ES2315239T3 - Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intron. - Google Patents

Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intron. Download PDF

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Abstract

Molécula de ácido nucleico, que comprende (i) una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o una variante según la reivindicación 1 (c) (ii) y al menos una secuencia de intrón, en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona de: (a) secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen: SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial) SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2), SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2), SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2), SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2), SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2), SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2), SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2), SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2), SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2), SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial), SEC ID Nº: 51 (dominio b'' de HtH2), SEC ID Nº: 52 (dominio d'' de HtH2), SEC ID Nº: 53 (dominio e'' de HtH2), SEC ID Nº: 57 (dominio b'' de KLH2), SEC ID Nº: 58 (dominio c'' de KLH2), SEC ID Nº: 59 (dominio d'' de KLH2), SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2), SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2), SEC ID Nº: 62 (dominio g'' de KLH2), SEC ID Nº: 88 (dominio a" de HtH2 parcial), SEC ID Nº: 89 (dominio b" de HtH2), SEC ID Nº: 90 (dominio c" de HtH2), SEC ID Nº: 91 (dominio d" de HtH2), SEC ID Nº: 92 (dominio e" de HtH2), SEC ID Nº: 93 (dominio f'' de HtH2), SEC ID Nº: 94 (dominio g" de HtH2), SEC ID Nº: 95 (dominio h" de HtH2), SEC ID Nº: 102 (dominio b" de KLH2), SEC ID Nº: 103 (dominio c" de KLH2), SEC ID Nº: 104 (dominio d" de KLH2), SEC ID Nº: 105 (dominio e" de KLH2), SEC ID Nº: 106 (dominio f'' de KLH2), SEC ID Nº: 107 (dominio g" de KLH2), SEC ID Nº: 108 (dominio h" de KLH2 parcial), SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa); (b)...

Description

Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intrón.
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina o un dominio de hemocianina, con al menos una secuencia de intrón, construcciones que comprenden tales moléculas de ácido nucleico, las secuencias de ácido nucleico o las células huésped que comprenden construcciones, a procedimientos para la preparación de polipéptidos de hemocianina y polipéptidos de hemocianina recombinante. Las formas de realización de la invención se definen en las reivindicaciones.
La hemocianina es una proteína de cobre azul, que está presente libremente disuelta en la sangre de múltiples moluscos y artrópodos y transporta el oxígeno. Entre los moluscos, los cefalópodos, quitones, la mayor parte de los gasterópodos así como algunos bivalvos, contienen hemocianina. En los artrópodos la hemocianina es típica en arácnidos, xifosuros, crustáceos malacostracos y Scutigera. Múltiples especies de insectos presentan proteínas que se derivan de hemocianina. Las hemocianinas están presentes fuera de la célula y flotan en la hemolinfa.
Mientras que la hemocianina de artrópodos en estudio por microscopio electrónico tiene un diámetro máximo de 25 nm y una subunidad presenta un peso molecular de 75.000 Da, las cianinas de moluscos son mucho mayores. Así por ejemplo la hemocianina de Megathura tiene un diámetro de 35 nm y está constituida por 2 subunidades. Cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 400.000 Da y esta dividida en ocho dominios que se unen a oxígeno, que tienen respectivamente un peso molecular de aproximadamente 50.000 Da. Los dominios se diferencian inmunológicamente. Estos dominios se pueden desprender de la subunidad con proteolisis
limitada.
La hemocianina de gasterópodos visible en el microscopio electrónico tiene un peso molecular de aproximadamente 8 millones de Da y es un di-decámero. Por el contrario la hemocianina de cefalópodos está dispuesta como decámero aislado que se diferencia también en la estructura cuaternaria claramente de la hemocianina de gasterópodos.
Es de especial interés inmunológico la hemocianina de fisurela californiana Megathura crenulata, una "Kayhole Limpet". La hemocianina se designa por tanto también como hemocianina de Keyhole Limpet (KLH). Las hemocianinas son antígenos muy fuertes. La inmunización de un vertebrado conduce a una activación inespecífica poco entendida hasta ahora del sistema inmunológico. Con la activación general del sistema inmunológico es entonces posible también conseguir una reacción inmune frente a otras estructuras extrañas hasta ahora toleradas. La KLH se usa sobre todo como vehículo de hapteno para conseguir así la formación de anticuerpos frente al
hapteno.
Además de Megathura crenulata pertenece también la oreja de mar Haliotis tuberculata al grupo relativamente viejo, en lo que respecta a la evolución, de los arqueogasterópodos. Se sabe que también Haliotis produce hemocianina.
