JP2001521731A - 誘導性ホスホフルクトキナーゼとワールブルグ効果 - Google Patents
誘導性ホスホフルクトキナーゼとワールブルグ効果Info
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Abstract
Description
ーゼのイソ酵素(iPFK-2)を提供する。本酵素及びその機能の発見により、本酵素
を、診断の標的及び薬物スクリーニングの標的として使用すること、そして、細
胞内での本酵素の翻訳を抑えるアンチセンス化合物を、抗腫瘍治療剤として使用
することが見出された。
の役割があり、すなわち糖を分解してエネルギー(ATP) を生成することと、生合
成反応の構築体を提供することがある。これらの2つの細胞要求性を満たす様に
、グルコースからピルビン酸への変換速度が制御される。解糖系では、ヘキソキ
ナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ及びピルビン酸キナーゼが不可逆的な反応を触
媒し、これらの酵素が、解糖系の調節点として制御を受ける。これらの酵素は、
アロステリック効果器の可逆的結合、共有結合修飾、及び転写調節によって、変
化する代謝要求性を満たす様に制御される。これらの3つの酵素の内、ホスホフ
ルクトキナーゼが、哺乳動物の解糖系において最も重要な調節点である。
的高い酸素濃度でも解糖速度の低下が無いことを指摘した。この制御的調節(す
なわちパスツール効果)の低下は、ワールブルグ効果と呼ばれた。腫瘍細胞にグ
ルコースを供給すると、酸素消費が抑制され、エネルギーのためにグルコース依
存性が増加する。他の型の細胞では、グルコース存在下でさえも他の基質による
呼吸が維持されるので、この効果は通常見られない。急速に増殖している腫瘍に
おいて、なぜ解糖系で生成されたピルビン酸が、完全な酸化のためにミトコンド
リアに輸送されることなく、乳酸に変換される傾向が著しいかと言う問題は、生
化学者を長年悩ませてきた。この代謝様式の変化による生理学的な結果は明らか
である。腫瘍組織にために、エネルギーの浪費過程、例えば腫瘍と肝臓との間の
コリ回路が促進され、その宿主における代謝効率が非常に低下する。解糖速度が
高いので、細胞内に多量のピルビン酸が生成すると共に、NADH/NAD+ 比が増加し
、従って乳酸脱水素酵素によるピルビン酸から乳酸への還元反応が促進される。
腫瘍細胞内のミトコンドリア含量が少ないために、電子伝達系によるNADHの消費
が抑制されることによっても、そして多くの腫瘍においてNADH往復系のレベルが
低いことによっても、この反応は促進される。腫瘍細胞は、低酸素状態の筋線維
の場合と同様に、乳酸を放出する。腫瘍を有する状態で促進されたコリ回路の正
確な役割は、完全に解明されていない。しかしこれにより、グルコースから酸素
分子への完全な酸化反応によって36〜38分子のATP が形成されても、2つの3炭
素分子をグルコース1分子に変換するために、正味4分子のATP が失われるとい
う様に、宿主における効率が悪くなる。
to, Mol.Cell.Biochem.81:3-17,1988)。腫瘍の宿主への浸潤は、代謝的には、宿
主の代謝効率の低下、筋タンパク質の減少、糖新生の増加、及び酸化的リン酸化
の非共役によって特徴づけられる。この正味の結果、エネルギーの不均衡が起き
、悪疫質、更に餓死に至る。
瘍組織の試料を含む)の獲得、及びiPFK-2特異的配列(配列番号11)を検出する
配列同定検査の実施、を包含する検査を提供する。好ましくは、この配列同定検
査は、PCR 検査、ELISA 免疫検査、ハイブリダイゼーション検査、及びそれらの
組合せの中から選択される。
単離iPFK-2配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬に適するオ
リゴヌクレオチド用担体とを含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、この
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3'(配列番号2)、 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'(配列番号4)、及び それらの組合せの中から選択されるオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた15〜
50塩基のオリゴヌクレオチドである。
クリーニング検査であって、(a) 基質フルクトース6リン酸からフルクトース2,
6-ビスリン酸を形成する活性を有する組換えiPFK-2の獲得;(b) 種々の濃度での
候補薬剤の添加、又は薬剤を含まないコントロール溶媒の添加;並びに(c) 酵素
活性の測定としてのフルクトース2,6-ビスリン酸の検査、を包含する検査を提供
する。好ましくは、この生産物検査を、酵素検査によって行う。
ドを提供する。更にこのiPFK-2ポリペプチドを、既知の抗体技術、例えば既知の
モノクローナル抗体技術において使用することによって、iPFK-2に特異的に結合
する抗体が提供される。この様な抗体として、モノクローナル抗体が好ましい。
瘍組織の試料の獲得、及びiPFK-2特異的配列を検出する配列同定検査の実施、を
包含する検査を提供する。好ましくは、この配列同定検査は、PCR 検査、ELISA
免疫検査、ハイブリダイゼーション検査、及びそれらの組合せの中から選択され
る。
なアンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬に適するオリゴヌクレオチド用担体
とを含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、このアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3'(配列番号2)、 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'(配列番号4)、及び それらの組合せの中から選択されるオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた15〜
50塩基のオリゴヌクレオチドから選択される。
ドを提供する。更にこのiPFK-2ポリペプチドを、既知の抗体技術、例えば既知の
モノクローナル抗体技術において使用することによって、iPFK-2に特異的に結合
する抗体が提供される。この様な抗体として、モノクローナル抗体が好ましい。
する単離されたcDNA配列を提供する。このcDNA配列を、配列番号11に示す。配列
番号11では、コード領域の開始コドンと停止コドンが存在する(太字)。更に、
他の任意のPFK-2 イソ型には存在しないC-末端の付加的なアミノ酸をコードする
領域が存在する(下線塩基対)。本発明のiPFK-2のcDNA配列は、組換えiPFK-2ポ
リペプチドを生産するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するため
に、そして組換えiPFK-2及びその断片を生産する様に細胞(原核及び真核細胞)
を形質転換するために有用である。この組換えiPFK-2ポリペプチドは、PFK-2 酵
素活性を有するので、治療活性を有する抗ガン剤として、特に本発明の誘導性iP
FK-2イソ型に対する阻害剤をスクリーニングするために有用である。抗ガン治療
活性を、iPFK-2阻害剤に求めることができるのは、富AU性の初期反応遺伝子が、
白血病細胞の増殖に必要であるからである。その遺伝子は、明らかに本発明の誘
導性iPFK-2遺伝子であり、その遺伝子産物が、腫瘍細胞において最も広範に分布
している。
コードする単離されたcDNA配列を提供する。下記の実施例に、この酵素の単離、
精製及び発現に関する詳細を記す。この単離されたイソ酵素配列は、腫瘍細胞に
おいて優先的に発現され、そのため解糖活性が増加することが分かった。
ホスファターゼ(FBPase)における新規な遺伝子、すなわち「iPFK-2」の同定及び
機能解明に基づく。本酵素は、炎症原性の刺激によって誘導されるものであり、
その遺伝子の3'非翻訳領域に、mRNA不安定性モチーフであるAUUUA が複数コピー
存在することによって、PFK 型酵素をコードする他の類似遺伝子と区別される。
この富AU性要素は、いくつかの炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1, IFN-γ及び
GM-CSFなど)及びガンタンパク質(c-Fos, c-Myc及びc-Sis など)をコードする
mRNAに特有である(Greenberg and Belasco, Control of Messenger RNA Stablit
y, Belasco and Brawerman eds.,pp.199-218,Academic Press, New York,1993)
。本明細書のデータから、iPFK-2は、いくつかのヒトガン細胞株において構成的
に発現していること、そしてインビボでの腫瘍細胞増殖にとって必須であること
が分かる。iPFK-2タンパク質の発現レベルを抑制したところ、プリン及びピリミ
ジン生合成の重要な前駆体である5-ホスホリボシル-1- ピロリン酸(PRPP)の細胞
内レベルが低下した。従ってiPFK-2は、腫瘍増殖にとって明らかに必須な重要な
調節性イソ酵素であり、そのアンタゴニストは、重要な抗ガン治療活性を有する
。そしてiPFK-2によって、解糖とガン細胞増殖との明らかな共役に関する長年の
観察を説明できる。
の3'非翻訳領域(3'UTR) に、配列モチーフAUUUA を含んでいる。この富AU要素は
、mRNA分子に不安定性を付与するもので、その生理的な半減期を調節する機能を
有する(Caput et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1670-1674,1986; Shaw et al
.,Cell 46:659-667,1986) 。配列モチーフAUUUA が保存されているcDNA配列を、
発現配列タグ(EST) データベースから検索した。以前に報告された遺伝子とは無
関係な1つの富AU性EST を同定し、その完全なcDNAをクローン化し、その配列を
決定した。この新規遺伝子のDNA 配列は、富AU性要素を含んでいないヒト肝臓PF
K-2 (図1)に対して29%同一であった。その予想アミノ酸配列は、69%同一で
あり、更に広範な保存的な置換が認められた(図1)(Lange and Pilkis, Nuc.A
cids Res.18:3652,1990)。
、分裂促進性又は炎症原性の刺激によって増加する。従って、正常なヒト組織(
心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓及びリンパ節)のノーザ
ンブロットでは、非常に低レベルのiPFK-2発現しか検出されなかった。これとは
対照的に、リポ多糖(LPS) で刺激したヒト単球のノーザンブロット分析から、こ
