ES2323692T3 - Metodos y materiales para tratar afecciones inflamatorias usando un polipeptido que comprende un segmento de aminoacidos c5 autogenicos y un segmento de aminoacidos no autogenicos. - Google Patents
Metodos y materiales para tratar afecciones inflamatorias usando un polipeptido que comprende un segmento de aminoacidos c5 autogenicos y un segmento de aminoacidos no autogenicos. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una composición que comprende un adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a propio del complemento en dicho mamífero.
Description
Método y materiales para tratar afecciones
inflamatorias usando un polipéptido que comprende un segmento de
aminoácidos C5 autogénicos y un segmento de aminoácidos no
autogénicos.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la
Solicitud Provisional nº de Serie 60/430.278 de EE.UU., presentada
el 2 de Diciembre de 2002.
El invento se refiere a composiciones y
medicamentos relativos al tratamiento de la artritis reumatoide.
La artritis reumatoide (RA; del inglés,
rheumatoid arthritis) es un estado inflamatorio autoinmune que
afecta a las articulaciones periféricas. Modelos de artritis
provocada con colágeno en animales han ayudado a definir genes
relacionados con estados de RA. Se ha identificado un gen (Aq en el
ratón) de la clase II del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC; del inglés, major histocompatibility
complex) que es importante para el inicio y el mantenimiento
de estados de RA. Este gen corresponde funcionalmente al gen DR*0401
del HLA-DR en seres humanos, lo que sugiere que en
la enfermedad está implicado el reconocimiento autoinmune, mediado
por células T, de antígenos específicos de articulaciones.
Se ha hallado también que genes de regiones
situadas fuera del MHC son importantes para el inicio y el
mantenimiento de estados de RA. Una de estas regiones génicas está
situada en el ratón en el cromosoma 2 y contiene un gen que
codifica el factor C5 del complemento. Uno de los componentes
activos de C5 es C5a, que se libera durante la unión del
complemento a inmunocomplejos. La liberación de C5a desencadena
diversas rutas diferentes que conducen a la inflamación reumatoide.
El C5a producido localmente en una articulación inflamatoria puede
unirse a receptores de macrófagos y granulocitos neutrófilos, lo
que conduce a la infiltración de células inflamatorias en las
articulaciones. El C5 también desempeña un papel central en procesos
mediados por el complemento tales como sepsis, daño miocárdico por
isquemia/reperfusión, síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, nefritis y rechazo de injertos, así como en estados
inflamatorios mediados por el complemento tales como artritis
reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis
múltiple, arteriosclerosis y vasculitis.
El Documento WO 96/39503 se refiere a
antagonistas del receptor de C5a que no tienen sustancialmente
actividad agonista, y a métodos para las preparaciones.
David Carney et al., 1993, Protein
Science, volumen 2, nº 9, páginas 1391-1399,
describen mutaciones específicas del sitio en la región
N-terminal del C5a humano que afectan a las
interacciones de C5a con el receptor de C5a del neutrófilo.
Pellas et al., 1998, Journal of
Immunology, volumen 160, nº 11, páginas 5616-5621,
describen nuevos antagonistas del receptor de C5a que regulan
funciones del neutrófilo in vitro e in vivo.
Michael Mulligan et al., 1996, Journal of
Clinical Investigation, volumen 98, nº 2, páginas
503-592, describen la necesidad y el papel de C5a
en el daño inflamatorio pulmonar agudo en ratas. En el Documento
EP0300740 se describen anticuerpos monoclonales hacia el C5a del
complemento.
El invento se refiere a medicamentos y
composiciones para uso en el tratamiento de un mamífero.
Específicamente, el invento proporciona adyuvantes y polipéptidos
para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide. Los
polipéptidos del invento pueden ser inmunogénicos. En un aspecto, el
invento proporciona polipéptidos inmunogénicos que contienen
segmentos de aminoácidos tanto propios como no propios. Por ejemplo,
el invento proporciona un polipéptido que contiene un segmento de
aminoácidos de C5a propio y uno o más epítopos de células T no
propios.
En un aspecto, el invento proporciona el uso de
un adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que
dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del
factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de
aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de
maltosa (MBP; del inglés, maltose binding
protein) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos
de aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta
anti-factor C5a propio del complemento en dicho
mamífero.
En otro aspecto, el invento presenta una
composición que comprende un adyuvante y un polipéptido, en que el
polipéptido incluye un segmento de aminoácidos de C5a propio, con
una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de
aminoácidos de la MBP bacteriana, y en que la longitud del segmento
no propio es superior a 40 restos de aminoácido, para uso en el
tratamiento de la artritis reumatoide. La administración del
polipéptido a un mamífero provoca una respuesta
anti-C5 en el mamífero, y el genoma del mamífero
puede incluir un ácido nucleico que codifique el segmento de
aminoácidos de C5 propio. El segmento de aminoácidos no propio puede
ser un segmento de aminoácidos de C5. Puede que el segmento de
aminoácidos de C5 no propio no se encuentre naturalmente. El
segmento de aminoácidos de C5 no propio puede contener al menos dos
epítopos de células T.
El polipéptido del invento incluye un segmento
de aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos de la MBP
bacteriana, en que la longitud del segmento de aminoácidos de la MBP
puede ser inferior a 350 (por ejemplo, inferior a 300, inferior a
250 o inferior a 200) restos de aminoácido. La administración del
polipéptido a un mamífero puede provocar una respuesta
anti-C5 en el mamífero, y el genoma del mamífero
puede contener un ácido nucleico que codifique el segmento de
aminoácidos de C5 propio.
El segmento de aminoácidos de mamífero no propio
puede contener al menos dos epítopos de células T.
En aún otro aspecto, la composición del invento
contiene un polipéptido, en que, con respecto al mamífero, el
polipéptido contiene un segmento de aminoácidos de C5a propio y un
segmento de aminoácidos de la MBP bacteriana, y en que el segmento
de aminoácidos de C5a propio tiene una identidad de al menos 90 por
ciento con respecto a una secuencia de C5a del mamífero.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo
significado que el comúnmente entendido por quien tiene una
experiencia normal en la técnica a la que pertenece este invento.
Aunque en la práctica o el examen del presente invento se pueden
utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí
descritos, más adelante se describen métodos y materiales adecuados.
En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo
las definiciones, tendrá el control.
Otras características y ventajas del invento
resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y los
dibujos siguientes y a partir de las reivindicaciones.
La Figura 1 es una representación de una
secuencia de DNA de pro-C5 de ratón (ID. SEC. nº
1).
La Figura 2 es una representación de la
secuencia de aminoácidos de pro-C5 de ratón,
incluyendo el péptido señal (ID. SEC. nº 2).
La Figura 3 es un diagrama que representa un
vector de ácido nucleico diseñado para que exprese un polipéptido
de fusión que contenga proteína ligante de maltosa (MBP) y C5a de
ratón.
La Figura 4 es la secuencia del ácido nucleico
de un producto MBP-C5a de PCR (ID. SEC. nº 3).
La Figura 5 es la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido MBP-C5a de fusión (ID. SEC. nº 4).
La Figura 6 es un gráfico en que se ha trazado
la incidencia de artritis provocada con colágeno en ratones testigo
(rombos claros) y en ratones vacunados con un polipéptido
MBP-C5a de fusión (círculos oscuros). *: p <
0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005.
