JP2002512522A

JP2002512522A - ヒト細胞遺伝子を下降調節することによるヒト免疫不全ウイルス感染を阻害するための組成物および方法

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Publication number: JP2002512522A
Application number: JP50104699A
Authority: JP
Inventors: エイ．ホルツマイヤー、ターニャ; ジェイ．ダン、ステファン; デイン、アンドリュー
Original assignee: サブサイダリーナンバースリーインコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2002-04-23
Also published as: IL133159A0; US20030229043A1; EP1015630A4; AU745745B2; EP1015630A1; US6537972B1; CA2291881A1; AU7813398A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス感染を抑制する治療剤のデザインのための細胞標的としての多数のヒト遺伝子の同定に関する。これらの遺伝子は、これらの遺伝子の発現が下降調節（ダウンレギュレート）される細胞におけるＨＩＶ感染の阻害によって証明されるように、ＨＩＶの複製に必要であるように見える産物をコードする。加えて、本発明は、ＨＩＶ感染を抑制するための治療標的としてのさらなる細胞遺伝子を同定する方法、およびＨＩＶのさらなる阻害剤を選択するためのスクリーニングアッセイにおけるかかる細胞遺伝子およびそれらがコードされた産物の使用方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト細胞遺伝子を下降調節することによるヒト免疫不全ウイルス感染を阻害するための組成物および方法１．序文本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染を抑制する治療剤のデザインのための細胞標的としての多数のヒト遺伝子の同定に関する。これらの遺伝子は、これらの遺伝子の発現が下降調節（ダウンレギュレート）される細胞におけるＨＩＶ感染の阻害によって証明されるように、ＨＩＶの複製に必要であるように見える産物をコードする。従って、これらの遺伝子およびそれらのコードされた産物の阻害は、ＨＩＶ感染の治療および／または予防のための治療剤として使用することができる。加えて、本発明は、ＨＩＶ感染についての治療標的としてのさらなる細胞遺伝子を同定する方法、およびＨＩＶのさらなる阻害剤を選択するためのスクリーニングアッセイにおけるかかる細胞遺伝子およびそれらがコードされた産物の使用方法にも関する。２．発明の背景２．１．ヒト免疫不全ウイルス後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主要な原因は、ＨＩＶであることが示されている（Barre-Sinoussiら， 1983，Science 220:868-870、Galloら，1984，Science 224：500-503）。ＨＩＶは、免疫系の重要な細胞タイプに感染し、それらの枯渇させることによって個体において免疫不全を引き起こす。これは、今度は、日和見感染、腫瘍増殖および死に導く。ＨＩＶは、レトロウイルスのレンチウイルス科のメンバーである（Teichら，1 984，RNA Tumor Viruses，Weissら編,CSH-Press，949-956頁）。レトロウイルスは、ジプロイド、一本鎖ＲＮＡゲノムを含有し、ウイルスによりコードされた逆転写酵素、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによって産生されたＤＮＡ中間体を介して複製する小さなエンベロープ付きのウイルスである（Varmus，1988，Sc ience 240:1427-1439）。ＨＩＶの少なくとも２つの区別されるサブタイプがある：ＨＩＶ−１（Barre-Sinoussiら，1983，Science 220:868-870、Galloら，19 84，Science 224:500-503）およびＨＩＶ−２（Clavelら，1986，Science 233:3 43-346、Guyaderら，1987，Nature 326:662-69）。遺伝的不均一性がこれらのＨＩＶサブタイプの各々内に存在する。ＣＤ４⁺Ｔ細胞はＨＩＶ感染の主要な標的である。何故ならば、ＣＤ４細胞表面蛋白質はＨＩＶ付着のための細胞受容体として作用するからである（Dalgleis hら，1984，Nature 312:763-767、Klatzmannら，1984，Nature 312:767-768、Ma ddonら，1986，Cell 47:333-348）。細胞へのウイルス侵入はＣＤ４細胞受容体分子（McDoug alら，1986,Science 231，382-385、Maddonら，1986，Cell 47:333-348）と結合するウイルスのｇｐ１２０蛋白質に依存している。２．２ＨＩＶ治療ＨＩＶ感染は汎流行性であって、ＨＩＶ−関連病は世界的な健康問題となった。抗−ＨＩＶ治療様式のデザインにおけるかなりの努力にも拘わらず、これまでに、ＡＩＤＳに対する成功した予防的または治療的方法はない。しかしながら、ＨＩＶのライフサイクルのいくつかの段階は治療的介入のための優れた標的として考えられてきた（Mitsuyaら，1991，FASEB J. 5:2369-2381）。例えば、ウイルスによりコードされた逆転写酵素は薬物開発の主要な焦点であった。ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、およびｄｄＴの様な２’，３’−ジデオキシヌクレオチドアナログを含めた多数の逆転写酵素−標的薬物がＨＩＶに対して活性であることが示されてきた（Mitsuyaら，1990，Science 249:1533-1544）。有益ではあるが、これらのヌクレオチドアナログは、恐らくは、薬物耐性ＨＩＶ突然変異体の迅速な出現のために、治癒的ではない（Landerら，1989，Science 243:1731-1734）。加えて、これらの薬物は、しばしば、骨髄抑制、嘔吐、および肝臓異常の様な毒性的な副作用を呈する。標的化されてきたＨＩＶライフサイクルのもう１つの段階は、ＨＩＶ感染の最も初期の段階、細胞へのウイルス侵入である。このアプローチは、主に、いくつかのＨＩＶ−１株によるＣＤ４⁺ Ｔ細胞の感染を阻害するための可溶性組換えＣＤ４蛋白質を利用してきた（Smi thら，1987，Science 238:1704-1707）。しかしながら、ある種の一次ＨＩＶ単離体は、組換えＣＤ４による阻害に対して比較的感受性が低い（Daarら，1990，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87:6574-6579）。今日、可溶性組換えＣＤ４の臨床的トライアルは、決定的でない結果を生じてきた（Schooleyら，1990，Ann ，I nt．Med. 112:247-253、Kahnら，1990，Ann ．Int．Med. 112:254-261、Yarchoan ら，1989，Proc ．Vth Int．Conf．on AIDS，564頁，MCP 137）。加えて、ある種のウイルス蛋白質および酵素の非常に重要なウイルス−特異的二次プロセッシングを含むＨＩＶ複製の後期段階が、抗−ＨＩＶ薬物開発で標的とされてきた。後期段階プロセッシングはウイルスによりコードされたプロテアーゼの活性に依存しており、サキナビル（saquinavir）、リトナビル（ritonavi r）およびインジナビル（indinavir）を含めた薬物がこのプロテアーゼを阻害するために開発されてきた（Pettitら，1993，Persp ．Drug．Discov．Design 1:69 -83）。このクラスの薬物に関しては、薬物耐性ＨＩＶ突然変異体の出現も問題である、１つの阻害剤に対する耐性は、しばしば、他のプロテアーゼ阻害剤に対する交差耐性を付与する（Condraら，1995，Nature 374:569-571）。これらの薬物は、しばしば、悪心、味覚変化、口周辺感覚異常、脂肪沈積、下痢および腎石症のような毒性的な副作用を呈する。ヌクレオシドアナログおよびプロテアーゼ阻害剤の種々の組合せを用いるＨＩＶの抗ウイルス療法は、最近、単一薬物単独の使用よりも効果的であることが示されてきた（Torresら，1997，Infec ．Med. 14:142-160）。しかしながら、ウイルス負荷の有意な減少を達成する能力にも拘わらず、入手可能な薬物の組合せがＡＩＤＳに対して治癒的治療を提供するという証拠は今日無い。ＡＩＤＳに対する治療を開発するための他の優れたアプローチは、感染細胞への外因性遺伝子の送達を含む。１つのかかる遺伝子治療アプローチは、毒性遺伝子産物を導入してＨＩＶ−感染細胞を殺すための遺伝子工学的に作製されたウイルスベクターの使用を含む。もう１つの形態の遺伝子治療が、ウイルス複製を特異的に破壊することによって、細胞溶解からウイルス感染細胞を保護するために設計されている。ＲＮＡ−ベース（デコイ、アンチセンスおよびリボザイム）の、または蛋白質−ベース（トランス優性突然変異体（transdominant mutant））のＨＩＶ−１抗ウイルス剤の安定な発現は、ウイルスのライフサイクルのある段階を阻害できる。ＴＡＲまたはＲＲＥのデコイＲＮＡ（Sullengerら，1990，Cel l 63:601-608、Sullengerら，1991，J．Virol. 65:6811-6816、Lisziewiczら，1 993，New Biol. 3:82-89、Leeら，1994，J ．Virol. 68:8254-8264）、リボザイム（Sarverら， 1990，Science 247:1222-1225、Werasingheら，1991,J ．Virol. 65:5531-5534、 Dropulicら，1992，J ．Virol. 66:1432-144、Ojwangら，1992，Proc ．Natl．Aca d．Sci．U.S.A. 89:10802-10806、Yuら，1993，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 90:6340-6344、Yuら，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92:699-703、Yamadaら，1994，Gene Therapy 1:38-45）、ｇａｇ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｅｎｖのｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡ（Sezakielら，1991，J ．Virol. 65:468-472、Ch atterjeeら，1992，Science 258:1485-1488、Rhodesら，1990，J ．Gen．Virol． 71:1965、Rhodesら，1991，AIDS 5:145-151、Sczakielら，1992，J ．Virol．66: 5576-5581、Joshiら，1991，J ．Virol. 65:5524-5530）ならびに、Ｒｅｖ（Beve cら，1992，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 89:9870-9874）、Ｔａｔ（Pearson ら，1990，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 87:5079-5083、Modestiら，1991．N ew Biol. 3:759-768）、Ｇａｇ（Tronoら，1989，Cell 59:113-120）、Ｅｎｖ（ Bushschacherら，1995，J ．Virol. 69:1344-1348）およびプロテアーゼ（Junker ら，1996，J ．Virol. 70:7765-7772）を含めたトランス優性突然変異体のような多数の抗−ＨＩＶサプレッサーが報告されている。ＨＩＶ−１転写体と複合体化するまたはそれを隔離するようにアンチセンスポリヌクレオチドが設計されてきた（Holmesら，WO 93/11230、Lippsら，WO 94/10 302、 Kretschmerら，EP 594,881、およびChatterjeeら，1992，Science 258:1485）。さらに、リボザイムという酵素的に活性なＲＮＡがウイルス転写体を切断するのに使用されてきた。造血細胞系においてＨＩＶ−１に対する耐性を生じさせるためのリボザイムの使用が報告されている（Ojawangら，1992，Proc ．Ntl．Acad． Sci．USA 89:10802-06、Yamadaら，1994，Gene Therapy 1.38-45、Hoら，WO 94/ 26877、およびCechおよびSullenger，WO 95/13379）。予備臨床研究において、ＲｅｖＭ１０、トランス優性Ｒｅｖ蛋白質がＨＩＶ−感染個体のＣＤ４⁺細胞にエクス・ビボ（ex vivo）でトランスフェクトされ、ベクターのみでトランスフェクトされた細胞よりも優れた生存利益を付与することが示されている（Woffen dinら，1996，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 93:2889-2894）。２．３．ＨＩＶ複製に必要な細胞遺伝子細胞内病原体の進化の結果、その遺伝子および遺伝子産物と複数の細胞成分との相互作用が発達した。例えば、ウイルスと宿主細胞との相互作用は、ウイルスの特異的細胞受容体への結合、細胞膜を通しての移動、脱皮、ウイルスゲノムの複製、ウイルス遺伝子の転写などを含む。これらの事象の各々は細胞中で起こり、細胞成分との相互作用を含む。かくして、ウイルスのライフサイクルは、該細胞が許容的である場合のみ完了できる。ウイルスゲノムの複製および蛋白質合成のためのアミノ酸およびヌクレオチドの利用性、細胞のエネルギー状態、細胞性転写因子および酵素の存在は、全て、細胞中でウイルスの増殖に寄与する。その結果、部分的には、細胞成分は感染に対する宿主細胞の罹患性を決定し、新しい治療的介入の開発のための優れた標的として用いることができる。ＨＩＶの場合、この目的に向けて使用されてきた１つの細胞成分は、ＨＩＶ付着のための細胞表面分子、ＣＤ４である。最近、罹患性細胞へのＨＩＶ侵入は、ＣＤ４に加えて、第２の受容体、ケモカイン受容体（ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）の発現を要することを報告している（Moore，1997，Science 276:51-52）。ケモカイン受容体は、通常、その天然リガンドとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ− １βに結合する。ＨＩＶ感染の場合には、ＣＤ４はまず細胞表面のＨＩＶのｇｐ１２０に結合し、続いて、該複合体がケモカイン受容体に結合し、その結果、ウイルスが細胞に侵入する（Cohen，1997，Science 275:1261）。従って、ケモカイン受容体は、ＨＩＶ治療剤のデザインのためのさらなる細胞標的を表し得る。ＨＩＶ／ケモカイン受容体相互作用の阻害剤は、抗−ＨＩＶ剤としてテストされつつある。しかしながら、抗−ＨＩＶ治療剤のデザインのためのさらなる細胞標的、特にウイルスの細胞への侵入後におけるウイルス複製を破壊する細胞内標的の発見に対する要望が依然として存在する。３．発明の概要本発明は、ある種のヒト細胞遺伝子の発現および／または機能を下降調節（ダウンレギュレート）することによって、ＨＩＶ感染を阻害するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、感染する細胞においてＨＩＶ複製を阻害する多数のヒト細胞−由来ポリヌクレオチドに関する。単離されたポリヌクレオチドは細胞遺伝子の一部またはその成分に対応し、これを本明細書では遺伝子サプレッサーエレメント（ＧＳＥ）という。細胞遺伝子は、生産的ＨＩＶ感染に必要な細胞内産物をコードする。加えて、同じ細胞遺伝子およびそれらのコードされた産物の小分子の阻害剤も本発明の範囲内にある。また、本発明は、ＨＩＶ感染を抑制するための治療標的としてのさらなる細胞遺伝子を同定する方法、およびＨＩＶのさらなる阻害剤を選択するための、かかる細胞遺伝子およびそれらのコードされた産物の使用方法にも関する。本発明は、部分的には、ヒト細胞から単離されたポリヌクレオチドがＣＤ４⁺ 細胞系における潜伏性ＨＩＶ−１の活性化ならびに生産的ＨＩＶ感染を妨げることができ、およびかかるポリヌクレオチドがある種のヒト細胞遺伝子の断片に対応するという出願人の発見に基づく。その関係において、ＨＩＶ複製に関係するいずれかの細胞またはウイルスマーカーを用いて、かかるポリヌクレオチドまたはＧＳＥにつき選択することができる。かかるマーカーの例がＣＤ４であり、これは、特異的抗体を使用することによって便宜にはモニターされる。実質的な配列の同一性（９０−１００％）に基づくと、多数の単離されたＧＳＥは、ミトコンドリア酵素複合体、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの異なるサブユニットをコードするヒト細胞遺伝子の部分に対応する。加えて、この酵素の阻害剤は、新たに単離されたヒトＣＤ４⁺Ｔ細胞を含めた感染性宿主細胞においてＨＩＶ複製を阻害する。さらに、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、Ｍ２− タイプ・ピルベートキナーゼ、カルネキシン、ＡＤＰ−リボシル化因子３、真核生物の開始因子３、プロテインチロシンホスファターゼ、ヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼ、真核生物の開始因子４Ｂ、ＣＤ４４、ホスファチジルイノシトール３キナーゼおよび伸長因子１αをコードするヒト細胞遺伝子との実質的配列同一性（９０−１００％）を有するさらなるＧＳＥが選択されている。ＨＩＶ複製を阻害するように選択されたＧＳＥの内、いくつかはセンス向きで機能し、他方、他のものはアンチセンス向きで機能する。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、本発明のＧＳＥは、種々のメカニズムによって細胞遺伝子を下降調節（ダウンレギュレート）すると考えられる。ＧＳＥは、ポリペプチド産物をコードすることができるまたはできないＲＮＡ分子をコードすることによって、宿主細胞で発現される。センス向きにおけるＧＳＥは、トランス優性突然変異体またはＲＮＡデコイとしてそれらの効果を発揮する。トランス優性突然変異体は、優性的に野生型蛋白質の正常機能を競合的に阻害する発現されたポリペプチドである。ＲＮＡデコイはこれらの蛋白質を滴定する蛋白質結合部位である。アンチセンス向きのＧＳＥはアンチセンスＲＮＡ、すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドとしてそれらの効果を発揮することができる。これらのポリヌクレオチドはｍＲＮＡに結合し、該ｍＲＮＡの翻訳をプロックする。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、転写を阻害するＤＮＡレベルで直接的に作用することができる。