secuencia LTR en su extremo 3'. El correspondiente vector sin la quimera se denominó pCIE.
Por otro lado, el vector pD15 se generó a partir del M387 (Schambach, A., et al., Mol Ther, 2000. 2(5): 435-45), un vector que contiene los 5'LTR y 3'LTR del virus del sarcoma mieloproliferativo. Además de por dichos LTR, la diferencia respecto a pCIE15 fue la inclusión de un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis del castor al inicio del 3'LTR.
Para la proliferación de ambos vectores se cultivaron células Phoenix-Amph al 80% de confluencia en placas de 10 cm, se transdujeron por el método de precipitación en fosfato cálcico empleando 16 \mug de vector retroviral, 2,25 \mug del plásmido pMD.G que codifica para la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, y 16 \mug del plásmido pNGVL3-MLV que contiene el gen gag y un grupo de genes del virus de la leucemia murina (MLV). A las 24 horas tras dicha transducción, se reemplazó el medio y a las 48 horas se filtró el sobrenadante del cultivo a través de una membrana con un poro de 0,45 \mum para obtener sobrenadantes con alta concentración de dichos vectores.
Células. Las líneas celulares de linfocitos CD4+ empleadas en los ensayos de infección (MT2, Jurkat, PM1 y MOLT-4) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas células fueron mantenidas hasta su uso en suero fetal bobino inactivado. Las células mononucleares periféricas para la obtención de linfocitos T fueron aisladas a partir de donantes sanos empleando Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences), resuspendidas con fitohemaglutinina P (1 \mug/ml) e interleuquina-2 (IL-2) recombinante (100 U/ml) a 37ºC durante 48-72 horas, propagándose posteriormente en medio de cultivo completo en presencia de 100 U/ml de IL-2. Para la producción de los vectores virales se utilizó la línea celular Phoenix^{TM}, capaz de generar retrovirus que no requieren las partículas "helper" para su proliferación, suministrada por la ATCC (referencia SD-3514).
Anticuerpos. El anticuerpo policlonal frente a gp160, cedido por el Dr. Gustavo del Real (Centro Nacional de Biotecnología del CSIC) se generó utilizando como antígeno toda la proteína. El anticuerpo frente al receptor CD4 humano acoplado a ficoeritrina se adquirió a Pharmingen.
Cepas e infección de VIH. La cepa NL4.3 del virus del SIDA (Adachi, A., et al., J Virol, 1986. 59(2): 284-91) fue cedida por el Dr. José Alcamí (Instituto de Salud Carlos III, Madrid). La cepa 1936 es una cepa clínica crecida en linfocitos T primarios. La cepa ME46 fue obtenida a partir del "AIDS Resarch and Reference Reagent Program", al igual que la cepa CBL23 de VIH-2. La cepa quimérica VISH 89.6 fue cedida por el Dr. Gerrit Koopman (Biomedical Primate Research Centre, Países Bajos). Para la proliferación de las cepas de laboratorio se utilizaron células MT2, determinando el título viral mediante el método de dilución del punto final, tal y como se describe en Adachi, A., et al., J Virol, 1986. 59(2): 284-91 y en San José, et al. Virology, 1997. 239(2): 303-14. Las preparaciones virales obtenidas se añadieron a los distintos cultivos celulares durante 2 horas a 37ºC a las diferentes multiplicidades de infección tal y como se indica en cada experimento. Las células fueron entonces lavadas y cultivadas en nuevo medio. La replicación viral se determinó según la secreción de la proteína p24 de la cápside del VIH medida en el sobrenadante de los cultivos mediante inmunoensayo. La carga viral se determinó también por el número de moléculas del ARN codificado por el gen gag del VIH medida por PCR reversa (RT-PCR), empleando los oligonucleótidos SK431 y SK462 como cebadores de la reacción de PCR (Amplicor HIV-1, Roche Diagnostics Systems).
Transducción celular. La transducción con los vectores virales se realizó plaqueando 2x10^{6} células diana por pocillo en placas de 6 pocillos y resuspendiéndolas en 4 ml de sobrenadante conteniendo los vectores virales obtenido según se ha descrito anteriormente, al que se le había añadido 4 \mu/ml de polibreno. Para facilitar la transducción, se centrifugaron a 2000 rpm, 32ºC durante 90 minutos, y posteriormente se incubaron a 37ºC, 3 horas, diluyéndose por último en nuevo medio de cultivo. Para la transducción de los linfoblastos T el protocolo seguido fue esencialmente el mismo, excepto que las células se mantenían en presencia de IL-2 (100 U/ml) y que se plaqueaban 10x10^{6} células por pocillo con 5 ml de sobrenadante. En todos los casos, la transducción de las células diana se realizó en 2 o 3 rondas en intervalos de 24 horas, analizando después de la última ronda la eficiencia de la transducción mediante citometría de flujo.