の新規なiPFK-2遺伝子の発現が、急速に誘導されること(図2a)が分かった。従
って「iPFK-2」と命名された。iPFK-2の発現レベルの増加の誘導は、サイトカイ
ンIL-1β(これも富AU性要素を含む)において観察された誘導と似ていた(図2b
)。PFK-2 の肝臓の(構成的)イソ体は、LPS 刺激の影響を受けなかった。抗iP
FK-2特異抗体を用いたウエスタンブロット分析から、iPFK-2のmRNAの誘導に伴っ
て、それに対応する免疫反応性のiPFK-2タンパク質の増加が見られた(図2c)。
これらのデータから、iPFK-2は、3'UTR に富AU性モチーフを有する他の遺伝子と
同様に、インビトロで炎症原性刺激した初代培養ヒト単球において誘導されるこ
とが判る。別の実験では、5人のHIV 感染者の末梢血白血球において、iPFK-2の
発現を調べた。各感染者のiPFK-2のmRNAレベルは、非感染者コントロール(n=3)
に比べてより高かった。これらのデータから、iPFK-2は、インビボでの白血球の
活性化時に誘導されることが示唆される。
形質転換細胞に特有の特性であり、直に発ガン性を呈し得る(Lee et al.,Mol.Ce
ll.Biol.8:5521-5527,1988; Rabbitts et al.,EMBO.J.4:3727-3733,1985; Piech
aczyk et al.,Cell 42:589-597,1985)。ヒトの8種類の腫瘍細胞株においてノー
ザンブロットによりiPFK-2のmRNAを調べたところ、高レベルの発現が認められた
(図3a)。そのiPFK-2のハイブリダイゼーションシグナル強度は、LPS 刺激した
初代培養ヒト単球から得たRNA におけるiPFK-2シグナルに匹敵した(図2b)。慢
性骨髄性白血病細胞株K562を用いて更に調べたところ、iPFK-2の発現は、肝PFK-
2 イソ体の発現よりも非常に高かった(図3b)。これらのデータから、iPFK-2の
発現は、腫瘍細胞増殖時の解糖系の調節にとって重要であることが示唆される。
。コントロールオリゴヌクレオチドを導入した細胞に比べて、iPFK-2タンパク質
及びF2,6BPレベルの両方が有意に増加した(図4a)。これらのデータから、iPFK
-2のキナーゼ活性が、細胞内F2,6BPレベルに有意に寄与することが分かる。悪性
形質転換細胞では解糖系の促進により、プリン及びピリミジン生合成の必須前駆
体である5-ホスホリボシルピロリン酸(PRPP)が増加する(Eifenbrody et al.,Tre
nds Pharmacol.Sci.1:24-245,1980)。K562細胞ではiPFK-2の阻害により、PRPPレ
ベルが有意に低下し、この低下に一致して、K562のDNA 合成及び細胞増殖が低下
した(図4c)。iPFK-2特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞株HL-60,
MOLT-4, SW480, G361及びKG1Aに導入しても、同様なレベルのDNA 合成阻害が認
められた。これらのデータから、iPFK-2が触媒したF2,6BPの生産により、(PFK-
1 の刺激を介して)解糖系が促進され、そしてPRPP合成に向かうグルコース代謝
の経路が増強され得ることが分かる。
にiPFK-2特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって調べた
。処理2日目に、iPFK-2アンチセンスで処理したマウスの腫瘍は、iPFK-2センス
オリゴヌクレオチド又はPBS で処理したマウスの腫瘍よりも有意に小さかった(
図5)。
インビトロ検査を用いて、iPFK-2阻害剤を検査するために、その方法と試薬を開
発した。既知のPFK-2 の機能ドメインとの相同性から、本iPFK-2ポリペプチドは
、2つの独特なドメイン:キナーゼドメインを含むアミノ末端部分(フルクトー
ス6-リン酸をリン酸化してフルクトース2,6-ビスリン酸を生成する機能を有する
)と、ホスファターゼドメインを含むカルボキシ末端部分(フルクトース2,6-ビ
スリン酸を加水分解してフルクトース6-リン酸を生成する機能を有する)とを含
んでいる。
の完全な読み取り枠を単離し、pT7T3D-Pacプラスミド(Pharmacia) にクローン化
した。制限切断と配列決定によって、この挿入体の配列が適切であることを確認
した。挿入体を有するベクターによって細菌を形質転換し、制限分析と配列決定
によって陽性コロニーを検出した。最後に、挿入体を切り出し、pET11b発現ベク
ター(Novagen) に再クローン化し、下記の一般的方法に従って発現させた。
ト単球の総mRNAを逆転写して得たcDNAプールを鋳型として、PCR 増幅を行った。
5'伸長部分にNdeIとBamHI の制限部位を保有する2つの特異的プライマーを合成
した: P1: 5'-ACATATGCCGTTGGAACTGACGCAGAGC-3'(配列番号27) P2: 5'-TGGATCCTCACAGGTAGATGGTACGCGGCT-3'(配列番号28)。 増幅産物は、予想サイズ通りであり、iPFK-2キナーゼドメイン(iPFK-2の読み取
り枠47-797に相当する)のヌクレオチド配列に一致した。この増幅DNA 産物を、
GENECLEAN DNA 精製キット(BIO101)によって精製し、pT7Blue クローニングt-ベ
クター(Novagen) と、ヒスチジンタグを有するpET14b発現ベクター(Novagen) と
