JPWO2006001275A1 - グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーングする方法 - Google Patents

グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーングする方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、また、グリコーゲン合成酵素２の変異体をコードする単離された核酸、当該核酸が挿入されたベクター及び遺伝治療用である当該ベクターを提供する。本発明は、さらに、グリコーゲン合成酵素２の変異体及び当該変異体を有効成分として含有する糖尿病治療薬を提供する。

Description

本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物に関する。
グリコーゲン合成酵素は、ヒトにおいては、筋型（グリコーゲン合成酵素１；７３７アミノ酸、８３．６ｋＤａ）及び肝臓型（グリコーゲン合成酵素２；７０３アミノ酸、８０．９ｋＤａ）の２タイプの遺伝子・酵素が存在し、グリコーゲン合成の律速酵素として機能することが知られている（非特許文献１）。
肝臓においては、食後に余剰の糖がグリコーゲン合成酵素によりグリコーゲンとして貯蔵される一方、空腹時にグリコーゲンホスホリラーゼによってグリコーゲンは分解されて、生じた糖が肝臓から放出される。このように、グリコーゲン合成酵素はグリコーゲンホスホリラーゼと共に、血糖調整に関与すると考えられている。
グリコーゲン合成酵素の活性は、リン酸化及びグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）によって調節されている。グリコーゲン合成酵素は７つのセリンリン酸化部位（Ｎ末端側から順にｓｉｔｅ２，２ａ，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５）を有し、種々のキナーゼによってリン酸化されると不活性型になる一方、プロテインホスファターゼ−１Ｇによって脱リン酸化されると活性型となる。また、内在性のアロステリック活性化因子であるＧ−６−Ｐにより、リン酸化型及び脱リン酸化型の双方のグリコーゲン合成酵素が、一定の活性まで強力に活性化される（非特許文献１）。
活性低下型のグリコーゲン合成酵素の変異を持つ人は、グリコーゲンの貯蔵ができないために肝臓の糖放出が亢進し、食後高血糖になることが知られている（非特許文献２及び３）。また、高血糖状態にある１型及び２型糖尿病患者において、肝グリコーゲンが減少していることも知られている（非特許文献４〜７）。これらの臨床的知見からグリコーゲン合成酵素活性の減少と高血糖との相関が示唆されており、グリコーゲン合成酵素の活性化に基づいた糖尿病治療薬の開発が進められている。
Juan C. Ferrer et al., FEBS Letters, 546, 127-132 (2003) M. Orho et al., J. Clin. Invest., 102, 507-515 (1998) B. E. Bachrach et al., J. Pediatr., 140, 781-783 (2002) J. H. Hwang et al., J. Clin. Invest., 95, 783-787 (1995) G. Velho et al., J. Clin. Invest., 98, 1755-1761 (1996) M. G. Bischof et al., Diabetes, 51, 49-54 (2002) I. Magnusson et al., J. Clin. Invest., 90, 1323-1327 (1992)
グリコーゲン合成酵素の活性化に基づく糖尿病治療薬のうち開発が進められているものは、すべてグリコーゲン合成酵素の活性を間接的に上昇させる作用に基づくものである。すなわち、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性型にする酵素であるグリコーゲン合成酵素キナーゼ３の阻害剤を有効成分としている。
しかし、グリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性型にする酵素（キナーゼ）は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３以外にも生体内に多数存在しており、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３の阻害剤はこれらすべてのキナーゼを阻害できるわけではない。つまり、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３を阻害しても、他のキナーゼによりグリコーゲン合成酵素がリン酸化を受けて不活性化されるため、最終的には高血糖を抑えることができない可能性がある。
したがって、本発明の目的は、様々なキナーゼの影響を受けることなくグリコーゲン合成酵素の活性を上昇させる糖尿病治療薬を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物を有効成分として含有する糖尿病治療薬を提供する。グリコーゲン合成酵素を直接活性化することにより、生体内に存在するグリコーゲン合成酵素を不活性化するキナーゼの影響を受けることがなくなり、高血糖を充分抑えることが可能である。また、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物は、他の糖尿病治療薬とは異なり、低血糖のリスクが低くなる可能性があることを本発明者らは見出している。さらに、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物は、肥満を改善し、１型及び２型糖尿病の双方に適用できる可能性についても本発明者らは見出している。
グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物を探索するために、本発明者らは、当該化合物のスクリーニング方法を開発した。すなわち、本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇが存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）（ａ）工程において測定された活性が、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い候補化合物を選択する工程と、を備えるスクリーニング方法を提供する。グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子がスクリーニング系から排除されているため、このスクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素を間接的に活性化する化合物が選択されることがない。
