ES2321482T3 - Nuevo procedimiento de cribado de moduladores de la transcripcion bacteriana. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección de un compuesto modulador de la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína que interviene durante la transcripción, en el que: - se deposita sobre un soporte sólido la proteína que interviene durante la transcripción, con el fin de adsorber dicha proteína sobre dicho soporte sólido, - se añade a dicho soporte sólido la ARN polimerasa y el compuesto sometido al procedimiento de detección, - se incuba dicho soporte sólido que comprende la ARN polimerasa, la proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, y se forma un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y se forma una unión por un lado entre dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, - se detecta, mediante un ensayo de complejación distinto de una cromatografía o de una inmunoprecipitación, la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier modulador, designando dicha variación significativa una variación de aproximadamente más del 20% de la cantidad de complejo formado, y - se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una modulación de la complejación entra la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
Description
Nuevo procedimiento de cribado de moduladores de
la transcripción bacteriana.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento de cribado de moduladores de la transcripción
bacteriana, en particular de activadores y de inhibidores. La
invención se refiere en particular a un procedimiento de cribado de
activadores y de inhibidores de la unión de los factores de
transcripción con la ARN polimerasa. La invención se refiere
asimismo a un kit o a un botiquín para la detección de moduladores
de la transcripción bacteriana, así como al uso de este
procedimiento de cribado en el ámbito del descubrimiento de
antibióticos, de medicamentos antivíricos y anticancerígenos.
La transcripción de los genes en moléculas de
ARN correspondientes es un proceso complejo catalizado por la ARN
polimerasa, dependiente del ADN, y que implica numerosas
proteínas.
La ARN polimerasa bacteriana se presenta en dos
formas: la enzima central (o "core enzima") y la holoenzima,
que aparece tras la fijación del factor de transcripción sigma
(\sigma) sobre la enzima central. Es esta holoenzima la que
reconoce y se une al promotor, lo que permite la iniciación de la
transcripción a partir de un sitio específico (Burgess et
al., 1969; Reznikoff et al., 1985). La enzima central es
incapaz de reconocer las secuencias del promotor; es por lo tanto
la adición de un factor \sigma lo que especifica la localización
de la iniciación de la transcripción. Esta complejación entre el
factor \sigma y la ARN polimerasa central es indispensable
durante las primeras etapas de la transcripción bacteriana. Después
de esas etapas de iniciación, \sigma abandona la enzima central,
y otras proteínas, tales como NusA, se unen a la enzima central.
De manera general, los factores \sigma
pertenecen a una familia de proteínas que poseen las mismas
funciones: son unas subunidades de la ARN polimerasa, necesarias
para la iniciación de la transcripción; estos factores tienen una
importancia primordial en cuanto a la selección de los sitios de
unión de la enzima a nivel de los promotores.
Los factores NusA se asocian a la ARN polimerasa
y favorecen las interrupciones o la terminación de la transcripción
a nivel de ciertas secuencias de ADN.
Mediante la expresión "interrupciones de la
transcripción" se define de manera habitual una disminución o
una parada transitoria de la actividad enzimática.
La búsqueda de nuevas dianas para unos
antibióticos es una prioridad para mantenerse por delante de la
aparición cada vez más frecuente de bacterias resistentes o
multirresistentes a los antibióticos comercializados (Courvalin,
1996).
La ARN polimerasa procariota es una diana
importante. En efecto, ésta es vital para la bacteria y ya es la
diana de antibióticos usados en terapéutica (rifampicina y
derivados). Es asimismo una diana para numerosos microorganismos
(Yang et al., 1995) y bacteriófagos (Kolesky et al.,
1999) que luchan contra las bacterias. La búsqueda de nuevas dianas
sobre la polimerasa es por lo tanto factible y deseable.
Las ARN y las ADN polimerasas así como las
transcriptasas inversas eucariotas, procariotas y víricas son
buenas dianas para afectar al funcionamiento de un organismo vivo.
Estas actividades enzimáticas son en general relativamente fáciles
de monitorizar, y por lo tanto se han convertido en unas dianas de
elección para la búsqueda de nuevos fármacos antivíricos,
anticancerígenos o antibióticos. Esta fuerte actividad industrial ha
generado unos ensayos de actividad más rápidos y más fiables,
adaptables a las nuevas exigencias del cribado de alto
rendimiento.
Así, la patente US nº 5 635 349 a nombre de
Tularik describe un método de identificación de un inhibidor de la
actividad de una polimerasa, en particular la ARN polimerasa,
derivada por ejemplo de un organismo patógeno infeccioso. Este
método consiste en medir la actividad de la ARN polimerasa en
presencia de diversas moléculas de las cuales se ensaya la
capacidad para inhibir la actividad de la enzima. En la actualidad,
la técnica básica usada por la mayoría de los laboratorios consiste
en medir la incorporación de nucleótidos radioactivos, testigos de
la actividad de la enzima, en presencia de los potenciales
inhibidores (Wu et al., 1997). Este método permite resaltar
globalmente todos los inhibidores de la transcripción (específicos
tal como la rifampicina, o menos específicos tales como los agentes
espaciadores, los agentes quelantes de iones divalentes, etc.).
Sin embargo, estos ensayos de actividad tienen
un coste elevado y son falseados, por ejemplo, por la presencia de
ARNasas y de ADNasas, así como de agentes que interactúan con el
ADN.
La patente WO 96/38478 da a conocer un
procedimiento de detección de compuestos que tienen la capacidad
para inhibir la asociación de una subunidad sigma con la ARN
polimerasa de Mycobacterium tuberculosis, método que
comprende la puesta en contacto de un compuesto con la subunidad
sigma y la ARN polimerasa, y la detección del compuesto formado
entre la ARN polimerasa y la subunidad sigma. En este caso, el
método de detección se lleva a cabo mediante cromatografía o
mediante inmunoprecipitación según Lesley et al. (1989), pero
estas técnicas de detección no son lo bastante rápidas para un
cribado de alto rendimiento.
En la actualidad, ninguno de los procedimientos
de cribado de alto rendimiento de la técnica anterior permite
identificar un compuesto que afecta específicamente a una etapa de
la transcripción para la cual no existe todavía ningún inhibidor
descrito anteriormente. En la actualidad, ninguno de los
procedimientos de la técnica anterior permite identificar
fácilmente moduladores de la unión entre el factor sigma y la ARN
polimerasa, los cuales no se pueden identificar mediante
transcripción in vitro. En efecto, durante la transcripción
in vitro, habiéndose ya formado el complejo entre el factor
sigma y la ARN polimerasa, no es posible determinar unos
moduladores de la unión entre las dos moléculas debido a que ya se
ha formado esta unión antes de la intervención de los moduladores
potenciales.
Ahora bien, la invención permite en particular
aportar una solución a estos problemas.
El objetivo de la invención es proporcionar un
nuevo procedimiento rápido e industrialmente aplicable que permite
el cribado de productos que intervienen durante la
transcripción.
El objetivo de la invención es proporcionar
dicho procedimiento que se pueda usar en el ámbito de un cribado de
alto rendimiento.
El objetivo de la invención es proporcionar un
nuevo ensayo de complejación en el que las ARNasas y las ADNasas no
interfieran con la medición de la actividad transcripcional,
degradando la matriz de ADN o el ARN producido.
El objetivo de la invención es proporcionar un
nuevo procedimiento que, dirigiéndose hacia la interfaz de
complejación entre dos proteínas, por ejemplo la ARN polimerasa y el
factor sigma, permite limitar los riesgos de resistencia por
mutación de la diana.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección de un compuesto modulador de la complejación entre la ARN
polimerasa y una proteína que interviene durante la transcripción,
en el que:
- -
- se incuba una mezcla que comprende la ARN polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, efectuándose la etapa de incubación en unas condiciones que permiten:
- \bullet
- la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y
- \bullet
- la formación de una unión, por un lado entre dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación, la variación significativa eventual de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier modulador, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre por una parte dicho compuesto y por otra parte la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una modulación de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
Mediante la expresión "proteína que interviene
durante la transcripción" se designa cualquier factor proteico
que interactúa físicamente con la ARN polimerasa (\alpha_{2},
\beta, \beta') y que modifica su actividad transcripcional.
