WO2003076468A1 - Nueva composición terapéutica para prevenir y tratar la infección por vih-1 en humanos. - Google Patents

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WO2003076468A1
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Balbino José ALARCÓN SÁNCHEZ
María Ester SAN JOSÉ MARTÍNEZ
Irene Zaldivar Notario
Maite GÓMEZ BUENDÍA
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    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • HIV human immunodeficiency virus
  • gene therapy of AIDS patients can become an alternative for the future.
  • the goal of anti-HIV gene therapy would be to repopulate the hematopoietic compartment with genetically modified cells that have a survival advantage after being reinfused in the patient and can thus reconstitute an HIV-resistant immune system, or the destruction of cells infected by targeted toxins or by the immune system (Burchschacher, GL and Wong-Staal, F. 2001. Approaches to gene therapy for human immunodeficiency virus infection. Hum. Gene Ther. 12: 1013-1019).
  • CD4 a soluble form of CD4 interferes with the recognition of CD4 + host cells by HIV virions (Morgan, RA, Baler-Bitterlich, G., Ragheb, JA, Wong-Staal, F., Gallo , RC and Anderson, WF 1994.
  • AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 1507-1515; Morgan, RA, Looney, DJ, Meunchau, DD, Wongstaal, F., Gallo, RC, and Anderson, WF 1990.
  • Retroviral vectors expressing soluble CD4 A potential gene therapy for AIDS. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6: 183-191).
  • An alternative strategy, also based on CD4, consists in the intracellular expression of a modified form of CD4 that is retained in the endoplasmic reticulum (ER) due to the addition of a retention signal in the ER. This form of CD4 thus retained, can trap the gpl60 precursor glycoprotein in the ER and prevent its processing and maturation in the Golgi apparatus. Cells expressing this CD4 chimera would become incompetent to produce new infectious virions, although they themselves would be susceptible to infection.
  • ER endoplasmic reticulum
  • the CD4 ⁇ lO chimera was constructed that contained the complete CD4 sequence and the 10 amino acid sequence of the cytoplasmic stem of CD3 ⁇ and, therefore, would be anchored to the ER membrane. With the generation of stable transfectants of the CD4 ⁇ lO chimera in the Jurkat T cell line, it was demonstrated that the expression of the chimera made them resistant to HIV-1 infection (San Jose, E., Mu ⁇ oz-Fernández, MA and Alarcón, B. 1998.
  • Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum -retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus type-1 replication. Hum. Gene Ther. 9: 1345-1357). Moreover, the degree of inhibition correlated with the level of expression of the chimera.
  • beta-chemokines act only at the level of virus entry by blocking the binding of the virus to the CCR5 receptor and cannot inhibit viral replication once the virus enters the cell.
  • the present invention faces the problem of providing new treatments capable of preventing and treating HIV-1 infection in humans.
  • the solution provided by this invention is based on the fact that the inventors have observed that the expression of a genetic construct that allows the expression of a chimeric protein that retains the gpl60 glycoprotein of the HIV-1 envelope in the endoplasmic reticulum (ER) , for example CD4 ⁇ l5, in different types of positive CD4 cells has a protective effect of infection and replication of NIH-1 by trans effect, that is, in other positive CD4 cells not transduced with said chimeric protein
  • An object of the present invention is a soluble protective factor of CD4 positive cells against infection and replication of NIH-1 obtained from a supernatant of CD4 positive cells transduced with a chimeric protein, for example CD4 ⁇ l5, which retains to the gpl60 glycoprotein of the envelope of
  • a further object of the present invention is the use of a chimeric protein, CD4 ⁇ 5 for example, for the preparation and obtaining of a supernatant containing a soluble protective factor of CD4 cells positive against HIV infection and replication.
  • Another additional object of the present invention is a chimeric protein, for example CD4 ⁇ 5, whose expression in CD4 positive cells infected by
  • NIH-1 causes retention of the HIV-1 envelope glycoprotein in the ER and protects other non-transduced CD4 positive cells present in the same environment from HIV-1 infection.
  • Another additional object of the present invention is the use of the CD4 chimeric protein expression system and the soluble factor, mentioned above, in the elaboration of therapeutic compositions intended for the prevention and treatment of HIV-1 infection in humans.
  • the present invention provides new therapeutic compositions for the prevention and treatment of NIH-1 infection in humans (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) comprising the administration of a therapeutic amount of: a) a soluble protective factor of CD4 positive cells against infection and replication of NIH-1 obtained from a supernatant of CD4 positive cells sufficiently transduced with a CD4 chimeric protein, hereinafter chimeric protein of the invention, which contains the CD4 protein fused to a stem peptide cytoplasmic of the CD3 ⁇ subunit of the receptor for T lymphocyte antigen (TCR), for example CD4 ⁇ l5 or CD4 ⁇ lO, which retains the gpl60 glycoprotein from the NIH-1 envelope in the ER, or b) a chimeric protein expression system mentioned above in a) comprising a DNA sequence encoding the chimeric protein and subsequently retaining the gpl60 glycoprotein from the NIH-1 envelope and inducing a trans-protective effect of the CD4 positive cells
  • NIH-1 also refers to the NIH-1 and NIH-2 viral subtype, both subspecies of the NIEL species
  • the term "effective therapeutic amount” refers to the amount of soluble factor or expression system of the chimeric protein CD4 calculated to produce the desired effect.
  • positive CD4 cells transduced sufficiently with a chimeric protein refers to positive CD4 cells capable of releasing a soluble factor / s that confers protection to other CD4 cells. positive against infection and replication of NIH-1 and which can be obtained in low proportions with respect to the initial population of positive CD4 cells, such as levels of at least 5-10%.
  • chimeric CD4 protein refers to genetic constructs that allow expression in the cells transduced by said chimeric protein CD4 protein in an amount sufficient to cause retention of the gpl60 glycoprotein from the envelope of the NIH- 1 in the ER, prevent the exit of the NIH-1 from the cell and the infection of other positive CD4 cells from the environment by means of a trans effect.
  • a particular embodiment of the present invention of chimeric protein CD4 is for example, CD4 ⁇ 5 and CD4 ⁇ l0.
  • trans effect refers to the action of a product produced by a cell on another cell other than the one that produces it.
  • CD4 positive cells includes, first of all, lymphoid T-line cells, among others: T cells from the blood, thymus, spleen, lymph nodes or any another lymphoid organ, cells of T lymphocyte lines cultured in vitro, as well as lymphoblasts and T clones obtained by stimulation of T lymphocytes and any hematopoietic precursor from bone marrow, blood, thymus, cord umbilical, or any other location, that may result after differentiation to mature T lymphocytes; and, secondly, to other cells that present the CD4 receptor in their membrane as monocyte / macrophage line cells and dentritic cells and that are also infected by NIH-1.
  • lymphoid T-line cells among others: T cells from the blood, thymus, spleen, lymph nodes or any another lymphoid organ, cells of T lymphocyte lines cultured in vitro, as well as lymphoblasts and T clones obtained by stimulation of T lymphocytes and any hematopoietic
  • the chimeric protein expression system can be any expression system capable of expressing said protein in a functional manner, that is, capable of inducing protection against infection and replication of NIH-1 in CD4 positive cells by a trans effect.
  • said expression system is based on a retroviral vector based on the Moloney-MLN virus (pCJE-15) that has the advantage of allowing a higher level of transduction of the chimeras used compared to other vectors and of allowing The monitoring of transduced cells because they become green fluorescent cells and can be visualized under a microscope or analyzed by flow cytometry.
  • the chimeric protein expression system contains the sequence of AD ⁇ (SEQ ID ⁇ O1) encoding the fusion protein CD4 ⁇ l5 (SEQ ID ⁇ O 2) or the sequence of AD ⁇ encoding the construction CD4 ⁇ lO (San Jose, E., Mu ⁇ oz-Fernández, MA and Alarcón, B. 1998. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human j-mmunodeficiency Virus type-1 replication Hum. Gene Ther. 9 : 1345-1357).
  • the AD ⁇ sequence encoding the chimeric protein of the present invention may, in a particular embodiment, be operably linked to a transcription regulatory region.
  • transcription regulatory region includes all the elements necessary for transcription and may include elements necessary for the regulation and specific transcription of the cell.
  • a transcription regulatory region includes at least one promoter, and may optionally include other regulatory sequences such as enhancers and transcription factor binding sites.
  • operably linked refers to a juxtaposition where the components involved are positioned so that they can function in the desired manner; for example, a promoter is operatively linked to a coding sequence if the promoter affects its transcription or expression.
  • the transcription regulatory region to which the DNA sequence encoding the chimeric protein of the present invention is operatively linked may be any known regulatory region, for example, a cytomegal virus (CMV) regulatory region (see Example 1).
  • CMV cytomegal virus
  • said expression system is a pCIE-15 virus, which contains the nucleotide sequence SEQ ID NO1 and that allows the expression of the CD4 ⁇ 5 protein (SEQ ID NO 2).
  • Another additional object of the present invention is the use of the soluble trans protective factor of CD4 positive cells or of the supernatant in which it is found, obtained according to the present invention, in the preparation of a medicament for the prevention and treatment of infection. for HIV-1 in humans.
