KR20050090390A - 자기 ｃ５ 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을포함하는 폴리펩티드를 이용하여 염증성 질환을 치료하기위한 방법 및 물질 - Google Patents
자기 ｃ５ 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을포함하는 폴리펩티드를 이용하여 염증성 질환을 치료하기위한 방법 및 물질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 염증성 질환을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 C5 또는 C5a와 같은 항원에 대하여 포유 동물에서 항체 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있는 폴리펩티드, 단리된 핵산, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 예를 들어 본 명세서에 개시된 방법 및 물질을 사용하여 포유 동물에 있어서 수용체 결합된 총 C5a의 양을 감소시킴으로써 포유 동물 내에서의 C5a의 영향을 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 염증성 질환의 치료에 관련된 방법 및 물질에 관한 것이다.
류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 말초 관절을 손상시키는 염증성 자가면역 질환이다. 콜라겐-유도된 관절염 동물 모델이 RA 질환에 관련된 유전자의 규정을 도왔다. RA 질환의 개시 및 유지에 중요한 주 조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 II 유전자(마우스에 있어서 Aq)가 동정되었다. 상기 유전자는 인간에 있어서 HLA-DR 유전자 DR*0401에 기능적으로 상응하는데, 이는 T 세포에 의해 매개되는 관절 특이적 항원의 자가면역 인식이 이 질병에 연루되어 있음을 시사한다.
MHC의 바깥 쪽 영역의 유전자도 RA 질환의 개시 및 유지에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이러한 유전자 영역 중 하나는 마우스에 있어서 2번 염색체에 위치하며 보체 인자 C5를 코딩하는 유전자를 포함한다. C5의 활성 성분 중 하나는 C5a이며, 이는 면역 복합체에 보체가 결합되는 중에 방출된다. C5a의 방출은 류마티스성 염증을 유도하는 여러 상이한 경로를 촉발시킨다. 염증성 관절에서 국소적으로 생성된 C5a는 대식 세포 및 호중성 과립구 상의 수용체에 결합할 수 있으며, 이는 염증 세포가 관절 내로 침윤되게 한다. C5는 또한 보체 매개 과정, 예를 들어 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 및 이식 거부와, 보체 매개 염증성 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염, 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 아테롬성 경화증, 및 혈관염에서 주된 역할을 한다.
개요
본 발명은 포유 동물에 있어서의 염증성 질환, 예를 들어 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 이식 거부, 류마티스성 관절염, 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 아테롬성 경화증, 및 혈관염을 치료하기 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명은 염증성 질환의 치료를 위한 폴리펩티드, 단리된 핵산, 숙주 세포, 및 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 면역원성일 수 있다. 본 발명은 하나의 태양에 있어서 자기(self) 및 비자기(non-self) 아미노산 단편 둘 다를 포함하는 면역원성 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어 본 발명은 자기 C5a 아미노산 단편 및 하나 이상의 비자기 T 세포 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 다른 태양에 있어서 염증성 질환을 갖는 포유 동물의 치료에 적합한 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 예를 들어 상기 코딩 폴리펩티드의 대량 생산에 사용될 수 있다.
본 발명은 하나의 태양에 있어서 폴리펩티드가 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며 비자기 단편의 길이는 350개 미만의 아미노산(예를 들어 300개 미만의 아미노산, 250개 미만의 아미노산, 또는 200개 미만의 아미노산)인 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 한다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 박테리아 아미노산 단편(예를 들어 MBP 아미노산 단편)일 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 C5 아미노산 단편일 수 있다. 비자기 C5 아미노산 단편은 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 척추 동물(예를 들어 포유 동물)의 C5 아미노산 단편일 수 있다. 비자기 척추 동물 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 바이러스 아미노산 단편 또는 진균류 아미노산 단편일 수 있다.
본 발명은 또한 염증성 질환에 걸린 포유 동물(예를 들어 인간)의 치료 방법을 그 특징으로 한다. 본 방법은 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하여 포유 동물에 있어서 폴리펩티드가 항-C5 반응을 유도하도록 하는 것을 포함할 수 있는데, 본 폴리펩티드는 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 염증성 질환은 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 이식 거부, 류마티스성 관절염, 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 아테롬성 경화증, 및/또는 혈관염일 수 있다. 본 폴리펩티드는 MBP-C5a일 수 있다. 자기 C5 아미노산 단편은 C5a 서열의 일부를 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 C5 서열의 일부를 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 바이러스, 박테리아, 진균류, 포유 동물 및/또는 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 한다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 비자기 C5 아미노산 단편은 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 한다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 포유 동물 아미노산 단편일 수 있다. 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 하는데, 비자기 아미노산 단편의 길이는 350개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기이다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 바이러스, 박테리아, 진균류, 포유 동물, 및/또는 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 포유 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 폴리펩티드 및 면역 보강제(adjuvant)를 포함하는 조성물을 그 특징으로 하며, 본 폴리펩티드는 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함한다. 박테리아 아미노산 단편은 MBP일 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 한다.
본 발명은 또 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 비자기 아미노산 단편의 길이는 360개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기이다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 폴리펩티드에는 C5 아미노산 단편과 박테리아 아미노산 단편 사이의 인자 Xa 절단 부위가 결여되어 있다. 비자기 박테리아 아미노산 단편은 MBP일 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 그 특징으로 한다.
본 발명의 다른 태양은 (1) 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; (2) 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; (3) 자기 C5 아미노산 단편 및 길이가 350개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기인 비자기 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; (4) 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 박테리아 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; (5) 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 진균류 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산; 및/또는 (6) 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 바이러스 아미노산 단편을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 그 특징으로 한다. 본 숙주 세포는 본 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 한다. 본 조성물은 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함한다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에 있어서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 비자기 C5 아미노산 단편은 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 하는데, 본 조성물은 폴리펩티드를 포함하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함한다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에 있어서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 포유 동물 아미노산 단편일 수 있다. 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 태양에 있어서 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 한다. 본 조성물은 폴리펩티드를 포함하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하고, 비자기 아미노산 단편의 길이는 350개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기이다. 본 폴리펩티드를 포유 동물에 투여하면 포유 동물에 있어서 항-C5 반응이 유도될 수 있으며, 포유 동물의 게놈은 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 비자기 아미노산 단편은 바이러스, 박테리아, 진균류, 또는 포유 동물 단편일 수 있다. 비자기 아미노산 단편은 비자연발생 단편일 수 있다. 비자기 포유 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 하는데, 본 조성물은 폴리펩티드 및 면역 보강제를 함유하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편(예를 들어 MBP)을 포함한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 하는데, 본 조성물은 폴리펩티드를 포함하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 포유 동물에 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 하는데, 본 조성물은 폴리펩티드를 포함하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며, 비자기 아미노산 단편의 길이는 350개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기이다.
본 발명은 또 다른 태양에 있어서 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하며, 본 폴리펩티드에는 C5 아미노산 단편과 박테리아 아미노산 단편 사이의 인자 Xa 절단 부위가 결여되어 있다. 박테리아 아미노산 단편은 MBP일 수 있다.
본 발명은 다른 태양에 있어서 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 단리된 핵산을 그 특징으로 하는데, 본 단리된 핵산은 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 (1) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함함 - ; (2) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함함 - ; (3) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 길이가 350개 미만(예를 들어 300개 미만, 250개 미만, 또는 200개 미만)의 아미노산 잔기인 비자기 아미노산 단편을 포함함 - ; (4) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 박테리아 아미노산 단편을 포함함 - ; (5) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 진균류 아미노산 단편을 포함함 - ; 및/또는 (6) 포유 동물에 투여하기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 - 여기서, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 바이러스 아미노산 단편을 포함함 - 을 포함하는 숙주 세포를 그 특징으로 한다. 본 숙주 세포는 본 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
본 발명은 또 다른 태양에 있어서 포유 동물에게 투여하기 위한 조성물을 그 특징으로 한다. 본 조성물은 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 본 폴리펩티드는 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며, 자기 C5 아미노산 단편은 포유 동물 유래의 C5 서열에 90% 이상 동일하다.
달리 정의되지 않는 한 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 대등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만 적합한 방법 및 재료가 하기되어 있다. 본 명세서에서 언급되는 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그의 전체 내용이 참고로 인용된다. 상충되는 경우에는 정의를 포함하여 본 명세서의 기술 사항이 지배한다. 또한 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 한정하려는 것이 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기의 도면 및 발명의 상세한 설명과, 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 마우스의 프로-C5 DNA 서열(서열 번호 1)을 도시한 것이다.