Mediante la expresión "compuesto modulador de
la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína que
interviene durante la transcripción" se designa:
- -
- un compuesto que provoca una disminución de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción, o bien
- -
- por el contrario, un compuesto que provoca un aumento de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
A continuación, se designa por parejas los dos
elementos que constituyen el complejo. Se designa por primera
pareja la que aparece en primer lugar en la mezcla, y por segunda
pareja la que interviene cronológicamente después de la primera
pareja. En el caso muy particular de la adición simultánea de los
dos elementos que constituyen el complejo, es evidente que las dos
parejas corresponden indiferentemente a la primera pareja y a la
segunda pareja.
Mediante la expresión "ensayo de
complejación", se entiende una técnica de revelación cuantitativa
del complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que
interviene durante la transcripción.
De manera ventajosa, este ensayo implica el
marcado molecular por una sustancia de por lo menos una de las
parejas, a saber, la ARN polimerasa y/o dicha proteína. Este marcado
permite una medición física cuantitativa directa o indirecta, por
emisión o consumo de señal, espontáneamente o después de la adición
de un sustrato o de una señal.
\newpage
De manera ventajosa, este ensayo no implica la
presencia, para el complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha
proteína, de una propiedad físico-química
particular, tal como el tamaño molecular o el punto isoeléctrico.
Por consiguiente, este ensayo es diferente de una cromatografía, se
trate de una técnica por filtración/exclusión o por efecto de
carga.
El marcado, tal como se ha mencionado
anteriormente, puede efectuarse usando en particular un elemento
radioactivo, un elemento fluorescente, un elemento luminiscente,
una enzima, una biotina para una revelación indirecta mediante
avidina marcada, etc.
En un modo de realización particular, cuando las
dos parejas, a saber, la ARN polimerasa y dicha proteína, se pueden
marcar por unas sustancias capaces entre sí de intercambios
energéticos (transferencias), se puede realizar en disolución la
determinación de la cantidad de complejo (o de su variación); la
formación del complejo se acompaña del acercamiento de las dos
parejas, lo que permite la transferencia de energía entre los dos
marcadores y conlleva entonces un aumento o una disminución de la
intensidad de la señal de fluorescencia emitida por uno de los dos
marcadores.
En otro modo de realización, sólo se marca una
de las parejas, y la otra se inmoviliza sobre una fase sólida,
previamente a la puesta en contacto con la pareja marcada, o bien
ulteriormente. La inmovilización puede ser de naturaleza
físico-química como, por ejemplo, por adsorción
sobre una superficie plástica hidrófoba, o de naturaleza
bio-específica: en este caso, un atractor biológico,
que puede ser un anticuerpo específico para una de las parejas, o
avidina, capaz de inmovilizar la pareja previamente revestida con
biotina, se inmoviliza él mismo previamente. En todos los casos, es
la segunda pareja la que permite determinar la cantidad de complejo
o la variación de la cantidad de complejo formado entre la ARN
polimerasa y dicha proteína mediante revelación cuantitativa de su
marcador, que puede haber sido fijado por unión química permanente
(elemento radioactivo, elemento fluorescente, elemento
luminiscente, enzima, biotina, etc.) o introducido de manera
bio-específica. En este caso, es posible usar un
anticuerpo dirigido contra la segunda pareja si está marcada directa
o indirectamente, o avidina marcada directa o indirectamente.
Por otra parte, este ensayo es asimismo
independiente de las técnicas inmunológicas denominadas ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay), puesto que usa
un anticuerpo únicamente para revelar una de las parejas de una
interacción bio-específica a la que este anticuerpo
es ajeno. Este ensayo se basa en la interacción entre la ARN
polimerasa y dicha proteína, al contrario de un ensayo ELISA, que
se basa en una interacción antígeno-anticuerpo.
Además, en este ensayo, el anticuerpo se usa únicamente para la
detección, y se puede sustituir, por ejemplo, por un marcador
fluorescente o radioactivo. Este ensayo es asimismo diferente de una
inmunoprecipitación, porque el anticuerpo no se usa para
inmunoprecipitar un complejo formado entre la ARN polimerasa y la
proteína que interviene durante la transcripción: sirve para
capturar este complejo sobre una fase sólida, o bien para revelar
una de las parejas del complejo.
Para obtener el valor de control que corresponde
a una ausencia de modulación se lleva a cabo el siguiente
experimento:
- -
- se incuba una mezcla que comprende la ARN polimerasa y una proteína tal como se ha definido anteriormente en unas condiciones que permiten la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y
- -
- se detecta la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína; correspondiendo esta cantidad a dicho valor de control.
Mediante la expresión "variación significativa
de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la
proteína que interviene durante la transcripción" se designa una
variación de aproximadamente más del 20% de la cantidad de complejo
formado, y preferentemente de por lo menos aproximadamente 50%.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que el
compuesto modulador es un compuesto activador de la complejación
entre la ARN polimerasa y una proteína que interviene durante la
transcripción, y en el que:
- -
- se incuba una mezcla que comprende la ARN polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, efectuándose la etapa de incubación en unas condiciones que permiten:
- \bullet
- la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y
- \bullet
- eventualmente la formación de una unión por un lado entre dicho compuesto y, por otro lado, la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación, la variación significativa eventual de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier agente activador, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre, por un lado dicho compuesto y, por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una activación de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
Mediante la expresión "compuesto activador de
la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína que
interviene durante la transcripción" se designa un compuesto que
provoca un aumento de la cantidad de complejo.
Dicho compuesto activador provoca una mayor
complejación, es decir, un aumento de por lo menos 120% y
preferentemente superior a 150%, con relación al control
(porcentaje de 100%) que corresponde a la cantidad de complejo
formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de
cualquier agente activador.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que el
compuesto modulador es un compuesto inhibidor de la complejación
entre la ARN polimerasa y una proteína que interviene durante la
transcripción, en el que:
- -
- se incuba una mezcla que comprende la ARN polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, efectuándose la etapa de incubación en unas condiciones que permiten:
- \bullet
- la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y
- \bullet
- eventualmente la formación de una unión por un lado entre dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación, la variación significativa eventual de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un primer valor de control y/o a un segundo valor de control, correspondiendo uno de estos valores de control a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier inhibidor, y correspondiendo el otro de estos valores de control a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en presencia de un inhibidor de referencia, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre, por un lado, dicho compuesto y, por otro lado, la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una inhibición de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
Mediante la expresión "compuesto inhibidor de
la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína que
interviene durante la transcripción" se designa un compuesto que
provoca la disminución de la cantidad de complejo formado entre la
ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la
transcripción.
Para obtener el primer valor de control, se
efectúa el experimento tal como se ha descrito anteriormente, que
corresponde a una ausencia de inhibición.
Para obtener el segundo valor de control, que
corresponde a una inhibición de referencia, se efectúa el siguiente
experimento:
- -
- se incuba una mezcla que comprende la ARN polimerasa, una proteína tal como se ha definido anteriormente y el inhibidor de referencia, efectuándose la etapa de incubación en unas condiciones que permiten:
- \bullet
- la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y
- \bullet
- la formación de una unión entre el inhibidor de referencia y la ARN polimerasa,
- -
- se detecta la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína; correspondiendo esta cantidad al segundo valor de control. Esta cantidad será inferior a la medida durante el primer control debido a la formación del complejo entre el inhibidor de referencia y la ARN polimerasa, y de su consecuencia negativa sobre la formación de dicho complejo.
El inhibidor de referencia es, por un ejemplo,
un anticuerpo monoclonal, en particular el anticuerpo monoclonal
3E10 (véase el ejemplo).
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento de detección tal como se ha definido anteriormente,
que comprende el uso de un solo valor de control, que corresponde a
la incubación de ARN polimerasa sola, interviniendo la proteína
durante la transcripción en ausencia de cualquier inhibidor (lo que
corresponde a una ausencia de inhibición).
\newpage
Para obtener este valor de control, que
corresponde a una ausencia de inhibición, se lleva a cabo el
experimento tal como se ha descrito anteriormente, que comprende la
incubación de la ARN polimerasa sola con la proteína que interviene
durante la transcripción.