ＧＳＥによる細胞遺伝子の下降調節（ダウンレギュレーション）は、次いで、ＨＩＶ複製に必要な細胞成分を除去し、その結果、ＨＩＶ感染を阻害する。限定されるものではないが、ＨＩＶ感染性細胞タイプへ医薬組成物としてのＧＳＥを導入することによるＨＩＶ治療および予防を含めた広範囲の使用が本発明に含まれる。例えば、ＨＩＶによって標的とされる主要な細胞集団であるＴ細胞、特にＣＤ４⁺Ｔ細胞にＧＳＥを導入することができる。別法として、ＧＳＥをインビトロで造血幹細胞に導入し、続いて、自己もしくは組織適合性受容者、さらには組織不適合受容者でさえにおいて植え付ける。別の実施形態において、ＨＩＶ感染に罹患性のいずれかの細胞を、インビボにてＧＳＥを直接導入（トランデュース）し、またはＧＳＥでトランスフェクトすることができる。さらに別の実施形態において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、Ｍ２−タイプ・ピルベートキナーゼ、カルネキシン、ＡＤＰ−リボシル化因子３、真核生物の開始因子３、プロテインチロシンホスフェート、ヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼ、真核生物の開始因子４Ｂ、ＣＤ４４、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよび伸長因子−１αの阻害剤をインビボで医薬組成物として使用してＨＩＶ感染を抑制することができる。４．図面の簡単な説明図１．ＣＤ４⁺○Ｍ１０．１のパーセントは、ＴＮＦ−α誘導の後に減少する。ＴＮＦ−誘導細胞、−■−；非誘導細胞、−◆−。図２．ＴＮＦ−α誘導後のＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を維持するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３１５のヌクレオチド配列（配列番号：１）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ６サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図３．１０００のＴＣＩＤ₅₀におけるＨＩＶ−１_SF ₂ での感染後のＣＦ−３１５配列（配列番号：１）を含有する細胞内ｐ２４⁺ＧＥＭ−ｓｓ細胞のパーセント。Ｃ３１５構築体またはＬＮＧＦＲＭと示される対照ベクターＤＮＡを含有するＣＥＭ−ｓｓ細胞（１０⁶）を感染から示された日数後に回収し、ＦＩＴＣ−結合抗−ｐ２４で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。偽感染、−◇−；ＬＮＧＦＲＭベクター−感染、−□−；およびＣ −３１５感染、−△−。図４．ＴＮＦ−α誘導後のＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を維持するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３１９のヌクレオチド配列（配列番号：２）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ６サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図５．ＴＮＦ−α誘導後のＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を維持するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−１０１のヌクレオチド配列（配列番号：３）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ２サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図６．ＴＮＦ−α誘導後のＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を維持するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−１１７のヌクレオチド配列（配列番号：４）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ６サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有するアンチセンス配列である。図７．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−０２５のヌクレオチド配列（配列番号：５）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ２サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有するアンチセンス配列である。図８．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−１２８のヌクレオチド配列（配列番号：６）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ４サブユニットをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図９．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−００４のヌクレオチド配列（配列番号：７）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト２−オキソグルタレートテヒドロゲナーゼをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１０．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−１１３のヌクレオチド配列（配列番号：８）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒトＭ２−タイプピルベートキナーゼおよび細胞質甲状腺ホルモン結合蛋白質をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１１．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２０４のヌクレオチド配列（配列番号：９）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・カルネキシンをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図１２．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−００１のヌクレオチド配列（配列番号：１０）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・ＡＤＰ−リボシル化因子３をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図１３．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２７３のヌクレオチド配列（配列番号：１１）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・真核生物開始因子３（ｅＩｆ−３）をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１４．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３１１のヌクレオチド配列（配列番号：１２）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・プロテインチロシンホスファターゼをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図１５．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３１３のヌクレオチド配列（配列番号：１３）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・プロテインチロシンホスファターゼをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１６．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２１０のヌクレオチド配列（配列番号：１４）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・ヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼ（ＨＡＵＳＰ）をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１７．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２６６のヌクレオチド配列（配列番号：１５）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト・真核生物開始因子４Ｂ（ｅＩｆ− ４Ｂ）をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図１８．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３０２のヌクレオチド配列（配列番号：１６）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ＣＤ４４をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図１９．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−３１７のヌクレオチド配列（配列番号：１７）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する分子のアンチセンス配列である。図２０．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２８６のヌクレオチド配列（配列番号：１８）。図面に開示されたヌクレオチド配列は、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する。図２１．ＴＮＦ−α誘導後にＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を維持するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−０６１のヌクレオチド配列（配列番号：１９）。図面に開示されたヌクレオチド配列はいずれの既知の配列に対しても相同性はない。図２２．ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するその能力につき選択されたＧＳＥ、ＣＦ−２８０のヌクレオチド配列（配列番号：２０）。図面に開示されたヌクレオチド配列はいずれの既知の配列に対しても相同性はない。図２３．１０００のＴＣＩＤ₅₀におけるＨＩＶ−１_SF2での感染後の種々のＧＳＥ：ＣＦ−００４（配列番号：７）、ＣＦ−０２５（配列番号：５）、ＣＦ −１１３（配列番号：８）およびＣＦ−２０４（配列番号：９）を含有する細胞内ｐ２４⁺ＣＥＭ−ｓｓ細胞のパーセント。対照は偽感染細胞、ベクター（ＬＮＧＦＲＭ）で感染した細胞およびＨＩＶ−感染したＣＥＭ−ｓｓ細胞を含む。図２４．１０００のＴＣＩＤ₅₀におけるＨＩＶ−１_SF2での感染後のＣＦ− ００１（配列番号：１０）を含有する細胞内ｐ２４⁺ＣＥＭ−ｓｓ細胞のパーセント。対照は偽感染細胞およびベクター（ＬＮＧＦＲＭ）で感染した細胞を含む。図２５．アミタール（amytal）での処理、続いてのＴＮＦ−α誘導後におけるＣＤ４⁺ＯＭ１０．１細胞のパーセント。ＴＮＦ誘導あり、−▲−；ＴＮＦ誘導無し、−■−。図２６．モファロテン（mofarotene）での処理、続いてのＴＮＦ−α誘導後のＣＤ４⁺ＯＭ１０．１細胞のパーセント。ＴＮＦ誘導あり、−■−；ＴＮＦ誘導無し、−◆−。５．発明の詳細な記載後記のセクション６は、ヒト細胞−由来ＲＦＥライブラリーからＧＳＥを選択しそれを単離するために使用された２つの特異的方法を説明する。これらの方法は、１）細胞−由来ｃＤＮＡを１００−７００塩基対（ｂｐ）断片に細胞−由来ｃＤＮＡをランダムに断片化し、２）断片を発現ベクターに挿入して、発現ライブラリーを形成させ、３）発現ライブラリーを、誘導可能な潜在的ＨＩＶ−１プロウイルスを含有する細胞、あるいはＨＩＶ感染に対して感染性の細胞の集団に導入し、４）ＨＩＶ感染に関連した細胞またはウイルスのマーカーをモニターすることによって、ＧＳＥにつき富化した発現ライブラリーのサブセットを含有する細胞の亜集団を選択し、次いで、５）選択された細胞集団からＧＳＥを回収する通常の工程を含む。該方法は、さらに、前記工程の反復を含み、多くの回数のラウンドにより連続的選択を行う。ＧＳＥの選択は、ＣＤ４の様な細胞マーカーの継続した発現または抗体を用いてｐ２４もしくはｇｐ１２０の様なウイルスマーカーの減少した発現をモニターすることによって行うことができる。本発明は、記載の目的のみで、かつ限定的ではなく、後記サブセクションで詳細に議論する。議論の明瞭性のため、ＯＭ１０．１細胞、ＣＥＭ−ｓｓ細胞、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、抗−ＣＤ４抗体、および抗−ｐ２４抗体を用いる本明細書に記載された特別の手法および方法が例示されるが、それらは本発明の実施のために単に例示的なものである。容易にアッセイできるＨＩＶ感染に関連したいずれかの細胞系およびいずれかのマーカーを利用して、同様の手法および技術を、他の細胞ＤＮＡからのＧＳＥの単離に適用することができる。５．１．哺乳動物細胞−由来ＲＦＥライブラリーの調製およびトランスフェクション細胞−由来ＲＦＥライブラリーは、いずれかの哺乳動物細胞の核酸分子から、特にＨＩＶ−感染性細胞のｃＤＮＡから構築することができる。その点、後記のセクション６は、天然でＨＩＶ感染に対して感染性であるＨＬ−６０細胞およびＣＤ４発現の欠如のためＨＩＶ感染に対して通常は感染性ではないＨｅＬａ細胞からＧＳＥを選択することができるのを示す。しかしながら、レトロウイルスベクターによるＨｅＬａ細胞の表面上のＣＤ４の発現は、細胞をＨＩＶ感染に対して感染性となることが示された。従って、通常はＨＩＶ感染に対して感染性でない細胞タイプは、依然として、ＲＦＥライブラリーの構築のための遺伝子物質の源として有用であり得る。また、正常化されたｃＤＮＡライブラリーが調製されるのが好ましい（GudkovおよびRoninson，1996，Methods in Molecular Biology 69:229-231）。ＤＮＡを、まず酵素で処理してランダム切断された断片を生じさせる。これは、便宜には、Ｍｎ⁺⁺の存在下でＤＮａｓｅＩ切断によって行うことができる（Roninsonら，特許第5,217,889号，第５欄，5-20行）。その後、ランダムに切断されたＤＮＡをゲル電気泳動によってサイズ分画する。１００および７００ｂｐの間の断片は、ＲＦＥライブラリーを構築するための好ましい長さである。サイズ選択された断片の一本鎖破損個所は、当該分野でよく知られた方法によって修復される。断片は５’および３’アダプターと連結し、これは、各断片が向きの様式で発現ベクターに挿入できるように、非粘着制限部位を有するように選択される。さらに、５’アダプターは、正しいフェーズでオープンリーディングフレームを含有する断片の翻訳を可能とする開始（ＡＴＧ）コドンを含有する。それから、断片を適当な発現ベクターに挿入する。宿主細胞において断片の効率的な発現となるいずれの発現ベクターを用いることもできる。好ましい実施形態において、レトロウイルスベクターＬＮＣＸ（MillerおよびRosman， 1989，BioTechniques 7:980）およびＬＮＧＦＲＭのようなウイルス−ベースのベクターが例示される。あるいは、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルスおよびヘルペスウイルスベクターもこの目的で用いることができる。ウイルス−ベクターのベクターを用いる場合、連結したベクターをまずパッキング細胞系に導入してウイルス粒子を得る。レトロウイルスベクターでは、ＰＡ３１７（MillerおよびButtimore，1986，Mol．Cell．Biol 6:2895-2902、ATCC CRl #9078）のようなどのようなアンフォトロピックパッキング系を用いても効率的にウイルスを生産することができる。本発明の好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、該ベクターを含有する細胞の単離を可能とする、ｎｅｏ^r 遺伝子またはトランケートされた神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）遺伝子のような選択可能な遺伝子も含有する。各ＲＦＥ発現ライブラリーに存在する独立したクローンの数は変化し得る。好ましい実施形態において、約１０⁶ないし１０⁸の独立したクローンの細胞−由来ｃＤＮＡのライブラリーを用いることができる。５．２．ＨＩＶ−感染細胞におけるＧＳＥの選択後記のセクション６の例によって説明される特別の実施形態において、ＯＭ１０．１細胞を用いて、ＧＳＥにつき選択し、それらをブテラ（Butera）（米国特許第5,256,534号）に記載されている様に従来の組織培養で維持する。ＧＳＥの選択のためのＯＭ１０．１細胞の使用の目的は、それらが、ＴＮＦ−αによって誘導可能な潜在的ＨＩＶ−１プロウイルスを含有することである。潜在的ＨＩＶで感染される細胞系の例は、限定されるものではないが、Ｕ１、Ｕ３３、８Ｅ５、ＡＣＨ−２、ＬＬ５８、ＴＨＰ／ＨＩＶおよびＵＨＣ４（BednarikおよびFolk s，1992，AIDS，6:3-16）を含む。種々の試薬が潜在的ＨＩＶ−感染細胞を誘導できることが示されており、これらは、ＴＮＦ−α，ＴＮＦ−β，インターロイキン−１、−２、−３、−４および−６、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、インターフェロン−γ，トランスフォーミング増殖因子−β、ＰＭＡ、レチノイン酸およびビタミンＤ３（PoliおよびFaucl，1992，AIDS Res ．Human Retro viruses 9:191-197）。あるいは、ＧＳＥは、ＨＩＶ感染からＨＩＶ感染性細胞を直接的に保護するそれらの能力を基礎として選択することができる（後記セクション５．５参照）。ＨＩＶ−感染細胞は、使用するベクター系に適した当該分野でよく知られたいずれかの技術によって、細胞−由来ＲＦＥライブラリーで導入することができる。本発明の１つの実施形態において、ウイルスベクターは、細胞ＤＮＡのランダム断片に加えて選択マーカーも含有する。