도 2는 신호 펩티드를 포함하는 마우스의 프로-C5의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 도시한 것이다.
도 3은 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP) 및 마우스 C5a를 포함하는 융합 폴리펩티드를 발현하도록 디자인된 핵산 벡터를 도시하는 다이아그램이다.
도 4는 MBP-C5a의 PCR 생성물의 핵산 서열(서열 번호 3)이다.
도 5는 MBP-C5a 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 번호 4)이다.
도 6은 대조군 마우스(◇) 및 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 백신접종한 마우스(●)에 있어서 콜라겐-유도된 관절염의 발병률을 도시한 그래프이다. *, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.005.
도 7은 대조군 마우스(○) 및 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 백신접종한 마우스(●)에 있어서 콜라겐-유도된 관절염의 평균 관절염 점수를 도시한 그래프이다. *, p<0.05; **, p<0.01, ***, p<0.005.
도 8은 대조군 마우스 및 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 백신접종한 마우스에 있어서 콜라겐-유도된 관절염의 평균 최대 관절염 점수를 도시한 그래프이다. **, p<0.01.
도 9는 콜라겐을 주사하고, 이어서 PBC(대조군) 또는 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 처리한 마우스로부터 얻은 관절염 점수 데이터의 곡선 아래 면적을 도시한 그래프이다. ***, p<0.005.
도 10은 대조군 마우스(●) 및 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 백신접종한 마우스(◇)에 있어서 콜라겐-유도된 만성 관절염의 발생 퍼센트를 도시한 그래프이다. *, p<0.05; **, p<0.01.
도 11은 대조군 마우스(●) 및 MBP-C5a 융합 폴리펩티드로 백신접종한 마우스(○)에 있어서 콜라겐-유도된 만성 관절염의 평균 점수를 도시한 그래프이다. *, p<0.05.
본 발명은 염증성 질환의 치료를 위한 방법 및 물질을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "염증성 질환"이라는 용어는 염증으로 이어지는 질병, 질병 상태, 증후군 또는 기타 병태를 나타낸다. 예를 들어 류마티스성 관절염 및 천식이 염증성 질환이다. 염증성 질환의 다른 예로는 한정됨이 없이 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 이식 거부, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 아테롬성 경화증, 및 혈관염을 들 수 있다. 본 발명은 포유 동물에 있어서 C5 또는 C5a와 같은 항원에 대하여 항체 반응을 유도하기 위한 폴리펩티드, 단리된 핵산, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 예를 들어 본 발명에서 개시되는 방법 및 물질을 사용하여 전체 및/또는 수용체 결합된 C5a의 양의 감소에 의해 포유 동물에 있어서 C5a의 영향을 감소시킬 수 있다.
폴리펩티드
본 발명은 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 면역원성일 수 있다. "면역원성" 폴리펩티드는 포유 동물에 있어서 항체 반응을 효과적으로 유도하는 임의의 폴리펩티드이다. 예를 들어 면역원성 폴리펩티드는 포유 동물에 있어서 항-자기 C5 항체의 생성을 효과적으로 유도하는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드를 수여받는 특정 포유 동물에 대하여 비자기인 것으로 간주되는 하나 이상의 아미노산 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 항-자기 C5 항체의 생성을 유도하는 폴리펩티드는 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편(예를 들어 비자기 C5 아미노산 단편)을 포함할 수 있다. 자기 C5 아미노산 단편은 항-자기 C5 항체 반응의 특이성을 부여할 수 있으며, 비자기 아미노산 단편은 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 비자기 아미노산 단편(예를 들어 비자기 C5 아미노산 단편)은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 대안적으로는 비자기 아미노산 단편은 면역원성 폴리펩티드를 안정화하여 특이적인 항-자기 C5 항체 반응이 유도되도록 할 수 있다. 폴리펩티드의 자기 C5 아미노산 단편은 C5a 수용체와 직접 상호 작용하는 C5의 일부일 수 있다. 이러한 자기 C5 아미노산 단편의 예로는 한정됨이 없이 C5a 또는 C5a의 단편을 들 수 있다. 부가적으로, 폴리펩티드의 자기 C5 아미노산 단편은 C5a와 C5a 수용체의 상호 작용에 간접적으로 영향을 주는 C5의 일부일 수 있다. 예를 들어 C5의 C5 컨버타제 인식 서열을 포함하는 폴리펩티드는 C5의 C5 컨버타제 인식 서열에 결합하는 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 이로써 C5 컨버타제에 의한 C5의 C5a로의 전환을 억제한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "아미노산 단편"이라는 용어는 폴리펩티드 내의 아미노산의 연속 스트레치를 나타낸다. 예를 들어 100개 아미노산의 폴리펩티드 내의 30∼40개의 아미노산 잔기는 아미노산 단편으로 간주된다. 아미노산 단편은 8개 초과의 임의의 길이의 아미노산 잔기(예를 들어 약 9개 초과, 10개 초과, 15개 초과, 20개 초과, 25개 초과, 30개 초과, 40개 초과, 50개 초과, 75개 초과, 100개 초과, 150개 초과, 200개 초과, 500개 초과, 1000개 초과, 또는 그보다 많은 아미노산 잔기)일 수 있다. 이와 같이 아미노산 단편은 C5, C5의 전체 C5a 영역, 또는 C5a의 일부일 수 있다. 일부 실시 형태에 있어서 아미노산 단편은 1000개 미만의 아미노산 잔기의 길이(예를 들어 500개 미만, 400개 미만, 300개 미만, 200개 미만, 또는 100개 미만의 아미노산 잔기)를 가질 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 아미노산 단편은 약 20개∼약 200개의 아미노산 잔기의 길이(예를 들어 약 30개∼약 180개의 아미노산 잔기, 또는 약 40개∼약 150개의 아미노산 잔기)를 가질 수 있다.
아미노산 단편 및 특정 포유 동물에 관하여 본 명세서에서 사용되는 "자기"라는 용어는 특정 포유 동물이 내인적으로 보유하는 임의의 아미노산 단편을 일반적으로 나타낸다. 아미노산 단편이 하나의 종의 구성원으로부터 유래되며 내인적으로 이 아미노산 단편을 보유하는 동일한 종의 다른 구성원 내로 도입된다면, 상기 특정 아미노산 단편은 자기 아미노산 단편으로 간주된다. 예를 들어 마우스로부터 유래되는 C5 아미노산 단편은 상기와 동일한 마우스, 유전적으로 동일한 마우스, 또는 동일한 아미노산 단편을 내인적으로 보유하는 유전적으로 동일하지 않은 마우스 내로 도입될 경우 자기 C5 아미노산 단편이다.
아미노산 단편 및 특정 포유 동물에 관하여 본 명세서에서 사용되는 "비자기"라는 용어는 특정 포유 동물이 내인적으로 보유하지 않는 임의의 아미노산 단편을 일반적으로 나타낸다. 아미노산 단편이 제1의 종의 구성원으로부터 유래되며 이 아미노산 단편을 내인적으로 보유하지 않는 제2의 종의 구성원 내로 도입된다면, 상기 특정 아미노산 단편은 비자기 아미노산 단편으로 간주될 수 있다. 예를 들어 마우스로부터 유래되는 C5 아미노산 단편이 인간 내로 도입될 경우 비자기 C5 아미노산 단편으로 간주될 수 있다. 다른 예에 있어서 폴리펩티드가 마우스로부터 유래되는 C5a 아미노산 단편 및 인간 유래의 C5b 아미노산 단편을 포함하며, 상기 폴리펩티드가 마우스 내로 도입된다면, C5a 아미노산 단편은 자기 C5a 아미노산 단편으로 간주될 수 있으며 C5b 아미노산 단편은 비자기 C5b 아미노산 단편으로 간주될 수 있다. 대안적으로는, 동일한 폴리펩티드가 인간 내로 도입될 경우 C5a 아미노산 단편은 비자기 C5a 아미노산 단편으로 간주될 수 있으며 C5b 아미노산 단편은 자기 C5b 아미노산 단편으로 간주될 수 있다. 하나의 종의 하나의 구성으로부터 유래되는 아미노산 단편이 동일한 종의 다른 구성원에 대하여 다형성인 것으로 간주되면, 이 아미노산 단편은 상기 다형성을 보유하지 않는 종의 구성원에 대하여 비자기 아미노산 단편인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어 아미노산 단편에 있어서 한 유형의 다형성을 갖는 인간으로부터 유래되는 C5 아미노산 단편이 상기 특정 유형의 다형성을 갖지 않는 제2의 인간 내로 도입될 경우, C5 아미노산 단편은 제2의 인간에 대하여 비자기 아미노산 단편인 것으로 간주될 수 있다. 또한 은폐성(cryptic) T 세포 에피토프(즉, 보통의 조건 하에서는 MHC 분자 상에서 T 세포에 의한 인식에 필요한 수준으로 발현되지 않는 자기 펩티드)가 비자기인 것으로 간주될 수 있음이 이해될 것이다.
