ES2319345T3 - Fosfofructocinasa inducible y efecto de warburg. - Google Patents

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Abstract

Ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal o tumoral para buscar la presencia de secuencias específicas de la fosfofructocinasa-2 inducible, seleccionadas de entre el grupo que consiste en las SEC ID N.º 2, 4 y 11.

Description

Fosfofructocinasa inducible y efecto de Warburg.
Campo técnico de la invención
La presente invención proporciona una nueva isoenzima fosfofructocinasa (iPFK-2) que se transcribe y se traduce preferentemente en las células tumorales. El descubrimiento de dicho isoenzima, junto con su función, llevó al descubrimiento de su utilización como herramienta de diagnóstico, como herramienta de identificación sistemática de fármacos, y la utilización de compuestos antisentido que inhiben su traducción en el citosol celular como tratamiento antitumoral.
Antecedentes de la invención
La vía metabólica glucolítica constituye una vía anaeróbica fundamental para el metabolismo de los glúcidos en las células eucariotas. La glucólisis desempeña un doble papel, al degradar los glúcidos para generar energía (ATP) y al proporcionar bloques estructurales para las reacciones de síntesis. Se regula la velocidad de conversión de la glucosa en piruvato para que satisfaga dichas dos necesidades celulares principales. En la glucólisis, los enzimas hexocinasa, fosfofructocinasa y piruvato cinasa catalizan unas reacciones irreversibles y son enzimas regulados para los puntos de control de la glucólisis. Los enzimas se regulan mediante el enlace reversible con efectores alostéricos, mediante la modificación covalente y mediante el control transcripcional para satisfacer las necesidades metabólicas cambiantes. De los tres enzimas de control, la fosfofructocinasa constituye el punto de control más importante de la glucólisis en los mamíferos.
En 1930, Warburg indicó que los tumores presentan un índice elevado de glucólisis anaeróbica y que no presentan un índice glucolítico disminuido a concentraciones relativamente elevadas de O_{2}. Dicha pérdida del control regulador (es decir, el efecto Pasteur) ha llegado a denominarse el efecto Warburg. Al suministrar células tumorales con glucosa se obtiene como resultado una inhibición del consumo de oxígeno, lo que aumenta la dependencia de la glucosa en lo que respecta a la energía. Otros tipos celulares no presentan habitualmente dicho efecto debido a que mantienen la respiración a partir de otras sustancias, incluso en presencia de glucosa. El tema de por qué los tumores que crecen rápidamente presentan una tendencia clara a convertir el piruvato originado mediante la glucólisis en ácido láctico en el citosol en vez de transportarlo hacia las mitocondrias para su oxidación total ha desconcertado a los bioquímicos durante años. Resultan claras las consecuencias fisiológicas de dicho comportamiento metabólico alterado. El tejido tumoral genera un nivel elevado de ineficiencia metabólica en el anfitrión, mediante un mayor funcionamiento de los procesos que consumen energía, tales como el ciclo de Cori entre el tumor y el hígado. Como resultado del elevado índice glucolítico, se genera una gran cantidad de piruvato, junto con un incremento en la proporción NADH/NAD^{+} en el citosol, lo que favorece la reducción del piruvato a lactato mediante la acción de la lactato deshidrogenasa. Ello se ve respaldado por el bajo contenido mitocondrial en las células tumorales lo que dificulta la posibilidad de gastar el NADH mediante la acción de la cadena respiratoria y los bajos niveles de los sistemas de transporte del NADH que son muy numerosos en los tumores. La célula tumoral se convierte en una exportadora de lactato de un modo similar al de algunas fibras musculares en situaciones de anoxia. A pesar de que no se ha determinado completamente el papel preciso que desempeña un ciclo de Cori incrementado en los estados tumorales, aporta ineficiencia al anfitrión de un modo que, en vez de la formación de 36 a 38 moléculas de ATP durante la oxidación completa de la glucosa a CO_{2}, se puede esperar una pérdida neta de 4 ATP cuando dos moléculas de tres carbonos se convierten en una molécula de glucosa.
Se ha descrito un ambiente metabólico distintivo de pacientes con cáncer (Argilés & Azcón-Bieto, Mol. Cell. Biochem. 81: 3-17, 1988). La invasión tumoral en un anfitrión se ha caracterizado metabólicamente por una reducción de la eficiencia metabólica del anfitrión, la reducción de las proteínas musculares, un incremento en la gluconeogénesis y el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. El resultado neto es un desequilibrio energético que provoca caquexia y una eventual inanición.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal comprendiendo, por ejemplo, una muestra de tejido tumoral, para buscar la presencia de secuencias específicas iPFK-2 (SEC ID N.º 11). Preferentemente, el ensayo de identidad de la secuencia se selecciona de entre el grupo que consiste en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA), pruebas de hibridación y combinaciones de las mismas. La presente invención proporciona además una composición farmacéutica antineoplásica, antinflamatoria y para la caquexia que comprende un oligonucleótido específico antisentido de la secuencia de la iPFK-2 aislada inventiva y un excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4], y combinaciones de las mismas. La presente invención proporciona además un ensayo de detección sistemática de un agente terapéutico para seleccionar compuestos con actividad antineoplásica, que comprende: (a) obtener iPFK-2 recombinante que presenta una actividad que forme fructosa-2,6-bisfosfato a partir de un sustrato fructosa-6-fosfato; (b) añadir el candidato terapéutico con diversas concentraciones o el vehículo de control sin fármaco; y (c) analizar la fructosa-26-bisfosfato como determinación de la actividad enzimática. Preferentemente, el análisis del producto se realiza mediante una prueba enzimática.
La presente invención proporciona además un polipéptido de iPFK-2 recombinante expresado mediante la secuencia de ADNc proporcionada en la SEC ID N.º 11. La utilización del polipéptido de iPFK-2, con técnicas conocidas de anticuerpos, entre ellas técnicas conocidas de anticuerpos monoclonales, proporciona además anticuerpos que se enlazan específicamente con la iPFK-2. Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos prevista y la alineación del nuevo ADNc de la iPFK-2 con las secuencias de PFK-2 obtenidas a partir de la placenta humana (Sakai, Kato, Fukusawa et al., J. Biochem. 119: 506-511, 1996) y clon de ADNc del hígado humano (Lange & Pilkis, Nuc. Acids Res. 18: 3652, 1990). Los residuos encuadrados indican identidad.