適切なマーカーはｎｅｏ^r遺伝子であり、これは薬物Ｇ−４１８による選択を可能とする。好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、抗−ＮＧＦＲモノクローナル抗体を用いる細胞の選択を可能とするトランケートされた低親和性の神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）を含有する。別の実施形態において、ライブラリーのビリオンの感染多重度は、ベクターによって形質導入（トランデュース）される細胞についてのプレ選択が必要でないように調整される。ＯＭ１０．１細胞の場合には、形質導入細胞集団は、ブテラ（Butera）の方法に従って、２４−７２時間、好ましくは約２４時間、１０Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−α で処理する。ＯＭ１０．１における潜在的ＨＩＶ−１プロウイルスの活性化は、細胞表面ＣＤ４の抑制によって検出することができる。ウイルス蛋白質ｇｐ１２０は細胞質中のＣＤ４に結合し、これは細胞表面上でのＣＤ４の引き続いての発現を妨げると考えられる。ＨＩＶ複製に対して耐性なクローンは、継続して細胞表面ＣＤ４を発現する。かるクローンは、ＣＤ４に対するいずれかの抗体染色技術および蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いる細胞ソーティングによって選択することができる。ＲＦＥライブラリーで形質導入されたＣＤ４⁺細胞の画分は、ベクターのみよりなる発現ベクターで形質導入された細胞と比較することができる。細胞−由来ＲＦＥライブラリーおよび対照ライブラリーの間の増大した相対的差異は、さらなる各ラウンドのＴＮＦ−α誘導で見出すことができる。従って、本発明の好ましい実施形態においては、さらなる特徴付けのために細胞からＧＳＥが回収される前に、少なくとも２サイクルの誘導、選択および再クローニングとなる。５．３．選択された細胞からのＧＳＥの回収選択の後、ＧＳＥに対応する特異的ポリヌクレオチドを、ＴＮＦ−αによる潜在的ＨＩＶプロウイルスの誘導に続いてＣＤ４を継続して発現する細胞から回収することができる。特異的ＧＳＥは、ＴＮＦ−α誘導後にＦＡＣＳによって分類されたＣＤ４⁺細胞から単離されたゲノムＤＮＡから回収される。この集団におけるＧＳＥは、ベクターの配列からデザインされたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって回収される。回収されたＧＳＥは、前記セクション５．１に議論された様に発現ベクターに導入することができる。得られたＧＳＥ発現ライブラリーは二次ライブラリーとして知られている。二次ライブラリーは、一次ライブラリーの構築のために使用したものと同一または異なるベクターを利用することができる。二次ライブラリーはもう１つの細胞集団に形質導入することができ、得られた集団を選択し、再度クローン化し、本明細書に記載される様に加工する。加えて、各個々に回収されたＧＳＥは、その特異的ヌクレオチド配列およびその向きを決定するためにクローニングベクターに挿入することができる。次いで、ＧＳＥの配列を、それが対応する細胞集団の一部を決定するために既知の遺伝子の配列と比較される。あるいは、ＰＣＲ産物を直接的に配列決定して、それらのヌクレオチド配列を決定する。同時に、単離されたＧＳＥを分析して、それらの最小コア配列を決定することができる。コア配列は、重複する配列とＧＳＥとの比較によって見出された共通配列である。ＧＳＥを、ＨＩＶ感染から従前に未感染の細胞を保護するそれらの能力につきさらにテストする。図２（配列番号：１）および図４−２２（配列番号：２−２０）に示された特異的ヌクレオチド配列に加えて、高度にまたは中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列またはそれらの相補体にハイブリダイズできるヌクレオチド配列は本発明の範囲内のものである。また、同一ポリペプチド産物を生じる保存的ヌクレオチド置換を持つＧＳＥも含まれる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６５℃における０．５ＭＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いての６８℃での０．１×ｓｓＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄と定義することができる（Ausube l F.M．ら編，１９８９，Current Protocols in Molecular Bioloy ，第１巻，Gr een Publishing Associates，Inc.およびJohn Wiley & Sons，Inc.，New York， 2.10.3頁）。中程度にストリンジェントな条件は、前記した様に実行されるハイブリダイゼーション、続いての４２℃における０．２×ｓｓＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄と定義することができる（Ausubelら，1989，前掲）。５．４．細胞−由来ＧＳＥのコア配列の決定また、本発明は、各ＧＳＥのコア配列を決定する方法も含む。これは、独立して誘導されるＧＳＥのオーバーラップする配列を比較することによってなすことができる。別法として、ＧＳＥは、付加、置換または欠失によって改変することができ、ＨＩＶ−抑制機能の保持につきアッセイすることができる。ＧＳＥ配列における改変は、当業者によく知られた種々の化学的および酵素的方法を用いて生じさせることができる。例えば、オリゴヌクレオチド−指向性突然変異誘発を用いて、規定された方法にてＧＳＥ配列を改変しおよび／または配列内の特異的領域に制限部位を導入することができる。加えて、欠失突然変異体はＢａ１３１またはＥｘｏIIIおよびＳ１ヌクレアーゼのようなＤＮＡヌクレアーゼを用いて生じさせることができる。ＧＳＥ配列において徐々に大きくする欠失は、ＤＮＡを徐々に長い時間ヌクレアーゼと共にインキュベートすることによって生じさせることができる（突然変異誘発のレビューについては、Ausubelら，1989，C urrent Protocols for Molecular Biology 参照）。改変された配列は、適当な宿主細胞中でｐ２４のようなＨＩＶ蛋白質の発現を抑制するそれらの能力につき評価することができる。ＨＩＶ感染を抑制するそれらの能力を保持するいずれかの改変されたまたは短くされたＧＳＥポリヌクレオチドをさらなる使用のために組換え発現ベクターに組み込むことができることは本発明の範囲内のものである。５．５．ＨＩＶ感染に対するＧＳＥによる未感染細胞の保護選択されたＧＳＥがＨＩＶ感染から未感染細胞を保護できることを確認するために、ＧＳＥをＨＩＶ感染性宿主細胞に導入し、続いてＨＩＶ感染させることができる。この関係で、ＧＳＥは、後記のセクション６に例示した特別の実施形態で示すように、ＨＩＶによる生産的感染を妨げるそれらの能力につきＲＦＥライブラリーから直接選択することができる。保護実験は、潜在的ＧＳＥを取りいれ、そうでなければＨＩＶ感染に対して感染的であるいずれかの細胞タイプで行うことができる。例示的好ましい実施形態において、ＣＥＭ−ｓｓ細胞系を用いる（Foleyら，1965，Cancer 18:522-29）。ＨＩＶ−１の定量的感染性についての標的としてのＣＥＭ−ｓｓ細胞の使用はナラ（Nara）およびフィシンガー（Fischinger）（1988，Nature 322:469-70）により記載されている。ＨＩＶ感染に対して感染性の他の細胞系は、限定されるものではないが、ＨＵＴ−７８、Ｈ９、ＪｕｒｋａｔＥ６−１、Ａ３．０１、Ｕ−９３７、ＡＡ−２、ＨｅＬａＣＤ４⁺およびＣ８１６６を含む。加えて、新たに単離された末梢血白血球を用いることができる。潜在的ＧＳＥのテストは、初期選択工程の間に細胞のＲＦＥライブラリー形質導入で使用されるものと同一の発現ベクター系を用いて行うことができる。別の実施形態において、該ベクター系を修飾してより高いレベルの発現を達成することができ、例えば、リンカーを使用して、メッセージの翻訳効率を増加させるリーダー配列を導入することができる。１つのかかる配列はコザック（Kozak），1 994，Biochemie 76:815-821によって開示されている。ＨＩＶに対する優れたＧＳＥの効果をテストするもう１つの方法は、そのエレメントの効果を無効にできるＨＩＶ−１変異体がいかにして迅速に発達するかを決定することである。かかるテストは、低い感染多重度にてＣＥＭ−ｓｓ細胞のような感染性細胞の培養物の感染と、ＨＩＶ−１感染が迅速に広がるか否かおよびどのようにしてはやく広がるかを決定するために培養物を反復してアッセイすることとを含む。有用な感染多重度の範囲は、１０⁶ＣＥＭ− ｓｓ細胞当たり１００ないし１０００組織培養感染単位（ＴＣＩＤ₅₀）の間である。ＴＣＩＤ₅₀は終点法によって測定され、感染多重度（ｍｏｉ）を決定するのに重要である。潜在的ＧＳＥの効果に対して耐性であるＨＩＶ−１株のテスト培養における発生と相関するパラメーターは、培養で感染する細胞の分率である。この分率は、固定された浸透化細胞のＨＩＶ−１ｐ２４抗原に特異的な抗体での免疫蛍光染色によって決定することができる。商業的に入手可能な試薬はかかるテストを行うのに適している（Leeら，1994，J ．Virol. 68:8254-8264）。後記セクション６．２において、いくつかのＧＳＥを、ＨＩＶ−１株ＳＦ２での感染からＣＥＭ−ｓｓ細胞を保護するそれらの能力につきテストした。未感染細胞を、ベクターＤＮＡまたはＧＳＥポリヌクレオチドいずれかを含有するレトロウイルス構築体で形質導入した。非形質導入細胞を、抗体によるＮＧＦＲ⁺細胞の選択または選択剤Ｇ−４１８への暴露によって排除した。ｐ２４⁺細胞のパーセントは、感染後の特定の時点において測定した。結果は、テストしたＧＳＥが感染性宿主細胞において生産的ＨＩＶ−１感染に対して保護できることを示す。ＨＩＶ−阻害活性を持つ選択されたＧＳＥのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおける公知のヌクレオチド配列と比較することができる。後記のセクション６に記載されたＧＳＥは公知の細胞遺伝子のｃＤＮＡと実質的配列同一性、すなわち９０％−１００％を有する。かくして、これらのＧＳＥは、細胞遺伝子の断片に対応する。実験を行って、かかる遺伝子を下降調節する薬剤およびそれらの遺伝子の産物の活性に拮抗する阻害剤を用いてＨＩＶ感染を阻害することもできる。後記のセクション７．２において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの阻害剤は、ヒト細胞においてＨＩＶ感染を直接的に阻害することが示される。この知見は、ヒト宿主細胞−由来ポリヌクレオチドが抗−ＨＩＶ活性を保有し、加えて、ある種の細胞遺伝子との配列同一性を用いて、さらなるＨＩＶ治療剤の開発のための標的としての細胞遺伝子および遺伝子産物を同定することができる。５．６．ＧＳＥの使用本発明のもう１つの態様は、予防的および治療的なＨＩＶ感染に対する単離されたＧＳＥの使用である。ＧＳＥおよびＧＳＥの機能的同等体としての保存的ヌクレオチド置換を含有するＧＳＥの機能的活性断片も本発明の範囲内のものである。この点に関し、それらの発現を制御する調節配列に作動可能に連結したＧＳＥまたはその機能的同等体を、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたは形質導入、続いての細胞の受容体への移植のような当該分野でよく知られたいずれかのＤＮＡ導入技術によって、ＣＤ４⁺細胞のようないずれかのＨＩＶ−感染性宿主細胞または骨髄または流動している末梢血液から得られたＣＤ３４⁺細胞のような造血先祖細胞に導入することができる。先祖細胞を含有するＧＳＥがインビボで分化する場合、子孫細胞はＧＳＥを発現し、ＨＩＶに対して耐性となる。別法として、ＧＳＥは、遺伝子治療発現ベクターを用いて、インビボで直接投与することができる。特に、ＧＳＥを、ＨＩＶ−感染または未感染個体双方中のＣＤ４⁺Ｔ細胞にデリバリーまたは導入して、ＨＩＶ感染の発生から保護することができる。また、ＧＳＥをマクロファージを含めた間質細胞に導入することもできる。レトロウイルス、アテノウイルス、アデノ−関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはパピローマウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターを、標的化細胞集団への組換えＧＳＥのデリバリー（送達）のために用いることができる。当業者によく知られた方法を用いて、その発現を促進するプロモーターに作動可能に連結したＧＳＥポリヌクレオチドを含有する組換えウイルスベクターを構築することができる（Sambrookら，1989，Molecular Cloning A Laboratory Man ual ，Cold Spring Harbor Laboratory，N,Y.およびAusubelら，1989，Current P rotocols in Molecular Biology ，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.）。例示的特別の実施形態において、ＧＳＥポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターに挿入した。アデノウイルスを発現べクターとして使用する場合、ＧＳＥをアデノウイルス転写−翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入の結果、生存可能であって感染宿主においてＧＳＥを発現できる組換えウイルスが得られるであろう（LoganおよびShenk，1984，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81:36 55-3659）。あるいは、非ウイルス送達系によって、組換えＧＳＥポリヌクレオチドを標的細胞に送達することができる。例えば、ＧＳＥを標的細胞への送達のためにリポソームに再構成することができる。リポソームは水性内部を持つ球状脂質二重層である。リポソーム形成の時点で水性溶液に存在する全ての分子（この場合は、オリゴヌクレオチド）はこの水性内部に取り込まれる。リポソーム内容物は外部ミクロ環境から保護され、かつリポソームは細胞膜と融合するので、細胞質に効果的に送達され、オリゴヌクレオチドの負の電荷を中和する必要性を軽減する。ＧＳＥがポリペプチドとして発現される場合、特異的開始シグナルも挿入されたＧＳＥ配列の効果的翻訳に必要であり得る。ＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンがＧＳＥ配列のリーディングフレームのフェース内にあって、全インサートの翻訳を確実としなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成双方の種々の起源のものであり得る。それらが導入される細胞におけるＧＳＥの発現の効率は、種々の調節因子を送達ベクターに含めることによって調節することができる。これらは、限定されるものではないが、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含む（Bittnerら，1987，Methods in Enzymol. 153:516-544）。単離されたＧＳＥはポリペブチドまたはＲＮＡ産物のいずれかをコードすることによってＨＩＶ活性を抑制する。本発明は、融合蛋白質、リーダーペプチドおよび局所化シグナルを含めたいずれのかかるポリペブチド産物も含む。加えて、ＨＩＶ感染を阻害するように機能するアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ分子およびリボザイムも本発明の範囲内である。ＧＳＥポリヌクレオチドを細胞または組織に導入する方法は裸のポリヌクレオチドの挿入を含み、例えば、自己細胞療法における使用、ウイルス、レトロウイルス、ファージまたはプラスミド等のようなベクターの使用、あるいはインビボまたはエクス・ビボで使用できるエレクトロポレーションのような技術の使用のための組織への注入やエクス・ビボにて細胞中へのＧＳＥの導入になどがある。ＧＳＥは処方し、全身、局所化、または局所投与を含めた種々の手段を通じて投与することができる。処方および投与のための技術は、「Remington's Pharma ceutical Sciences」Mack Publishing Co.，Easton，PA，最終版で見出すことができる。投与の様式を選択して、身体中の所望の部位への送達を最大化することができる。全身投与では、注入経路は筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む。本発明のポリヌクレオチドは水性溶液中に、好ましくは、ハンクスの溶液、リンガー溶液、または生理食塩水緩衝液の様な生理学的に適合する緩衝液中に処方される。加えて、ポリヌクレオチドは固体または凍結乾燥形態に処方し、次いで、使用直前に再溶解または懸濁させることができる。５．７．細胞遺伝子および遺伝子産物の阻害剤はＨＩＶ感染を抑制する。ヒト細胞−由来ＲＦＥライブラリーから選択された多数のＧＳＥは、公知の細胞遺伝子の特異的部分に由来することが示されている。例えば、いくつかの独立して選択されたＧＳＥは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのある種のサブユニットをコードする遺伝子のｃＤＮＡと実質的配列同一性（９０−１００％）を有する。ＧＳＥおよび細胞遺伝子配列の間の完全な同一性の欠如は、異なる個体間の遺伝的多形またはクローニングまたはＰＣＲ増幅の間に導入された突然変異に由来したものであろう。後記のセクション７は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ遺伝子発現の阻害剤が初代ヒトＴ細胞培養においてＨＩＶ感染を阻害することを示す。従って、本発明は、ＨＩＶ感染の間に細胞標的として同定されている細胞遺伝子および遺伝子産物も含む。一旦、細胞遺伝子がＨＩＶライフサイクルを支持する潜在的に重要な標的として同定されれば、アッセイ系は、遺伝子の発現を下降調節し、またはその遺伝子産物の活性を阻害するそれらの能力に基づいて、抗−ＨＩＶ治療剤としてのさらなる化合物のスクリーニングおよび選択のためのかかる遺伝子を用いて確立されるであろう。例えば、天然で注目する遺伝子を発現する、またはそれでトランスフェクトされた細胞系を種々の化合物と共にインキュベートすることができる。注目する遺伝子の発現の低下またはそのコードされた産物の活性の阻害を、リードアウトとして使用することができる。化合物はＯＭ１０．１細胞におけるまたは生産的ＨＩＶ感染におけるような他のアッセイで再テストして、ＨＩＶ感染に対するそれらの活性を確認する。これらの化合物は、公知の有機化合物、ペプチドライブラリーの産物および化学品コンビナトリアルライブラリーの産物からスクリーニングすることができる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの場合、非常に多数の小分子阻害剤が当該分野で入手できる。かかる阻害剤は本発明の方法で使用することができる。