La KLH es una mezcla de dos hemocianinas distintas que se designan KLH1 y KLH2. La diferencia de KLH1 es un polipéptido de 390 kDa, que se compone de ocho dominios globulares que se designan en correspondencia a una secuencia en la subunidad 1a a 1h. La KLH2 por el contrario presenta un peso molecular de 350 kDa y contiene igualmente según los datos más recientes 8 dominios que se designan 2a a 2h. In vivo cada tipo de subunidad forma homo-oligómeros mientras que no se observaron hetero-oligómeros.
Mediante proteolisis limitada e inmunoelectroforesis cruzada de la subunidad de KLH1 y KLH2 se obtuvieron dominios con terminal amino, interno y carboxi, cuya secuencia de terminal amino fue determinada (Söhngen y col., Eur. J. Biochem. 248 (1997), 602-614; Gebauer y col., Zoology 98 (1994), 51-68). Las secuencias obtenidas no permiten sin embargo el diseño de cebadores y/o sondas específicos de la secuencia, que aseguren el éxito de una hibridación con ADN genómico. Por tanto aunque ambos tipos de KLH se conocen desde 1991 y/o 1994 no se pudo aclara hasta ahora estructura primaria alguna.
Sobre el plano del ADN se conoce hasta ahora en lo que respecta a moluscos sólo la secuencia de ADNc de la subunidad de hemocianina de los cefalópodos Octopus dofleini (Millar y col., J. Mol. Biol. 278 (1988), 827-842). Octopus dofleini está filogenéticamente muy lejos de los arqueogasterópodos. Hasta hoy en día no se conoce en general una secuencia génica de hemocianina de moluscos.
Como se describe por parte de Miller y col. véase anteriormente, es tan difícil aislar un dominio funcional individual (unidad funcional = dominio; denominado "dominio funcional") como también obtener tejido que sea adecuado para la purificación de ARNm para la secuenciación de ADNc.
En el análisis de la hemocianina de Megathura crenulata una dificultad adicional consiste en que animales de ensayo deben haber alcanzado una edad de 4 a 8 años para poder extraer su hemolinfa por primera vez. Tras la extracción de la hemolinfa no se produce hemocianina en estos animales. Hasta ahora no se sabe como se podría estimular la síntesis de hemocianina. Adicionalmente la cría de Megathura es extraordinariamente costosa ya que se requieren para tal fin recipientes de corriente especiales.
Se plantea por tanto un objetivo de la presente invención en cuanto a proporcionar agentes y mecanismos para poder producir hemocianina y/o dominios de la misma en cantidad suficiente y a buen coste. Esto comprende el objetivo adicional de facilitar un procedimiento con el que se pueda preparar esta hemocianina.
Este objetivo se consigue de acuerdo con la invención mediante
1. Una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de la misma, en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona de:
(a)
secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
\quad
SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial)
\quad
SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 51 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 52 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 53 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 57 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 58 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 59 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 62 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 88 (dominio a'' de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 89 (dominio b'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 90 (dominio c'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 91 (dominio d'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 92 (dominio e'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 93 (dominio f' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 94 (dominio g'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 95 (dominio h'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 102 (dominio b'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 103 (dominio c'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 104 (dominio d'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 105 (dominio e'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 106 (dominio f' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 107 (dominio g'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 108 (dominio h'' de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa),
\vskip1.000000\baselineskip
(b)
secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
\quad
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
\quad
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
\vskip1.000000\baselineskip
(c)
Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos, que son al menos 60% idénticas a una secuencia de la forma de realización 1b, calculándose la identidad de secuencia en 90 aminoácidos.
2. Molécula de ácido nucleico según la forma de realización 1, caracterizada porque la secuencia de intrón se selecciona de:
(i)
secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de las secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
\quad
SEC ID Nº: 147 (intrón 2B/2C de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 148 (intrón 2C/2D de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 149 (intrón 2D/2E de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 150 (intrón 2E/2F de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 151 (intrón 2B/2C de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 152 (intrón 2F-2/2G de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 153 (intrón 2G-1/2G-2 de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 154 (intrón 2G-2/2G-3 de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 155 (intrón 2G/2H de KHL2);
\vskip1.000000\baselineskip
(ii)
secuencias de ácido nucleico, que se hibridan con la contrahebra de una secuencia de ácido nucleico según (i);
(iii)
secuencias de ácido nucleico que son idénticas al menos en el 60% con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i);
(iv)
variantes de las secuencias dadas en (i) a (iii), en donde las variantes presentan frente a las secuencias dadas en (i) a (iii), adiciones, deleciones, inserciones o inversiones; y
(v)
combinaciones de varias de las secuencias de ADN dadas en (i) a (iv).
3. Molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 y 2, caracterizada porque es una molécula de ácido desoxirribonucleico.
4. Construcción que comprende una molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3.
5. Construcción según la forma de realización 4, que comprende además uno de los promotores adecuados para el control de expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de la misma se encuentra bajo el control del promotor.
6. Construcción según la forma de realización 4 ó 5, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno, que está unida directamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de la misma.
7. Construcción según la forma de realización 6, en donde el antígeno se selecciona de: antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes patógenos bacterianos o parasitarios.
8. Construcción según una de las formas de realización 4 a 7, en donde la construcción contiene al menos una parte de un vector, en donde el vector se selecciona de: bacteriófagos, andenovirus, virus de vacunas, baculovirus, virus SV-40 y retrovirus.
9. Construcción según una de las formas de realización 4 a 8, en donde la construcción comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica His-Tag y la expresión de la construcción conduce a la formación de una proteína de fusión con un His-Tag.
10. Célula huésped, que contienen una construcción según una de las formas de realización 4 a 9, en donde la célula huésped es una célula procariótica o eucariótica adecuada para la expresión de la construcción.
11. Célula huésped según la forma de realización 10, caracterizada porque la célula huésped procariótica se selecciona de E. coli y Bacillus subtilis.
12. Célula huésped según la forma de realización 10, caracterizada porque la célula huésped eucariótica se selecciona de células de levadura, células de plantas, células de insectos y células de mamíferos, preferiblemente de células CHO, células COS y células HeLa.
A continuación se aclaran más detalladamente algunos términos para dejar claro como se deben entender en lo que respecta a la presente solicitud.
El término "hemocianina", tal cual, como se usa en lo sucesivo en la descripción, comprende hemocianina completa, dominios de hemocianina y/o fragmentos, mutantes de hemocianina y proteínas de fusión. En lo referente a las proteínas de fusión están comprendidas particularmente aquellas en las que la fusión comprende hemocianina y antígenos.
Con "dominios" se entienden secuencias parciales funcionales de subunidades de hemocianina, que se pueden separar unas de otras, por ejemplo, mediante proteolisis limitada. Adicionalmente estas pueden presentar distintas propiedades inmunológicas.
Con "propiedades inmunológicas de al menos un dominio de hemocianina" se indica la propiedad de un polipéptido para inducir, al igual que al menos un dominio de hemocianina, una respuesta inmunológica del receptor que se inmuniza con el polipéptido. Con "respuesta inmunológica" se entienden aquí respuestas de células T y/o B frente a epítopos de hemocianina como, por ejemplo, una producción de anticuerpos. La reacción inmunológica se puede observar, por ejemplo, con inmunización de un mamífero como, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo con el correspondiente polipéptido y comparación de la respuesta inmune para el polipéptido usado para la inmunización con la respuesta inmune para la hemocianina natural.
El término "secuencia de intrón" representa tanto una secuencia intermedia en un gen eucariótico como también la secuencia intermedia correspondiente en el transcripto de ARN. La(s) secuencia(s) de intrón y la(s) secuencia(s) de codificación se transcriben conjuntamente; el transcripto de intrón o los transcriptos de intrón se separan luego para obtener el ARN funcional.
El término "antígeno" comprende de acuerdo con la invención tanto haptenos como también antígenos débiles y fuertes. Haptenos se caracterizan porque se trata de sustancias de bajo peso molecular (inferior a 4000 Da), pero que no pueden desencadenar una reacción inmunológica sin acoplarse a una molécula vehículo. Antígenos débiles son sustancias que pueden desencadenar ya por sí mismas una reacción inmunológica, cuyo potencial puede desencadenar una reacción inmunológica pudiendo aumentarse aún más con acoplamiento con una molécula vehículo sobre planos de la proteína y/o del ADN.
"His-Tag" significa una secuencia de al menos 6 aminoácidos de histidina que conduce mediante clonación y fusión correspondientes con una secuencia que se puede expresar a una proteína de fusión con al menos 6 restos His en el término NH_{2}, que se puede purificar fácilmente mediante complejación con una columna de Ni^{2+}.
"Clonación" debe comprender todos los procedimientos de clonación conocidos en el estado de la técnica que podrían ser de utilidad en esta invención pero que no se describen todos detalladamente ya que se sobreentiende pertenecen a las habilidades del especialista en la técnica.
"Variantes" de un ácido nucleico comprenden adiciones, deleciones, inserciones o inversiones y codificación de un polipéptido que presenta las propiedades inmunológicas de al menos un dominio de hemocianina. Las variantes pueden ser artificiales o naturales. Un ejemplo de variantes naturales lo representan las variantes alélicas.