  • Another additional object of the present invention is the use of the CD4 chimeric protein expression system, object of the present invention, in the elaboration of clinical gene therapy protocols for the treatment and prevention in humans of HIV-1 infection, comprising the following steps: a) the extraction of CD4 positive cells from an HIV-1 patient, b) the ex vivo transduction of the positive CD4 cells obtained in a) with an expression system of the CD4 chimeric protein of the present invention that retains gpl60 glycoprotein from the envelope of the VEH-1 in the ER and that promotes the protection in trans of uninfected positive CD4 cells from the patient against infection and replication of HIV-1, and c) administration of the supernatant and / or CD4 positive, infected and healthy cells, from the previous step b) in the donor patient with HIV; or comprising the following steps: a) direct administration of a vector encoding the CD4 chimeric protein to an HIV-1 patient, b) the expression of the CD4 chimeric protein by the patient's cells transduced
  • compositions usable in the gene therapy protocols are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the preparation of medicaments, excipients. and vehiculizing compositions of genetic material.
  • the invention also relates to the use of the chimeric protein expression system in a process for preparing and obtaining a soluble protective factor in trans positive CD4 cells against HIV infection and replication by the following steps: a) transduction of CD4 positive cells by an expression system that encodes the chimeric protein, b) promote infection of a) CD4 positive cells by HIV-1 by contacting said CD4 positive cells and HIV-1, and c ) collection of the culture supernatant of said transduced and infected CD4 positive cells where the soluble factor is found.
  • a particular embodiment of the present invention is a process for preparing and obtaining a soluble protective factor in trans positive CD4 cells against infection and replication of HIV-1
  • the expression system is pCIE-15 encoding the chimeric protein CD4 ⁇ l5
  • CD4 positive cells come from healthy human donors or infected with VLH-1 (in a VJ-Hl patient there may be positive CD4 cells infected or not by HIV-1) (see example 3 and 5 of the present invention ) and HIV-1 comes from an infectious HIV-1 strain.
  • FIG. 1 Retroviral constructions.
  • the pKB construction previously used (San Jose, E., Mu ⁇ oz-Fernández, MA and Alarcón, B. 1998) is shown at the top.
  • Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human hrimunodeficiency Virus type-1 replication. Hum. Gene Ther. 9: 1345-1357).
  • the construction pCJE-15 used in the present studies is indicated at the bottom.
  • Figure 2. Transduction protocol.
  • Figure 3. Inhibition of the release of p24 by MT-2 cells transduced with CD4 ⁇ 5.
  • MT-2 cells were transduced either with the pCIE-15 construct, or with the empty vector (pCLE); they were cloned by limit dilution and selected according to the expression of EGFP.
  • Figure 4 Inhibition of the release of p24 in a non-clonal population of MT-2 cells transduced with CD4 ⁇ 1.
  • MT-2 cells were transduced with pCIE-15 or with the empty vector (pCIE).
  • GFP marker expression was analyzed 48 h after transduction by flow cytometry. The percentage of positive cells in each case is indicated.
  • the non-transduced MT-2 cells and the population of transduced MT-2 cells were infected with VEH-1 at an mdi of 0.001.
  • the figure shows the release of p24 on day 10 of the infection, when the infection levels had reached a maximum.
  • FIG. 5 Inhibition of VTH-1 replication in a mixture of transduced and non-transduced MT-2 cells- The CIO clone from transduced MT-2 cells was mixed, in the indicated percentages (figure legend), with MT-2 non-transduced cells and mixtures were infected with HIV-1 at an mdi of 0.001. The release of p24 was followed to estimate the degree of replication of VJ-H-1.
  • Figure 6. Inhibition of the release of p24 in human T lymphoblasts by transduction of CD4 ⁇ 5. Human PBMCs were stimulated with PHA and IL-2 and 48 h later transduced with retroviral supernatant. Transduced cells were mixed with untransduced cells from the same donor in different proportions and the percentage of GFP + cells was estimated by flow cytometry before infection with VEH-1 (figure legend).
  • Figure 7 Inhibition of HIV-1 replication in a two chamber experiment.
  • MT-2 non-transduced cells were placed in the lower well of a set of two wells separated by a membrane with a pore diameter of 0.4 ⁇ m.
  • the upper chamber was filled well with non-transduced MT-2 cells, or with the CIO clone expressing CD4 ⁇ 5.
  • the NU ⁇ -1 in both chambers was inoculated at an mdi of 0.001 and the replication of the NEH-1 was examined on the indicated days, according to the formation of syncytia and cytopathic effect (crosses) and also the release of p24 ( indicated in ng / ml).
  • FIG. 8 Anti-HIV-1 effect of the supernatant produced in the CIO clone expressing CD4 ⁇ 5.
  • Culture supernatants from the CIO clone infected or not infected with strain p ⁇ L4.3 of VEB-1 were collected at a mdi of 2.5 after 48 h of infection and added at dilutions 1: 2, 1: 4 and 1:10 on cultures of MT-2 cells that were subsequently infected with VEH-1 at an mdi of 0.001.
  • the release of p24 was measured on the indicated days to continue infection with VEH-1.
  • Figure 9. Protocol to test in vivo the anti-HIV-1 effects of transduction with CD4 ⁇ 5.
  • Figure 10. Effect of transduction with CD4 ⁇ l5 on the replication of HIV-1 in SCID-huPBL mice.
  • the protocol of Figure 9 was followed to populate SCED mice with human PBMCs in the peritoneum. Lymphoblasts from the same donor were transduced either with pCIE-15 to express the CD4 ⁇ 5 chimera (mice A, B, C, D, E), either with the empty vector (mice 1, 2, 3, 4, 5) and inoculated with VEH-l. Mice 1, 2, 3, A, B and C were sacrificed on day 2 post-infection. Mice 4, 5, D and E were sacrificed on day 6 post-infection.
  • the viral load was estimated by PCR from the peripheral washes of said mice and expressed as the number of copies of R ⁇ A of HIV per ml of fluid.
  • the protective effect of the expression of the CD4 ⁇ 5 genetic construct in different types of T lymphocytes, among other types of CD4 cells, on the replication and infection of VEH-1 in humans, in addition to previously advanced retention in the ER of viral envelope glycoproteins (San Jose, E., Mu ⁇ oz-Fernández, MA and Alarcón, B. 1998.
  • Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus type-1 replication. H ⁇ m Gene Ther. 9: 1345-1357), is produced by trans effect.
  • the transduced cells become green fluorescent cells and can be visualized in the microscope or analyzed by flow cytometry, Example 1).
  • the MT-2 cell line was transduced with the pCIE-15 vector or with the empty vector (pCIE).
  • pCIE empty vector
  • VEH-1 replication was abolished when the chimeric CD4 ⁇ 5 protein was expressed in percentages as low as 10% of the total population ( Figure 5, gray square line). This result indicates that the expression of the chimeric protein effectively has a trans effect that inhibits infection and replication of VEH-1 in non-transduced MT-2 cells.
  • MT-2 is a T cell line transformed by the HTLV-I virus.
  • an experiment similar to that shown in Figure 4 was performed with human T lymphoblasts derived from a healthy donor and transduced with the pCLE-15 vector that allows the expression of the chimeric protein CD4 ⁇ l5.
  • the culture supernatant obtained from the clone transduced with CD4 ⁇ 5 and infected with HIV-1 inhibited the replication of VEH-1 when added to MT-2 cells ( Figure 8), compared with the culture supernatant from the uninfected clone .
  • Figure 8 the nature of the soluble factor is still unknown, we know that cells transduced with the CD4 ⁇ 5 chimeric protein do not produce ⁇ and ⁇ interferons (data not shown) and that these factors are not, therefore, responsible for the effect on trans.
  • the soluble factor is found in this supernatant, which would allow the preparation of a drug from it intended for the prevention and treatment of infection with VEH-1.
  • the ability of the chimeric protein CD4 ⁇ 5 to inhibit the replication and infection of HIV-1 in an animal model has been determined to bring the results to the possible clinical use of the expression thereof in therapy protocols. gene of HIV-1 infection in humans.
  • a scheme of the protocol followed is shown in Figure 9.
  • the expression of the chimeric CD4 ⁇ 5 protein in a low percentage of human cells also reduced the replication of VEH-1 both at day 2 and at day 6 after infection ( Figure 10).
  • a retroviral vector based on the vector derived from Moloney-MLV virus has been used.
  • This vector has an IRES sequence that allows the transcription of a bicistronic mRNA encoding the GFP fluorescent marker and the protein of interest, in this case CD4 ⁇ l5 (construction pCIE-15, Figure 1).
  • CD4 ⁇ l5 construction pCIE-15, Figure 1.
  • the MT-2 cell line was transduced with the pCIE-15 construct or with the empty vector (pCIE). Both populations were cloned by limit dilution and clones were selected that stably express the constructs according to GFP expression. Two of these clones were infected with VrH-1 (strain pNL4.3), the CIO clone expressing CD4 ⁇ 5 and clone 6 transduced with the empty vector, at a multiplicity of infection (mdi) of 0.001 and as a replication marker The release of the p24 viral antigen to the culture supernatant was followed over several days.