インビトロアッセイを確立して、ミトコンドリア機能活性およびＡＴＰ濃度に応じて、ミトコンドリア膜および細胞質膜に蓄積する染料であるＤｉ０Ｃ６で生きた細胞の膜電位を測定することによって、さらなるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体Ｉ阻害剤をスクリーニングすることができる（Methods in Enzymology，1995，260:448）。当該分野でよく知られた方法によって膜電位を低下させるそれらの能力につき化合物を選択する。後記するサブセクションは、ＨＩＶ治療剤の開発のための重要な標的としてここに同定された多数の細胞遺伝子を記載する。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子産物の阻害剤を用いて、ＨＩＶ感染を阻害することができる。５．７．１ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ好気性生物において、アデリシン三リン酸（ＡＴＰ）はエネルギーの主要な源を提供する。ＡＴＰの生成では、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ₂のようなエネルギーが豊富な分子がまず解糖、脂肪酸酸化およびクエン酸回路で形成される。これらの分子がその電子を分子酸素に与えると、自由エネルギーが放出されてＡＴＰを生成する。酸化的リン酸化は、それによりＡＴＰが、一連の電子担体によってＮＡＤＨまたはＦＡＤＨ₂からＯ₂に移動されるにつれて形成されるプロセスである（Stryer ，1988，Biochemistry，Freeman）。このプロセスは、真核生物細胞のミトコンドリアで起こる。より詳しくは、電子輸送鎖を触媒する酵素はミトコンドリアの内部膜に存在し、それらは核およびミトコンドリアＤＮＡ双方によってコードされる。これらの酵素は大きな蛋白質複合体として存在し、該鎖の第１の複合体はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼまたはＮＡＤＨ−Ｑレダクターゼとして知られている。それは、８５０，０００ダルトンの分子量を有し、４０を超えるポリペブチドサブユニット（そのうちの７つがミトコンドリアゲノムによってコードされている）よりなる（Andersonら，1981，Nature 290:457、Chomynら，1985，Nature 3 14 :592、Chomynら，1986，Science 234:619）。サブユニットについての核遺伝子のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は記載されている（Walkerら，1992，J ．Mol． Biol. 226:1051、Feasnleyら，1989，EMBO J. 8:665、Pilkingtonら，1989，Bio chem 28:3257）。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨからユビキノンと呼ばれる電子担体までの電子の移動を触媒する。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤はＨＩＶ感染を抑制するので、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの発現および／または機能を阻害する他の治療的に適当な薬剤もまた本発明の範囲内にある。これらの阻害剤は、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット遺伝子発現と干渉する小分子ならびにアンチセンスおよびリボザイム分子を含む。他の阻害剤の例は、限定されるものではないが、アミタール、アンノニンＶＩ、オーラチンＡ、オーラチンＢ、オーレオチン、ベンズイミダゾール、ブラクチン、カプサイシン、エトキシギ酸無水物、エトキシキン、フェンピロキシメート、モファロテン（Ro 40-8757、アロチノイド）、モルビザリン、ミクサラミドＰＩ、オチバリン（アンノナセオスアセトゲニン（anno naceous acetogenins））、ペチジン、フェナルアミドＡ₂、フェノキサン、ピエリシジンＡ、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、ラノラジン（ＲＳ−４３２８５）、ロリニアサチン−１、ロリニアサチン−２、ロテノン、スクアモシン及びチアンガゾール、（SingerおよびRamsay，1992，Mol ．Mechan，in Bioenergetic s Chap．6，p．153、Degli Espastiら，1994，Biochem ．J. 301:161、Friedrich ら，1994，Eur ．J．Biochem. 219:691、Uchidaら，1994，Int ．J．Cancer 58:89 1、Wyattら，1995，Biochem ．Pharmacol. 50:1599、Shimonuraら，1989，Arch ． Biochem．Biophy ，270:573）。５．７．２．２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ複合体は２ −オキソグルタレートのスクシニル−ＣｏＡおよびＣＯ₂への酸化的脱カルボキシル化を触媒し、クレブス回路を通じて基質のフラックスを制御する律速酵素である（Delvin，T．M.編，1992，Textbook of Biochemistry，Wilcy-Liss，Inc. ）。この酵素複合体はミトコンドリアの内部膜／マトリックス区画に位置する。複合体は２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼの複数コピー（リポアミド）［ＯＧＤＨまたはＥＬＯ、２−オキソグルタレート：リポアミド２−オキシドレダクターゼ（脱カルボキシル化およびアクセプタースクシニル化）、ＥＣ１．２．４．２．］、ジヒドロリポアミドスクシニルトランスフェラーゼ（Ｅ２０と命名、ＥＣ２．３．１．６１）およびジヒドロリポアミドデヒドロゲナーセ（Ｅ３、ＥＣ１．８．１．４）。２−オキシドレダクターゼデヒドロゲナーゼは記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｄ１０５２３およびＤ９０４９９、 Koikeら，1992，Proc ．Natl．Acd．Sci．U.S.A. 89:1963-1967、Koikeら，1995 ，Gene 159:261-266）。２−オキシドレダクターゼデヒドロゲナーゼに対する多数の阻害剤が記載されている（Majamaaら，1985，Biochem ．J. 229:127-133）。５．７．３．ピルベートキナーゼピルベートキナーゼ／甲状腺ホルモン結合性蛋白質ｐ５８（ＴＢＰ）は、ピルベートキナーゼのモノマー（ＡＴＰピルベートＯ^2-ホスホトランスフェラーゼ．ＥＣ２．７．１．４０）サブタイブＭ２である。四量体ピルベートキナーゼへの変換はフラクトース１，６−二リン酸（Ｆｒｕ−１，６−Ｐ２）によって調節される。低グルコース濃度では、哺乳動物細胞はＦｒｕ−１，６−Ｐ２を含有し、ピルベートキナーゼは不活性である。高グルコース濃度では（正規の媒体は５−１０ｍＭグルコースを含有する）、高レベルのＦｒｕ−１，６−Ｐ２が増殖する腫瘍の細胞で見出されており、これは増殖に高いピルベートキナーゼ活性を要する。低Ｆｒｕ−１，６−Ｐ２はｐ５８の形成に好都合であり、高濃度はそれを四量体酵素に変換することが示されている。グルコース濃度の増加はｐ５８の多量体化に導き、今度はこれはピルベートキナーゼおよび解糖を活性化する。同時に甲状腺ホルモンがＴＢＰとの複合体から放出され、核およびミトコンドリア受容体に結合し、酸化的リン酸化を活性化する。ピルベートキナーゼ／甲状腺ホルモン結合性蛋白質のコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ２６２５２，katoら，1989，Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A. 86:7861-7865）。５．７．４．カルネクシンカルネクチンは、基質結合に関与する２つの共因子としてのＡＴＰおよびＣａ⁺⁺ と共に小胞体（ＥＲ）において分泌性糖蛋白質にための分子シャペロンとして機能するタイプＩ膜蛋白質である（Ouら，1995，J ．Biol．Che m. 270:18051）。ｇｐ１２０の折り畳みは、合成されたｇｐ１２０のＥＲへの移転の間にカルネクチンによって媒介されることが示されている（Liら，1996，Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93:9606）カルネキシンのコーディング配列は記述されていた（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ１０２８４、Davidら，1993，J ．Biol． Chem. 268:9585-9592）。５．７．５．ＡＤＰ−リボシル化因子３ＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）はインビトロでクロレラ毒のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を刺激する約２０ｋＤａの分子量のグアニンヌクレオチド結合蛋白質である（Tsalら，1991，J ．Biol．Chem. 266:23053-23059）。５つの異なるＡＲＦがヒトｃＤＮＡにクローン化されている。ＡＲＦ３は、別のポリアデニル化シグナルの使用を介して生成される３．７および１．２ｋｂの２つのｍＲＮＡによって表わされる（Tsaiら，1991，前掲）。５．７．６．ユビキチン−特異的プロテアーゼユビキチン−特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）は、遺伝子発現、細胞周期の制御、ＤＮＡ修復および分化を含めた、いくつかの細胞プロセスで重要な役割を演じる（Hochtrassee，1995，Curr ．Opin．Cell．Biol．7:215-223、Wilkinson，199 5,Ann ．Rev．Nutr．15:161-189）。遺伝子発現に関与する良好に特徴付けされているユビキチン−依存性経路の１つはＮＦ−κＢの活性化である。ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットの前駆体であるｐ１０５の切断はユビキチンのコンジュゲーション（Palombellaら，1994，Cell，78 :773-785）を要し、第２に、ＩκＢの破壊（活性形態でＮＦ−κＢを核に移動させるプロセス）はリン酸化−依存的に阻害剤のユビキチン化を要する（Schere rら，1995，Proc ．Natl．Acd．Sci．U.S.A. 92:11259-11263）。ＵＳＰは、２つの保存された活性部位ドメインの存在によって特徴付けられており、モデル基質からユビキチンを切断することが示されている（Bverettら，1 997，EMBO J. 18:556-577）。２つのクラスのＵＳＰがある。第１ものは、プロテオソームによる基質の蛋白質分解後に前駆体融合蛋白質またはペプチド−連結ポリュビキチンからの遊離ユビキチンの生成に関与する蛋白質である（Hochstra sser，1995）。第２のものは、ユビキチンアダクトを除去することによって特異的基質を認識し安定化させることができる、数が増加する脱−ユビキチン化蛋白質である。このクラスの例は、その脱−ユビキチン化が適当な目の発育に要するところのショウジョウバエ脂肪個眼蛋白質を含む（Huangら，1995，Science 270 :1828-1831）。もう１つの例は細胞増殖を調節する即時型遺伝子であるＤＵＢ− １遺伝子に関する（Zhuら，1996,Proc ．Natl．Acd．Sci．U.S.A．93:3275-3279 ）。ヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼについてのコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ７２４９９、Everett ら，1997，EMBO J ．16:566-577）。５．７．７．ＣＤ４４ＣＤ４４は、細胞外マトリックス−細胞接着、リンパ球ホーミング、リンパ系 −造血、Ｔ細胞活性化および腫瘍転移の様な多数の生理学的細胞機能に関与する広く分布した表面受容体糖蛋白質である（Shimuzuら，1989，J ．Immunol．143:2 457-2463、Huetら，1989，J ．Immunol．143:798-801）。これらの機能のいくつかは、細胞外マトリックス成分ヒアルロン酸を認識するＣＤ４４の能力に依存する。ＣＤ４４はいくつかの異なるイソ形態として発現され、これは、８５ないし２００ｋＤａの間で変化し、細胞外ドメインおよび細胞タイプ特異的グリコシル化をコードする１０個のエクソンの異なる用法に依存する。各イソ形態はある程度の機能的ユニーク性を呈することができる（Stamenkovichら，1989，Cell 56: 1057-1062）。最も広く発現される分子は、ヒアルロン酸に対する主要受容体であることが示されている、ＣＤ４４Ｈと通常は言われている８５−９０ｋＤａの糖蛋白質である（Bartolazziら，1996，J ．Cell Biol．132:1199-1208）。ＣＤ４４Ｈは造血細胞で見出される主要イソ形態を表す。ＣＤ４のような他のＨＩＶ受容体と共にＣＤ４４はウイルスの趨性において役割を演じることができ、ウイルスの感染性に影響することが示されている。ＨＩＶは単球においてＣＤ４４下降変調を引き起こすが、翻訳後のレベルに関してである（GuoおよびHildreth，1993，J ．Immonol．151 :2225-2236）。ヒトＣＤ４４についてのコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５５１５０、Stamenkovichら，1991，EMBO J ．10:243-248）。５．７．８．チロシンホスファターゼセリン、トレオニンおよびチロシン残基のリン酸化は、遺伝子発現および翻訳後修飾における重要な調節メカニズムの１つである。チロシンのリン酸化は、細胞の増殖および分化の様な正常細胞プロセスの制御、ならびに悪性形質転換の様な病理学的事象において重要である（Cantley，1991，Cell 64:281-301）。チロシンリン酸化の全体のレベルは、プロテインチロシンキナーゼおよびプロテインホスファターゼの相補的および拮抗的作用によって変調される。定常状態、１％未満の全細胞リン酸化はチロシンのリン酸化によるものである。しかしながら、ホスホチロシン含有量は細胞の形質転換に際して劇的に増加することができる（ WaltonおよびDixon，1993，Ann ．Rev．Biochem．62:101-120）。約４０の公知のホスファターゼがある（ZoInierowiezおよびHemmings，1994，Trcnds Cell Biol ． 4:61-64）。いくつかのウイルスはプロテインチロシンキナーゼおよびホスファターゼを含有することが知られている。推定プロテインチロシンキナーゼがＨＶＩ−１の５ ’ＬＴＲ中で見出されている（NandiおよびBanerjee，1995，Med ，Hypothesis 4 5:476-480）。リン酸化はｔａｔ−媒介トランス活性化(Ensollら，1990，Nature 345:84-86)、ｎｅｆ蛋白質機能（Ballietら，1994，Virology 200:623-631、Ve nkateshら，1990,Virology 176:39-47）、およびウイルスマトリックス組み立て（Camaurら，1997，J ．Virol．71:6834-6841）。プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤はオルト−バナデート、ペルバナデート、バナジン酸ナトリウム、およびフェニルアルシンオキシドを含む。プロテインチロシンホスファターゼの阻害剤は、好酸球、好中性球、および造血細胞においてアポトーシスを阻害することが示されている（Yousefiら，1994，Proc ．Natl．Acd．Sci．U.S.A． 91:10868-10872、Lund-Johnsonら，1996，Cytometey 25:182-190）。脳由来ホスファターゼ（ＢＤＰ１）ｍＲＮＡおよびＣＬ１００ｍＲＮＡからのプロテインチロシンホスファターゼのコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ７９５６８、Kimら，1996，Oncogene 13:2275-2279 およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ６８２７７、KeyseおよびEmslie，1992，Nat ure 359:644-647）。５．７．９．ホスファチジルイノシトールキナーゼホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は受容体シグナル形質導入に関与する酵素として特徴付けられている。異なる基質特異性をもつ複数の形態が存在する。それらは、成長因子、トロンビン、化学走性ペプチドおよびサイトカインについてのものを含めた種々の範囲の細胞表面受容体に関連付けられてきた。ＰＩ１３Ｋは、恐らくはある種のプロテインキナーゼＣイソタイプの活性化を介して二次メッセンジャーとして使用すると提唱されている（liscovitch およびCantley，1994 Cell 77:329-334、Tokerら，1994，J ．Biol．Chem．269:2 3598-32367）。ＰＩ３Ｋは、ゴルジ体からリソソームへの蛋白質輸送の調節で役割を演じることもできる（Volinisら，1995，EMBO J ．14.3339−3348）。ＨＶＩ−１Ｎｅｆの発現は、ＰＩ３Ｋと受容体との会合をかなり損ない、これは、ＮｅｆがＰＩ３Ｋシグナリング経路に影響し、その結果、宿主細胞の機能に悪影響となることを示唆する（Grazianiら，1996，J ．Biol．Chem．271:6590- 6593）。Ｎｅｆの発現には基礎細胞内ＰＩＫの減少が伴い、これはＨＩＶ複製におけるＰＩＫの役割を示唆する（Garcia，1997，C.R ．Acd．Sci．III 320:505-5 08）。ＰＩ３Ｋはｇｐ１６０によって活性化することができ、また、Ｔａｔ−媒介アポトーシスと関連付けられてきた（Mazerollesら，1997，Eur ．J．Immu nol ． 27:2457-2465、Borgattiら，1997，Eur ．J．Immunol．27:2805-2811）。ＰＩ３Ｋの公知の阻害剤は、ワートマンニンおよびテオフィリンを含む。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼのコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ４６９７３、Voliniaら，1995，EMBO J ．14.3339 -3348）。５．７．１０．伸長因子ポリペプチド鎖の伸長は翻訳の開始に続いて起こる。伸長因子はＧＴＰ加水分解によって放出されるエネルギーを利用して、適当なアミノアシル−ｔＲＮＡの選択を確保し、リボザイムの脱コーディング領域を介してメッセージを移動させ、ｔＲＮＡに関連付ける（Devlinら，1992，Textbook of Biochemistry，Wiley- Liss，Inc.）