La Figura 7 es un gráfico en que se ha trazado
la calificación media de artritis para la artritis provocada con
colágeno en ratones testigo (círculos claros) y en ratones vacunados
con un polipéptido MBP-C5a de fusión (círculos
oscuros). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,005.
La Figura 8 es un gráfico en que se ha trazado
la calificación media de artritis máxima para la artritis provocada
con colágeno en ratones testigo y en ratones vacunados con un
polipéptido MBP-C5a de fusión. **: p < 0,01.
La Figura 9 es un gráfico en que se ha trazado
el área bajo la curva de los datos de calificación de artritis
obtenidos de ratones a los que se ha inyectado colágeno y han sido
luego tratados con PBS (testigo) o con un polipéptido
MBP-C5a de fusión. ***: p < 0,005.
La Figura 10 es un gráfico en que se ha trazado
el porcentaje de incidencia de artritis crónica provocada con
colágeno en ratones testigo (círculos oscuros) y en ratones
vacunados con un polipéptido MBP-C5a de fusión
(rombos claros). *: p < 0,05; **: p < 0,01.
La Figura 11 es un gráfico en que se ha trazado
la calificación media de la artritis crónica provocada con colágeno
en ratones testigo (círculos oscuros) y en ratones vacunados con un
polipéptido MBP-C5a de fusión (círculos claros). *:
p < 0,05.
El invento proporciona medicamentos y
composiciones para tratar la artritis reumatoide. Como aquí se
utiliza, la expresión "estado inflamatorio" se refiere a una
enfermedad, estado morboso, síndrome u otro estado que da lugar a
inflamación. Por ejemplo, la artritis reumatoide y el asma son
estados inflamatorios. Otros ejemplos de estados inflamatorios
incluyen, sin limitación, sepsis, daño miocárdico por
isquemia/reperfusión, síndrome de insuficiencia respiratoria del
adulto, nefritis, rechazo de injertos, enfermedad inflamatoria
intestinal, esclerosis múltiple, arteriosclerosis y vasculitis. El
invento proporciona polipéptidos para provocar una respuesta de
anticuerpos contra un antígeno, tal como C5 o C5A, en un mamífero.
Por ejemplo, los medicamentos y composiciones aquí descritos se
pueden utilizar para reducir los efectos de C5a en un mamífero al
reducir la cantidad de C5a total y/o unido a receptor.
El invento proporciona polipéptidos que pueden
ser utilizados para tratar la artritis reumatoide. Dichos
polipéptidos pueden ser inmunogénicos. Un polipéptido
"inmunogénico" es cualquier polipéptido que provoca eficazmente
una respuesta de anticuerpos en un mamífero. Por ejemplo, un
polipéptido inmunogénico puede ser un polipéptido que provoque
eficazmente la producción de un anticuerpo anti-C5
propio en un mamífero.
Los polipéptidos del invento contienen al menos
un segmento de aminoácidos de MBP bacteriana que sería considerado
no propio por el mamífero concreto que recibiera el polipéptido. Por
ejemplo, un polipéptido que provoca la producción de un anticuerpo
anti-C5 propio puede contener un segmento de
aminoácidos de C5a propio y un segmento de aminoácidos no propio
(por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 no propio). El
segmento de aminoácidos de C5 propio puede conferir la
especificidad de la respuesta de anticuerpos anti-C5
propio, y el segmento de aminoácidos no propio puede potenciar la
inmunogenicidad del polipéptido. El segmento de aminoácidos no
propio (por ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 no propio)
puede contener al menos dos epítopos de células T.
Alternativamente, el segmento de aminoácidos no propio puede
estabilizar un polipéptido inmunogénico de modo que se provoque la
respuesta específica de anticuerpos anti-C5 propio.
El segmento de aminoácidos de C5 propio de un polipéptido es una
porción de C5 que interacciona directamente con un receptor de C5a.
Los ejemplos de dichos segmentos de aminoácidos de C5 propios
incluyen, sin limitación, C5a y fragmentos de C5a.
Cómo se utiliza aquí, la expresión "segmento
de aminoácidos" se refiere a un tramo de aminoácidos contiguos
de un polipéptido. El segmento de aminoácidos puede tener cualquier
longitud superior a cuarenta restos de aminoácido (por ejemplo,
superior a aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 o más
restos de aminoácido). De esta manera, el segmento de aminoácidos
puede ser la región C5a completa de C5, o una porción de C5a. En
algunas realizaciones, el segmento de aminoácidos puede tener una
longitud inferior a 1000 restos de aminoácido (por ejemplo,
inferior a 500, inferior a 400, inferior a 300, inferior a 200 o
inferior a 100 restos de aminoácido). En otras realizaciones, el
segmento de aminoácidos puede tener una longitud de aproximadamente
40 a aproximadamente 150 restos de aminoácido.
El término "propio", como aquí se utiliza
con respecto a un segmento de aminoácidos y a un mamífero concreto,
se refiere generalmente a cualquier segmento de aminoácidos que
posee endógenamente el mamífero concreto. Si un segmento de
aminoácidos procede de un miembro de una especie y se introduce en
otro miembro de la misma especie que posee endógenamente el
segmento de aminoácidos, ese segmento de aminoácidos concreto es
entonces considerado un segmento de aminoácidos propio. Por
ejemplo, un segmento de aminoácidos de C5 procedente de un ratón es
un segmento de aminoácidos de C5 propio cuando se introduce en ese
mismo ratón, un ratón genéticamente idéntico, o un ratón no
genéticamente idéntico que posee endógenamente el mismo segmento de
aminoácidos.
La expresión "no propio", como aquí se
utiliza con respecto a un segmento de aminoácidos y a un mamífero
concreto, se refiere generalmente a cualquier segmento de
aminoácidos que no posee endógenamente el mamífero concreto. Si un
segmento de aminoácidos procede de un miembro de una primera especie
y se introduce en un miembro de una segunda especie que no posee
endógenamente el segmento de aminoácidos, ese segmento de
aminoácidos concreto puede ser entonces considerado un segmento de
aminoácidos no propio. Por ejemplo, un segmento de aminoácidos de
C5 procedente de un ratón puede ser considerado un segmento de
aminoácidos de C5 no propio cuando se introduce en un ser humano.
En otro ejemplo, si un polipéptido contiene un segmento de
aminoácidos de C5a procedente de un ratón y un segmento de
aminoácidos de C5b procedente de un ser humano y se introduce ese
polipéptido en un ratón, el segmento de aminoácidos de C5a puede
ser entonces considerado un segmento de aminoácidos de C5a propio,
y el segmento de aminoácidos de C5b puede ser entonces considerado
un segmento de aminoácidos de C5b no propio. Alternativamente, si
se introduce el mismo polipéptido en un ser humano, el segmento de
aminoácidos de C5a puede ser considerado un segmento de aminoácidos
de C5a no propio, y el segmento de aminoácidos de C5b puede ser
considerado un segmento de aminoácidos de C5b propio. Si un segmento
de aminoácidos de un miembro de una especie es considerado
polimórfico con respecto a otro miembro de la misma especie, ese
segmento de aminoácidos puede ser entonces considerado un segmento
de aminoácidos no propio para un miembro de la especie que no posea
ese polimorfismo. Por ejemplo, si un segmento de aminoácidos de C5
de un ser humano que tiene un tipo de polimorfismo en el segmento
de aminoácidos es introducido en un segundo ser humano que no tiene
ese tipo concreto de polimorfismo, el segmento de aminoácidos de C5
puede ser considerado un segmento de aminoácidos no propio para el
segundo ser humano. También se entenderá que epítopos de células T
ocultos (es decir, péptidos propios que no se expresan bajo
condiciones normales en moléculas del MHC hasta el nivel requerido
para el reconocimiento por células T) pueden ser considerados no
propios.