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, que comprende
el uso de dos valores de control, correspondiendo uno a la
incubación de ARN polimerasa sola con la proteína que interviene
durante la transcripción en ausencia de cualquier inhibidor (lo que
corresponde a una ausencia de inhibición), y correspondiendo el
otro a una incubación de la ARN polimerasa con la proteína que
interviene durante la transcripción, y con un inhibidor de
referencia (lo que corresponde a una inhibición de referencia).
Para obtener los dos valores de control, se
llevan a cabo los dos experimentos tal como se han descrito
anteriormente; el primero se obtiene detectando la cantidad de
complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que
interviene durante la transcripción en ausencia de inhibidor, y el
segundo detectando la cantidad de complejo formado entre la ARN
polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción en
presencia del inhibidor de referencia.
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en fase
sólida, que comprende el uso de un primer valor de control y/o de un
segundo valor de control y/o de un tercer valor de control;
correspondiendo uno a la cantidad de complejo formado entre la ARN
polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier inhibidor,
correspondiendo el otro a la cantidad de complejo formado entre la
ARN polimerasa y dicha proteína en presencia de un inhibidor de
referencia, y correspondiendo el tercero:
- -
- a la ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción, que resulta de la introducción de la proteína que interviene durante la transcripción fijada sobre un soporte, de la ARN polimerasa y de un exceso de proteína que interviene durante la transcripción, preferentemente incubándose previamente el exceso de proteína que interviene durante la transcripción con la ARN polimerasa, correspondiendo la ausencia de dicho complejo a una inhibición total de la complejación entre la ARN polimerasa y dicha proteína, o bien
- -
- a la ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción, que resulta de la presencia sola de ARN polimerasa y de la ausencia de proteína que interviene durante la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la expresión "procedimiento en fase
sólida" se designa un procedimiento en el que una de las parejas,
a saber, la ARN polimerasa o la proteína que interviene durante la
transcripción, se inmoviliza de manera covalente (reacción química)
o no covalente (adsorción no específica sobre plástico, sistema
avidina-biotina, anticuerpo) sobre un soporte
sólido. La segunda pareja se incuba en unas condiciones que permiten
la complejación entre las dos parejas, y después el exceso de la
segunda pareja se elimina eventualmente mediante lavado. Después,
el complejo se somete al procedimiento de detección.
Para obtener el primer valor de control, se
lleva a cabo el experimento tal como se ha descrito anteriormente,
que corresponde a una ausencia de inhibición.
Para obtener el segundo valor de control, que
corresponde a una inhibición de referencia, se detecta la cantidad
de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que
interviene durante la transcripción, en presencia del inhibidor de
referencia.
Para obtener el tercer valor de control, que
corresponde a una inhibición de referencia,
- -
- se lleva a cabo el siguiente experimento que corresponde a una incubación de un soporte sobre el cual se fija la proteína que interviene durante la transcripción con una ARN polimerasa y un exceso de la proteína que interviene durante la transcripción, preincubándose preferentemente el exceso de dicha proteína con la ARN polimerasa, y que provoca una inhibición total de la complejación entre la ARN polimerasa y dicha proteína, es decir, una ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína, o bien
- -
- se lleva a cabo el siguiente experimento que corresponde a una incubación de un soporte con la ARN polimerasa sola, lo que conlleva una ausencia total de la complejación entre la ARN polimerasa y dicha proteína, es decir, una ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína.
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en fase
líquida, que comprende el uso de un primer valor de control y/o de
un segundo valor de control y/o de un tercer valor de control,
correspondiendo uno a la cantidad de complejo
formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de
cualquier inhibidor,
correspondiendo el otro a la cantidad de
complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en
presencia de un inhibidor de referencia, y
correspondiendo el tercero a la ausencia de
complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que
interviene durante la transcripción, que resulta de la introducción
de la ARN polimerasa, de un exceso de proteína no marcada que
interviene durante la transcripción y de dicha proteína marcada,
correspondiendo la ausencia de dicho complejo a una inhibición
total de la complejación entre la ARN polimerasa y dicha
proteína.
Mediante la expresión "procedimiento en fase
líquida" se designa un procedimiento en el que las parejas están
en disolución en una disolución tampón. Una de las parejas o ambas
están, por ejemplo, marcadas con una molécula fluorescente. Su
interacción se cuantifica mediante transferencia o polarización de
fluorescencia.
Para obtener el primer valor de control, se
lleva a cabo el experimento tal como se ha descrito anteriormente,
que corresponde a una ausencia de inhibición.
Para obtener el segundo valor de control, que
corresponde a una inhibición de referencia, se detecta la cantidad
de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que
interviene durante la transcripción, en presencia del inhibidor de
referencia.
Para obtener el tercer valor de control, que
corresponde a una inhibición de referencia, se lleva a cabo el
siguiente experimento que corresponde a una incubación de la ARN
polimerasa, de un exceso de proteína no marcada que interviene
durante la transcripción y de la proteína que interviene durante la
transcripción, lo que provoca una inhibición total de la
complejación entre la ARN polimerasa y dicha proteína, es decir, una
ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha
proteína.
Un procedimiento ventajoso de detección es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que se
prepara la mezcla que comprende la ARN polimerasa, una proteína que
interviene durante la transcripción y un compuesto sometido al
procedimiento de detección:
- -
- añadiendo simultáneamente la ARN polimerasa, la proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, o
- -
- añadiendo sucesivamente: la ARN polimerasa, el compuesto sometido al procedimiento de detección y la proteína que interviene durante la transcripción, o sucesivamente: la proteína que interviene durante la transcripción, el compuesto sometido al procedimiento de detección y la ARN polimerasa, o
- -
- añadiendo dicho compuesto previamente incubado con la ARN polimerasa o dicha proteína, y respectivamente dicha proteína o la ARN polimerasa, o
- -
- añadiendo dicho compuesto y la ARN polimerasa previamente incubada con dicha proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo
simultáneamente la ARN polimerasa, la proteína que interviene
durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de
detección, puede permitir la búsqueda de los compuestos que se unen
a un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y que
disocian dicho complejo así como los compuestos que se unen sólo a
una de las dos parejas, pero que son suficientemente eficaces para
competir con un complejo preformado.
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo
sucesivamente: la ARN polimerasa, el compuesto sometido al
procedimiento de detección y la proteína que interviene durante la
transcripción, puede facilitar la detección de compuestos que se
unen a la ARN polimerasa. Este modo de realización puede permitir la
selección, además de los ligandos de la ARN polimerasa, de los
mejores ligandos de dicha proteína que están, en este caso, en
desventaja desde el punto de vista cinético.
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo
sucesivamente: la proteína que interviene durante la transcripción,
el compuesto sometido al procedimiento de detección y la ARN
polimerasa, puede favorecer la detección de compuestos que se unen
a la molécula que interviene durante la transcripción, así como la
búsqueda de ligandos de la ARN polimerasa muy buenos que están
desfavorecidos desde el punto de vista cinético.
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo dicho
compuesto previamente incubado con la ARN polimerasa a dicha
proteína, puede favorecer la unión de dicho compuesto con la ARN
polimerasa antes de la adición de la proteína que interviene
durante la transcripción. Este modo de realización que comprende
una incubación previa puede favorecer la detección de moléculas que
se unen a la ARN polimerasa.
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo dicho
compuesto previamente incubado con dicha proteína a la ARN
polimerasa, permite facilitar la unión entre dicho compuesto y la
proteína que interviene durante la transcripción antes de la
adición de la ARN polimerasa. Este modo de realización puede
favorecer la detección de moléculas que se unen a dicha
proteína.
La preparación de la mezcla que comprende la ARN
polimerasa, una proteína que interviene durante la transcripción y
un compuesto sometido al procedimiento de detección añadiendo dicho
compuesto y la ARN polimerasa previamente incubada con dicha
proteína, permite detectar los compuestos que favorecen la
disociación del complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha
proteína.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de detección tal como se ha definido anteriormente, en
el que se aplica a un soporte sólido, antes, durante o después de
la etapa de incubación, la ARN polimerasa o la proteína que
interviene durante la transcripción.