  • Example 3 Really low levels of transduced CD4 ⁇ 5 cells produce trans protection against VTH-1.
  • the CIO clone which stably expresses the CD4 ⁇ 5 chimera, was mixed in different proportions with the non-transduced MT-2 cells (0, 10, 20, 40, 60, 80 and 100%), and the mixture was infected with V3H-1 at one mdi of 0.001.
  • the release of p24 was followed to estimate the degree of EBV-1 replication.
  • VEH-1 replication was abolished when the CD4 ⁇ 5 chimera was expressed in percentages as low as 10% of the total population ( Figure 5). This result indicates that chimera expression effectively has a trans effect that inhibits the replication of VEH-1 in non-transduced MT-2 cells.
  • MT-2 is a T cell line transformed by the HTLV-I virus.
  • an experiment similar to that shown in Figure 4 was performed with T lymphoblasts derived from a healthy donor and transduced with CD4 ⁇ l5 .
  • Human PBMCs were stimulated with PHA and IL-2 and 48 h later transduced with retroviral supernatant to obtain approximately 23% CD4 ⁇ 5 expression.
  • these modified cells were mixed with cells from the same donor without transducing to obtain cultures with different percentage of CD4 ⁇ 5 expression (6%, 11% and 23%).
  • Example 4.- The trans effect of CD4 ⁇ 5 expression is mediated by a soluble factor.
  • the clone expressing CD4 ⁇ 5 was placed in the upper chamber and the parental line MT-2 in the lower chamber, separated by a 0.4 ⁇ m pore membrane and, as a control, the parallel same experiment with non-transduced MT-2 cells placed in both chambers. Both cell populations were infected with HIV-1 at an mdi of 0.001 and viral infection was followed over 2 weeks according to the release of p24 and the formation of syncytia and cytopathic effect (Lifson JD, Reyes GR McGrath MS, Stein BS, Engleman EG. AIDS retrovirus induced cytopathology: giant cell formation and involvement of CD4 antigen. Science. 1986. 232 (4754): 1123-7).
  • the culture supernatants of the CIO clone infected or not infected with the strain pNL4.3 of VEH-1 were collected at a mdi of 2 , 5 after 48 h of infection and were added at dilutions 1: 2, 1: 4 and 1:10 on cultures of MT-2 cells that were subsequently infected with EBV-1 at a mdi of 0.001.
  • the release of p24 was measured on the indicated days to continue infection with VEH-1.
  • the ability of the CD4 ⁇ l5 chimera to inhibit the replication of VflT-1 in an animal model to bring the results to the possible clinical use of the chimera was tested.
  • the model consists of the use of immunocompromised SCEO mice repopulated intraperitoneally with human PBMC. These mice are infused intraperitoneally with T lymphoblasts from the same human donor, transduced with the different constructs two weeks later. These mice are infected one day later by injecting T lymphoblasts infected with VEH-1 ex vivo, and the progress of the infection is followed by estimating the viral load in the peritoneum. A scheme of the protocol followed in Figure 9 is shown.
  • the expression of the CD4 ⁇ 5 chimera in a low percentage of human cells also reduced the replication of HIV-1 both on day 2 and 6 after infection (AE mice) (assessed by the viral load determined by PCR from the peripheral washes of said mice and expressed as the number of RNA copies of Vffl-1 per ml of fluid).
  • Plasmids, cell lines, animals and reagents are identified in the following Materials and Methods section, as well as a detailed description of the assays used in these Examples.
  • MATERIALS AND METHODS Cell lines The Jurkat and MT-2 lymphoblast T cell lines (from the ATCC) were used. Both were grown in RPMI 1640 medium in the presence of 5% fetal bovine serum.
  • Peripheral blood T lymphocytes were obtained from healthy donors and were isolated by density gradient centrifugation in Ficoll Hypaque. They were stimulated for 48 hours with recombinant human IL-2 (10OO / ml) and PHA (10 ⁇ g / ml) in RPMI medium with fetal bovine serum and after that time the cells were grown in complete medium with IL-2.
  • the Phoenix packaging cell line comes from the 293T line (human embryonic kidney line transformed with the adenovirus El protein) that stably expresses the gag pol and env proteins of the Moloney leukemia mouse virus (MLV) stably. It is grown in DMEM medium in the presence of 5% fetal bovine serum.
  • Viral preparations were generated by infecting MT-2 cells with ⁇ NL4.3 and the culture supernatant was collected when the cells exhibited cytopathic effect (ECP). This viral preparation was titrated to limit dilution in MT-2 and the result obtained is given in TCEDso / ml form.
  • the cells to be infected (Jurkat, MT-2, peripheral blood lymphocytes) were resuspended in the volume of the viral stock necessary for the multiplicity of infection (mdi) indicated in each case. They were kept at 37 ° C for 2 hours to allow viral adsorption and subsequently the cells were washed and left in complete medium. Culture supernatant was collected twice a week to detect the p24 antigen secreted into the medium. This protein was detected by a commercial ELISA (Innogenetics, Ghent, Belgium) by inoculating 100 ⁇ l / sample and calculating the protein concentration by extrapolation with a standard curve. The data is express in pg / ml. The evolution of the infection is also followed by observing in the cultures the appearance of syncytia (SI) or cytopathic effect (ECP).
  • SI syncytia
  • ECP cytopathic effect
  • Retroviral constructions The bicistronic retroviral vector used in this work is based on Mo-MLV and is called pLZRS-CMV-IRES-gfp (Abad JL, Serrano F, San Román AL, Delgado R, Bernad A, González MA. Single-step, multiple retroviral transduction of human T cells. J Gene Med 2001. 3: 1-12)
  • the CD4 ⁇ l5 chimera has been cloned into the Xl oI / BamHI sites.
  • the construction pCEB corresponds to the empty vector and pCEE-15 corresponds to the vector with CD4 ⁇ l5. Generation of viral supernatants expressing CD4 ⁇ l5.
  • the Phoenix packaging cell line derived from 293T, was transfected by calcium phosphate with the retroviral vector pCIE or pCEE-15, with the gag-pol sequences derived from MLV and with the G protein of the vesicular stomatitis virus as enveloped. After 48h the supernatants of these transfections were collected and used to transduce Jurkat, MT-2 cells or peripheral blood lymphocytes. The cells were subjected to three rounds of transduction, first incubating the supernatants with the cells for 90 min at 32 ° C and centrifuging them simultaneously at 1500 rpm. After this, they were incubated overnight at 37 ° C. They were analyzed for GFP expression after 6 days of the first round of transduction.
  • Viral RNA detection The supernatants of the cultures to be analyzed were collected and the viral load was detected by a commercial Kit (Amplicor HIV-1 monitor test version 1.5, Roche, Barcelona, Spain) (Correa, R and Mu ⁇ oz-Fernandez, MA. 2001. Viral phenotype affects the thymic production of new T cells in HJN-1-infected children. AIDS 15: 1959-1963.). Initially, the R ⁇ A is extracted from the samples and by action of the retrotranscriptase, cD ⁇ A is obtained which is subjected to 30 cycles of amplification. This cD ⁇ A hybridizes with a specific probe for the gag gene and is revealed with a peroxidase-linked conjugate.
  • mice were analyzed for each experiment, 5 of which were repopulated with healthy donor lymphocytes transduced with the empty vector and the other 5 with human donor lymphocytes transduced with CD4 ⁇ 5.
  • Mice were injected intraperitoneally with resting lymphocytes and then with transduced lymphoblasts. 24 h later, lymphoblasts from the same donor infected with NEFJ-1 were injected into high multiplicity of infection. Mice were sacrificed several days after infection and a peritoneal lavage was performed to analyze the viral load by RT-PCR (Correa, R and Mu ⁇ oz-Fernandez, MA. 2001. Viral phenotype affects the thymic production of new T cells in HIV-1-infected children. AIDS 15: 1959-1963.).

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Abstract

En la presente invención se ha definido por primera vez el efecto protector en trans de la expresión de la construcción genética CD4•15, entre otras, en distintos tipos de células CD4 positivas sobre la replicación e infección del VIH-1 en humanos. Un objeto de la presente invención lo constituye una composición terapéutica constituida por un factor soluble protector de células CD4 positivas que se obtienen a partir de un sobrenadante de células CD4 positivas transducidas con una proteina quimérica, por ejemplo CD4•15, ó por un sistema de expresión de la proteina quimérica CD4. Un objeto adicional lo constituye el empleo de ambas composiciones terapéuticas en el tratamiento y prevención de la infección por VIH-1 en humanos.