El segmento o segmentos propios de los
polipéptidos aquí proporcionados tienen típicamente una identidad de
al menos 90 por ciento (por ejemplo, una identidad de al menos 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento) con respecto a una
secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al cual se
administrará el polipéptido. En algunas realizaciones, el segmento
propio puede tener una identidad de 100 por ciento con respecto a
una secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al cual se
administrará el polipéptido. De este modo, el invento proporciona
polipéptidos que contienen un segmento de aminoácidos que tiene (1)
una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con respecto a una
secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, una secuencia
de aminoácidos de un mamífero concreto) en toda esa longitud. El
invento también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas
que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que contiene un segmento de aminoácidos que tiene (1)
una longitud, y (2) un porcentaje de identidad con respecto a una
secuencia de aminoácidos de un mamífero en toda esa longitud.
Típicamente, a la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de
mamífero se hace mención como "secuencia de referencia", y a la
secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que se compara con la
secuencia de mamífero se hace mención como "secuencia diana".
Por ejemplo, una secuencia de mamífero puede ser la secuencia de
referencia que tiene la secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 2.
La longitud y el porcentaje de identidad en toda
esa longitud para cualquier secuencia de aminoácidos o de ácido
nucleico se determinan del modo siguiente. En primer lugar, se
compara una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico con una
secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico del mamífero al cual se
administrará, utilizando el programa de secuencias BLAST 2 (B12seq)
de la versión independiente de BLASTZ que contiene la versión
2.0.14 de BLASTN y la versión 2.0.14 de BLASTP. Esta versión
independiente de BLASTZ se puede obtener de la página web de Fish
& Richardson (www.fr.com/blast), la página web del National
Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) del
gobierno de EE.UU., o la Old Westbury Library de la State University
of New York (QH 497.m6714). En el archivo "readme" que
acompaña a BLASTZ se pueden hallar instrucciones que explican cómo
utilizar el programa B12seq.
B12seq lleva a cabo una comparación entre dos
secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se
utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que
BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para
comparar dos secuencias de ácido nucleico, se ajustan las opciones
del modo siguiente: -i se ajusta a un archivo que contiene la
primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por
ejemplo, C:\seq1.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la
segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por
ejemplo, C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastn; -o se ajusta a
cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt);
-q se ajusta a -1; -r se ajusta a 2; y todas las demás opciones se
dejan en sus ajustes por defecto. Por ejemplo, se puede usar la
siguiente orden para generar un archivo de salida que contenga una
comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j
c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar
dos secuencias de aminoácidos, se ajustan las opciones de B12seq del
modo siguiente: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera
secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo,
C:\seq1.txt); -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda
secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo,
C:\seq2.txt); -p se ajusta a blastp; -o se ajusta a cualquier nombre
de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás
opciones se dejan en sus ajustes por defecto. Por ejemplo, se puede
utilizar la siguiente orden para generar un archivo de salida que
contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos:
C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt.
Si la secuencia diana comparte homología con cualquier porción de
la secuencia de mamífero, el designado archivo de salida presentará
entonces las regiones de homología como secuencias alineadas. Si la
secuencia diana no comparte homología con porción alguna de la
secuencia de mamífero, el designado archivo de salida no presentará
entonces secuencias alineadas.
Tras la alineación, se determina la longitud
contando el número de nucleótidos o restos de aminoácido
consecutivos de la secuencia diana presentados en alineación con la
secuencia de mamífero. Una posición correspondiente es cualquier
posición en que se presenta un nucleótido o resto de aminoácido
idéntico tanto en la secuencia diana como en la de mamífero. Los
huecos presentados en la secuencia diana no se cuentan ya que los
huecos no son nucleótidos ni restos de aminoácido. Asimismo, los
huecos presentados en la secuencia de mamífero no se cuentan ya que
se cuentan los nucleótidos o restos de aminoácido de la secuencia
diana, no los nucleótidos ni los restos de aminoácido de la
secuencia de mamífero.
El porcentaje de identidad en relación con una
longitud determinada se determina contando el número de posiciones
correspondientes en esa longitud y dividiendo ese número por la
longitud y multiplicando luego el valor resultante por 100. Por
ejemplo, si (1) se compara una secuencia diana de 300 aminoácidos
con una secuencia de referencia, (2) el programa B12seq presenta
200 aminoácidos consecutivos de la secuencia diana alineados con una
región de la secuencia de referencia, y (3) el número de
correspondencias a lo largo de esos 200 aminoácidos alineados es
180, esa secuencia diana de 300 aminoácidos contiene entonces un
segmento de aminoácidos que tiene una longitud de 200 y un
porcentaje de identidad de 90 [es decir, (180/200) x 100 = 90] en
toda esa longitud.
Se advierte que el porcentaje del valor de
identidad de secuencias se redondea a la décima más próxima. Por
ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondean hacia abajo hasta
75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean
hacia arriba hasta 75,2. También se advierte que el valor de
longitud será siempre un número entero.
El segmento o segmentos no propios de los
polipéptidos aquí proporcionados tienen típicamente una identidad
inferior a 95 por ciento (por ejemplo, una identidad inferior a 94,
93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 ó 50 por ciento) con
respecto a una secuencia de un polipéptido hallado en el mamífero al
cual se administrará el polipéptido.
Para preparar un polipéptido se puede utilizar
cualquier método, incluyendo, por ejemplo, la expresión por
sistemas procarióticos, la expresión por sistemas eucarióticos, y
técnicas de síntesis química. Para purificar un polipéptido se
puede utilizar cualquier método, incluyendo, sin limitación, el
fraccionamiento, la centrifugación y la cromatografía. Por ejemplo,
los polipéptidos que contienen proteína ligante de maltosa (MBP)
pueden ser purificados utilizando cromatografía de afinidad sobre
amilosa.
Como se utiliza aquí, la expresión "ácido
nucleico" abarca tanto RNA como DNA, incluyendo cDNA, DNA
genómico y DNA sintético (por ejemplo, químicamente sintetizado).
El ácido nucleico puede ser de cadena doble o de cadena sencilla.
Cuando es de cadena sencilla, el ácido nucleico puede ser la cadena
sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede
ser circular o lineal.
