ES2318131T3 - Metodos de modulacion de la actividad tubulina desacetilasa. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para identificar un agente que modula la actividad enzimática de una tubulina desacetilasa dependiente de NAD humana, comprendiendo el método: poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba en una mezcla de ensayo que comprende NAD y un péptido de tubulina acetilado; y determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa dependiente de NAD.
Description
Métodos de modulación de la actividad tubulina
desacetilasa.
La presente invención pertenece al campo de las
enzimas desacetilasas y de las enzimas que modifican la
tubulina.
La acetilación reversible de las histonas se
encuentra bajo el control de actividades enzimáticas opuestas de
dos categorías de enzimas: las histona desacetilasas (HDAC) y las
histona acetiltransferasas (HAT). La desacetilación de restos de
lisina en colas N-terminales de histonas por HDAC
generalmente está asociada con el silenciamiento transcripcional,
mientras que la acetilación de los mismos restos de lisina está
asociada con la activación de la transcripción. Además de las
histonas, una cantidad que está creciendo rápidamente de otras
proteínas no histonas experimentan la modificación postraduccional
de la acetilación en restos de lisina. Un ejemplo de algunas de
estas proteínas incluye HMG-14 y 17, HMGI(Y),
p53, E2F1, NF-\kappaB y la proteína Tat de
VIH-1. Las HDAC se separan en tres clases distintas
basándose en su homología con represores de la transcripción de
levaduras. Las desacetilasas de clase I y de clase II son homólogos
de las proteínas Rpd3p y Hdalp, respectivamente. Las HDAC de clase
III se definen basándose en su homología con el represor de la
transcripción de levaduras Sir2p.
La familia de genes reguladores de la
información de silenciamiento (SIR) se identificó inicialmente
basándose en su papel en la regulación de la expresión génica en
los loci HM en S. cerevisiae. Ciertos estudios
posteriores definieron adicionalmente el papel de las proteínas SIR
en el silenciamiento transcripcional en varios loci adicionales en
el genoma de levadura, incluyendo telómeros, el locus de ADNr y en
sitios de lesiones en el ADN. El silenciamiento en los telómeros y
en los loci HM está mediado por un complejo multiproteína
que incluye Sir2p, Sir3p y Sir4p, estando implicada Sir1p en el
silenciamiento de loci HM únicamente. De manera interesante,
el silenciamiento y la represión de la recombinación en el locus de
ADNr se consigue por Sir2p en asociación con el complejo RENT, que
contiene Net1, Nan1 y cdc14, y se ha asociado con el envejecimiento
en S. cerevisiae. El reciente descubrimiento de que SIR2
codifica una histona desacetilasa dependiente de NAD ha validado la
sospecha mantenida durante mucho tiempo de que esta proteína
regulaba el nivel de acetilación de las histonas.
La familia de genes SIR2 está conservada desde
las arqueobacterias a los eucariotas. En S cerevisiae, esta
familia consiste en Sir2 y cuatro genes muy relacionados
(HST1-4). Aunque Sir2p y HST1p se localizan
principalmente en el núcleo, Hst2p es exclusivamente citoplásmica.
Los seres humanos tienen siete proteínas con homología con Sir2p de
S. cerevisiae, que se han denominado Sirtuínas o SIRT. La
SIRT1 humana y la Sir2\alpha de ratón, que son los homólogos más
parecidos a Sir2p y HST1p, presentan una actividad proteína
desacetilasa con especificidad por la proteína del factor de
transcripción p53. La desacetilación de p53 por SIRT1 reprime la
apoptosis dependiente de p53 en respuesta a las lesiones en el ADN.
La proteína SIRT2 humana, que es la relacionada más estrechamente
con Hst2p, también se localiza en el citoplasma. De manera
interesante, tanto SIRT2 como Hst2p regulan el silenciamiento del
ADNr y telomérico indirectamente desde su localización
citoplásmica.
La red de microtúbulos se forma por la
polimerización de heterodímeros de \alpha/\beta tubulina y
juega un papel importante en la regulación de la forma celular, el
transporte intracelular, la motilidad celular y la división
celular. Las subunidades de \alpha y \beta tubulina se someten a
numerosas modificaciones postraduccionales incluyendo tirosinación,
fosforilación, poliglutaminación, poliglicilación y acetilación. La
tubulina representa una de las proteínas citoplásmicas acetiladas
principales. La acetilación de la tubulina tiene lugar en la
lisina-40 de la \alpha-tubulina
que, basándose en la estructura cristalina del heterodímero de
tubulina, se predice que está dentro del lado luminal del
microtúbulo polimerizado.
Se ha notificado que una diversidad de señales
fisiológicas modulan el nivel de acetilación de tubulina. Éstas
incluyen el fármaco anticanceroso paclitaxel, así como la asociación
de MAP1 y 2C, tau y la proteína VP22 codificada por el virus del
herpes simple. De forma similar, los microtúbulos asociados con
estructuras estables tales como los cilios, contienen
\alpha-tubulina relativamente hiperacetilada.
Estas observaciones han respaldado la opinión de que los
microtúbulos estabilizados llegan a estar hiperacetilados. Sin
embargo, no se han identificado las enzimas responsables de la
acetilación reversible de la tubulina. Esta falta de reactivos ha
impedido un análisis minucioso del papel biológico de la
acetilación de tubulina en la dinámica de los microtúbulos, la
estabilidad y las funciones fisiológicas del citoesqueleto.
Grozinger et al (J. Biol. Chem., 2001,
276:38837-38843) mencionan la identificación de una
clase de inhibidores de molécula pequeña de la familia de
desacetilasas dependientes de NAD conocidas como sirtuínas por
selección fenotípica. Maruta et al (J. Cell. Biol, 1986,
103:571-579) mencionan la acetilación de la
alfa-tubulina y su relación con el ensamblaje y
desensamblaje de los microtúbulos. El documento WO 89/06132 se
refiere a un inhibidor de transcriptasa inversa tal como
3'-azido-3'-desoxitimidina
para el tratamiento o profilaxis de un carcinoma asociado con
retrovirus tal como un cáncer de mama en un ser humano.
La presente invención proporciona métodos para
identificar agentes que modulan el nivel o la actividad del
polipéptido tubulina desacetilasa, así como agentes identificados
por los métodos. La invención, además proporciona métodos para
modular la actividad tubulina desacetilasa en una célula. La
invención también proporciona métodos para modular la proliferación
celular por medio de la modulación de la actividad de la tubulina
desacetilasa.
La invención se refiere a un método in
vitro para identificar un agente que modula una actividad
enzimática de una tubulina desacetilasa humana, por ejemplo la
SIRT2 humana. El método comprende, en general, poner en contacto un
polipéptido de tubulina desacetilasa con un agente de ensayo en una
mezcla de ensayo que comprende dinucleótido de nicotinamida adenina
(NAD) y un péptido de tubulina acetilado y determinar el efecto, si
lo hay, del agente de ensayo sobre la actividad enzimática de la
tubulina desacetilasa. En algunas realizaciones, el polipéptido de
tubulina desacetilasa comprende una secuencia de aminoácidos como la
indicada en la SEC ID Nº: 02. En algunas realizaciones, el péptido
de tubulina acetilado comprende la secuencia
NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG-CO_{2}
(SEC ID Nº: 08). En algunas realizaciones, el péptido de tubulina
acetilado contiene un grupo acetilo marcado con ^{14}C en una
lisina correspondiente a la Lys-40 de la tubulina
nativa, y la determinación del efecto del agente sobre la enzima se
realiza midiendo la liberación del grupo acetilo radiactivo. En
algunas realizaciones, el efecto del agente sobre la actividad de
la enzima se mide detectando la unión de un anticuerpo específico
para la tubulina
acetilada.
acetilada.
La presente invención se refiere además a un
método in vitro para identificar un agente que modula el
nivel de tubulina desacetilasa en una célula. El método generalmente
implica poner en contacto una célula que produce tubulina
desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo
hay, del agente de ensayo sobre el nivel de tubulina desacetilasa.
En algunas realizaciones, la determinación del efecto del agente
implica determinar el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa en la
célula. En otras realizaciones, la determinación del efecto del
agente implica determinar el nivel de polipéptido de tubulina
desacetilasa en la célula.
La invención también proporciona el uso de un
agente que inhibe la tubulina desacetilasa dependiente de NAD para
la fabricación de un medicamento para tratar cánceres en un
individuo, donde el agente es ribavirina, y donde la ribavirina es
para la administración en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día por
administración oral. La invención también proporciona ribavirina
para uso en un método de tratamiento de cánceres en un individuo,
donde el uso comprende la administración oral de ribavirina en una
dosis de 30 mg a 1200 mg al día.
Las figuras 1A-D representan la
desacetilación dependiente de NAD de un péptido de histona por SIRT2
humana.
Las figuras 2A-C representan la
inactivación de la actividad histona desacetilasa de SIRT2 por
mutaciones puntuales dentro del dominio catalítico de SIRT2.
Las figuras 3A-E representan que
SIRT2 desacetila la tubulina ex vivo.
Las figuras 4A-D representan la
preferencia de sustrato para SIRT2.
Las figuras 5A y 5B representan la regulación de
la distribución subcelular de MIZ-1 por medio de
tubulina acetilada.
Las figuras 6A y 6B representan las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente, de SIRT2 humana
(SEC ID Nº: 01 y 02, respectivamente).
La figura 7 representa la inhibición por
ribavirina de SIRT2.
Los términos "polipéptido" y
"proteína", usados en el presente documento de forma
indistinta, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de
cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no
codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o
bioquímicamente y polipéptidos que tienen estructuras peptídicas
modificadas. El término incluye proteínas de fusión, incluyendo pero
sin limitación proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos
heterólogos, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas,
con o sin restos de metionina N-terminales;
proteínas marcadas inmunológicamente; y similares.
Un polipéptido "aislado sustancialmente" o
"aislado" es uno que carece sustancialmente de las
macromoléculas con las que está asociado en la naturaleza. Por
carece sustancialmente se entiende que carece de al menos el 50%,
preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 80%
e incluso más preferiblemente al menos el 90% de los materiales con
los que está asociado en la naturaleza.
Una "muestra biológica" incluye una
diversidad de tipos de muestras obtenidos a partir de un individuo y
puede usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La
definición incluye sangre y otras muestras líquidas de origen
biológico, muestras de tejidos sólidos tales como muestras de
biopsia o cultivos de tejidos o células procedentes de las mismas y
su descendencia. La definición también incluye muestras que se han
manipulado de cualquier manera después de su obtención, tal como
por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento en
ciertos componentes tales como polinucleótidos. La expresión
"muestra biológica" incluye una muestra clínica, y también
incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados
celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de
tejidos.
Los términos "cáncer", "neoplasma",
"tumor" y "carcinoma" se usan en el presente documento de
forma indistinta para hacer referencia a células que presentan un
crecimiento relativamente autónomo, de forma que presentan un
fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida
significativa de control de la proliferación celular. Las células
cancerosas pueden ser benignas o malignas.
Como se usan en este documento, los términos
"tratamiento", "tratar" y similares se refieren a la
obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El
efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o
parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser
terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una
enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad.
"Tratamiento", como se usa en el presente documento, incluye
cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particular
en un ser humano, e incluye: (a) la prevención de que aparezca la
enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la
enfermedad pero en el que aún no se ha diagnosticado; (b) la
inhibición de la enfermedad, es decir, la detención de su
desarrollo; y (c) el alivio de la enfermedad, es decir, la regresión
de la enfermedad.
Antes de describir adicionalmente la presente
invención, debe entenderse que esta invención no se limita a
realizaciones particulares descritas ya que éstas, por supuesto,
pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en
el presente documento tiene los fines de describir realizaciones
particulares únicamente y no debe considerarse limitante, ya que el
alcance de la presente invención se limitará solamente por las
reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores,
debe entenderse que dentro de la invención está incluido cada valor
intermedio, hasta el decimal de la unidad del límite inferior a
menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite
superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado
o intermedio en dicho intervalo. Los límites superior e inferior de
estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente
en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la
invención, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el
intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o los
dos límites, también se incluyen en la invención intervalos que
excluyen uno cualquiera o los dos límites incluidos.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un
especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta
invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención
puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a
los descritos en este documento, los métodos y materiales preferidos
se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en
el presente documento se incorporan como referencia para describir
y analizar los métodos y/o materiales en relación con los que se
citan en las publicaciones.
Debe indicarse que, como se usa en el presente
documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares
"un" o "una", y "la" o "el" incluyen los
referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra
cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una tubulina
desacetilasa" incluye una pluralidad de dichas desacetilasas y
la referencia al "agente" incluye la referencia a uno o más
agentes y equivalentes de los mismos conocidos por los
especialistas en la técnica, y similares.
Las publicaciones descritas en el presente
documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de
la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el
presente documento debe considerarse una admisión de que la
presente invención no tiene derecho a preceder a dichas
publicaciones en virtud de la invención anterior. Además, las
fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las
fechas de la publicación reales que pueden necesitar confirmarse de
forma independiente.
La presente invención proporciona métodos para
identificar un agente que modula el nivel o la actividad de la
tubulina desacetilasa; agentes identificados por los métodos; y
métodos terapéuticos, incluyendo métodos para estabilizar
microtúbulos, métodos para controlar la proliferación celular
indeseada y métodos para tratar trastornos asociados o producidos
por una proliferación celular indeseada.
La invención se basa, en parte, en la
observación de que la SIRT2 humana es una tubulina desacetilasa
dependiente de NAD. La enzima SIRT2 humana es una proteína
citoplásmica que está muy relacionada con la proteína Hst2P de
Saccharomyces cerevisiae, que no desacetila la tubulina; y es
un ortólogo de la proteína 2 reguladora de la información de
silenciamiento de S. cerevisiae (Sir2p), una histona
desacetilasa que interviene en el silenciamiento transcripcional.
La SIRT2 humana retira un grupo acetilo de la
lisina-40 de la \alpha-tubulina.
La desacetilación de la tubulina también produce una reducción en la
interacción específica de la tubulina con el factor de
transcripción-1 de dedo de cinc de interacción con
myc-1 ("MIZ-1").
La identificación de SIRT2 humana como una
tubulina desacetilasa permitió el desarrollo de ensayos para
identificar agentes que modulan la actividad de esta enzima. Los
agentes que modulan el nivel o la actividad enzimática de la SIRT2
humana son útiles para modular la proliferación celular y, por lo
tanto, son útiles, por ejemplo, como agentes anticancerosos.
La invención proporciona métodos in vitro
para identificar un agente que modula el nivel o la actividad de
una tubulina desacetilasa. Los métodos generalmente implican poner
contacto una proteína tubulina desacetilasa, o una célula que
produce una proteína tubulina desacetilasa, con un agente de ensayo,
y determinar el efecto, si lo hay, sobre el nivel o la actividad de
la proteína tubulina desacetilasa.
En algunas realizaciones, los métodos son
métodos sin células. Los métodos sin células generalmente implican
poner en contacto una tubulina desacetilasa con un agente de ensayo
y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo sobre la
actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.
En otras realizaciones, los métodos son métodos
basados en células. Los métodos basados en células implican, en
general, poner en contacto una célula que produce tubulina
desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo
hay, del agente de ensayo sobre el nivel de ARNm de tubulina
desacetilasa o proteína tubulina desacetilasa en la célula. En
algunas realizaciones, los métodos basados en células implican poner
en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un
agente de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de
ensayo sobre la unión de una proteína a tubulina.
Como se usa en el presente documento, el término
"determinar" se refiere a determinaciones tanto cuantitativas
como cualitativas y como tal, el término "determinar" se usa
indistintamente en el presente documento con "ensayar",
"medir" y similares.
La expresión "polipéptido de tubulina
desacetilasa" incluye proteínas tubulina desacetilasas humanas
(por ejemplo, proteínas SIRT2 humanas) que tienen las secuencias de
aminoácidos indicadas en cualquiera de los números de acceso del
GenBank NM_012237; AF083107; y NM_030593, o se representan en la
Figura 6B, donde el polipéptido es una proteína citoplásmica y
presenta actividad tubulina desacetilasa dependiente de NAD. El
término incluye variantes que tienen inserciones, deleciones y/o
sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan a la
capacidad de la proteína para desacetilar
\alpha-tubulina que tiene una lisina acetilada en
la posición 40. En algunas realizaciones, la tubulina desacetilasa
es recombinante, por ejemplo, se produce en una célula transfectada
con una construcción de expresión que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica la tubulina desacetilasa.
La expresión "polipéptido de tubulina
desacetilasa" incluye además proteínas de fusión que comprenden
una tubulina desacetilasa y un polipéptido heterólogo
("compañeros de fusión"), donde los compañeros de fusión
adecuados incluyen marcadores inmunológicos tales como marcadores de
epítopos incluyendo, pero sin limitación, hemaglutinina, FLAG
(véase, por ejemplo, Archives of Biochem and Biophys. 406:
209-221, 2002; J. Bio. Chem., 277(23):
20750-20755, 2002), y similares; proteínas que
proporcionan una señal detectable incluyendo, pero sin limitación,
proteínas fluorescentes (por ejemplo, una proteína fluorescente
verde, una proteína fluorescente de una especie de antozoo y
similares), enzimas (por ejemplo
\beta-galactosidasa, luciferasa, peroxidasa de
rábano picante, etc.) y similares; polipéptidos que facilitan la
purificación o aislamiento de la proteína de fusión, por ejemplo,
polipéptidos de unión a iones metálicos tales como marcadores 6His
(por ejemplo, tubulina desacetilasa/6His),
glutatión-S-transferasa (GST) y
similares. La expresión "polipéptido de tubulina desacetilasa"
incluye además un polipéptido de tubulina desacetilasa modificado
para incluir uno o más sitios de escisión específicos de
proteasa.
Las actividades atribuidas a la tubulina
desacetilasa incluyen acetilación de la Lys-40 de
tubulina; control de la unión MIZ-1/tubulina y
similares. De esta manera, una "actividad de tubulina
desacetilasa" incluye la actividad directa, por ejemplo,
acetilación de tubulina; y actividades indirectas, por ejemplo, una
reducción en la unión de MIZ-1 a tubulina. Puede
encontrarse una secuencia de aminoácidos de la proteína
MIZ-1 con el número de acceso del GenBank Q
13105.