Las figuras 2A-C representan cómo los LPS provocan que los monocitos de la sangre periférica expresen rápidamente el ARNm del iPFK-2 y la proteína. La figura 2A representa un análisis mediante RT-PCR. La figura 2B representa un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern. La figura 2C representa un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, en el que el antisuero anti iPFK-2 utilizado en el panel derecho se absorbió previamente con el péptido específico iPFK-2 contra el cual creó el antisuero.
Las figuras 3A-B representan la expresión del ARNm del iPFK-2 por parte de unas estirpes celulares cancerosas humanas. La figura 3A representa un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern de diversas estirpes celulares cancerosas humanas. La figura 3B representa un análisis mediante RT-PCR de las células K-562 con respecto a la \beta-actina, el iPFK-2 y el PFK-2 del hígado humano.
Las figuras 4A-C representan como un oligonucleótido antisentido antagonista del iPFK-2 inhibe la proliferación de las células K-562 específicas del iPFK-2 in vitro. Específicamente, la figura 4A representa un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western de la actividad antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido antisentido. La figura 4B representa una prueba con la fructosa-2,6-bisfosfato para la actividad antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido antisentido (AS) con respecto a la secuencia transcrita (S). La figura 4C representa una prueba con 5-fosforribosil-1-pirofosfato y una prueba de proliferación de las células K-562 de la actividad antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido antisentido (AS) con respecto a la secuencia transcrita (S).
La figura 5 representa los datos in vivo que proporcionan pruebas de la actividad antagonista del iPFK-2 de los oligonucleótidos antisentido y representa además la actividad terapéutica antineoplásica de los antagonistas del iPFK-2.
La figura 6 representa cómo la endotoxinemia in vivo provoca la expresión del ARNm de la iPFK-2 de ratón en el bazo y el tejido muscular. Se inyectaron ratones de 10 semanas de edad del tipo BALB/c (19-20 g) por vía i. p. con LPS (12,5 mg/kg) o disolución salina como control. Tras 6 y 24 horas se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO_{2} y se retiraron el cerebro, el hígado, los músculos de las extremidades inferiores y el bazo mediante disección. Se realizó la extracción del ARN total y un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern utilizando una sonda de ADNc específica de la iPFK-2 de ratón (amplificada a partir de un ADNc de macrófago peritoneal de ratón mediante 30 ciclos de RT-PCR utilizando los siguientes iniciadores específicos de la iPFK-2 humana: 5'-TGAGGCAGACGTGTCGGTTC-3' [SEC ID N.º 5], 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3' [SEC ID N.º 6]. Dichos datos in vivo demuestran que los LPS provocó la expresión del ARNm de la iPFK-2 de los ratones en los tejidos del cerebro, del hígado, muscular y del bazo.
La figura 7 representa como la iPFK-2 se superexpresa en las PBMC (células mononucleares de la sangre periférica) de pacientes HIV+. Se aisló el ARN total a partir de 3 pacientes sin infectar (carriles 1 a 3) y 5 pacientes HIV+ (carriles 4 a 8) y se analizaron mediante RT-PCR con iniciadores específicos de la \beta-actina (5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3' [SEC ID N.º 8], 19 ciclos) e iniciadores específicos de la iPFK-2 (5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3' [SEC ID N.º 10], 23 ciclos).
La figura 8 representa un esquema metabólico propuesto para el papel metabólico de la iPFK-2, particularmente en células cancerosas que se dividen rápidamente en las que se produce una concentración de lactato a partir del metabolismo anaeróbico y la producción de nucleótidos para soportar una división celular rápida.
La figura 9 representa los resultados de los oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 en la inhibición de la proliferación de la estirpe tumoral de linfocitos T MOLT-4. Resultaron efectivos dos oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 distintos y presentaron una actividad antineoplásica farmacológica in el presente ensayo de pronóstico.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal para buscar la presencia de secuencias específicas iPFK-2. Preferentemente, el ensayo de identidad de la secuencia se selecciona de entre el grupo que consiste en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA), pruebas de hibridación y combinaciones de las mismas. La presente invención proporciona además una composición farmacéutica antineoplásica, antinflamatoria y para la caquexia que comprende un oligonucleótido específico de la secuencia de la iPFK-2 aislada inventiva y un excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el oligonucleótido se selecciona a partir de un oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4], y combinaciones de las mismas.
La presente invención comprende además un polipéptido de la iPFK-2 recombinante expresado mediante la secuencia de ADNc proporcionada en la SEC ID N.º 11. La utilización del polipéptido de la iPFK-2, con técnicas conocidas de anticuerpos, entre ellas técnicas conocidas de anticuerpos monoclonales, proporciona además anticuerpos que se enlazan específicamente con la iPFK-2. Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
La presente invención proporciona además una secuencia de ADNc aislado que codifica un enzima fosfofructocinasa-2 inducible (iPFK-2) humano. La secuencia de ADNc se indica como SEC ID N.º 11. La SEC ID N.º 11 proporcionan un codón de iniciación y de terminación de la región de codificación incorporados. Además, se destacan los pares de bases de la región carboxiterminal de la región de codificación que proporciona unos aminoácidos adicionales que no se encuentran en otros isotipos de PFK-2. La secuencia inventiva de ADNc de la iPFK-2 resulta útil para producir un polipéptido de la iPFK-2 recombinante, para diseñar oligonucleótidos antisentido y para que las células sometidas a transfección (tanto procariotas como eucariotas) produzcan iPFK-2 recombinante y fragmentos de la misma. El polipéptido iPFK-2 recombinante, que presenta la actividad enzimática del PFK-2, resulta útil para realizar la detección sistemática de inhibidores que presenten actividad terapéutica como agentes antineoplásicos, específicamente contra la isoforma inducible iPFK-2 de la presente invención. La actividad terapéutica antineoplásica se puede atribuir a los inhibidores de la iPFK-2 ya que se requiere un nuevo gen de respuesta precoz rico en AU para el desarrollo de la leucemia. Dicho gen parece ser el gen de la iPFK-2 inducible, el producto genético más frecuente en las células tumorales.
La presente invención proporciona además una secuencia de ADNc aislado que codifica un enzima fosfofructocinasa-2 inducible (iPFK-2) humano. Los ejemplos posteriores detallan los proyectos que condujeron al aislamiento, purificación y expresión del isoenzima. Se descubrió que la secuencia del isoenzima aislado se expresaba preferentemente en las células tumorales y provocaba un incremento en la actividad glucolítica.