Con "expresión recombinante en una célula huésped adecuada" se deben entender procedimientos de expresión conocidos en el estado de la técnica en sistemas de expresión conocidos, que podrían ser de utilidad en esta invención pero que no se describen todos detalladamente ya que se sobreentiende pertenecen a las habilidades del especialista en la técnica.
La secuencia de ácido nucleico contenida en la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser ADN genómico o ADN sintético, en donde con secuencias de ADN sintético también se entienden aquellas que contienen enlaces internucleosídicos modificados. Además las secuencias de ácido nucleico pueden tratarse de secuencias de ARN que, por ejemplo, se pueden requerir para la expresión mediante sistemas de vector recombinantes. Las secuencias de ácido nucleico se pueden obtener, por ejemplo, con uso de una sonda marcada detectable, que corresponde a una de las secuencias dadas o a un fragmento o su contrahebra, para el rastreo de bibliotecas de ADNc/ADN genómico de moluscos o artrópodos. El ARNm en que se basa la biblioteca de ADNc se obtiene preferiblemente de tejidos de moluscos que expresan hemocianina de forma especialmente fuerte como, por ejemplo, tejido de la envoltura de gasterópodos y tejidos de glándula branquial de cefalópodos.
La identificación de clones de ADN genómicos positivos se realiza según procedimientos convencionales. Véase, Maniatis y col., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Condiciones de hibridación estrictas son, por ejemplo, 68ºC durante la noche en 0,5 x SSC; 1% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim); 0,1% de laurilsarcosinato de sodio y a continuación lavado con 2 x SSC, 0,1% de SDS.
En una forma de realización preferida adicional se proporcionan secuencias de ácido nucleico que comprenden al menos una secuencia de intrón, que es al menos un 60% homóloga con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i). Se prefiere (o se prefieren) la(s) secuencia(s) de intrón al menos 80% homólogas con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a). Se prefiere (o se prefieren) especialmente la(s) secuencia(s) de intrón al menos 90% homólogas con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a). De forma particular es (o son) la(s) secuencia(s)
de intrón al menos un 95% homólogas a una de las secuencias de ácido nucleico dadas en 2(a).
De acuerdo con la invención la expresión "homología" significa homología en el plano de ADN, que se puede determinar según procedimientos conocidos, por ejemplo, de comparación de secuencias asistida informáticamente (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410).
La expresión "homología" conocida por el especialista en la técnica designa el grado de analogía entre dos o más moléculas de ácido nucleico que se determina mediante la concordancia entre las secuencias. El porcentaje de "homología" resulta del porcentaje de regiones idénticas en dos o más secuencias considerando huecos u otras particularidades de la secuencia.
La homología de moléculas de ácido nucleico análogas se puede determinar con ayuda de procedimientos conocidos. Por lo general se usan programas informáticos especiales con algoritmos que incluyen los requerimientos especiales de cálculo.
Los procedimientos preferidos para la determinación de la homología dan en primer lugar la mayor concordancia entre las secuencias investigadas. Programas informáticos para la determinación de la homología entre dos secuencias comprenden, pero sin limitarse a estos, el programa GCG, incluyendo GAP ((Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El programa BLAST X de Nacional Centre for Biotechnology Information (NCBI) y al que se refieren otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). También se puede usar el algoritmo de Smith Waterman conocido para la determinación de homología.
Parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleico comprenden los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970).
Matriz de comparación: concordancia (matches) = + 10 no concordancia (mismatch) = 0
Valor de huecos (Gap Penalty): 50
Valor de longitud de huecos (Gap Lenght Penalty): 3
El programa GAP es también adecuado para el uso con los parámetros precedentes. Los parámetros precedentes son parámetros de error (parámetros de defecto) para comparación de secuencia de ácido nucleico.
Se pueden usar por ejemplo otros algoritmos, valores de huecos-aberturas (gap opening penalties), valores de extensión de huecos (gap extension penalties), matrices de comparación incluyendo el Wisconsin-Paket en el Programm-Handbuch, versión 9, Septiembre 1997, conocidos. La elección depende de la comparación que se va a llevar a cabo y además de si se lleva a cabo la comparación entre pares de secuencias, en donde se prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una base de datos de secuencia extensa, en donde se prefieren FASTA o BLAST.
Una concordancia determinada con el algoritmo anteriormente citado del 60% se designa en el marco de esta solicitud como 60% de homología. Esto es correspondientemente válido para grados de homología superiores.