Como aquí se utiliza con referencia a un ácido
nucleico, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico
naturalmente presente que no está inmediatamente contiguo a una o
las dos secuencias a las que está inmediatamente contiguo (una en
el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma naturalmente
presente del organismo del cual procede. Por ejemplo, un ácido
nucleico aislado puede ser, sin limitación, un DNA recombinante de
cualquier longitud con tal de que esté eliminada o ausente una de
las secuencias de ácido nucleico normalmente halladas flanqueando
inmediatamente ese DNA recombinante en un genoma presente en la
naturaleza. De esta manera, un ácido nucleico aislado incluye, sin
limitación, un DNA recombinante que es independiente de otras
secuencias (por ejemplo, un cDNA o un fragmento de DNA genómico
producido mediante PCR o mediante tratamiento con endonucleasas de
restricción), así como DNA recombinante que está incorporado a un
vector, un plásmido autónomamente replicante, un virus (por
ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpesvirus) o el DNA genómico
de un procarionte o eucarionte. Además, un ácido nucleico aislado
puede incluir un DNA recombinante que sea parte de una secuencia de
ácido nucleico híbrida o de fusión.
Como aquí se utiliza con referencia a un ácido
nucleico, el término "aislado" también incluye cualquier ácido
nucleico que no aparece naturalmente ya que las secuencias de ácido
nucleico que no aparecen naturalmente no se encuentran en la
naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un
genoma que aparece naturalmente. Por ejemplo, se considera que un
ácido nucleico que no aparece naturalmente, tal como un ácido
nucleico diseñado, es un ácido nucleico aislado. Se puede preparar
un ácido nucleico diseñado utilizando técnicas de clonación
molecular o de síntesis química de ácido nucleico. El ácido nucleico
aislado que no aparece naturalmente puede ser independiente de
otras secuencias o estar incorporado a un vector, un plásmido
autónomamente replicante, un virus (por ejemplo, un retrovirus,
adenovirus o herpesvirus) o el DNA genómico de un procarionte o
eucarionte. Además, un ácido nucleico que no aparece naturalmente
puede incluir un ácido nucleico que sea parte de una secuencia de
ácido nucleico híbrida o de fusión.
No se ha de considerar un ácido nucleico aislado
el ácido nucleico que existe entre de cientos a millones de otros
ácidos nucleicos en, por ejemplo, bancos de cDNA o genómicos, ni los
cortes de geles que contienen fragmentos de digestión de DNA
genómico con enzimas de restricción.
Como se utiliza aquí con referencia a un ácido
nucleico y a una célula concreta, el término "exógeno" se
refiere a cualquier ácido nucleico que no tiene su origen en esa
célula concreta como se encuentra en la naturaleza. De esta manera,
se considera que cualquier ácido nucleico que no aparece
naturalmente es exógeno para una célula una vez introducido en la
célula. Es importante advertir que un ácido nucleico que no aparece
naturalmente puede contener secuencias de ácido nucleico o
fragmentos de secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la
naturaleza, con tal de que el ácido nucleico en su totalidad no
exista en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico que
contiene una secuencia de DNA genómico en un vector de expresión es
un ácido nucleico que no aparece naturalmente y, por lo tanto, es
exógeno para una célula una vez introducido en la célula ya que el
ácido nucleico en su totalidad (DNA genómico más DNA vector) no
existe en la naturaleza. De este modo, se considera que cualquier
vector, plásmido autónomamente replicante o virus (por ejemplo,
retrovirus, adenovirus o herpesvirus) que en su totalidad no exista
en la naturaleza es un ácido nucleico que no aparece naturalmente.
De esto resulta que los fragmentos de DNA genómico producidos por
PCR o por tratamiento con endonucleasas de restricción así como los
cDNAs son considerados ácidos nucleicos que no aparecen naturalmente
ya que existen como moléculas independientes no halladas en la
naturaleza. También resulta que cualquier ácido nucleico que
contenga una secuencia promotora y una secuencia codificadora de
polipéptido (por ejemplo, cDNA o DNA genómico) en una disposición
no hallada en la naturaleza es un ácido nucleico que no aparece
naturalmente.
Un ácido nucleico que se encuentra en la
naturaleza puede ser exógeno para una célula concreta. Por ejemplo,
un cromosoma completo aislado de una célula de la persona X es un
ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la persona Y
una vez que se introduce ese cromosoma en la célula de Y.
Se pueden obtener ácidos nucleicos aislados
utilizando cualquier método, incluyendo, sin limitación, las
técnicas comunes de clonación molecular y de síntesis química de
ácido nucleico. Por ejemplo, se puede utilizar la PCR para obtener
un ácido nucleico aislado que contenga una secuencia de ácido
nucleico que presente similitud con respecto a la secuencia
expuesta en la ID. SEC. nº 1. La PCR se refiere a un procedimiento o
técnica con que se multiplica un ácido nucleico diana de un modo
similar al descrito en la Patente de EE.UU. nº 4.683.195, y a las
subsiguientes modificaciones del procedimiento en ella descrito.
Generalmente, se utiliza información sobre la secuencia desde los
extremos de la región de interés o más allá para diseñar cebadores
oligonucleotídicos que tengan una secuencia idéntica o similar a la
de las cadenas opuestas de un posible molde que se va a multiplicar.
Usando la PCR, se puede multiplicar una secuencia de ácido nucleico
a partir de RNA o DNA. Por ejemplo, se puede aislar una secuencia
de ácido nucleico mediante multiplicación por PCR a partir de RNA
celular total, DNA genómico total o cDNA, así como a partir de
secuencias de bacteriófagos, secuencias de plásmidos, secuencias
víricas, y similares. Cuando se utiliza RNA como fuente del molde,
se puede utilizar la transcriptasa inversa para sintetizar cadenas
de DNA complementarias.
También se pueden obtener ácidos nucleicos
aislados mediante mutagénesis. Por ejemplo, un ácido nucleico
aislado que contenga una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1
puede ser mutado usando técnicas de clonación molecular habituales
(por ejemplo, una mutagénesis dirigida al sitio). Las mutaciones
posibles incluyen, sin limitación, deleciones, inserciones y
sustituciones, así como combinaciones de deleciones, inserciones y
sustituciones.
Además, se pueden utilizar bases de datos de
ácidos nucleicos y aminoácidos (por ejemplo, GenBank®) para obtener
un ácido nucleico aislado. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier
secuencia de ácido nucleico que presente cierta homología con una
secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1, o cualquier secuencia de
aminoácidos que presente cierta homología con una secuencia
expuesta en la ID. SEC. nº 2, como sujeto de búsqueda en
GenBank®.
Además, se pueden utilizar técnicas de
hibridación de ácido nucleico para obtener un ácido nucleico
aislado. En pocas palabras, cualquier ácido nucleico que presente
cierta homología con una secuencia expuesta en la ID. SEC. nº 1
puede ser utilizado como una sonda para identificar un ácido
nucleico similar mediante hibridación bajo unas condiciones de
rigurosidad moderada a elevada. Una vez identificado, el ácido
nucleico puede ser purificado, secuenciado y analizado para
determinar si está dentro del alcance del invento como aquí se
describe.
La hibridación se puede hacer mediante un
análisis Southern o Northern para identificar una secuencia de DNA
o RNA, respectivamente, que se hibride con una sonda. La sonda puede
ser marcada con biotina, digoxigenina, una enzima o un radioisótopo
tal como ^{32}P. El DNA o RNA que se va a analizar puede ser
sometido a separación electroforética en un gel de agarosa o
poliacrilamida, transferido a nitrocelulosa, nailon u otra membrana
adecuada, e hibridado con la sonda utilizando técnicas estándares
bien conocidas en este campo, tales como las descritas en las
secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al.