La presente invención se basa en la identificación y a comprensión de un nuevo gen para la PFK-2/FBPasa (6-fosfofructo-2-cinasa (PFK-2)/fructosa-2,6-bifosfatasa (FBPasa)) o "iPFK-2" que se activa mediante estímulos proinflamatorios y que se distingue de otros genes similares que codifican enzimas del tipo PFK mediante la presencia de una pluralidad de copias de un fragmento de inestabilidad de ARNm AUUUA en su extremo 3' sin traducir. Dicho elemento rico en AU es característico de los ARNm que codifican diversas citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNF\alpha, IL-1, IFN-\gamma y GM-CSF) y oncoproteínas (por ejemplo, c-Fos, c-Myc, y c-Sis) (Greenberg & Belasco, en Control of Messenger RNA Stability ("Control de la estabilidad del ARN mensajero"), Belasco and Brawerman eds., pág. 199-218, Academic Press, New York, 1993). Los datos presentados en la presente memoria demuestran que la iPFK-2 se expresa de un modo constitutivo en diversas estirpes celulares cancerosas humanas y se descubrió que resultaba esencial ara el crecimiento de las células tumorales in vivo. La inhibición del nivel de la expresión de la proteína iPFK-2 (mediante la utilización de antagonistas antisentido) disminuye los niveles intracelulares del 5-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP), un precursor importante en la biosíntesis de purinas y de pirimidinas. Por consiguiente, la iPFK-2 constituye un isoenzima regulador importante que parece es esencial para el crecimiento tumoral, cuyos antagonistas desempeñan una actividad importante en los tratamientos antineoplásicos, y proporciona una explicación para las observaciones tradicionales por lo que se refiere a la relación aparente entre la glucólisis y la proliferación de células cancerosas.
Se ha indicado que los ARNm de diversas citocinas y protoncogenes que forman parte de la familia de genes de respuesta precoz contiene el fragmento de secuencia AUUUA en su región 3' sin traducir (3'UTR). Dicho elemento rico en AU confiere inestabilidad a la molécula de ARNm y desempeña un papel en la regulación de su semivida fisiológica (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83: 1670-1674, 1986; y Shaw et al., Cell 46: 659 - 667, 1986). En una base de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST) se buscaron secuencias de ADNc que contenían los fragmentos de secuencia AUUUA conservados. Se identificaron EST ricas en AU, sin guardar relación con genes descritos anteriormente, y se clonó y secuenció el ADNc. Se descubrió que la secuencia de ADN de dicho nuevo gen compartía un 29% de identidad con el PFK-2 del hígado humano (figura 1), que no contiene elementos ricos en AU. LA secuencia de aminoácidos prevista presentó un 69% de identidad y frecuentes sustituciones conservadoras (figura 1) (Lange & Pilkis, Nucl. Acids Res. 18: 3652, 1990).
La expresión de muchos protoncogenes y citocinas que presentan el fragmento AUUUA aumenta en las células como consecuencia de una estimulación mitógena o proinflamatoria. Por lo tanto, se detectaron únicamente unos niveles muy bajos de expresión de la iPFK-2 mediante inmunoelectrotransferencia de tipo Northern de tejidos humanos normales (es decir, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo y ganglio linfático). El análisis de tipo Northern de monocitos humanos estimulados con lipopolisacáridos (LPS), mediante contraste, demostraron que se provocaba rápidamente la expresión de dicho nuevo gen iPFK-2 (figura 2A), de aquí el término "iPFK-2". La inducción y el incremento del nivel de la expresión de la iPFK-2 resultó similar al observado para la citocina IL-1\beta (que contiene asimismo elementos ricos en AU) (figura 2B). La expresión de la isoforma hepática (constitutiva) del PFK-2 no se vio afectada por la estimulación con LPS. La inducción del ARNm de la iPFK-2 iba acompañada del incremento correspondiente de la proteína inmunorreactiva iPFK-2, tal como se determinó mediante inmunoelectrotransferencia de tipo Western utilizando un anticuerpo específico anti iPFK-2 (figure 2C). Dichos datos demuestran que la iPFK-2, al igual que otros genes con elementos ricos en AU en su 3'UTR, se induce en los monocitos primarios humanos con la activación proinflamatoria in vitro. En un experimento independiente se examinó la expresión de la iPFK-2 en leucocitos de la sangre periférica de 5 pacientes infectados con HIV. En cada caso, el nivel de ARN de la iPFK-2 resultó superior que el observado en el control, pacientes sin infectar (n = 3). Dichos datos sugieren que la iPFK-2 se induce mediante la activación in vivo de los leucocitos.
Un incremento del nivel de la expresión estable de protoncogenes con 3'UTR ricos en AU constituye un aspecto característico de muchas células transformadas y puede ser directamente oncógeno (Lee et al., Mol. Cell. Biol. 8: 5521-5527, 1988; Rabbitts et al., EMBO J. 4: 3727-3733, 1985; y Piechaczyk et al., Cell 42: 589-597, 1985). Se examinaron ocho estirpes celulares tumorales humanas con respecto al ARNm de la iPFK-2 mediante inmunoelectrotransferencia de tipo Northern y se hallaron unos niveles de expresión elevados (figure 3A). Las intensidades de las señales de hibridación de la iPFK-2 resultaron comparables a las señales de la iPFK-2 observadas en el ARN obtenido a partir de monocitos primarios humanos estimulados con LPS (figura 2B). Un examen más detallado de la estirpe celular de leucemia mielógena crónica K562 demostró que la expresión de la iPFK-2 era muy superior que la de la isoforma hepática PFK-2 (figura 3B). Dichos datos sugieren que la expresión de la iPFK-2 es importante en la regulación de la vía glucolítica durante el crecimiento de la célula tumoral.