Esta aplicación se puede llevar a cabo mediante
la intervención de una unión covalente
(físico-químico) o bioespecífica entre el soporte
sólido y la ARN polimerasa o dicha proteína.
Cuando se aplica, antes de la etapa de
incubación, la ARN polimerasa sobre un soporte sólido, es posible
que la ARN polimerasa esté desnaturalizada.
Cuando se aplica, antes de la etapa de
incubación, la proteína que interviene durante la transcripción
sobre un soporte sólido, es posible que dicha proteína esté
desnaturalizada.
Un procedimiento de detección ventajoso de la
invención es un procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
en el que se añade simultáneamente, no mezclados previamente, la
ARN polimerasa y el compuesto sometido al procedimiento de
detección, a la proteína que interviene durante la transcripción
aplicada sobre un soporte.
Este modo de realización puede permite la
detección al mismo tiempo de los ligandos de la proteína que
interviene durante la transcripción, los de la ARN polimerasa y
asimismo los del complejo formado entre dicha proteína y la ARN
polimerasa. Este modo de realización es muy restrictivo para las
moléculas que inhiben la asociación entre la ARN polimerasa y dicha
proteína, y puede permitir asimismo la búsqueda de compuestos que
disocian el complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha
proteína.
Un procedimiento ventajoso de detección de la
invención es un procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
en el que se añade el compuesto sometido al procedimiento de
detección incubado previamente con la ARN polimerasa a la proteína
que interviene durante la transcripción, aplicada a un soporte.
Este modo de realización puede permitir la
detección al mismo tiempo de los ligandos de la proteína que
interviene durante la transcripción, los de la ARN polimerasa y
asimismo los del complejo formado entre dicha proteína y la ARN
polimerasa. Este modo de realización puede facilitar la unión de
dicho compuesto con la ARN polimerasa, pero también puede servir
para seleccionar los mejores ligandos de dicha proteína que están,
en este caso, cinéticamente desfavorecidos.
Un procedimiento ventajoso de detección de la
invención es un procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
en el que se añade simultáneamente, no mezclados previamente, la
proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto
sometido al procedimiento de detección a la ARN polimerasa aplicada
a un soporte.
Este modo de realización puede permitir la
detección al mismo tiempo de los ligandos de la proteína que
interviene durante la transcripción, los de la ARN polimerasa y
asimismo los del complejo formado entre dicha proteína y la ARN
polimerasa. Este modo de realización es muy restrictivo para las
moléculas que inhiben la asociación entre la ARN polimerasa y dicha
proteína, y puede asimismo permitir la búsqueda de los compuestos
que disocian el complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha
proteína.
Un procedimiento de detección ventajoso de la
invención es un procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
en el que se añade el compuesto sometido al procedimiento de
detección previamente incubado con la proteína que interviene
durante la transcripción a la ARN polimerasa aplicada a un
soporte.
Este modo de realización puede permitir la
detección al mismo tiempo de los ligandos de la proteína que
interviene durante la transcripción, los de la ARN polimerasa y
asimismo los del complejo formado entre dicha proteína y la ARN
polimerasa. Este modo de realización puede facilitar así la unión de
dicho compuesto con dicha proteína antes de la incubación con la
ARN polimerasa, y permite la búsqueda de los ligandos de dicha
proteína. Puede servir para seleccionar los mejores ligandos de la
ARN polimerasa que están, en este caso, cinéticamente
desfavorecidos.
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que se
añade uno tras otro el compuesto sometido al procedimiento de
detección y la ARN polimerasa a la proteína que interviene durante
la transcripción aplicada a un soporte.
La aplicación de la proteína que interviene
durante la transcripción a un soporte y después la adición sucesiva
del compuesto sometido al procedimiento de detección y la ARN
polimerasa puede permitir la detección de los compuestos que
inhiben únicamente la proteína que interviene durante la
transcripción. En efecto, si el compuesto tal como se ha definido
anteriormente no se fija sobre la proteína tal como se ha definido
anteriormente, se elimina durante el lavado que se lleva a cabo
antes de la adición de la ARN polimerasa.
Un procedimiento de detección ventajoso es un
procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que se
añade uno tras otro el compuesto sometido al procedimiento de
detección y la proteína que interviene durante la transcripción a
la ARN polimerasa aplicada a un soporte.
La aplicación de la ARN polimerasa a un soporte
y después la adición sucesiva del compuesto sometido al
procedimiento de detección y de la proteína que interviene durante
la transcripción puede permitir la detección de los compuestos que
inhiben únicamente la ARN polimerasa. En efecto, si el compuesto tal
como se ha definido anteriormente no se fija a la ARN polimerasa,
se elimina durante el lavado que se lleva a cabo antes de la adición
de la proteína tal como se ha definido anteriormente.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que, en el
momento de la etapa de incubación de la ARN polimerasa con una
proteína que interviene durante la transcripción y con un compuesto
sometido al procedimiento de detección, se forma una unión:
- -
- entre dicho compuesto y la ARN polimerasa, o
- -
- entre dicho compuesto y dicha proteína, o
- -
- entre dicho compuesto, dicha proteína y la ARN polimerasa.
Cuando se forma una unión entre dicho compuesto
y la ARN polimerasa, si el compuesto sometido al procedimiento de
detección se fija en la región del sitio de complejación de dicha
proteína, dicho compuesto impide que la proteína que interviene
durante la transcripción se compleje con la ARN polimerasa, mientras
que la fijación de dicho compuesto al lado del sitio de
complejación de dicha proteína conlleva un cambio de conformación e
impidy asimismo la complejación entre dicha proteína y la ARN
polimerasa.
Cuando se forma una unión entre dicho compuesto
y dicha proteína, si dicho compuesto se fija en la región del sitio
de complejación de la ARN polimerasa, dicho compuesto impide que la
ARN polimerasa se compleje con dicha proteína, mientras que la
fijación de dicho compuesto al lado del sitio de complejación de la
ARN polimerasa conlleva un cambio de conformación e impidy asimismo
la complejación entre dicha proteína y la ARN polimerasa.
Cuando se forma una unión entre dicho compuesto,
dicha proteína y la ARN polimerasa, dicho compuesto se une a la ARN
polimerasa implicada en el complejo con dicha proteína y favorece la
disociación, o bien el compuesto se une a dicha proteína, cambia su
conformación y fuerza la disociación.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que, durante
la etapa de detección de la variación significativa eventual de la
cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína
que interviene durante la transcripción, se usa un anticuerpo
anti-ARN polimerasa.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que la
proteína que interviene durante la transcripción tiene un peso
molecular superior a aproximadamente 15 kDa, o es una proteína de
fusión entre una proteína de peso molecular inferior a 15 kDa y otra
proteína, tal como la GST (glutathione S transferase).
Ejemplos de dichas proteínas comprenden en
particular los dominios del factor sigma en forma de fusión GST, y
las proteínas Gp33 o 55 del bacteriófago T4 en forma de fusión
GST.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que las
concentraciones de la ARN polimerasa están comprendidas entre
aproximadamente 1 fmol hasta aproximadamente 100 pmoles/ensayo, en
particular aproximadamente 1 fmol y aproximadamente 10
pmoles/ensayo, las de la proteína que interviene durante la
transcripción entre aproximadamente 10 fmoles y aproximadamente 500
pmoles/ensayo, y las del compuesto sometido al procedimiento de
detección entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 \muM, en
particular aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 \muM.
Los intervalos de concentraciones inferiores a
la concentración más baja corresponden al límite de detección,
mientras que los intervalos de concentraciones superiores a la
concentración más fuerte favorecen una unión no específica y
necesitan demasiada cantidad de proteína, lo que es muy desfavorable
para las concentraciones de compuestos sometidos al procedimiento
de detección, que es necesario añadir para observar el efecto
inhibidor.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que la ARN
polimerasa usada procede de células procariotas, en particular de
E. coli.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que la
proteína que interviene durante la transcripción interviene durante
la etapa de iniciación de la transcripción, o durante la etapa de
alargamiento, o durante la etapa de terminación de la
transcripción.