また、本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする別の方法として、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物との結合定数を測定する工程と、（ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、結合定数が所定値以上の候補化合物を選択する工程と、を備えるスクリーニング方法を提供する。結合実験によりグリコーゲン合成酵素と結合する化合物のみを選択することが可能となるため、本スクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素を直接的に活性化する化合物のみを選択することが可能である。
さらに、本発明は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする別の方法として、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇからなる群から選択される１以上の酵素に対する候補化合物の活性調節作用を測定する工程と、（ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、（ｂ）工程においては活性調節作用を示さない候補化合物を選択する工程と、を備えるスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対して影響を与える化合物が排除されるため、グリコーゲン合成酵素を間接的に活性化する化合物が選択されることがない。
上記スクリーニング方法におけるグリコーゲン合成酵素はグリコーゲン合成酵素２であることが好ましい。糖尿病では、肝臓におけるグリコーゲン貯蔵や糖放出の制御が重要であるため、特異性の観点から肝臓型のグリコーゲン合成酵素であるグリコーゲン合成酵素２を対象としたスクリーニングを行うことが好ましいからである。
本発明は、また、配列番号１１に記載の塩基配列からなる単離された核酸、当該核酸が挿入されたベクター及び遺伝子治療用である当該ベクターを提供する。本発明は、さらに、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質及び当該タンパク質を有効成分として含有する糖尿病治療薬を提供する。
配列番号１１に記載の塩基配列からなる核酸は、ヒトのグリコーゲン合成酵素２の変異体（配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードしている。この変異体は、グリコーゲン合成酵素２が有する７つのセリンリン酸化部位のうち、ｓｉｔｅ２，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５の６つのセリン残基がアラニン残基に置換されている。リン酸化部位を欠いたこの変異体は、リン酸化されて不活性型になることがなく常時活性型となり、生体内に存在するキナーゼの影響を受けることなく常にグリコーゲン合成を行うことが可能となる。したがって、配列番号１１に記載の塩基配列からなる核酸は、糖尿病の遺伝子治療に応用することが可能である。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は糖尿病治療薬に用いることが可能である。
本発明は、また、配列番号１３に記載の塩基配列からなる単離された核酸、当該核酸が挿入されたベクター及び遺伝子治療用である当該ベクターを提供する。本発明は、さらに、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質及び当該タンパク質を有効成分として含有する糖尿病治療薬を提供する。
配列番号１３に記載の塩基配列からなる核酸は、ヒトのグリコーゲン合成酵素２の変異体（配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードしている。この変異体は、グリコーゲン合成酵素２が有する７つのセリンリン酸化部位（ｓｉｔｅ２，２ａ，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５）のすべてのセリン残基がアラニン残基に置換されている。リン酸化部位を欠いたこの変異体は、リン酸化されて不活性型になることがなく常時活性型となり、生体内に存在するキナーゼの影響を受けることなく常にグリコーゲン合成を行うことが可能となる。したがって、配列番号１３に記載の塩基配列からなる核酸は、糖尿病の遺伝子治療に応用することが可能である。また、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は糖尿病治療薬に用いることが可能である。
本発明によれば、様々なキナーゼの影響を受けることなくグリコーゲン合成酵素の活性を上昇させる糖尿病治療薬を提供することができる。
グリコーゲン合成酵素の活性測定方法の一例の概略図である。 様々な感染多重度における、コントロール（ＬａｃＺ）及び変異型グリコーゲン合成酵素２（ＡＳ−５Ａ及びＡＡ−５Ａ）のグルコース産生量を示すグラフである。 変異型グリコーゲン合成酵素２（ＡＳ−５Ａ）を高発現させたマウスに対する経口ブドウ糖負荷試験の結果を表すグラフである。
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
（グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物のスクリーニング方法）
本発明の第一のグリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物のスクリーニング方法は、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇが存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）（ａ）工程において測定された活性が、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い候補化合物を選択する工程と、を備える。
細胞内にはグリコーゲン合成酵素に影響を与える因子が数多く存在する。例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３はグリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性型に変換する。したがって、細胞内でグリコーゲン合成酵素の活性を測定し、候補化合物の存在によりその活性が上昇した場合、候補化合物がグリコーゲン合成酵素を直接活性化しているのか、グリコーゲン合成酵素の活性を抑制している因子を阻害しているのかの区別ができない。そこで、本発明のスクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子（グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇ）が存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定している。このようにして活性を測定することにより、グリコーゲン合成酵素に直接作用して活性を上昇させる候補化合物のみを選択することが可能である。
グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子が存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定する方法としては、具体的には以下の方法が挙げられる。
グリコーゲン合成酵素によるＵＤＰ（ウリジン ５’−二リン酸）の生成をピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼとカップルさせ、減少するＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を測定することにより、グリコーゲン合成酵素の活性を測定することができる。この測定方法の概略を図１に示す。まず、最初の反応として、グリコーゲン合成酵素により、グリコーゲン及びＵＤＰ−グルコースから、グルコースがひとつ付加したグリコーゲン及びＵＤＰが生成する。次に、ピルビン酸キナーゼにより、ＵＤＰ及びホスホエノールピルビン酸から、ＵＴＰ及びピルビン酸が生成する。最後に、乳酸デヒドロゲナーゼにより、ピルビン酸及びＮＡＤＨから乳酸及びＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が生成する。すなわち、グリコーゲン合成酵素の反応が進行するたびにＮＡＤＨが消費されるため、ＮＡＤＨの減少量がグリコーゲン合成酵素の活性を反映する。ＮＡＤＨの定量は、３４０ｎｍにおける吸光度、又は、蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、検出波長：４６０ｎｍ）を測定することにより行うことができる。
より具体的には、まず、グリコーゲン合成酵素及びＵＤＰ−グルコースを除いた酵素、基質、補因子（ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリコーゲン、ホスホエノールピルビン酸、ＮＡＤＨ、ＭｇＣｌ２等）等を添加したバッファー（トリス−塩酸バッファー等）を調製する。このバッファーに、候補化合物、グリコーゲン合成酵素及びＵＤＰ−グルコースを添加し、酵素反応を開始させる。所定時間、所定温度、酵素反応させた後（例えば、３０℃で６０分間）、反応液の吸光度（３４０ｎｍ）又は蛍光強度（励起波長：３４０ｎｍ、検出波長：４６０ｎｍ）を測定してＮＡＤＨを定量することにより、グリコーゲン合成酵素の活性が測定できる。当業者であれば、反応条件（添加物の種類及び量、反応温度、反応時間等）を適宜調整することが可能である。
候補化合物を添加した場合のグリコーゲン合成酵素の活性が、候補化合物を添加しなかった場合のグリコーゲン合成酵素の活性よりも高かった場合、その候補化合物は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物と判定することができる。
また、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子が存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定する別の方法としては、例えば以下の方法がある。グリコーゲン合成酵素により、グリコーゲン及びＵＤＰ−［１４Ｃ］グルコースから、［１４Ｃ］グリコーゲン及びＵＤＰを生成させ、エタノール沈殿によりグリコーゲンをペレットとして回収し、液体シンチレーションカウンター等によりペレットの放射線量を定量する。放射線量は、グリコーゲン合成酵素の活性を反映している。
次に、本発明の第二のグリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物のスクリーニング方法について説明する。第二のスクリーニング方法は、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物との結合定数を測定する工程と、（ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、結合定数が所定値以上の候補化合物を選択する工程と、を備える。
本スクリーニング方法では、結合実験を行い、グリコーゲン合成酵素と結合しうる化合物のみを選択しているため、グリコーゲン合成酵素に直接作用して、その活性を上昇させる化合物のみを選択することが可能である。
本スクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する方法は特に限定されず、グリコーゲン合成酵素の活性を抑制する因子が存在する条件下で測定を行ってもよく（肝細胞等を用いた系）、前述したような、グリコーゲン合成酵素の活性を抑制する因子が存在しない条件下で測定を行ってもよい。
肝細胞等を用いた測定系として、細胞抽出液を用いて、ＵＤＰ−［１４Ｃ］−グルコースのグリコーゲンへの取込みを指標として、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する方法が挙げられる。ここで、細胞抽出液は、初代肝細胞、培養細胞、遺伝子導入された培養細胞のいずれでもよい。また、別の測定系として、初代肝細胞、培養細胞、遺伝子導入された培養細胞を用いて、培養液に［１４Ｃ］−グルコースを添加して細胞に取り込ませ、細胞内でのグリコーゲン合成酵素によるグリコーゲンへの取込みを指標として、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する方法が挙げられる。
グリコーゲン合成酵素と候補化合物との結合定数を測定するための結合実験は、当業者にとって公知の方法を用いることが可能である。結合定数（Ｋａ）が所定値以上である場合、グリコーゲン合成酵素と候補化合物とが結合し得ると推定できる。ここで所定値は、測定条件等により左右されるが、一般的には２×１０３Ｍ−１〜１×１０６Ｍ−１の範囲の数値であり、１×１０４Ｍ−１であることが好ましい。
結合実験の具体的な方法は、例えば、以下の通りである。Ｈｉｓ−タグなどのアフィニティータグを結合したグリコーゲン合成酵素をそのアフィニティータグと結合する樹脂をコートしたプレートなどに固定化する。次に、その系にグルコース−６−リン酸の放射ラベル体と候補化合物とを添加し、グリコーゲン合成酵素に対して競合させる。適切なバッファーで洗浄して非吸着ラベル体及び非吸着化合物を取り除いた後、系の放射活性を測定する。
候補化合物を添加した場合のグリコーゲン合成酵素の活性が、候補化合物を添加しなかった場合のグリコーゲン合成酵素の活性よりも高く、かつ、グリコーゲン合成酵素と候補化合物との結合定数が所定値以上である場合、その候補化合物は、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物と判定することができる。
次に、本発明の第三のグリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物のスクリーニング方法について説明する。第三のスクリーニング方法は、（ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、（ｂ）グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇからなる群から選択される１以上の酵素に対する候補化合物の活性調節作用を測定する工程と、（ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、（ｂ）工程においては活性調節作用を示さない候補化合物を選択する工程と、を備える。
本スクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する候補化合物の活性調節作用を測定して、かかる活性調節作用を示す候補化合物を除外するため、グリコーゲン合成酵素に直接作用して、その活性を上昇させる化合物のみを選択することが可能である。
本スクリーニング方法では、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する方法は特に限定されず、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子が存在する条件下で測定を行ってもよく、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子が存在しない条件下で測定を行ってもよい。
グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する候補化合物の活性調節作用を測定する方法は、当業者にとって公知の方法を用いることが可能である。活性調節作用を測定し、阻害率又は活性化率が所定値以下の場合、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対して活性調節作用（阻害作用又は活性化作用）を示さない候補化合物とみなせる。
あるいは、グリコーゲン合成酵素に対する候補化合物の活性化作用が、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する候補化合物の活性調節作用の１００倍の選択性を示す場合に、当該候補化合物をグリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対して活性調節作用を示さない候補化合物とみなせる。すなわち、グリコーゲン合成酵素に対する候補化合物のＥＣ５０（５０％有効濃度）が、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する候補化合物のＥＣ５０又はＩＣ５０（５０％阻害濃度）の１００倍以上である場合に、当該候補化合物をグリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対して活性調節作用を示さない候補化合物とみなせる。
グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する候補化合物の活性調節作用の測定は、当該因子の活性を測定する系（以下に具体例を示す）に候補化合物を添加した場合の活性の変化を測定することにより可能である。
グルコース−６−ホスファターゼの活性は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。グルコース−６−ホスファターゼによりグルコース−６−リン酸をグルコースに変換する。さらに、ヘキソキナーゼによりグルコースをグルコース−６−リン酸に変換し、その際にＡＴＰから生じるＡＤＰをピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼの反応にカップルさせ、減少するＮＡＤＨを測定する。
ヘキソキナーゼの活性は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。ヘキソキナーゼによりグルコース及びＡＴＰからグルコース−６−リン酸を産生させる。生成物であるグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応にカップルさせ、生成するＮＡＤＨを測定する。
グリコーゲンホスホリラーゼの活性は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。グリコーゲンホスホリラーゼにより、グリコーゲン及び無機リン酸からグルコース−１−リン酸を産生させる。生成物であるグルコース−１−リン酸をホスホグルコムターゼによりグルコース−６−リン酸に変換し、さらにグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより６−ホスホグルコン酸に変換し、この反応で生成するＮＡＤＨを測定する。
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３の活性は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。グリコーゲン合成酵素を基質として、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、ＭｇＣｌ２及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３をインキュベートする。反応後、フィルターにタンパク質を吸着させ適切なバッファーで洗浄後、フィルターの放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。
プロテインホスファターゼ１Ｇの活性は、例えば、以下の方法で測定することが可能である。ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として、ＭｇＣｌ２及びプロテインホスファターゼ１Ｇをインキュベートし、生成するｐ−ニトロフェノールを測定する（４１０ｎｍにおける吸光度を測定）。
候補化合物を添加した場合のグリコーゲン合成酵素の活性が、候補化合物を添加しなかった場合のグリコーゲン合成酵素の活性よりも高く、かつ、グリコーゲン合成酵素の活性調節に関与する因子に対する活性調節作用を示さない場合、その候補化合物はグリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物と判定することができる。
（グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物を有効成分として含有する糖尿病治療薬）
本発明のスクリーニング方法により、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物を選択することができる。そして、本発明の糖尿病治療薬は、かかる化合物を有効成分として含有する。本発明の糖尿病治療薬の投与形態としては各種の形態を選択でき、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の経口剤、例えば溶液、懸濁液等の殺菌した液状の非経口剤等が挙げられる。