Cuando el ensayo es un ensayo sin células in
vitro, los métodos generalmente implican poner en contacto un
polipéptido de tubulina desacetilasa con un agente de ensayo. El
polipéptido de tubulina desacetilasa puede purificarse, pero esto
no es necesario. Por ejemplo, el polipéptido de tubulina
desacetilasa puede estar en un lisado celular, o puede estar
aislado o purificado parcialmente. De esta manera, el ensayo puede
realizarse en presencia de componentes adicionales siempre que los
componentes adicionales no afecten adversamente a la reacción en un
grado inaceptable.
Cuando el ensayo es un ensayo basado en células
in vitro, puede usarse cualquiera de una diversidad de
células. Las células usadas en el ensayo normalmente son células
eucariotas incluyendo, pero sin limitación, células de roedores,
células humanas y células de levadura. Las células pueden ser
cultivos celulares primarios o pueden ser líneas celulares
inmortalizadas. Las células pueden ser "recombinantes", por
ejemplo, la célula puede tener una construcción introducida de
forma transitoria o estable (por ejemplo, un plásmido, un vector
viral recombinante o cualquier otro vector adecuado) que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de
tubulina desacetilasa, o que comprende una secuencia de nucleótidos
que comprende un promotor de tubulina desacetilasa unido de forma
funcional a un gen indicador.
Las expresiones "agente candidato",
"agente de ensayo", "agente", "sustancia" y
"compuesto" se usan indistintamente en el presente documento.
Los agentes candidatos incluyen numerosas clases químicas,
típicamente moléculas orgánicas o inorgánicas sintéticas,
semi-sintéticas o naturales. Los agentes candidatos
incluyen los que se encuentran en grandes bibliotecas de compuestos
sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles en el
mercado bibliotecas de compuestos sintéticos en Maybridge Chemical
Co. (Trevillet, Cornwall, UK), ComGenex (South San Francisco, CA) y
MicroSource (New Milford, CT). En Aldrich (Milwaukee, Wis) está
disponible una biblioteca química rara y también puede usarse. Como
alternativa, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales
en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales en
Pan Labs (Bothell, WA) o se pueden producir fácilmente.
Los agentes candidatos pueden ser compuestos
orgánicos o inorgánicos pequeños que tienen un peso molecular mayor
de 50 y menor de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes
candidatos pueden comprender grupos funcionales necesarios para la
interacción estructural con proteínas, particularmente formación de
enlaces de hidrógeno, y pueden incluir al menos un grupo amina,
carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener al menos dos de
los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden
comprender carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o
estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de
los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes
candidatos entre biomoléculas, incluyendo péptidos, sacáridos,
ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados,
análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
Los ensayos de la invención incluyen controles,
donde los controles adecuados incluyen una muestra (por ejemplo,
una muestra que comprende proteína tubulina desacetilasa o una
célula que sintetiza tubulina desacetilasa) en ausencia del agente
de ensayo. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se
procesan en paralelo con diferentes concentraciones de agente para
obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones.
Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control
negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de
detección.
Cuando el ensayo de selección es un ensayo de
unión (por ejemplo, unión a tubulina desacetilasa; unión de
MIZ-1 a tubulina), una o más de las moléculas pueden
unirse a un marcador, donde el marcador puede proporcionar directa
o indirectamente una señal detectable. Diversos marcadores incluyen
radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas,
moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo, partículas
magnéticas y similares. Las moléculas de unión específicas incluyen
pares, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina
etc. En el caso de los miembros de unión específicos, el miembro
complementario normalmente se marcaría con una molécula que
facilita la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos.
En el ensayo de selección pueden incluirse una
diversidad de reactivos distintos. Éstos incluyen reactivos tales
como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes,
etc. que se usan para facilitar una unión óptima
proteína-proteína y/o reducir las interacciones no
específicas o de fondo. Pueden usarse reactivos que mejoran la
eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores
de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. Los componentes de la
mezcla de ensayo se añaden en cualquier orden que proporcione la
unión requerida u otra actividad. Las incubaciones se realizan a
cualquier temperatura adecuada, típicamente entre 4\capC y
4\capC. Los periodos de incubación se seleccionan para conseguir
una actividad óptima, pero también pueden optimizarse para
facilitar una selección de alto rendimiento. Típicamente será
suficiente un periodo comprendido entre 0,1 y 1 hora.
Los métodos de selección pueden diseñarse de
varias formas diferentes, pudiendo emplearse una diversidad de
configuraciones de ensayo y protocolos, como se conoce en la
técnica. Por ejemplo, uno de los componentes puede unirse a un
soporte sólido y los demás componentes pueden ponerse en contacto
con el componente unido al soporte. Los componentes anteriores del
método pueden combinarse sustancialmente al mismo tiempo o en
momentos diferentes.
Cuando el ensayo es un ensayo de unión, después
de las etapas de contacto e incubación los métodos de la presente
invención generalmente, aunque no necesariamente, incluirán además
una etapa de lavado para retirar los componentes no unidos, donde
dicha etapa de lavado generalmente se emplea cuando sea necesario
para retirar el marcador que daría lugar a una señal de fondo
durante la detección, tales como componentes unidos de forma no
específica marcados con fluorescencia o radiactivos. Después de la
etapa de lavado opcional, se detectará la presencia de complejos
unidos.
Un agente de ensayo de interés es uno que reduce
el nivel de proteína tubulina desacetilasa o inhibe la actividad
tubulina desacetilasa al menos en aproximadamente un 10%, al menos
en aproximadamente un 20%, al menos en aproximadamente un 25%, al
menos en aproximadamente un 30%, al menos en aproximadamente un 35%,
al menos en aproximadamente un 40%, al menos en aproximadamente un
45%, al menos en aproximadamente un 50%, al menos en
aproximadamente un 55%, al menos en aproximadamente un 60%, al menos
en aproximadamente un 65%, al menos en aproximadamente un 70%, al
menos en aproximadamente un 80%, al menos en aproximadamente un 90%
o más, en comparación con un control en ausencia de agente de
ensayo.
Los presentes métodos de selección incluyen
métodos para detectar un agente que modula el nivel de un ARNm de
tubulina desacetilasa y/o un polipéptido de tubulina desacetilasa en
una célula. En algunas realizaciones, los métodos implican poner en
contacto una célula que produce tubulina desacetilasa con un agente
de ensayo y determinar el efecto, si lo hay, del agente de ensayo
sobre el nivel de ARNm de tubulina desacetilasa en la célula.
Un agente candidato se ensaya con respecto a
cualquier actividad citotóxica que pueda presentar hacia la célula
usada en el ensayo usando ensayos bien conocidos, tales como
exclusión de colorante azul tripán, un ensayo de MTT (bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio)
y similares. Los agentes que no presentan actividad citotóxica se
consideran agentes candidatos.
Para identificar agentes que reducen el nivel de
tubulina desacetilasa en una célula eucariota, puede usarse una
amplia diversidad de ensayos basados en células que usan, por
ejemplo, una célula que normalmente produce ARNm de tubulina
desacetilasa, una célula de mamífero transformada con una
construcción que comprende un ADNc que codifica tubulina
desacetilasa de tal forma que el ADNc se sobreexprese o, como
alternativa, una construcción que comprende un promotor de tubulina
desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para identificar un agente, particularmente
un agente biológicamente activo, que reduce el nivel de expresión de
tubulina desacetilasa en una célula, comprendiendo el método:
combinar un agente candidato a ensayar con una célula que comprende
un ácido nucleico que codifica un polipéptido de tubulina
desacetilasa, o una construcción que comprende un promotor de
tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador;
y determinar el efecto de dicho agente sobre la expresión de
tubulina desacetilasa. Una reducción de al menos aproximadamente un
10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un
25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un
35%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un
45%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un
55%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un
65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un
80%, al menos aproximadamente un 90%, o más, en el nivel (es decir,
en la cantidad) de ARNm y/o polipéptido de tubulina desacetilasa
después del contacto de la célula con un agente candidato a
ensayar, en comparación con un control al que no se le ha añadido
agente, es una indicación de que el agente modula la expresión de
la tubulina desacetilasa.
El ARNm y/o el polipéptido de tubulina
desacetilasa cuyos niveles se están midiendo pueden codificarse por
un polinucleótido endógeno de tubulina desacetilasa, o el
polinucleótido de tubulina desacetilasa puede ser uno comprendido
dentro de un vector recombinante e introducido dentro de la célula,
es decir, el ARNm y/o el polipéptido de tubulina desacetilasa puede
codificarse por un polinucleótido exógeno de tubulina desacetilasa.
Por ejemplo, un vector recombinante puede comprender una secuencia
reguladora de la transcripción de tubulina desacetilasa aislada,
tal como una secuencia de promotor, unida de forma funcional a un
gen indicador (por ejemplo, \beta-galactosidasa,
cloranfenicol acetil transferasa, una proteína fluorescente,
luciferasa u otro gen que puede ensayarse fácilmente con respecto a
la expresión).
En estas realizaciones, el método para
identificar un agente que modula el nivel de expresión de tubulina
desacetilasa en una célula comprende: combinar un agente candidato a
ensayar con una célula que comprende un ácido nucleico que
comprende un elemento regulador de la transcripción del gen de
tubulina desacetilasa unido de forma funcional a un gen indicador;
y determinar el efecto de dicho agente sobre la expresión del gen
indicador. Un vector recombinante puede comprender una secuencia
reguladora de la transcripción de tubulina desacetilasa aislada,
tal como una secuencia de promotor, unida de forma funcional a
secuencias que codifican un polipéptido de tubulina desacetilasa; o
las secuencias de control de la transcripción pueden unirse de
forma funcional a secuencias codificantes de una proteína de fusión
de tubulina desacetilasa que comprenden un polipéptido de tubulina
desacetilasa fusionado a un polipéptido que facilita la detección.
En estas realizaciones, el método comprende combinar un agente
candidato a ensayar con una célula que comprende un ácido nucleico
que comprende un elemento regulador de la transcripción del gen de
tubulina desacetilasa unido de forma funcional a una secuencia
codificante de un polipéptido de tubulina desacetilasa; y determinar
el efecto de dicho agente sobre la expresión de la tubulina
desacetilasa, pudiendo realizarse dicha determinación midiendo una
cantidad de ARNm de tubulina desacetilasa, polipéptido de tubulina
desacetilasa o polipéptido de fusión de tubulina desacetilasa
producido por la célula.
Los ensayos basados en células generalmente
comprenden las etapas de poner en contacto la célula con un agente
a ensayar, formar una muestra de ensayo y, después de un periodo de
tiempo adecuado, evaluar el efecto del agente sobre la expresión de
la tubulina desacetilasa. Una muestra de control comprende la misma
célula, sin el agente candidato añadido. Los niveles de expresión
de tubulina desacetilasa se miden tanto en la muestra de ensayo
como en la muestra de control. Se realiza una comparación entre el
nivel de expresión de tubulina desacetilasa en la muestra de ensayo
y la expresión de tubulina desacetilasa en la muestra de control
puede evaluarse usando ensayos convencionales. Por ejemplo, cuando
una línea celular de mamífero se transforma con una construcción
que produce la expresión de la tubulina desacetilasa, pueden
detectarse y medirse los niveles de ARNm de tubulina desacetilasa,
o pueden detectarse y medirse los niveles de polipéptido de tubulina
desacetilasa. Un periodo de tiempo adecuado para poner en contacto
el agente con la célula puede determinarse empíricamente, y
generalmente es un periodo de tiempo suficiente para permitir la
entrada de la agente en la célula y permitir que el agente tenga un
efecto medible sobre los niveles de ARNm y/o polipéptido de tubulina
desacetilasa. Generalmente, un periodo de tiempo adecuado está
comprendido entre 10 minutos y 24 horas, o es de aproximadamente 1
hora a aproximadamente 8 horas.
Los métodos para medir los niveles de ARNm de
tubulina desacetilasa son conocidos en la técnica, habiéndose
descrito anteriormente varios de ellos, y cualquiera de estos
métodos puede usarse en los métodos de la presente invención para
identificar un agente que modula el nivel de ARNm de tubulina
desacetilasa en una célula incluyendo, pero sin limitación, una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como una PCR que
emplea cebadores oligonucleotídicos marcados de forma detectable, y
cualquiera de una diversidad de ensayos de hibridación.
De forma similar, los niveles de polipéptido de
tubulina desacetilasa pueden medirse usando cualquier método
convencional, habiéndose descrito en el presente documento varios de
ellos incluyendo, pero sin limitación, un inmunoensayo tal como un
ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), por ejemplo un
ELISA que emplea un anticuerpo marcado de forma detectable
específico para un polipéptido de tubulina desacetilasa.
Los niveles de polipéptido de tubulina
desacetilasa también pueden medirse en células que llevan una
construcción recombinante que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de fusión de tubulina
desacetilasa, donde el compañero de fusión proporciona una señal
detectable o puede detectarse de otra manera. Por ejemplo, cuando
el compañero de fusión proporciona un epítopo reconocible
inmunológicamente (un "marcador de epítopo"), puede usarse un
anticuerpo específico para un epítopo del compañero de fusión para
detectar y cuantificar el nivel de tubulina desacetilasa. En
algunas realizaciones, el compañero de fusión proporciona una señal
detectable y en estas realizaciones el método de detección se elige
basándose en el tipo de señal generada por el compañero de fusión.
Por ejemplo, cuando el compañero de fusión es una proteína
fluorescente, se mide la fluorescencia.
Las proteínas fluorescentes adecuadas para uso
incluyen, pero sin limitación, una proteína fluorescente verde
(GFP) incluyendo, pero sin limitación, una versión "humanizada"
de una GFP, por ejemplo, donde los codones de la secuencia de
nucleótidos natural se han cambiado por una preferencia codónica
humana con una correspondencia más estrecha; una GFP derivada de
Aequoria victoria o un derivado de la misma, por ejemplo, un
derivado "humanizado" tal como una GFP mejorada, que está
disponible en el mercado, por ejemplo, en Clontech, Inc.; una GFP
de otra especie tal como Renilla reniformis, Renilla mulleri
o Ptilosarcus guernyi, como se describe, por ejemplo, en el
documento WO 99/49019 and Peelle et al. (2001) J. Protein
Chem. 20:507-519; GFP recombinante
"humanizada" (hrGFP) (Stratagene); cualquiera de una diversidad
de proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de antozoos
como se describe, por ejemplo, en Matz et al. (1999) Nature
Biotechnol. 17:969-973; y similares. Cuando el
compañero de fusión es una enzima que produce un producto
detectable, el producto puede detectarse usando un medio apropiado,
por ejemplo, la \beta-galactosidasa, dependiendo
del sustrato, puede producir un producto coloreado que se detecta
espectrofotométricamente, o un producto fluorescente; la luciferasa
puede producir un producto luminiscente detectable con un
luminómetro; etc.
Se dispone de varios métodos para analizar
ácidos nucleicos con respecto a la presencia y/o nivel de un ARNm
específico en una célula. El ARNm puede ensayarse directamente o
transcribirse de forma inversa en ADNc para el análisis. El ácido
nucleico puede amplificarse por técnicas convencionales tales como
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para proporcionar
suficientes cantidades para el análisis. El uso de la reacción en
cadena de la polimerasa se describe en Saiki, et al. (1985),
Science 239:487, y puede encontrarse una revisión de técnicas en
Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH
Press 1989, páginas 14.2-14.33. Como alternativa,
en la técnica se conocen diversos métodos que utilizan ligamiento de
oligonucleótidos como medio de detección de polimorfismos, por
ejemplo, véase Riley et al. (1990), Nucl. Acids Res.
18:2887-2890; y Delahunty et al. (1996), Am.
J. Hum. Genet. 58:1239-1246.
En una reacción de amplificación puede incluirse
un marcador detectable. Los marcadores adecuados incluyen
fluorocromos, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC),
rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina,
6-carboxifluoresceína (6-FAM),
2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína
(JOE),
6-carboxi-X-rodamina
(ROX),
6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína
(HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM)
o
N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina
(TAMRA), marcadores radiactivos, por ejemplo, ^{32}P, ^{35}S,
^{3}H; etc. El marcador puede ser un sistema de dos fases, donde
el ADN amplificado se conjuga con biotina, haptenos, etc. que tienen
un compañero de unión de alta afinidad, por ejemplo, avidina,
anticuerpos específicos, etc., donde el compañero de unión se
conjuga con un marcador detectable. El marcador puede conjugarse
con uno o con los dos cebadores. Como alternativa, el grupo de
nucleótidos usados en la amplificación se marca para incorporar el
marcador en el producto de amplificación.
Los especialistas en la técnica conocen una
diversidad de métodos diferentes para determinar la abundancia de
ácidos nucleicos en una muestra, incluyendo los métodos particulares
de interés los descritos en: Pietu et al., Genome Res.
(Junio de 1996) 6:492-503; Zhao et al., Gene
(24 de abril de 1995) 156:207-213; Soares, Curr.
Opin. Biotechnol. (octubre de 1997) 8:542-546;
Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (noviembre de 1994)
32:125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem
(1 de febrero de 1994) 216:299-304; Stolz &
Tuan, Mol. Biotechnol. (diciembre de 1996)
6:225-230; Hong et al. Bioscience Reports
(1982) 2:907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143:298. También son
de interés los métodos descritos en el documento WO 97/27317, cuya
descripción se incorpora en el presente documento como
referencia.
Se dispone de varios métodos para determinar el
nivel de expresión de un gen o proteína en una muestra particular.
Por ejemplo, la detección puede utilizar tinción de células o
secciones histológicas con anticuerpos marcados, realizada de
acuerdo con métodos convencionales. Las células se permeabilizan
para teñir moléculas citoplásmicas. Los anticuerpos de interés se
añaden a la muestra de células y se incuban durante un periodo de
tiempo suficiente para permitir la unión al epítopo, normalmente al
menos aproximadamente 10 minutos. El anticuerpo puede marcarse con
radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes u otros
marcadores para la detección directa. Como alternativa, se usa un
anticuerpo o reactivo de segunda etapa para amplificar la señal.