。ＥＦ−１−αは、全ての生きた細胞において、進化の過程で保存された、蛍白質合成の普遍的共因子である。それは、ＧＴＰ−依存的にリボソームのＡ−部位に対してアミノアシル−ｔＲＮＡを運ぶ。ＥＦ−１αの発現レベルは成長阻止、形質転換および老化のような、細胞ライフの種々の段階で調節される。ＥＦ−１αのレベルは、アポトーシスの速度を変調するにおいて鍵となる調節である。ＥＦ−１−α発現の減少はアポトーシスを失速させ、他方、過剰発現はプロセスを加速する（Duttaroyら，1998，Exp ．Cel l Res. 238:168-176）。阻害剤はケルセチン（３，３’，４’，５，７−ペンタヒドロフラボン）およびジデムニンＢを含む。ヒト伸長因子１−αについてのコーディング配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ０４６１７、Uetsukiら，1989，J ．Biol．Chem．264:5791-5 798）。５．７．１１．真核生物翻訳開始因子翻訳の開始は、ｍＲＮＡのキャップ構造におけるまたはその近くにおける４０Ｓリボソームサブユニットの結合、続いてＡＵＧが遭遇するまでの５’非翻訳領域のリボソームスキャンニングによって起こる。このプロセスは、開始因子として知られている蛋白質の複合体群によって促進される。これらの因子は翻訳の開始にのみ関与する（Devlinら編，1992，Textbook of Biochemistry，Wiley-Liss ，Inc.）。真核生物開始因子３（ｅＩＦ３）は、蛋白質合成の開始に関与する最大のマルチサブユニット複合体である。それは、６００ｋＤａの質量および１０のサブユニットを有する。因子はリボソームサブユニットの会合を妨げ、４０Ｓサブユニットへのメチオニル−ｔＲＮＡ結合を安定化させ、ｍＲＮＡ結合を促進する（Me rrickおよびHershey，1996，Translational Control，Hershey，MathewsおよびS onenberg編，31-69頁，Cold Spring Harbor，Cold Spring Harbor，NY）。ヒト真核生物開始因子３についての配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ７８５２５）。真核生物開始因子４Ｂ（ｅＩＦ４Ｂ）は、ｍＲＮＡのリボソームへの結合に必須である８０ｋＤａのポリペプチドである。ｅＩＦ４ＢはＲＮＡ結合活性を有し、ＡＴＰａｓｅおよびＲＮＡヘリカーゼを刺激する（Mehotら，1996，RNA 2:38- 50、Abramsonら，1987，J ．Biol．Chem．262:3826-3832、Rayら，1985，J ．Biol ．Chem． 260:7651-7658、Rozenら，Mol ．Cell．Biol．10:1134-1144）。加えて、ｅＩＦ４ＢはＲＮＡアニーリング活性を有し、ＲＮＡストランドにおける相補的配列の間の塩基対合を促進することが報告されている（Altmannら，1995，EMB O J ． 14:3820-3827）。また、それは、ｅＩＦ４ＡおよびｅＩＦ３に干渉する（M ethotら，1996，Mol ．Cell．Biol．16:5328-5334）。ｅＩＦ４Ｂの過剰生産の結果、翻訳の一般的阻害が起こる（Milburnら，1990，EMBO J 9:783-2790）。ヒト真核生物開始因子４Ｂについての配列は記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５５７３３、Milburnら，1990，EMBO J ．9:2783-2790）。５．７．１２．細胞遺伝子発現を下降調節する方法小分子阻害剤に加えて、セクション５．７．１−５．７．１１に記載された細胞遺伝子の発現および／または機能を下降調節する当該分野で知られたいずれの方法も本発明に含まれる。例えば、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子を用いて、標的化ｍＲＮＡに結合し、蛍白質翻訳を妨げることによって、これらの細胞遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックすることができる。ポリデオキシリボヌクレオチドは、デュプレックス化ＤＮＡ中の特異的相補的配列に水素結合することによって、配列−特異的三重ラセンを形成することができる。特異的三重ラセンの形成は、機能的トランス−作用性因子の特異的結合を禁止することによって、標的化遺伝子の複製および／または遺伝子発現を選択的に阻害することができる。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム酵素のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイムの配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてのエンドヌクレオチド分解的切断を含む。細胞ＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド分解的切断を特異的かつ効果的に触媒する遺伝工学的に作成したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本発明の範囲内のものである。標的配列に対して高い親和性結合を示すアンチセンスＲＮＡを、当業者に公知の酵素的に活性な配列の添加によって、リボザイムとして用いることもできる。三重ラセン形成で使用されるべきポリヌクレオチドは、一本鎖であり、デオキシヌクレオチドよりなるべきである。これらのポリヌクレオチドの塩基組成は、デュプレックスの１のストランド上に存在するプリンまたはピリミジンいずれかの捕獲可能なストレッチを一般的に要する、フーグスティーン塩基対合を介する三重ラセン形成を促進するように設計することができる。ポリヌクレオチド配列はピリミジン−ベースとすることができ、この結果、得られた三重ラセンの３つの会合したストランドを横切ったＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットが生じる。該ピリミジンリッチのポリヌクレオチドは、そのストランドに対して平行向きのデュプレックスの一本鎖のプリンリッチの領域に対する塩基相補性を供する。加えて、ポリヌクレオチドは、例えば、Ｇ残基のストレッチを含有するプリンリッチであるポリヌクレオチドを選択することができる。これらのポリヌクレオチドは、ＧＣ対がリッチなＤＮＡデュプレックスとの三重ラセンを形成するであろう。この場合、プリン残基の大部分は標的化デュプレックスの一本鎖上に位置し、その結果、トリプレックス中の３つのストランドを横切ったＧＧＣトリプレックスが生じる。あるいは、三重ラセン形成のために標的化できる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」ポリヌクレオチドを生成させることによって増加されることができる。スイッチバックポリヌクレオチドは、それらが、デュプレックスの第１の１のストランドと塩基対合し、次いで相互に対合し、デュプレックスの１のストランド上に存在させるべきプリンまたはピリミジンいずれかの捕獲可能なストレッチに対する必要性を排除するように、５’ −３’、３’−５’交互様式で合成される。本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびリボザイムは共に、当該分野で知られたいずれかの方法によって調製することができる。これらは、固相ホスホルアミダイト化学合成のような当該分野でよく知られたポリデオキシリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術を含む。別法として、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成されることができる。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターの様な適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む種々のベクターに取り込むことができる。別法として、使用するプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体を宿主細胞に安定に導入することができる。核酸分子に対する種々の修飾を、細胞内安定性および半減期を増大させる手段として導入することができる。可能な修飾は、限定されるものではないが、当該分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加またはオリゴデオキシリボフクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ −メチルの使用を含む。５．８．医薬製剤および阻害剤の投与の経路ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキナーゼ、カルネキシン、ＡＤＰ−リボシル化因子３、ユビキチン−特異的プロテアーゼ、ＣＤ４４、チロシンホスファターゼ、ホスファチジルイノシトールキナーゼ、伸長因子および真核生物翻訳開始因子をコードする遺伝子の発現の阻害化合物、ならびにそれらのコードされた産物の阻害剤を、それ自体、または阻害剤が適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物中にて、治療を必要とするヒト患者に投与することができる。治療上有効量とは、治療前状態と比較した、ＨＩＶ感染の阻害の結果となるのに十分な化合物のその量をいう。本出願の化合物の処方および投与についての技術は「Remington's Pharmaceutical Sci ence」Mack Publishing Co.，Easton，PA,最新版中に見出される。５．８．１．投与経路適当な投与経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜、経皮、または腸投与、筋肉内、骨髄内、ならびにクモ摸下腔、直接的心室内注入、静脈内、腹腔内、鼻孔内、または眼内注入を含めた非経口送達を含む。別法として、例えば、しばしばデポ剤または徐放性製剤中にて、特異的組織への化合物の直接的注射を介して、全身様式よりもむしろ局所様式で化合物を投与することができる。さらに、例えば、リポソーム中にて、および／または細胞−特異的抗体とコンジュゲートさせて、標的化薬物送達系にて化合物を投与することもできる。リポソームおよび細胞−特異的抗体は標的化され、ＨＩＶ−感染細胞によって選択的に摂取されるであろう。５．８．２．組成物／製剤本発明の医薬組成物は、自体公知の方法にて、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作成、混練、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。本発明で使用する医薬組成物は、かくして、医薬的に使用できる製造へと活性化合物を加工するのを容易とする賦形剤および補助剤よりなる１以上の生理学的に許容される担体を用いて、常法により処方することができる。適当な処方は、選択された投与経路に依存する。注射には、本発明の化合物を、ハンクスの溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水の様な生理学的に適合する緩衝液のような適当な水性溶液に処方することができる。経粘膜および皮下投与では、透過させるべきバリアーに対して適した浸透剤を該処方で使用される。かかる浸透剤は当該分野で公知である。経口投与では、当該分野でよく知られた医薬上許容される担体と活性化合物を合わせることによって、該化合物を処方することができる。かかる担体は、本発明の化合物が、治療すべき患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として処方できるようにする。経口使用用の医薬製剤は、所望により得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工し、適当な補助剤を添加した後、所望ならば錠剤または糖衣錠コアを得ることにより、固体賦形剤にて得ることができる。適当な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖のような充填剤、例えば、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤を添加することができる。糖衣錠コアには適当なコーティングを設ける。この目的では、所望によりアラビアガム、タルタ、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒またはその混合液を含有してもよい濃縮された糖溶液を用いることができる。活性化合物の用量の確認のためまたは活性化合物の異なる組合せを特徴付けるために染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。経口的に使用できる医薬製剤は、ゼラチンから作成されたプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールの様な可塑剤から作成されたソフトなシールされたカプセルを含む。ブッシューフィットカプセル剤は、ラクトースの様な充填剤、澱粉の様なバインダー、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムの様な滑沢剤および所望により安定化剤と混合した有効成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコールの様な適当な液体に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定化剤を添加することができる。経口投与の全ての処方は、かかる投与に適した用量とすべきである。バッカル投与では、該組成物は常法により処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入による投与では、本発明で使用される化合物は、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、加圧したパックまたはネビュライザーからエアロゾルスプレイ提示の形態で便宜には送達される。加圧エアロゾルの場合には、投与単位は、計量した量を送達するためのバルブを供することによって決定することができる。例えば、インヘーラーまたはインサフレーターで使用されるゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたは澱粉の様な適当な粉末ベースの粉末混合物を含有するように処方することができる。化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、投与単位形態に、例えば、防腐剤を添加した、アンプルまたは複数用量容器にて提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤の様な処方剤を含有することができる。非経口用医薬製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製することができる。適当な新油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドの様な脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランの様な懸濁液の粘度を上昇させる物質を含有することができる。所望により、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能とするための、化合物の溶解度を増加させる適当な安定化剤または剤を含有することもできる。別法として、活性化合物は、適当なビヒクル、例えば、使用前における滅菌した無ピローゲン水とでの復元のために粉末の形態とすることもできる。該化合物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドの様な通常の坐薬基剤を含有する坐薬または保持浣膓のような直腸組成物に処方することもできる。前記した製剤に加えて、該化合物は、デポ剤として処方することもできる。かかる長期作用製剤は、（例えば、皮下または筋肉内）移植によって、または筋肉内注射によって投与することができる。かくして、例えば、該化合物は（例えば、許容される油中の）適当なポリマーもしくは疎水性物質またはイオン交換樹脂とで、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として処方することができる。本発明の疎水性化合物用の医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水−混和性有機ポリマー、および水性相よりなる共溶媒系である。共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であり得る。ＶＰＤは、無水エタノール中で容量調製した、３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖポリエチレングリコール３００であり得る。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、水溶液中に５％デキストロースで１：１希釈したＶＰＤよりなる。この共溶媒系は疎水性化合物を溶解させ、それ自体が全身投与に際して低毒性しか生じない。当然、その溶解性および毒性特徴を破壊することなく、共溶媒系の割合をかなり変化させることができる。さらに、共溶媒成分の同一性を変化させることができる、例えば、他の低毒性非極性界面活性剤を、ポリソルベート８０の代わりに使用することができる、ポリエチレングリコールのフラクションサイズは変化させることができる、他の生体適合性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンでポリエチレングリコールを置き換えることができる、および他の糖または多糖でデキストロースを置き換えることができる。別法として、疎水性医薬化合物についての他の送達系を使用することもできる。リポソームおよびエマルジョンは疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体のよく知られた例である。ジメチルスルホキシドの様なある種の有機溶媒を使用することができるが、通常はより大きな毒性の犠牲を払う。加えて、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスの様な、徐放系を用いて送達することができる。種々の徐放性物質が確立されており、当業者によく知られている。徐放性カプセル剤その化学的性質に応じて、数週間ないし１００日までにわたって化合物を放出する。治療剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて、蛋白質安定化のためのさらなる戦略を使用することもできる。また、医薬組成物は、適当な固体もしくはゲル相担体または賦形剤を含むことができる。かかる担体または賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールの様なポリマーを含む。