(1989), "Molecular Cloning", segunda edición, Cold Spring
Harbor Laboratory, Plainview, Ney York, EE.UU.
Además, se puede utilizar cualquier método para
dirigir la transcripción o traducción de un ácido nucleico aislado
concreto que codifica un polipéptido. Dichos métodos incluyen, sin
limitación, la construcción de un ácido nucleico de modo que un
elemento regulador promueva la expresión de una secuencia de ácido
nucleico que codifica un polipéptido. Típicamente, los elementos
reguladores son secuencias de DNA que regulan la expresión de otras
secuencias de DNA a nivel de transcripción. Por lo tanto, los
elementos reguladores incluyen, sin limitación, promotores,
potenciadores y similares.
Los polipéptidos aquí proporcionados pueden ser
utilizados en la fabricación de un medicamento o una composición
para tratar la artritis reumatoide. La composición puede contener un
polipéptido que actúe como un antígeno contra el que se desea una
respuesta inmune. Además, la composición puede contener más de un
polipéptido o cualquier combinación de diferentes polipéptidos. Se
advierte que cada polipéptido de la composición puede tener una
secuencia de aminoácidos idéntica. Además, los polipéptidos de la
composición pueden contener diferentes segmentos de aminoácidos,
cada uno de los cuales puede actuar como una unidad antigénica
definida contra la que se desea una respuesta inmune. De esta
manera, los polipéptidos de la composición pueden contener
diferentes segmentos de aminoácidos que correspondan a cualquier
región de un polipéptido, incluyendo, sin limitación, regiones de
unión al receptor, regiones de unión al ligando, sitios activos de
enzimas, sitios de sustratos polipeptídicos para escisión
enzimática, regiones de anticuerpo que se unen al antígeno, y
epítopos reconocidos por anticuerpos. Por ejemplo, los polipéptidos
de la composición pueden incluir tres diferentes segmentos de
aminoácidos, cada uno de los cuales corresponda a la secuencia de C5
que reconoce la convertasa de C5. Además, segmentos diferentes o
idénticos de aminoácidos pueden estar en tándem o estar dispersos a
lo largo del mismo polipéptido. Típicamente, la administración de
un polipéptido da lugar a la formación de anticuerpos que presentan
especificidad para un epítopo o una combinación de epítopos formados
por los segmentos de aminoácidos situados dentro de uno o más de
los polipéptidos de la composición.
Se puede preparar una composición combinando
cualquiera de los polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos
inmunogénicos) aquí proporcionados con un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, sin
limitación, disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no
acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen,
por ejemplo, aceite mineral, propilenglicol, polietilenglicol,
aceites vegetales y ésteres orgánicos inyectables. Los vehículos
acuosos incluyen, sin limitación, agua, alcohol, disolución salina y
disoluciones tamponadas. También pueden estar presentes
conservantes, agente saboreadores y otros aditivos tales como, por
ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes,
gases inertes, y similares. Se apreciará que cualquier material
aquí descrito que se va a administrar a un mamífero puede contener
uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
La composición también incluye un adyuvante. Un
"adyuvante" es un compuesto inmunológico que puede potenciar
una respuesta inmune contra un antígeno concreto, tal como un
polipéptido. Se pueden combinar adyuvantes tales como, por ejemplo,
hidróxido de aluminio y otros compuestos basados en aluminio (por
ejemplo, Al_{2}O_{3}) con un polipéptido que contiene un
segmento de aminoácidos propio (por ejemplo, un segmento de
aminoácidos de C5a propio) para formar una composición que provoque
una respuesta anti-propio cuando se administra a un
mamífero. Los compuestos basados en aluminio se pueden obtener de
diversos proveedores comerciales. Por ejemplo, los adyuvantes
REHYDRAGEL® se pueden obtener de Reheis Inc. (Berkeley Heights, New
Jersey, EE.UU.). Los adyuvantes REHYDRAGEL® se basan en
oxihidróxido de aluminio cristalino y son geles hidratados que
contienen partículas cristalinas con una elevada superficie
específica (aproximadamente 525 m^{2}/g). Su contenido de
Al_{2}O_{3} varía típicamente de aproximadamente 2 por ciento a
aproximadamente 10 por ciento. Por ejemplo, Rehydragel LG tiene un
contenido de Al_{2}O_{3} de aproximadamente 6 por ciento y fluye
fácilmente tras una ligera agitación. Además, Rehydragel LG tiene
una capacidad ligante de proteínas de 1,58 (es decir, 1,58 mg de
albúmina sérica bovina unida por 1 mg de Al_{2}O_{3}), un
contenido de sodio de 0,02 por ciento, un contenido de cloruro de
0,28 por ciento, un nivel de sulfato indetectable, un nivel de
arsénico inferior a 3 ppm, un contenido de metales pesados inferior
a 15 ppm, un pH de 6,5 y una viscosidad de 1090 mPa\cdots. Se
puede combinar Rehydragel LG con una disolución de polipéptido (por
ejemplo, un polipéptido en PBS) para obtener
Al(OH)_{3}. Además, se puede usar
ALHYDROGEL^{TM}, un adyuvante de gel de hidróxido de aluminio
(Alhydrogel 1,3%, Alhydrogel 2,0% o Alhydrogel "85") obtenido
de Brenntag Stinnes Logistics.
Además, se puede combinar MN51 con los
polipéptidos aquí proporcionados para formar una composición que
provoque una respuesta anti-propio cuando se
administra a un mamífero. MN51 {MONTANIDE® 51 [Adyuvante Incompleto
de SEPPIC (ISA; del inglés, Incomplete SEPPIC
Adjuvant)]} y también MN720 son asequibles de Seppic (París,
Francia). MN51 contiene oleato de manida (MONTANIDE® 80, también
conocido como octadecenoato de manitol anhidro) en una disolución
de aceite mineral (Drakeol 6 VR). MONTANIDE® 80 es un líquido claro
con un valor máximo de acidez de 1, un valor de saponificación de
164-172, un valor de hidroxilo de
89-100, un valor de yodo de 67-75,
un valor máximo de peróxido de 2, un valor de metales pesados
inferior a 20 ppm, un contenido máximo de agua de 0,35%, un valor
máximo de color de 9, y una viscosidad de aproximadamente 300
mPa\cdots a 25ºC. MONTANIDE® asociado con aceite (por ejemplo,
aceite mineral, aceite vegetal, escualano, escualeno o ésteres) es
conocido como MONTANIDE® ISA. Drakeol 6 VR es un aceite mineral de
calidad farmacéutica. Drakeol 6 VR no contiene hidrocarburos
insaturados ni aromáticos y tiene una densidad A.P.I. de
36,2-36,8, una densidad relativa de
0,834-0,838 a 25ºC, una viscosidad de
59-61 SSU o
10,0-10,6\cdot10^{-6} m^{2}/s a 37,8ºC, un
índice de refracción de 1,458-1,463 a 25ºC, y un
valor de acidez mejor que el mínimo en la prueba de acidez, es
negativo en cuanto a fluorescencia a 360 nm, es negativo en cuanto
a materia suspendida visible, tiene un valor de -17,8 a -9,4ºC en la
prueba de fluidez ASTM, tiene un punto mínimo de inflamabilidad ASTM
de 146,1ºC, y cumple todos los requisitos RN para aceites minerales
ligeros y en cuanto a absorción ultravioleta. MN51 contiene
aproximadamente de 8 a 12 por ciento de octadecenoato de manitol
anhidro y aproximadamente de 88 a 92 por ciento de aceite mineral.