Estos reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el
anticuerpo primario puede conjugarse con biotina, añadiendo avidina
conjugada con peroxidasa de rábano picante como reactivo de segunda
etapa. La detección final usa un sustrato que experimenta un cambio
de color en presencia de la peroxidasa. Como alternativa, el
anticuerpo secundario se conjuga con un compuesto fluorescente, por
ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, etc. La ausencia o
presencia de unión de anticuerpo puede determinarse por diversos
métodos, incluyendo citometría de flujo de células disociadas,
microscopía, radiografía, recuento de centelleo, etc.
Los métodos para detectar un agente que modula
una actividad de un polipéptido de tubulina desacetilasa incluyen
métodos sin células y métodos basados en células. Los métodos
generalmente implican poner en contacto un polipéptido de tubulina
desacetilasa con un agente de ensayo y determinar el efecto, si lo
hay, sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.
En la técnica se conocen métodos de ensayo de la
actividad enzimática de la tubulina desacetilasa y puede usarse
cualquier método conocido. Como ejemplo no limitante, se incuba un
péptido de tubulina acetilado, junto con NAD, con la tubulina
desacetilasa y un agente de ensayo, y se determina el efecto, si lo
hay, del agente de ensayo sobre la desacetilación del péptido de
tubulina. Los péptidos de tubulina acetilados generalmente
comprenden una secuencia de aminoácidos que comprende la
Lys-40 de la tubulina nativa más tres, cuatro,
cinco, seis, siete o más aminoácidos en el lado NH_{2} terminal,
y tres, cuatro, cinco, seis, siete o más aminoácidos en el lado del
CO_{2} terminal de la Lys-40 de la tubulina
nativa. Como ejemplo no limitante, un péptido de tubulina acetilado
tiene la secuencia
NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG-CO_{2}
(SEC ID Nº:08). Los especialistas en la técnica pueden diseñar
fácilmente péptidos de tubulina acetilados adicionales: el péptido
de tubulina acetilado está presente en la mezcla de ensayo a una
concentración de aproximadamente 20 \muM a aproximadamente 1 mM,
de aproximadamente 30 \muM a aproximadamente 900 \muM, de
aproximadamente 40 \muM a aproximadamente 700 \muM, de
aproximadamente 50 \muM a aproximadamente 500 \muM, de
aproximadamente 50 \muM a aproximadamente 300 \muM o de
aproximadamente 60 \muM a aproximadamente 100 \muM. El NAD está
presente en la mezcla de ensayo a una concentración de
aproximadamente 1 mM. El grupo acetilo en el péptido de tubulina
está radiomarcado, por ejemplo, se usa
^{14}C-acetilo. El ensayo entonces implica
determinar la cantidad de ^{14}C-acetilo que se
libera, típicamente por recuento de centelleo.
Otro método para detectar la actividad tubulina
desacetilasa es controlar el estado de acetilación de la tubulina
usando un anticuerpo específico para la tubulina acetilada. La falta
de reactividad del anticuerpo anti-tubulina
acetilada con el sustrato de tubulina indica que la tubulina se ha
desacetilado. Un ejemplo de dicho anticuerpo es el anticuerpo
6-11B-1 como se describe en los
ejemplos. De esta manera, en algunas realizaciones los métodos
implican determinar la unión de un anticuerpo
anti-tubulina acetilada con el sustrato de tubulina.
La unión de anticuerpo anti-tubulina
acetilada/tubulina puede determinarse usando cualquier tipo de
ensayo inmunológico, incluyendo ensayos de inmunotransferencia,
ensayos ELISA y similares.
En algunas realizaciones, el ensayo es un ensayo
sin células, donde la tubulina desacetilasa se pone en contacto con
el agente de ensayo, el sustrato (es decir tubulina acetilada) y
otros componentes de la reacción (por ejemplo, NAD, tampones y
similares), y se determina la actividad de la tubulina desacetilasa.
En estas realizaciones, la tubulina desacetilasa puede purificarse,
pero no necesariamente está purificada. La tubulina desacetilasa
puede estar presente en un extracto celular; en un inmunoprecipitado
de un extracto celular; o puede estar parcialmente purificada, por
ejemplo, puede estar purificada en al menos aproximadamente un 50%,
al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%,
al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o
más, por ejemplo, puede estar libre de otras macromoléculas
presentes en la fuente de la tubulina desacetilasa. La tubulina
desacetilasa puede ser recombinante o puede aislarse de una fuente
natural, por ejemplo, una célula o tejido de mamífero que
normalmente produce la enzima.
En otras realizaciones, el ensayo es un ensayo
in vitro basado en células, donde la célula se pone en
contacto con el agente de ensayo y se determina el efecto, si lo
hay, del agente sobre la actividad de la tubulina desacetilasa. En
estas realizaciones, el efecto del agente sobre la actividad
enzimática de la tubulina desacetilasa se determina controlando el
estado de acetilación de la tubulina en la célula. Los métodos
implican poner contacto la célula con el agente de ensayo y,
después de un periodo de tiempo adecuado, se extrae la tubulina de
la célula y se determina el grado de acetilación. El grado de
acetilación de tubulina puede determinarse usando cualquier método
conocido incluyendo, por ejemplo, unión de un anticuerpo
anti-tubulina acetilada a la tubulina extraída de
la célula.
En algunas realizaciones, el método de ensayo
implica determinar la unión de MIZ-1 a la tubulina
acetilada. La unión de MIZ-1/tubulina puede medirse
usando cualquier ensayo conocido, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína bien conocidos. Los métodos
adecuados incluyen: un método doble híbrido de levadura; un ensayo
de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET);
un ensayo de transferencia de energía por resonancia de
bioluminiscencia (BRET); un ensayo de inactivación de fluorescencia;
un ensayo de anisotropía de fluorescencia; un ensayo inmunológico;
y un ensayo que implica la unión de una proteína marcada de manera
detectable a una proteína inmovilizada.
En cualquier ensayo que implique la unión de
MIZ-1 a la tubulina acetilada, puede usarse un
fragmento de tubulina acetilada. Los fragmentos de tubulina
acetilada se han descrito anteriormente e incluyen, pero sin
limitación, un fragmento tal como el indicado en la SEC ID Nº:08.
En cualquier ensayo que implique la unión de MIZ-1 a
tubulina acetilada, puede usarse MIZ-1 como se
indica en la SEC ID Nº:09 o un fragmento de unión a tubulina
acetilada de MIZ-1. En algunas realizaciones, se
marcan de forma detectable la tubulina acetilada o la proteína
MIZ-1, o las
dos.
dos.
El FRET implica la transferencia de energía
desde un fluoróforo donador en un estado excitado a un fluoróforo
aceptor cercano. Para que tenga lugar esta transferencia, las
moléculas donadoras y aceptoras deben estar muy cerca (por ejemplo,
deben estar separadas por una distancia menor de 10 nanómetros,
normalmente deben estar separadas por una distancia comprendida
entre 10 y 100 \ring{A}), y los espectros de emisión del
fluoróforo donador deben coincidir parcialmente con los espectros
de excitación del fluoróforo aceptor.
En estas realizaciones, una proteína
MIZ-1 marcada de forma fluorescente o una proteína
de tubulina sirve como donador y/o aceptor en combinación con una
segunda proteína fluorescente o colorante, por ejemplo, una
proteína fluorescente como se describe en Matz et al., Nature
Biotechnology (octubre de 1999) 17:969-973; una
proteína fluorescente verde (GFP), incluyendo una GFP
"humanizada"; una GFP de Aequoria victoria o un mutante
fluorescente de la misma, por ejemplo, como se describe en las
Patentes de Estados Unidos Nº: 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577;
5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; y 5.874.304,
cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como
referencia; una GFP de otra especie tal como Renilla reniformis,
Renilla mulleri o Ptilosarcus guernyi como se describe, por
ejemplo, en el documento WO 99/49019 y Peelle et al. (2001)
J. Protein Chem. 20:507-519; GFP recombinante
"humanizada" (hrGFP) (Stratagene); otros colorantes
fluorescentes, por ejemplo cumarina y sus derivados, por ejemplo,
7-amino-4-metilcumarina,
aminocumarina, colorantes bodipy tales como Bodipy FL, cascada azul
(Cascade Blue), fluoresceína y sus derivados, por ejemplo,
isotiocianato de fluoresceína, verde Oregón, colorantes de rodamina,
por ejemplo, rojo Texas, tetrametilrrodamina, eosinas y
eritrosinas, colorantes de cianina, por ejemplo Cy3 y Cy5, quelatos
macrocíclicos de iones de lantánidos, por ejemplo colorante
quantum, etc., y colorantes quimioluminiscentes, por ejemplo,
luciferasas.
BRET es un ensayo de interacción
proteína-proteína basado en la transferencia de
energía desde un donador bioluminiscente a una proteína aceptora
fluorescente. La señal de BRET se mide por la cantidad de luz
emitida por el aceptor con respecto a la cantidad de luz emitida
por el donador. La relación entre estos dos valores aumenta según
se acercan las dos proteínas. El ensayo BRET se ha descrito
ampliamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las Patentes
de Estados Unidos Nº 6.020.192; 5.968.750 y 5.874.304, y Xu et
al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:151-156. Los ensayos de BRET pueden realizarse
analizando la transferencia entre una proteína donadora
bioluminiscente y proteínas aceptoras fluorescentes. La interacción
entre las proteínas donadora y aceptora puede controlarse por un
cambio en la relación de luz emitida por las proteínas
bioluminiscente y fluorescente. En esta aplicación, la proteína
MIZ-1 o la proteína tubulina sirve como proteína
donadora y/o aceptora.
La presente invención proporciona además agentes
biológicamente activos identificados usando un método de la
presente invención. Un agente biológicamente activo de la invención
modula el nivel o la actividad de una tubulina desacetilasa. En
algunas realizaciones, un agente que inhibe la tubulina desacetilasa
es útil en un método para estabilizar la tubulina, reduciendo de
esta manera la proliferación celular, y por lo tanto es útil para
tratar cánceres.
En muchas realizaciones el agente es una
molécula pequeña, por ejemplo un compuesto orgánico o inorgánico
pequeño que tiene un peso molecular mayor de 50 y menor de
aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes pueden comprender grupos
funcionales necesarios para la interacción estructural con
proteínas, particularmente la formación de enlaces de hidrógeno, y
pueden incluir al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o
carboxilo, y pueden contener al menos dos de los grupos químicos
funcionales. Los agentes pueden comprender estructuras de carbono
cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o
poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales
anteriores. También pueden encontrarse agentes entre biomoléculas
que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides,
purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o
combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un agente activo es un
péptido. Los péptidos adecuados incluyen péptidos con una longitud
de aproximadamente 3 aminoácidos a aproximadamente 50, de
aproximadamente 5 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 10 a
aproximadamente 25 aminoácidos. Un péptido de interés inhibe la
actividad enzimática de la tubulina desacetilasa.
Los péptidos pueden incluir aminoácidos
naturales y aminoácidos no naturales. Los péptidos pueden comprender
D-aminoácidos, una combinación de
D-y L-aminoácidos, y diversos
aminoácidos "de diseño" (por ejemplo,
\beta-metil aminoácidos,
C\alpha-metil aminoácidos y
N\alpha-metil aminoácidos, etc.) para conferir
propiedades especiales a los péptidos. Además, el péptido puede ser
un péptido cíclico. Los péptidos pueden incluir aminoácidos no
clásicos para introducir motivos conformacionales particulares.
Puede usarse cualquier aminoácido no clásico conocido. Los
aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin limitación,
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato;
(2S,3S)-metilfenilalanina,
(2S,3R)-metil-fenilalanina
(2R,3S)-metilfenilalanina y
(2R,3R)-metil-fenilalanina; ácido
2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico;
hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato;
\beta-carbolina (D y L); HIC (ácido histidina
isoquinolina-carboxílico) y HIC-(histidina urea
cíclica). En un péptido se pueden incorporar análogos de
aminoácidos y peptidomiméticos para inducir o favorecer estructuras
secundarias específicas incluyendo, pero sin limitación,
LL-Acp (ácido
LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico),
un análogo dipeptídico que induce giros \beta; análogos que
inducen láminas \beta; análogos que inducen giros \beta;
análogos que inducen hélices \alpha; análogos que inducen giros
\gamma; análogos de giros Gly-Ala; isósteros de
enlaces amida; tetrazol; y similares.
Un péptido puede ser un depsipéptido, que puede
ser un depsipéptido lineal o cíclico. Kuisle et al. (1999)
Tet. Letters 40:1203-1206. Los "depsipéptidos"
son compuestos que contienen una secuencia de al menos dos
aminoácidos alfa y al menos un ácido alfa-hidroxi
carboxílico, que están unidos a través de al menos un enlace
peptídico normal y enlaces éster, derivados de los ácidos hidroxi
carboxílicos, donde los "depsipéptidos lineales" pueden
comprender anillos formados a través de enlaces S-S,
o a través de un grupo hidroxi o un grupo mercapto de un hidroxi- o
mercapto-aminoácido y el grupo carboxilo de otro
amino-o hidroxi-ácido pero no comprenden anillos
formados únicamente a través de enlaces peptídicos o éster derivados
de ácidos hidroxi carboxílicos. Los "depsipéptidos cíclicos"
son péptidos que contienen al menos un anillo formado únicamente a
través de enlaces peptídicos o éster, derivados de ácidos hidroxi
carboxílicos.
Los péptidos pueden ser cíclicos o bicíclicos.
Por ejemplo, puede inducirse la ciclación del grupo carboxilo
C-terminal o un grupo éster
C-terminal por desplazamiento interno del -OH del
éster (-OR) del grupo carboxilo o éster, respectivamente, con el
grupo amino N-terminal para formar un péptido
cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y escisión para dar el
ácido del péptido, el ácido libre se convierte en un éster activado
por un activador de grupo carboxilo apropiado tal como
diciclohexilcarbodiimida (DCC) en solución, por ejemplo, en mezclas
de cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}) y dimetilformamida (DMF).
El péptido cíclico después se forma por desplazamiento interno del
éster activado con la amina N-terminal. La ciclación
interna en oposición a la polimerización puede mejorarse por medio
del uso de soluciones muy diluidas. En la técnica se conocen bien
métodos para obtener péptidos cíclicos.
El término "bicíclico" se refiere a un
péptido en el que existen dos cierres de anillo. Los cierres de
anillo se forman por enlaces covalentes entre aminoácidos presentes
en el péptido. Un enlace covalente entre dos aminoácidos no
adyacentes constituye un cierre de anillo, así como también un
segundo enlace covalente entre un par de aminoácidos adyacentes que
ya están unidos por un enlace peptídico covalente. Los enlaces
covalentes que forman los cierres de anillo pueden ser enlaces
amida, es decir, el enlace formado entre un grupo amino libre en un
aminoácido y un carboxilo libre de un segundo aminoácido, o enlaces
formados entre las cadenas laterales o grupos "R" de
aminoácidos presentes en los péptidos. De esta manera, los péptidos
bicíclicos pueden ser péptidos bicíclicos "verdaderos", es
decir, péptidos ciclados por la formación de un enlace peptídico
entre el extremo N y el extremo C del péptido, o pueden ser péptidos
"depsi-bicíclicos", es decir, péptidos en los
que los aminoácidos terminales están unidos de forma covalente a
través de sus restos de cadena lateral.
En los extremos del péptido puede incorporarse
un resto desamino o descarboxi, de forma que no haya ningún grupo
amino o carboxi terminal, para reducir la susceptibilidad a
proteasas o para restringir la conformación del péptido. Los grupos
funcionales C-terminales incluyen amida,
amida-alquilo inferior, amida di(alquilo
inferior), alcoxi inferior, hidroxi y carboxi, y los derivados de
éster inferior de los mismos, y las sales farmacéuticamente
aceptables de los mismos.
Además de las modificaciones
N-terminales y C-terminales
anteriores, un péptido o peptidomimético puede modificarse o
acoplarse covalentemente a uno o más de una diversidad de polímeros
hidrófilos para aumentar la solubilidad y la vida media en
circulación del péptido. Los polímeros hidrófilos no proteicos
adecuados para el acoplamiento a un péptido incluyen, pero sin
limitación, polialquiléteres ejemplificados por polietilenglicol y
polipropilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico,
polioxialquenos, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona,
celulosa y derivados de celulosa, dextrano y derivados de dextrano,
etc. En general, estos polímeros hidrófilos tienen un peso
molecular medio que varía de aproximadamente 500 a aproximadamente
100.000 daltons, de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 40.000
daltons, o de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 20.000
daltons. El péptido puede derivatizarse o acoplarse a dichos
polímeros usando cualquiera de los métodos indicados en Zallipsky,
S., Bioconjugate Chem., 6:150-165 (1995);
Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem.,
6:62-69 (1995); Patente de Estados Unidos Nº
4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337 o
documento WO 95/34326.
Otro agente adecuado para reducir la actividad
de la tubulina desacetilasa es un aptámero peptídico. Los aptámeros
peptídicos son péptidos o polipéptidos pequeños que actúan como
inhibidores dominantes de la función de las proteínas. Los
aptámeros peptídicos específicamente se unen a proteínas diana,
bloqueando su capacidad de funcionamiento. Kolonin y Finley, PNAS
(1998) 95: 14266-14271. Debido a la naturaleza
altamente selectiva de los aptámeros peptídicos, se pueden usar no
sólo para dirigirse a una proteína específica, sino también para
dirigirse a funciones específicas de una proteína dada (por ejemplo,
una función de señalización). Además, los aptámeros peptídicos
pueden expresarse de una forma controlada por medio del uso de
promotores que regulan la expresión de una manera temporal,
espacial o inducible. Los aptámeros peptídicos actúan de forma
dominante; por lo tanto, pueden usarse para analizar proteínas para
las que no se dispone de mutantes de pérdida de función.
Los aptámeros peptídicos que se unen con alta
afinidad y especificidad a una proteína diana pueden aislarse por
una diversidad de técnicas conocidas en este campo. Los aptámeros
peptídicos pueden aislarse a partir de bibliotecas peptídicas
aleatorias por medio de selecciones doble híbrido de levaduras (Xu
et al., PNAS-(1997) 94:12473-12478). También
pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos (Hoogenboom et
al. Immunotechnology (1998) 4:1-20) o
péptidos/bibliotecas generadas químicamente.