Se realizó la transfección de células de leucemia K562 con oligonucleótidos antisentido específicos de la iPFK-2. Tanto los niveles de la proteína iPFK-2 como de F2,6BP disminuyeron significativamente si se comparan con las células sometidas a transfección con oligonucleótidos de control (figure 4A). Dichos datos indican que la actividad como cinasa de la iPFK-2 contribuye significativamente a los niveles intracelulares de F2,6BP. El flujo glucolítico aumentado de las células transformadas facilita la biosíntesis de 5-fosforribosilpirofosfato (PRPP), un precursor crítico en la biosíntesis de las purinas y las pirimidinas (Eifenbrody et al., Trends Pharmacol. Sci. 1: 24-245, 1980). Se descubrió que la inhibición de la iPFK-2 disminuía significativamente los niveles de PRPP en las células K562 y se asoció dicha disminución con el descenso correspondiente de la síntesis del ADN K562 y la proliferación celular (figura 4B). Se observó un nivel similar de inhibición de la síntesis del ADN tras la transfección de oligonucleótidos antisentido de iPFK-2 en estirpes celulares HL-60, MOLT-4, SW480, G361 y KG1A. Dichas observaciones indican que la producción de F2-6BP catalizada con la iPFK-2 puede aumentar el flujo glucolítico (mediante la estimulación del PFK-1) y permite incrementar la canalización del metabolismo de la glucosa en la dirección de la síntesis de PRPP.
Se examinó el papel de la iPFK-2 en la oncogénesis in vivo mediante la administración de oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 específicos de ratones atímicos que presentan el tumor K562. Al cabo de 2 días de tratamiento, los tumores de los ratones tratados con los oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 eran significativamente más pequeños que los tumores de los ratones tratados con oligonucleótidos homosentido de la iPFK-2 o con PBS (figura 4C).
Se han desarrollado procedimientos y reactivos para analizar los inhibidores de la iPFK-2 utilizando análisis rápidos in vitro apropiados para realizar una detección sistemática de alto rendimiento de compuestos o genotecas de compuestos. Mediante la homología con dominios funcionales PFK-2, el polipéptido iPFK-2 comprende dos dominios distintos: la parte aminoterminal del péptido comprende el dominio cinasa (responsable de la fosforilación de la fructosa-6-fosfato para obtener fructosa-2,6-bisfosfato) y la parte carboxiterminal comprende el dominio fosfatasa (responsable de la hidrólisis de la fructosa-2,6-bisfosfato para obtener fructosa-6-fosfato).
Expresión de la iPFK2
Se clonó el marco de lectura abierto de la iPFK2 completa realizando la detección sistemática en una genoteca de ADNc EST utilizando una sonda específica de la iPFK-2, y a continuación se clonó en el plásmido pT7T3D-Pac (Pharmacia). Se confirmó la secuencia de dicho inserto como correcta mediante la digestión de restricción y secuenciación. El vector que presentaba el inserto se utilizó para realizar la transformación de bacterias y se detectaron las colonias positivas realizando un análisis de restricción y de secuenciación. Por último, se extrajo el inserto y se volvió a clonar en el vector de expresión pET11b (Novagen) y se expresó siguiendo el procedimiento general descrito a continuación.
Expresión del dominio de la iPFK2 cinasa
Se obtuvo el dominio de la iPFK-2 cinasa mediante clonación por PCR. Resumidamente, un conjunto de ADNc, obtenido mediante la transcripción inversa del ARNm de monocitos humanos estimulados con LPS se utilizó como molde para la amplificación mediante PCR. Se sintetizaron especialmente unos iniciadores, que contenían las zonas de restricción NdeI y BamHI en la extensión 5': P1, 5'-ACATATGCCGTTGGAACTGACGCAGAGC-3' [SEC ID N.º 27], P2, 5'-TGGATCCTCACAGGTAGATGGTACGCGGCT-3' [SEC ID N.º 28]. Se descubrió que el producto amplificado presentaba el tamaño previsto y que correspondía a la secuencia de nucleótidos del dominio de la iPFK-2 cinasa (que corresponde a las posiciones 47-797 del marco de lectura abierto de la iPFK-2). Dicho producto de amplificación del ADN se purifica mediante un equipo de purificación de ADN GENECLEAN (BIO101) y a continuación se clonó tanto en el vector t de clonación pT7Blue (Novagen) como en el vector de expresión pET14b (Novagen), que contiene una etiqueta de histidina. Los clones que presentaban el inserto se detectaron mediante un procedimiento de detección sistemática por PCR, y se verificó la secuencia del inserto mediante secuenciación. Se inoculó una colonia positiva para el inserto pET14b en 2 ml de caldo de cultivo LB y se incubó a 37ºC durante 3 horas. El cultivo bacteriano se transfirió a un frasco mayor, que contenía 100 ml de caldo de cultivo de LB y se incubó a 37ºC. una vez el OD_{600} alcanzó 0,7, se realizó la inducción del cultivo añadiendo IPTG (1 mM) y se dejó proliferar sometiéndose a agitación durante la noche a 25ºC. Por último, se centrifugó el cultivo, se aspiró el sobrenadante y se congeló el sedimento a -70ºC. Dichas células depositadas se volvieron a suspender en una disolución amortiguadora de lisis (B-PER, Pierce), se centrifugaron y se almacenó el sobrenadante para utilizar posteriormente como proteínas solubles a -20ºC. Se purificó el péptido del dominio cinasa utilizando un equipo de purificación etiquetado para la histidina (Novagen) y se analizó con respecto a su actividad enzimática tal como se describirá a continuación. Dicho procedimiento se puede utilizar para producir polipéptidos etiquetados con histidina con respecto al dominio cinasa o al dominio fosfatasa.
Análisis de la actividad de la iPFK2 cinasa
Resumidamente, se siguió el procedimiento de Sakata et al. (J. Biol. Chem. 266: 15764-15770, 1991). Se analizó adecuadamente la actividad enzimática del péptido iPFK-2 o del dominio de la iPFK-2 cinasa (a partir de fuentes naturales o recombinantes) determinando la producción del metabolito Fru 2,6BP a partir de Fru 6-P y ATP. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 \mumol de metabolito por minuto. Se realizó apropiadamente la reacción a 30ºC en un volumen final de 200 \mul, que contenía Tris-HCl 100 mM, a un pH de 7,5, DTT 2 mM, EDTA 0,1 mM, ATP 5 mM, F6-P 1 mM, fosfato potásico 5 mM y MgCl_{2} 10 mM. A intervalos programados, se transfirieron alícuotas de 20 \mul a 180 \mul de NaOH 50 mM, y las disoluciones diluidas se calentaron hasta 90ºC para detener la reacción. Se añadió un alícuota apropiado de las disoluciones calentadas con respecto al F2,6-BP tal como se describirá posteriormente. Los agentes del ensayo se analizaron como inhibidores de la actividad de la iPFK-2 cinasa mediante la inclusión de la incubación anterior, seguido por el análisis de la producción de F2,6BP; se utilizaron experimentos de control para determinar que los agentes del ensayo no interfirieran pos sí mismos con el siguiente ensayo con la fructosa-2,6-bisfosfato.