Microscopía electrónica. Este análisis se llevó a cabo fundamentalmente según se describe en Hockley, D.J., et al., J Gen Virol, 1988. 69 (Pt 10): 2455-69. Así, se infectaban 3x10^{6} células a elevada multiplicidad de infección, y 48 horas después se fijaban en glutaraldehido (2,5%) y paraformaldehido (1%) en tampón de cacodilato sódico al 0.1M y pH 7.4. Se incubaban a temperatura ambiente durante 30 minutos o a 4ºC durante la noche, se lavaban tres veces en el mismo tampón, y posteriormente se fijaban en tetróxido de osmio al 1% en agua. Se trataban entonces con ácido tánico (0,15%) durante 1 minuto y acetato de uranilo acuoso (2%). A continuación, se deshidrataban las células en etanol a 4ºC y se embebían en resina epoxi (TAAD 812). Esta se cortaba en secciones finas con una cuchilla de diamante, que eran finalmente fijadas en acetato de uranilo y citrato de plomo para su examen al microscopio electrónico (Modelo JEM-1010).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
La expresión de CD4\varepsilon15 inhibe la formación de partículas víricas infectivas de VIH
Para estudiar el potencial de la expresión de CD4\varepsilon15 (figura IA) en el control de la replicación de VIH y poder hacer un seguimiento simultáneo de las células transducidas, se insertó dicha secuencia quimera en dos vectores bi-cistrónicos diferentes. El vector pCIE15 contiene un promotor híbrido de la expresión génica (LTR/CMV) que controla la expresión de la quimera CD4\varepsilon15, la cual, al estar seguida de una secuencia de señalización para entrada en el ribosoma (TRES, del inglés "Internal Ribosome Entry Site"), y la secuencia de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) se expresa siempre de forma ligada a la EGFP. Al vector sin dicha quimera se le denominó pCIE. El otro vector utilizado (pD15) fue similar, excepto porque su 5'LTR proviene del virus del sarcoma mieloproliferativo y además cuenta al inicio del 3'LTR con un elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis de la marmota. Dado que este vector deriva del retrovirus M387, se utilizó dicho retrovirus como vector control de pD15 sin quimera.
Para generar células transducidas se utilizó la línea celular MT2, una línea de células T muy sensible a la infección con VIH. Tras su infección con partículas del vector pCIE15, se obtuvo el clon de células transducidas C10. La infección con VIH de células MT2 provocó la formación de sincitios, partículas infectivas de VIH y liberación de la proteína p24 de la cápside a las 24 horas tras la infección, afectando a todas las células del cultivo a las 48 horas (figura 1B). Por el contrario, tras su infección con VIH, las células C10 transducidas no formaron sincitios (figura 1B) y el número de partículas infectivas generadas tras un solo ciclo de replicación de VIH disminuyó a 1/3 respecto a lo observado en el cultivo de células MT2 (figura 1C). Sin embargo la síntesis y liberación de la proteína p24 al medio de cultivo no se vio afectada tras 24 horas de infección.
El efecto protector de la expresión de la quimera CD4\varepsilon15 se potenció claramente después del primer ciclo de replicación de VIH, por lo que en células C10 apenas se detectó producción de partículas virales y síntesis de p24 a las 48 horas de la infección por VIH (figura ID). Mediante Tisis de las células transducidas de distintos clones originados por transducción de MT2 (C10, 2 y G11) infectadas con VIH, y posterior detección mediante técnicas inmunológicas ("western blot") pudo comprobarse que dichas células continuaban sintetizando el precursor gp160, pero éste no era procesado para originar gp120 (figura 1E).
Este experimento demostró que la transducción con CD4\varepsilon15 impide que se extienda la infección por VIH al prevenir su transmisión célula a célula a través de los sincitios y virus-a-célula al inhibir la formación de partículas infectivas.
\newpage
Ejemplo 2
La expresión de CD4\varepsilon15 inhibe la replicación de distintas cepas de VIH en distintas líneas celulares
Para excluir posibles influencias de la cepa viral, se infectaron cultivos de MT2 (figura 2A, barras blancas) y del clon transducido C10 (figura 2A, barras negras) a una multiplicidad de infección de 0,0001 con distintas cepas de VIH: NL4.3, ME46, la cepa de laboratorio CBL-23 del VIH-2 y la cepa VISH 86.9 (híbrido entre el VIS y el VIH). En todos los casos se apreció que la transducción con CD4\varepsilon15 inhibía la liberación de p24, siendo particularmente intensa tras varias rondas de replicación, alcanzando la inhibición 5 a 6 órdenes de magnitud (figura 2A).