にクローン化した。PCR スクリーニングによって、挿入体を有するベクターを検
出し、配列決定によって、挿入体の配列を検査した。挿入体陽性のpET14bの単一
コロニーを、LBブロス2mlに接種し、37℃で3時間培養した。その培養細菌を、
100ml のLBブロスが入った大きいフラスコに移し、37℃で培養した。そのOD600
が0.7 になったら、誘導のために培養細菌にIPTG(1mM) を加え、撹拌しながら25
℃で一晩増殖させた。最後に培養液を遠心し、上清を吸い取り出し、ペレットを
−70℃で凍結した。この保存細胞を溶解緩衝液(B-PER, Pierce) 中に再縣濁し、
遠心し、可溶性タンパク質としての上清を、使用まで−20℃で保存した。ヒスチ
ジンタグ精製キット(Novagen) で、本キナーゼドメインペプチドを精製し、下記
の通りその酵素活性を検査した。この方法によって、ヒスチジンタグを付加した
キナーゼドメイン又はホスファターゼドメインポリペプチドを生産し得る。
とATP とからの代謝物であるFru2,6BPの生産を測定することで、iPFK-2ペプチド
又はiPFK-2キナーゼドメイン(天然のもの又は組換え体)の酵素活性を簡便に検
査する。活性1単位を、1分間あたり1μmol の代謝物の生成を触媒する酵素の
量として定義する。通常、100mM Tris-HCl,pH7.5, 2mM DTT, 0.1mM EDTA, 5mM A
TP, 1mM F6-P, 5mM リン酸カリウム及び10mM MgCl2を含む最終容量200 μl の反
応液中で、30℃で反応を行う。一定の時間間隔で反応を止めるために、20μl 分
量を、180 μl の50mM NaOH 溶液中に移し、この希釈溶液を90℃まで加熱する。
この加熱した溶液の適量を用いて、下記通りF2,6BPを検査した。iPFK-2キナーゼ
活性の阻害剤としてテスト薬剤を簡便に評価するために、前記インキュベーショ
ンにおいてテスト薬剤を添加し、F2,6BPの生産を検査した。コントロール実験を
行って、テスト薬剤自体が、引き続いて行われるフルクトース2,6-ビスリン酸の
測定を妨害しないことを確認した。
96ウエルプレート上で最終容量300 μl にて、簡便にF2,6BP検査を行った。各ウ
エルで、30μl の酵素溶液(4.5U/mlアルドラーゼ、17U/mlグリセロール-3-Pデヒ
ドロゲナーゼ、50U/mlトリオースイソメラーゼ、0.1U/ml1- ピロリン酸依存性フ
ルクトースビスリン酸キナーゼ、0.2%BSA)を、150 μl の緩衝液(100mM Tris/酢
酸緩衝液、4mM 酢酸マグネシウム、100mM フルクトース-6- リン酸、0.3mM EDTA
) に加える。試料(又は基準液)(105μl)を各ウエルに分配し、ピペッティング
によって混合する。この反応混合液を室温で5分間インキュベーションしてから
、10mMピロリン酸15μl を試料ウエルとコントロールウエルに同時に加え、ピペ
ッティングによって混合する。この反応によりNADHが酸化される。それを、試料
の340nm の吸光度を1分間隔で10分間測定することによって監視し、OD/分の値
を得る。単位時間あたりの吸光度の変化率は、試料中に存在するF2,6BP濃度の双
曲線関数になる。フルクトース2,6-ビスリン酸の適当な標準曲線に当てはめて、
実験値を決定する。
を有する発現配列タグ(EST) を、National Center for Biotechnology Informat
ion のdbEST データベースから、参照配列ATTTATTTATTTA (配列番号12)を用い
たTBLASTN 検索によって同定した。富AU性EST(GenBank ID F00287)を、ヒト骨格
筋cDNAライブラリーから得た。これは、以前に同定された配列と無関係であった
。ヒト骨格筋用Marathon cDNA-ready RACEキット(Clontech Lab.Inc.,Palo Alto
,CA)を用いて、5'及び3'RACE法(cDNA末端急速増幅法)を行った。連続的5'方向
RACE法に用いた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、以下に示す: 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3'(配列番号19) 5'-GATTGTACCATACCTGAAGCACAGCCTC-3'(配列番号13) 5'-TCTCCTGCCGCTCCAGCTCCATGATCAC-3'(配列番号14) 5'-GTCAGCTTCTTGGAGATGTAGGTCTTGC-3'(配列番号15) 3'方向RACE法に用いた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、以下に示す: 5'-TTGGTTTGGGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'(配列番号16) 5'-TTGGCGTCTACTGATTCCTCCAACTCTC-3'(配列番号17) 増幅DNA 産物を、QIAEX DNA ゲル抽出キット(Qiagen, Germany) により精製し、
そしてpT7Blue T-ベクター(Novagen, Madison,WI) 内にクローン化した。各増幅
産物毎に、5個の組換えクローンを単離し、その挿入DNA の配列を、Taq Dye De
oxy Terminator Cycle配列決定キットとABI モデル373A DNA配列決定装置(Appli