비자기 및 자기 아미노산 단편은 동일하거나 상이한 자연발생 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드가 인간 C5로부터 유래되는 자기 아미노산 단편을 포함한다면, 비자기 아미노산 단편은 동일한 유형의 폴리펩티드(예를 들어 래트 C5) 또는 상이한 유형의 폴리펩티드(예를 들어 래트 알부민)으로부터 유래될 수 있다. 다른 예에 있어서 폴리펩티드는 MBP에 의해 제공되는 하나 이상의 비자기 T 세포 에피토프 및 자기 C5a 아미노산 단편을 포함할 수 있다. 또한 아미노산 단편은 한정됨이 없이 박테리아 폴리펩티드(예를 들어 MBP), 진균류 폴리펩티드, 바이러스 폴리펩티드, 또는 포유 동물 폴리펩티드를 포함하는 임의의 유형의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 폴리펩티드의 자기 단편(들)은 일반적으로 본 폴리펩티드가 투여되는 포유 동물에서 발견되는 폴리펩티드로부터의 서열에 대하여 90% 이상 동일하다(예를 들어 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일함). 일부 실시 형태에 있어서 자기 단편은 본 폴리펩티드가 투여되는 포유 동물에서 발견되는 폴리펩티드로부터 유래되는 서열에 대하여 100% 동일할 수 있다. 따라서 본 발명은 (1) 길이, 및 (2) 기준 아미노산 서열에 대하여(예를 들어 특정 포유 동물 유래의 아미노산 서열) 그 길이에 대하여 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 (1) 길이, 및 (2) 그 길이에 대하여 포유 동물의 아미노산 서열에 대하여 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일반적으로 포유 동물 아미노산 또는 핵산 서열은 기준 서열로 칭해지며, 포유 동물 서열에 비교되는 아미노산 또는 핵산 서열은 표적 서열로 칭해진다. 예를 들어 포유 동물의 서열은 서열 번호 2에 나타내어진 서열을 갖는 기준 서열일 수 있다.
임의의 아미노산 또는 핵산 서열에 있어서 길이 및 그 길이에 대한 퍼센트 동일성은 하기와 같이 결정된다. 첫째, BLASTN 버전 2.0.14 및 BLASTP 버전 2.0.14를 포함하는 독립형(stand-alone) 버전의 BLASTZ로부터의 BLAST 2 Sequences(B12seq) 프로그램을 사용하여 아미노산 또는 핵산 서열을 그가 투여되는 포유 동물로부터 유래되는 아미노산 또는 핵산 서열과 비교한다. 이러한 BLASTZ의 독립형 버전은 Fish & Richardson의 웹 사이트(www.fr.com/blast), 미국 정부의 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nib.gov), 또는 the State University of New York at Old Westbury Library(QH 497.m6714)로부터 입수할 수 있다. B12seq 프로그램의 사용 방법을 설명하는 설명서는 BLASTZ에 첨부된 리드미(readme) 파일에서 찾을 수 있다.
B12seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 이용하여 2개의 서열 사이의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열의 비교에 사용되며, 반면 BLASTP는 아미노산 서열의 비교에 사용된다. 2개의 핵산 서열의 비교를 위해서는 옵션이 하기와 같이 설정된다: -i는 비교할 제1 핵산 서열을 포함하는 파일에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼seq1.txt); -j는 비교할 제2 핵산 서열을 포함하는 파일에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼seq2.txt); -p는 blastn에 대하여 설정되며; -o는 임의의 원하는 파일명에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼output.txt); -q는 -1로 설정되며; -r은 2로 설정되며; 모든 다른 옵션은 디폴트 설정치로 둔다. 예를 들어 하기 명령을 이용하여 두 서열 사이의 비교를 포함하는 출력 파일을 생성할 수 있다: C:＼B12seq -i c:＼seg1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1 -r 2. 두 아미노산 서열의 비교를 위해서는 B12seq의 옵션이 하기와 같이 설정된다: -i는 비교할 제1 아미노산 서열을 포함하는 파일에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼seq1.txt); -j는 비교할 제2 아미노산 서열을 포함하는 파일에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼seq2.txt); -p는 blastp에 대하여 설정되며; -o는 임의의 원하는 파일명에 대하여 설정되며(예를 들어 C:＼output.txt); 모든 다른 옵션은 디폴트 설정치로 둔다. 예를 들어 하기 명령을 이용하여 두 아미노산 사이의 비교를 포함하는 출력 파일을 생성할 수 있다: C:＼B12seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt. 표적 서열이 포유 동물 서열의 임의의 일부와 상동성을 공유한다면, 명시된 출력 파일은 상동 영역을 정렬 서열로 제시할 것이다. 표적 서열이 포유 동물 서열의 임의의 일부와 상동성을 공유하지 않는다면, 명시된 출력 파일은 정렬된 서열을 제시하지 않을 것이다.
일단 정렬되면 길이는 포유 동물 서열로부터 유래되는 서열과 정렬되어 제시되는 표적 서열로부터의 연속 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 갯수를 세어 결정한다. 매치되는 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 표적 및 포유 동물 서열 둘 다에서 제시되는 임의의 위치이다. 표적 서열에서 제시되는 갭은 계산되지 않는데, 이는 갭이 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 아니기 때문이다. 마찬가지로 포유 동물 서열에서 제시되는 갭은 계산되지 않는데, 이는 포유 동물 서열로부터 유래되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 아니라 표적 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 계산되기 때문이다.
소정 길이에 대한 동일성 퍼센트는 그 길이에 대하여 매치되는 위치의 갯수를 세고 이 갯수를 길이로 나누고 이어서 생성된 값에 100을 곱함으로써 결정한다. 예를 들어 (1) 300개 아미노산의 표적 서열을 기준 서열과 비교하고, (2) B12seq 프로그램이 기준 서열의 영역과 정렬되는 표적 서열로부터의 200개의 연속 아미노산을 제시하며, (3) 상기 200개의 정렬 아미노산에 대한 매치의 갯수가 180개라면, 상기 300개 아미노산의 표적 서열은 길이가 200이며 상기 길이에 대한 동일성 퍼센트는 90(즉, 180÷200*100=90)인 아미노산 단편을 포함한다.
서열 동일성 퍼센트 값은 가장 가까운 소수점 자리로 반올림된다. 예를 들어 75.11, 75.12, 75.13, 및 75.14는 75.1로 사사오입되며, 반면 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, 및 75.19는 75.2로 사사오입된다는 것을 알 수 있다. 또한 길이 값은 항상 정수임을 알 수 있다.
본 발명에서 제공되는 폴리펩티드의 비자기 단편(들)은 일반적으로 본 폴리펩티드가 투여되는 포유 동물에서 발견되는 폴리펩티드로부터 유래되는 서열에 대하여 동일성이 95% 미만이다(예를 들어 동일성이 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만임).
예를 들어 원핵 생물 시스템에 의한 발현, 진핵 생물 시스템에 의한 발현, 및 화학적 합성 기술을 포함하는 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 한정됨이 없이 분획화, 원심분리, 및 크로마토그래피를 포함하는 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 예를 들어 말토스 결합 단백질(MBP)을 포함하는 폴리펩티드는 아밀로스 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다.