本発明の化合物は、医薬上許容される対イオンとの塩として供することができる。医薬上許容される塩は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸等を含めた多くの酸とで形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中でより安定な傾向がある。５．８．３．有効用量本発明で使用するのに適した医薬組成物は、有効成分がその意図した目的を達成するように含有された組成物を含む。さらに詳しくは、治療上有効量は、治療すべき対象の存在する徴候の発生を妨げる、またはそれを軽減するのに効果的な量である。有効量の決定は、特に、本明細書中の詳細な開示に徴して、十分に当業者の能力内のものである。本発明の方法で用いるいずれの化合物についても、治療上有効量は細胞培養アッセイからまず見積もることができる。例えば、細胞培養で測定してＥＣ５０（５０％増加のための有効量）を含む循環濃度範囲、すなわち、ＣＤ４発現を保持し、ウイルスｐ２４またはｇｐ１２０を減少させ、シンシチウム形成を妨げる、感染細胞により検定してＨＩＶ複製の最大の半分を達成するテスト化合物の濃度を達成する用量を動物モデルで処方することができる。かかる処方を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、LD５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上効果的な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手法によって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比は治療指標であって、それは、ＬＤ５０およびＥＤ５０の間の比率である。高い治療指標を呈する化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイから得られたデータは、ヒトで使用される用量の範囲を処方するにおいて使用することができる。かかる化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。該用量は、使用される投与形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。正確な処方、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Fingeら，1975 ，「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第１章、第１頁参照）。投与の量および間隔を個々に調整して、阻害効果を維持するのに十分な活性部位の血漿中レベルを提供することができる。全身投与用の有用な患者用量は１００−２０００ｍｇ／日である。患者の体の表面積で記載すると、通常の用量は５０−９１０ｍｇ／ｍ²／日の範囲である。通常の平均血漿中レベルは、０．１−１０００μＭ内に維持されるべきである。局所投与または選択的摂取の場合、化合物の効果的な局所濃度は血漿中濃度に関係しないであろう。投与される組成物の量は、勿論、治療されるべき対象、対象の体の表面積、病気の重症度、投与の様式および処方医師の判断に依存するであろう。６．実施例ＨＩＶ抑制活性を呈するヒト細胞−由来ＧＳＥの単離および同定６．１．材料および方法６．１．１．ＲＦＥラリブラリーの構築２つのＲＦＥラリブラリーを、Gudkovら（1994，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:3744）によって記載された方法に従って、２つのヒト細胞系のｃＤＮＡから構築した。ＨＬ−６０細胞およびＨｅＬａ細胞から調製したｃＤＮＡを、Ｍｎ⁺⁺ の存在下でＤＮＡｓｅＩで部分的に消化した（Sambrookら，1989，Molceular Cl oning A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.）。これらの条件下で、ＤＮＡｓｅＩはかなり二本鎖破壊を生じることが知られている。得られた断片をＤＮＡポリメラーゼＩおよびのクレノウ断片およびＴ４ポリメラーゼで修復し、合成二本鎖アダプターに連結した。５’アダプター（配列番号：２１および２２）は５’−ＣＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧ３’ＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＡＣ−５’ であった。３’アダプター（配列番号：２３および２４）は５’ＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＴＡＧＣＴＡＣＣＴＡＧＧＣＡＧＡＴＣＣＴ−５’ であった。ＨＬ−６０細胞から作成されたラリブラリーの場合、非誘導細胞からのｍＲＮＡをまずＴＮＦ−αで誘導した細胞からのｍＲＮＡから差し引いた。差し引かれたＨＬ−６０ラリブラリーはCocheら，1994，Nucleic Acids Res. 22:1322-1323 に記載された手法の修飾を表す。ＴＮＦ−αでの誘導後の種々の時点において、ＬＮＣＸプラスミドを含有するＨＬ−６０細胞からトレーサーｍＲＮＡを精製した。ＬＮＣＸ遺伝子を内部標準として用いて、差し引き後に、トレーサーに存在する配列の豊富さをモニターした。誘導または非誘導細胞から単離したｍＲＮＡを別々にオリゴｄＴ磁性ビーズ（Ｄｙｎａ）にアニールし、第１のｃＤＮＡストランドを、逆転写酵素およびプライマーとしてのオリゴｄＴを用いて合成した。ＲＮＡストランドを加水分解し、３つのＡＴＧコドンおよび３’末端の１０個のランダムヌクレオチドを含有するプライマーを用いて誘導した集団で第２ストランドを合成した。一本鎖ｃＤＮＡ断片を、磁性ビーズに付着させた過剰のドライバーｃＤＮＡにアニールした。スパイクしたＬＮＣＸ配列における実質的豊富さが観察されるまでこの手法を数回反復した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の最終集団は、３’末端の１０個のランダムヌクレオチドと共に全ての３つのリーディングフレームにおいて３つのＴＧＡコドンを持つプライマーを用いて増幅した。ｃＤＮＡ断片の得られた集団をＬＮＣＸにクローン化した。この工程は、ＨＩＶのライフサイクルのある段階を支持して、ＯＭ１０．１細胞へのレトロウイルス導入の低効率を補償するにおいて重要であろう細胞遺伝子によってコードされたｍＲＮＡにつき豊富化するために採用した。このラリブラリーは１０⁶組換えクローンによって表された。ＨｅＬａ細胞からのｃＤＮＡのランダム断片を正規化手法に付して、異なるＤＮＡ配列の均一な豊富さを提供した（GudkovおよびRoninson，1997，Methods in Molecular Biology 69:211，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.）。この手法を用いて、稀なｃＤＮＡからＧＳＥを単離する確率を増大させた。というのは、全ポリＡ⁺ＲＮＡは不均等に表された配列の混合物であったからである。略言すれば、方法は、まず、２５μｌのＴＥ緩衝液中で５分間沸騰させ、続いて直ちに氷上で冷却することによって、２０μｇのｃＤＮＡを変性した。次いで、２５μｌの２×ハイブリダイゼーション溶液を添加し、混合物を各々１２．５μ ｌのエッペンドルフ試験管中にて４つのアリコットに分割した。鉱油の２滴のうちの１滴を各試料に添加して、蒸発を回避し、試験管をアニーリングのために６８℃の水浴に入れた。１つの試験管を１２時間毎に凍結した。最後の時点後に、アニーリング混合物の各々を水で希釈して最終容量５００μｌとし、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）クロマトグラフィーに付した。ＨＡＰペレットの容量がほぼ１００μｌとなるように、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＨＡＰ懸濁液をエッペンドルフ試験管に入れた。ＨＡＰおよび後記で使用する全ての溶液を含む試験管を予備加熱し、６５℃に維持した。過剰のＰＢＳを除去し、希釈したアニーリング溶液を添加した。６５℃の水浴中で混合した後、ＨＡＰペレットが形成されるまで試験管を水浴中に放置した（１５秒間の遠心を用いて、ＨＡＰ結晶の損傷を回避するためにミクロ遠心機中で１０００ｇを超えることなくペレットを収集した。上清を１ｍｌの予備加熱した０．０１ＭＰＢＳで注意深く置き換え、プロセスを反復した。上清を合わせ、遠心によって痕跡量のＨＡＰを除去した。遠心によってｓｓＤＮＡを濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ −１００上で水１ｍｌを用いて３回洗浄した。１０μｇの生成物を得るための最小数のサイクルを用い、単離されたｓｓＤＮＡ配列を、アダプターからのセンスプライマーにおいてのＰＣＲによって増幅した。所望の範囲内（２００−５００ｂｐ）内に止まるＰＣＲ産物のサイズを確認した。０．３−１．０μｇの正規化したｃＤＮＡ／レーンを用い、高い−、中程度の−および低い−発現遺伝子についての³²Ｐ−標識プローブでのサザーンまたはスロット−ブロットハイブリダイゼーションによって、正規化品質をテストした。β−アクチンおよびβ−チューブリンｃＤＮＡを、高−発現遺伝子用のプローブ、中程度用のｃ−ｍｙｃおよびｔｏｐｏＩＩｃＤＮＡ、および低−発現遺伝子用のｃ−ｆｏｓｃＤＮＡとして使用した。種々のアニーリング時間後に単離されたｃＤＮＡを、元の非正規化ｃＤＮＡと比較した。プローブは同様のサイズおよび特異的活性を有することが確認された。クローニング用の少なくとも２０μｇの産物を合成する大規模なＰＣＲ増幅のために、異なるプローブで最も均一なシグナル強度を生じる最良の−正規化ｓｓＤＮＡフラクションを用いた。より多量のｓｓＤＮＡ鋳型を用いて、ＰＣＲの数または反応容量をスケールアップすることによって、所望の量を得た。正規化の後、アダプターに連結された断片の混合物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、カラム精製し、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（MillerおよびRosman，1989，BioTechniques 7:980-990）またはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＬ−ＮＧＦＲＭに連結した。ｐＬＮＧＦＲＭベクターは、ｎｅｏｒ遺伝子が切形された低親和性のＮＧＦＲ遺伝子で置き換えられた以外はｐＬＮＣＸベクターと同一である。ｐＬＮＧＦＲＭで形質導入した細胞は、抗−ＮＧＦＲ抗体およびＦＡＣＳによって容易に選択することができる切形受容体をそれらの表面で発現する。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。全プラスミドを〜１０，０００個の組換えクローンから精製した。アダプターに隣接したベクター配列から得られたプライマーを用い、クローン化断片のサイズ分布をＰＣＲ増幅によってテストした。６．１．２細胞系および試薬ＯＭ１０．１細胞はAmerican Type Culture Collection，Manaｓｓas，VAからＣＲＬ１０８５０として入手できる（Butera，米国特許第５，２５６，５３４号）。ＣＥＭ−ｓｓ細胞はカタログ番号７７６としてNIH AIDS Research and Refe rence Reagent Programから入手できる。ＨＩＶ−１_SF2はカタログ番号２７５としてNIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手できる。ＨＬ −６０細胞はAmerican Tissue Culture CollectionからＣＣＬ２４０として入手できる。ＨＩＶ−１_IIIBはAIDS Programからカタログ番号３９８として入手できる。抗−ＣＤ４（Ｑ４１２０ＰＥ）および抗−ｐ２４（ＫＣ−５７ＦＩＴＣ）抗体はＳｉｇｍａおよびＣｏｕｌｔｅｒから各々購入した。ＴＮＦ−αはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから得た。Ｇ４１８はＧｅｎｅｔｉｃｉｎとしてＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入した。抗−ＮＧＦＲ抗体はハイブリドーマ２０．４としてＡＴＣＣ（ＨＢ−８７３７）から得た（米国特許第４，７８６，５９３号および第４，８５５，２４１号）として得た。２つの抗−ＣＤ４抗体（Ｌ７７およびＬ１２０）はＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎから得た。６．１．３．ＧＳＥの形質導入および選択セクション６．１．１．の方法、前掲、に従ってＨＬ−６０細胞から調製したラリブラリーを、パッケージング細胞系ＰＡ３１７（ＡＴＣＣＣＲＬ＃９０７８）にトランスフェクトし、ＯＭ１０．１細胞の感染のためにレトロウイルスに変換した。ｐＬＮＣＸベクター中のラリブラリーを共培養し、Ｇ４１８で選択した。ｐＬＮＧＦＲＭベクター中のラリブラリーを、スピノキュレーション（濾過したレトロウイルス上清の存在下での１２００×ｇにおける９０分間の標的細胞の遠心）によって形質導入し、ＮＧＲＦ⁺集団のＦＡＣＳソーティングによって選択した。選択後、全ＲＦＥラリブラリーを保有するＯＭ１０．１細胞を３７℃ で１０Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−αで誘導し、２４時間後、抗体で染色し、ＣＤ４発現につきソートした。ＣＤ４⁺細胞からのゲノムＤＮＡを精製し、ベクター−由来プライマーにてのインサートのＰＣＲ増幅のために使用した。増幅された混合物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、レトロウイルスベクターに戻しクローン化した。選択をさらなるラウンド反復した。加えて、ＨｅＬａ細胞から作成した正規化ＲＦＥラリブラリーをＣＥＭ−ｓｓ細胞に導入し、ｎｅｏ耐性集団をＨＩＶ−１_IIIBの３０００のＴＣＩＤ₅₀／１０⁶ 細胞で感染させた。このＲＦＥラリブラリーは、５０×１０⁶の独立した組換えクローンによって表された。感染から４日および７日後、精製された抗−ＣＤ４モノクローナル抗体、Ｌ７７（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｎｓｏｎ）を５μｇ／ｍｌで添加して、シンシチウムの形成を妨げた。シンシチウムの形成は、感染細胞の表面で発現されたｇｐ１２０および未感染細胞の表面のＣＤ４の間の相互作用をブロックすることによって妨げられると考えられる。抗体Ｌ７７は細胞のＨＩＶ感染を妨げない。感染の１０−１２日後、未感染細胞を表すＣＤ４⁺、ｐ２４^- 細胞集団をソートした。ＣＤ４⁺、ｐ２４^-細胞からのゲノムＤＮＡを精製し、ベクター−由来プライマーでのインサートのＰＣＲ増幅のために用いた。増幅された混合物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、レトロウイルスベクターに戻しクローン化した。選択をさらなるラウンド反復した。６．１．４．免疫蛍光およびフローサイトメトリー選択のためのＣＤ４⁺細胞の免疫蛍光染色のため、１０⁷ 細胞をアッセイ緩衝液（５００ｍｌＰＢＳ、１ｍｌのｐＨ８の０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍｌの１０％アジ化ナトリウムおよび１０ｍｌの胎児子ウシ血清）で２回洗浄し、５０μｌの抗−ＣＤ４抗体（Ｑ４１２０ＰＥ、Ｓｉｇｍａ）を添加した５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、５ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、１２００ｒｐｍにて細胞を４分間遠心した。細胞をＦＡＣＳによるソーティング前にアッセイ緩衝液で２回洗浄した。前記手法を滅菌条件下で行った。ＨＩＶ−感染細胞におけるｐ２４発現を測定するために、細胞をまずアッセイ緩衝液で２回洗浄した。約１０⁶細胞を１００μｌのアッセイ緩衝液に懸濁させ、２ｍｌのＯｒｔｈｏＰｅｒｍｅａＦｉｘ溶液（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合し、室温で４０分間インキシュベートした。４℃での４分間の１２００ｒｐｍでの遠心後、細胞を２ｍｌのアッセイ緩衝液（５００ｍｌＰＢＳ、２５ｍｌの胎児ウシ血清、１．５％ウシ血清アルブミンおよび０．００５５％ＥＤＴＡ）に室温で１０分間で再懸濁した。遠心後、細胞を５０μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、４℃にて２０分間、ＩｇＧ_2a抗体の１：５００希釈と混合し、続いて４℃にて３０分間、５−１０μｌの抗−ｐ２４抗体（ＫＣ５７−ＦＩＴＣ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ＮＧＦＲ⁺細胞の選択のために、１０⁷個の細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのアッセイ緩衝液＋５％正常マウス血清で２回洗浄し、２ｍｌの抗 −ＮＧＦＲ−ＰＥ抗体を添加した。４℃での３０分間のインキュベーションの後、５ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、細胞を１２００ｒｐｍで４分間遠心した。ＦＡＣＳによるソーティングの前に細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄した。６．１．５．ＧＳＥの回収および配列分析細胞ペレットを、１×ＰＣＲ緩衝液中の０．１％トリトンＸ−１００、２０μ ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫに再懸濁させ、５５℃で１時間インキュベートし、次いで１０分間沸騰させることによって、推定ＧＳＥを保有するＯＭ１０．１またはＣＥＭ−ｓｓ細胞の選択された集団からゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡは、ベクター−由来プライマーを用いてＰＣＲ増幅で用い、当該分野でよく知られた技術を用いてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のプラスミドを、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いてＥ．ｃｏｌｉクローンから精製した。ジデオキシ手法によってインサートを配列決定し（Auto Read SequencIng Kit，Pharmaci a Biotech）、ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーで泳動させた。ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを用いて配列を分析した。６．２．結果２つの選択戦略を用いて、ＲＦＥラリブラリーから、ＨＩＶ−抑制活性を持つヒト細胞−由来ＧＳＥを単離した。