MN51 es un líquido amarillo claro que tiene un valor máximo de
acidez de 0,5, un valor de saponificación de 16-20,
un valor de hidroxilo de 9-13, un valor máximo de
peróxido de 2, un valor de yodo de 5-9, un contenido
máximo de agua de 0,5 por ciento, un índice de refracción de entre
1,455 y 1,465 a 25ºC, una densidad de aproximadamente 0,85 a 20ºC y
una viscosidad de aproximadamente 50 mPa\cdots a 20ºC. La
conductividad de una mezcla 50:50 de MN51 y disolución salina es
inferior a 10 \muS/cm.
Otros adyuvantes incluyen complejos
inmunoestimulantes (ISCOMs; del inglés,
immune-stimulating complexes) que pueden
contener componentes tales como colesterol y saponinas. Se pueden
preparar matrices de ISCOMs y se pueden conjugar con Cu^{2+}
usando métodos tales como los aquí descritos. Adyuvantes tales como
FCA, FIA, MN51, MN720 y Al(OH)_{3} son
comercialmente asequibles de compañías tales como Seppic, Difco
Laboratories (Detroit, Michigan, EE.UU.) y Superfos Biosector A/S
(VedBeak, Dinamarca).
En ciertas realizaciones, la composición puede
contener también uno o más componentes inmunoestimuladores
adicionales. Estos incluyen, sin limitación,
muramil-dipéptido (por ejemplo,
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina;
MDP), monofosforil-lípido A (MPL), y tripéptidos
que contienen formil-metionina tales como
N-formil-Met-Leu-Phe.
Dichos compuestos son comercialmente asequibles de, por ejemplo,
Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, EE.UU.) y RIBI ImmunoChem
Research, Inc. (Hamilton, Montana, EE.UU.).
Las composiciones aquí proporcionadas pueden
contener cualquier relación de adyuvante a polipéptido. Por ejemplo,
la relación adyuvante:antígeno puede ser 50:50 (volumen:volumen).
Alternativamente, la relación adyuvante:antí-
geno puede ser, sin limitación, 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80 ó 10:90.
geno puede ser, sin limitación, 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80 ó 10:90.
Se puede administrar a un huésped una cantidad
eficaz de cualquier composición aquí proporcionada. Como aquí se
utiliza, el término "eficaz" se refiere a cualquier cantidad
que provoca una respuesta inmune deseada sin producir una toxicidad
significativa en el huésped. Dicha cantidad puede ser determinada
evaluando la respuesta inmune del huésped después de la
administración de una cantidad conocida de una composición concreta.
Además, el nivel de toxicidad, si lo hubiera, puede ser determinado
evaluando síntomas clínicos del huésped antes y después de la
administración de una cantidad conocida de una composición concreta.
Se advierte que la cantidad eficaz de una composición concreta
administrada a un huésped puede ser ajustada de acuerdo con unos
resultados deseados así como con la respuesta del huésped y el
nivel de toxicidad. La toxicidad significativa puede variar para
cada huésped particular y depende de múltiples factores que
incluyen, sin limitación, el estado morboso, la edad y la
tolerancia al dolor del huésped.
Además, cualquier composición aquí descrita
puede ser administrada a cualquier parte del cuerpo del huésped. Se
puede distribuir una composición, sin limitación, en las
articulaciones, la mucosa nasal, la sangre, los pulmones, los
intestinos, tejidos musculares, la piel o la cavidad peritoneal de
un mamífero. Además, la composición se puede administrar mediante
inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea,
intratecal o intradérmica, mediante administración oral o nasal,
por inhalación, o por perfusión gradual a lo largo del tiempo. En
un ejemplo más, se puede administrar una preparación de una
composición en aerosol a un huésped por inhalación. La duración del
tratamiento con cualquier composición aquí proporcionada puede ser
cualquiera, desde tampoco como un día hasta tanto como la vida
entera del huésped (por ejemplo, muchos años). Por ejemplo, se
puede administrar un polipéptido una vez al mes durante tres meses o
una vez al año durante un periodo de diez años. Se advierte también
que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo,
se puede administrar un polipéptido una vez (o dos veces, tres
veces, etc.) al día, a la semana, al mes o al año.
Se puede utilizar cualquier método para
determinar si se provoca una respuesta inmune concreta. Por ejemplo,
se pueden determinar las respuestas de anticuerpos contra antígenos
concretos utilizando un ensayo inmunológico (por ejemplo, un ensayo
ELISA). En dicho ensayo, se pueden revestir los pocillos de una
placa de microtitulación con C5 y se pueden incubar con suero de un
mamífero tratado con una composición destinada a producir
anticuerpos anti-C5 en ese mamífero, y se puede
determinar la presencia o ausencia de anticuerpos
anti-C5 utilizando anti-IgG de rata
marcada. Además, se pueden utilizar métodos clínicos que permiten
evaluar el grado de un estado morboso concreto, para determinar si
se provoca una respuesta inmune deseada. Por ejemplo una reducción
de la inflamación puede indicar una respuesta inmune deseada en un
paciente tratado con una composición destinada a producir
anticuerpos anti-C5. Para respaldar la indicación de
una respuesta inmune deseada, se pueden medir los niveles de
anticuerpos anti-C5 en una muestra de sangre de
dicho paciente utilizando la técnica ELISA anteriormente
descrita.
Los polipéptidos y composiciones aquí
proporcionados se pueden utilizar en la fabricación de un
medicamento (por ejemplo, un medicamento para tratar un estado
inflamatorio). Además, el invento proporciona artículos de
fabricación que pueden incluir polipéptidos y composiciones aquí
proporcionados. Los componentes y métodos para producir artículos
de fabricación son bien conocidos. Un artículo de fabricación del
invento incluye uno o más polipéptidos que provocan la producción
de un anticuerpo anti-C5 propio (uno o más
polipéptidos que contienen un segmento de aminoácidos de C5a propio
y un segmento de aminoácidos no propio de MBP bacteriana, tal como
un segmento de aminoácidos de C5 no propio). Además, el artículo de
fabricación puede incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos
de control para tratar o verificar un estado inflamatorio. En
algunas realizaciones, dichos artículos de fabricación pueden
incluir una etiqueta o instrucciones que indiquen que los
polipéptidos contenidos en ellos son eficaces para tratar un estado
inflamatorio.
El invento será adicionalmente descrito en los
ejemplos siguientes, los cuales no limitan el alcance del invento
descrito en las reivindicaciones.