固体の製剤は、そのまま錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は粉末の形態として製造することもできるが、適当な添加物を使用して製造することもできる。該添加物としては、例えば乳糖、ブドウ糖等の糖類、例えばトウモロコシ、小麦、米等の澱粉類、例えばステアリン酸等の脂肪酸、例えばメタケイ酸ナトリウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム等の無機塩、例えばポリビニルピロリドン、ポリアルキレングリコール等の合成高分子、例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、例えばステアリルアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール類、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の合成セルロース誘導体、その他、水、ゼラチン、タルク、植物油、アラビアゴム等通常用いられる添加物等が挙げられる。
これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末等の固形製剤は、一般的には０．１〜１００重量％、好ましくは５〜１００重量％の有効成分を含むことができる。液状製剤は、水、アルコール類又は例えば大豆油、ピーナツ油、ゴマ油等の植物由来の油等液状製剤において通常用いられる適当な添加物を使用し、懸濁液、シロップ剤、注射剤等の形態として製造することができる。特に、非経口的に投与する場合の適当な溶剤としては、例えば注射用蒸留水、塩酸リドカイン水溶液（筋肉内注射用）、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、静脈内注射用液体（例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム等の水溶液）、電解質溶液（例えば点滴静注、静脈内注射用）等又はこれらの混合溶液が挙げられる。また、経口投与の懸濁剤又はシロップ剤等の液剤は、０．５〜１０重量％の有効成分を含むことができる。
グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物の実際に好ましい投与量は、使用される化合物の種類、配合された組成物の種類、適用頻度および治療すべき特定部位および患者の病状によって適宜増減することができる。例えば、一日当りの成人一人当りの投与量は、経口投与の場合、０．１ないし１０００ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当り０．０１ないし５００ｍｇである。なお、投与回数は、投与方法および症状により異なるが、単回又は２ないし５回に分けて投与することができる。
（核酸、ベクター及びタンパク質）
本発明の核酸は、配列表の配列番号１１に記載の塩基配列からなり、本発明のベクターは本発明の核酸が挿入されている。また、本発明のタンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる。本発明の核酸は、配列番号１１に記載の塩基配列に限定されるものではなく、配列番号１２に記載のアミノ酸配列をコードするものすべてを包含する。
配列番号１１に記載の塩基配列からなる核酸は、ヒトのグリコーゲン合成酵素２の変異体（配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードしている。この変異体は、グリコーゲン合成酵素２が有する７つのセリンリン酸化部位のうち、ｓｉｔｅ２，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５の６つのセリン残基がアラニン残基に置換されている（それぞれ、配列番号１２の８、６４１、６４５、６４９、６５３及び６５７番目のアミノ酸残基に相当する。）。リン酸化部位を欠いたこの変異体は、リン酸化されて不活性型になることがなく常時活性型となり、生体内に存在するキナーゼの影響を受けることなく常にグリコーゲン合成を行うことが可能となる。したがって、本発明の核酸を用いて糖尿病の遺伝子治療を行うことが可能であり、また、本発明のタンパク質は糖尿病治療薬として用いることが可能である。
本発明の別の核酸は、配列表の配列番号１３に記載の塩基配列からなり、本発明のベクターは本発明の核酸が挿入されている。また、本発明のタンパク質は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる。本発明の核酸は、配列番号１３に記載の塩基配列に限定されるものではなく、配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードするものすべてを包含する。
配列番号１３に記載の塩基配列からなる核酸は、ヒトのグリコーゲン合成酵素２の変異体（配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードしている。この変異体は、グリコーゲン合成酵素２が有する７つのセリンリン酸化部位（ｓｉｔｅ２，２ａ，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５）のすべてのセリン残基がアラニン残基に置換されている（それぞれ、配列番号１４の８、１１、６４１、６４５、６４９、６５３及び６５７番目のアミノ酸残基に相当する。）。リン酸化部位を欠いたこの変異体は、リン酸化されて不活性型になることがなく常時活性型となり、生体内に存在するキナーゼの影響を受けることなく常にグリコーゲン合成を行うことが可能となる。したがって、本発明の核酸を用いて糖尿病の遺伝子治療を行うことが可能であり、また、本発明のタンパク質は糖尿病治療薬として用いることが可能である。
本発明の核酸は、ヒトのグリコーゲン合成酵素２のｃＤＮＡを部位特異的突然変異法で改変することにより、調製することができる。より具体的には、例えば、まず、ヒト肝臓ｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行い、得られる増幅産物を適当なベクターにサブクローニングする。次に、市販の部位特異的突然変異誘発キット等を利用して、上記セリン残基をコードするコドンを、アラニンをコードするコドンに置換することにより、本発明の核酸が得られる。
本発明の核酸を治療用ベクターに組み込むことにより、糖尿病の遺伝子治療を行うことが可能である。治療用ベクターとしては、特に限定されず、ウイルスベクター及び非ウイルスベクター（プラスミドベクター）のいずれであってもよい。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、センダイウイルス等から誘導される組み換えウイルスベクターを用いることが可能である。上記ベクターに適当なプロモーターや複製起源、選択マーカー、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の形質発現に関する配列を導入する。
このように上記ベクターに組み込まれた本発明の核酸は、通常の手法により遺伝子治療薬として使用できる。すなわち、組み換えウイルスベクターを治療の標的細胞（例えば、肝細胞）に接触させるか、又はプラスミドベクターをリン酸カルシウム法、リポソーム法、エレクトロポレーション法等により標的細胞に導入すればよい。