Asimismo, para excluir posibles influencias del clon celular, se procedió a la transducción con pCIE15 y pD15 de células T de las líneas PM1, MOLT4, Jurkat y MT2, y se infectaron con la cepa NL4.3 del VIH-1 a baja multiplicidad. Tras la infección con NL4.3, se midió la liberación de la proteína p24 al medio de cultivo tras la infección (Dias p.i) y determinó el porcentaje de células infectadas en cada experimento fue determinado por citometría de flujo. La comparación de células transducidas con los vectores correspondientes sin la quimera CD4\varepsilon15 mostró que la inhibición de la replicación del VIH no dependía de la línea celular, ni del vector (figura 2B).
Especialmente interesante resultó la observación de que se lograba una protección frente a la infección por VIH incluso cuando sólo una minoría de las células del cultivo estaba transducida con la quimera. Así, cuando únicamente el 20% de las células PM1 estaban transducidas con pCIE15, se observó una reducción de 10 veces en la liberación de la proteína p24 de la cápside del VIH al medio. Un efecto similar se observó cuando sólo un 56% de las células Jurkat estaban transducidas con pD15. La inhibición más intensa de la replicación del VIH se observó en la línea celular MT2, en la que, cuando únicamente el 33% de las células del cultivo estaban transducidas (figura 2B, gráfica MT2), se observaba una reducción de 100.000 veces en la liberación de p24 al medio a los 7 días tras la infección con VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
La expresión de CD4\varepsilon15 ejerce un efecto protector en células vecinas no transducidas
La expresión de CD4\varepsilon15, al inhibir un paso tardío en la replicación del VIH (la maduración de su envuelta) sólo debería tener efecto en las mismas células que expresan la quimera, sin embargo los resultados muestran que la expresión de CD4\varepsilon15 en un porcentaje minoritario de las células de un cultivo es suficiente para proteger a las otras células de la infección por VIH (ver también ejemplo 2). Así, cuando se procedió a la infección con VIH-1 de células T primarias transducidas con el vector pCIE15 y se mezclaron en distintas proporciones con células T no transducidas, e igualmente cuando se mezclaron células T de la línea MT2 (no transducidas) y del clon C10 (transducidas con pCIE15) y se infectaron las mezclas con la cepa NL4.3, la replicación del VIH se bloqueó de forma casi completa. Esta inhibición se pudo observar incluso cuando sólo un 30% del cultivo provenía de las células que expresaban la quimera. Del mismo modo, el porcentaje de células T CD4+ en el cultivo primario de células T activadas con fitohemaglutinina e interleuquina-2 (que contiene tanto células T CD4 como CD8,) aumentó hasta asemejarse al de los cultivos no infectados con VIH, debido a que se redujo su mortalidad. Cuando los porcentajes de células transducidas eran menores (7% y 15%) el efecto inhibidor fue dependiente de la dosis, es decir a mayor porcentaje de células transducidas, mayor inhibición de la infección por VIH (figura 3A, derecha).
Aunque estos ensayos sugerían la existencia de un efecto protector en células no transducidas, podía aducirse que la medida mediante citometría de flujo del porcentaje de células que expresaban la proteína EGFP quizá estaba subestimando el número de células transducidas. Para excluir esta posibilidad se analizaron los efectos de infectar mezclas de cultivos de células C10 (transducidas) y de sus células parentales MT2 (no transducidas), con la cepa NL4.3 del VIH. Así, tras la infección de las mezclas de distintas proporciones de ambos tipos celulares, se evaluó la replicación del VIH analizando la liberación de p24 (cuantificada en pg/ml del medio) y estimando la carga viral (figura 3B, izquierda). Los resultados muestran como la expresión de la quimera CD4\varepsilon15 en tan sólo un 10% de la población celular protegió completamente frente a la replicación del VIH a toda la población, demostrando de forma evidente el efecto protector de esta expresión en las células no transducidas.
Para asegurar que la protección de las células no transducidas por parte del factor no requería contacto célula a célula se realizaron experimentos con placas que contienen pares de pocillos separadas por membranas con un poro de 0.4 pm y que por tanto permiten la difusión a su través de macromoléculas pero no de las células (figura 3C). Se crecieron cultivos de C10 o de MT2 en los pocillos superiores y sólo de MT2 en los pocillos inferiores. Posteriormente se infectaron ambos tipos de cultivos con VIH-1 y se evaluó su replicación determinando la liberación de la proteína p24 de su cápside, así como la formación de sincitios en las células. Se observó que cuando el pocillo superior contenía el clon C10 se reducía la replicación de VIH en el cultivo de MT2 del pocillo inferior de forma muy intensa, confirmando que no es necesario el contacto célula a célula.
\newpage
Ejemplo 4
El fragmento de la región C3-C5 de gp120 es suficiente para conferir protección frente a la infección por VIH a células transducidas y a las células no transducidas en un cultivo