En la Figura 1 se muestra una secuencia de DNA
de pro-C5 de ratón (ID. SEC. nº 1), y en la Figura 2
se muestra la secuencia de aminoácidos de pro-C5 de
ratón incluyendo el péptido señal (ID. SEC. nº 2). La región de
codificación del C5a de ratón fue aislada mediante multiplicación
por PCR a partir de un banco de cDNA total de hígado de ratón. El
fragmento de PCR fue ligado en el vector de expresión bacteriano
pMAL-p2x (Figura 3; New England Biolabs, Beverly,
Massachusetts, EE.UU.), adyacentemente a una secuencia que codifica
una porción de la proteína ligante de maltosa (MBP). La región de
codificación del polipéptido de fusión MBP-C5a fue
luego multiplicada por PCR a partir de este vector. Para facilitar
la purificación final del polipéptido de fusión, el cebador 5' de
PCR también codificaba seis restos de histidina. Además, el cebador
5' contenía un sitio EcoRI, y el cebador 3' contenía un
sitio SalI con fines de clonación. El producto de PCR
(secuencia mostrada en la Figura 4) fue transferido a un vector de
expresión de mamífero, el pCEP-Pu2 episomalmente
mantenido, que contiene una secuencia señal de una región
inmunoglobulínica variable. El sitio SalI del producto de
PCR fue ligado en el sitio XhoI del vector
pECP-Pu2, lo que dio lugar a la destrucción de ambos
sitios. En la ID. SEC. nº 3 se expone la secuencia de nucleótidos
del producto de PCR que codifica el polipéptido de fusión, y en la
ID. SEC. nº 4 se expone la secuencia de aminoácidos del polipéptido
de fusión.
Se transfectaron células
293-EBNA con la construcción
pCEP-Pu2 que contenía el polipéptido de fusión
6His-MBP-C5a, para la
sobreexpresión y purificación del polipéptido de fusión secretado.
Las células EBNA-293 de mamífero fueron
transfectadas por lipofección y fueron cultivadas en medio Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternera
fetal al 5%, 0,5 \mug/ml de puromicina, 50 \mug/ml de
gentamicina y 100 \mug/ml de geneticina. Se desarrollaron las
células en crecimiento y se recogieron los medios acondicionados
cada 4-5 días. Se separaron las células y los
fragmentos celulares mediante centrifugación.
El polipéptido de fusión contenía seis restos de
histidina para permitir la purificación utilizando agarosa
Ni-NTA. Se añadió una parte alícuota de 0,75 ml de
una suspensión de agarosa Ni-NTA (QIAGEN GmbH,
Alemania) que contenía \sim0,35 ml de glóbulos en etanol al 20%,
por 500 ml de medio acondicionado. Después de una incubación
durante la noche a 4ºC en un sacudidor, la agarosa
Ni-NTA fue recogida como sedimento tras una
centrifugación a aproximadamente 2000 g durante 10 minutos y fue
transferida a columnas. Los glóbulos fueron lavados con PBS, pH de
7,4, en presencia de NaCl 1 M y Tween-20 al 01%,
realizándose la elución con imidazol 100 mM (Merck, Alemania) en
Tris 20 mM, pH de 8,0, con NaCl 0,1 M, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las fracciones que contenían el
polipéptido fueron reunidas y fueron dializadas frente a PBS, pH de
7,4, utilizando una membrana con un corte de pesos moleculares de
12.000-14.000 Da (Spectra/Por Membranes, Spectrum
Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, California, EE.UU.). Si era
necesario, las muestras eran concentradas usando un dispositivo
centrífugo Macrosep 10K (PALL Gelman Laboratory). La concentración
final de polipéptido fue estimada mediante un ensayo Bradford
(Ensayo BIO-RAD para Proteínas,
Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE.UU.).
Las células producían el polipéptido de fusión
6His-MBP-C5a con un nivel de
aproximadamente 2 mg/litro. Para la estimación del tamaño se usó un
marcador Rainbow de pesos moleculares para proteínas (Amersham
International, Buckinghamshire, Inglaterra). El polipéptido migraba
hasta una posición correspondiente al tamaño esperado de 53 kDa. En
la Figura 5 se muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido
de fusión.
El polipéptido purificado
6His-MBP-C5a en PBS fue combinado
con adyuvante completo de Freund (CFA; del inglés, Complete
Freund's Adjuvant) o adyuvante incompleto de Freund
(IFA; del inglés, Incomplete Freund's Adjuvant)
en una relación 1:1 inmediatamente antes de su uso. La disolución
fue hecha subir y bajar repetidamente por una jeringa Hamilton
(Hamilton Corp., Reno, Nebraska, EE.UU.) provista de una aguja 18G,
realizándose el mezclamiento hasta que se formó una emulsión blanca
con unas características reológicas similares a las de un ungüento.
Para la administración de la mezcla se colocó una aguja 23G en la
jeringa. También se preparó una mezcla testigo que contenía
volúmenes iguales de PBS y CFA o IFA.
Se repartieron machos de ratón QB (Balb/c X
B10.Q) F1, de doce semanas de edad, en dos grupos de 14 ó 16
animales cada uno y se les inyectó subcutáneamente la mezcla
testigo o 100 \mug de MBP-C5a emulsionado en CFA
el día -21 entre las escápulas. También se tomaron muestras de
sangre el día -21, y se almacenaron los sueros a -20ºC. El día -3 y
el día 28 los animales recibieron inyecciones de refuerzo de la
mezcla testigo o de 50 \mug de MBP-C5a en IFA.
Las inyecciones se administraron típicamente en un volumen de 100 a
200 \mul.
Para provocar la artritis, se inyectaron
intradérmicamente 100 \mug de CII sometido a digestión con pepsina
y emulsionado 1:1 en CFA, el día 0, en la base de la cola de los
ratones. Se esperaba que la artritis se desarrollara entre los días
28 y 56. Los animales recibieron una inyección de refuerzo de CII
emulsionado en IFA el día 35, y se tomaron muestras de sangre el
día 35. Los animales fueron examinados al menos tres veces a la
semana desde el día 14 hasta el día 90, cuando finalizó el
experimento. Los animales fueron calificados a ciegas utilizando un
sistema de calificación basado en el número de articulaciones
inflamadas en cada pata. La inflamación fue definida por la
tumefacción y el enrojecimiento. En este sistema de calificación,
cada dedo o nudillo inflamado recibió un punto, mientras que una
muñeca o tobillo inflamado recibió cinco puntos. Esto daba lugar a
una calificación de 0-15 para cada pata (5 dedos + 5
nudillos + 1 muñeca/tobillo) y de 0-60 para cada
ratón. El experimento finalizó el día 90 o cuando se juzgó
apropiado basándose en el desarrollo de la artritis. Ningún ratón
presentó indicios de estado anormal del pelaje, cambios
estereotípicos o de conducta, infección ni otros efectos
secundarios graves o inesperados aparte de los síntomas que aparecen
normalmente en relación con la esperada enfermedad artrítica. Se
anestesiaron los animales con enflurano (Forene®)/oxígeno y se
obtuvo sangre mediante punción reorbital. Se recogió el suero y se
almacenó a -20ºC. Utilizando un método ELISA, se evaluaron los
niveles de anticuerpos anti-CII y
anti-C5a en los sueros recogidos los días -21 y 35 y
al final del estudio.