本発明のタンパク質は、本発明の核酸をベクターに組み込み、大腸菌等の宿主に導入した後、培地中で宿主細胞を培養し、当該核酸を発現させることによって得られる。宿主細胞を培養後、必要に応じて細胞を溶解した後、塩析、透析、限外ろ過、ゲルろ過、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、電気泳動等の慣用技術により本発明のタンパク質を精製することができる。
本発明のタンパク質は糖尿病治療薬として用いることができる。すなわち、本発明の糖尿病治療薬は、本発明のタンパク質を有効成分として含有する。糖尿病治療薬の投与形態は特に限られないが、主として注射剤等の非経口投与が一般的である。製剤化は常法にしたがって行うことができ、該糖尿病治療薬は、安定化剤、可溶化剤、防腐剤、酸化防止剤等の添加剤を必要に応じて含有してよい。
本発明のタンパク質の好ましい投与量は、患者の病状等によって適宜増減することができる。例えば、一日当りの成人一人当りの投与量は、非経口投与の場合、１日当り本発明のタンパク質として１μｇないし１００ｍｇである。なお、投与回数は、投与方法および症状により異なるが、単回又は２ないし５回に分けて投与することができる。
以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（製造例１：pcDNA3.1(-)/AS-5A GYS2プラスミドの作製）
（１）グリコーゲン合成酵素２（ＧＹＳ２）遺伝子のクローニング
ヒト肝臓ｃＤＮＡ（liver cDNA(S-1202), Multiple tissue cDNA panel, CLONTEC）をテンプレートにして、ＧＹＳ−２−ＦＷ（配列番号１）及びＧＹＳ−２−ＲＶ（配列番号２）をプライマーにして、PfuTurbo DNA polymerase（STRATAGENE）を用いてＰＣＲを行った（９４℃１分間、６０℃１分、７２℃３分、２５サイクル）。得られた増幅断片をHindIII-EcoRIで処理した後、pFLAG.CTC（SIGMA）にサブクローニングした。得られたプラスミドをpFLAG.CTC/GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ−２−ＦＷ：catatgaagcttcgaggccgatccctctctgta
ＧＹＳ−２−ＲＶ：acccgggaattcgttcttatattcaccatgcagctt
pFLAG.CTC/GYS2をテンプレートにして、ＧＹＳ２−Ｖ−ＦＷ（配列番号３）及びＧＹＳ２−Ｖ−ＲＶ（配列番号４）をプライマーにしてＰＣＲを行った。得られた増幅断片をEcoRI-HindIIIで処理した後、pcDNA3.1(-)にサブクローニングした。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ−Ｖ−ＦＷ：ttttttgaattccgccaccatgcttcgaggccgatccctctctgtaac
ＧＹＳ−Ｖ−ＲＶ：ttttttaagctttcagttcttatattcaccatgcagc
（２）Ｓｉｔｅ２のＳｅｒのＡｌａへの置換
pcDNA3.1(-)/GYS2をテンプレートにして、ＧＹＳ２−Ｖ−ＦＷ−Ｓｉｔｅ２（配列番号５）及びＧＹＳ２−Ｖ−ＲＶ−Ｓｉｔｅ２（配列番号６）をプライマーにしてＰＣＲを行った。得られた増幅断片をEcoRI-HindIIIで処理した後、pcDNA3.1(-)にサブクローニングした。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/AS-5S GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ２−Ｖ−ＦＷ−Ｓｉｔｅ２：ttttttgaattccgccaccatgcttcgaggccgatccctcgctgtaacatcc（下線部分がＳｉｔｅ２に相当）
ＧＹＳ２−Ｖ−ＲＶ−Ｓｉｔｅ２：ttttttaagctttcagttcttatattcaccatgcagc
（３）Ｓｉｔｅ３ａ及び３ｂのＳｅｒのＡｌａへの置換
pcDNA3.1(-)/AS-5S GYS2をテンプレートにして、ＧＹＳ２−３ａ，３ｂ−ｓｅｎｓｅ（配列番号７）及びＧＹＳ２−３ａ，３ｂ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号８）をプライマーにして、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATGENE）を用いて、変異導入を行った。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/AS-AASSS GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ２−３ａ，３ｂ−ｓｅｎｓｅ：agaaggatttaaatatcccaggccttccgctgtaccacctgctccttcaggg（下線部分が、順にＳｉｔｅ３ａ及び３ｂに相当）
ＧＹＳ２−３ａ，３ｂ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ccctgaaggagcaggtggtacagcggaaggcctgggatatttaaatccttct（下線部分が、順にＳｉｔｅ３ｂ及び３ａに相当）
（４）Ｓｉｔｅ３ｃ，４及び５のＳｅｒのＡｌａへの置換
pcDNA3.1(-)/AS-AASSS GYS2をテンプレートにして、ＧＹＳ２−３ｃ，４，５−ｓｅｎｓｅ（配列番号９）及びＧＹＳ２−３ｃ，４，５−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号１０）をプライマーにして、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて、変異導入を行った。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/AS-5A GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ２−３ｃ，４，５−ｓｅｎｓｅ：cctgctccttcaggggctcaggcctccgctcctcagagcgctgatgtggaagatgaag（下線部分が、順にＳｉｔｅ３ｃ、４及び５に相当）
ＧＹＳ２−３ｃ，４，５−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：cttcatcttccacatcagcgctctgaggagcggaggcctgagcccctgaaggagcagg（下線部分が、順にＳｉｔｅ５、４及び３ｃに相当）
以上の操作で得られたプラスミドpcDNA3.1(-)/AS-5A GYS2は、ヒトＧＹＳ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のセリンリン酸化部位のうち、Ｓｉｔｅ２，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５をコードするコドンをＧＣＴ（Ａｌａコドン）に置換した変異型ヒトＧＹＳ２のＯＲＦを保有する。
（製造例２：pcDNA3.1(-)/AA-5A GYS2プラスミドの作製）