Description

NUEVA COMPOSICIÓN TERAPÉUTICA PARA PREVENIR Y TRATAR LA INFECCIÓN POR VIH-1 EN HUMANOS
SECTOR DE LA TÉCNICA
Tratamiento y prevención de la infección provocada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Factores solubles protectores de linfocitos T, entre otras células CD4 positivas, y nuevas terapias génicas para el tratamiento de pacientes infectados por VIH.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Dada la alta tasa de mutación y la rápida aparición de imitantes del virus de la inmunodeíϊciencia humana (VIH) resistentes a las farmacoterapias existentes, la terapia génica de los pacientes con SIDA puede convertirse en una alternativa de futuro. La meta de la terapia génica anti-VIH sería bien la repoblación del compartimento hematopoyético con células modificadas genéticamente que tengan una ventaja de supervivencia tras ser reinfundidas en el paciente y que puedan así reconstituir un sistema inmunitario resistente al VIH, o bien la destrucción de las células infectadas mediante toxinas dirigidas o mediante el sistema inmunitario (Burchschacher, G.L. y Wong-Staal, F. 2001. Approaches to gene therapy for human immunodeficiency virus infection. Hum. Gene Ther. 12: 1013-1019). Entre las estrategias basadas en la interferencia con la replicación viral, se está estudiando la inhibición de genes reguladores de VIH (entre las que las más avanzadas consisten en el uso de imitantes de Rev), la inhibición de la fusión de la membrana de la envuelta vírica con la membrana de la célula huésped, ó la inhibición de la maduración de las proteínas víricas (Patente US 6043081, Expression vectors encoding recombinant proteins comprising a VPR/VPX virion incorporation domain for targeting into HIV-1 or HIN-2 virions). El hecho de que CD4 sea el receptor para el VIH lo convierte en un buen candidato para la elaboración de diversas estrategias de terapia génica. Por ejemplo, se ha mostrado que una forma soluble de CD4 interfiere con el reconocimiento de las células huésped CD4+ por los viriones de VIH (Morgan, R.A., Baler-Bitterlich, G., Ragheb, J.A., Wong-Staal, F., Gallo, R.C. y Anderson, W.F. 1994. Further evaluation of sCD4 as an anti-HIV gene therapy: Demonstration of protection of primary human peripheral blood lymphocytes f om infection by fflV-1. AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 1507-1515; Morgan, R.A., Looney, D.J., Meunchau, D.D., Wongstaal, F., Gallo, R.C., y Anderson, W.F. 1990. Retroviral vectors expressing soluble CD4: A potential gene therapy for AIDS. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6: 183-191). Una estrategia alternativa, basada también en CD4, consiste en la expresión intracelular de una forma modificada de CD4 que es retenida en el retículo endoplásmico (RE) debido a la adición de una señal de retención en el RE. Esta forma de CD4 así retenida, puede atrapar a la glicoproteína precursora gpl60 en el RE y prevenir su procesamiento y maduración en el aparato de Golgi. Las células que expresen esta quimera de CD4 se convertirían en incompetentes para producir viriones infecciosos nuevos, aunque ellas mismas serían susceptibles a la infección. Hace una década el laboratorio de John Rose publicó que la expresión de una forma soluble de CD4 (carente de los dominios transmembránico e intracitoplásmico) con la secuencia de retención en el RE Lys-Asp-Glu-Leu añadida a su extremo C-terminal, inhibe la maduración de gpl60 (Buonocore, L. y Rose, J.K. 1990. Prevention of HIN-1 glycoprotein transport by soluble CD4 retained in the endoplasmic reticulum. Νature 345: 625-628; Buonocore, L. y Rose, J.K. 1993. Blockade of human immunodeficiency virus type 1 production of CD4+ T cells by an intracellular CD4 expressed under control of the viral long terminal repeat. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2695-2699). Por las mismas fechas se describió la existencia de una señal de retención en el RE presente en el tallo citoplásmico de la subunidad CD3ε del receptor para el antígeno de los linfocitos T (TCR) (Mallabiabarrena, A., Fresno, M. y Alarcón, B. 1992. An endoplasmic reticulum retention signal in the CD3ε chain of the T cell receptor. Nature 357: 593-596; Mallabiabarrena, A., Jiménez, M.A., Rico, M. y Alarcón, B. 1995. A tyrosine- containing motif mediates ER retention of CD3ε and adopts a helix/turn structure. EMBO J. 14: 2257-2268). Pensamos que la presencia del anclaje a membrana podría presentar ventajas comparando con la quimera de CD4 soluble utilizada anteriormente porque permitiría alcanzar concentraciones más altas de la quimera en la membrana del RE, donde está gpl60, y no en el lumen. Se construyó la quimera CD4εlO que contenía la secuencia completa de CD4 y la secuencia de 10 aminoácidos del tallo citoplasmático de CD3ε y que, por lo tanto, estaría anclada a la membrana del RE. Con la generación de transfectantes estables de la quimera CD4εlO en la línea celular T Jurkat se demostró que la expresión de la quimera las convertía en resistentes a la infección por VIH-1 (San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. y Alarcón, B. 1998. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus type-1 replication. Hum. Gene Ther. 9: 1345- 1357). Es más, el grado de inhibición se correlacionaba con el nivel de expresión de la quimera.
Por otro lado, distintos autores han observado que la producción endógena de beta-quimioquinas por células CD4 positivas de enfermos infectados por VIH-1 asintomáticos pueden suprimir la replicación de HIN (Saha, K., et al., J Nirology 1998; 72: 876-881). Sin embargo, estas beta-chemokinas actúan solamente a nivel de la entrada del virus mediante el bloqueo de la unión del virus al receptor CCR5 y no pueden inhibir la replicación viral una vez que el virus entra en la célula. Posteriormente, estos mismos autores han descrito el desarrollo de unos clones de linfocitos T CD4+ obtenidos a partir de un paciente NIH-1 positivo asintomático inmortalizados, resistentes a la infección de NIH-1, que secretan un factor soluble, de naturaleza desconocida, capaz de inhibir la infección de linfocitos por NIH-1 (Solicitud PCT de Patente US 20010051373, T-cell clones expressing anti-NIH-1 factors). Hallazgos futuros de factores solubles producidos por las propias células T y que induzcan la protección de linfocitos T no infectados por NIH-1, y cuya obtención pueda controlarse de forma más precisa mediante técnicas de ingeniería genética, pueden permitir avances significativos en el tratamiento y prevención de la infección por NIH-1.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN BREVE DESCRIPCIÓN La presente invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevos tratamientos capaces de prevenir y tratar la infección del VIH-1 en humanos.
La solución proporcionada por esta invención se basa en el hecho que los inventores han observado que la expresión de una construcción genética que permite la expresión de una proteína quimérica que retiene la glicoproteína gpl60 de la envuelta del VIH-1 en el retículo endoplásmico (RE), por ejemplo CD4εl5, en distintos tipos de células CD4 positivas presenta un efecto protector de la infección y replicación del NIH- 1 por efecto trans, es decir, en otras células CD4 positivas no transducidos con dicha proteína quimérica.
Un objeto de la presente invención lo constituye un factor soluble protector de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del NIH-1 que se obtiene a partir de un sobrenadante de células CD4 positivas transducidas con una proteína quimérica, por ejemplo CD4εl5, que retiene a la glicoproteína gpl60 de la envuelta del
NIH-1 en el RE.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo de una proteína quimérica, CD4εl5 por ejemplo, para la elaboración y obtención de un sobrenadante que contiene un factor soluble protector de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del VIH.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye una proteína quimérica, por ejemplo CD4εl5, cuya expresión en células CD4 positivas infectadas por
NIH-1 provoca la retención de la glicoproteína de la envuelta del VIH-1 en el RE y protege de la infección VIH-1 a otras células CD4 positivas no transducidas presentes en el mismo entorno.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo del sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 y del factor soluble, anteriormente mencionados, en la elaboración de composiciones terapéuticas destinadas a la prevención y tratamiento de la infección por VIH-1 en humanos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona nuevas composiciones terapéuticas para la prevención y el tratamiento de la infección del NIH-1 en humanos (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, SIDA) que comprenden la administración de una cantidad terapéutica de: a) un factor soluble protector de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del NIH-1 que se obtiene a partir de un sobrenadante de células CD4 positivas transducidas suficientemente con una proteína quimérica CD4, en adelante proteína quimérica de la invención, que contiene la proteína CD4 fusionada a un péptido proveniente del tallo citoplasmático de la subunidad CD3ε del receptor para el antígeno de los linfocitos T (TCR), por ejemplo CD4εl5 ó CD4εlO, que retiene a la glicoproteína gpl60 de la envuelta del NIH-1 en el RE, ó b) un sistema de expresión de la proteína quimérica anteriormente mencionada en a) que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína quimérica y que posteriormente retiene a la glicoproteína gpl60 de la envuelta del NIH-1 e induce un efecto protector en trans de las células CD4 positivas no transducidas frente a la infección y replicación del VIH- 1.
Tal como se utiliza en esta invención, el término "NIH-1" se refiere de igual forma al subtipo viral NIH-1 y NIH-2, ambas subespecies de la especie NIEL
Tal como se utiliza en esta invención, el término "cantidad terapéutica efectiva" se refiere a la cantidad de factor soluble o de sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 calculada para producir el efecto deseado.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta invención, el término "células CD4 positivas transducidos suficientemente con una proteína quimérica" se refiere a células CD4 positivas capaces de liberar un/os factor/es soluble/s que confiere/n protección a otros células CD4 positivas f ente a la infección y replicación del NIH-1 y que pueden obtenerse en bajas proporciones con respecto a la población inicial de partida de células CD4 positivas, como por ejemplo niveles de al menos 5-10%.