핵산
본 발명은 본 명세서에 기술된 것과 같은 폴리펩티드(예를 들어 자기 및 비자기 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드)를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 예를 들어 본 발명의 핵산은 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 대안적으로는 본 발명의 핵산은 서열 번호 2에 나타낸 서열의 일부를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서 본 발명에서 제공되는 핵산은 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 단리된 핵산은 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편(예를 들어 비자기 C5 아미노산 단편, 또는 비자기 척추 동물, 박테리아, 진균류, 또는 바이러스 아미노산 단편)을 포함하는 폴리펩티드를 또한 코딩할 수 있다. 단리된 핵산에 의해 코딩되는 자기 단편은 본 폴리펩티드가 투여되는 포유 동물에서 발견되는 폴리펩티드로부터 유래되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성(예를 들어 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성, 또는 100% 동일성)을 갖는 아미노산 단편(예를 들어 C5 아미노산 단편)을 포함할 수 있다. 단리된 핵산에 의해 코딩되는 비자기 단편은 본 폴리펩티드가 투여되는 포유 동물에서 발견되는 폴리펩티드로부터 유래되는 아미노산 서열에 대하여 95% 미만의 동일성(예를 들어 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만의 동일성)을 갖는 아미노산 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "핵산"이라는 용어는 RNA와, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성된(예를 들어 화학적으로 합성된) DNA를 포함하는 DNA를 모두 포함한다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥일 경우 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
본 명세서에서 핵산에 관하여 사용되는 바와 같이 "단리된"이라는 용어는 핵산이 유래되는 유기체의 자연발생 게놈에서 바로 인접하는 서열 중 하나 또는 이들 서열 둘 다(하나는 5' 말단, 다른 하나는 3' 말단)와 바로 인접하지는 않은 자연발생 핵산을 나타낸다. 예를 들어 단리된 핵산은 한정됨이 없이, 자연발생 게놈 중의 재조합 DNA의 바로 측면에서 보통 발견되는 핵산 서열 중 하나가 제거되거나 존재하지 않는다면, 임의의 길이의 재조합 DNA일 수 있다. 따라서 단리된 핵산은 한정됨이 없이 다른 서열과는 관계 없는 재조합 DNA(예를 들어 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)와, 벡터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 허피스 바이러스), 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 삽입된 재조합 DNA를 포함한다. 또한 단리된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 재조합 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 핵산과 관련하여 사용되는 바와 같이 "단리된"이라는 용어는 임의의 비자연발생 핵산을 또한 포함하는데, 이는 비자연발생 핵산 서열이 자연에서 발견되지 않으며 자연발생 게놈에 있어서 바로 인접하는 서열을 갖지 않기 때문이다. 예를 들어 비자연발생 핵산, 예를 들어 조작된 핵산은 단리된 핵산으로 간주된다. 조작된 핵산은 일반적인 분자 클로닝 또는 화학적 핵산 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 단리된 비자연발생 핵산은 다른 서열과는 상관이 없을 수 있거나, 벡터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 허피스 바이러스), 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 삽입될 수 있다. 또한 비자연발생 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산 서열의 일부인 핵산을 포함할 수 있다.
예를 들어 게놈 DNA 제한 효소 절단물을 포함하는 젤 슬라이스, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 내의 수백 내지 수백만의 다른 핵산 중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산으로 간주되지 않는다.
본 명세서에서 핵산 및 특정 세포와 관련하여 사용되는 "외인성"이라는 용어는 자연에서 발견되는 특정 세포로부터 유래되지 않는 임의의 핵산을 나타낸다. 따라서 임의의 비자연발생 핵산은 일단 세포 내로 도입되면 세포에 대하여 외인성인 것으로 간주된다. 비자연발생 핵산이 전체 핵산이 자연에 존재하지 않는다면, 비자연발생 핵산은 자연에서 발견되는 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 발현 벡터 내에 게놈 DNA 서열을 포함하는 핵산은 비자연발생 핵산이며, 따라서 세포 내로 일단 도입되면 세포에 대하여 외인성인데 이는 전체로서의 이 핵산(게놈 DNA + 벡터 DNA)이 자연에 존재하지 않기 때문이다. 따라서, 전체로서는 자연에 존재하지 않는 임의의 벡터, 자가 복제 플라스미드, 또는 바이러스(예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 허피스 바이러스)는 비자연발생 핵산인 것으로 간주된다. 덧붙이자면 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 게놈 DNA 단편과 cDNA는 비자연발생 핵산인 것으로 간주되는데 이는 이들이 자연에서 발견되지 않는 별개의 분자로 존재하기 때문이다. 또한 덧붙이자면 자연에서 발견되지 않는 배열의 프로모터 서열 및 폴리펩티드 코딩 서열(예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA)를 포함하는 임의의 핵산은 비자연발생 핵산이다.
자연발생 핵산은 특정 세포에 대하여 외인성일 수 있다. 예를 들어 사람 X의 세포로부터 단리되는 전 염색체는 일단 이 염색체가 사람 Y의 세포 내로 도입되면 사람 Y의 세포에 대하여 외인성 핵산이다.
단리된 핵산은 한정됨이 없이 일반적인 분자 클로닝 및 화학적 핵산 합성 기법을 비롯한 임의의 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어 PCR을 이용하여 서열 번호 1에 나타낸 서열에 대하여 유사성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산을 수득할 수 있다. PCR은 미국 특허 제4,683,195호에 개시된 것과 유사한 방식으로, 그리고 그 후의 상기 특허에 개시된 절차의 변경으로 증폭시킨다. 일반적으로, 목적으로 하거나 그 이상인 영역의 말단으로부터의 서열 정보를 사용하여 증폭시킬 잠재적인 주형의 반대 가닥에 대하여 서열 면에서 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인한다. PCR을 이용하여 핵산 서열을 RNA 또는 DNA로부터 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 핵산 서열은 전체 세포 RNA, 전체 게놈 DNA, 또는 cDNA와, 박테리오파지 서열, 플라스미드 서열, 바이러스 서열 등으로부터 PCR 증폭으로 단리할 수 있다. RNA를 주형원으로 사용할 경우 역전사효소를 사용하여 상보성 DNA 가닥을 합성할 수 있다.
단리된 핵산은 또한 돌연변이 유도에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어 서열 번호 1에 나타낸 서열을 포함하는 단리된 핵산은 일반적인 분자 클로닝 기법(예를 들어 부위 특이적(site-directed) 돌연변이 유도)을 이용하여 돌연변이화할 수 있다. 가능한 돌연변이는 한정됨이 없이 결실, 삽입 및 치환과, 결실, 삽입 및 치환의 조합을 포함한다.
또한 핵산 및 아미노산 데이터베이스(예를 들어 GenBank(등록상표))를 이용하여 단리된 핵산을 얻을 수 있다. 예를 들어 서열 번호 1에 나타낸 서열에 대하여 약간의 상동성을 갖는 임의의 핵산 서열, 또는 서열 번호 2에 나타낸 서열에 대하여 약간의 상동성을 갖는 임의의 아미노산 서열을 쿼리(query)로 사용하여 GenBank(등록상표)를 검색할 수 있다.
또한 핵산 하이브리드화 기법을 이용하여 단리된 핵산을 얻을 수 있다. 간략하게는, 서열 번호 1에 나타낸 서열에 대하여 약간의 상동성을 갖는 임의의 핵산을 프로브로 사용하여 중간 정도 내지 높은 엄격도 조건 하에서의 하이브리드화에 의해 유사한 핵산을 동정할 수 있다. 일단 동정되면, 이어서 핵산을 정제, 서열 결정, 및 분석하여 이것이 본 명세서에 기술되어 있는 본 발명의 범주 이내인지를 결정할 수 있다.
하이브리드화는 서던 또는 노던 분석으로 행하여 프로브에 하이브리드화하는 DNA 또는 RNA 서열을 각각 동정할 수 있다. 프로브는 바이오틴, 디그옥시제닌, 효소, 또는 방사성 동위 원소, 예를 들어 32P로 표지할 수 있다. 분석할 DNA 또는 RNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 젤 상에서 전기영동으로 분리하고, 니트로셀룰로스, 나일론, 또는 기타 적합한 막으로 옮기고, 당업계에 잘 알려진 표준 기법, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY, 섹션 7.39-7.52]에 기술되어 있는 것을 사용하여 프로브와 하이브리드화한다.
또한, 임의의 방법을 사용하여 폴리펩티드를 코딩하는 특정의 단리된 핵산의 전사 또는 번역을 유도할 수 있다. 이러한 방법은 한정됨이 없이 조절 요소가 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 촉진하도록 핵산을 제작하는 것을 포함한다. 일반적으로 조절 요소는 전사 수준에서 다른 DNA 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열이다. 따라서 조절 요소는 한정됨이 없이 프로모터, 인핸서 등을 포함한다.