（１）Ｓｉｔｅ２及び２ａのＳｅｒのＡｌａへの置換
製造例１で得たpcDNA3.1(-)/GYS2をテンプレートにして、ＧＹＳ２−Ｖ−ＦＷ−Ｓ２，２ａ（配列番号１５）及びＧＹＳ２−Ｖ−ＲＶ−Ｓ２，２ａ（配列番号１６）をプライマーにしてＰＣＲを行った。得られた増幅断片をEcoRI-HindIIIで処理した後、pcDNA3.1(-)にサブクローニングした。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/AA-5S GYS2と命名した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
ＧＹＳ２−Ｖ−ＦＷ−Ｓ２，２ａ：ttttttgaattccgccaccatgcttcgaggccgatccctcgctgtaacagctctgggtggg（下線部分が順にＳｉｔｅ２、２ａに相当）
ＧＹＳ２−Ｖ−ＲＶ−Ｓ２，２ａ：ttttttaagctttcagttcttatattcaccatgcagc
（２）Ｓｉｔｅ３ａ及び３ｂのＳｅｒのＡｌａへの置換及びＳｉｔｅ３ｃ，４及び５のＳｅｒのＡｌａへの置換
pcDNA3.1(-)/AA-5S GYS2をテンプレートにして、製造例１の（３）及び（４）に記載の方法と同様の方法により、Ｓｉｔｅ３ａ、３ｂ、３ｃ，４及び５のＳｅｒをＡｌａへ置換した。得られたプラスミドをpcDNA3.1(-)/AA-5A GYS2と命名した。このプラスミドは、ヒトＧＹＳ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のすべてのセリンリン酸化部位（Ｓｉｔｅ２，２ａ，３ａ，３ｂ，３ｃ，４及び５）をコードするコドンをＧＣＴ（Ａｌａコドン）に置換した変異型ヒトＧＹＳ２のＯＲＦを保有する。
（製造例３：組み換えアデノウイルスの作製）
まず、アデノウイルスベクターであるpCosAdv-CMVを以下の方法で作成した。Morsyらの方法（J. Clin. Invest., 92, 1580-1586 (1993））によりE1及びE3領域を欠失させたアデノウイルス由来のゲノム配列を調製した。CMVプロモーターとBGH-ployA付加シグナル配列の間に、目的の遺伝子を導入する為の制限酵素部位（SwaI)を導入した。Charomid 9-20コスミドベクター（WAKO）にPacI及びPmeI部位を導入し、アデノウイルス由来のゲノム配列をPacI部位に導入し、pCosAdv-CMVベクターを作製した。
pCosAdv-CMVをSwaIで消化し、末端をＣＩＡＰ（仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼ）により脱リン酸化した。製造例１及び２で作製したpcDNA3.1(-)/AS-5A GYS2及びpcDNA3.1(-)/AA-5A GYS2をEcoRV-HindIIIで処理し、得られたＤＮＡ断片をクレノーフラグメントにより平滑化し、前記アデノウイルスベクターにサブクローニングした。In vitro Packaging Kit LAMBDA INN（ニッポンジーン）により大腸菌に形質転換し、目的の遺伝子が正しい向きに入った組み換えアデノウイルスプラスミドを精製した。精製したプラスミドＤＮＡをPacIで完全消化してウイルスＤＮＡを切り出し、２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、２９３細胞を回収し、凍結融解し、遠心分離し、上清のウイルス液を得た。さらに、このウイルス液を２９３細胞に感染させてウイルスの増幅を繰り返し、大量のウイルス液を得た（それぞれ、Ａｄ−ＡＳ−５Ａ、Ａｄ−ＡＡ−５Ａ）。コントロールとして、ｌａｃＺを導入したアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌａｃＺ）を作製し、同様の方法で大量のウイルス液を得た。また、比較のために、pcDNA3.1(-)/GYS2を導入したアデノウイルスベクターを作製し、同様の方法で大量のウイルス液を得た。
得られたウイルス液は、ＣｓＣｌ密度勾配遠心により精製し、透析バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）に対して透析を行った。回収したウイルス液は使用時まで−８０℃で保存した。
（試験例１：グルコース産生量の測定）
門脈灌流法により、ラット（７〜９週齢、雄性）から肝細胞を分離し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む高グルコースＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁させ、１００ｍｍコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に３．５×１０６ｃｅｌｌ／１０ｍＬの濃度で細胞を播いた。３時間後、無血清の低グルコースＤＭＥＭに培地を置換し、組み換えアデノウイルスを２時間感染させた。１０％ＦＢＳを含む低グルコースＤＭＥＭに培地を置換し、一晩培養した。
１０ｍＭのジヒドロキシアセトンを含むグルコースフリーＤＭＥＭに培地を置換し、３〜６時間インキュベートした後、培地中に放出されたグルコース量をデタミナーＧＬＥ（協和）にて測定した。この測定値は、主に糖新生の基質前駆物質であるジヒドロキシアセトンからのグルコース産生量、つまり、糖新生系によるグルコース産生量に相当する。
図２は、様々な感染多重度における、コントロール（ＬａｃＺ）及び変異型ＧＹＳ２（ＡＳ−５Ａ及びＡＡ−５Ａ）のグルコース産生量を示すグラフである。図２から、変異型ＧＹＳ２はいずれもコントロールに比べてグルコース産生量が減少しているのが分かる。コントロールを基準にしたグルコース産生の減少率は、感染多重度が２、１０及び２０の場合に、変異型ＧＹＳ２（ＡＳ−５Ａ）でそれぞれ１１％、５４％及び５８％であり、変異型ＧＹＳ２（ＡＡ−５Ａ）でそれぞれ４％、２６％及び６２％であった。
一方、野生型ＧＹＳ２を過剰発現させた場合には、コントロールと比較してもグルコース産生量はほとんど変化しなかった。すなわち、グルコース産生の減少率は、感染多重度が２、１０及び２０の場合に、それぞれ１５％、１３％及び９％であった。
野生型ＧＹＳ２を過剰発現させても、グルコース産生量はほとんど変化しないという結果は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３等によってグリコーゲン合成酵素がリン酸化を受けて不活性化されていることを示唆している。一方、変異型ＧＹＳ２（ＡＳ−５Ａ及びＡＡ−５Ａ）はリン酸化部位が存在しないため、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３等が存在しても不活性化されないため、グルコース産生量が減少しているものと考えられる。
（試験例２）
アデノウイルスベクターを用いてマウスの肝臓に変異型ＧＹＳ２（ＡＳ−５Ａ）を高発現させ、これにより肝ＧＹＳ２活性を大きく上昇させた条件下で経口ブドウ糖負荷試験を実施し、耐糖能が改善されるかを検討した。