Ensayo con la fructosa-2,6-bisfosfato
Resumidamente, se siguió el procedimiento de Van Schaftingen et al. (Eur. J. Biochem. 129: 191-195, 1982). Se realizó apropiadamente el ensayo con F2,6BP en placas de 96 pocillos, a un volumen final de 300 \mul. En cada pocillo, se añadieron 30 \mul de la disolución enzimática (4,5 U/ml de aldolasa, 17 U/ml de glicerol-3-P-deshidrogenasa, 50 U/ml de triosa isomerasa, 0,1 U/ml de fructosa bisfosfato cinasa dependiente del 1-pirofosfato, en BSA al 0,2%) a 150 \mul de disolución amortiguadora del pH (Tris 100 mM/disolución amortiguador de acetato, acetato magnésico 4 mM, fructosa-6-fosfato, en presencia de NADH 0,3 mMNADH). A continuación se dispensaron unas muestras (o unas cantidades estándar) (105 \mul) en cada pocillo y se mezclaron por pipeteo. Dicha mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación se añadieron simultáneamente 15 \mul de pirofosfato 10 mM a cada pocillo de las muestras y de control, mezclando dos veces mediante pipeteo. La reacción tuvo como resultado la oxidación del NADH, realizándose el seguimiento de la misma mediante la lectura de la absorbancia de las muestras a intervalos de 1 minuto durante 10 minutos a 340 nm, obteniéndose unos valores de OD/min. La velocidad del cambio en la absorbancia por unidad de tiempo es una función hiperbólica de la concentración del F2,6BP presente en la muestra. Los valores experimentales se determinaron por interpolación de una curva normal apropiada de la fructosa-2,6-bisfosfato.
Ejemplo 1
El presente ejemplo ilustra la clonación inicial de la secuencia de la iPFK-2. Se identificó una etiqueta de la secuencia expresada (EST) que contenía un elemento rico en AU en la base de datos dbEST en el National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información en Biotecnología) al realizar una búsqueda TBLASTN utilizando la secuencia de consulta ATTTATTTATTTA [SEC ID N.º 12]. La EST rica en AU (GenBank ID F00287) se había obtenido a partir de una genoteca de ADNc de músculo esquelético de Homo sapiens y que no estaba relacionado con las secuencias identificadas anteriormente. La amplificación rápida 5'- y 3'- de los extremos del ADN complementario (RACE) se realizó utilizando el equipo RACE Human Skeletal Muscle Marathon cDNA-ready (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Los oligonucleótidos específicos del gen utilizados para la secuencia del RACE en la dirección 5' comprenden 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 19], 5'-GATTGTACCATACCTGAAGCACAGCCTC-3' [SEC ID N.º 13], 5'-TCTCCTGCCGCTCCAGCTCCATGATCAC-3' [SEC ID N.º 14] y 5'-GTCAGCTTCTTGGAGATGTAGGTCTTGC-3' [SEC ID N.º 15]. Los oligonucleótidos específicos del gen utilizados para la secuencia del RACE en la dirección 3' comprenden 5'-TTGGTTTGGGAGCCTCCTATGTGTGACT-3' [SEC ID N.º 16] y 5'-TTGGCGTCTACTGATTCCTCCAACTCTC-3' [SEC ID N.º 17]. Los productos de la amplificación del ADN se purificaron con un equipo de extracción de ADN en gel QIAEX (Qiagen, Germany) y a continuación se clonaron en el vector T pT7Blue (Novagen, Madison, WI). Para cada producto de amplificación, se aislaron cinco clones recombinantes y se secuenciaron los insertos de ADN en las dos direcciones utilizando el equipo de secuenciación Taq DyeDeoxy Terminator Cycle y un secuenciador de ADN ABI Modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA). En la figura 1 se presenta la secuencia de aminoácidos completa prevista para la iPFK-2 humana, que presenta una comparación con las secuencias relacionadas.
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Ejemplo 2
El presente ejemplo ilustra como los LPS provocan que los monocitos de la sangre periférica expresen rápidamente el ARNm de la iPFK-2 y la proteína. Se aislaron PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad de la sangre entera con Ficoll (Ficoll-Paque, analizado con respecto a endotoxinas, Pharmacia, Piscataway, NJ) y a continuación se cultivaron en placas de 6 pocillos (2 x 10^{6} células/ml/pocillo de RPMI con suero bovino fetal al 10%, Hyclone Labs, Logan, UT). Se retiraron las células no adherentes cambiando el medio después de 24 horas y los monocitos restantes, adherentes, se incubaron solos como control o en presencia de 1 mg/ml de LPS (E. coli 0111: B4; Sigma Chemical Co., S. Luis, MO). Tras la incubación durante 1,5, 3, 6, 12, o 24 horas, se separaron las células, se recogieron por centrifugación a 300 g durante 10 minutos y se analizaron inmediatamente. Se aisló el ARN celular total mediante el un procedimiento modificado con isotiocianato de guanidinio (RNAzol, Cinna Biotecx, Friendswood, TX). En el caso del análisis mediante RT-PCR, se preparó ADNc a partir de 1,0 mg del ARN total utilizando 0,25 ng de oligo-(dT) y Superscript II siguiendo el protocolo del fabricante (Gibco/BRL, Grand Island, NY). A continuación se amplificaron alícuotas de ADNc de dos \mul mediante la PCR en un ciclador térmico Perkin-Elmer modelo 9600 utilizando los iniciadores que se indican a continuación y la siguiente programación del ciclo: desnaturalización durante 15 segundos a 95ºC, hibridación durante 20 segundos a 55ºC, y extensión durante 30 segundos a 72ºC durante los ciclos indicados con una extensión final durante 5 minutos a 72ºC. Se sintetizaron especialmente los siguientes iniciadores de ARNm humano: \beta-actina, 5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3' [SEC ID N.º 8]; IL-1\beta, 5'-CTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3' [SEC ID N.º 18], 5'-AGCTCTCTTTAGGAAGACAC-3' [SEC ID N.º 19]; iPFK-2, 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3' [SEC ID N.