Mediante la expresión "que interviene durante
la etapa de iniciación de la transcripción" se entiende una
proteína que se une a la ARN polimerasa, que le confiere una
especificidad para un promotor y permite la iniciación de la
transcripción.
Ejemplos de proteínas que intervienen durante la
iniciación son en particular la familia de los factores sigma, en
particular el factor sigma 70, así como las proteínas Gp33, Gp45 y
Gp55 del bacteriófago T4.
Mediante la expresión "que intervienen durante
la etapa de alargamiento de la transcripción" se entiende una
proteína que se une a la ARN polimerasa y cambia su velocidad de
alargamiento.
Ejemplos de proteínas que intervienen durante el
alargamiento son en particular las proteínas NusA, greA y greB.
Mediante la expresión "que intervienen durante
la etapa de terminación de la transcripción" se entiende una
proteína que cambia el sitio de terminación de la transcripción.
Ejemplos de proteínas que intervienen durante la
terminación son en particular las proteínas NusA, NusB, NusG, Rho o
la proteína N del bacteriófago lambda.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que la
proteína que interviene durante la transcripción es:
- -
- la proteína \sigma^{70} o una proteína equivalente,
- mediante la expresión "proteína equivalente" se entiende cualquier proteína que se une a la ARN polimerasa, le confiere una especificidad para un promotor y permite la iniciación, o
- -
- la proteína NusA o una proteína equivalente,
- mediante la expresión "proteína equivalente" se entiende cualquier proteína que tiene entre 22 y 100% de identidad de secuencia con la de la proteína NusA de E. coli (Swiss Prot P03003), o
- -
- unos fragmentos de una de estas dos proteínas, o
- -
- una de estas dos proteínas en forma de una proteína de fusión, o bien
- -
- unos fragmentos de una de estas dos proteínas en forma de una proteína de fusión.
La invención se refiere a un procedimiento de
detección tal como se ha definido anteriormente, en el que:
- -
- se adsorbe la proteína que interviene durante la transcripción sobre un soporte,
- -
- se incuba dicho soporte con la ARN polimerasa y con el compuesto sometido al procedimiento de detección, lo que conduce a la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y a la formación eventual de una unión entre la ARN polimerasa y dicho compuesto,
- -
- se incube dicho soporte con un anticuerpo anti-ARN polimerasa,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación, la variación significativa eventual de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier modulador, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre dicho compuesto y la ARN polimerasa, lo que corresponde a una modulación de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
Mediante la expresión "modulación de la
complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene
durante la transcripción" se entiende al mismo tiempo la
activación y la inhibición de dicha complejación.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de detección tal como se ha definido anteriormente, en
el que:
- -
- se adsorbe la proteína que interviene durante la transcripción sobre un soporte,
- -
- se incuba dicho soporte con la ARN polimerasa y con el compuesto sometido al procedimiento de detección, lo que conduce a la formación de un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y a la formación eventual de una unión entre la ARN polimerasa y dicho compuesto,
- -
- se incuba dicho soporte con un anticuerpo anti-ARN polimerasa,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación, la variación significativa eventual de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier inhibidor, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre dicho compuesto y la ARN polimerasa, lo que corresponde a una inhibición de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
La Figura 1 corresponde a la inhibición de la
unión entre la enzima central de la ARN polimerasa y la proteína
\sigma^{70} por los compuestos de la familia de 5 988 031,
estando las fórmulas químicas de dichos compuestos representadas
más adelante. Así, los diferentes compuestos ensayados se incuban en
presencia de la enzima central en una cápsula de microensayo sobre
la cual se adsorbe la proteína \sigma^{70}, conteniendo cada
pocillo de la placa 1 \muM de \sigma^{70} durante la fase de
adsorción. Después, la cápsula se lava y se incuba con el
anticuerpo monoclonal 11D11 marcado con peroxidasa, y después se
revela.
El eje de las ordenadas representa la densidad
óptica medida a 496 nm, que resulta de la inhibición de la mezcla
que comprende la enzima central de la ARN polimerasa, la proteína
\sigma^{70} y un compuesto ensayado, y el eje de las abscisas
representa la concentración de dichos compuestos ensayados en
\mug/ml.
La curva con los asteriscos (*) corresponde a la
densidad óptica a 496 nm con el compuesto 5 988 031; la curva con
los círculos (\bullet) corresponde a la densidad óptica a 496 nm
con el compuesto 5 951 261; La curva con los triángulos
(\blacktriangle) corresponde a la densidad óptica a 496 nm con el
compuesto 5 128 773; la curva con los cuadrados (\sqbullet)
corresponde a la densidad óptica a 496 nm con el compuesto 5 128
772; la curva con los rombos (\blacklozenge) corresponde a la
densidad óptica a 496 nm con el compuesto 5 128 767, y la curva con
las cruces (X) corresponde a la densidad óptica a 496 nm con el
compuesto 5 210 476.
Se recuerda que el porcentaje de unión se
calcula de la siguiente manera:
La Figura 2 representa el porcentaje de unión
entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma^{70}, con relación
a un valor de control que corresponde a la unión máxima (porcentaje
de unión de 100%), para los compuestos 5 858 445, 5 761 990 y 5 768
818 (véanse las fórmulas más adelante).
La Figura 3 representa la densidad óptica medida
a 490 nm durante la introducción de la ARN polimerasa y de la
proteína NusA fijada sobre un soporte, con uno de los compuestos
ensayados para determinar su capacidad para inhibir la unión entre
la ARN polimerasa y NusA.
Más precisamente, los diferentes compuestos
ensayados (de la familia de 5 988 031) se incuban en presencia de
una enzima central en una cápsula de microensayo sobre la cual se
adsorbe la proteína NusA a una concentración igual a 20 \mug/ml.
Después, la cápsula se lava y se incuba con el anticuerpo monoclonal
11D11 marcado con peroxidasa, y después se revela.
La Figura 4 corresponde a la inhibición del
crecimiento de células E. coli TG1 por el compuesto
mencionado anteriormente 5 988 031. Esta figura representa la
densidad óptica medida a 650 nm (en ordenadas) en función de la
concentración del compuesto 5 988 031 en \mug/ml (en
abscisas).
Las células E. coli TG1, diluidas según
el protocolo descrito a continuación en la parte experimental, se
incuban con concentraciones crecientes del compuesto 5 988 031. El
crecimiento de las bacterias se mide a 650 nm después de la
incubación durante 12 horas a 37ºC bajo agitación en una cápsula de
microensayo.
La invención tiene por objeto un nuevo método
que permite el cribado de una zona de interacción de dos proteínas
indispensables para la vida de la célula con el fin de limitar las
resistencias por mutación de la diana.
La invención tiene por objeto el cribado de
bancos de productos químicos sintéticos o de productos naturales,
incluso los contaminados por unas actividades ARNasas o ADNasas.
Las proteínas sigma70 y la ARN polimerasa de
E. coli se expresan y se purifican en unas condiciones
estándar (Burgess et al., Biochemistry, 1975, oct. 21;
14(21): 4634-8; Burgess R., Methods Enzymol
1996; 273: 145-9). La proteína sigma70 se almacena
a -80ºC en (20 mM tris HCI pH 8; 5 M de cloruro de guanidina; 10 mM
de \beta-mercaptoetanol, 50% de glicerol) a una
concentración de 100 \muM. La ARN polimerasa central se almacena a
-80ºC en (20 mM tris HCI pH 8, 100 mM KCI, 10 mM
\beta-mercaptoetanol, 50% de glicerol) a una
concentración de 1 \muM. El anticuerpo monoclonal antipolimerasa
se obtuvo y se purificó mediante unas técnicas estándar (Short
Protocols in Molecular Biology 2ª edición, John Wiley & Son), y
después se acopló químicamente a la peroxidasa activada (Boehringer
Mannheim Biochemica ref. 1428861) según las recomendaciones del
proveedor.