숙주 세포
본 발명은 본 명세서에 기술되어 있는 하나 이상의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 범주 이내의 단리된 핵산을 포함하는 세포는 폴리펩티드를 발현하기 위해 필요한 것은 아님을 알 수 있다. 또한 단리된 핵산은 세포의 게놈 내로 통합되거나 에피좀 상태로 유지될 수 있다. 따라서 숙주 세포는 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 구성체로 안정하게, 또는 일시적으로 트랜스펙션될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 숙주 세포는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어 세포는 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 또한 본 숙주 세포는 코딩된 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
임의의 방법을 사용하여 생체내 또는 시험관 내에서 단리된 핵산을 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어 인산칼슘 침전법, 전기 천공법, 열 충격법(heat shock), 리포펙션(lipofection), 미세 주입법, 및 바이러스 매개 핵산 이동법이 단리된 핵산을 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있는 일반적인 방법이다. 또한 나형(naked) DNA를 다른 특허에 개시된 바와 같이 생체 내에서 세포로 직접 전달할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제5,580,859호 및 동 제5,589,466호와 그의 연속 특허 참조). 또한 단리된 핵산은 트랜스제닉 동물을 생성함으로써 세포 내로 도입할 수 있다.
트랜스제닉 동물은 수중 동물(예를 들어 어류, 상어, 돌고래 등), 농장 동물(예를 들어 돼지, 염소, 양, 축우, 말, 토끼 등), 설치류(예를 들어 마우스, 기니 피그, 및 래트), 비-인간 영장류(예를 들어 비비 원숭이, 원숭이, 및 침팬지)와, 가축(예를 들어 개 및 고양이)일 수 있다. 당업계에 공지된 여러 기법을 사용하여 단리된 핵산을 동물 내로 도입하여 트랜스제닉 동물의 시조 주를 생성할 수 있다. 이러한 기법은 한정됨이 없이 전핵 미세 주입법(미국 특허 제4,873,191호); 생식선 내로의 레트로바이러스 매개 유전자 이동법(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 6148 (1985)); 배아 줄기 세포 내로의 유전자 트랜스펙션(Gossler et al., Proc Nail. Acad. Sci. 25 USA 83: 9065-9069 (1986)); 배아 줄기 세포 내로의 유전자 표적화법(Thompson et al., Cell, 56: 313 (1989)); 체세포 핵의 핵 이동법(Schnieke et al., Science 278: 2130-2133 (1997)); 및 배아의 전기 천공법(Lo Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983))을 포함한다. 트랜스제닉 동물은 일단 수득되면 전통적인 교배법 또는 동물 클로닝법을 사용하여 복제할 수 있다.
임의의 방법을 사용하여 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 세포를 동정할 수 있다. 이러한 방법은 한정됨이 없이 PCR 및 핵산 하이브리드화 기법, 예를 들어 노던 및 서던 분석법을 포함한다. 일부의 경우에 있어서 면역 조직 화학 및 생화학 기법을 사용하여 특정의 단리된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현의 탐지에 의해 이 특정의 단리된 핵산을 세포가 포함하는 지를 결정할 수 있다.
염증성 질환의 치료 방법
본 발명에서 제공되는 폴리펩티드는 염증성 질환 치료용 의약 또는 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 한정됨이 없이 조성물을 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 조성물은 면역 반응이 요망되는 항원으로 작용하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한 조성물은 하나보다 많은 폴리펩티드, 또는 상이한 폴리펩티드의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어 조성물은 바이러스 폴리펩티드 및 포유 동물 폴리펩티드 둘 다를 함유할 수 있다. 조성물 중의 각각의 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있음을 알 수 있다. 또한 조성물 중의 폴리펩티드는 상이한 아미노산 단편을 포함할 수 있는데, 이들 각각은 면역 반응이 요망되는 소정의 항원성 단위로 작용할 수 있다. 따라서 조성물 중의 폴리펩티드는 한정됨이 없이 수용체 결합 영역, 리간드 결합 영역, 효소 활성 부위, 폴리펩티드 기질의 효소 절단 부위, 항체의 항원 결합 영역, 및 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 폴리펩티드로부터의 임의의 영역에 상응하는 상이한 아미노산 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 조성물 중의 폴리펩티드는 3 가지의 상이한 아미노산 단편을 포함할 수 있는데, 이들 각각은 C5의 C5 컨버타제 인식 서열에 상응한다. 또한, 상이하거나 동일한 아미노산 단편은 동일한 폴리펩티드 전반에 걸쳐 분산되어 있거나 직렬식으로 존재할 수 있다. 일반적으로 폴리펩티드의 투여는 조성물 중의 하나 이상의 폴리펩티드 내의 아미노산 단편에 의해 형성되는 에피토프 또는 에피토프의 조합에 대하여 특이성을 갖는 항체의 형성으로 이어진다.
조성물은 숙주 세포 내로 도입 시 특정 폴리펩티드를 발현하도록 디자인된 단리된 핵산을 함유할 수 있다. 예를 들어 단리된 핵산은 자기 C5a 아미노산 단편 및 하나 또는 하나보다 많은 비자기 T 세포 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 코딩하도록 디자인될 수 있다. 일단 제작되면, 단리된 핵산은 코딩된 폴리펩티드가 발현되도록 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 한정됨이 없이 원핵 세포(예를 들어 박테리아) 및 진핵 세포(예를 들어 인간 세포)를 포함하는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 본 폴리펩티드는 일단 생성되면 정제하여 포유 동물의 백신 접종을 위하여 사용될 수 있다. 대안적으로는 특정 폴리펩티드를 발현하도록 디자인된 단리된 핵산을 포함하는 조성물은 폴리펩티드가 생체 내에서 발현되도록 포유 동물에게 투여될 수 있다.
조성물은 본 발명에서 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제공되는 임의의 폴리펩티드(예를 들어 면역원성 폴리펩티드) 또는 단리된 핵산(예를 들어 면역원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)의 조합에 의해 제조될 수 있다. 이러한 담체는 한정됨이 없이 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함할 수 있다. 비수성 용매의 예로는 예를 들어 광유, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 및 주사 가능한 유기 에스테르를 들 수 있다. 수성 담체는 한정됨이 없이 물, 알코올, 염수, 및 완충 용액을 포함한다. 보존제, 착향제 및 기타 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 산화 방지제, 킬레이트제, 비활성 기체 등이 또한 존재할 수도 있다. 포유 동물에게 투여될 본 명세서에 기술된 임의의 물질은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다.
조성물은 또한 면역 보강제를 함유할 수 있다. "면역 보강제"는 폴리펩티드와 같은 특정 항원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 면역학적 화합물이다. 면역 보강제, 예를 들어 명반 및 기타 알루미늄 기재의 화합물(예를 들어 Al2O3)은 자기 아미노산 단편(예를 들어 자기 C5 아미노산 단편)을 포함하는 폴리펩티드와 조합되어 포유 동물에 투여시 항-자기 반응을 유도할 수 있는 조성물을 형성할 수 있다. 알루미늄 기재의 화합물은 다양한 시판품 공급자로부터 입수할 수 있다. 예를 들어 REHYDRAGEL(등록상표) 면역 보강제는 레하이스 인코포레이티드(뉴저지주 버클리 하이츠 소재)로부터 입수할 수 있다. REHYDRAGEL(등록상표) 면역 보강제는 결정형 알루미늄 옥시히드록시드를 기재로 하며 표면적이 큰(약 525 m2/g) 결정형 입자를 포함하는 수화된 젤이다. 그의 Al203 함량은 일반적으로 약 2%∼약 10%의 범위이다. 예를 들어 Rehydragel LG는 Al203 함량이 약 6%이며, 약간의 교반시 쉽게 유동한다. Rehydragel LG는 또한 단백질 결합능이 1.58(즉, 1 mg의 Al203당 1.58 mg의 소 혈청 알부민이 결합됨)이며, 나트륨 함량이 0.02%이며, 클로라이드 함량이 0.28%이며, 탐지될 수 없는 설페이트, 비소의 수준이 3 ppm 미만이며, 중금속의 함량이 15 ppm 미만이며, pH가 6.5이며, 점도가 1090 cp이다. Rehydragel LG는 폴리펩티드 용액(예를 들어 PBS 중 폴리펩티드)와 조합되어 Al(OH)3를 생성할 수 있다. 또한 Brenntag Stinnes Logistics로부터 입수되는 알루미늄 히드록시 젤 면역 보강제인 ALHYDROGEL(상표명)(Alhydrogel 1.3%, Alhydrogel 2.0%, 또는 Alhydrogel "85")이 사용될 수 있다.