º 10]; PFK-2 hepático, 5'-GAAGTCAAACTGAATGTGTC-3' [SEC ID N.º 20], 5'-CCTCTTGTAGGCAGTAAGTC-3' [SEC ID N.º 21] (y 5'-AGGCAGTAAGTCTTTATTCG-3' [SEC ID N.º 22], 5'-AAGTCAAACTGCCTGTGTCC-3' [SEC ID N.º 23], datos no representados) (Gibco/BRL). Para el análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern, se realizó la electroforesis del ARN (7.5 \mug) a través de geles de agarosa - formaldehído al 1.5%, se transfirió a unas membranas de nilón (Schleicher & Schuell), y se realizó la hibridación secuencial con sondas de ADNc para la iPFK-2 y la \beta-actina humanas. Las sondas se produjeron mediante PCR utilizando los iniciadores descritos anteriormente y a continuación se marcaron con ^{32}P mediante el procedimiento de cebado aleatorio (Megaprime kit, Amersham). Se realizó la autorradiografía a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas utilizando películas DuPont Reflection y filtros de intensificación. Para el análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, se lisaron las células en una disolución amortiguadora para muestras 2X Laemle durante 5 minutos a 95ºC y se obtuvieron las proteínas celulares totales mediante electroforesis a través de geles de SDS de poliacrilamida al 18% en unas condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Se incubaron las membranas con suero policlonal de conejo anti iPFK-2 humana (producido mediante la inmunización de conejos con un péptido carboxiterminal de la iPFK-2 ([NH_{2}]-GQPLLGQACLT-[COOH]) [SEC ID N.º 24] que se conjugó con KLH. Dicho péptido comprende una región única de la iPFK-2 (aminoácidos 505-515) que difiere de la parte correspondiente del PFK-2 placentario en una eliminación parcial de 5 aminoácidos y 8 errores en los aminoácidos. A continuación se visualizó la iPFK-2 inmunorreactiva (M_{r} = 59 kD) desarrollando membranas con un anticuerpo anti IgG de conejo conjugado con peroxidasa de asno (1:8.000) seguido por la reacción con reactivos ECL (Amersham International, Buckinghamshire, Inglaterra) (véase la figura 2).
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Ejemplo 3
El presente ejemplo ilustra la expresión del ARNm de la iPFK-2 por parte de células cancerosas humanas. Una inmunoelectrotransferencia de tipo Northern, que contenía 2 \mug de poliA ARN por carril de 8 estirpes celulares humanas distintas (Clontech Labs), se hibridó de un modo secuencial con sondas de ADNc para GADPH (Clontech Labs) y la iPFK-2 tal como en el ejemplo 2 anterior. Las estirpes celulares eran: leucemia promielocítica HL-60, células HeLa S3, leucemia mielógena crónica K562, leucemia linfoblástica MOLT-4, linfoma de Burkitt Raji, adenocarcinoma colorrectal SW480, carcinoma de pulmón A549 y melanoma G361. Para el análisis con RT-PCR se amplificaron alícuotas de ADNc de dos \mul mediante la PCR en un ciclador térmico Perkin-Elmer modelo 9600 utilizando los iniciadores específicos para la \beta-actina, la iPFK-2 o PFK-2 hepática (las secuencias de iniciadores indicadas en el ejemplo 2 anterior). Dichos datos (que se presentan en la figura 3) demuestran que el iPFK-2 se expresa mediante una gran variedad de estirpes celulares cancerosas humanas y es probablemente una secuencia enzimática marcadora de tumores que se puede utilizar para determinar el progreso del tratamiento contra el cáncer, para identificar inicialmente células como cancerosas o para identificar si un paciente presenta tumores.
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Ejemplo 4
El presente ejemplo ilustra cómo los oligonucleótidos antisentido específicos de la iPFK-2 inhiben la proliferación de las células K562 in vitro. Se cultivaron células K562 (ATCC) en fase de crecimiento exponencial por triplacado en placas de 96 pocillos (5 x 10^{3} células/pocillo) en RPMI (Gibco/BRL) enriquecidas con FBS al 10%. Se incubaron las células con PBS como control o se sometieron a transfección mediante el procedimiento de la lipofectina (Gibco/BRL) durante 20 horas con los siguientes oligonucleótidos de fosforotioato: S-iPFK-2 (A) (homosentido, posición 35-55): 5'-AGCCGCGAAGATGCCGTTGG-3' [SEC ID N.º 1]; AS-iPFK-2 (A) (antisentido, posición 35-55): 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID N.º 2]; S-IPFK-2 (B) (homosentido, posición 42-62): 5'-AAGATGCCGTTGGAACTGAC-3' [SEC ID N.º 3]; AS-iPFK-2 (B) (antisentido, posición 42-62): 5'-GTCAGTTC
CAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4]. Se realizó la inmunoelectrotransferencia de tipo Western tal como en el ejemplo 2. Se determinaron la fructosa-2,6-bisfosfato y el 5-fosforribosil-1-pirofosfato celulares totales utilizando los procedimientos descritos en Van Schaftingen, Methods. Enz. Anal. 6: 335-341, 1984 y en Sant et al., J. Biol. Biochem. 16: 11038-11045, 1992, respectivamente. La actividad proliferativa de las K562 se determinó mediante la incorporación de [^{3}H]timidina (4 \muCi/ml) (DuPont, Boston, MA) en ADN durante las últimas 14 horas de incubación/transfección realizándose la determinación cuantitativa mediante el recuento del centelleo en líquido. Los datos de la figura 4 se expresan como la media \pm desviación típica (n = 3). El nivel de significación estadística se calculó mediante pruebas T con dos muestras (asumiendo unas varianzas no iguales) (*, p < 0,05) (Taetle et al., Cancer Trmt. Reports 71: 297-304, 1987). La figura 4 representa cómo un grupo de oligonucleótidos antisentido presentan una actividad antagonista de la iPFK-2 y probablemente presentarán una actividad terapéutica antineoplásica significativa en vista de la amplia prevalencia de la iPFK-2 y del efecto Warburg conocidos para el tejido tumoral.