Tal como se utiliza en la presente invención "proteína quimérica CD4" se refiere a construcciones genéticas que permiten la expresión en las células transducidas por dicha proteína quimérica CD4 de proteína en cantidad suficiente para provocar la retención de la glicoproteína gpl60 de la envuelta del NIH-1 en el RE, impedir la salida del NIH-1 de la célula y la infección de otros células CD4 positivas del entorno mediante un efecto en trans. Una realización particular de la presente invención de proteína quimérica CD4 es por ejemplo, CD4εl5 y CD4εl0.
En el sentido que se utiliza en la presente invención "efecto en trans" se refiere a la acción de un producto producido por una célula sobre otra célula distinta a la que lo produce.
En el sentido utilizado en esta invención la expresión "células CD4 positivas" incluye, en primer lugar, a células de estirpe linfoide T, entre otras: células T procedentes de la sangre, del timo, del bazo, de los ganglios linfáticos o de cualquier otro órgano linfoide, células de líneas de linfocitos T cultivados in vitro, así como a linfoblastos y clones T obtenidos por estimulación de linfocitos T y cualquier precursor hematopoyético procedente de la médula ósea, de la sangre, del timo, de cordón umbilical, o de cualquier otra localización, que pueda dar lugar tras diferenciarse a linfocitos T maduros; y, en segundo lugar, a otras células que presenten el receptor CD4 en su membrana como células de la línea monocitos/macrófagos y células dentríticas y que son infectadas también por el NIH-1. El sistema de expresión de la proteína quimérica puede ser cualquier sistema de expresión capaz de expresar dicha proteína de forma funcional, es decir, capaz de inducir protección frente a la infección y replicación del NIH-1 en células CD4 positivas por un efecto en trans. En una realización particular, dicho sistema de expresión se basa en un vector retroviral basado en el virus Moloney- MLN (pCJE-15) que presenta la ventaja de permitir un mayor nivel de transducción de las quimeras utilizadas en comparación con otros vectores y de permitir el seguimiento de las células transducidas porque se convierten en células fluorescentes verdes y pueden ser visualizadas en el microscopio o ser analizadas por citometría de flujo. En otra realización particular, el sistema de expresión de la proteína quimérica contiene la secuencia de ADΝ (SEQ ID ΝO1) que codifica la proteína de fusión CD4εl5 (SEQ ID ΝO 2) ó la secuencia de ADΝ codificante de la construcción CD4εlO (San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. y Alarcón, B. 1998. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human j-mmunodeficiency Virus type-1 replication. Hum. Gene Ther. 9: 1345-1357). La secuencia de ADΝ que codifica la proteína quimérica de la presente invención puede estar, en una realización particular, operativamente enlazada a una región reguladora de la transcripción. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "región reguladora de la transcripción" incluye a todos los elementos necesarios para la transcripción y puede incluir elementos necesarios para la regulación y transcripción específica de la célula. Por tanto, una región reguladora de la transcripción incluye, al menos, un promotor, y puede incluir, opcionalmente, otras secuencias reguladoras tales como potenciadores y sitios de unión del factor de transcripción.
Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes implicados están situados de manera que pueden funcionar en la forma deseada; por ejemplo, un promotor está operativamente enlazado a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión.
La región reguladora de la transcripción a la que está operativamente enlazada la secuencia de ADN que codifica la proteína quimérica de la presente invención puede ser cualquier región reguladora conocida, por ejemplo, una región reguladora de citomegalo virus (CMV) (ver Ejemplo 1). En una realización particular, dicho sistema de expresión es un virus pCIE-15, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO1 y que permite la expresión de la proteína CD4εl5 (SEQ ID NO 2).
Otro objeto adicional de la presente invención es el empleo del factor soluble protector en trans de células CD4 positivas o del sobrenadante en el que se encuentra, obtenido según la presente invención, en la elaboración de un medicamento destinado a la prevención y tratamiento de la infección por VIH-1 en humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención es el empleo del sistema de expresión de la proteína quimérica CD4, objeto de la presente invención, en la elaboración de protocolos de terapia génica clínica para el tratamiento y prevención en humanos de la infección por VIH-1, que comprende los siguientes pasos: a) la extracción de células CD4 positivas de un enfermo de VIH-1, b) la transducción ex vivo de las células CD4 positivas obtenidas en a) con un sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 de la presente invención que retiene la glicoproteína gpl60 de la envuelta del VEH-l en el RE y que promueve la protección en trans de células CD4 positivas no infectadas del enfermo frente a la infección y replicación del VIH-1, y c) la administración del sobrenadante y/o células CD4 positivas, infectadas y sanas, del anterior paso b) en el paciente donante enfermo de VIH; o que comprende los siguientes pasos: a) la administración directa de un vector codificante por la proteína quimérica CD4 a un enfermo de VIH-1, b) la expresión de la proteína quimérica CD4 por las células del enfermo transducidas in vivo, y c) la generación in vivo por las células del enfermo que expresan la quimera CD4 del factor que produce en trans la protección de células CD4 positivas del enfermo no transducidas.
Potenciales desarrollos de terapia génica pueden definirse a partir de las descripciones realizadas en los ejemplos de la presente invención (ver Ejemplo 5, Figura 9) y forman parte del estado de la técnica.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dicha elaboración de medicamento o en la elaboración de composiciones utilizables en los protocolos de terapia génica son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de medicamentos, excipientes y composiciones vehiculizantes de material genético.
Asimismo, la invención también se refiere al empleo del sistema de expresión de la proteína quimérica en un procedimiento de elaboración y obtención de un factor soluble protector en trans de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del VIH mediante los siguientes pasos: a) transducción de células CD4 positivas mediante un sistema de expresión que codifica la proteína quimérica, b) promover la infección de las células CD4 positivas de a) por VIH-1 mediante la puesta en contacto de dichas células CD4 positivas y el VIH-1, y c) recogida del sobrenadante del cultivo de dichas células CD4 positivas transducidas e infectados donde se encuentra el factor soluble.
Una realización particular de la presente invención es un procedimiento de elaboración y obtención de un factor soluble protector en trans de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del VIH-1 donde el sistema de expresión es el pCIE- 15 que codifica la proteína quimérica CD4εl5, las células CD4 positivas provienen de donantes humanos sanos o infectados por el VLH-1 (en un paciente de VJ-H-l pueden existir células CD4 positivas infectadas o no por el VIH-1) (ver ejemplo 3 y 5 de la presente invención) y el VIH-1 proviene de una cepa VIH-1 infecciosa.
DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1.- Construcciones retrovirales. En la parte superior se muestra la construcción pKB, usada anteriormente (San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. y Alarcón, B. 1998. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4 chimera inhibits Human hrimunodeficiency Virus type-1 replication. Hum. Gene Ther. 9: 1345-1357). La construcción pCJE-15 usada en los estudios presentes está indicada en la parte inferior. El promotor inmediato- temprano de citomegalo virus añadido al LTR 5' del virus Moloney-MLV (CMV- 5'LTR) regula la transcripción de un mRNA bicistrónico que codifica a la vez por CD4εl5 y por EGFP separados por una secuencia ERES. Figura 2.- Protocolo de transducción. Figura 3.- Inhibición de la liberación de p24 por células MT-2 transducidas con CD4εl5. Las células MT-2 fueron transducidas bien con la construcción pCIE-15, bien con el vector vacío (pCLE); se clonaron por dilución límite y se seleccionaron de acuerdo con la expresión de EGFP. Dos clones (el clon CIO que expresa CD4εl5, y el clon 6 transducido con el vector vacío) fueron infectados con VIH-1 (cepa pNL4.3) a una mdi de 0,001 y la liberación de p24 al medio de cultivo fue medida a lo largo de dos semanas.
Figura 4.- Inhibición de la liberación de p24 en una población no clonal de células MT-2 transducidas con CD4εl5. Las células MT-2 fueron transducidas con pCIE-15 o con el vector vacío (pCIE). La expresión del marcador GFP fue analizada 48 h tras la transducción mediante citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células positivas en cada caso. Las células MT-2 no transducidas y la población de células MT-2 transducidas fueron infectadas con VEH-l a una mdi de 0,001. La figura muestra la liberación de p24 a día 10 de la infección, cuando los niveles de infección habían alcanzado un máximo. Figura 5.- Inhibición de la replicación del VTH-1 en una mezcla de células MT-2 transducidas y no transducidas- El clon CÍO procedente de células MT-2 transducidas fue mezclado, en los porcentajes indicados (leyenda de la figura), con células MT-2 no transducidas y las mezclas fueron infectadas con el VIH-1 a una mdi de 0,001. La liberación de p24 fue seguida para estimar el grado de replicación del VJ-H-1. Figura 6.- Inhibición de la liberación de p24 en linfoblastos T humanos mediante la transducción de CD4εl5. Se estimularon PBMC humanos con PHA e IL-2 y 48 h más tarde se transdujeron con sobrenadante retroviral. Se mezclaron células transducidas con células sin transducir del mismo donante en distintas proporciones y se estimó el porcentaje de células GFP+ mediante citometría de flujo antes de la infección con VEH- 1 (leyenda de la figura).