El ensayo se basa en la adsorción de sigma70
sobre una placa de ELISA durante 12 horas a 4ºC (6 pmoles de
proteína diluida en 100 \mul de PBS por pocillo, sobre unas placas
Nunc-immuno plate, Maxisorp). Se han optimizado las
diluciones de proteína y los tampones para reducir la unión no
específica de la ARN polimerasa. Después del lavado de la placa con
PBS 0,1% tween20, se satura la placa con 200 \mul de PBS 0,1%
tween20, 1% de BSA, y después se incuba durante 1 hora a
temperatura ambiente con la ARN polimerasa de E. coli (0,25
pmoles de ARN polimerasa central en 100 \mul de PBS 0,1% tween 20,
1% de BSA, 10 mM de MgCl_{2}) en presencia o en ausencia de un
eventual inhibidor. Se lava después la placa y se incuba a
continuación con un anticuerpo anti-ARN polimerasa
acoplado a peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente. El
complejo de sigma70-anticuerpo
anti-ARN polimerasa se detecta con un sustrato de la
peroxidasa, la O-fenilendiamina, u otro medio
apropiado.
Alternativamente, se usó otro protocolo. Este
ensayo se basa en la adsorción de ARN polimerasa central sobre una
placa de ELISA durante 12 horas a 4ºC (0,5 pmoles de proteína
diluida en 100 \mul de PBS por pocillo sobre unas placas
Nunc-immuno plate Maxisorp). Después de lavar la
placa con PBS 0,1% tween20, ésta se satura con 200 \mul de PBS
0,1% tween20, 1% de BSA, y después se incuba durante 1 hora a
temperatura ambiente con sigma70 que comprende una etiqueta de
polihistidina C-terminal (1 pmol de sigma70 en 100
\mul de PBS 0,1% tween20, 1% de BSA, 10 mM de MgCl_{2}) en
presencia o en ausencia de un eventual inhibidor. Después, se lava
la placa, y a continuación se incuba con un anticuerpo etiquetado
con polihistidina acoplado a peroxidasa (Sigma ref. A7058 diluido
al 1/2000 (v/v)) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El
complejo de sigma70-anticuerpo
anti-ARN polimerasa se detecta con un sustrato de la
peroxidasa, la O-fenilendiamina, u otro medio
apropiado.
Se ha clonado en un vector de tipo pet21 el gen
que codifica la proteína NusA y que comprende una etiqueta de
polihistidina C-terminal. Después de la transfección
en unas células BL21lambdaDE3, se cultivan las células en un medio
LB a 37ºC en agitación vigorosa. La producción de proteína es
inducida por la adición de 1 mM de IPTG. Después de 3 horas de
cultivo, se recuperan las células mediante centrifugación y se lisan
según (Burgess et al., Biochemistry, 1975 oct. 21;
14(21): 4634-8). Después de la
centrifugación, el sobrenadante se pasa sobre una columna de Ni NTA
agarosa (Quiagen) según las recomendaciones del proveedor. La
proteína NusA se almacena a -80ºC en (20 mM de tris HCI pH 8; 5 M
de cloruro de guanidina; 10 mM de
\beta-mercaptoetanol; 50% de glicerol) a une
concentración de 100 \muM.
El ensayo se basa en la adsorción de NusA sobre
una placa de ELISA durante 12 horas a 4ºC (6 pmoles de proteína
diluida en 100 \mul de PBS por pocillo sobre unas placas
Nunc-immuno plate, Maxisorp). Se optimizaron las
diluciones de proteína y los tampones para reducir la unión no
específica de la ARN polimerasa. Después de lavar la placa con PBS
0,1% tween20, ésta se satura con 200 \mul de PBS 0,1% tween20, 1%
de BSA, y después se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente
con ARN polimerasa de E. coli (0,25 pmol de ARN polimerasa
central en 100 \mul de PBS 0,1% tween20, 1% de BSA, 10 mM de
MgCl_{2}) en presencia o en ausencia de un eventual inhibidor. A
continuación se lava la placa y después se incuba con un anticuerpo
anti-ARN polimerasa acoplado a peroxidasa durante
30 minutos a temperatura ambiente. El complejo de
sigma70-anticuerpo anti-ARN
polimerasa se detecta con un sustrato de la peroxidasa, la
O-fenilendiamina, u otro medio apropiado.
Se inmunizan los ratones con ARN polimerasa de
E. coli. Después de 3 revacunaciones con 100 \mug, 50
\mug y
10 \mug de ARN polimerasa en presencia de adyuvante completo de Freund, se fusionan los linfocitos del bazo de ratones inmunizados con las células del linfoma. Se selecciona un grupo de 9 anticuerpos monoclonales mediante ELISA usando ARN polimerasa aplicada a unas placas. De estos 9 anticuerpos, se obtiene el anticuerpo 3E10 que es un inhibidor de la unión entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma70 o NusA, así como el anticuerpo 11D11, que reconoce la subunidad \beta' de la ARN polimerasa, y que puede servir para revelar la unión entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma70 o NusA.
10 \mug de ARN polimerasa en presencia de adyuvante completo de Freund, se fusionan los linfocitos del bazo de ratones inmunizados con las células del linfoma. Se selecciona un grupo de 9 anticuerpos monoclonales mediante ELISA usando ARN polimerasa aplicada a unas placas. De estos 9 anticuerpos, se obtiene el anticuerpo 3E10 que es un inhibidor de la unión entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma70 o NusA, así como el anticuerpo 11D11, que reconoce la subunidad \beta' de la ARN polimerasa, y que puede servir para revelar la unión entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma70 o NusA.
La producción de anticuerpos monoclonales a
partir de fluido ascítico se efectúa según los protocolos habituales
(Short Protocols in Molecular Biology). Los anticuerpos se
purifican mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de
proteína A-sefarosa según la referencia "Short
Protocols in Molecular Biology".
Se efectuó un cribado mediante competición entre
\sigma^{70}, la enzima central ("core enzyme") de la ARN
polimerasa de E. coli y los compuestos químicos de un banco
de 3200 moléculas (Chembridge Inc.). La proteína \sigma^{70}, a
una concentración de 1 \muM en tampón PBS (NaCl 150 mM;
K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH 7,2), se
adsorbe sobre una placa de microensayo durante una noche a 4ºC. Las
placas se lavan tres veces con PBS-T 0,1% (v/v)
(NaCl 150 mM; K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH
7,2; Tween 20 0,1% (v/v)), para eliminar todo lo que no esta fijado
sobre la placa. Para evitar cualquier reacción no específica, se
saturan después los pocillos de la placa con 200 \mul de
disolución de saturación (PBS-T 0,1% (v/v); BSA 1%
(p/v)) durante una hora a temperatura ambiente. Después de la
eliminación de la disolución de saturación, se incuba la ARN
polimerasa y los competidores eventuales (a una concentración de 20
\mug/ml) en estos mismos pocillos durante una hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavan a continuación tres veces con
PBS-T 0,1% (v/v). La unión entre la enzima central y
la proteína \sigma^{70} se revela mediante un anticuerpo
monoclonal dirigido contra la subunidad \beta de la ARN polimerasa
y acoplado a peroxidasa diluida al 1/2.000 (11D11) en el tampón de
saturación e incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Después de tres lavados con
PBS-T 0,1% (v/v), se añade el sustrato de la
peroxidasa (OPD, Biorad). La reacción se desarrolla durante 2 a 3
minutos en la oscuridad y después se efectúa una medición de la
absorbancia a 490 nm, después de detener la reacción con 50 \mul
de H_{2}SO_{4} 4N.
Para el cribado de inhibidores de la interacción
entre la enzima central de la ARN polimerasa y la proteína NusA el
protocolo es idéntico. Sin embargo, la etapa de incubación con los
inhibidores potenciales y la ARN polimerasa se lleva a cabo en una
mezcla de NaCl 350 mM - K_{2}PO_{4} 2,5 mM - Na_{2}PO_{4}
8,5 mM; Ph 7,2, con el fin de limitar las uniones no específicas
entre la ARN polimerasa y la proteína NusA.
Los compuestos retenidos son los que inhiben más
del 50% de la unión entre la ARN polimerasa y la proteína NusA o
\sigma^{70}, usando para referencias:
- -
- una medición sin ningún inhibidor, es decir, en presencia sólo de la ARN polimerasa y de la proteína que interviene durante la transcripción, que corresponde a la unión máxima,
- -
- una medición en presencia de ARN polimerasa y de 100 pmoles de \sigma^{70} o de NusA libre, que corresponde a la unión mínima.