１つの戦略は、ＨＩＶによる細胞の生産的感染を抑制するＧＳＥにつき選択した。第２の戦略はＯＭ１０．１細胞における潜伏性プロウイルスの誘導を抑制するＧＳＥにつき選択した。ＯＭ１０．１細胞をＴＮＦ−αで処理し、細胞表面分子ＣＤＤ４につき特異的抗体で染色すると、ＣＤ４抑制の迅速な喪失が観察された（図１）。対照的に、未誘導ＯＭ１０．１細胞のほとんど大部分がＣＤ４発現を保持した。ＴＮＦ−αによるＯＭ１０．１細胞における潜伏性ウイルスの活性化は、細胞質ＣＤ４に結合し、それにより、細胞表面へのその移動を妨げるウイルス蛋白質ｇｐ１２０の生産に導く。ＣＤ４⁺ ＯＭ１０．１細胞の減少は、ＴＮＦ−α誘導に続く細胞でのウイルス蛋白質ｐ２４の増大した生産とも相関する。発現されたヒト細胞遺伝子を表すｃＤＮＡに由来するＧＳＥを同定し、リードアウトとしてＯＭ１０．１細胞中のＨＩＶプロウイルス活性化を用い、ＨＬ−６０細胞から作成したＲＦＥラリブラリーから単離した。全ラリブラリーのパッケージング細胞系へのトランスフェクションに続き、ラリブラリーを担うレトロウイルスを用いて、共培養およびスピノキュレーションによってＯＭ１０．１細胞を感染させ、ＮＧＦＲ選択を行い、ウイルスベクターの保護を確認した。感染細胞をＴＮＦ−αで処理すると、少数の残存するＣＤ４⁺細胞を、抗− ＣＤ４抗体によって検出し、ＦＡＣＳによってソートした。これらの細胞に含有されるＧＳＥをＰＣＲ増幅によって回収し、それらのヌクレオチド配列を決定した。ＯＭ１０．１およびＣＥＭ−ｓｓ細胞を用い、２つの前記した選択戦略によって、合成２０のＧＳＥを単離した。これらのＧＳＥのうち６つは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ酵素複合体の異なるサブユニットをコードする遺伝子のｃＤＮＡと実質的配列同一性を有することが示された。例えば、ＣＦ−３１５（配列番号：１）は、ミトコンドリア酵素ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットＮＤ６をコードする遺伝子とソノセンス向きで配列同一性を有する、アンチセンス分子としてＨＩＶ複製を抑制するＧＳＥである（Chomynら，1988，Science 234:614）（図２）。ＣＦ−３１５は、さらに、生産的なＨＩＶ−１感染から未感染ヒトＴ細胞を保護することが示された（図３）。この実験において、ＣＦ−３１５ポリヌクチレオチドを含有するレトロウイルスベクターｐＬＮＧＦＲＭをＣＥＭ−ｓｓ細胞に導入し、続いてＮＧＦＲ選択した。プラスミドＤＮＡを含有するベクター（ＬＮＧＦＲＭと命名）を陰性対照として用いた。ＮＧＦＲ⁺細胞は９９％ＣＤ４⁺であり、次いで、それらを４０００のＴＣＩＤ₅₀のＨＩＶ−１_SF2で感染させた。感染細胞を感染後１１、１４、１８、２１、２５、２８、３２、３５および３９日後に取り出し、ＨＩＶ感染のインジケーターとしての蛍光化−抗−ｐ２４抗体で染色した。図３は、ＣＦ−３１５が、ベクタープラスミドＤＮＡの陰性対照と比較して、ＨＩＶ−１_SF2によるヒトＴ細胞の感染を阻害した。ＣＦ−３１９（配列番号：２）は、センス向きでＨＩＶ複製を抑制し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ６サブユニットをコードする遺伝子のもう１つの部分との実質的配列同一性を有するＧＳＥである（図４）。ＣＦ−１０１（配列番号：３）は、センス向きで、そのＨＩＶ−抑制活性を有し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ２のサブユニットをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図５）（Chomynら，1985，Natuere 314:592）。ＣＦ−１１７（配列番号：４）はアンチセンス分子としてＨＩＶ活性を抑制し、そのセンス向きで、それはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ６サブユニットをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図６）。ＣＦ−０２５（配列番号：５）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＳ２サブユニットをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図７）。ＣＦ− １２８（配列番号：６）は、センス向きでＨＩＶ感染を抑制し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのＮＤ４サブユニットをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図８）。両選択戦略はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの異なるサブユニットと実質的配列同一性を有するＧＳＥを生産したので、この酵素複合体はＨＩＶ感染の間に重要な役割を演じ得、従って、この複合体またはそのサブユニットのいずれかの発現を下降調節する方法を用いて、感染細胞においてＨＩＶ複製を阻害することができる。ＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を用いるＨｅＬａ細胞ライブラリーからのＧＳＥの選択は、他の細胞遺伝子との実質的配列同一性を有する１２のさらなるポリヌクレオチドを単離した。ＣＦ−００４（配列番号：７）は、ヒト２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する（図９）（Koike，1995，Gene 158:261-266、Koikeら，1992，Proc ．Natl．Acad ．Sci．U.S.A. 89:1963-1967）。ＣＦ−１１３（配列番号：８）は、センス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、ヒトＭ２−タイプ推定キナーゼおよび胸腺ホルモン結合蛋白質との実質的配列同一性を有する（図１０）（Katoら，1989，Proc ．Na tl．Acad．Sci．U．S．A. 86:7861-7865）。ＣＦ−２０４（配列番号：９）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、ヒトカルネキシンをコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する（図１１）（Davidら、199 3，J ．Biol．Chem. 268:9585-9592）ＣＦ−００１（配列番号：１０）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、ヒトＡＤＰ−リボシル化因子３をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する（図１２）（Tsaiら，1991，J ．B iol．Chem. 266:23053-23059）。ＣＦ−２７３（配列番号：１１）は、センス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、ヒト真核生物翻訳開始因子３をコードする遺伝子との実質的配列同一性を有する（図１３）（MerrickおよびHershey，1996，Tran slational Control ，３１−６９頁，Cold Spring Harbor，NY）。ＣＦ−３１１（配列番号：１２）は、アンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、それはヒトプロテインチロシンホスファターゼをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図１４）（Kimら，1996，Oncogene 13:2275-2279）。ＣＦ−３１３（配列番号：１３）はセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、ヒト・プロテインチロシンホスファターゼをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図１５）（KeyseおよびEmslie，1992，Nature，359:644-647）。ＣＦ −２１０（配列番号：１４）はセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、ヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼと実質的に配列同一性を有する（図１６）（Everettら，1997，EMBO J. 16：566-577）。ＣＦ−２６６（配列番号：１５）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、それは、ヒト真核生物開始因子４Ｂをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図１７）（Milburnら，1990，EMBO J. 9:2783-2790）。ＣＦ−３０２（配列番号：１６）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、それは、ヒトＣＤ４４をコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図１８）（Stramenkovic ら，1991，EMBO J ．10:243-248）。ＣＦ−３１７（配列番号：１７）はアンチセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、そのセンス向きで、ヒト・ホスファチジルイノシトール３−キナーゼをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図１９）（Voliniaら，1995，EMBO J ．14:3339-3348）。ＣＦ−２８６（配列番号：１８）はセンス分子としてＨＩＶ感染を抑制し、ヒト伸長因子−１αをコードする遺伝子と実質的配列同一性を有する（図２０）（vctsukyら，1989，J ．Biol ．Chem. 264:5791-5798）。加えて、２つの単離されたＧＳＥは配列比較によるといずれの公知の遺伝子とも配列相同性を有しなかった。ＣＦ−０６１（配列番号：１９）はＯＭ１０．１細胞で選択された（図２１）。ＣＦ−２８０（配列番号：２０）はＣＥＭ−ｓｓ細胞で選択された（図２２）。これらの２つのポリヌクレオチドは、ＨＩＶ感染を支持するにおいて役割を演じる未知のヒト細胞遺伝子の一部を表す。図２３は、ＨＩＶによるＣＥＭ−ｓｓ細胞の生産的感染を防止するにおける前記４つの例示的ＧＳＥの能力を示す。ＧＳＥを区別される細胞遺伝子の断片として単離されるが、それらは、対照と比較して、感染細胞においてｐ２４レベルの低下によって示される様に全てＨＩＶ感染を阻害した。加えて、図２４は、アンチセンス分子として機能するＣＦ−００１のＨＩＶ−抑制活性を示す。７．実施例：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤はＨＩＶ感染を抑制する。７．１．材料および方法７．１．１．ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤であるアミタール（Ｓｉｇｍａ）およびモファロテン（Ｕｃｈｉｄａら，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５８：８９１−８９７）を滅菌培養培地中で希釈し、示した濃度に従って使用した。７．１．２．阻害アッセイＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤でのインキュベーションおよびＴＮＦ−α誘導に先立っておよびその間に、ＯＭ１０．１細胞をＲＰＭＩ１６４０無グルコース培地中で培養した。阻害剤を細胞に添加し、続いて１−２時間後にＴＮＦ−α 誘導した。抗−ＣＤ４抗体染色および３７℃での２４時間のインキュベーション後のフローサイトメトリーによって細胞によるＣＤ４の発現を評価した。７．１．３．新たに単離したＣＤ４⁺細胞の感染Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度購買分離を用い、ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。細胞を２回洗浄し、０．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋２％ヒトＡＢ血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン＋１００単位／ｍｌのＩＬ−２中に再懸濁した。次いで、ＰＨＬを０．５μｇ／ｍｌにてフィトヘマトグルチニンで活性化し、３７℃／５％ＣＯ₂ にて湿潤化インキュベーター中に入れた。２日の活性化後に、１０⁶細胞を、種々の濃度のモファロテン：０μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭおよび０．０５μＭの存在下で、１０００のＴＣＩＤ₅₀にてＨＩＶ−１_SF33で感染させた。同一濃度のモファロテン下の未感染試料の別の組も対照として維持した。試料を感染の第４日および第６日後にフローサイトメトリーによって分析した。細胞を（Ｔ細胞につき）ＣＤ３発現の間ゲートした。次いで、ＣＤ４およびウイルスｐ２４およびＣＤ４の発現を、ビバリエートドットプロットによって調べた。７．２．結果いくつかのＧＳＥを選択し、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの異なるサブユニットをコードする細胞遺伝子との実質的配列同一性を有することが示されたので、公知のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ−阻害性活性を持つ２つの化合物をＨＩＶ感染を抑制するそれらの能力につきテストした。図２５は、ＴＮＦ−α誘導ＯＭ１０．１細胞によってＣＤ４発現を保護するその能力によって示される様に、用量依存的に、ＯＭ１０．１細胞において潜伏性ＨＩＶプロウイルスの誘導をアミタールが阻害したことを示す。同一アッセイにおいて、ミトコンドリア遺伝子発現を下降調節するモファロテンは低い濃度においてもＨＩＶ−１誘導を阻害した（図２６）。１００ｎＭのモファロテンにおいて、８０％の細胞がＣＤ４発現を保持し、８０％を超える細胞が生きたままであった。加えて、ｐ２４発現をＨＩＶ感染による指標として測定し、アミタールおよびモファロテンは共に未処理対照と比較して、処理細胞において細胞内ｐ２４レベルを抑制した。ＨＩＶによるＴ細胞の生産的感染を防止するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤の能力をテストするために、ヒトＰＢＬを単離し、種々の濃度のモファロテンの存在下で、ＨＩＶ_SF33で感染させた。ＣＤ３⁺Ｔ細胞をＣＤ４およびウイルスｐ２４のそれらの発現に関して分析し、結果を表１に示す。感染の４日後に、モファロテンを添加したかしていないかに拘わらず、ＨＩＶで感染させたＰＢＬの間の検出できる差異はほとんどなかった。モファロテンは単独で、ＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセント後に有意に変化させず、細胞表面のＣＤ３の発現レベルを変化させなかった。第６日には、有意な差異がＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセントおよびｐ２４⁺ＣＤ４⁺ Ｔ細胞に関して検出された。モファロテン無しでのＨＩＶ−感染試料において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の３３％およびＴ細胞の１５％のみがＣＤ４⁺であった。ＨＩＶ−股間線対照試料では、Ｔ細胞の〜３２％がＣＤ４⁺であり、ＨＩＶ感染によるＣＤ４⁺Ｔ細胞の劇的な枯渇を示唆する。１μＭのモファロテンでのＨＩＶ−感染試料において、１０％のＣＤ４⁺Ｔ細胞がｐ２４⁺であった。加えて、Ｔ細胞の〜２５％がＣＤ４⁺であり、これは、モファロテンがＨＩＶ感染によるＣＤ４⁺細胞の枯渇を阻害することを示す。モファロテンによる保護のレベルは、ＣＤ３⁺Ｔ細胞集団におけるｐ２４⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセンテージおよびＣＤ４⁺細胞のパーセンテージによって測定される様に、減少した濃度のモファロテンにて低下した。モファロテンは単独で未感染試料においてＣＤ４⁺Ｔ細胞のパーセンテージを低下させたが、効果は最小であった（４％高いまで）。第６日に、モファロテンは細胞表面でのＣＤ３の発現レベルを変化させなかった。よって、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ阻害剤はヒトＴ細胞の初代培養によってＨＩＶによる生産的感染を防止した。本発明は、本発明の個々の態様の説明として意図される例示的実施形態によって範囲が限定されるものではない。事実、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の種々の修飾は、これまでの記載および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修飾は添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用した全ての刊行物は出典を明示して本明細書に一体化させる。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１２月１４日（１９９９．１２．１４）【補正内容】請求の範囲１．細胞遺伝子の全長部分未満またはその相補体である単離されたポリヌクレオチドを含むＨＩＶ阻害性組成物であって、前記遺伝子は生産的ＨＩＶ感染に必要な細胞内産物をコードし、前記単離されたポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に連結し、かつ宿主細胞における前記単離されたポリヌクレオチドの発現がＨＩＶによる感染を阻害する組成物。２．ＨＩＶによる感染の阻害が、ＨＩＶ感染に続く、細胞における継続したＣＤ４の発現によって測定される請求項１に記載の組成物。３．ＨＩＶによる感染の阻害が、ＨＩＶ感染に続く、細胞における低下したウイルスｐ２４の発現によって測定される請求項１に記載の組成物。４．細胞遺伝子がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードしている請求項１に記載の組成物。５．ポリヌクレオチドが、配列番号１に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。６．ポリヌクレオチドが、配列番号２に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。７．ポリヌクレオチドが、配列番号３に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。８．ポリヌクレオチドが、配列番号４に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。９．