Figura 7.- Inhibición de la replicación del VIH-1 en un experimento de dos cámaras. Se emplazaron células MT-2 no transducidas en el pocilio inferior de un conjunto de dos pocilios separados por una membrana con diámetro de poro de 0,4 μm. La cámara superior fue rellenada bien con células MT-2 no transducidas, bien con el clon CIO que expresa CD4εl5. Se inoculó el NUϊ-1 en ambas cámaras a una mdi de 0,001 y se examinó la replicación del NEH-1 a los días indicados, de acuerdo con la formación de sincitios y de efecto citopático (cruces) y también de la liberación de p24 (indicado en ng/ml).
Figura 8.- Efecto anti-VIH-1 del sobrenadante producido en el clon CÍO que expresa CD4εl5. Se recogieron los sobrenadantes de cultivos del clon CÍO infectado o no con la cepa pΝL4.3 de VEB-1 a una mdi de 2,5 tras 48 h de infección y se añadieron a diluciones 1:2, 1:4 y 1:10 sobre cultivos de células MT-2 que fueron infectados subsecuentemente con VEH-1 a una mdi de 0,001. La liberación de p24 fue medida a los días indicados para seguir la infección con VEH-1.
Figura 9.- Protocolo para probar in vivo los efectos anti-VIH-1 de la transducción con CD4εl5. Figura 10.- Efecto de la transducción con CD4εl5 sobre la replicación del VIH-1 en ratones SCID-huPBL. Se siguió el protocolo de la Figura 9 para poblar ratones SCED con PBMC humanos en el peritoneo. Se transdujeron linfoblastos procedentes del mismo donante bien con pCIE-15 para expresar la quimera CD4εl5 (ratones A, B, C, D, E), bien con el vector vacío (ratones 1, 2, 3, 4, 5) y se inocularon con VEH-l. Se sacrificaron los ratones 1, 2, 3, A, B y C en el día 2 postinfección. Los ratones 4, 5, D y E se sacrificaron en el día 6 postinfección. Se estimó la carga viral por PCR a partir de los lavados perifonéales de dichos ratones y se expresa como el número de copias de RΝA de VIH por mi de fluido.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLOS
En la presente invención se ha definido por primera vez que el efecto protector de la expresión de la construcción genética CD4εl5 en distintos tipos de linfocitos T, entre otros tipos de células CD4, sobre la replicación e infección de VEH-l en humanos, además del adelantado anteriormente de retención en el RE de las glicoproteínas de la envuelta vírica (San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. y Alarcón, B. 1998. Retroviral vector-mediated expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum- retained CD4 chimera inhibits Human Immunodeficiency Virus type-1 replication. Hωm. Gene Ther. 9: 1345-1357), se produce por efecto en trans. En la presente invención se ha preparado un nuevo vector que ha permitido un mayor nivel de transducción de las proteínas quiméricas utilizadas y su seguimiento a lo largo de los distintos experimentos de la presente invención (las células transducidas se convierten en células fluorescentes verdes y pueden ser visualizadas en el microscopio o ser analizadas por citometría de flujo, Ejemplo 1). Para determinar si la transducción con la construcción quimérica pCEE-15 confiere resistencia contra la infección por VEΗ-1, la línea celular MT-2 fue transducida con el vector pCIE-15 o con el vector vacío (pCIE). En células MT-2 no transducidas, así como en un clon MT-2 transducido con el vector vacío, los niveles de p24 alcanzaron concentraciones por encima de 3 μg/ml (Figura 3). Por el contrario, en el clon CIO, transducido con el vector pCIE-15 que permite la expresión de la proteína quimérica CD4εl5, la liberación de p24 fue indetectable, por debajo de 10 pg/ml. Una vez demostrado que la expresión de la proteína quimérica CD4εl5 inhibe la replicación de VEH-1, se decidió comprobar si la expresión de dicha quimera, no en un clon T individual, sino en un conjunto de células no clonadas confería resistencia a la replicación e infección por VIH-1. Así, en uno de estos experimentos se pudo transducir un 33% de la población de células MT-2 con el vector de expresión pCEE-15 y, por otro lado, un 51% de la población de MT-2 con el vector vacío como control. Tras la infección con VEH-1, encontramos que la liberación de p24 no fue afectada por la transducción del vector vacío pero fue completamente bloqueada en las células transducidas con el vector pCIE-15 que permite la expresión de la proteína quimérica CD4εl5 (Figura 4). Este resultado fue sorprendente puesto que en este experimento, un 67% de las células no se habían transducido (de acuerdo con la expresión del marcador GFP) y deberían ser perfectamente competentes para replicar VIH-1 y producir p24. Por lo tanto, el resultado de la Figura 4 indica que la expresión de la proteína quimérica CD4εl5 tiene un efecto en trans sobre las células no transducidas, capaz de prevenir la infección y replicación de VUϊ-1 en las mismas, y forma parte de la presente invención.
Los resultados anteriores podrían hacer pensar que el porcentaje de células transducidas con el vector pCEE-15, que permite la expresión de la proteína quimérica CD4εl5, de la Figura 4 estaba subestimado y que un porcentaje más alto de células MT- 2 había sido transducido pero no estaban expresando GFP a niveles detectables por citometría de flujo. Estas células, aparentemente negativas para GFP y para la proteína quimérica CD4εl5, expresarían todavía niveles suficientes de CD4εl5 como para impedir la replicación del VEH-1. Para excluir esta posibilidad, en la presente invención el clon CIO de MT-2, que expresa de forma estable la proteína quimérica CD4 l5 en un 100% de las células, se mezcló en diferentes proporciones con las células MT-2 no transducidas, y la mezcla se infectó con VIH-1. La replicación del VEH-1 fue abolida cuando la proteína quimérica CD4εl5 era expresada en porcentajes tan bajos como un 10% de la población total (Figura 5, línea de cuadrados grises). Este resultado indica que la expresión de la proteína quimérica tiene efectivamente un efecto en trans que inhibe la infección y replicación del VEH-l en células MT-2 no transducidas.
MT-2 es una línea celular T transformada por el virus HTLV-I. Para excluir que el efecto en trans de la expresión de CD4εl5 pudiera derivarse de la acción de un producto génico del HTLV-I, un experimento similar al mostrado en la Figura 4 fue realizado con linfoblastos T humanos derivados de un donante sano y transducidos con el vector pCLE-15 que permite la expresión de la proteína quimérica CD4εl5. Estos resultados demostraron que la expresión de la quimera CD4εl5 en un porcentaje minoritario (23%) de los linfoblastos previno la infección y replicación del VIH-1 (Figura 6, línea con cruces). Porcentajes más bajos de expresión (6% y 11%) también tuvieron algún efecto inhibidor en comparación con los linfoblastos T no transducidos..
En conjunto estos resultados muestran que la transducción retroviral de la proteína quimérica CD4εl5 en una línea celular T humana y también en linfoblastos humanos previene la infección y replicación del VIH-1 por un mecanismo no anticipado anteriormente que actúa en trans.
Para determinar si el efecto en trans de la expresión de la proteína quimérica CD4 l5 requiere del contacto célula-célula, se realizó un experimento de dos cámaras en la presente invención. La presencia del clon transducido con CD4εl5 en la cámara superior produjo una inhibición considerable de la replicación del VEH-l en las células MT-2 no transducidas, presentes en la cámara inferior, comparada con el experimento control en el que las células no transducidas MT-2 fueron emplazadas en ambas cámaras (Figura 7). Este resultado sugiere que un factor soluble media el efecto en trans de la expresión de CD4εl5. De hecho, el sobrenadante de cultivo obtenido del clon transducido con CD4εl5 e infectado con VIH-1 inhibió la replicación del VEH-l cuando se añadió a células MT-2 (Figura 8), comparado con el sobrenadante de cultivo procedente del clon sin infectar. Aunque la naturaleza del factor soluble es desconocida todavía, sabemos que las células transducidas con la proteína quimérica CD4εl5 no producen interferones α y γ (datos no presentados) y que estos factores no son, por lo tanto, responsables del efecto en trans. También sabemos que el factor soluble se encuentra en este sobrenadante, lo que permitiría la preparación de un medicamento a partir del mismo destinado a la prevención y tratamiento de la infección por el VEH-l. Por otro lado, en la presente invención se ha determinado la capacidad de la proteína quimérica CD4εl5 para inhibir la replicación e infección del VIH-1 en un modelo animal para acercar los resultados al posible uso clínico de la expresión de la misma en protocolos de terapia génica de la infección por VIH-1 en humanos. En la Figura 9 se muestra un esquema del protocolo seguido. Como se ha comprobado, la expresión de la proteína quimérica CD4εl5 en un porcentaje bajo de células humanas redujo también la replicación del VEH-1 tanto al día 2 como al día 6 tras la infección (Figura 10). Ejemplo 1.- Optimización del protocolo de transducción.