Se centrifugaron cultivos de células T transducidas con CD4\varepsilon15 e infectadas con VIH-1 a alta multiplicidad de infección. El sobrenadante fue sometido a ultracentrifugación y el pellet, correspondiente a la fracción particulada, se sometió a nuevo fraccionamiento por ultracentrifugación en gradientes de iodixanol. En el gradiente formado, se seleccionaron las fracciones que contenían el factor soluble mediante experimentos de protección de células MT2 frente a la infección por VIH. Estas fracciones se fraccionaron nuevamente por ultracentrifugación en gradiente, obteniéndose 11 fracciones en las que se realizaron nuevos ensayos de protección. Mediante separación por electroforesis en geles de poliacrilamida de dichas fracciones se pudo identificar una proteína con un peso molecular de aproximadamente 30 KDa que sólo aparecía en la fracción protectora (figura 4A, señalada por la flecha). Se secuenció parcialmente dicha proteína y se encontró una identidad con un heptapéptido de la glicoproteína gp120 del virus VIH (secuencia aminoacídica SEQ ID NO:4, que fue denominado como SIMI -ver figura 4B). Estas mismas 11 fracciones se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, hibridándose dichas membranas con anticuerpos específicos frente a distintas regiones de gp120 y con una mezcla de sueros de pacientes seropositivos (técnica de "Western blot"). Se encontró que las proteínas que hibridaban con estos anticuerpos y sueros y que correspondían al factor protector (pues se detectaron únicamente en la fracción protectora), hibridaban asimismo con anticuerpos específicos que reconocen las regiones C3, C4 y V3 de gp120, respectivamente, pero no con los anticuerpos específicos para la región C1. Se comprobó mediante la misma técnica que este factor no hibridaba con anticuerpos frente a las proteínas p24 (cápside del VIH) y p17 (matriz del VIH).
Teniendo en cuenta tanto que el heptapéptido que presentaba homología con la secuencia SIM1 del factor se encontraba en la región V4 de gp120, como el peso molecular de dicho factor y su reactividad frente a anticuerpos anti-C3 y anti-C4, pero no a anticuerpos anti-C1, se planteó la posibilidad de que fuera un fragmento correspondiente al tercio C-terminal de gp120. Se diseñaron por tanto diversos vectores para la expresión de fragmentos de gp120 que contenían toda la secuencia de las regiones C3 a C5 de gp120 y que se diferencian en la presencia o no de la región V3 y de la secuencia N-terminal de gp41 (estos fragmentos se denominaron I, II, III y IV; véase la figura 4B). La inclusión en ciertas construcciones de esta secuencia N-terminal se debió al hecho de que con los datos disponibles no era posible distinguir si el factor antiviral procedía del procesamiento de gp120 ó del procesamiento del precursor gp160 (en este último caso incluiría parte del extremo N-terminal de pg41). El vector de expresión fue el pSR\alpha-leader HA, que contiene una secuencia líder para dirigir los distintos fragmentos (I, II, III o IV -ver figura 4B) de gp120 al retículo endoplasmático, permitiendo su secreción, y una secuencia que codifica por un epítopo HA fusionada al extremo N-terminal de dichos fragmentos, que permite su detección usando un anticuerpo anti-HA. Las construcciones se usaron para transducir células COS, recogiéndose muestras del cultivo celular a las 48 horas de la transducción. Estas muestras se centrifugaban y se realizaron ensayos de protección de células MT2 frente a la infección por VIH utilizando los sobrenadantes de dichas centrifugaciones.
El resultado fue que la construcción que codificaba por el fragmento III de gp120, es decir la correspondiente a la región C3-C5, fue la que confirió protección en el ensayo (figura 4C). La transducción de células T Jurkat con el fragmento III y posterior infección con VIH a dos multiplicidades de infección altas (0,1 y 0,5 partículas infecciosas/célula) demostró que la expresión de dicho fragmento era suficiente para la protección frente a VIH (Figura 4D). Se confirmó por tanto que el factor antiviral es un fragmento del extremo C-terminal de gp120 que corresponde a la secuencia C3-C5.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Polipéptido de la proteína gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.7
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(189)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región C3-C5 de la proteína gp120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido que codifica para la región C3-C5 de la proteína gp120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de direccionamiento a retivulo endoplasmático
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
5