ed Biosystems, Foster City,CA)を用いて、両方向から決定した。ヒトiPFK-2の
完全な予想アミノ酸配列を、近縁配列との比較と共に図1に示す。
ンパク質の急速発現を説明する。フィコール(Ficoll-Paque,内毒素検査済み;Ph
armacia, Piscataway,NJ) を用いた全血の密度勾配遠心によってPBMCを単離し、
6ウエルプレートで培養した(2x106cell/ml/well;10%牛胎児血清含有RPMI, Hycl
one Labs, Logan, UT)。24時間後に培地交換して非接着細胞を除き、残った接着
性の単球を、コントロールとしてそのまま、又は1mg/ml LPS(E.Coli 0111:B4;Si
gma Chemical Co.,St.Louis,MO) を加えて培養した。1.5, 3, 6, 12 又は24時間
インキュベーションした後、細胞を剥がし、10分間の300g遠心で収集し、即座に
分析した。改変グアニジニウムイソチオシアネート法(RNAzol, Cinna Biotecx,F
riendwood,TX) によって細胞内総RNA を単離した。RT-PCR分析のために、取扱説
明書に従って1.0mg の総RNA から、0.25ngのオリゴ(dT)及びSuperscript II(Gib
co/BRL, Grand Island,NY)を用いてcDNAを調製した。そのcDNA2μl を、Perkin
-Elmerモデル9600Thermal Cyclerで、下記のプライマーを用いたPCR によって増
幅した。このPCR では、1サイクルを、95℃15秒の変性、55℃20秒のアニール、
そして72℃30秒の伸長として、指示したサイクル数反応した後、72℃で5分間最
後の伸長を行った。下記のヒトmRNA用プライマーを合成した(Gibco/BRL) : βアクチン用: 5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3'(配列番号7) 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'(配列番号8) IL-1β用: 5'-CTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3'(配列番号18) 5'-AGCTCTCTTTAGGAAGACAC-3'(配列番号19) iPFK-2用: 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3'(配列番号9) 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'(配列番号10) 肝臓PFK-2 用: 5'-GAAGTCAAACTGAATGTGTC-3'(配列番号20) 5'-CCTCTTGTAGGCAGTAAGTC-3'(配列番号21) (及び、 5'-AGGCAGTAAGTCTTTATTCG-3'(配列番号22) 5'-AAGTCAAACTGCCTGTGTCC-3'(配列番号23) データ未表示) ノーザンブロット分析のために、RNA(7.5 μg)を1.5%アガロース/ホルムアルデ
ヒドゲル中で電気泳動し、ナイロン膜(Schleicher & Schuell)に転写し、ヒトiP
FK-2及びβアクチン用のcDNAプローブによって連続してハイブリダイズした。前
記のプライマーを用いたPCR によってプローブを作成し、ランダムプライマー法
(Megaprime Kit, Amersham) によって32P-標識した。DuPont反射フィルムと増強
スクリーンとを用いて、室温で2〜6時間かけてオートラジオグラフを得た。ウ
エスタンブロット分析のために、2X Laemle 試料用緩衝液中で95℃で5分間加熱
することで細胞を溶解し、18% SDS ポリアクリルアミドゲル中で還元条件下に電
気泳動することで細胞総タンパク質を分離し、ニトロセルロース膜(Schleicher
& Schuell)に転写した。この膜を、ウサギポリクローナル抗体である抗ヒトiPFK
-2抗血清とインキュベーションした。この抗体を、KLH と連結したiPFK-2カルボ
キシ末端ペプチド([NH2]-GQPLLGQACLT-[COOH])(配列番号24)によってウサギを
免疫化することで作成した。このペプチドは、iPFK-2に特有な領域(アミノ酸50
5-515 )を含むもので、その領域は、5アミノ酸の欠失及び8アミノ酸の不一致
の点で胎盤PFK-2 の対応部分と異なる。その膜を、ペルオキシダーゼを連結した
ロバの抗ウサギIgG 抗体(1:8000)で、続いてECL 試薬(Amersham International,
Buckinghamshire,England) で処理することで、免疫反応性のiPFK-2(Mr=59kD)
を検出した(図2)。
に8種類のヒト細胞株由来のポリA-RNA 2 μg を含んだノーザンブロット膜(Clo
ntech Labs) を、GAPDH のcDNAプローブ(Clontech Labs) と、実施例2のiPFK-2
のcDNAプローブとによって連続してハイブリダイズした。下記の細胞株:前骨髄
性白血病由来のHL-60 、HeLa細胞S3、慢性骨髄性白血病由来のK562、リンパ芽球
性白血病由来のMOLT-4、バーキットリンパ腫由来のRaji、結腸直腸アデノカルシ
ノーマ由来のSW480 、肺カルシノーマ由来のA549、及びメラノーマ由来のG361、
を用いた。RT-PCR分析のために、K562のcDNA2μl を、Perkin-Elmerモデル9600