Se utilizó el test Mann-Whitney
para analizar los datos de calificación, y se usaron las áreas bajo
las curvas y los valores de chi-cuadrado para
analizar la significación de la incidencia de la artritis. El día 28
después del primer tratamiento con colágeno, siete de los 14
ratones del grupo testigo (50%) presentaban inflamación, mientras
que sólo 2 de los 16 ratones (12,5%) pretratados con
MBP-C5a presentaban inflamación (Figura 6). Estos
datos dieron lugar a un valor P en chi-cuadrado de
0,025. La incidencia acumulada de inflamación (a partir del día 67)
fue 14 de 14 en el grupo testigo y 11 de 16 en el grupo pretratado
con MBP-C5a (P = 0,022). Por lo tanto, la
incidencia de artritis provocada con colágeno fue significativamente
diferente entre los dos grupos.
Entre los días 1 y 90 se representó gráficamente
para cada grupo la calificación media de artritis basada en la
cantidad de inflamación (Figura 7). La calificación máxima de 1
ratón para cada grupo fue 60. Al final del estudio, la gravedad
máxima dio como resultado un valor medio de 38,6 en el grupo testigo
y de19,0 en el grupo pretratado con MBP-C5a (P =
0,0085; Figura 8). El área bajo la curva dio como resultado un valor
medio de 485,9 en el grupo testigo y de 168,9 en el grupo
pretratado con MBP-C5a (P = 0,0012; Figura 9). Estos
resultados demostraron que el tratamiento con el polipéptido de
fusión MBP-C5a daba lugar a disminuciones en la
incidencia y la gravedad de la artritis provocada con colágeno en
estos animales.
El polipéptido purificado
MBP-C5a en PBS fue combinado con CFA o IFA del modo
anteriormente descrito. También se preparó una mezcla testigo que
contenía volúmenes iguales de PBS y CFA o IFA.
Se inyectaron intradérmicamente 100 \mug de
CII sometido a digestión con pepsina y emulsionado 1:1 en IFA en la
base de la cola de machos y hembras de ratón QB-BC
[B10.Q (Balb/c X B10.Q)] de ocho a diez semanas de edad. Después de
35 días, los ratones recibieron una segunda inyección con 50 \mug
de CII sometido a digestión con pepsina, en IFA. Luego se
calificaron los ratones al menos 3 veces a la semana durante el
desarrollo de la artritis crónica. Muchos de los ratones, aunque no
todos, desarrollaron un curso morboso crónico con recidivas,
caracterizado por períodos de recurrencia de artritis activa. Estas
recidivas aparecían sin predicción y duraban unas pocas semanas
cada vez, y parecía que iban a producirse durante toda la vida. La
variabilidad del efecto de la artritis en la cohorte se debía
esencialmente a la heterogeneidad genética (los ratones eran
animales N2, debido a un diseño experimental dirigido a reproducir
la situación genética en seres humanos).
Para coordinar la recurrencia de las recidivas,
los ratones fueron inmunizados de nuevo con CII durante la fase
crónica de recidivas. Cuando los ratones tenían
12-14 meses de edad, los animales que presentaban
enfermedad crónica con recidivas pero que no presentaban una
recidiva morbosa activa en ese momento fueron aleatoriamente
mezclados y repartidos en cuatro grupos de igual tamaño. Para
provocar una recidiva de artritis controlada, se inyectó
subcutáneamente PBS solo o 100 \mug de MBP-C5a en
PBS (n = 24), cada uno emulsionado 1:1 en CFA (n = 12), a los
ratones el día -21 (día 259 después de la primera inmunización con
CII) entre las escápulas. Los animales recibieron una inyección de
refuerzo de 50 \mug de MBP-C5a en PBS o de PBS
solo (cada uno en CFA) el día -3. El día 0 (día 280 después de la
primera inmunización con CII), se inyectaron intradérmicamente 50
\mug de CII sometido a digestión con pepsina y emulsionado 1:1 en
IFA a los animales de ambos grupos en la base de la cola. Se
administró una segunda inyección de refuerzo de 50 \mug de
MBP-C5a en PBS o de PBS solo el día 21 (día 301
después de la primera inmunización con CII). Además, se obtuvieron
muestras de sangre mediante punción reorbital el día -21 y el día
0.
Los animales fueron calificados a ciegas
utilizando el sistema de calificación anteriormente descrito, el
cual daba lugar a una calificación de artritis de
0-60 para cada ratón. El experimento finalizó el día
358 después de la primera inmunización con CII. Estos estudios
revelaron que, aunque todos los ratones testigo presentaban
síntomas de artritis, especialmente cerca del día 40, sólo el 50% de
los ratones inmunizados con MBP-C5a presentaban
artritis crónica (p < 0,05; Figura 10). Además, se determinó la
calificación media de artritis para los dos grupos desde el
comienzo del estudio (es decir, desde la primera inyección de CII)
hasta el final del estudio, más de 358 días después y el día 78
después de la nueva provocación o recaída (Figura 11). La
calificación media de artritis no fue significativamente diferente
entre los dos grupos hasta la inmunización con
MBP-C5a, después de la cual la calificación media de
artritis para el grupo tratado fue significativamente menor que
para el grupo testigo (P < 0,05; Figura 11). Estos resultados
demuestran que el polipéptido MBP-C5a de fusión era
capaz de reducir la incidencia de artritis crónica con recidivas en
los animales tratados.
Se ha de entender que, aunque el invento ha sido
descrito conjuntamente con su descripción detallada, la descripción
precedente está destinada a ilustrar y no a limitar el alcance del
invento, el cual viene definido por el alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (10)
1. Uso de una composición que comprende un
adyuvante y un polipéptido para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de la artritis reumatoide en un mamífero, en que
dicho polipéptido comprende un segmento de aminoácidos propio del
factor C5a del complemento, con una longitud superior a 40 restos de
aminoácido, y un segmento de aminoácidos de la proteína ligante de
maltosa (MBP) bacteriana, con una longitud superior a 40 restos de
aminoácido, y en que dicho polipéptido provoca una respuesta
anti-factor C5a propio del complemento en dicho
mamífero.
2. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho
adyuvante es un compuesto basado en aluminio.
3. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho
adyuvante es hidróxido de aluminio.
4. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho
polipéptido carece de un sitio de escisión por factor Xa entre
dicho segmento de aminoácidos de C5a y dicho segmento de aminoácidos
de la proteína ligante de maltosa.
5. El uso de la Reivindicación 1, en que dicho
mamífero es un ser humano.
6. Una composición para uso en el tratamiento de
la artritis reumatoide en un mamífero, composición que comprende un
adyuvante y un polipéptido, en que dicho polipéptido comprende un
segmento de aminoácidos propio del factor C5a del complemento, con
una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y un segmento de
aminoácidos de la proteína ligante de maltosa (MBP) bacteriana, con
una longitud superior a 40 restos de aminoácido, y en que dicho
polipéptido provoca una respuesta anti-factor C5a
propio del complemento en dicho mamífero.
7. La composición para el uso de la
Reivindicación 6, en que dicho adyuvante es un compuesto basado en
aluminio.
8. La composición para el uso de la
Reivindicación 6, en que dicho adyuvante es hidróxido de
aluminio.
9. La composición para el uso de la
Reivindicación 6, en que dicho polipéptido carece de un sitio de
escisión por factor Xa entre dicho segmento de aminoácidos de C5a y
dicho segmento de aminoácidos de la proteína ligante de
maltosa.
10. La composición para el uso de la
Reivindicación 6, en que dicho mamífero es un ser humano.
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