ポリヌクレオチドが、配列番号５に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。１０．ポリヌクレオチドが、配列番号６に示された配列を含んでいる請求項４に記載の組成物。１１．細胞遺伝子が２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼをコードしている請求項１に記載の組成物。１２．ポリヌクレオチドが、配列番号７に示された配列を含んでいる請求項１１に記載の組成物。１３．細胞遺伝子がピルベートキナーゼをコードしている請求項１に記載の組成物。１４．ポリヌクレオチドが、配列番号８に示された配列を含んでいる請求項１３に記載の組成物。１５．細胞遺伝子がカルネキシンをコードしている請求項１に記載の組成物。１６．ポリヌクレオチドが、配列番号９に示された配列を含んでいる請求項１５に記載の組成物。１７．細胞遺伝子がＡＤＰ−リボシル化因子３をコードしている請求項１に記載の組成物。１８．ポリヌクレオチドが、配列番号１０に示された配列を含んでいる請求項１７に記載の組成物。１９．細胞遺伝子が真核生物の開始因子３をコードしている請求項１に記載の組成物。２０．ポリヌクレオチドが、配列番号１１に示された配列を含んでいる請求項１９に記載の組成物。２１．細胞遺伝子がプロテインチロシンホスファターゼをコードしている請求項１に記載の組成物。２２．ポリヌクレオチドが、配列番号１２に示された配列を含んでいる請求項２１に記載の組成物。２３．ポリヌクレオチドが、配列番号１３に示された配列を含んでいる請求項２１に記載の組成物。２４．細胞遺伝子がヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼをコードしている請求項１に記載の組成物。２５．ポリヌクレオチドが、配列番号１４に示された配列を含んでいる請求項２４に記載の組成物。２６．細胞遺伝子が真核生物の開始因子４Ｂをコードしている請求項１に記載の組成物。２７．ポリヌクレオチドが、配列番号１５に示された配列を含んでいる請求項２６に記載の組成物。２８．細胞遺伝子がホスファチジルイノシトール３キナーゼをコードしている請求項１に記載の組成物。２９．ポリヌクレオチドが、配列番号１７に示された配列を含んでいる請求項２８に記載の組成物。３０．細胞遺伝子が伸長因子１αをコードしている請求項１に記載の組成物。３１．ポリヌクレオチドが、配列番号１８に示された配列を含んでいる請求項３０に記載の組成物。３２．ポリヌクレオチドが、配列番号１９に示された配列を含んでいる請求項１に記載の組成物。３３．ポリヌクレオチドが、配列番号２０に示された配列を含んでいる請求項１に記載の組成物。３４．ヒトＣＤ４４をコードしている遺伝子の一部またはその相補体を含むＨＩＶ阻害性組成物であって、前記ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結し、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現が、ＨＩＶによる感染を阻害する組成物。３５．ポリヌクレオチドが、配列番号１６に示された配列を含んでいる請求項３４に記載の組成物。３６．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のいずれかのポリヌクレオチドを含有している発現ベクター。３７．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のいずれかのポリヌクレオチドを含有している遺伝子工学的に作製された宿主細胞。３８．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のいずれかのポリヌクレオチドを含む医薬組成物。３９．（ａ）細胞ＤＮＡからのポリヌクレオチド断片の発現ライブラリーを構築し、（ｂ）宿主細胞に発現ライブラリーを導入し、次いで、（ｃ）細胞における検出可能なマーカーのレベルを測定することによって、ＨＩＶ感染を阻害するポリヌクレオチドを含有する細胞を選択することを含む、ＨＩＶ感染に必要な産物をコードする細胞遺伝子を、同定する方法。４０．細胞が誘導可能な潜伏性ＨＩＶプロウイルスを含有している請求項３９に記載の方法。４１．宿主細胞がＯＭ１０．１である請求項４０に記載の方法。４２．細胞がＴＮＦ−αによって誘導される請求項４０に記載の方法。４３．マーカーが細胞のＣＤ４である請求項３９に記載の方法。４４．マーカーの発現が宿主細胞によって保持されている請求項３９に記載の方法。４５．マーカーがウイルス蛋白質ｐ２４である請求項３９に記載の方法。４６．マーカーがウイルス蛋白質ｇｐ１２０である請求項３９に記載の方法。４７．マーカーの発現が宿主細胞において抑制されている請求項４５または４６に記載の方法。４８．有効量の請求項１に記載の組成物を、導入することを含むＨＩＶ感染から宿主細胞を保護する方法。４９．組成物がインビトロで宿主細胞に導入される請求項４８に記載の方法。５０．組成物がインビボで宿主細胞に導入される請求項４８に記載の方法。５１．治療上有効量の請求項１に記載の組成物を、個体に投与してＨＩＶ感染を阻害することを含むＨＩＶ感染の治療方法。５２．治療上有効量の細胞遺伝子の阻害剤を、個体に投与してＨＩＶ感染を阻害することを含むＨＩＶ感染を阻害する方法。５３．ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットの遺伝子発現を、阻害剤が下降調節する請求項５２に記載の方法。５４．阻害剤がモファロテンである請求項５３に記載の方法。５５．阻害剤が酵素活性を干渉する請求項５２に記載の方法。５６．阻害剤がアミタールである請求項５５に記載の方法。５７．阻害剤が２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。５８．阻害剤がピルベートキナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。５９．阻害剤がカルネキシン阻害剤である請求項５２に記載の方法。６０．阻害剤がＡＤＰ−リボシル化因子３阻害剤である請求項５２に記載の方法。６１．阻害剤がユビキチン−特異的プロテアーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６２．阻害剤がＣＤ４４阻害剤である請求項５２に記載の方法。６３．阻害剤がチロシンホスファターゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６４．阻害剤がホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６５．阻害剤が真核生物の伸長因子阻害剤である請求項５２に記載の方法。６６．阻害剤が真核生物の開始因子３阻害剤である請求項５２に記載の方法。６７．阻害剤が真核生物の開始因子４Ｂ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６８．（ａ）生産的ＨＩＶ感染に必要な細胞遺伝子を発現する哺乳類の細胞をテスト化合物に暴露し、（ｂ）細胞における細胞の遺伝子の発現またはそれがコードされた産物の活性を測定し、次いで（ｃ）前記遺伝子の発現を下降調節するか、またはそれがコードされた産物の活性に干渉する化合物を選択することを含む、ＨＩＶ阻害剤を選択する方法。６９．細胞遺伝子がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードしている請求項６８に記載の方法。７０．細胞遺伝子が、Ｍ２−タイプのピルベートキナーゼと細胞質甲状腺ホルモン結合蛋白質とをコードしている請求項６８に記載の方法。７１．細胞遺伝子がカルネキシンをコードしている請求項６８に記載の方法。７２．細胞遺伝子がＡＤＰ−リボシル化因子３をコードしている請求項６８に記載の方法。７３．細胞遺伝子が真核生物の開始因子３をコードしている請求項６８に記載の方法。７４．細胞遺伝子がチロシンホスファターゼをコードしている請求項６８に記載の方法。７５．細胞遺伝子がヘルペス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼをコードしている請求項６８に記載の方法。７６．細胞遺伝子が真核生物の開始因子４Ｂをコードしている請求項６８に記載の方法。７７．細胞遺伝子がＣＤ４４をコードしている請求項６８に記載の方法。７８．細胞遺伝子がホスファチジルイノシトール３キナーセをコードしている請求項６８に記載の方法。７９．細胞遺伝子が伸長因子１αをコードしている請求項６８に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/99 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/68 14/715 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 9/02 14/715 9/06 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/12 9/06 9/16 Ｂ 9/12 9/64 Ｚ 9/16 15/00 ＺＮＡＡ 9/64 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ダン、ステファンジェイ. アメリカ合衆国 94041 カリフォルニア州マウンテンヴューポールアヴェニュー 80 (72)発明者デイン、アンドリューアメリカ合衆国 94043 カリフォルニア州マウンテンヴューウィンドミルパークレイン 880

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞遺伝子の一部またはその相補体に対応する単離されたポリヌクレオチドを含むＨＩＶ阻害性組成物であって、前記遺伝子は生産的ＨＩＶ感染に必要な細胞内産物をコードし、前記ポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に連結し、かつ宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現はＨＩＶによる感染を阻害する組成物。２．ＨＩＶによる感染の阻害が細胞における継続したＣＤ４発現、続いてのＨＩＶ感染によって測定される請求項１に記載の組成物。３．ＨＩＶによる感染の阻害が細胞における低下したウイルスｐ２４発現、続いてのＨＩＶ感染によって測定される請求項１に記載の組成物。４．細胞遺伝子がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードする請求項１に記載の組成物。５．ポリヌクレオチドが配列番号：１に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。６．ポリヌクレオチドが配列番号：２に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。７．ポリヌクレオチドが配列番号：３に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。８．ポリヌクレオチドが配列番号：４に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。９．ポリヌクレオチドが配列番号：５に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。１０．ポリヌクレオチドが配列番号：６に記載された配列を含む請求項４に記載の組成物。１１．細胞遺伝子が２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼである請求項１に記載の組成物。１２．ポリヌクレオチドが配列番号：７に記載された配列を含む請求項１１に記載の組成物。１３．細胞遺伝子がピルベートキナーゼをコードする請求項１に記載の組成物。１４．ポリヌクレオチドが配列番号：８に記載された配列を含む請求項１３に記載の組成物。１５．細胞遺伝子がカルネクシンをコードする請求項１に記載の組成物。１６．ポリヌクレオチドが配列番号：９によって記載された配列を含む請求項１５に記載の組成物。１７．細胞遺伝子がＡＤＰ−リボシル化因子３をコードする請求項１に記載の組成物。１８．ポリヌクレオチドが配列番号：１０に記載された配列を含む請求項１７に記載の組成物。１９．細胞遺伝子が真核生物開始因子３をコードする請求項１に記載の組成物。２０．ポリヌクレオチドが配列番号：１１に記載された配列を含む請求項１９に記載の組成物。２１．細胞遺伝子がプロテインチロシンホスファターゼをコードする請求項１に記載の組成物。２２．ポリヌクレオチドが配列番号：１２に記載された配列を含む請求項２１に記載の組成物。２３．ポリヌクレオチドが配列番号：１３に記載された配列を含む請求項２１に記載の組成物。２４．細胞遺伝子がヘルペスウイルス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼをコードする請求項１に記載の組成物。２５．ポリヌクレオチドが配列番号：１４に記載された配列を含む請求項２４に記載の組成物。２６．細胞遺伝子が真核生物開始因子４Ｂをコードする請求項１に記載の組成物。２７．ポリヌクレオチドが配列番号：１５に記載された配列を含む請求項２６に記載の組成物。２８．細胞遺伝子がホスファチジルイノシトール３キナーゼをコードする請求項１に記載の組成物。２９．ポリヌクレオチドが配列番号：１７に記載された配列を含む請求項２８に記載の組成物。３０．細胞遺伝子が伸長因子１アルファをコードする請求項１に記載の組成物。３１．ポリヌクレオチドが配列番号：１８に記載された配列を含む請求項３０に記載の組成物。３２．ポリヌクレオチドが配列番号：１９に記載された配列を含む請求項１に記載の組成物。３３．ポリヌクレオチドが配列番号：２０に記載された配列を含む請求項１に記載の組成物。３４．ヒトＣＤ４４をコードいる遺伝子の一部またはその相補体を含むＨＩＶ阻害性組成物であって、前記ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結し、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現がＨＩＶによる感染を阻害する組成物。３５．ポリヌクレオチドが配列番号：１６に記載された配列を含む請求項３４に記載の組成物。３６．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。３７．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のポリヌクレオチドを含有する遺伝子工学により作成された宿主細胞。３８．請求項５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３３または３５のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。３９．（ａ）細胞ＤＮＡからのポリヌクレオチド断片の発現ライブラリーを構築し、（ｂ）宿主細胞に発現ライブラリーを導入し、次いで、（ｃ）細胞における選択マーカーのレベルを測定することによって、ＨＩＶ感染を阻害するポリヌクレオチドを含有する細胞を選択することを特徴とする、ＨＩＶ感染に必要な産物をコードする細胞遺伝子を同定する方法。４０．細胞が誘導可能な潜伏性ＨＩＶプロウイルスを含有する請求項３９に記載の方法。４１．宿主細胞が〇Ｍ１０．１である請求項４０に記載の方法。４２．細胞がＴＮＦ−αによって誘導される請求項３０に記載の方法。４３．マーカーが細胞ＣＤ４である請求項３９に記載の方法。４４．マーカーの発現が宿主細胞によって保持される請求項３９に記載の方法。４５．マーカーがウイルス蛋白質ｐ２４である請求項３９に記載の方法。４６．マーカーがウイルス蛋白質ｇｐ１２０である請求項３９に記載の方法。４７．マーカーの発現が宿主細胞において抑制される請求項４５または４６に記載の方法。４８．有効量の請求項１に記載の組成物を導入することを特徴とする、ＨＩＶ感染から宿主細胞を保護する方法。４９．組成物がインビトロで宿主細胞に導入される請求項４８に記載の方法。５０．組成物がインビボで宿主細胞に導入される請求項４８に記載の方法。５１．治療上有効量の請求項１に記載の組成物を個体に投与してＨＩＶ感染を阻害することを特徴とするＨＩＶ感染の治療方法。５２．治療上有効量の細胞遺伝子の阻害剤を個体に投与してＨＩＶ感染を阻害することを特徴とするＨＩＶ感染を阻害する方法。５３．ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットの遺伝子発現を阻害剤が下降調節する請求項５２に記載の方法。５４．阻害剤がモファロテンである請求項５３に記載の方法。５５．阻害剤が酵素活性に干渉する請求項５２に記載の方法。５６．阻害剤がアミタールである請求項５２に記載の方法。５７．阻害剤が２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。５８．阻害剤がピルベートキナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。５９．阻害剤がカルネキシン阻害剤である請求項５２に記載の方法。６０．阻害剤がＡＤＰ−リボシル化因子３阻害剤である請求項５２に記載の方法。６１．阻害剤がユビキチン−特異的プロテアーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６２．阻害剤がＣＤ４４阻害剤である請求項５２に記載の方法。６３．阻害剤がチロシンホスファターゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６４．阻害剤がホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６５．阻害剤が真核生物伸長因子阻害剤である請求項５２に記載の方法。６６．阻害剤が真核生物開始因子３阻害剤である請求項５２に記載の方法。６７．阻害剤が真核生物開始因子４Ｂ阻害剤である請求項５２に記載の方法。６８．（ａ）哺乳動物細胞をテスト化合物に暴露し、（ｂ）細胞における前記細胞の遺伝子の発現またはそのコードされた産物の活性を測定し、次いで（ｃ）遺伝子の発現を下降調節し、またはそのコードされた産物の活性に干渉する化合物を選択することを特徴とするＨＩＶ阻害剤を選択する方法。６９．細胞遺伝子をＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードする請求項６８に記載の方法。７０．細胞遺伝子がＭ２−タイブのピルベートキナーゼおよび細胞ゾル甲状腺ホルモン結合蛋白質をコードする請求項６８に記載の方法。７１．細胞遺伝子がカルネクシンをコードする請求項６８に記載の方法。７２．細胞遺伝子がＡＤＰ−リボシル化因子３をコードする請求項６８に記載の方法。７３．細胞遺伝子が真核生物開始因子３をコードする請求項６８に記載の方法。７４．細胞遺伝子がチロシンホスファターゼをコードする請求項６８に記載の方法。７５．細胞遺伝子がヘルペス−関連ユビキチン−特異的プロテアーゼをコードする請求項６８に記載の方法。７６．細胞遺伝子が真核生物開始因子４Ｂをコードする請求項６８に記載の方法。７７．細胞遺伝子がＣＤ４４をコードする請求項６８に記載の方法。７８．細胞遺伝子がホスファチジルイノシトール３キナーゼをコードする請求項６８に記載の方法。７９．細胞遺伝子が伸長因子１アルファをコードする請求項６８に記載の方法。