Thermal Cyclerで、βアクチン、iPFK-2又は肝臓PFK-2 に特異的なプライマー(
実施例2に記載されたもの)を用いてPCR で増幅した。これらのデータ(図3)
から、多様なヒトガン細胞株でiPFK-2が発現していることが分かる。従って、こ
のiPFK-2は、治療中ガンの進行を測定するため、細胞がガンであることを最初に
同定するため、又は、患者がガンを有することを同定するために使用することが
できる腫瘍マーカー酵素配列としての可能性が高い。
ロでK562細胞の増殖を抑制することを説明する。対数増殖期のK562細胞(ATCC)を
、96ウエルプレート上で10%FBS補充RPMI(Gibco/BRL) によって3対1組で培養し
た(5x103cell/well)。この細胞を、コントロールとしてPBS と共に、又はリポフ
ェクチン法によって下記のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを導入して、
20時間培養した: S-iPFK-2(A) (位置35-55 センス) 5'-AGCCGCGAAGATGCCGTTGG-3'(配列番号1) AS-iPFK-2(A)(位置35-55 アンチセンス) 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3'(配列番号2) S-iPFK-2(B) (位置42-62 センス) 5'-AAGATGCCGTTGGAACTGAC-3'(配列番号3) AS-iPFK-2(B)(位置42-62 アンチセンス) 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'(配列番号4) 実施例2の通りにウエスタンブロット分析を行った。 Van Schaftingen, Methods.Enz.Anal.6:335-341,1984及びSant et al.,J.Biol.B
iocehm.16:11038-11045,1992に各々従って、細胞のフルクトース2,6-ビスリン酸
及び5-ホスホリボシル1-ピロリン酸の総量を測定した。K562の増殖活性を、イン
キュベーション/導入過程の最後の14時間におけるDNA への[3H]チミジン(4μCi
/ml)(DuPont, Boston,MA) の取り込みから、それを液体シンチレーション計数機
で定量して、測定した。図4のデータを平均±SD(n=3) として表す。2群のT-検
定によって統計的有意差を評価した(分散を不均一と仮定した)(*はp<0.05)(Ta
etle et al.,Cancer Trmt.Reports 71:297-304,1987)。図4から、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの一群は、iPFK-2アンタゴニスト活性を有することが分かる
。従って、このアンチセンスは、腫瘍組織におけるiPFK-2の広範な存在、及びワ
ールブルグ効果の観点から、有意な抗ガン治療活性となる可能性が高い。
でK562腫瘍の増殖を抑制することを説明する。K562腫瘍を保有したマウスに、PB
S (白丸)、S-iPFK-2(B) (白四角)又はAS-iPFK-2(B)(黒四角)を含んだミク
ロ浸透ポンプを、指示した日数の間移植した(図5)。10%FBS補充RPMI培地中で
対数増殖期まで培養したK562細胞を集め、2回洗浄し、そしてPBS 中に再縣濁し
た(1x107cell/ml)。1群5匹の雌BALB/cヌードマウス(20gm)(Harlan Labs) の皮
下に、K562縣濁液0.10ml(1x106cell) を注射した。処理前に平均重量が0.4gに成
る様に、腫瘍を7日間増殖させた。0.1ml のPBS 、あるいはホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドS-iPFK-2(B) 又はAS-iPFK-2(B)(3mM/PBS;実施例4参照) を
詰めたAlzet ミクロ浸透ポンプ(Alzet Co.,Palo Alto,CA)を、腫瘍保有マウスの
皮下に移植した。0, 1, 2, 3及び4 日後に、Vernier カリパスを用い、式:重量
(mg)=幅mm2 x 長さmm2 に従って、腫瘍のサイズを決定した(Taetle et al.,Can
cer Trmt.Reports 71:297-304,1987) 。図5から、iPFK-2アンタゴニスト活性を
示した当アンチセンスオリゴヌクレオチドが、抗ガン治療活性をも有することが
証明される。従って、iPFK-2アンタゴニストは、ガン治療に有用である。
現を誘導すること説明する。10週齢のBALB/cマウス(19-20gm) の腹腔内に、LPS(
12.5mg/kg)又はコントロールとしての生理食塩水を注射した。6及び24時間後に
CO2 窒息によりマウスを安楽死させ、脳(B) 、肝臓(L) 、下肢筋(M) 及び脾臓(S
) を切開により取り出した。総RNA を抽出して、マウスiPFK-2に特異的なcDNAプ
ローブを用いてノーザンブロット分析した(前記プローブを、ヒトiPFK-2特異的
プライマー: 5'-TGAGGCAGACGTGTCGGTTC-3'(配列番号25) 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3'(配列番号26) を用いて、マウス腹腔内マクロファージのcDNAから、30サイクルのRT-PCRにより