Claims (22)

1. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) que comprende una secuencia con al menos un 70% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.
2. Polipéptido según la reivindicación anterior que comprende una secuencia con al menos un 90% de homología con la región C3-C5 de la proteína gp120 del virus.
3. Polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA (VIH) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la región C3-C5 es la SEQ ID NO: 1.
4. Polinucleótido capaz de codificar por un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Polinucleótido según la reivindicación anterior cuya secuencia es la SEQ ID NO:2.
6. Vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.
7. Vector según la reivindicación 6 que además comprende al menos una secuencia control que permite la expresión de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.
8. Célula transfectada capaz de producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende:
a.
un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, 6
b.
un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7.
9. Célula transfectada según la reivindicación anterior donde dicha célula es una célula madre hematopoyética o progenitora de células linfáticas.
10. Célula transfectada según la reivindicación 8 donde dicha célula es un linfocito T.
11. Célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde dichas células son de origen humano.
12. Composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención frente al virus del SIDA (VIH) que comprende:
a.
un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o
b.
un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, o
c.
un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, o
d.
una célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. Método para la obtención o identificación de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende:
a.
transfectar células hematopoyéticas, linfoblásticas, ó linfocitos T, con un polinucleótido quimérico que comprende la secuencia del receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica para una señal de retención a retículo endoplasmático de al menos 12 amino ácidos.
b.
infectar las células de la etapa (a) con al menos una cepa del virus del SIDA, y
c.
aislar al polipéptido capaz de inhibir el ciclo vital del virus del SIDA de la fracción soluble de un extracto obtenido a partir de las células infectadas de la etapa (b).
14. Método según la reivindicación anterior donde la señal de retención en el retículo endoplasmático es un fragmento de CD3\varepsilon de al menos 12 amino ácidos.
15. Método según la reivindicación 13 donde el fragmento de CD3\varepsilon tiene la secuencia seleccionada del grupo:
a.
la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
b.
secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
\newpage
16. Polinucleótido quimérico para llevar a cabo el método según la reivindicación 13 que comprende la secuencia que codifica para el receptor CD4 y una segunda secuencia que codifica para una señal de retención en el retículo endoplasmático de al menos 12 amino ácidos.
17. Polinucleótido quimérico según la reivindicación anterior donde la señal de retención en el retículo endoplasmático es un fragmento de CD3\varepsilon.
18. Polinucleótido quimérico según la reivindicación anterior donde el fragmento de CD3\varepsilon tiene la secuencia seleccionada del grupo:
a.
la SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
b.
secuencia con al menos un 75% de homología con SEQ ID NO:3 o variantes alélicas de la misma.
19. Célula transfectada hematopoyética, linfoblástica ó linfocito T, para llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 13-15 que comprende un polinucleótido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
20. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de una vacuna.
21. Uso de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 5 para la elaboración de una vacuna.
22. Uso de una célula transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la elaboración de una vacuna.
ES200700907A 2007-04-04 2007-04-04 Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida. Expired - Fee Related ES2324755B1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200700907A ES2324755B1 (es) 2007-04-04 2007-04-04 Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida.
PCT/ES2008/070065 WO2008122687A1 (es) 2007-04-04 2008-04-04 Polipéptido de la proteína gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200700907A ES2324755B1 (es) 2007-04-04 2007-04-04 Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2324755A1 ES2324755A1 (es) 2009-08-13
ES2324755B1 true ES2324755B1 (es) 2010-05-31