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Ejemplo 5
El presente ejemplo ilustra como los oligonucleótidos antisentido específicos de la iPFK-2 inhiben el crecimiento de tumores K-562 in vivo. A unos ratones con tumores K562 se les implantó durante los días indicados (figura 5) unas bombas microosmóticas que contenían PBS, (o); S-iPFK-2 (B), (\Box); o AS-iPFK-2 (B), (\sqbullet). Se recogieron las células K562 del cultivo en fase de crecimiento exponencial en medio RPMI enriquecido con FBS al 10% y a continuación se lavaron y se volvieron a suspender en PBS (1 x 10^{7} células/ml). Se inyectaron grupos de 5 ratones atímicos hembra BALB/c (20 g) (Harlan Labs) por vía s. c. con 0,10 ml de la suspensión de K562 (1 x 10^{6} células). Se dejaron crecer los tumores durante 7 días hasta un peso medio de 0,4 g antes de iniciar el tratamiento. Se implantaron unas bombas microosmóticas Alzet (Alza Corporation, Palo Alto, CA) cargadas con 0,1 ml de PBS o los oligonucleótidos de fosforotioato S-iPFK-2 (B) o AS-iPFK-2 (B) (3,0 mM en PBS, véase el ejemplo 4 para las secuencias) por vía s. c. en los ratones que presentaban tumores. Se determinó el tamaño de los tumores tras 0, 1, 2, 3 y 4 días con un pie de rey según la fórmula siguiente: peso (mg) = (anchura, mm^{2} x (longitud, mm^{2}) (Taetle et al., Cancer Trmt. Reports 71: 297-304, 1987). La figura 5 muestra cómo los oligonucleótidos antisentido que presentaban una actividad antagonista de la iPFK-2 presentaban asimismo una actividad terapéutica antineoplásica. Por lo tanto, los antagonistas de la iPFK-2 resultan útiles en el tratamiento del cáncer.
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Ejemplo 6
El presente ejemplo ilustra cómo la endotoxinemia provoca la expresión del ARNm de la iPFK-2 de ratones en el bazo y el músculo. Se inyectaron unos ratones BALB/c (19-20 g) de 10 semanas de edad por vía i. p. con LPS (12,5 mg/kg) o disolución salina como control. Tras 6 y 24 horas se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO_{2} y se retiraron el cerebro, el hígado, los músculos de las extremidades inferiores y el bazo mediante disección. Se realizó la extracción del ARN total y un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern utilizando una sonda de ADNc específica de la iPFK-2 de ratón (amplificada a partir de un ADNc de macrófago peritoneal de ratón mediante 30 ciclos de RT-PCR utilizando los siguientes iniciadores específicos de la iPFK-2 humana: 5'-TGAGGCA
GACGTGTCGGTTC-3' [SEC ID N.º 25], 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3' [SEC ID N.º 26]).
Los resultados se presentan en la figura 6 y demuestran que los LPS provocan la expresión del ARNm de la iPFK-2 en los tejidos del ratón. Dichos datos ilustran la importancia farmacológica en el pronóstico de la iPFK-2 como marcador terapéutico de procesos inflamatorios.
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Ejemplo 7
El presente ejemplo ilustra cómo la iPFK-2 se superexpresa en las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) de pacientes HIV+. Se aisló el ARN total de tres pacientes sin infectar (carriles 1 a 3) y 5 pacientes HIV+ (carriles 4 a 8) y se analizaron mediante RT-PCR con iniciadores específicos de la \beta-actina (5'-TAAGGA
GAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3' [SEC ID N.º 8], 19 ciclos) e iniciadores específicos de la iPFK-2 (5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGT
GACT-3' [SEC ID N.º 10], 23 ciclos).
Los resultados se presentan en la figura 7 y demuestran que la iPFK-2 se superexpresa en las PBMC de pacientes HIV+.
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Ejemplo 8
El presente ejemplo ilustra la actividad terapéutica antineoplásica de los antagonistas de la iPFK-2. Los compuestos a analizar, tales como el antagonista potencial de la iPFK-2 2,5-anhidro-D-manitol se utilizan en la inhibición de la actividad enzimática (es decir, cinasa) de la iPFK-2 utilizando el polipéptido recombinante de la iPFK-2 tal como se proporciona en la presente memoria. El 2,5-anhidro-D-manitol, u otros compuestos a analizar se pueden analizar adicionalmente en un ensayo in vitro de la actividad terapéutica antineoplásica que correlaciona la inhibición de la iPFK-2 de la actividad enzimática cinasa de la iPFK-2 con la actividad farmacológica antineoplásica. Las células tumorales K562 (1 x 10^{4} células cultivadas en RPMI enriquecido con FBS al 10%) se expusieron a distintas concentraciones de 2,5-anhidro-D-manitol u otros compuestos a analizar para controlar el azúcar (glucosa) durante 12 horas. A continuación se utiliza un ensayo de proliferación celular, por ejemplo, determinando la asimilación de timidina tritiada, para estimar la proliferación de las células tumorales. Por lo tanto, este procedimiento ayuda a determinar si un compuesto a analizar es un antagonista de la iPFK-2, siendo un antagonista un agente que actúa en la iPFK-2 para disminuir F2,6 P y/o incrementar el F6P en el ensayo.