Así, los siguientes compuestos se retuvieron
principalmente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
así como los compuestos de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos aislados al final del cribado
primario se ensayan a continuación a diferentes concentraciones
(250; 165; 60; 30; 15; 7,5 y 3 \mug/ml), según los protocolos
descritos anteriormente.
Se ensayan los diversos compuestos aislados para
determinar sus propiedades para inhibir el crecimiento de bacterias
E. coli TG1. Se diluyen unas células en fase estacionaria al
1/10000 en un medio LB (triptona 10 g; extracto de levadura 5 g;
NaCl 5 g), y se transfectan en una cápsula de microensayo (200
\mul/pocillo). Se añaden las moléculas en DMSO 10%, a una
concentración final de 100 mg/ml. En estas condiciones, el
disolvente no afecta al crecimiento de las bacterias. Después de
una incubación durante una noche a 37ºC bajo agitación, se mide la
densidad óptica de cada pocillo a 650 nm.
Se efectúa un precultivo de las cepas E.
coli K12, S. aureus y S. epidermis en medio de
caldo de Mueller Hinton (Mueller y Hinton, 1941) a 37ºC, hasta la
obtención de una densidad óptica de 0,1 a 650 nm. Se añaden 100
\mul del precultivo a 10 ml del medio: agarosa 0,1%, fosfato de
sodio 10 mM - pH 7,4; tripcasa de soja 0,3 mg/ml; NaCl
100 mM.
100 mM.
El conjunto se vierte sobre una cápsula de Petri
de 10 mm. Los pocillos se obtienen en la gelosa, y se depositan en
cada pocillo 5 \mul de las disoluciones a ensayar, que contienen
los productos cribados. Las cápsulas se dejan a temperatura
ambiente durante 2 horas, y después se vierten 10 ml del medio
(agarosa 1%; fosfato de sodio 10 mM - pH 7,4 - tripcasa de soja 6%)
sobre la cápsula de Petri formando una sobrecapa. Después de la
solidificación, las cápsulas se incuban durante una noche a
37ºC.
La actividad antibacteriana se evalúa midiendo
el diámetro de inhibición del crecimiento bacteriano de la zona en
el centro de la cual se ha depositado el producto.
Los resultados de los ensayos de unión
demuestran claramente que es posible identificar unos compuestos de
pequeño peso molecular que inhiben a diversos grados la unión entre
la ARN polimerasa y la proteína NusA, así como la unión entre la
ARN polimerasa y la proteína \sigma^{70} (véanse las Figuras 1,
2 y 3).
Se observa por lo tanto que los dos compuestos
más activos en este ensayo de unión son los compuestos 5 988 031
(Figuras 1 y 3) y 5 858 445 (Figura 2). En el caso del compuesto 5
988 031 (Figura 1), se observa una inhibición de 50% de la unión
entre \sigma^{70} y la ARN polimerasa para una concentración de
\sigma^{70} de aproximadamente 5 \mug/ml. Se observa asimismo
que tres análogos de dicho compuesto, a saber, los compuestos 5 951
261, 5 128 773 y 5 128 772, son asimismo eficaces a concentraciones
5 a 10 veces superiores. Así, la posición y la longitud de la
cadena que porta el ácido carboxílico unido al anillo bencénico del
producto 5 988 031 influyen altamente la afinidad aparente de estas
moléculas.
Las dos familias de moléculas ensayadas, a
saber, las del compuesto 5 988 031 y 5 858 445, desplazan al mismo
tiempo la unión enzima central - \sigma^{70} y la unión enzima
central - NusA. Siendo la unión de estas dos proteínas con la ARN
polimerasa mutuamente exclusiva (lo que significa que las dos
proteínas compiten por el mismo sitio de unión), no es sorprendente
que los dos inhibidores ensayados desplacen las dos proteínas. Sin
embargo, no se puede excluir que sea posible aislar unos inhibidores
específicos de la unión entre la ARN polimerasa y una u otra de
estas proteínas.
El compuesto 5 988 031 inhibe la unión entre
\sigma^{70} y la ARN polimerasa, la unión entre NusA y la ARN
polimerasa, pero no la unión entre un anticuerpo, por ejemplo 11D11,
y la ARN polimerasa o el conjunto de las subunidades \alpha,
\beta y \beta'. Estos resultados permiten por lo tanto demostrar
la especificidad de este compuesto.
Por otro lado, se han evaluado las actividades
antibióticas de estas diferentes moléculas sobre unas bacterias
diana.
Así, el compuesto 5 988 031 inhibe el
crecimiento de células relativamente sensibles tales como E.
coli TG1, lo que demuestra la relación directa entre el ensayo
de unión y la actividad biológica (véase Figura 4). Sin embargo, se
ha observado que esta molécula no es activa sobre otras cepas
ensayadas tales como S. aureus, E. coli K12, M.
Luteus, etc.
La tabla representada a continuación corresponde
a los resultados obtenidos durante unos ensayos de la actividad
bacteriana e indica para cada compuesto ensayado el diámetro de
inhibición medido.
El compuesto 5 858 445 inhibe asimismo
fuertemente el crecimiento de las células de bacterias de S.
aureus y de S. Epidermidis en el ensayo en medio sólido
(véase actividad anti-bacteriana). Se observa un
diámetro de inhibición (véase actividad
anti-bacteriana) de 4,2 mm a una concentración de
500 \mug/ml, mientras que en estas condiciones se observa un
diámetro de inhibición de 5 mm con vancomicina a 50 \mug/ml.
Por otro lado, se observa que los análogos de
este compuesto 5 858 445 no tienen ningún efecto en cuanto a la
actividad anti-bacteriana. Parece por lo tanto que
la sustitución del grupo nitro por un grupo metoxi es importante
para las propiedades anti-bacterianas de los
compuestos pero no para las propiedades de inhibición de la unión
entre la ARN polimerasa y una proteína que interviene durante la
transcripción.
Estos resultados permiten demostrar la relación
entre la actividad en el ensayo de unión y la actividad biológica.
Además, unos resultados obtenidos en el ensayo de unión con unas
proteínas de E. coli permiten seleccionar unas moléculas
activas sobre otras bacterias patógenas que tienen frecuentemente
una ARN polimerasa que presenta fuertes homologías con la de E.
coli, es decir, un porcentaje de identidad de aproximadamente
90% a nivel de las regiones de \sigma implicadas en la unión con
la ARN polimerasa.
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Biol. Chem. 270, 23930-3,
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edición, John Wiley & Son.
Claims (13)
1. Procedimiento de detección de un compuesto
modulador de la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína
que interviene durante la transcripción, en el que:
- -
- se deposita sobre un soporte sólido la proteína que interviene durante la transcripción, con el fin de adsorber dicha proteína sobre dicho soporte sólido,
- -
- se añade a dicho soporte sólido la ARN polimerasa y el compuesto sometido al procedimiento de detección,
- -
- se incuba dicho soporte sólido que comprende la ARN polimerasa, la proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, y se forma un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y se forma una unión por un lado entre dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación distinto de una cromatografía o de una inmunoprecipitación, la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier modulador, designando dicha variación significativa una variación de aproximadamente más del 20% de la cantidad de complejo formado, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una modulación de la complejación entra la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
2. Procedimiento de detección según la
reivindicación 1, en el que el compuesto modulador es un compuesto
activador de la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína
que interviene durante la transcripción, y en el que:
- -
- se deposita sobre un soporte sólido la proteína que interviene durante la transcripción, con el fin de adsorber dicha proteína sobre dicho soporte sólido,
- -
- se añade a dicho soporte sólido la ARN polimerasa y el compuesto sometido al procedimiento de detección,
- -
- se incuba dicho soporte sólido que comprende la ARN polimerasa, la proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, y se forma un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y una unión por un lado entre dicho compuesto y, por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación distinto de una cromatografía o de una inmunoprecipitación, la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier activador, designando dicha variación significativa un aumento de por lo menos 120% de la cantidad de complejo formado, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una activación de la complejación entra la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
3. Procedimiento de detección según la
reivindicación 1, en el que el compuesto modulador es un compuesto
inhibidor de la complejación entre la ARN polimerasa y una proteína
que interviene durante la transcripción, y en el que:
- -
- se deposita sobre un soporte sólido la proteína que interviene durante la transcripción, con el fin de adsorber dicha proteína sobre dicho soporte sólido,
- -
- se añade a dicho soporte sólido la ARN polimerasa y el compuesto sometido al procedimiento de detección,
- -
- se incuba dicho soporte sólido que comprende la ARN polimerasa, la proteína que interviene durante la transcripción y el compuesto sometido al procedimiento de detección, y se forma un complejo entre la ARN polimerasa y dicha proteína, y se forma una unión por un lado entre dicho compuesto y, por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción,
- -
- se detecta, mediante un ensayo de complejación distinto de una cromatografía o de una inmunoprecipitación, la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de cualquier inhibidor, designando dicha variación significativa una disminución de aproximadamente más del 20% de la cantidad de complejo formado, y
- -
- se deduce, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, que se ha formado una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína que interviene durante la transcripción, lo que se traduce por una inhibición de la complejación entra la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción.