各アデノウイルスは、ビークルとしてＰＢＳを使用し、５×１０９ｐｆｕ／マウスとなるように希釈した。免疫抑制剤は以下の要領で調製した。プレドニゾンにエタノール（最終容量の３．７５％）を添加してなじませ、そこにシクロスポリンＡ（サンディミュン注射液）を加えてよく撹拌した。その後、最終容量になるまで、滅菌生理食塩水を加えてさらに撹拌した。
（１）免疫抑制剤の投与開始
アデノウイルス投与の２日前から、１日１回、免疫抑制剤の腹腔内投与を開始した。アデノウイルス投与の２日前及び１日前は、２．５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾン＋８ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを投与し、アデノウイルス投与当日は、２．５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾン＋１６ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを投与した。また、アデノウイルス投与の１日後及び２日後は、２．５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾン＋４ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを投与した。
（２）アデノウイルスの投与
アデノウイルス投与前日に、自由摂餌下の血糖値及び体重を測定した。まず、ヘパリン処理したキャピラリーを用いて、覚醒下のマウスの眼窩静脈より少量の血液を採取し、標準校正したアントセンスＩＩ（バイエルメディカル）を用いて血糖値を測定した。
アデノウイルス投与当日、マウスを保定器に入れ、２９Ｇ針付シリンジを用いて、ビークル、Ａｄ−ＬａｃＺ又はＡｄ−ＡＳ−５Ａ（製造例３で作製）を尾静脈から静脈内投与した。アデノウイルスの投与量は、いずれも５×１０９ｐｆｕ／マウスであった。
（３）投与２日後：血糖値測定
投与２日後の午前、自由摂餌下にて、全てのマウスの血糖値を測定した。マウスを保定器に入れ、尻尾から１滴の血液を採取し、標準校正したアントセンスＩＩで血糖値を測定した。
（４）投与３日後：経口ブドウ糖負荷試験
投与３日後の午前、絶食時のマウスの体重を測定し、午後に行う経口ブドウ糖負荷試験のグルコース投与量（１ｇ／１０ｍＬ／ｋｇ）を決定した。午後、マウスの尾採血を行い、試験直前の血糖値を測定した。次に、１ｇ／１０ｍＬのグルコース液（ビークルは０．５％メチルセルロース水溶液）を１０ｍＬ／ｋｇ経口投与し、その３０、６０、９０及び１２０分後に、血糖値を測定した。血糖値の測定方法は上記（３）に記載した通りである。
（５）血漿グルコース測定
グルコース測定キット「デタミナーＧＬ−Ｅ」（協和メディックス）を用いて、血漿グルコースを測定した。血漿５μＬを生理食塩水で２０倍に希釈し、スタンダード及び検体を２０μＬずつ９６ウェルプレートに分注した。試薬１及び試薬２を等量混合し、各ウェルに１５０μＬずつ分注し、３７℃で３０分間インキュベートした後、５８５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度測定はＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ ３４０ＰＣ（モレキュラーデバイス社）を使用し、機器に付属のソフトウェアＳＯＦＴｍａｘＰｒｏ３．１．１を用いて解析した。得られた結果をＡＵＣ（血中濃度−時間曲線下面積；０−１２０分）で示した（図３）。図３から明らかなように、ＡＳ−５Ｓを高発現させたマウスでは耐糖能が改善された。
本発明のスクリーニング方法によれば、グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物が得られる。かかる化合物は、糖尿病の治療に用いることができる。

Claims (15)

  1. グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物を有効成分として含有する糖尿病治療薬。
  2. グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇが存在しない条件下でグリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、
    （ｂ）（ａ）工程において測定された活性が、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い候補化合物を選択する工程と、
    を備える方法。
  3. グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、
    （ｂ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物との結合定数を測定する工程と、
    （ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、結合定数が所定値以上の候補化合物を選択する工程と、
    を備える方法。
  4. グリコーゲン合成酵素を直接活性化する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）グリコーゲン合成酵素と候補化合物を接触させ、グリコーゲン合成酵素の活性を測定する工程と、
    （ｂ）グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３及びプロテインホスファターゼ１Ｇからなる群から選択される１以上の酵素に対する候補化合物の活性調節作用を測定する工程と、
    （ｃ）（ａ）工程において、候補化合物を用いない他は（ａ）工程と同様にして測定された活性よりも高い活性を示し、（ｂ）工程においては活性調節作用を示さない候補化合物を選択する工程と、
    を備える方法。
  5. グリコーゲン合成酵素がグリコーゲン合成酵素２である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
  6. 配列番号１１に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
  7. 請求項６に記載の核酸が挿入されたベクター。
  8. 遺伝子治療用である、請求項７に記載のベクター。
  9. 配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質。
  10. 請求項９に記載のタンパク質を有効成分として含有する糖尿病治療薬。
  11. 配列番号１３に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
  12. 請求項１１に記載の核酸が挿入されたベクター。
  13. 遺伝子治療用である、請求項１２に記載のベクター。
  14. 配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質。
  15. 請求項１４に記載のタンパク質を有効成分として含有する糖尿病治療薬。
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