Family

ID=39830507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES200700907A Expired - Fee Related ES2324755B1 (es) 2007-04-04 2007-04-04 Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida.

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2324755B1 (es)
WO (1) WO2008122687A1 (es)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2181590C (en) * 1994-01-19 2009-01-06 Frank A. Robey Peptomers with enhanced immunogenicity
AU9678598A (en) * 1997-10-01 1999-04-23 Dana-Farber Cancer Institute Stabilization of envelope glycoprotein trimers by disulfide bonds introduced into a gp41 glycoprotein ectodomain
AU2003216927A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-22 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Novel therapeutic composition for the prevention and treatment of hiv-1 infection in humans
WO2007024976A2 (en) * 2005-08-23 2007-03-01 University Of Maryland Biotechnology Institute Virus coat protein/receptor chimeras and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAN JOSÉ, E., MUÑOZ-FERNÁNDEZ, M. A., ALARCÓN, B. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus Type-1 replication. Human Gene Therapy. Junio 1998, Vol. 9, N$^{o}$ 9, páginas 1345-1357. ISSN 1043-0342. *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2324755A1 (es) 2009-08-13
WO2008122687A1 (es) 2008-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2447115T3 (es) Vectores para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas
ES2384553T3 (es) Utilización de secuencias de adn de estructura triple para la transferencia de secuencias nucleotídicas
KR101790187B1 (ko) 신드비스 바이러스 외피 당단백질로 가성형태화된 렌티바이러스 벡터
ES2708856T3 (es) Vectores de transferencia de gen lentivírico y sus aplicaciones medicinales
ES2291025T3 (es) Celulas lentivirales de empaquetamiento.
US6235881B1 (en) Polypeptides encoded by novel HIV-2 proviruses
ES2718899T3 (es) Método para modificar la jerarquía de inmunodominio de gag del VIH mediante una vacuna de ADN que expresa regiones conservadas
ES2329768T3 (es) Poxvirus recombinantes para las proteinas quimericas del virus de inmunodeficiencia humana.
KR20160135740A (ko) 재조합 이스파한 바이러스 벡터
Perez et al. Suppression of HIV-1 infection in primary CD4 T cells transduced with a self-inactivating lentiviral vector encoding a membrane expressed gp41-derived fusion inhibitor
Kumar et al. Immunogenicity testing of a novel engineered HIV-1 envelope gp140 DNA vaccine construct
ES2326217T3 (es) Glicoproteinas quimericas mejoradas y vectores lentivirales pseudotipados.
ES2324755B1 (es) Polipeptido de la proteina gp120 capaz de inhibir el ciclo vital del virus del sida.
Wild et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model
CN111918880A (zh) 埃博拉病毒和马尔堡病毒糖蛋白粘蛋白样结构域替换表达系统用作新的疫苗方法
ES2329648T3 (es) Clones moleculares con genes mutados gag/pol de vih, gag de vis y env de vis.
ES2377829T3 (es) Mutantes de Vif del HIV
Poluri et al. Genetic therapy for HIV/AIDS
Miyake et al. Selective killing of human immunodeficiency virus-infected cells by targeted gene transfer and inducible gene expression using a recombinant human immunodeficiency virus vector
KR100969271B1 (ko) 제8 혈액응고 인자와 폰 빌리 블란트 인자 변이체의 재조합 발현 벡터 시스템
Neumann et al. Retroviral vectors for vaccine development: induction of HIV-1-specific humoral and cellular immune responses in rhesus macaques using a novel MLV (HIV-1) pseudotype vector
Gallinaro Integrase defective lentiviral vector as a vaccine platform for delivering HIV-1 antigens
US20140024100A1 (en) Measles viruses with reduced susceptibility to neutralization
Lang et al. Philip Podschwadt1, Anna Malyshkina1, Sonja Windmann1, Athanasios Papadamakis1, Leonie Kerkmann1, Dennis Lapuente2, Matthias Tenbusch2, Mengji Lu1, Michael Schindler3
KR100969268B1 (ko) 제8 혈액응고 인자와 폰 빌리 블란트 인자 변이체의 재조합 발현 벡터 시스템

Legal Events

Date Code Title Description
EC2A Search report published

Date of ref document: 20090813

Kind code of ref document: A1

FG2A Definitive protection

Ref document number: 2324755B1

Country of ref document: ES

FD2A Announcement of lapse in spain

Effective date: 20180912