4. Procedimiento de detección según la
reivindicación 3, que comprende el uso de dos valores de control,
correspondiendo uno a la incubación de ARN polimerasa sola con la
proteína que interviene durante la transcripción en ausencia de
cualquier inhibidor (lo que corresponde a una ausencia de
inhibición), y correspondiendo el otro a una incubación de la ARN
polimerasa con la proteína que interviene durante la transcripción y
con un inhibidor de referencia (lo que corresponde a una inhibición
de referencia).
5. Procedimiento de detección según la
reivindicación 3, que comprende el uso de un primer valor de control
y/o de un segundo valor de control y/o de un tercer valor de
control,
correspondiendo uno a la cantidad de complejo
formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en ausencia de
cualquier inhibidor,
correspondiendo el otro a la cantidad de
complejo formado entre la ARN polimerasa y dicha proteína en
presencia de un inhibidor de referencia, y
correspondiendo el tercero:
- -
- o bien a la ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción, que resulta de la introducción de la proteína que interviene durante la transcripción fijada sobre un soporte, de la ARN polimerasa y de un exceso de proteína que interviene durante la transcripción, siendo el exceso de proteína que interviene durante la transcripción preferentemente incubado previamente con la ARN polimerasa, correspondiendo la ausencia de dicho complejo a una inhibición total de la complejación entre la ARN polimerasa y dicha proteína, o bien
- -
- a la ausencia de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la transcripción, que resulta de la presencia de ARN polimerasa sola y de la ausencia de proteína que interviene durante la transcripción.
6. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que, durante la etapa de detección de
la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre
la ARN polimerasa y la proteína que interviene durante la
transcripción, se usa un anticuerpo anti-ARN
polimerasa.
7. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína que interviene
durante la transcripción tiene un peso molecular superior a 15 kDa o
es una proteína de fusión entre una proteína de peso molecular
inferior a 15 kDa y otra proteína tal como la GST (glutathione S
transferase).
8. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las concentraciones de la ARN
polimerasa están comprendidas entre 1 fmol y 100 pmoles/ensayo, las
de la proteína que interviene durante la transcripción entre 10
fmoles y 500 pmoles/ensayo, y las del compuesto sometido al
procedimiento de detección entre
1 pM y 1 \muM.
1 pM y 1 \muM.
9. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la ARN polimerasa usada procede
de células procariotas.
10. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteína que interviene
durante la transcripción interviene durante la etapa de iniciación
de la transcripción, o bien durante la etapa de alargamiento, o
bien durante la etapa de terminación de la transcripción.
11. Procedimiento de detección según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la proteína que interviene
durante la transcripción es:
- -
- o bien la proteína \sigma^{70},
- -
- o bien la proteína NusA,
- -
- o bien una de estas dos proteínas en forma de proteína de fusión.
12. Procedimiento de detección de un compuesto
inhibidor de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína
\sigma^{70} según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que
comprende las siguientes etapas:
- -
- una etapa de adsorción de la proteína \sigma^{70} sobre un soporte sólido durante una noche a 4ºC, estando dicha proteína en particular a una concentración de 1 \muM en tampón de PBS (NaCl 150 mM; K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH 7,2),
- -
- una etapa de lavado de dicho soporte con PBS-T 0,1% (v/v) (NaCl 150 mM; K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH 7,2; Tween 20 0,1% (v/v)) para eliminar todo lo que no se fijó sobre la placa,
- -
- una etapa de saturación de dicho soporte sólido con 200 \mul de disolución de saturación (PBS-T 0,1% (v/v); BSA 1% (p/v)) durante una hora a temperatura ambiente, con el fin de evitar cualquier reacción no específica,
- -
- una etapa de eliminación de la disolución de saturación,
- -
- una etapa de adición al soporte sólido de la ARN polimerasa y de un compuesto sometido al procedimiento de detección a una concentración de 20 \mug/ml, y una etapa de incubación de dicho soporte sólido durante una hora a temperatura ambiente,
- -
- una etapa de lavado del soporte sólido tres veces con PBS-T 0,1% (v/v),
- -
- una etapa de detección de la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma^{70} con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma^{70} en ausencia de cualquier modulador, comprendiendo esta etapa el uso de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad \beta de la ARN polimerasa y acoplado a la peroxidasa en la disolución de saturación, la incubación de dicho anticuerpo acoplado a la peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente, la adición del sustrato de la peroxidasa y la medición de la absorbancia a 490 nm tras la detención de la reacción entre la peroxidasa y su sustrato, y
- -
- una etapa de deducción, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, de la formación de una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína \sigma^{70}, lo que se traduce por una modulación de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína \sigma^{70}.
13. Procedimiento de detección de un compuesto
inhibidor de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína
NusA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende
las siguientes etapas:
- -
- una etapa de adsorción de la proteína NusA sobre un soporte sólido durante una noche a 4ºC, estando dicha proteína en particular a una concentración de 1 \muM en tampón de PBS (NaCl 150 mM; K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH 7,2),
- -
- una etapa de lavado de dicho soporte con PBS-T 0,1% (v/v) (NaCl 150 mM; K_{2}PO_{4} 2,5 mM; Na_{2}PO_{4} 8,5 mM - pH 7,2; Tween 20 0,1% (v/v)) para eliminar todo lo que no se fijó sobre la placa,
- -
- una etapa de saturación de dicho soporte sólido con 200 \mul de disolución de saturación (PBS-T 0,1% (v/v); BSA 1% (p/v)) durante una hora a temperatura ambiente, con el fin de evitar cualquier reacción no específica,
- -
- una etapa de eliminación de la disolución de saturación,
- -
- una etapa de adición al soporte sólido de la ARN polimerasa y de un compuesto sometido al procedimiento de detección a una concentración de 20 \mug/ml, y una etapa de incubación de dicho soporte sólido durante una hora a temperatura ambiente en una mezcla NaCl 350 mM - K_{2}PO_{4} 2,5 mM - Na_{2}PO_{4} 8,5 mM; pH 7,2,
- -
- una etapa de lavado del soporte sólido tres veces con PBS-T 0,1% (v/v),
- -
- una etapa de detección de la variación significativa de la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína NusA con relación a un valor de control que corresponde a la cantidad de complejo formado entre la ARN polimerasa y la proteína NusA en ausencia de cualquier modulador, comprendiendo esta etapa el uso de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la subunidad \beta de la ARN polimerasa y acoplado a la peroxidasa en la disolución de saturación, la incubación de dicho anticuerpo acoplado a la peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente, la adición del sustrato de la peroxidasa y la medición de la absorbancia a 490 nm tras detener la reacción entre la peroxidasa y su sustrato, y
- -
- una etapa de deducción, cuando existe una variación significativa tal como se ha definido anteriormente, de la formación de una unión entre por un lado dicho compuesto y por otro lado la ARN polimerasa y/o la proteína NusA, lo que se traduce por una modulación de la complejación entre la ARN polimerasa y la proteína NusA.
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