Los anticuerpos expresados intracelularmente, o
intracuerpos, son moléculas de anticuerpos monocatenarios diseñadas
para unirse específicamente e inactivar moléculas diana dentro de
las células. Se han usado intracuerpos en ensayos celulares y en
organismos enteros. Chen et al., Hum. Gen. Ther. (1994)
5:595-601; Hassanzadeh et al., Febs Lett.
(1998) 16 (1,2): 75-80 y 81-86.
Pueden construirse vectores de expresión inducibles con intracuerpos
que reaccionan específicamente con la proteína tubulina
desacetilasa. Estos vectores pueden introducirse en organismos
modelo y estudiarse de la misma manera que se ha descrito
anteriormente para los aptámeros.
En algunas de la invención, el agente activo es
un agente que modula, en generalmente reduce o regula negativamente,
la expresión del gen que codifica la tubulina desacetilasa en el
hospedador. Estos agentes incluyen, pero sin limitación, ARN
antisentido, ARN interferente, ribozimas y similares.
En algunas realizaciones, el agente activo es un
ARN interferente (ARNi). El ARNi incluye ARN de interferencia
bicatenario (ARNibc). El uso de ARNi para reducir el nivel de ARNm
y/o proteína particular se basa en las propiedades de interferencia
del ARN bicatenario procedente de las regiones codificantes del gen.
En un ejemplo de este método, se sintetiza in vitro ARN con
sentido y antisentido complementarios derivados de una parte
sustancial del gen de la tubulina desacetilasa. Los ARN con sentido
y antisentido resultantes se hibridan en un tampón de inyección, y
el ARN bicatenario se inyecta o se introduce de otra manera en el
sujeto (tal como en su alimento o sumergiéndolo en el tampón que
contiene el ARN). Véase, por ejemplo, el documento W099/32619. En
otra realización, se genera in vivo ARNbc derivado de un gen
de tubulina desacetilasa por expresión simultánea tanto del ARN con
sentido como del ARN antisentido a partir de promotores colocados de
manera apropiada unidos de forma funcional a secuencias
codificantes de la tubulina desacetilasa tanto en orientación con
sentido como en orientación
antisentido.
antisentido.
Pueden usarse moléculas antisentido para regular
negativamente la expresión del gen que codifica la tubulina
desacetilasa en las células. Los compuestos antisentido incluyen
ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS)
(oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos
catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su
expresión.
El reactivo antisentido puede ser
oligonucleótidos antisentido (odn), particularmente odn sintéticos
que tienen modificaciones químicas a partir de ácidos nucleicos
nativos, o construcciones ácido nucleico que expresan dichas
moléculas antisentido tales como ARN. La secuencia antisentido es
complementaria al ARNm del gen diana, e inhibe la expresión de los
productos del gen diana. Las moléculas antisentido inhiben la
expresión del gen por medio de diversos mecanismos, por ejemplo,
reduciendo la cantidad de ARNm disponible para la traducción, por
medio de la activación de ARNsa H, o impedimento estérico. Puede
administrarse una o una combinación de moléculas antisentido, donde
una combinación puede comprender múltiples secuencias
diferentes.
Las moléculas antisentido pueden producirse por
expresión de todo o parte de secuencia del gen diana en un vector
apropiado, donde la iniciación de la transcripción está orientada de
tal manera que se produce una cadena antisentido como una molécula
de ARN. Como alternativa, la molécula antisentido es un
oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos antisentido
generalmente tendrán una longitud de al menos aproximadamente 7,
normalmente de al menos aproximadamente 12, más habitualmente de al
menos aproximadamente 20 nucleótidos y no mayor de aproximadamente
500, normalmente no mayor de aproximadamente 50 y más habitualmente
no mayor de aproximadamente 35 nucleótidos, controlándose la
longitud por la eficacia de la inhibición, especificidad,
incluyendo ausencia de reactividad cruzada, y similares. Se ha
descubierto que ciertos oligonucleótidos cortos, de 7 a 8 de bases
de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de la
expresión génica (véase Wagner et al. (1996), Nature
Biotechnol. 14:840-844). Como se conoce la secuencia
de nucleótidos del gen que codifica la tubulina desacetilasa humana
(véase, por ejemplo, el Nº de acceso del GenBank NT 011109; y los Nº
de acceso del GenBank NM_030593, NM_012237, AJ505014 y AF083107),
los especialistas en la técnica pueden generar fácilmente ácidos
nucleicos antisentido que reducen el nivel de un producto del gen de
la tubulina desacetilasa humana en una célula.
Se elige una región o regiones específicas de la
secuencia de ARNm de cadena con sentido endógena para que se
complementen por la secuencia antisentido. La selección de una
secuencia específica para el oligonucleótido puede usar un método
empírico, donde se ensayan varias secuencias candidatas con respecto
a la inhibición de la expresión del gen diana en un modelo animal o
in vitro. También puede usarse una combinación de
secuencias, donde varias regiones de la secuencia de ARNm se
seleccionan para la complementación antisentido.
Los oligonucleótidos antisentido pueden
sintetizarse químicamente por métodos conocidos en la técnica (véase
Wagner et al., (1993), supra, y Milligan et al.,
supra.). Los oligonucleótidos preferidos se modifican
químicamente a partir de la estructura de fosfodiéster nativa para
aumentar su estabilidad intracelular y su afinidad de unión. En la
bibliografía se han descrito varias de estas modificaciones,
alterando dichas modificaciones la química de la estructura
principal, azúcares o bases heterocíclicas.
Entre los cambios útiles en la química de la
estructura principal se encuentran los fosforotioatos;
fosforoditioatos, donde los dos oxígenos que no participan en los
enlaces están sustituidos con azufre; fosforamiditas; alquil
fosfotriésteres y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquirales
incluyen
3'-O'-5'-S-fosforotioato,
3'-S-5'-O-fosforotioato,
3'-CH2-5'-O-fosfonato
y
3'-NH-5'-O-fosforamidato.
Los ácidos péptido nucleicos reemplazan la estructura principal
entera de ribosa fosfodiéster con un enlace peptídico. También se
usan modificaciones de azúcares para mejorar la estabilidad y la
afinidad. Puede usarse el anómero \beta de desoxirribosa, donde la
base está invertida con respecto al anómero \alpha natural. El
2'-OH del azúcar de ribosa puede alterarse para
formar 2'-O-metil o
2'-O-alil azúcares, que proporcionan
resistencia a la degradación sin comprometer la afinidad. La
modificación de las bases heterocíclicas debe mantener un
emparejamiento de bases apropiado. Algunas sustituciones útiles
incluyen la sustitución de desoxitimidina por desoxiuridina; y
desoxicitidina por
5-metil-2'-desoxicitidina
y
5-bromo-2'-desoxicitidina.
Se ha demostrado que la
5-propinil-2'-desoxiuridina
y la
5-propinil-2'-desoxicitidina
aumentan la afinidad y la actividad biológica cuando sustituyen a
la desoxitimidina y desoxicitidina, respectivamente.
Las estructuras principales de oligonucleótidos
modificados ilustrativos que no incluyen un átomo de fósforo del
presente documento tienen estructuras principales que se forman por
enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena
corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomos y alquilo o
cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heterocíclicos
o heteroatómicos de cadena corta. Éstos incluyen los que tienen
enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar
de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras
principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales
de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de
metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de
riboacetilo; estructuras principales que contienen alqueno;
estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de
metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de
sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otros
que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH_{2}.
También pueden usarse oligonucleótidos que
tienen una estructura principal de morfolino (Summerton, J. E. y
Weller D. D. Patente de Estados Unidos Nº 5.034.506) o una
estructura principal de ácido péptido nucleico (APN) (P. E.
Nielson, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 1991, 254:
1497). En la bibliografía se describen ampliamente oligonucleótidos
antisentido con morfolino. Véase, por ejemplo, Partridge et
al. (1996) Antisense Nucl. Acid Drug Dev.
6:169-175, y Summerton (1999) Biochem. Biophys. Acta
1489: 141-158.
Como alternativa a los inhibidores antisentido,
pueden usarse compuestos de ácido nucleico catalíticos, por ejemplo
ribozimas, conjugados antisentido etc., para inhibir la expresión
génica. Las ribozimas pueden sintetizarse in vitro y
administrarse al paciente, o pueden codificarse en un vector de
expresión a partir del cual se sintetiza la ribozima en la célula
diana (por ejemplo, véase la solicitud de patente internacional WO
9523225, y Beigelman et al. (1995), Nucl. Acids Res.
23:4434-42). En el documento WO 9506764 se describen
ejemplos de oligonucleótidos con actividad catalítica. En Bashkin
et al. (1995), Appl. Biochem. Biotechnol.
54:43-56 se describen conjugados de ODN antisentido
con un complejo metálico, por ejemplo, terpiridilCu(II),
capaz de mediar la hidrólisis del ARNm.
La invención proporciona formulaciones,
incluyendo formulaciones farmacéuticas, que comprenden un agente que
reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa. En
general, una formulación comprende una cantidad eficaz de un agente
que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina desacetilasa.
Una "cantidad eficaz" significa una dosificación suficiente
para producir un resultado deseado, por ejemplo, una reducción del
nivel y/o actividad de la tubulina desacetilasa, estabilización de
microtúbulos; una reducción en la desacetilación de tubulina; una
reducción en la proliferación celular; y similares. En general, el
resultado deseado es al menos una reducción en el nivel y/o
actividad de la tubulina desacetilasa en comparación con un
control.
En los presentes métodos, el agente o agentes
activos pueden administrarse al hospedador usando cualquier medio
conveniente capaz de producir la reducción deseada en el nivel y/o
actividad de la tubulina desacetilasa. De esta manera, el agente
puede incorporarse en una diversidad de formulaciones para la
administración terapéutica. Más particularmente, los agentes de la
presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas
por combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente
aceptables apropiados, y pueden formularse en preparaciones en
formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas tales como
comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones,
supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.
En las formas de dosificación farmacéuticas, los
agentes pueden administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente
aceptables, o también pueden usarse solos o en asociación
apropiada, así como en combinación, con otros compuestos
farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son
simplemente ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse
limitantes.
Para las preparaciones orales, los agentes
pueden usarse solos o en combinación con aditivos apropiados para
obtener comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con
aditivos convencionales tales como lactosa, manitol, almidón de
maíz o almidón de patata; con aglutinantes tales como celulosa
cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o
gelatinas; con disgregantes tales como almidón de maíz, almidón de
patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes tales como
talco o estearato de magnesio y, si se desea, con diluyentes,
agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes
aromatizantes.
Los agentes pueden formularse en preparaciones
para inyección por medio de su disolución, suspensión o emulsión en
un disolvente acuoso o no acuoso tal como aceites vegetales u otros
aceites similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos,
ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se
desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes,
agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes,
estabilizantes y conservantes.
Los agentes pueden utilizarse en una formulación
de aerosol para administrarse por inhalación. Los compuestos de la
presente invención pueden formularse en propulsores presurizados
aceptables tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y
similares.
Además, los agentes pueden introducirse en
supositorios por mezcla con una diversidad de bases tales como
bases emulsionantes o bases solubles en agua. Los compuestos de la
presente invención pueden administrarse por vía rectal a través de
un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como
manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a
la temperatura corporal y se solidifican a temperatura ambiente.
Pueden proporcionarse formas de dosificación
unitarias para administración oral o rectal tales como jarabes,
elixires y suspensiones donde cada unidad de dosificación, por
ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio contiene
una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más
inhibidores. De forma similar, las formas de dosificación unitarias
para inyección o administración intravenosa pueden comprender el
inhibidor o inhibidores en una composición como una solución en agua
estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La expresión "forma de dosificación
unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a
unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones
unitarias para la seres humanos y animales, conteniendo cada unidad
una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención
calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto
deseado en asociación con un diluyente, vehículo o soporte
farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las nuevas
formas de dosificación unitarias de la presente invención dependen
del compuesto particular empleado y del efecto a conseguir, y de la
farmacodinámica asociada con cada compuesto en el hospedador.
Otros modos de administración también
encontrarán utilidad con la presente invención. Por ejemplo, un
agente de la invención puede formularse en supositorios y, en
algunos casos, composiciones de aerosol e intranasales. En el caso
de los supositorios, la composición de vehículo incluirá
aglutinantes y vehículos tradicionales tales como
polialquilenglicoles o triglicéridos. Estos supositorios pueden
formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en
el intervalo de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 10%
(p/p), preferiblemente de aproximadamente un 1% a aproximadamente
un 2%.
Las formulaciones intranasales normalmente
incluirán vehículos que no producen irritación en la mucosa nasal
ni alteran significativamente la función ciliar. Con la presente
invención pueden emplearse diluyentes tales como agua, solución
salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones
nasales también pueden contener conservantes tales como, pero sin
limitación, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar
presente un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas
de la presente invención por la mucosa nasal.
Un agente de la invención puede administrarse
como inyectables. Típicamente, las composiciones inyectables se
preparan como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden
prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en
vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también
puede emulsionarse o el ingrediente activo puede encapsularse en
vehículos de liposomas.
Son vehículos excipientes adecuados, por
ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o
similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el
vehículo puede contener cantidades minoritarias de sustancias
auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes
tamponantes del pH. Se conocen métodos reales para preparar dichas
formas de dosificación o serán evidentes para los especialistas en
la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17ª
edición, 1985. La composición o formulación a administrar, en
cualquier caso, contendrá una cantidad del agente adecuada para
conseguir el estado deseado en el sujeto a tratar.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables,
tales como vehículos, adyuvantes, soportes o diluyentes están
disponibles fácilmente para el público. Además, están fácilmente
disponibles para el público sustancias auxiliares farmacéuticamente
aceptables tales como agentes para ajustar el pH y tamponantes,
agentes para ajustar la tonicidad, estabilizantes, agentes
humectantes y similares.
Aunque la dosificación usada variará dependiendo
de los objetivos clínicos a conseguir, un intervalo de dosificación
adecuado es uno que proporciona hasta aproximadamente 1 \mug a
aproximadamente 1.000 \mug o aproximadamente 10.000 \mug de un
agente que reduce el nivel y/o la actividad de la tubulina
desacetilasa, que puede administrarse en una sola dosis. Como
alternativa, una dosificación diana de un agente que reduce el nivel
y/o la actividad de la tubulina desacetilasa puede considerarse
aproximadamente en el intervalo de aproximadamente
0,1-1000 \muM, aproximadamente
0,5-500 \muM, aproximadamente
1-100 \muM, o aproximadamente 5-50
\muM en una muestra de sangre del hospedador extraída en las
primeras 24-48 horas después de la administración
del agente.
Los especialistas apreciarán fácilmente que los
niveles de dosificación pueden variar en función del compuesto
específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del
sujeto a los efectos secundarios. Las dosificaciones preferidas
para un compuesto dado se pueden determinar fácilmente por los
especialistas en la técnica por una diversidad de medios.
Un agente que reduce el nivel y/o la actividad
de la tubulina desacetilasa se administra a un individuo usando
cualquier método disponible y vía adecuada para la administración de
fármacos, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así
como vías de administración sistémicas y localizadas.
Las vías de administración convencionales y
farmacéuticamente aceptables incluyen las vías de administración
intranasal, intramuscular, intratraqueal, intratumoral, subcutánea,
intradérmica, tópica, intravenosa, rectal, nasal, oral y otras vías
de administración parenterales. Las vías de administración pueden
combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del
\hbox{agente y/o el efecto deseado. La composición puede
administrarse en una sola dosis o en dosis múltiples.}
El agente puede administrarse a un hospedador
usando cualquier método convencional disponible y vía adecuada para
la administración de fármacos convencionales, incluyendo las vías
sistémicas o localizadas. En general, las vías de administración
contempladas por la invención incluyen, pero no necesariamente se
limitan a las vías entérica, parenteral o por inhalación.
Las vías de administración parenterales
distintas de la administración por inhalación incluyen, pero no
necesariamente se limitan a las vías tópica, transdérmica,
subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular,
intraespinal, intraesternal e intravenosa, es decir, cualquier vía
de administración distinta de la administración a través del canal
alimentario. La administración parenteral puede realizarse para
conseguir la liberación sistémica o local del agente. Cuando se
desea la liberación sistémica, la administración típicamente implica
la administración tópica o en la mucosa invasiva o absorbida
sistémicamente de preparaciones farmacéuticas.
El agente también puede administrarse al sujeto
por administración entérica. Las vías de administración entéricas
incluyen, pero no necesariamente se limitan a la administración oral
y rectal (por ejemplo usando un supositorio).
Los métodos de administración del agente a
través de la piel o la mucosa incluyen, pero no se limitan
necesariamente a la aplicación tópica de una preparación
farmacéutica adecuada, transmisión transdérmica, inyección y
administración epidérmica. Para la transmisión transdérmica, son
métodos adecuados promotores de la absorción o iontoforesis. La
transmisión iontoforética puede realizarse usando "parches"
disponibles en el mercado que administran su producto continuamente
por medio de pulsos eléctricos a través de la piel intacta durante
periodos de varios días o más.
Por tratamiento se entiende al menos una mejoría
de los síntomas asociados con la afección patológica que padece el
hospedador, donde mejoría se usa en sentido amplio para hacer
referencia a al menos una reducción en la magnitud de un parámetro,
por ejemplo, un síntoma asociado con la patología a tratar, tal como
una hipersensibilidad alérgica. Como tal, el tratamiento también
incluye situaciones en las que la patología, o al menos los síntomas
asociados con ella, se inhiben completamente, por ejemplo se impide
su aparición, o se detienen, por ejemplo se terminan, de tal forma
que el hospedador ya no padece la patología, o al menos los síntomas
que caracterizan la patología.
De acuerdo con los métodos de la presente
invención se puede tratar a una diversidad de hospedadores (donde
el término "hospedador" se usa indistintamente en el presente
documento con los términos "sujeto" y "paciente").
Generalmente, estos hospedadores son "mamíferos" o de la clase
"mammalia", donde estos términos se usan en sentido amplio
para describir organismos que están dentro de la clase mammalia,
incluyendo las órdenes carnívoro (por ejemplo, perros y gatos),
roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por
ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En muchas
realizaciones los hospedadores serán humanos.