또한 MN51을 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드와 조합하여, 포유 동물에 투여시 항-자기 반응을 유도하는 조성물을 형성할 수 있다. MN51(MONTANIDE(등록상표) Incomplete SEPPIC Adjuvant(ISA) 51)과 MN720은 Seppic(Paris, France)으로부터 입수가 가능하다. MN51은 광유 용액(Drakeol 6 VR) 중의 만나이드 올레에이트(MONTANIDE(등록상표) 80, 무수 만니톨 옥타데세노에이트로도 알려져 있음)를 포함한다. MONTANIDE(등록상표) 80은 최대 산가가 1이며, 비누화 값이 164∼172이며, 히드록실가가 89∼100이며, 요오드 값이 67∼75이며, 최대 퍼옥사이드 값이 2이며, 중금속 값이 20 ppm 미만이며, 최대 수 함량이 0.35%이며, 최대 색도 값이 9이며, 25℃에서의 점도가 약 300 mPas인 투명한 액체이다. 오일(예를 들어 광유, 식물유, 스쿠알란, 스쿠알렌, 또는 에스테르)와 결부된 MONTANIDE(등록상표)는 MONTANIDE(등록상표) ISA로 알려져 있다. Drakeol 6 VR은 약학 등급의 광유이다. Drakeol 6 VR은 불포화 또는 방향족 탄화수소를 전혀 포함하지 않으며, A.P.I. 비중이 36.2∼36.8이며, 25℃에서의 비중이 0.834∼0.83S이며, 100℉에서의 점도가 59∼61 SSU 또는 10.0∼10.6 센티스토크이며, 25℃에서의 굴절률이 1.458∼1.463이며, 이는 최소 산 시험보다 우수하며, 360 nm에서의 형광에 대해 음성이며, 눈에 보이는 현탁 물질에 대해 음성이며, ASTM 유동 시험 값이 0∼15℉이며, 최소 ASTM 인화점(flash point)이 295℉이며, 경 광유 및 자외광 흡수에 있어서의 모든 RN 요건에 따른다. MN51은 약 8∼12%의 무수 만니톨 옥타데세노에이트 및 약 88∼92%의 광유를 포함한다. MN51은 최대 산가가 0.5이며, 비누화 값이 16∼20이며, 히드록실가가 9∼13이며, 최대 퍼옥사이드 값이 2이며, 요오드 값이 5∼9이며, 최대 수 함량이 0.5%이며, 25℃에서의 굴절률이 1.455∼1.465 사이이며, 20℃에서의 밀도가 약 0.85이며, 20℃에서의 점도가 약 50 mPas인 맑은 황색 액체이다. MN51과 염수의 50:50 혼합물의 전도율은 10 μScm-1 미만이다.
다른 면역 보강제는 콜레스테롤 및 사포닌과 같은 성분을 포함할 수 있는 면역 자극 복합체(immuno-stimulating complexes(ISCOM))를 포함한다. ISCOM 매트릭스를 제조하고 본 명세서에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 Cu2+에 접합시킬 수 있다. FCA, FIA, MN51, MN72O, 및 Al(OH)3과 같은 면역 보강제는 Seppic, Difco Laboratories(Detroit, MI), 및 Superfos Biosector A/S(Vedbeak, Demark)와 같은 회사에서 시판된다.
일부 실시 형태에 있어서 조성물은 하나 이상의 추가의 면역 자극 성분을 또한 함유할 수 있다. 이는 한정됨이 없이 무라밀디펩티드(예를 들어 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민; MDP), 모노포스포릴-지질 A(MPL), 및 포르밀-메티오닌 함유 트리펩티드, 예를 들어 N-포르밀-Met-Leu-Phe을 포함한다. 이러한 화합물은 예를 들어 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO) 및 RIBI InmunoChem Research, Inc.(Hamilton, MT)로부터 시판된다.
본 발명에서 제공되는 조성물은 폴리펩티드에 대하여 임의의 비의 면역 보강제를 함유할 수 있다. 면역 보강제:항원의 비는 예를 들어 50:50(부피:부피)일 수 있다. 대안적으로는 면역 보강제:항원의 비는 한정됨이 없이 90:10, 80:20, 70:30, 64:36, 60:40, 55:45, 40:60, 30:70, 20:80, 또는 90:10일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 임의의 조성물의 유효량이 숙주에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "유효한"이라는 용어는 숙주에 있어서 유의적인 독성을 유도함이 없이 원하는 면역 반응을 유도하는 임의의 양을 나타낸다. 이러한 양은 공지된 양의 특정 조성물의 투여 후 숙주의 면역 반응을 평가함으로써 결정할 수 있다. 또한, 독성의 수준은, 만일 있다면, 공지된 양의 특정 조성물의 투여 전후의 숙주의 임상 증상을 평가함으로써 결정할 수 있다. 숙주에게 투여되는 특정 조성물의 유효량은 원하는 결과와, 숙주의 반응 및 독성 수준에 따라 조정될 수 있다. 유의적인 독성은 각각의 특정 숙주에 따라 달라질 수 있으며, 한정됨이 없이 숙주의 질병 상태, 연령, 및 통증 내성을 비롯한 다수의 인자에 좌우된다.
또한 본 명세서에 기술되어 있는 임의의 조성물은 숙주의 신체의 임의의 부분에 투여될 수 있다. 조성물은 한정됨이 없이 포유 동물의 관절, 비강 점막, 혈액, 폐, 장, 근육 조직, 피부, 또는 복강에 전달될 수 있다. 또한 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 경막내, 또는 피내 투여에 의해, 또는 경구 또는 비강 투여에 의해, 흡입에 의해, 또는 시간이 지남에 따른 점진적인 관류에 의해 투여될 수 있다. 추가의 예에 있어서 조성물의 에어로졸 제제가 흡입에 의해 숙주에게 투여될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 임의의 조성물을 이용한 치료 기간은 1일만큼 짧은 시간 길이 내지 숙주의 수명(예를 들어 다년)만큼 긴 시간 길이의 임의의 길이의 시간일 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드는 3 개월 동안 1 개월에 1회 또는 10년의 기간 동안 1년에 1회 투여될 수 있다. 또한 치료 빈도는 가변적일 수 있음을 알 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드는 매일, 매주, 매달, 또는 매년 1회(또는 2회, 3회 등) 투여될 수 있다.
임의의 방법을 사용하여 특정 면역 반응이 유도되는 지를 결정할 수 있다. 예를 들어 특정 항원에 대한 항체 반응은 면역학적 분석법(예를 들어 ELISA)을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 분석에 있어서 미량적정 플레이트의 웰을 C5로 코팅하고 포유 동물에서 항-C5 항체를 생성하도록 디자인된 조성물로 치료된 포유 동물로부터의 혈청과 함께 항온처리할 수 있으며, 항-C5 항체의 존재 또는 부재를 표지된 항-래트 IgG를 사용하여 측정할 수 있다. 또한 특정 질병 상태의 정도를 평가할 수 있는 임상적 방법을 이용하여 원하는 면역 반응이 유도되는 지를 측정할 수 있다. 예를 들어 염증의 감소는 항-C5 항체를 생성하도록 디자인된 조성물로 치료한 환자에 있어서의 원하는 면역 반응을 나타낼 수 있다. 원하는 면역 반응의 조짐을 지지하기 위해서는 이러한 환자로부터의 혈액 샘플 중의 항-C5 항체의 수준을 상기한 ELISA 기법을 이용하여 측정할 수 있다.
제조 물품
본 발명에서 제공되는 폴리펩티드 및 조성물은 의약(예를 들어 염증성 질환 치료용 의약)의 제조에 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드 및 조성물을 포함할 수 있는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 생성을 위한 성분 및 방법은 잘 알려져 있다. 제조 물품은 예를 들어 항-자기 C5 항체의 생성을 유도하는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들어 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편, 예를 들어 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드)을 포함할 수 있다. 또한 제조 물품은 예를 들어 염증성 질환의 치료 또는 모니터링을 위한 완충제 또는 기타 제어 시약을 더 포함할 수도 있다. 일부 실시 형태에 있어서 이러한 제조 물품은 제조 물품에 포함된 폴리펩티드가 염증성 질환의 치료에 유효하다는 것을 나타내는 라벨 또는 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명하는데, 이 실시예는 청구의 범위에 기술된 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 - 마우스 C5a 폴리펩티드의 생성 및 정제
마우스 프로-c5 DNA 서열(서열 번호 1)이 도 1에 도시되어 있으며, 신호 펩티드를 포함하는 마우스 프로-C5의 아미노산 서열(서열 번호 2)이 도 2에 도시되어 있다. 마우스 간의 전체 cDNA 라이브러리로부터 PCR 증폭에 의해 마우스 C5a의 코딩 영역을 단리하였다. PCR 단편을 박테리아 발현 벡터 pMAL-p2x(도 3; New England Biolabs, Beverly, MA) 내로, 말토스 결합 단백질(MBP)의 일부를 코딩하는 서열에 인접하여 결찰하였다. 이어서 MBP-C5a 융합 폴리펩티드의 코딩 영역을 PCR로 상기 벡터로부터 증폭시켰다. 이 융합 폴리펩티드의 최종적인 정제를 용이하게 하기 위하여 5' PCR 프라이머는 6개의 히스티딘 잔기를 또한 코딩한다. 또한 클로닝 목적으로 5' 프라이머는 EcoRI 부위를 포함하며, 3' 프라이머는 SalI 부위를 포함한다. PCR 생성물(도 4에 도시된 서열)을 포유 동물 발현 벡터인 에피좀으로 유지되는 pCEP-Pu2 내로 이전하였는데, 상기 벡터는 면역글로불린 가변 영역으로부터 유래되는 신호 서열을 포함한다. PCR 생성물의 SalI 부위를 pCEP-Pu2 벡터의 XhoI 부위 내로 결찰하여 두 부위 모두를 파괴하였다. 융합 폴리펩티드를 코딩하는 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 3에 나타내며 융합 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타낸다.