増幅した)。 この結果を示した図6から、LPS が、マウスの組織においてiPFK-2のmRNA発現
を誘導したことが分かる。このデータから、iPFK-2が、炎症症状の治療マーカー
として診断薬理学上重要であることが指摘できる。
発現していることを説明する。3人の非感染者(レーン1-3)と5人のHIV 陽性者
(レーン4-8)から総RNA を単離し、そしてβアクチン特異的プライマー: 5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3'(配列番号7) 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'(配列番号8) 及びiPFK-2特異的プライマー: 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3'(配列番号9) 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'(配列番号10) を用いたRT-PCR(各々19及び23サイクル)によって分析した。 この結果を示した図7から、HIV 陽性者のPBMCにおいて、iPFK-2が過剰発現し
ていることが分かる。
- マンニトールは、本発明で提供される組換えiPFK-2ポリペプチドにおいて、そ
のiPFK-2酵素(すなわちキナーゼ)活性を阻害するものである。次に、この2,5-
アンヒドロ-D- マンニトール又はその他のテスト化合物を、抗腫瘍治療活性のイ
ンビトロ検査によって検査することもできる。これにより、iPFK-2キナーゼ酵素
活性の阻害と、治療上の抗腫瘍薬理活性とを関係づける。糖(グルコース)を制
御するために、K562腫瘍細胞(10%FBS補充RPMI培地中で増殖した1x104 細胞)を
、種々の濃度の2,5-アンヒドロ-D- マンニトール又はその他のテスト化合物に12
時間さらす。次に腫瘍細胞の増殖を評価するために、細胞増殖検査、例えばトリ
チウム化チミジンの取り込みの測定を行う。従ってこの方法は、テスト化合物が
、iPFK-2アンタゴニストであるかどうかを決定する助けとなる。このアンタゴニ
ストとは、検査においてiPFK-2に作用して、F2,6BPを低下させるか、及び/又は
F6P を増加させる薬剤を指す。
ドとT-細胞腫瘍株MOLT-4を用いて、実施例4の記載の様に実施した。図9で示す
通り、両iPFK-2アンチセンスオリゴヌクレオチドが、腫瘍細胞増殖を抑制し、こ
の予想インビトロ検査において抗腫瘍医薬活性を示した。
ノ酸配列と、ヒト胎盤のcDNA(Sakai, Kato, Fukusawa et al.,J.Biochem.119:50
6-511,1996) 及びヒト肝臓のcDNA(Lange and Pilkis, Nuc.Acids Res.18:3652,1
990)から推定したPFK-2 アミノ酸配列との整列を示す。箱で囲った部分の残基が
同一である。
血単球を誘導することを示す。図2aは、RT-PCRによる分析である。図2bは、ノー
ザンブロットによる分析である。図2cは、ウエスタンブロットによる分析であり
、右パネルでは抗iPFK-2血清を用い、左パネルでは、その抗血清を作ったiPFK-2
特異的ペプチドによって、その抗血清を事前に吸着させたものを用いた。
、種々のヒトのガン細胞株におけるノーザンブロット分析を示す。図3bは、RT-P
CRによる、K562細胞におけるβアクチン、iPFK-2及びヒト肝臓PFK-2 の分析を示
す。
インビトロで、iPFK-2特異的なK562細胞の増殖を阻害することを示す。図4aは、
アンチセンスオリゴヌクレオチドのiPFK-2アンタゴニスト活性を、ウエスタンブ
ロットで分析したものである。図4bは、センスオリゴヌクレオチド(S) とアンチ
センスオリゴヌクレオチド(AS)のiPFK-2アンタゴニスト活性を、フルクトース2,
6-ビスリン酸測定によって分析したものである。図4cは、センスオリゴヌクレオ
チド(S) とアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)のiPFK-2アンタゴニスト活性を
、5-ホスホリボシル1-ピロリン酸測定と、K562細胞の増殖測定とによって分析し
たものである。
ビボで証明するデータであり、しかもiPFK-2アンタゴニストの抗ガン治療活性を
示す。
導することを示す。10週齢のBALB/cマウス(19-20gm) の腹腔内に、LPS(12.5mg/k
g)又はコントロールとしての生理食塩水を注射した。6及び24時間後にCO2 窒息
によりマウスを安楽死させ、脳(B) 、肝臓(L) 、下肢筋(M) 及び脾臓(S) を切開
により取り出した。総RNA を抽出して、マウスiPFK-2に特異的なcDNAプローブを
用いてノーザンブロット分析した(前記プローブを、ヒトiPFK-2特異的プライマ
ー: 5'-TGAGGCAGACGTGTCGGTTC-3'(配列番号5) 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3'(配列番号6) を用いて、マウス腹腔内マクロファージのcDNAから、30サイクルのRT-PCRにより
増幅した)。このインビボのデータから、LPS が、マウスの脳、肝臓、筋及び脾
臓において、iPFK-2のmRNA発現を誘導することが示される。
いることを示す。3人の非感染者(レーン1-3)と5人のHIV 陽性者(レーン4-8)