Se proporcionan kits con dosis unitarias del
agente activo, por ejemplo, en dosis orales o inyectables. En estos
kits, además de los recipientes que contienen las dosis unitarias
habrá un prospecto de información que describe el uso y los efectos
beneficios asociados de los fármacos para tratar la patología de
interés. Son compuestos preferidos y dosis unitarias los descritos
en este documento anteriormente.
La presente invención también proporciona
métodos para tratar cánceres y métodos para reducir la proliferación
celular indeseada, que implican administrar un agente que modula
(por ejemplo inhibe) la tubulina desacetilasa; y un segundo agente
terapéutico. En algunas realizaciones, el agente que inhibe la
tubulina desacetilasa se administra como un adyuvante a una terapia
convencional para el cáncer.
Las terapias convencionales para el cáncer
incluyen cirugía (por ejemplo eliminación quirúrgica de tejido
canceroso), radioterapia, trasplante de médula ósea, tratamiento
quimioterapéutico, tratamiento modificador de la respuesta
biológica y ciertas combinaciones de los anteriores.
La radioterapia incluye, pero sin limitación,
rayos X o rayos gamma que se liberan desde una fuente aplicada
externamente tal como un haz, o por implantación de fuentes
radiactivas pequeñas.
Los agentes quimioterapéuticos son compuestos no
peptídicos (es decir, no proteicos) que reducen la proliferación de
las células cancerosas e incluyen agentes citotóxicos y agentes
citostáticos. Los ejemplos no limitantes de agentes
quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, nitrosoureas,
antimetabolitos, antibióticos antitumorales, alcaloides de plantas
(vinca) y hormonas esteroideas.
En la técnica se conocen y se usan ampliamente
agentes que actúan reduciendo la proliferación celular. Estos
agentes incluyen agentes alquilantes tales como mostazas
nitrogenadas, nitrosoureas, derivados de etilenimina, alquil
sulfonatos y triazenos incluyendo, pero sin limitación,
mecloretamina, ciclofosfamida (Cytoxan^{TM}), melfalán
(L-sarcolisina), carmustina-(BCNU), lomustina
(CCNU), semustina (metil-CCNU), estreptozocina,
clorozotocina, mostaza de uracilo, clormetina, ifosfamida,
clorambucilo, pipobroman, trietilenomelamina,
trietilenotiofosforamina, busulfán, dacarbazina y temozolomida.
Los agentes antimetabolito incluyen análogos de
ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e
inhibidores de adenosina desaminasa incluyendo, pero sin limitación,
citarabina (CYTOSAR-U), arabinósido de citosina,
fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FudR),
6-tioguanina, 6-mercaptopurina
(6-MP), pentostatina,
5-fluorouracilo (5-FU),
metotrexato,
10-propargil-5,8-didesazafolato
(PDDF, CB3717), ácido 5,8-didesazatetrahidrofólico
(DDATHF), leucovorina, fosfato de fludarabina, pentostatina y
gemcitabina.
Los productos naturales adecuados y sus
derivados (por ejemplo, alcaloides de la vinca, antibióticos
antitumorales, enzimas, linfoquinas y epipodofilotoxinas) incluyen,
pero sin limitación, Ara-C, paclitaxel (Taxol®),
docetaxel (Taxotere®), desoxicoformicina,
mitomicina-C, L-asparaginasa,
azatioprina; brequinar; alcaloides, por ejemplo vincristina,
vinblastina, vinorelbina, vindesina, etc.; podofilotoxinas, por
ejemplo, etopósido, tenipósido, etc.; antibióticos, por ejemplo
antraciclina, clorhidrato de daunorubicina (daunomicina,
rubidomicina, cerubidina), idarubicina, doxorubicina, epirubicina y
derivados de morfolino, etc; bisciclopéptidos de fenoxizona, por
ejemplo dactinomicina; glicopéptidos básicos, por ejemplo
bleomicina; glicósidos de antraquinona, por ejemplo plicamicina
(mitramicina); antracenodionas, por ejemplo mitoxantrona;
azirinopirrolo indoldionas, por ejemplo mitomicina;
inmunosupresores macrocíclicos, por ejemplo ciclosporina,
FK-506 (tacrolimus, Prograf), rapamicina, etc., y
similares.
Otros agentes citotóxicos antiproliferativos son
navelbene, CPT-11, anastrazol, letrazol,
capecitabina, reloxafme, ciclofosfamida, ifosfamida y
droloxafine.
También son adecuados para uso agentes que
afectan a los microtúbulos y que tienen actividad antiproliferativa
e incluyen, pero sin limitación, alocolchicina (NSC 406042),
halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de
colchicina (por ejemplo, NSC 33410 ), dolstatina 10 (NSC 376128),
maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel
(Taxol®), derivados de Taxol®, docetaxel (Taxotere®), tiocolchicina
(NSC 361792), tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de
vincristina, epotilonas naturales y sintéticas incluyendo, pero sin
limitación, epotilona A, epotilona B, discodermolida; estramustina,
nocodazol y similares.
Moduladores de hormonas y esteroides (incluyendo
análogos sintéticos) que son adecuados para su uso incluyen, pero
sin limitación, adrenocorticosteroides, por ejemplo prednisona,
dexametasona, etc; estrógenos y progestinas, por ejemplo caproato
de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de
megestrol, estradiol, clomifeno, tamoxifeno, etc; y supresores
adrenocorticales, por ejemplo aminoglutetimida;
17\alpha-etinilestradiol; dietilestilbestrol,
testosterona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona,
testolactona, metilprednisolona, metiltestosterona, prednisolona,
triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona,
aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona,
leuprolida, flutamida (Drogenil), toremifeno (Fareston) y Zoladex®.
Los estrógenos estimulan la proliferación y diferenciación, por lo
tanto, para bloquear esta actividad se usan compuestos que se unen
al receptor de estrógenos. Los corticosteroides pueden inhibir la
proliferación de células T.
Otros agentes quimioterapéuticos incluyen
complejos metálicos, por ejemplo cisplatino
(cis-DDP), carboplatino, etc.; ureas, por ejemplo,
hidroxiurea; e hidrazinas, por ejemplo,
N-metilhidrazina; epidofilotoxina; un inhibidor de
topoisomerasa; procarbazina; mitoxantrona; leucovorina; tegafur;
etc. Otros agentes antiproliferativos de interés incluyen
inmunosupresores, por ejemplo, ácido micofenólico, talidomida,
desoxispergualina, azasporina, leflunomida, mizoribina, azaspirano
(SKF 105685); Iressa® (ZD 1839,
4-(3-cloro-4-fluorofenilamino)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil)propoxi)quinazolina),
etc.
"Taxanos" incluye paclitaxel, así como
cualquier derivado de taxano activo o profármaco. El
"paclitaxel" (que como debe entenderse en el presente
documento incluye análogos, formulaciones y derivados tales como,
por ejemplo, docetaxel, TAXOL^{TM}, TAXOTERE^{TM} (una
formulación de docetaxel), 10-desacetil análogos de
paclitaxel y
3'N-desbenzoil-3'N-t-butoxicarbonil
análogos de paclitaxel) puede prepararse fácilmente utilizando
técnicas conocidas por los especialistas en este campo (véanse
también los documentos WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO
94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; Patentes de Estados Unidos Nº
5.294.637; 5.283.253; 5.279.949; 5.274.137; 5.202.448; 5.200.534;
5.229.529; y EP 590.267), u obtenerse a partir de una diversidad de
fuentes comerciales incluyendo, por ejemplo, Sigma Chemical Co., St
Louis, Mo (T7402 de Taxus brevifolia; o
T-1912 de Taxus yannanensis).
Debe entenderse que el paclitaxel se refiere no
sólo a la forma común químicamente disponible de paclitaxel, sino
también a análogos y derivados (por ejemplo, Taxotere^{TM}
docetaxel, como se indicó anteriormente) y conjugados de paclitaxel
(por ejemplo, paclitaxel-PEG,
paclitaxel-dextrano o
paclitaxel-xilosa).
Dentro del término "taxano" también se
incluyen una diversidad de derivados conocidos, incluyendo tanto
derivados hidrófilos como derivados hidrófobos. Los derivados de
taxano incluyen, pero sin limitación, derivados de galactosa y
manosa descritos en la solicitud de patente internacional Nº WO
99/18113; derivados de piperazino y otros derivados descritos en el
documento WO 99/14209; derivados de taxano descritos en los
documentos WO 99/09021, WO 98/22451 y la patente de Estados Unidos
Nº 5.869.680; 6-tio derivados descritos en el
documento WO 98/28288; derivados de sulfenamida descritos en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.821.263; y derivados de taxol
descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.415.869. También
incluye profármacos de paclitaxel incluyendo, pero sin limitación,
los descritos en los documentos WO 98/58927, WO 98/13059, y en la
Patente de Estados Unidos Nº 5.824.701.
Los modificadores de la respuesta biológica
adecuados para uso en relación con los métodos de la invención
incluyen, pero sin limitación (1), inhibidores de la actividad
tirosina quinasa (RTK); (2) inhibidores de la actividad
serina/treonina quinasa; (3) antagonistas de antígenos asociados a
tumores tales como anticuerpos que se unen específicamente a un
antígeno tumoral; (4) agonistas de receptores de apoptosis; (5)
interleuquina-2; (6) IFN-\alpha;
(7) IFN-\gamma; (8) factores estimuladores de
colonias; (9) inhibidores de la angiogénesis; y (10) antagonistas
del factor de necrosis tumoral.
La presente invención proporciona métodos para
modular la acetilación de tubulina; métodos para estabilizar los
microtúbulos; métodos para reducir la proliferación celular
indeseada; y métodos para tratar trastornos debidos a una
proliferación celular indeseada. Los métodos generalmente implican
administrar a un individuo una cantidad eficaz de un agente de la
presente invención que modula (por ejemplo, inhibe) la actividad
enzimática de la tubulina desacetilasa (por ejemplo, SIRT2), en una
cantidad eficaz para reducir la proliferación celular indeseada.
Una cantidad eficaz de un agente de la presente invención reduce la
proliferación celular y/o reduce la masa tumoral.
Un agente que inhibe la actividad enzimática de
la tubulina desacetilasa se administra a un paciente que lo
necesita, por ejemplo un paciente que tiene cáncer.
En el contexto de la reducción de la
proliferación celular indeseada, y la reducción de la masa tumoral,
un cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa
es una cantidad que reduce el nivel y/o la velocidad de
proliferación celular y/o reduce la masa tumoral al menos en
aproximadamente un 10%, al menos en aproximadamente un 20%, al
menos en aproximadamente un 25%, al menos en aproximadamente un 30%,
al menos en aproximadamente un 35%, al menos en aproximadamente un
40% al menos en aproximadamente un 45%, al menos en aproximadamente
un 50%, al menos en aproximadamente un 55%, al menos en
aproximadamente un 60%, al menos en aproximadamente un 65%, al
menos en aproximadamente un 70%, al menos en aproximadamente un 80%,
al menos en aproximadamente un 85%, o al menos en aproximadamente
un 90% o más, en comparación con el nivel y/o velocidad de
proliferación celular y/o masa tumoral en ausencia de tratamiento
con un agente que inhibe la tubulina desacetilasa.
Puede determinarse si un agente particular
reduce la velocidad y/o nivel de proliferación celular usando
cualquier ensayo conocido. Por ejemplo, puede usarse un ensayo
in vitro en el que se cultivan células (por ejemplo, células
tumorales) en un medio de cultivo al que se le ha añadido un agente.
La proliferación celular se determina usando cualquier ensayo
conocido, por ejemplo, la incorporación de
^{3}H-timidina; o el recuento del número de
células viables. El número de células viables puede contarse usando
cualquier método conocido. Por ejemplo, se usa un método de
clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para
determinar el número de células que se tiñen con un tinte de
células viables (por ejemplo,
di-O-acetato de fluoresceína, y
similares), en comparación con el número de células teñidas con un
colorante que normalmente no tiñe las células viables, tal como
yoduro de propidio.
Puede determinarse si un régimen terapéutico
particular de la invención es eficaz para reducir la proliferación
celular indeseada, por ejemplo, en el contexto del tratamiento de
cánceres, usando métodos convencionales. Por ejemplo, puede
determinarse el número de células cancerosas en una muestra
biológica (por ejemplo, sangre, una muestra de biopsia y
similares). La masa tumoral puede determinarse usando métodos
radiológicos convencionales.
Puede determinarse si una carga tumoral se ha
reducido usando cualquier método conocido incluyendo, pero sin
limitación, la medición de la masa tumoral sólida; el recuento del
número de células tumorales usando ensayos citológicos;
clasificación de células activadas por fluorescencia (por ejemplo,
usando un anticuerpo específico para un antígeno asociado a
tumores) para determinar el número de células que llevan un antígeno
tumoral dado; exploración de tomografía computarizada, formación de
imágenes de resonancia magnética y/o imágenes de rayos X del tumor
para estimar y/o controlar el tamaño del tumor; medición de la
cantidad de antígeno asociado a tumores en una muestra biológica,
por ejemplo, sangre, suero, etc.; y similares.
Puede determinarse si se inhibe el crecimiento
de un tumor usando cualquier método conocido incluyendo, pero sin
limitación, un ensayo de proliferación celular in vitro (por
ejemplo, recuento del número de células); un ensayo de captación de
^{3}H-timidina; y similares.
Un agente que inhibe la tubulina desacetilasa se
administra por cualquier vía de administración. Las vías de
administración convencionales y farmacéuticamente aceptables
incluyen la vía intranasal, intramuscular, intratraqueal,
intratumoral, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica,
intravenosa, rectal, nasal, oral y otras vías de administración
parenterales. Las vías de administración pueden combinarse, si se
desea, o ajustase dependiendo del agente y/o el efecto deseado.
El agente puede administrarse en una sola dosis
o en múltiples dosis. Por ejemplo, un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres
veces al mes, una semana sí y otra no (qow), una vez por semana
(qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw),
cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por
semana, un día sí y otro no (qod), diariamente (qd), dos veces al
día (qid) o tres veces al día (tid), de una forma substancialmente
continua o continua, durante un periodo de tiempo que varía de
aproximadamente un día a aproximadamente una semana, de
aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas, de
aproximadamente un mes a aproximadamente dos meses, de
aproximadamente dos meses a aproximadamente cuatro meses, de
aproximadamente cuatro meses a aproximadamente seis meses, de
aproximadamente seis meses a aproximadamente ocho meses, de
aproximadamente ocho meses a aproximadamente 1 año, de
aproximadamente 1 año a aproximadamente 2 años, o de aproximadamente
2 años a aproximadamente 4 años o más.
En algunas realizaciones, un agente que inhibe
una tubulina desacetilasa se administra como un adyuvante para una
terapia convencional para el cáncer, como se ha descrito
anteriormente.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
agente alquilante. En algunas realizaciones, el agente alquilante es
una mostaza nitrogenada. En otras realizaciones, el agente
alquilante es una etilenimina. En otras realizaciones, el agente
alquilante es un alquilsulfonato. En otras realizaciones, el agente
alquilante es un triazeno. En otras realizaciones, el agente
alquilante es una nitrosourea.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
antimetabolito. En algunas realizaciones, el antimetabolito es un
análogo de ácido fólico tal como metotrexato. En otras
realizaciones, el antimetabolito es un análogo de purina tal como
mercaptopurina, tioguanina y axatioprina. En otras realizaciones,
el antimetabolito es un análogo de pirimidina tal como 5FU, UFT,
capecitabina, gemcitabina y citarabina.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
alcaloide de la vinca. En algunas realizaciones, el alcaloide de la
vinca es un taxano, tal como paclitaxel. En otras realizaciones, el
alcaloide de la vinca es una podofilotoxina, tal como etopósido,
tenipósido, ironotecan y topotecan.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
antibiótico antineoplásico. En algunas realizaciones, el antibiótico
antineoplásico es
doxorubicina.
doxorubicina.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
complejo de platino. En algunas realizaciones, el complejo de
platino es cisplatino. En otras realizaciones, el complejo de
platino es carboplatino.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
inhibidor de tirosina quinasa. En algunas realizaciones, el
inhibidor de tirosina quinasa es un inhibidor de una tirosina
quinasa asociada a receptores (RTK), tal como inhibidores de
tirosina quinasa asociada a receptores de tipo I (por ejemplo,
inhibidores de receptores del factor de crecimiento epidérmico),
inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo II
(por ejemplo, inhibidores del receptor de insulina), inhibidores de
tirosina quinasa asociada a receptores de tipo III (por ejemplo
inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas) e
inhibidores de tirosina quinasa asociada a receptores de tipo IV
(por ejemplo, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos).
En otras realizaciones, el inhibidor de tirosina quinasa es un
inhibidor de tirosina quinasa no asociada a receptores tal como
inhibidores de las quinasas src o las quinasas janus.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
inhibidor de una tirosina quinasa asociada a receptores implicada en
una o más rutas de señalización de factores de crecimiento. En
algunas realizaciones, el inhibidor es genisteína. En otras
realizaciones, el inhibidor es un antagonista específico de
tirosina quinasa asociada al receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), tal como gefitinib IRESSA^{TM}, erolotinib
TARCEVA^{TM} o tirfostina AG1478
(4-(3-cloro-anilino)-6,7-dimetoxiquinazolina.
En otras realizaciones, el inhibidor es cualquier antagonista de
indolinona de la actividad tirosina quinasa de
Flk-1/KDR (VEGF-R2). En otras
realizaciones, el inhibidor es cualquiera de los siguientes: el
antagonista
3-[(4,5,6,7-tetrahidro-1H-indol-2-il)metileno]-1,3-dihidroindol-2-ona
sustituida de la actividad tirosina quinasa de
Flk-1/KDR (VEGF-R2),
FGF-R1 o PDGF-R. En realizaciones
adicionales, el inhibidor es cualquier antagonista 3-[(3- o
4-carboxietilpirrol-2-il)metilidenil]indolin-2-ona
sustituida de Flt-1 (VEGF-R1),
Flk-1/KDR (VEGF-R2),
FGF-R1 o PDGF-R.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
inhibidor de una tirosina quinasa no asociada a receptores implicada
en una o más rutas de señalización de factores de crecimiento. En
algunas realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la
actividad tirosina quinasa de JAK2, tal como tirfostina AG490
(2-ciano-3-(3,4-dihidroxifenil)-N-(bencil)-2-propenamida).