En la presente invención se ha usado un vector retroviral basado en el vector derivado del virus Moloney-MLV. Este vector tiene una secuencia IRES que permite la transcripción de un RNAm bicistrónico que codifica por el marcador fluorescente GFP y la proteína de interés, en este caso CD4εl5 (construcción pCIE-15, Figura 1). Este sistema permite trazar exactamente el número y el destino de las células transducidas porque se convierten en células fluorescentes verdes y pueden ser visualizadas en el microscopio o ser analizadas por citometría de flujo.
Para producir sobrenadantes para la transducción, se transfectaron células empaquetadoras Phoenix con la construcción pCIE-15 por el método del fosfato de calcio junto con un vector que codifica por las proteínas de Moloney gag y pol y con un vector que codifica por la proteína G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV). De esta forma, reforzamos la expresión de los productos génicos gag y pol en las células empaquetadoras, y también, pseudotipamos las partículas transductoras con la proteína G de VSV. Esto convierte a las partículas transductoras en más resistentes y amplía el espectro de células huésped. Los sobrenadantes transductores son recogidos cada 24 h y son usados frescos para transducir tanto líneas T como linfoblastos T en los siguientes ejemplos de la presente invención. En la Figura 2 se muestra un esquema del protocolo utilizado. De forma rutinaria se pueden transducir cerca del 100% de las células de las líneas T Jurkat y MT-2 y un 20-30% de los linfoblastos T humanos.
Ejemplo 2.- Efecto protector en trans de la expresión de CD4εl5 sobre la replicación de VIH-1
Para determinar si la transducción con la construcción pCEE-15 confiere resistencia contra la infección por VEH-1, la línea celular MT-2 fue transducida con la construcción pCIE-15 o con el vector vacío (pCIE). Se clonaron ambas poblaciones por dilución límite y se seleccionaron clones que expresan de forma estable las construcciones de acuerdo con la expresión de GFP. Se infectaron dos de estos clones con VrH-1 (cepa pNL4.3), el clon CÍO que expresa CD4εl5 y el clon 6 transducido con el vector vacío, a una multiplicidad de infección (mdi) de 0,001 y como un marcador de la replicación vírica se siguió la liberación del antígeno vírico p24 al sobrenadante de cultivo a lo largo de varios días. En células MT-2 no transducidas, así como en un clon MT-2 transducido con el vector vacío, los niveles de p24 alcanzaron concentraciones por encima de 3 μg/ml (Figura 3). Por el contrario, en el clon CÍO, transducido con CD4εl5, la liberación de p24 fue indetectable, por debajo de 10 pg/ml. Una vez demostrado que la expresión de la quimera CD4εl5 inhibe la replicación de VEH-1, era necesario comprobar si la expresión de la quimera, no en un clon T individual, sino en un conjunto de células no clonadas confería resistencia al VEB-1. Así, en uno de estos experimentos pudimos transducir un 33% de la población de células MT-2 con la construcción pCIE-15 y, por otro lado, un 51% de la población de MT-2 con el vector vacío (pCIE) como control. Tras la infección con VEH-1, encontramos que la liberación de p24 no fue afectada por la transducción del vector vacío pero fue completamente bloqueada en las células transducidas con CD4 l5 (Figura 4).
Ejemplo 3.- Niveles realmente bajos de células transducidas CD4εl5 producen protección en trans frente al VTH-1. Para confirmar esta posibilidad, el clon CÍO, que expresa de forma estable la quimera CD4εl5, se mezcló en diferentes proporciones con las células MT-2 no transducidas (0, 10, 20, 40, 60 80 y 100%), y la mezcla se infectó con V3H-1 a una mdi de 0,001. La liberación de p24 fue seguida para estimar el grado de replicación del VEB-1. La replicación del VEH-l fue abolida cuando la quimera CD4εl5 era expresada en porcentajes tan bajos como un 10% de la población total (Figura 5). Este resultado indica que la expresión de la quimera tiene efectivamente un efecto en trans que inhibe la replicación del VEH-1 en células MT-2 no transducidas.
MT-2 es una línea celular T transformada por el virus HTLV-I. Para excluir que el efecto en trans de la expresión de CD4εl5 pudiera derivarse de la acción de un producto génico del HTLV-I, un experimento similar a este mostrado en la Figura 4 fue realizado con linfoblastos T derivados de un donante sano y transducidos con CD4εl5. Se estimularon PBMC humanos con PHA e IL-2 y 48 h más tarde se transdujeron con sobrenadante retroviral obteniendo aproximadamente un 23% de expresión de CD4εl5. Posteriormente se mezclaron estas células modificadas con células del mismo donante sin transducir para obtener cultivos con distinto porcentaje de expresión de CD4εl5 (6%, 11% y 23%). Posteriormente estas células se infectaron con un aislado clínico y los resultados demostraron que la expresión de la quimera CD4εl5 en un porcentaje minoritario (23%) de los linfoblastos previno la replicación del VEH-l (Figura 6). Porcentajes más bajos de expresión (6% y 11%) también tuvieron algún efecto inhibidor. También se pudo observar una inhibición en la formación de sincitios en las células que contenían un 23% de expresión de CD4εl5 en el día 5 después de la infección (datos no mostrados).
Ejemplo 4.- El efecto en trans de la expresión de CD4εl5 está mediado por un factor soluble.
En este tipo de experimento, el clon que expresa CD4εl5 fue emplazado en la cámara superior y la línea parental MT-2 en la cámara inferior, separadas por una membrana de 0,4 μm de poro y, como control, se realizó en paralelo el mismo experimento con células MT-2 no transducidas puestas en ambas cámaras. Ambas poblaciones celulares fueron infectadas con el VIH-1 a una mdi de 0,001 y la infección vírica se siguió a lo largo de 2 semanas de acuerdo con la liberación de p24 y con la formación de sincitios y de efecto citopático (Lifson JD, Reyes GR, McGrath MS, Stein BS, Engleman EG. AIDS retrovirus induced cytopathology: giant cell formation and involvement of CD4 antigen. Science. 1986. 232 (4754): 1123-7). La presencia del clon transducido con CD4εl5 en la cámara superior produjo una inhibición considerable de la replicación del VEB-1 en las células MT-2 no transducidas, presentes en la cámara inferior, comparada con el experimento control en el que las células no transducidas MT-2 fueron emplazadas en ambas cámaras (Figura 7). Este resultado sugiere que un factor soluble media el efecto en trans de la expresión de CD4εl5. Para confirmar la existencia de un factor soluble como responsable de esta protección en trans frente a la infección de HIV-1 se recogieron los sobrenadantes de cultivos del clon CIO infectado o no con la cepa pNL4.3 de VEH-1 a una mdi de 2,5 tras 48 h de infección y se añadieron a diluciones 1:2, 1:4 y 1:10 sobre cultivos de células MT-2 que fueron infectados subsecuentemente con VEB-1 a una mdi de 0,001. La liberación de p24 fue medida a los días indicados para seguir la infección con VEH-1. De hecho, el sobrenadante de cultivo obtenido del clon transducido con CD4εl5 e infectado con VEH-1 inhibió la replicación del VEB-1 cuando se añadió a células MT-2 (Figura 8), comparado con el sobrenadante de cultivo procedente del clon sin infectar en las distintas diluciones. Aunque la naturaleza del factor soluble es desconocida todavía, sabemos que las células transducidas con la quimera CD4εl5 no producen interferones y γ (datos no mostrados) y que estos factores no son, por lo tanto, responsables del efecto en trans. Ejemplo 5.- Efecto de la transducción de la quimera CD4εl5 sobre la replicación del VIH-1 en un modelo de ratón.
Se probó la capacidad de la quimera CD4εl5 para inhibir la replicación del VflT- 1 en un modelo animal para acercar los resultados al posible uso clínico de la quimera. El modelo consiste en el uso de ratones inmunodeficientes SCEO repoblados intraperitonealmente con PBMC humanos. Estos ratones son infundidos intraperitonealmente con linfoblastos T del mismo donante humano, transducidos con las diferentes construcciones dos semanas después. Estos ratones son infectados un día más tarde mediante la inyección de linfoblastos T infectados con VEH-l ex vivo, y el progreso de la infección es seguido a través de la estimación de la carga vírica en el peritoneo. Se muestra un esquema del protocolo seguido en la Figura 9. Como se muestra en la Figura 10, la expresión de la quimera CD4εl5 en un porcentaje bajo de células humanas redujo también la replicación del VIH-1 tanto al día 2 como al 6 tras la infección (ratones A-E) (valorada mediante la carga viral determinada por PCR a partir de los lavados perifonéales de dichos ratones y se expresa como el número de copias de RNA de Vffl-1 por mi de fluido). En la siguiente sección de Materiales y Métodos se identifican los plásmidos, líneas celulares, animales y reactivos, así como una descripción detallada de los ensayos utilizados en dichos Ejemplos. MATERIALES Y MÉTODOS Líneas celulares. Se utilizaron las líneas celulares T linfoblastoides Jurkat y MT-2 (provenientes de la ATCC). Ambas se crecieron en medio RPMI 1640 en presencia de 5% de suero bovino fetal. Los linfocitos T de sangre periférica se obtuvieron de donantes sanos y se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll Hypaque. Se estimularon durante 48h con IL-2 humana recombinante (lOOU/ml) y PHA (lμg/ml) en medio RPMI con suero bovino fetal y después de ese tiempo las células se crecieron en medio completo con IL-2. La línea celular empaquetadora Phoenix proviene de la línea 293T (línea humana embrionaria de riñon transformada con la proteína El de adenovirus) que establemente expresa las proteínas gag pol y env, del virus de ratón de la leucemia de Moloney (MLV) de forma estable. Se crece en medio DMEM en presencia de 5% de suero bovino fetal.