Se realizó asimismo un ensayo adicional de proliferación de las células tumorales, tal como se ha descrito en el ejemplo 4, con dos oligonucleótidos antisentido distintos de la iPFK-2 utilizando la estirpe de células tumorales de linfocitos T MOLT-4. Tal como se representa en la figura 9, ambos oligonucleótidos antisentido inhibieron la proliferación celular y presentaron una actividad terapéutica antineoplásica en el presente ensayo de pronóstico in vitro.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTES: Bucala, Richard J. et al.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fosfofructocinasa inducible y el efecto Warberg
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: DAVIS WRIGHT TREMAIN
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1501 Fourth Avenue 2600 Century Square
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Seattle
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(D)
ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 98101
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(v)
SOPORTE INFORMÁTICO:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
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(D)
SOFTWARE: Word
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(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: a asignar
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
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(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Oster, Jeffrey B.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 32.585
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 0902WO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 206 628 7711
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 206 628 7699
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCCGCGAAG ATGCCGTTGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAACGGCAT CTTCGCGGCT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGATGCCGT TGGAACTGAC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: oligonucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCAGTTCCA ACGGCATCTT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGCAGAC GTGTCGGTTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCAGCTCC AGGAAAGTGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAGGAGAAG CTGTGCTACG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCTCCTTCT GCATCCTGTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTGGTCTGG CAACTGCAAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGCCTCCT ATGTGTGACT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4121 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iPFK-2 humana
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 11:
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: secuencia de consulta
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTTATTTAT TTA 
\hfill
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTGTACCA TACCTGAAGC ACAGCCTC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCCTGCCG CTCCAGCTCC ATGATCAC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCAGCTTCT TGGAGATGTA GGTCTTGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGTTTGGG AGCCTCCTAT GTGTGACT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGCGTCTA CTGATTCCTC CAACTCTC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTACCTGT CCTGCGTGTT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTCTCTTT AGGAAGACAC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGTCAAAC TGAATGTGTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCTTGTAG GCAGTAAGTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGCAGTAAG TCTTTATTCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTCAAACT GCCTGTGTCC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GQPLLGQACL T 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGCAGAC GTGTCGGTTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCAGCTCC AGGAAAGTGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACATATGCCG TTGGAACTGA CGCAGAGC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGATCCTCA CAGGTAGATG GTACGCGGCT 
\hfill
30

Claims (14)

1. Ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal o tumoral para buscar la presencia de secuencias específicas de la fosfofructocinasa-2 inducible, seleccionadas de entre el grupo que consiste en las SEC ID N.º 2, 4 y 11.
2. Ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna según la reivindicación 1, seleccionándose el ensayo de entre el grupo que consiste en los ensayos de la reacción en cadena de la polimerasa, las pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA), las pruebas de hibridación y combinaciones de las mismas.
3. Composición farmacéutica antineoplásica que comprende un oligonucleótido específico antisentido de por lo menos 10 bases complementarias de la secuencia de ADNc de la fosfofructocinasa-2 [SEC ID N.º 11] y un excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable.
4. Composición farmacéutica antineoplásica según la reivindicación 3, en la que el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4].
5. Procedimiento de detección sistemática de agentes terapéuticos antineoplásicos que inhiben la actividad enzimática como cinasa de la fosfofructocinasa-2, que comprende:
(a)
expresar un enzima fosfofructocinasa-2 inducible o dominio cinasa del mismo a partir de la secuencia de ADNc [SEC ID N.º 11];
(b)
purificar y aislar el enzima fosfofructocinasa-2 inducible o dominio cinasa del mismo expresado;
(c)
proporcionar un candidato terapéutico y un sustrato de fructosa-6-fosfato; y
(d)
determinar la formación del producto de fructosa-2,6-bisfosfato como medida de la actividad enzimática como cinasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la etapa de determinar que el agente terapéutico no inhibe la actividad enzimática como cinasa de la fosfofructocinasa-2 inducible hepática.
7. Anticuerpo que se enlaza con un epítopo de fosfofructocinasa-2 inducible, comprendiendo el epítopo una secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 505 a 515 de la fosfofructocinasa-2 inducible, descrita en la SEC ID N.º 24.
8. Polipéptido de la fosfofructocinasa-2 inducible aislado expresado mediante la secuencia de ADNc descrita en la SEC ID N.º 11.
9. Secuencia de ADN aislada que codifica un dominio cinasa de un polipéptido de la fosfofructocinasa-2 inducible que comprende los pares de bases 47 a 797 de la SEC ID N.º 11.
10. Polipéptido del dominio cinasa de la fosfofructocinasa-2 inducible aislada expresado mediante los pares de bases 47 a 797 de la SEC ID N.º 11.
11. Composición farmacéutica antinflamatoria que comprende un oligonucleótido antisentido específico de por lo menos 10 bases complementarias de dicha secuencia de ADNc de la fosfofructocinasa-2 inducible [SEC ID N.º 11] y un excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable.
12. Composición farmacéutica antinflamatoria según la reivindicación 11, en la que el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en: 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4].
13. Utilización de un antagonista de la fosfofructocinasa-2 inducible para la realización de un medicamento para tratar enfermedades inflamatorias, seleccionándose el antagonista de entre un oligonucleótido antisentido según las reivindicaciones 11 ó 12 o un anticuerpo según la reivindicación 7.
14. Utilización de un antagonista de la fosfofructocinasa-2 inducible para la realización de un medicamento para tratar el cáncer, seleccionándose el antagonista de entre un oligonucleótido antisentido según las reivindicaciones 11 ó 12 o un anticuerpo según la reivindicación 7.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6413939B1 (en) 1997-10-31 2002-07-02 The Picower Institute For Medical Research Inducible phosphofructokinase and the Warburg effect
MY140679A (en) * 2001-05-24 2010-01-15 Avanir Pharmaceuticals Inhibitors of macrohage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
GB0216097D0 (en) * 2002-07-11 2002-08-21 Univ London Treatment of proliferative disorders
TW200418829A (en) * 2003-02-14 2004-10-01 Avanir Pharmaceutics Inhibitors of macrophage migration inhibitory factor and methods for identifying the same
MXJL06000006A (es) * 2003-08-22 2006-05-04 Avanir Pharmaceuticals Derivados de naftiridina sustituidos como inhibidores del factor inhibidor de la migracion de macrofagos y su uso en el tratamiento de enfermedades en el hombre.
WO2006065967A2 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 General Atomics Allosteric enzyme coupled immunoassay (aecia)
CA2600175A1 (en) * 2005-03-24 2006-03-20 Avanir Pharmaceuticals Thienopyridinone derivatives as macrophage migration inhibitory factor inhibitors
GB0605689D0 (en) * 2006-03-21 2006-05-03 Novartis Ag Organic compounds
US8662667B2 (en) * 2007-12-21 2014-03-04 Carl Zeiss Meditec Ag Ophthalmologic visualization system
US20100158829A1 (en) * 2008-12-24 2010-06-24 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Method and Composition for Color Modulation
US9012242B2 (en) * 2010-09-20 2015-04-21 Caliper Life Sciences Multivalent fluorescent probes
EP2532747B1 (en) * 2011-06-09 2015-12-02 Deutsches Krebsforschungszentrum Modulators of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD2) for therapy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472516B1 (en) * 1995-10-24 2002-10-29 The Garvan Institute Of Medical Research Progestin-regulated gene
US6413939B1 (en) 1997-10-31 2002-07-02 The Picower Institute For Medical Research Inducible phosphofructokinase and the Warburg effect

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