실시예 2 - 포유 동물 세포로부터 유래된 MBP-C5a의 발현 및 정제
분비되는 융합 폴리펩티드의 과발현 및 정제를 위하여 6His-MBP-C5a 융합 폴리펩티드를 포함하는 pCEP-Pu2 구성체로 293-EBNA 세포를 트랜스펙션시켰다. 포유 동물 EBNA-293 세포를 리포펙션으로 트랜스펙션시키고 5%의 송아지 태아 혈청, 0.5 ㎍/ml의 퓨로마이신, 50 ㎍/ml의 젠타마이신, 및 100 ㎍/ml의 제네티신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 배양하였다. 성장 세포를 확장시키고, 조절 배지를 매 4∼5일마다 수집하였다. 세포 및 잔해를 원심 분리로 제거하였다.
융합 폴리펩티드는 Ni-NTA 아가로스를 사용한 정제를 가능하게 하기 위하여 6개의 히스티딘 잔기를 포함한다. 500 ml의 조절 배지에 대하여 20% 에탄올 중에 ∼0.35 ml의 비드를 포함하는 0.75 ml의 분액의 Ni-NTA 아가로스 슬러리(QIAGEN GmbH, Germany)를 첨가하였다. 진탕기에서 4℃에서 하룻밤 항온처리한 후 Ni-NTA 아가로스를 약 2000 g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 컬럼으로 옮겼다. 제조업자의 지시에 따라 비드를 1 M NaCl 및 0.1%의 트윈 20 존재 하에 pH 7.4의 PBS로 세척하고 0.1 M NaCl을 포함하는 pH 8.0의 20 mM 트리스 중 100 mM의 이미다졸(Merck, Germany)로 용출시켰다. 폴리펩티드를 포함하는 분획을 풀링하고 분자량 컷오프가 12,000∼14,000 Da(SpectraPor Membranes, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA)인 막을 사용하여 pH 7.4의 PBS에 대하여 투석시켰다. 필요할 경우 샘플을 Macrosep 1OK 원심분리 장치(PALL Gelman Laboratory)를 사용하여 농축시켰다. 최종 폴리펩티드 농도를 브래드포드 분석법(BIO-RAD Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 개산하였다. 세포는 6His-MBP-C5a 융합 폴리펩티드를 약 2 mg/L의 수준으로 생성하였다. Rainbow 단백질 분자량 마커(Amersham International, Buckinghamshire, England)를 크기 개산에 사용하였다. 폴리펩티드는 53 kD의 예상 크기로 이동하였다. 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도 5에 도시하였다.
실시예 3 - 콜라겐-유도된 쥐 관절염에 대한 MBP-C5a의 영향
PBS 중 정제 6His-MBP-C5a 폴리펩티드를 완전 프로인트 면역 보강제(Complete Freund's Adjuvant, CFA) 또는 불완전 프로인트 면역 보강제(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)와 1:1의 비로 사용 직전에 조합하였다. 이 용액을 18G 니들이 갖추어진 해밀턴 시린지(Hamilton Corp., Reno, NE)에서 위아래로 반복적으로 흡인하고, 연고와 유사한 유동학적 특성을 갖는 백색 에멀션이 형성될 때까지 혼합하였다. 23G 니들을 혼합물의 투여를 위하여 시린지 상에 두었다. 동일한 부피의 PBS 및 CFA 또는 IFA를 함유하는 대조군 혼합물도 제조하였다.
12 주령의 수컷 QB(Balb/c X B10.Q) F1 마우스를 각각 14 마리 또는 16 마리의 동물의 두 군으로 나누고, CFA에 유화시킨 100 ㎍의 MBP-C5a 또는 대조군 혼합물로 -21일에 견갑골 사이에 피하 주사하였다. 혈액 샘플을 -21일에 또한 채취하고, 혈청을 -20℃에 보관하였다. -3일 및 28일에 IFA 중 50 ㎍의 MBP-C5a 또는 대조군 혼합물의 추가 주사를 동물에 행하였다. 주사제는 일반적으로 100∼200 μL의 부피로 투여하였다.
관절염을 유도하기 위하여 0일에 CFA에 1:1로 유화시킨 100 ㎍의 펩신 분해 CII를 마우스의 미근에 피내 주사하였다. 관절염은 28일과 56일 사이에 발병할 것으로 예상되었다. 35일에 IFA에 유화시킨 CII를 동물에 추가로 주사하고, 혈액 샘플을 35일에 채취하였다. 실험이 종료되었을 때, 동물을 14일부터 90일까지 매주 3회 이상 조사하였다. 각각의 발의 염증이 생긴 관절의 수에 기초하는 평점 시스템을 사용하여 동물을 맹목적으로 평점을 매겼다. 염증은 부기 및 발적으로 정의하였다. 이러한 평점 시스템에 있어서 염증이 생긴 발가락 또는 무릎 관절에 1점을 부여하고, 반면, 염증이 생긴 손목 또는 발목에 5점을 부여하였다. 이것에 의해 각각의 발의 경우 0∼15점의 점수(발가락 5점 + 무릎 관절 5점 + 손목/발목 1점), 그리고 각각의 마우스의 경우 0∼60점의 점수가 산출되었다. 이 실험은 관절염의 발병에 기초하여 적절하다고 생각되는 경우 또는 90일에 종결하였다. 마우스는 비정상적인 털 상태, 상동 행동 상의 변화 또는 거동 상의 변화, 감염, 또는 예상되는 관절염 질병과 관련하여 보통 나타나는 증상 이외의 기타 중하거나 기대되지 않는 부작용의 징후를 전혀 나타내지 않았다. 동물을 엔플루란(Forene(등록상표))/산소로 마취시키고, 혈액을 레오비탈(reorbital) 천자로 수득하였다. 혈청을 수집하고 -20℃에 보관하였다. ELISA 방법을 사용하여 -21일, 35일, 및 연구의 마지막에 수집한 혈청에 있어서 항-CII 및 항-C5a 항체의 수준을 평가하였다.
만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 이용하여 평점 데이터를 분석하고, 곡선 아래 면적 및 카이 제곱 값을 이용하여 관절염의 발병률의 유의성을 분석하였다. 1차 콜라겐 처리 후 28일에 대조군의 14 마리의 마우스 중 7 마리(50%)가 염증을 나타내었으며, 반면 MBP-C5a로 전처리한 16 마리의 마우스 중 단지 2 마리(12.5%)만 염증을 나타내었다(도 6). 이 데이터에 의해 0.025의 카이 제곱 P 값이 생성되었다. 염증의 누적 발생(67일)은 대조군에 있어서 14 마리 중 14 마리였으며 MBP-C5a로 전처리한 군에 있어서는 16 마리 중 11 마리였다(P = 0.022). 따라서 콜라겐-유도된 관절염의 발병률은 두 군 사이에서 유의적으로 상이하였다.
염증의 양에 기초한 평균 관절염 점수를 1일과 90일 사이에서 각각의 군에 대하여 도시하였다(도 7). 각각의 군에 있어서의 1 마리의 마우스의 최대 점수는 60이었다. 연구의 마지막에 최대로 중한 것에서는 대조군에 있어서 38.6의 평균 값, 그리고 MBP-C5a로 예비 처리한 군에 있어서는 19.0의 평균 값이 생성되었다(P = 0.0085; 도 8). 곡선 아래 면적에 의해서는 대조군에 있어서는 485.9의 평균 값, 그리고 MBP-C5a로 전처리한 군에 있어서는 168.9의 평균 값이 생성되었다(P = 0.0012; 도 9). 이러한 결과는 상기 동물에 있어서의 콜라겐-유도된 관절염의 발병률 및 중증도가 MBP-C5a 융합 폴리펩티드를 이용한 치료에 의해 감소된다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 4 - QB-BC 마우스에 있어서 콜라겐-유도된 만성 관절염에 대한 MBP-C5a의 영향
상기한 바와 같이 PBS 중 정제 MBP-C5a 폴리펩티드를 CFA 또는 IFA와 조합하였다. 동일한 부피의 PBS 및 CFA 또는 IFA를 포함하는 대조군 혼합물도 제조하였다.