En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la
actividad tirosina quinasa de bcr-abl, tal como
mesilato de imatinib
GLEEVEC^{TM}.
GLEEVEC^{TM}.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
inhibidor de serina/treonina quinasa. En algunas realizaciones, el
inhibidor de serina/treonina quinasa es un inhibidor de
serina/treonina quinasa asociada a receptores, tal como antagonistas
de la actividad serina/treonina quinasa asociada al receptor de
TGF-\beta. En otras realizaciones, el inhibidor de
serina/treonina quinasa es un inhibidor de serina/treonina quinasa
no asociado a receptores, tal como antagonistas de la actividad
serina/treonina quinasa de las MAP quinasas, proteína quinasa C
(PKC), proteína quinasa A (PKA), o las quinasas dependientes de
ciclina (CDK).
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente con cáncer una cantidad
eficaz de al menos un fármaco antineoplásico adicional que es un
inhibidor de una o más quinasas implicadas en la regulación del
ciclo celular. En algunas realizaciones, el inhibidor es un
antagonista de la activación de CDK2, tal como trifostina AG490
(2-ciano-3-(3,4-dihidroxifenil)-N-(bencil)-2-propenamida).
En otras realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la
actividad CDK1/ciclina B, tal como alsterpaulona. En otras
realizaciones, el inhibidor es un antagonista de la actividad
quinasa de CDK2 tal como
indirubin-3'-monoxima.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de un
taxano. En algunas realizaciones, los métodos implican administrar
una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina desacetilasa
y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de un taxano, y una
cantidad eficaz de un complejo de platino. En algunas
realizaciones, el taxano es paclitaxel y el complejo de platino es
cisplatino o carboplatino.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de al
menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antagonista de
antígeno asociado a tumores, tal como un anticuerpo antagonista. En
algunas realizaciones que implican el tratamiento de tumores que
expresan HER2, el antagonista de antígeno asociado a tumores es un
anticuerpo monoclonal anti-HER2, tal como
trastuzumab HERCEPTIN^{TM}. En algunas realizaciones que implican
el tratamiento de tumores que expresan CD20, tales como linfomas de
células B, el antagonista de antígeno asociado a tumores es un
anticuerpo monoclonal anti-CD20, tal como rituximab
RITUXAN^{TM}.
En algunas realizaciones, los métodos implican
administrar una cantidad eficaz de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa, y coadministrar al paciente una cantidad eficaz de al
menos un fármaco antineoplásico adicional que es un antagonista de
factor de crecimiento tumoral. En algunas realizaciones, el
antagonista del factor de crecimiento tumoral es un antagonista del
factor de crecimiento epidérmico (EGF), tal como un anticuerpo
monoclonal anti-EGF. En otras realizaciones, el
antagonista del factor de crecimiento tumoral es un antagonista del
receptor del factor de crecimiento epidérmico erbB1 (EGFR), tal como
un anticuerpo monoclonal anti-EGFR antagonista de
la activación o transducción de señales de EGFR.
En algunas realizaciones, el agente que inhibe
la tubulina desacetilasa es ribavirina o un derivado de ribavirina.
La ribavirina,
1-\beta-D-ribofuranosil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxamida,
disponible en ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif., se
describe en el Merck Index, compuesto Nº 8199, decimoprimera
edición. Su fabricación y formulación se describen en la Patente de
Estados Unidos Nº 4.211.771. La invención también contempla el uso
de derivados de ribavirina (véase, por ejemplo, la Patente de
Estados Unidos Nº 6.277.830). La ribavirina puede administrarse por
vía oral en forma de cápsulas o de comprimidos. Por supuesto, se
contemplan otros tipos de administración que están disponibles,
tales como pulverización nasal, la vía transdérmica, intravenosa,
por medio de supositorios, por una forma de dosificación de
liberación sostenida, etc. Funcionará cualquier forma de
administración siempre que se administren las dosificaciones
apropiadas sin destruir el ingrediente activo.
La ribavirina generalmente se administra en una
cantidad que varía de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 1200
mg al día, por ejemplo, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente
60 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 125 mg, de
aproximadamente 125 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente
200 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 300 mg a
aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente
600 mg, de aproximadamente 600 mg a aproximadamente 800 mg, de
aproximadamente 800 mg a aproximadamente 1000 mg, o de
aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 1200 mg al día.
Son ejemplos no limitantes ilustrativos de
terapias combinadas que incluyen tratamiento con radiación, agente
inhibidor de tubulina desacetilasa o tratamiento con un agente
quimioterapéutico y el agente inhibidor de tubulina desacetilasa,
los siguientes:
1) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y cisplatino en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150
mg/m^{2};
2) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y carboplatino en un intervalo de
dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150
mg/m^{2};
3) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y radiación en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 200 cGy a aproximadamente 8000 cGy;
4) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y paclitaxel en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250
mg/m^{2};
5) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y paclitaxel en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}; y
carboplatino en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5
mg/m^{2} a aproximadamente 1000 mg/m^{2};
6) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de
aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}, y
leucovorina en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5
mg/m^{2} a aproximadamente de 1000 mg/m^{2};
7) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; y trastuzumab en una dosis de carga inicial
de 4 mg/kg y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg;
8) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; trastuzumab en una dosis de carga inicial de
4 mg/kg y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg; y
paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40
mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2};
9) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; paclitaxel en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 40 mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}; y
fosfato de estramustina (Emcyte®) en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 1000
mg/m^{2};
10) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; cisplatino en un intervalo de dosificación
de aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 150 mg/m^{2}, y
5FU en un intervalo de dosificación de aproximadamente 5 mg/m^{2}
a aproximadamente 5000 mg/m^{2};
11) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de
aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}; y
radiación en una dosis de aproximadamente 200 cGy a aproximadamente
8000 cGy; y
12) una dosificación de un agente que inhibe la
tubulina desacetilasa; 5FU en un intervalo de dosificación de
aproximadamente 5 mg/m^{2} a aproximadamente 5000 mg/m^{2}; y
paclitaxel en un intervalo de dosificación de aproximadamente 40
mg/m^{2} a aproximadamente 250 mg/m^{2}.
En cualquiera de los ejemplos
1-12 de las terapias combinadas descritas
anteriormente, puede administrarse al paciente por vía oral
ribavirina en una dosis de aproximadamente 30 a aproximadamente 1200
mg/día.
Un agente que reduce el nivel de tubulina
desacetilasa y/o que inhibe la actividad enzimática de la tubulina
desacetilasa es útil para tratar cánceres en un paciente que tiene
un cáncer. Los métodos son útiles para tratar una amplia diversidad
de cánceres, incluyendo carcinomas, sarcomas, leucemias y linfomas.
Un paciente que tiene cualquier cáncer es adecuado para el
tratamiento con un método de la presente invención.
Los carcinomas que pueden tratarse usando un
método de la presente invención incluyen, pero sin limitación,
carcinoma esofágico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células
basales (una forma de cáncer de piel), carcinoma de células
escamosas (diversos tejidos), carcinoma de vejiga, incluyendo
carcinoma de células transicionales (un neoplasma maligno de la
vejiga), carcinoma broncogénico, carcinoma de colon, carcinoma
colorrectal, carcinoma gástrico, carcinoma pulmonar, incluyendo
carcinoma de células pequeñas y carcinoma de no microcítico de
pulmón, carcinoma adrenocortical, carcinoma de tiroides, carcinoma
de páncreas, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de
próstata, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara,
carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma
papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma de células
renales, carcinoma ductal in situ o carcinoma del conducto
biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de
Wilm, carcinoma cervical, carcinoma uterino, carcinoma testicular,
carcinoma osteogénico, carcinoma epitelial y carcinoma
nasofaríngeo, etc.
Los sarcomas que pueden tratarse usando un
método de la presente invención incluyen, pero sin limitación,
fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, cordoma,
sarcoma osteogénico, osteosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma,
linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma,
sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma y otros sarcomas
de tejidos blandos.
Otros tumores sólidos que pueden tratarse usando
un método de la presente invención incluyen, pero sin limitación,
glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma,
pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma,
menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Las leucemias que pueden tratarse usando un
método de la presente invención incluyen, pero sin limitación: a)
síndromes mieloproliferativos crónicos (trastornos neoplásicos de
células madre hematopoyéticas multipotenciales); b) leucemias
mielógenas agudas (transformación neoplásica de una célula madre
hematopoyéticas multipotencial o una célula hematopoyética de un
potencial de linaje restringido; c) leucemias linfocíticas crónicas
(CLL; proliferación clonal de linfocitos pequeños inmunológicamente
inmaduros y funcionalmente incompetentes) incluyendo CLL de células
B, CLL de células T, leucemia prolinfocítica y leucemia de células
pilosas; y d) leucemias linfoblásticas agudas (caracterizadas por
la acumulación de linfoblastos). Los linfomas que pueden tratarse
usando un método de la presente invención incluyen, pero sin
limitación, linfomas de células B (por ejemplo, linfoma de
Burkitt); linfoma de Hodgkin; y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
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MIZ-1 is regulated via microtubule association.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se presentan para
proporcionar a los especialistas habituales en la técnica una
descripción y análisis completo de cómo realizar y usar la presente
invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los
inventores consideran su invención ni pretenden describir que los
experimentos proporcionados a continuación son todos o los únicos
experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la
exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo,
cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos
errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra
cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es un peso
molecular medio ponderal, la temperatura está en grados centígrados,
y la presión es la presión atmosférica o una presión cercana a
ésta. Pueden usarse abreviaturas convencionales, por ejemplo, pb,
par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl,
picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h,
hora(s); y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se obtuvieron células HEK 293T y HeLa en la
ATCC, se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al
10% (Gemini Bio-products, Woodland, CA) en presencia
de penicilina, estreptomicina y L-glutamina 2 mM
(Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). HepG2 se obtuvo en la ATCC
y se cultivó en el medio descrito anteriormente con la adición de
aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM (Gibco Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA).
Para la SIRT2 recombinante, se alteró ADNc de
SIRT2 humana en pHEX (una donación de R. Frye) para insertar un
sitio de escisión de proteasa del factor Xa. Las construcciones
SIRT1 y SIRT3 humanas también fueron una donación de R. Frye. Las
SIRT4-7 humanas se clonaron a partir de bibliotecas
de ADNc de testículo y de bazo (Clontech, Mountain View, CA) en el
vector pcDNA3.1 (+) por estrategias basadas en PCR convencionales y
se confirmaron por secuenciación. Todos los ADNc de SIRT se
subclonaron para generar fusiones marcadas con FLAG en el extremo C
en la estructura principal de pcDNA3.1(+) (In Vitrogen, Carlsbad,
CA) y la SIRT2 humana de tipo silvestre se clonó en el vector
pEGFP-C1 (Clontech, Mountain View, CA) por
mutagénesis basada en PCR convencional.
pEGFP-MIZ-1 fue una donación de J.E
Wilson. La mutagénesis dirigida para las construcciones de SIRT2 se
realizó usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange
(Stratagene, La Jolla, CA) como describe el fabricante.
Se transformaron bacterias DH5\alphaF'IQ
(Gibco Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) con el vector pHEX que
contenía el ADNc de SIRT2 humana con el sitio de escisión del
factor Xa y se indujeron con IPTG 0,1 mM a 37ºC durante 2 horas. La
proteína marcada con His 6x resultante se purificó en condiciones
nativas a 4ºC por Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA),
desalificación con HiPrep 26/10 y cromatografías en Sepharose Q
(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Se prepararon
alícuotas de la proteína recombinante y se almacenaron a -20ºC.
Se transfectaron células HEK 293T por el método
de precipitación de ADN con fosfato cálcico y se lisaron 48 horas
después de la transfección en tampón de lisis de baja rigurosidad
(Tris-HC 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,5 mM,
NP-40 al 0,5%, NaCl 150 mM) en presencia de cóctel
inhibidor de proteasa (Complete, Roche Molecular Biochemicals,
Indianapolis, IN). Las proteínas marcadas con FLAG se
inmunoprecipitaron con gel de afinidad de agarosa
anti-FLAG M2 (Sigma, St Louis, MO) y las proteínas
marcadas con GFP se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal
anti-GFP (Sigma, St Louis, MO) en presencia de
proteína G Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway,
NJ) durante 2 horas a 4ºC. El material inmunoprecipitado se lavó 3
veces en tampón de lisis de baja rigurosidad y una vez en tampón de
SIRT2 desacetilasa (Tris-HCI 50 mM, pH 9,0,
MgCl_{2} 4 mM y ditiotreitol (DTT) 0,2 mM).
Se transfectaron células HEK 293T como se ha
descrito anteriormente y se sometieron a extracción nuclear y
citoplásmica como se ha descrito previamente (Dignam et al.,
1983) excepto por la adición de NP-40 al 1,0% al
tampón C.
Se resuspendieron material inmunoprecipitado y
SIRT2 recombinante en 100 \mul de tampón de SIRT2 desacetilasa
que contenía NAD (Sigma, St Louis, MO) y péptido H4 de histona
acetilada [^{3}H] (a.a. 1-23) (Emiliani et
al., 1998). Se resuspendió TSA (WACO BioProducts, Richmond, VA)
en dimetil sulfóxido (DMSO), se diluyó adicionalmente en DMSO y se
añadió a reacciones a la concentración deseada. Las reacciones se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se
interrumpieron por la adición de 25 \mul de HCl 0,1 M y ácido
acético 0,16 M. El acetato liberado se extrajo en 500 \mul de
acetato de etilo y se sometió a agitación vorticial durante 15
minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos, se
mezclaron 400 \mul de la fracción de acetato de etilo con 5 ml de
líquido de centelleo y se contaron.
Se separaron muestras en geles de dodecil
sulfato sódico (SDS) al 10%-poliacrilamida y se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ). Las membranas se bloquearon con reactivo de
bloqueo al 5% (Bio-Rad, Hercules, CA) en
TBS-Tween (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, y
Tween-20 al 0,1%), se sondaron con anticuerpo
anti-tubulina acetilada
6-11B-1,
anti-tubulina
B-5-1-2 o
anti-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO), todos a una
dilución 1:2000 o anticuerpo anti-péptido de colores
vivos (Clontech, Mountain View, CA), anti-p65
(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) o anti-Lamina A
(Cell Signalling Technology, Inc., Beverly, MA) todos diluidos
1:1000. La detección secundaria se realizó usando IgG oveja
anti-ratón acoplada a peroxidasa de rábano picante
(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) o IgG de cabra
anti-conejo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL),
ambas diluidas 1:5000, y sistema de detección de transferencia de
Western ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
Se transfectaron células HeLa cultivadas en
cubreobjetos con reactivo LipofectAMINE (Gibco Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA) durante 8 horas de acuerdo con el protocolo del
fabricante o por el método de precipitación de ADN con fosfato
cálcico. Las células transfectadas se incubaron durante 12 horas con
TSA 400 nM (WACO BioProducts, Richmond, VA) 24 horas después de la
transfección. Las células se lavaron dos veces durante 10 minutos en
PBS y se fijaron durante 10 minutos en formaldehído al 4% (EMS, Ft.
Washington, PA) seguido de permeabilización durante 10 minutos en
Triton X-100 al 0,5% en PBS. Después de tres lavados
durante 10 minutos en PBS, las células se incubaron durante 10
minutos BSA al 10% y se incubaron durante 1 hora con
anti-tubulina acetilada
6-11B-1,
anti-tubulina
B-5-1-2 diluido
1:1000, o anti-FLAG M2 diluido 1:500 en detergente
no iónico Tween-20^{TM} al 0,1%. Las células se
lavaron tres veces en detergente no iónico
Tween-20^{TM} al 0,1%, seguido de incubación con
anticuerpo IgG conjugado con TRITC (con especificidad de Fc) de
cabra anti-ratón. (Sigma, St. Louis) diluido 1:100
en detergente no iónico Tween-20^{TM} al 0,1%.
Después de la incubación, las células se incubaron durante 5
minutos en 20 mg/ml de clorhidrato de
4',6'-diamidino-2-fenilindol
(DAPI), se lavaron tres veces en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) y una vez en ddH_{2}O y se montaron con Gel Mount
(Biomeda Corp., Foster City, CA). Los portaobjetos se visualizaron
en un sistema de microscopio Nikon E600 equipado con una cámara
digital SPOT 2. Las imágenes confocales se adquirieron por
microscopía de exploración láser confocal con un microscopio
Olympus BX60 equipado con un sistema confocal Radiance 2000 (BioRad,
Hercules, California).
Se resuspendieron inmunoprecipitaciones en 100
\mul de tampón de SIRT desacetilasa que contenía 50 \mug de
lisado celular de células HEK 293T no transfectadas y NAD 1 mM. Las
reacciones que contenían TSA 400 nM o nicotinamida 5 mM (Sigma, St.
Louis, MO) se preincubaron a temperatura ambiente con todos los
componentes de la reacción en ausencia de NAD durante 10 minutos.
Después de la preincubación, las reacciones enzimáticas se
iniciaron con la adición de NAD seguido de incubación durante 2
horas a temperatura ambiente con agitación constante. Las
reacciones se detuvieron por la adición de 50 \mul de tampón de
electroforesis de SDS-gel de poliacrilamida (PAGE)
6x. Las perlas se sedimentaron por centrifugación a 14.000 rpm
durante 10 minutos, se separaron 10 \mul de cada sobrenadante en
geles de SDS-PAGE al 10% y se sometieron a
transferencia de Western como se ha descrito anteriormente.