Preparaciones virales. Para los experimentos de infección se utilizó la cepa de referencia pNL4.3 (Adachi A, Gendelman HE, Koenig S, Folks T, Willey R, Rabson A, Martin MA. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 1986 Aug; 59 (2): 284-91). Se generaron stocks virales infectando células MT-2 con ρNL4.3 y se recogió el sobrenadante del cultivo cuando las células presentaron efecto citopático (ECP). Esta preparación viral se tituló a dilución límite en MT-2 y el resultado obtenido se da en forma TCEDso/ml. Ensayos de infección. Las células a infectar (Jurkat, MT-2, linfocitos de sangre periférica) se resuspendieron en el volumen del stock viral necesario para la multiplicidad de infección (mdi) indicada en cada caso. Se mantuvieron a 37°C durante 2 horas para permitir la adsorción viral y posteriormente las células se lavaron y se dejaron en medio completo. Se recogió sobrenadante de cultivo dos veces por semana para detectar el antígeno p24 secretado al medio. Esta proteína se detectó por un ELISA comercial (Innogenetics, Ghent, Bélgica) inoculando 100 μl/muestra y calculando la concentración de la proteína por extrapolación con una curva patrón. Los datos se expresan en pg/ml. También se sigue la evolución de la infección observando en los cultivos la aparición de sincitios (SI) ó efecto citopático (ECP).
Construcciones retrovirales. El vector retroviral bicistrónico utilizado en este trabajo está basado en Mo-MLV y se denomina pLZRS-CMV-IRES-gfp (Abad JL, Serrano F, San Román AL, Delgado R, Bernad A, González MA. Single-step, múltiple retroviral transduction of human T cells. J Gene Med 2001. 3:1-12) La quimera CD4εl5 se ha clonado en los sitios Xl oI/BamHI. La construcción pCEB corresponde al vector vacío y pCEE-15 corresponde al vector con CD4εl5. Generación de sobrenadantes virales que expresen CD4εl5. La línea celular empaquetadora Phoenix, derivada de 293T, se transfectó por fosfato calcico con el vector retroviral pCIE ó pCEE-15, con las secuencias gag-pol derivadas de MLV y con la proteína G del virus de la estomatitis vesicular como envuelta. Después de 48h se recogieron los sobrenadantes de estas transfecciones y se utilizaron para transducir células Jurkat, MT-2 ó linfocitos de sangre periférica. Las células se sometieron a tres rondas de transducción, incubando primero los sobrenadantes con las células durante 90 min a 32°C y centrifugándolos simultáneamente a 1500 rpm. Tras esto, se incubaron toda la noche a 37°C. Se analizaron para la expresión de GFP después de 6 días de la primera ronda de transducción. Detección de RNA viral. Se recogieron los sobrenadantes de los cultivos a analizar y la carga viral se detectó por un Kit comercial (Amplicor HIV-1 monitor test versión 1.5, Roche, Barcelona, España) (Correa, R y Muñoz-Fernandez, MA. 2001.Viral phenotype affects the thymic production of new T cells in HJN-1-infected children. AIDS 15:1959- 1963.). Inicialmente se extrae el RΝA de las muestras y por acción de la retrotranscriptasa se obtiene cDΝA que es sometido a 30 ciclos de amplificación. Este cDΝA se híbrida con una sonda específica para el gen gag y se revela con un conjugado unido a peroxidasa. Los resultados se obtienen en número de copias RΝA ml. Experimentos en el modelo de ratón SCID-huPBLs. Para cada experimento se analizaron un total de 10 ratones, 5 de los cuales eran repoblados con linfocitos de un donante sano transducidos con el vector vacío y los otros 5 con linfocitos humanos del mismo donante transducidos con CD4εl5. Los ratones se inyectaron intraperitonealmente con linfocitos en reposo y después con linfoblastos transducidos. 24 h más tarde, se inyectaron linfoblastos del mismo donante infectados con NEFJ-1 a alta multiplicidad de infección. Los ratones se sacrificaron a distintos días tras la infección y se procedió a hacerles un lavado peritoneal para analizar la carga viral por RT-PCR (Correa, R y Muñoz-Fernandez, MA. 2001.Viral phenotype affects the thymic production of new T cells in HIV-1-infected children. AIDS 15: 1959-1963.).

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Nueva composición terapéutica para prevenir y tratar la infección por VEH-l en humanos caracterizada porque se produce por un efecto en trans a partir de células CD4 positivas transducidas con construcciones genéticas que permiten la expresión de la proteína CD4 que retiene la glicoproteína de la envuelta gpl60 del VIH-1 en el retículo endoplásmico (RE).
2.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 1 caracterizada porque las células CD4 positivas pertenecen, entre otras, al siguiente grupo: a) células de estirpe linfoide T, entre otras: células T procedentes de la sangre, del timo, del bazo, de los ganglios linfáticos o de cualquier otro órgano linfoide, células provenientes de líneas de linfocitos T cultivados in vitro, linfoblastos y clones T obtenidos por estimulación de linfocitos T, b) cualquier precursor hematopoyético procedente de la médula ósea, de la sangre, del timo, de cordón umbilical, o de cualquier otra localización, que pueda dar lugar tras diferenciarse a linfocitos T maduros; u c) otras células que presenten el receptor CD4 en su membrana como células de la línea monocitos/macrófagos y células dentríticas y que son infectadas también por el VIH-1.
3.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 1 y 2 caracterizada porque comprende un factor soluble protector de células CD4 positivas producido por células
CD4 positivas transducidas suficientemente con una proteína quimérica CD4.
4.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 3 caracterizada porque el factor soluble protector de células CD4 positivas se obtiene mediante un procedimiento que comprende los siguientes pasos: a) transducción de células CD4 positivas mediante un sistema de expresión que codifica por la proteína quimérica CD4, b) promover la infección de las células CD4 positivas de a) por VEH-l mediante la puesta en contacto de dichas células CD4 positivas y el VEB-1, y c) recogida del sobrenadante del cultivo de dichas células CD4 positivas transducidas e infectados donde se encuentra el factor soluble.
5.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 4 caracterizada porque el procedimiento de elaboración y obtención del factor soluble protector en trans de células CD4 positivas frente a la infección y replicación del NIH-1 comprende como sistema de expresión el vector retroviral basado en el virus Moloney- MLN, pCJE-15, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID ΝO1 y que codifica la proteína quimérica CD4εl5 (SEQ ED ΝO 2), las células CD4 positivas provienen de donantes humanos sanos o infectados por el NEB-1 y el NEH-1 proviene de una cepa NEH-1 infecciosa.
6.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 4 caracterizada porque la proteína quimérica CD4 es la proteína CD4εlO.
7.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 1 y 2 caracterizada porque comprende un sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína quimérica y que posteriormente retiene a la glicoproteína gpl60 de la envuelta del VEH-1 e induce una protección en trans de las células CD4 positivas no transducidas frente a la infección y replicación del VJH-1.
8.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque el sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 es el vector retroviral basado en el virus Moloney- MLV (pCEE-15) que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ EO NO1 y que permite la expresión de la proteína quimérica CD4εl5 (SEQ ED NO 2).
9.- Nueva composición terapéutica según la reivindicación 7 caracterizada porque la proteína quimérica CD4 es la proteína CD4εlO.
10.- Empleo del factor soluble protector en trans de células CD4 positivas, o del sobrenadante en el que se encuentra, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 6 en la elaboración de un medicamento destinado a la prevención y tratamiento de la infección por VEH-1 en humanos.
11.- Empleo del sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9 en la elaboración de un protocolo de terapia génica clínica en humanos de la infección por VEH-1, que comprende: a) la extracción de células CD4 positivas de un enfermo de VEH-1, b) la transducción ex vivo de las células CD4 positivas obtenidas en a) con un sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 de la presente invención que retiene la glicoproteína gpl60 de la envuelta del VEH-1 en el RE y que promueve la protección en trans de células CD4 positivas no infectadas del enfermo frente a la infección y replicación del VEH-1, y d) a administración del sobrenadante y/o células CD4 positivas, infectadas y sanas, del anterior paso b) en el paciente donante enfermo de VIH.
12.- Empleo de un sistema de expresión de la proteína quimérica CD4 según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9 en la elaboración de un protocolo de terapia génica clínica en humanos de la infección por VEH-1, que comprende: a) la administración directa de un vector codificante por la proteína quimérica CD4 a un enfermo de VEH-1, b) la expresión de la proteína quimérica CD4 por las células del enfermo transducidas in vivo, y c) la generación in vivo por las células del enfermo que expresan la quimera CD4 del factor que produce en trans la protección de células CD4 positivas del enfermo no transducidas.
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