から総RNA を単離し、そしてβアクチン特異的プライマー: 5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3'(配列番号7) 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'(配列番号8) 及びiPFK-2特異的プライマー: 5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3'(配列番号9) 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'(配列番号10) を用いたRT-PCR(各々19及び23サイクル)によって分析した。
を推定した代謝経路図であり、そこには、嫌気的代謝による乳酸の集積と、急速
な細胞分裂を支援するためのヌクレオチド生産とがある。
殖を阻害することを示す。2つの異なるiPFK-2アンチセンスオリゴヌクレオチド
が有効であり、この予想検査において抗腫瘍医薬活性を示した。
Claims (17)
- 【請求項1】 ガンの悪性度の診断検査であって、体液又は体組織、腫瘍液
又は腫瘍組織の試料の獲得、及びiPFK-2特異的配列を検出する配列同定検査の実
施、を含んで成る検査。 - 【請求項2】 その配列同定検査が、PCR 検査、ELISA 免疫検査、ハイブリ
ダイゼーション検査、及びそれらの組合せの中から選択される、請求項1のガン
の悪性度の診断検査。 - 【請求項3】 iPFK-2のcDNA配列(配列番号11)に相補的な少なくとも10塩
基から成る特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬に適するオリゴヌク
レオチド用担体とを含有する、抗ガン医薬組成物。 - 【請求項4】 そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3'(配列番号2)、 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'(配列番号4)、及び それらの組合せの中から選択されるオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた15-5
0 塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項3の抗ガン医薬組成物。 - 【請求項5】 iPFK-2のキナーゼ酵素活性を阻害する抗ガン治療薬剤をスク
リーニングする方法であって、下記過程を含む方法: (a) 配列番号11のcDNA配列から、iPFK-2酵素又はそのキナーゼドメインを発現す
ること; (b) 発現したiPFK-2酵素又はそのキナーゼドメインを精製及び単離すること; (c) 候補の治療薬剤及び基質のフルクトース6リン酸を供給すること;並びに、
(d) キナーゼ酵素活性の測定としてフルクトース2,6-ビスリン酸の生成を測定す
ること。 - 【請求項6】 その治療薬剤が、肝臓のPFK-2 のキナーゼ酵素活性を阻害し
ないことを決定する過程を更に含んでいる、請求項5の方法。 - 【請求項7】 iPFK-2のエピトープと結合する抗体であって、そのエピトー
プが、iPFK-2のアミノ酸配列505-515 に相当するアミノ酸配列を含んでいる抗体
。 - 【請求項8】 iPFK-2ポリペプチドをコードし、且つ配列番号11の配列内の
コード領域を含んでいる、単離されたDNA 配列。 - 【請求項9】 配列番号11のcDNA配列から発現された、単離されたiPFK-2ポ
リペプチド。 - 【請求項10】 配列番号11の塩基対47-797を含み、且つiPFK-2ポリペプチ
ドのキナーゼドメインをコードする、単離されたDNA 配列。 - 【請求項11】 配列番号11の塩基対47-797から発現された、単離されたiP
FK-2のキナーゼドメインポリペプチド。 - 【請求項12】 iPFK-2のcDNA配列(配列番号11)に相補的な少なくとも10
塩基から成る特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドと、医薬に適するオリゴヌ
クレオチド用担体とを含有する、抗炎症医薬組成物。 - 【請求項13】 そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、 5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3'(配列番号2)、 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'(配列番号4)、及び それらの組合せの中から選択されるオリゴヌクレオチド配列が組み込まれた15-5
0 塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項12の抗炎症医薬組成物。 - 【請求項14】 有効量のiPFK-2アンタゴニストの投与を含んで成る、炎症
性疾患の治療方法。 - 【請求項15】 そのiPFK-2アンタゴニストが、iPFK-2酵素活性の阻害剤、
抗iPFK-2抗体、又はiPFK-2特異的アンチセンス分子である、請求項14の方法。 - 【請求項16】 有効量のiPFK-2アンタゴニストの投与を含んで成る、ガン
の治療方法。 - 【請求項17】 そのiPFK-2アンタゴニストが、iPFK-2酵素活性の阻害剤、
抗iPFK-2抗体、又はiPFK-2特異的アンチセンス分子である、請求項15の方法。
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