Se hicieron reaccionar concentraciones
crecientes de péptido de tubulina (20-900 \muM) y
NAD 800 \muM en presencia de SIRT2 recombinante de 0,8 a 1 \muM
en Tris 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM y metanol al 10% a 37ºC. Para las
reacciones de Hst2p, se hicieron reaccionar los péptidos de tubulina
y NAD 500 \muM en presencia de Hst2p recombinante de 9 a 19
\muM en las mismas condiciones. Las reacciones se inactivaron con
ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final del 1%. Se
eligieron puntos de tiempo de tal forma que se observaran las
condiciones de velocidad iniciales. Se inyectaron muestras en la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna
analítica Beckman C18. Después de la inyección, el sistema se hizo
funcionar isocráticamente con disolvente A (TFA al 0,05% en
H_{2}O), seguido de un gradiente de 0-10% de
disolvente B (TFA al 0,02% en CH_{3}CN) durante 4 minutos y
seguido de un gradiente de 10-23% de disolvente B
durante 23 minutos. Los péptidos desacetilados y acetilados se
eluyeron con CH_{3}CN al 16% y 18%, respectivamente. La elución
de los sustratos y de los productos se controló midiendo la
absorbencia a 214 nm, y los picos correspondientes se integraron
usando el software Beckman System Gold Nouveau. La cantidad de
producto se cuantificó calculando el porcentaje de péptido de
tubulina desacetilado a partir del péptido de tubulina total
basándose en sus valores de integración. Se ajustaron gráficos de
velocidad frente concentraciones de péptido de tubulina a la
ecuación de Michaelis-Menten para obtener los
parámetros cinéticos de K_{m}, k_{cat} y V/K.
Como sustrato para Hst2p y SIRT2 se utilizaron
el péptido de histona H3 monoacetilado
ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL (SEC ID Nº:03)
(AcLys-14 H3). El péptido de H3 se marcó con ^{3}H
usando la histona acetiltransferasa PCAF y se purificó como se ha
descrito previamente (Tanner et al., 2000). Las mediciones de
la velocidad utilizaron un ensayo de unión a carbón donde 70 \mul
de reacciones HDAC se inactivaron en 10 \mul de suspensión de
carbón (volumen de carbón frente a volumen de tampón glicina 1:3)
que contenía glicina 2 M a pH 10,0. Los tiempos de reacción se
eligieron (normalmente 2-5 minutos) de tal forma que
se mantuvieran las velocidades iniciales en estado estacionario.
Las muestras se calentaron inmediatamente durante \geq 20 minutos
para liberar el acetato libre de la Ac-ADP ribosa
antes de la centrifugación. El sobrenadante se trató con 10 \mul
adicionales de suspensión de carbón antes de determinar el acetato
libre total liberado (por recuento de centelleo de líquidos). Los
datos se convirtieron en velocidades iniciales y se ajustaron a la
ecuación de Michaelis-Menten \nu_{0} =
([E]_{0}k_{cat} \cdot [S]/(K_{m}+[S]). Los
experimentos de control indicaron que el péptido
[^{3}H]-Ac-Lys H3 no se había
hidrolizado de manera no enzimática. Además, la adición de carbón
activado (a todos los valores de pH y temperaturas examinadas)
detuvo inmediatamente la reacción enzimática. El calentamiento a
alto pH sólo fue necesario para liberar el acetato de la
Ac-ADP ribosa.
Se acetilaron histonas nucleares de timo de
ternero (Calbiochem, San Diego, CA) usando 7,5-10
mg/ml de histonas de timo de ternero, AcCoA 100 \muM (\sim150
cpm/pmol, NEN), PCAF 10 \muM, en [DTT 5 mM, Tris 50 mM, pH 7,5]
durante 1,5 h a 23ºC. La Acetil-CoA restante se
retiró por exclusión molecular y las histonas marcadas se
cuantificaron por recuento de centelleo de líquidos. Los ensayos de
desacetilación se realizaron usando enzima 30-50
nM, NAD 500 \muM, histonas \sim1,2 \muM, pH 7,5 y 24 \pm
1ºC. La formación del producto se calculó a partir del ensayo de
unión a carbón radiactivo.
Se trataron células HEK 293T, HeLa y HepG2
durante 6 horas con colchicinas 25 \muM (Sigma) y se lisaron en
tapón de lisis de baja rigurosidad. Los lisados se equilibraron por
concentración de proteína total, se separaron en geles de
SDS-PAGE al 10% y se sometieron a transferencia de
Western como se ha descrito anteriormente.
Para determinar si SIRT2 contenía la actividad
desacetilasa dependiente de NAD asociada con otras proteínas
relacionadas con SIR2, se incubó SIRT2 recombinante purificada a
partir de E. coli con concentraciones crecientes de NAD y un
péptido correspondiente a la cola amino terminal de la histona H4
(a.a. 1-23) acetilado in vitro.
Las figuras 1A-D representan la
desacetilación dependiente de NAD de un péptido de histona por SIRT2
humana. Figura 1A. Se midió la actividad enzimática de
6-His-SIRT2 recombinante sobre un
péptido de histona H4 acetilado marcado con [^{3}H] (a.a.
1-23) en presencia de concentraciones crecientes de
NAD. Se extrajo el acetato liberado y se midió por recuento de
centelleo. Figura 1B. Se midió la actividad enzimática de proteína
inmunoprecipitada procedente de células HEK 293T transfectadas con
FLAG o SIRT2-FLAG en un péptido de histona H4
acetilado marcado con [^{3}H] (a.a. 1-23) en
presencia de concentraciones crecientes de NAD. El 10% del material
inmunoprecipitado introducido en la reacción enzimática se analizó
por SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western
con un anticuerpo anti-FLAG. Figura 1C. Reacción
similar a la descrita en (B) con SIRT2-FLAG -/+ NAD
o HDAC6-FLAG y concentraciones crecientes de TSA.
SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western como
se ha descrito en (B). Figura 1D. Reacción similar a la descrita en
(B) con SIRT2-FLAG -/+ NAD y concentraciones
crecientes de nicotinamida. SDS-PAGE y análisis de
transferencia de Western como se ha descrito en (B).
Se observó un aumento dependiente de la dosis en
la actividad histona desacetilasa (HDAC) en respuesta a
concentraciones crecientes de NAD (figura 1A). Un aumento adicional
en la concentración de NAD a 10 mM produjo una reducción en la
actividad desacetilasa (figura 1A). De manera similar, una proteína
SIRT2 marcada con el epítopo FLAG (SIRT2-FLAG) se
inmunoprecipitó después de la transfección de células HEK 293T.
SIRT2-FLAG mostró un aumento similar en la
actividad HDAC en respuesta a concentraciones crecientes de NAD
desde 1 \muM a 1 mM (figura 1B). Sin embargo, esta actividad HDAC
aumentó adicionalmente en respuesta a concentraciones de NAD de 10
mM (figura 1B). En cada reacción estaban presentes cantidades
equivalentes de SIRT2-FLAG como se demuestra por el
análisis de transferencia de Western (figura 1B).
Los resultados de los presentes solicitantes
confirman que SIRT2 contiene actividad histona de desacetilasa
dependiente de NAD como se ha descrito previamente (Tanner et
al., 2000; Finnin et al., 2001). Además, la observación
de que la SIRT2 recombinante es enzimáticamente activa indica que la
actividad desacetilasa de SIRT2 no requiere factores asociados
(figura 1A). Sin embargo, la presencia de factores asociados en
lisados celulares podría jugar un papel en la mayor actividad
observada en presencia de altas concentraciones de NAD (figura
1B).
A diferencia de las desacetilasas de clase I y
de clase II, se ha notificado que las desacetilasas de clase III
son insensibles al potente inhibidor de clase I y de clase II
tricostatina A (TSA) (Yoshida et al., 1990; Furumai et
al., 2001). Para confirmar que la actividad enzimática de SIRT2
es insensible a TSA, se midió la actividad enzimática de
SIRT2-FLAG inmunoprecipitada con NAD 1 mM en
presencia o ausencia de concentraciones crecientes de TSA
(100-1600 nM). No se midió ningún cambio en la
actividad HDAC de SIRT2 en respuesta a concentraciones crecientes
de TSA (figura 1C). Por el contrario, HDAC6-FLAG
inmunoprecipitada a partir de células HEK-293T
transfectadas se inhibió de forma potente por TSA 400 nM (figura
1C).
La nicotinamida representa el primer producto de
la hidrólisis del enlace
piridinio-N-glicosídico del NAD
(Landry et al., 2000) y funciona como un inhibidor eficaz
para la proteína SIRT1 relacionada (Luo et al., 2001). Para
ensayar si SIRT2 también se inhibe por la nicotinamida, se incubó
SIRT2-FLAG inmunoprecipitada procedente de lisados
transfectados con concentraciones crecientes de nicotinamida. Se
observó una reducción de la actividad HDAC dependiente de la dosis
con concentraciones crecientes de nicotinamida que variaban de 156
\muM a 20 mM (figura 1D).
Las figuras 2A-C representan la
inactivación de la actividad histona desacetilasa de SIRT2 por
mutaciones puntuales dentro del dominio catalítico de SIRT2. Figura
2A. Diagrama esquemático de proteínas Sir2 procedentes de S.
cerevisiae, C. elegans y Drosophila alineadas con SIRT2
humana dentro de una región del dominio Sir2 (esquema adaptado de
(Frye, 1999)). Se destacan dos restos clave necesarios para la
actividad histona desacetilasa (Finnin et al., 2001). Los
números de acceso del Genbank de las proteínas descritas son: S.
cerevisiae NP 010242, C. elegans NP 501912, D.
melanogaster AAC79684 y SIRT2 humana NP 036369. Figura 2B. Se
midió la actividad enzimática de la proteína inmunoprecipitada del
vector FLAG y SIRT2-FLAG de tipo silvestre, N152A o
células HEK 293T transfectadas con mutantes H187Y sobre un péptido
de histona H4 acetilado marcado con [^{3}H] (a.a.
1-23) con o sin NAD. El 10% del material de
inmunoprecipitación introducido en la reacción enzimática se
analizó por SDS-PAGE y transferencia de Western con
un anticuerpo anti-FLAG. Figura 2C. La actividad
enzimática de la proteína inmunoprecipitada a partir de GFP o
GFP-SIRT2 de tipo silvestre, N152A o mutantes H187Y
se midió en el ensayo descrito en (B). SDS-PAGE y
transferencia de Western como se describe en (B) usando un
anticuerpo anti-GFP.
Las proteínas Sir2 contienen un dominio muy
conservado, el dominio Sir2, asociado con la actividad enzimática.
Se han identificado varios restos muy conservados dentro de este
dominio que son necesarios para la actividad desacetilasa
(destacados en la figura 2A) (Finnin et al., 2001). Para
confirmar el papel de estos restos en la actividad desacetilasa, la
asparagina 168 se sustituyó por una alanina y la histidina 187 por
una tirosina dentro del contexto de SIRT2-FLAG y en
una proteína de fusión entre GFP y el extremo N de SIRT2
(GFP-SIRT2). Se demostró que las dos proteínas
inmunoprecipitadas con anti-FLAG o
anti-GFP, respectivamente, contienen actividad
dependiente de NAD (figura 2B, C). En las dos construcciones, las
sustituciones N168A y H187Y anulaban esta actividad HDAC observada
(figura 2B, C).
Aunque las HDAC de clase I permanecen
exclusivamente en el núcleo, las HDAC de clase II se desplazan entre
el núcleo y el citoplasma. El desplazamiento nucleocitoplásmico se
regula por la fosforilación y representa un elemento en la
regulación de su actividad enzimática (Fischle et al., 2001).
De manera interesante, las HDAC de clase III presentan una
distribución subcelular variable. Sir2\alpha de ratón y su
homólogo humano SIRT1 se localizan principalmente en el núcleo
(Vaziri et al., 2001; Luo et al., 2001). Por el
contrario, la SIRT2 de ratón y humana se localizan principalmente
en el citoplasma (Afshar y Murnane, 1999; Yang et al., 2000)
y, de manera interesante, la proteína SIRT3 humana se localiza en
las mitocondrias (Schwer et. al., presentado). La
localización subcelular de SIRT2, como una proteína de fusión con
GFP y como una proteína marcada con FLAG, se determinó por dos
estrategias independientes. En primer lugar se purificaron extractos
nucleares y citoplásmicos de células HEK 293T transfectadas y estos
extractos se ensayaron por transferencia de Western con anticuerpos
anti-GFP o anti-FLAG.
GFP-SIRT2 era exclusivamente citoplásmica, mientras
que SIRT2-FLAG era predominantemente citoplásmica
con una pequeña fracción presente dentro del compartimento nuclear.
El sondeo de las mismas fracciones para una proteína citoplásmica
conocida, p65, y para una proteína nuclear conocida, Lamina A,
confirmó la pureza de las fracciones citoplásmicas y nucleares de
los presentes solicitantes.
En segundo lugar se usó microscopía de
inmunofluorescencia para confirmar adicionalmente la localización
subcelular de SIRT2. Después de la transfección de
GFP-SIRT2 y SIRT2-FLAG en células
HeLa, se observó una localización exclusivamente citoplásmica para
las dos proteínas de fusión. Además, se detectó que SIRT2 estaba
localmente más concentrada en un eje apolar del núcleo. Este patrón
de localización coincidía con el aumento característico en la
localización de tubulina en el centro de organización de los
microtúbulos (MTOC), también localizado en un eje apolar del
núcleo.
La localización de SIRT2 en una región
correspondiente al MTOC llevó a los presentes solicitantes a ensayar
si SIRT2 puede desacetilar la tubulina. Después de la transfección
de células HeLa con GFP-SIRT2, que se mantiene
catalíticamente activa como una desacetilasa (figura 2C), las
células se tiñeron con un antisuero específico para la
\alpha-tubulina acetilada en la
lisina-40 (Piperno et al., 1987). Se
descubrió que las células que expresaban GFP-SIRT2
mostraban una notable reducción en la tubulina acetilada en
comparación con células no transfectadas vecinas. Como control, las
células transfectadas con un vector de expresión para GFP sola no
presentaban ninguna alteración en el nivel de tubulina acetilada. Se
consideraron dos posibilidades para explicar estos resultados. En
primer lugar, SIRT2 podía ser una tubulina desacetilasa auténtica.
En segundo lugar, la SIRT2 activa puede regular la dinámica de la
polimerización de tubulina dando como resultado de esta manera
microtúbulos polimerizados reducidos, lo cual puede afectar al
estado de acetilación de la \alpha-tubulina. Para
responder a esta cuestión, las células transfectadas con
GFP-SIRT2 se tiñeron con un antisuero que reconoce
la \alpha-tubulina independientemente del estado
de acetilación. No se observó ningún cambio visible en la red de
microtúbulos en células transfectadas con GFP-SIRT2
en comparación con las células no transfectadas. Estos resultados
son coherentes con el modelo de que SIRT2 es una tubulina
desacetilasa funcional.
Para verificar que la actividad desacetilasa de
SIRT2 era necesaria para la desacetilación de la
\alpha-tubulina, se introdujeron vectores de
expresión de GFP-SIRT2 que contenían las mutaciones
catalíticamente inactivas de los presentes solicitantes N168A y
H187Y en células HeLa mediante transfección. Se observó que el
mutante catalíticamente inactivo SIRT2 no tenía ningún efecto sobre
el nivel de \alpha-tubulina acetilada. Estos
resultados indican que la expresión de SIRT2 tipo silvestre in
vivo conduce a la desacetilación de la
lisina-40 en la \alpha-tubulina,
mediada por la actividad desacetilasa de SIRT2.
Para ensayar directamente la capacidad de SIRT2
de desacetilar la \alpha-tubulina, se desarrolló
un ensayo de desacetilación de tubulina ex vivo. En este
ensayo, se transfectaron células HEK 293T con
SIRT2-FLAG seguido de inmunoprecipitación de la
proteína marcada con FLAG (figura 3A). El material inmunoprecipitado
se separó en dos fracciones. La primera fracción se usó para medir
la actividad HDAC usando el péptido de la histona H4 acetilado. La
segunda fracción se usó para un ensayo de la actividad de
desacetilación de tubulina (figura 3A) usando lisados celulares
totales procedentes de células HEK 293T no transfectadas como
sustrato para la \alpha-tubulina acetilada. El
grado de acetilación/desacetilación de
\alpha-tubulina se determinó por análisis de
transferencia de Western usando un antisuero específico para la
\alpha-tubulina acetilada. En primer lugar, se
demostró que el material inmunoprecipitado después de la
transfección de células HEK 293T con un vector FLAG vacío no tenía
ningún efecto sobre la acetilación de tubulina (figura 3B, calle 1).
Este resultado demuestra que ni el lisado utilizado como sustrato
de \alpha-tubulina acetilada ni el procedimiento
de inmunoprecipitación llevan niveles significativos de actividad
tubulina desacetilasa. Por el contrario, la incubación del lisado
celular con la proteína SIRT2-FLAG inmunoprecipitada
desacetilaba la tubulina de una manera dependiente de NAD (figura
3B, calles 2 y 3). Además, se confirmó que los mutantes
catalíticamente inactivos N168A y H187Y no desacetilan la
\alpha-tubulina (figura 3B, calles 4 y 5).
Los seres humanos contienen siete proteínas muy
conservadas con homología con Sir2p de S. cerevisiae (Frye,
1999; Frye, 2000). Para determinar si la actividad de desacetilación
de la \alpha-tubulina se restringía a SIRT2, se
expresaron las siete proteínas Sir2 humanas marcadas con FLAG en el
extremo C en células HEK 293T y se inmunoprecipitaron. El material
inmunoprecipitado se ensayó en el ensayo de desacetilación de
tubulina ex vivo de los presentes solicitantes y en el
ensayo de actividad HDAC usando el péptido de histona H4. De las
siete proteínas SIRT, sólo SIRT1, 2 y 3 demostraron una actividad
HDAC significativa sobre un péptido de histona H4 (figura 3C).
SIRT4, 5, 6 y 7 no tuvieron actividad HDAC detectable (figura 3C).
Por el contrario, sólo SIRT2 desacetilaba la tubulina in
vitro (figura 3C). Estos resultados demuestran que SIRT2 es la
única proteína desacetilasa de clase III capaz de desacetilar la
tubulina.