8∼10 주령의 수컷 및 암컷 QB-BC(B1O.Q(Balb/c X B1O.Q)) 마우스의 미근에 IFA에 1:1로 유화시킨 100 ㎍의 펩신 분해 CII를 피내 주사하였다. 35일에 IFA 중 50 ㎍의 펩신 분해 CII를 마우스에 2차 주사하였다. 이어서 마우스에 있어서 만성 관절염의 발병을 주당 3회 이상 평점을 매겼다. 마우스 전부는 아니지만 다수에서 활성 관절염의 재발 기간을 특징으로 하는 만성적인 재발 질병의 코스가 전개되었다. 이러한 재발은 예견됨이 없이 나타났으며 한 번에 수주 동안 지속되었으며 일생에 기초하여 나타나는 것으로 보였다. 코호트에 있어서의 관절염의 영향의 가변성은 주로 유전적 이질성으로 인한 것이었다(마우스는 인간의 유전적 상황을 모방하려는 실험 디자인으로 인하여 N2 동물이었음).
재발의 재현의 조정을 위하여, 만성 재발기 동안 마우스를 CII로 재면역화하였다. 마우스가 12∼14 주령이 되면 만성 재발성 질병에 걸렸지만 현재는 활성 질병 재발이 전혀 없는 동물을 무작위적으로 혼합하고 동일한 크기의 네 군으로 분류하였다. 제어되는 관절염 재발의 유도를 위하여 -21일(1차 CII 면역화 후 259일)에 각각을 CFA에서 1:1로 유화시킨 PBS 중 100 ㎍의 MBP-C5a(n=24) 또는 PBS 단독(n=12)을 마우스의 견갑골 사이에 피하 주사하였다. -3일에 PBS 중 50 ㎍의 MBP-C5a 또는 PBS 단독(각각 CFA 중)을 동물에 추가 주사하였다. 0일(1차 CII 면역화 후 280일)에 두 군 모두의 동물의 미근에 IFA에 1:1로 유화시킨 50 ㎍의 펩신 분해 CII를 피내 주사하였다. 21일(1차 CII 면역화 후 301일)에 PBS 중의 50㎍의 MBP-C5a 또는 PBS 단독을 2차 추가 주사로 투여하였다. 또한 혈액 샘플을 -21일 및 0일에 레오비탈 천자로 수득하였다.
상기한 평점 시스템을 사용하여 동물을 맹목적으로 평점을 매겨 각각의 마우스에 있어서 0∼60의 관절염 점수를 생성하였다. 이 실험은 1차 CII 면역화 후 358일에 종결하였다. 이 연구는 대조군 마우스 전부가 특히 대략 40일에 관절염 증상을 나타내었으며, MBP-C5a로 면역화한 마우스 중 단지 50%가 만성 관절염을 나타낸다는 것을 보여주었다(p<0.05; 도 10). 또한 평균 관절염 점수를 연구의 시작시부터(즉, CII의 1차 주사시부터) 358일보다 더 나중의 연구의 마지막, 그리고 재유발 또는 재발 후 78일까지 두 군에 대하여 측정하였다(도 11). 평균 관절염 점수는 MBP-C5a를 이용한 면역화까지는 두 군 사이에서 유의적으로 상이하지 않았으며, 그 후 처리된 군의 평균 관절염 점수는 대조군보다 유의적으로 더 낮았다(P<0.05; 도 11). 이러한 결과는 MBP-C5a 융합 폴리펩티드가 처리된 동물에 있어서 만성 재발 관절염의 발병률을 감소시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
기타 실시 형태
본 발명을 상세한 설명과 함께 기술하였지만 전술한 상세한 설명은 예시하려는 것이며, 첨부된 청구의 범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 한정하려는 것이 아님을 알아야 한다. 기타 태양, 이점 및 변경은 하기의 청구의 범위의 범주 이내이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2002년 12월 2일에 출원된 미국 가출원 제60/430,278호를 우선권으로 주장한다.
Claims (83)
- 염증성 질환에 걸린 포유 동물의 치료 방법으로서, 자기(self) C5 아미노산 단편 및 비자기(non-self) 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 상기 포유 동물에 투여하여 상기 폴리펩티드가 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하도록 하는 것을 포함하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증, 심근 허혈/재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 신장염, 이식 거부, 류마티스성 관절염, 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 아테롬성 경화증, 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 MBP-C5a인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 자기 C5 아미노산 단편은 C5a 서열의 일부를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 C5 서열의 일부를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 바이러스의 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 박테리아의 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 진균류의 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 포유 동물의 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 비자연발생 단편인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 방법.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 비자기 C5 아미노산 단편은 비자연발생 단편인 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 비자기 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 포유 동물 아미노산 단편인 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 길이가 350개 미만의 아미노산 잔기인 비자기 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 바이러스의 단편인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 박테리아의 단편인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 진균류의 단편인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 포유 동물의 단편인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 비자연발생 단편인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 포유 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 300개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 250개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 200개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드와 면역 보강제를 포함하는 조성물.
- 제32항에 있어서, 상기 박테리아 아미노산 단편은 MBP인 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 길이가 350개 미만의 아미노산 잔기인 비자기 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 제38항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 300개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 제38항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 250개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 제38항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 200개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하며 상기 C5 아미노산 단편과 상기 박테리아 아미노산 단편 사이의 인자 Xa 절단 부위가 결여된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 제42항에 있어서, 상기 비자기 박테리아 아미노산 단편은 MBP인 단리된 핵산.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
- 제36항 내지 제38항, 제42항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제46항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 것인 숙주 세포.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 것인 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 비자기 C5 아미노산 단편은 비자연발생 단편인 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 비자기 C5 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함하는 것인 조성물.
- 제52항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제52항에 있어서, 상기 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 포유 동물 아미노산 단편인 조성물.
- 제52항에 있어서, 상기 비자기 척추 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 350개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 포유 동물에의 투여는 상기 포유 동물에서 항-C5 반응을 유도하며, 상기 포유 동물의 게놈은 상기 자기 C5 아미노산 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 바이러스의 단편인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 박테리아의 단편인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 진균류의 단편인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 포유 동물의 단편인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편은 비자연발생 단편인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 포유 동물 아미노산 단편은 2개 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 300개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 250개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 제56항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 200개 미만의 아미노산 잔기인 조성물.
- 폴리펩티드 및 면역 보강제를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하는 것인 조성물.
- 제67항에 있어서, 상기 박테리아 아미노산 단편은 MBP인 조성물.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함하는 것인 조성물.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함하는 것인 조성물.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 C5 아미노산 단편을 포함하는 것인 단리된 핵산.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 척추 동물 아미노산 단편을 포함하는 것인 단리된 핵산.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하고, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 350개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 제73항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 300개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 제73항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 250개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 제73항에 있어서, 상기 비자기 아미노산 단편의 길이는 200개 미만의 아미노산 잔기인 단리된 핵산.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 박테리아 아미노산 단편을 포함하고, 상기 폴리펩티드에는 상기 C5 아미노산 단편과 상기 박테리아 아미노산 단편 사이에 인자 Xa의 절단 부위가 결여된 것인 단리된 핵산.
- 제77항에 있어서, 상기 비자기 박테리아 아미노산 단편은 MBP인 단리된 핵산.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 진균류 아미노산 단편을 포함하는 것인 단리된 핵산.
- 포유 동물 투여용의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 바이러스 아미노산 단편을 포함하는 것인 단리된 핵산.
- 제71항 내지 제73항, 제77항, 제79항 및 제80항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
- 제81항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 것인 숙주 세포.
- 폴리펩티드를 포함하는 포유 동물 투여용 조성물로서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유 동물에 대하여 자기 C5 아미노산 단편 및 비자기 아미노산 단편을 포함하며, 상기 자기 C5 아미노산 단편은 상기 포유 동물로부터 유래되는 C5 서열에 대하여 90% 이상 동일한 것인 조성물.
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