El tratamiento de células con el inhibidor de
HDAC de la clase I y de clase II TSA induce la hiperacetilación de
la \alpha-tubulina (Grozinger et al.,
2001). Este resultado sugiere que una HDAC de clase I o de clase II
también puede desacetilar la \alpha-tubulina. Como
las HDAC de clase I son exclusivamente nucleares, las HDAC de clase
II, que se sabe que se desplazan entre el núcleo y el citoplasma,
fueron el objetivo de este estudio. Las HDAC4, 5, 6 y 7 se marcaron
con FLAG en el extremo C, se introdujeron por transfección en
células HEK 293T, se inmunoprecipitaron y se ensayaron con respecto
a la actividad HDAC y la actividad tubulina desacetilasa. Todas las
HDAC de clase II mostraron una actividad desacetilasa abundante en
el péptido H4 acetilado (figura 3D). Sin embargo, ninguna de las
HDAC de clase II ensayadas contenían actividad tubulina desacetilasa
(figura 3D).
La purificación de un complejo SET3 de S.
cerevisiae ha identificado HDAC de clase I y de clase III
presentes en el mismo complejo multiproteína (Pijnappel et
al., 2001). Para confirmar que una proteína de tipo SIR2 es el
único componente en la inmunoprecipitación responsable de la
desacetilación de tubulina, se ensayó si la nicotinamida podía
inhibir la actividad tubulina desacetilasa asociada con SIRT2. Se
transfectaron células HEK 293T con SIRT2-FLAG o el
vector vacío como control, seguido de inmunoprecipitación usando
anti-FLAG. No se detectó desacetilación en ausencia
de NAD (figura 3E, calle 2).La adición de NAD a la reacción
SIRT2-FLAG condujo a la desacetilación completa de
la tubulina. Esta reacción se inhibió completamente en presencia de
nicotinamida 5 mM (figura 3E, calles 3 y 4). Como control, la
tricostatina A, un potente inhibidor de las HDAC de clase I y de
clase II, no tuvo ningún efecto sobre la desacetilación de tubulina
por SIRT2 (figura 3E, calle 5). Estos resultados confirman que la
única tubulina desacetilasa encontrada dentro del material de SIRT2
inmunoprecipitado es SIRT2.
Las figuras 3A-E demuestran que
SIRT2 desacetila la tubulina ex vivo. Figura 3A. Diagrama
esquemático del ensayo de desacetilación de tubulina ex
vivo. Figura 3B. La proteína inmunoprecipitada correspondiente
a SIRT2-FLAG de tipo silvestre, N168A o H187Y, se
incubó con lisado celular in vitro. Los productos de
reacción se separaron por SDS-PAGE y transferencia
de Western usando antisuero específico para la tubulina acetilada,
tubulina y FLAG. La mitad de la inmunoprecipitación se sometió a un
ensayo de la actividad HDAC usando un péptido de histona H4
acetilado in vitro. Figura 3C. Ensayo de desacetilación de
tubulina similar usando las siete HDAC de clase III,
SIRT1-7-FLAG, como se ha descrito
para (B). La mitad de la inmunoprecipitación se sometió al ensayo
de actividad HDAC descrito para (B). Figura 3D. Ensayo de
desacetilación de tubulina similar usando las HDAC de clase II
descritas para (B). La mitad de la inmunoprecipitación se sometió al
ensayo de actividad HDAC descrito para (B). Figura 3E. La
inhibición de la desacetilación de la tubulina por SIRT2 se examinó
usando el ensayo de desacetilación de tubulina similar con
SIRT2-FLAG como en (B) incluyendo reacciones
incubadas con nicotinamida 5 mM o TSA 400 nM.
Para analizar adicionalmente la desacetilación
de tubulina por SIRT2, se realizó un análisis enzimático detallado.
Con fines comparativos, se analizó la histona desacetilasa de
levadura de alta actividad Hst2p paralelamente con la enzima
humana. Hst2p muestra una fuerte selectividad por péptidos
correspondientes a la histona H3 acetilada en la
lisina-14 (Tanner et al., 2000; Landry et
al., 2000). Se utilizó un péptido de
\alpha-tubulina sintético de 9 aminoácidos
(MPSD(AcK)TIGG; SEC ID Nº:08) acetilado en la
lisina-40 y un péptido sintético de 20 aminoácidos
de la histona H3 (ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL; SEC ID
Nº:03), acetilado en la lisina-14, para medir las
velocidades iniciales de Hst2p y SIRT2 a diversas concentraciones de
péptido de histona H3 o tubulina. Las curvas de saturación
resultantes se ajustaron a la ecuación de
Michaelis-Menten, produciendo los parámetros
cinéticos k_{cat}, K_{m} y V/K. El valor
K_{cat} es la velocidad máxima de renovación de la enzima
cuando los sustratos están en concentraciones de saturación. El
valor de K_{m} es la concentración de sustrato necesaria
para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. La constante más
relevante desde el punto de vista fisiológico es el valor de
V/K, ya que esta constante de segundo orden define la
velocidad de la reacción cuando las concentraciones de sustrato no
están a niveles de saturación, y refleja tanto la unión al sustrato
como la catálisis. Como las reacciones enzimáticas celulares rara
vez se producen en condiciones de velocidad máxima (es decir,
niveles de sustrato de saturación), es probable que grandes
diferencias en el valor de V/K de la enzima reflejen las
consecuencias más relevantes in vivo.
Con péptidos de tubulina acetilados como
sustrato, SIRT2 presentó una preferencia sorprendente por este
sustrato en comparación con Hst2p de levadura (figura 4A). Esta
diferencia fue de \sim60 veces y se reflejó tanto en los valores
de K_{cat} como en los de V/K, que fueron de 0,144
\pm 0,005 s^{-1} y 894 \pm 100 M^{-1}s^{-1} para SIRT2 y
de 0,00254 \pm 0,0003 s^{-1} y 14,9 M^{-1}s^{-1} para Hst2p,
respectivamente. Por el contrario, cuando se empleó el péptido de
H3 acetilado como sustrato, Hst2p demostró una preferencia
\sim200 veces más fuerte por el péptido H3 con respecto a SIRT2
(figura 4B). Estas diferencias se reflejaron en los valores de
V/K y K_{m}, que fueron de 3930 \pm 261
M^{-1}s^{-1} y 54,2 \pm 3,6 \muM para SIRT2, y de 717.900
\pm 35.900 M^{-1}s^{-1} y 0,280 \pm 0,014 \muM para Hst2p,
respectivamente. Los valores de k_{m} (\sim0,2 s^{-1})
fueron similares entre las dos enzimas.
Estos resultados indican que la familia Sir2 de
las desacetilasas dependientes de NAD presenta notables diferencias
en la especificidad por el sustrato, y que la SIRT2 humana presenta
una notable preferencia por el péptido de tubulina acetilado con
respecto a la enzima Hst2p de levadura (figura 4A, C y D). Para
proporcionar pruebas adicionales de que SIRT2 tiene una capacidad
reducida para desacetilar histonas en comparación con Hst2p, se
examinó la capacidad de SIRT2 y Hst2p para desacetilar histonas
nucleares. Se incubaron histonas purificadas acetiladas in
vitro por PCAF con cantidades catalíticas de SIRT2 o Hst2p, y se
cuantificó la desacetilación (figura 4C). Se determinaron los
valores de V/K aparentes y se compararon. De acuerdo con los
resultados de péptidos, Hst2p presentó un valor de V/K 7
veces mayor que SIRT2.
Las figuras 4A-D representan la
preferencia de substrato para SIRT2. Figura 4A. Velocidades
iniciales medidas a concentraciones variables de péptido de
tubulina, (MPSD(AcK)TIGG) para SIRT2 (círculos
blancos) y para Hst2p (círculos negros) con las concentraciones y
condiciones descritas en materiales y métodos. La curva con SIRT2
representa las velocidades medias de 3 experimentos diferentes. La
curva de Hst2p es una serie de datos representativos de 1 de 3
experimentos distintos. Las concentraciones de NAD indicadas son
saturantes con respecto a cada enzima.
Figura 4B. Velocidades iniciales para cada
enzima medidas a diversas concentraciones de péptido H3 acetilado
(ARTKQTARKSTGG(AcK)APRKQL; SEC ID Nº:03) para SIRT2
(círculos blancos) y para Hst2p (círculos negros) con las
concentraciones y condiciones descritas en materiales y métodos. Las
concentraciones de NAD indicadas son saturantes con respecto a cada
enzima.
Figura 4C. Curvas de progreso cinético de
desacetilación de histona por SIRT2 y Hst2p. SIRT2 (50 nM) o Hst2p
(20 nM) se incubaron con histonas de núcleo de timo de ternero
acetiladas con PCAF \sim1,2 \muM.
Figura 4D. La tabla que indica los resultados
cuando los gráficos de (A) y (B) se ajustaron a la ecuación de
Michaelis-Menten para obtener los parámetros
cinéticos de K_{m}, k_{cat} y V/K.
Un informe reciente documentó la formación de
complejos del factor de transcripción, dedo de zinc 1 de interacción
con Myc (MIZ-1), por medio de la unión a tubulina
en microtúbulos polimerizados (Ziegelbauer et al., 2001). En
este informe, los autores sugieren que después de la
despolimerización de la red de microtúbulos, MIZ-1
se libera por su unión a tubulina y es libre para translocarse al
núcleo. De forma interesante, cuando se averiguó el estado de
polimerización de tubulina por tratamiento con colchicina o
nocodazol, se observó las desacetilación de tubulina en respuesta a
la despolimerización por los dos tratamientos (figura 5A). Además,
se observó que sólo los microtúbulos polimerizados pueden servir
como sustrato para la acetilación de
\alpha-tubulina por la tubulina acetiltransferasa
aún no definida. En su informe, Ziegelbauer et al. demuestra
que en la línea de células de carcinoma hepatocelular, HepG2,
MIZ-1 tiene una localización predominantemente
citoplásmica. De forma interesante, cuando se examinó la
localización de GFP-MIZ-1 en células
HeLa, que tienen un bajo nivel de \alpha-tubulina
acetilada, se descubrió que está localizado predominantemente en el
núcleo. Sin embargo, cuando estas células se trataron con TSA, lo
cual conduce a una hiperacetilación de tubulina, se observó un
claro desplazamiento en la localización de
GFP-MIZ-1 desde el núcleo al
citoplasma.
Para determinar si esta relocalización de
MIZ-1 al citoplasma después del tratamiento de las
células con TSA depende del estado de acetilación de la
\alpha-tubulina, se utilizó la actividad
desacetilasa de SIRT2. Después de la cotransfección de las células
con GFP-MIZ-1 y el vector FLAG,
SIRT2-FLAG de tipo silvestre o el mutante N168A
catalíticamente inactivo de SIRT2-FLAG, se observó
que en todos los casos GFP-MIZ-1 se
localizaba predominantemente en el núcleo (figura 5B). Sin embargo,
después del tratamiento de estas células con TSA, se observó una
relocalización estadísticamente significativa de
GFP-MIZ-1 en el citoplasma cuando
GFP-MIZ-1 se cotransfectaba con el
vector vacío FLAG o el SIRT2-FLAG N168A
catalíticamente inactivo del 36,9% y del 35,3% respectivamente
(figura 5B). Sin embargo, cuando el
GFP-MIZ-1 se cotransfectaba con
SIRT2-FLAG de tipo silvestre se observó una
reducción significativa en el porcentaje de células con
GFP-MIZ-1 localizado en el
citoplasma hasta el 11,2% (figura 5B). En su informe, Ziegelbauer
et al., demuestran la colocalización de
MIZ-1 con la red de microtúbulos en células HepG2,
donde MIZ-1 está localizado aparentemente de forma
predominante en el citoplasma.
Como se ha demostrado anteriormente en células
HeLa, GFP-MIZ-1 está localizado
principalmente en el núcleo. Para descartar la posibilidad de que
la versión marcada con GFP de MIZ-1 estuviera
alterando la capacidad de MIZ-1 de unirse a
tubulina, se ensayaron la localización subcitoplásmica en células
cotransfectadas con GFP-MIZ-1 y
vectores FLAG vacíos y tratadas con TSA. Se visualizó una
colocalización de GFP-MIZ-1 con
tubulina acetilada por microscopía confocal. Esta colocalización
indica que GFP-MIZ-1 mantiene la
capacidad de unirse a la tubulina e indica que después del
tratamiento de células transfectadas con TSA,
GFP-MIZ-1 se translocará desde el
núcleo al citoplasma donde se unirá a la red de microtúbulos
hiperacetilados. Estos datos sugieren que la distribución
subcelular de MIZ-1 se regula no sólo por el estado
de polimerización de la tubulina, sino también por el estado de
acetilación de la \alpha-tubulina dentro de la red
de microtúbulos.
Las figuras 5A y 5B representan la regulación de
la distribución subcelular de MIZ-1 por la tubulina
acetilada.
Figura 5A. Se trataron células HeLa, 293T y
HepG2 con 10 \mug/ml de colchicina o 1 \mug/ml de nocodazol
durante 6 horas. Las células se recogieron y los lisados se
separaron por SDS-PAGE y transferencia de Western
usando antisuero específico para tubulina acetilada y tubulina.
Figura 5B. Las células transfectadas se contaron
como GFP-MIZ-1 localizado
completamente en el núcleo o con una retención citoplásmica
parcial. Los recuentos de células se obtuvieron por inspección de al
menos 150 células transfectadas de seis campos microscópicos. Los
resultados son medias de tres transfecciones distintas
representando las barras de error la desviación típica entre cada
transfección. La serie de datos es representativa de tres
experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Basándose en la dependencia de las proteínas
SIRT del NAD, se ensayaron varias moléculas con homología de
estructura con el NAD como posibles inhibidores de su actividad
enzimática. La molécula caracterizada previamente de
1-\beta-D-Ribofuranosil-1-2-4-triazol-3-carboxamida
(Ribavirina) se ha usado como un agente antiviral aprobado contra
la hepatitis C y es un análogo de la parte de nicotinamida del
NAD.
La actividad inhibidora de la ribavirina contra
las proteínas SIRT2 y SIRT3 se ensayó usando proteínas SIRT2
recombinantes y un ensayo in vitro. Se incubó ribavirina con
proteína recombinante sólo en tampón durante 10 minutos; y después
se añadieron NAD y sustrato para iniciar la reacción. Las reacciones
se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las reacciones
se interrumpieron añadiendo 25 \mul de tampón de terminación (HCl
0,1 M, ácido acético 0,16 M) y agitando con vórtice brevemente. La
extracción con acetato de etilo aisló todos los grupos acetilo
liberados. Se añadió acetato de etilo (0,5 ml), la mezcla de agitó
con vórtice durante 15 segundos y se centrifugó a 14.000 rpm
durante 5 minutos. La fase superior (0,4 ml) se añadió a 5 ml de
líquido de centelleo (Econofluor-2; Packard) y se
contó.
Los resultados se muestran en la Figura 7. La
ribavirina inhibió la actividad HDAC in vitro de la SIRT2
con una inhibición de aproximadamente el 50% a 25 \muM, pero no
tuvo ningún efecto sobre la actividad HDAC in vitro de la
SIRT3. Este experimento demuestra la identificación de un inhibidor
nuevo y específico para SIRT2.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-05-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1963
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido de histona H3
monoacetilado
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACETILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = lisina acetilada
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> C. elegans
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> H. sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético de
a-tubulina
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACETILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)...(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = lisina acetilada
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier Aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 803
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> H. sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (15)
1. Un método in vitro para identificar un
agente que modula la actividad enzimática de una tubulina
desacetilasa dependiente de NAD humana, comprendiendo el
método:
- poner en contacto un polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba en una mezcla de ensayo que comprende NAD y un péptido de tubulina acetilado; y
- determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre la actividad enzimática de la tubulina desacetilasa dependiente de NAD.
2. El método de la reivindicación 1, donde el
polipéptido de tubulina desacetilasa dependiente de NAD comprende
una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID
Nº:02.
3. El método de la reivindicación 1, donde el
péptido de tubulina acetilado comprende la secuencia
NH_{2}-MPSD(AcK)TIGG.CO_{2}(SEC
ID Nº:08).
4. El método de la reivindicación 1, donde el
péptido de tubulina acetilado contiene un grupo acetilo marcado con
^{14}C en una lisina correspondiente a la Lys-40
de la tubulina nativa, y dicha determinación se realiza midiendo la
liberación del grupo acetilo radiactivo.
5. El método de la reivindicación 1, donde dicha
determinación se realiza detectando la unión de un anticuerpo
específico para la tubulina acetilada.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicha
determinación se realiza detectando la unión entre tubulina y la
proteína Miz-1.
7. Un método in vitro para identificar un
agente que modula el nivel de tubulina desacetilasa dependiente de
NAD en una célula, comprendiendo el método:
- poner en contacto una célula que produce tubulina desacetilasa dependiente de NAD con un agente de prueba; y
- determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre el nivel de tubulina desacetilasa dependiente de NAD.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicha
determinación comprende determinar el nivel de ARNm de tubulina
desacetilasa dependiente de NAD en la célula.
9. El método de la reivindicación 7, donde dicha
determinación comprende determinar el nivel de polipéptido de
tubulina desacetilasa dependiente de NAD en la célula.
10. Un método para modular la proliferación
celular, comprendiendo el método poner en contacto una célula con
un agente que inhibe la tubulina desacetilasa dependiente de
NAD.
11. El método de la reivindicación 12, donde el
agente es la ribavirina.
12. Uso de un agente que inhibe la tubulina
desacetilasa dependiente de NAD para la fabricación de un
medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un individuo,
donde el agente es ribavirina, y donde la ribavirina es para la
administración en una dosis de 30 mg a 1200 mg al día por
administración oral.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12,
donde el tratamiento comprende además administrar un segundo agente
antineoplásico seleccionado de un agente alquilante, un
antimetabolito, un alcaloide de la vinca, un antibiótico
antineoplásico, un complejo de platino, un inhibidor de tirosina
quinasa, un taxano y un anticuerpo monoclonal que se une a un
antígeno asociado a tumor.
14. Ribavirina para usar en un método de
tratamiento de cáncer en un individuo, donde el uso comprende la
administración oral de ribavirina en una dosis de 30 mg a 1200 mg al
día.
15. Ribavirina para el tratamiento del cáncer de
acuerdo con la reivindicación 14, donde el tratamiento comprende
además administrar un segundo agente antineoplásico seleccionado de
un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide de la vinca,
un antibiótico antineoplásico, un complejo de platino, un inhibidor
de tirosina quinasa, un taxano y un anticuerpo monoclonal que se
une a un antígeno asociado a tumor.
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