En una forma de realización preferida la secuencia de ADN de acuerdo con la invención es una combinación de varias de las secuencias de ADN dadas en (a) a (f) y al menos una secuencia de intrón, que se pueden obtener con la fusión conocida por el especialista en la técnica y dado el caso clonación. Estas combinaciones son de especial interés ya que los polipéptidos codificados de estas son especialmente inmunógenos. De forma particular son combinaciones preferidas las que presentan varios o todos los dominios en las sucesión (a a h) de origen natural en la subunidad. Son especialmente preferidas a este respecto formas de realización en las que las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios están acopladas entre ellas directamente en la retícula, después de que se hubiesen separado la secuencia de intrón o las secuencias de intrón.
Adicionalmente se proporcionan construcciones que comprenden las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En una forma de realización preferida la construcción de acuerdo con la invención comprende un promotor adecuado para la expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico se encuentra bajo el control del promotor. La elección del promotor depende del sistema de expresión usado para la expresión. En general se prefieren promotores constitutivos sin embargo son posibles también promotores inducibles como, por ejemplo, el promotor de metalotioneína.
En una forma de realización preferida adicional la construcción comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno, que está unida directamente con el ácido nucleico de hemocianina de acuerdo con la invención. La secuencia que codifica el antígeno puede estar dispuesta tanto en 5' como también en 3' respecto a la secuencia de hemocianina o también en ambos extremos. Esta se adiciona en el mismo marco de lectura bien directamente en la secuencia de hemocianina o bien se une con ella mediante un ligador de ácido nucleico sin perjuicio del marco de lectura. Mediante la fusión de la secuencia que codifica el antígeno con la secuencia de hemocianina se pretende la formación de una proteína de fusión, uniéndose la secuencia que codifica el antígeno de forma covalente con la secuencia de hemocianina. El antígeno de acuerdo con la invención es a este respecto un antígeno medicinalmente relevante que se selecciona, por ejemplo, de: antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes patógenos bacterianos o parasitarios. Los antígenos tumorales pueden ser a este respecto, por ejemplo, Rb y p53. Preferiblemente los antígenos de virus derivan de virus de importancia inmunológica como, por ejemplo, virus de la gripe, virus de hepatitis y VIH. Antígenos patógenos son, entre otros, aquellos que derivan de patógenos de mamíferos, particularmente organismos patógenos humanos como, por ejemplo, Plasmodium. Antígenos bacterianos pueden derivarse, por ejemplo, de Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, Vibrio cholerae, Chlamydia, estreptococos o
estafilococos.
En una forma de realización preferida adicional la construcción comprende además al menos una parte de un vector, de forma particular regiones regulatorias, en donde el vector se selecciona de: bacteriófagos como derivados \lambda, adenovirus, virus de vacunas, baculovirus, virus SV40 y retrovirus, preferiblemente MoMuLV (virus de la Leucemia Murina de Moloney).
Además se prefiere una construcción que comprenda adicionalmente una secuencia de ADN que codifique His-Tag, que con la expresión de la construcción conduzca a la formación de una proteína de fusión con un His-Tag en el término NH_{2} de la hemocianina, que facilita la purificación de la proteína en una columna de níquel mediante formación de quelato.
Adicionalmente la invención proporciona células huésped que contienen la construcción y son adecuadas para la expresión de la construcción. En el estado de la técnica se conocen múltiples sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos como E. coli o B. subtilis, de células eucarióticas como células de levadura, células de plantas, células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo, células CHO, células COS o células HeLa, así como derivados de las mismas. En el estado de la técnica se conocen, por ejemplo, determinadas líneas de producción de CHO, cuyos modelos de glicosilación están modificados en comparación con las células CHO. La hemocianina obtenida con el uso de células huésped con déficit de glicosilación o de glicosilación reducida se encuentran disponibles posiblemente en epítopos adicionales que de otro modo con glicosilación completa no se podrían alcanzar el sistema inmunológico del receptor, de modo que la hemocianina con glicosilación reducida presenta en determinadas circunstancias una inmunogenicidad elevada. De las células de plantas transformadas con la construcción de acuerdo con la invención se pueden preparar plantas transgénicas o cultivos de células de plantas que producen el polipéptido hemocianina, por ejemplo, plantas o cultivos de células de plantas de tabaco, patata, tomate, remolacha azucarera, soja, café, guisantes, habas, colza, algodón, arroz o maíz.
Es además objeto de la presente invención un procedimiento para la preparación de un polipéptido de hemocianina. A tal fin se expresa la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o la construcción en una célula huésped adecuada y se aísla la proteína de la célula huésped o del medio con procedimientos habituales. Son formas de realización de la invención.
13. Procedimiento para la preparación de un polipéptido de hemocianina, en donde la molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3 y/o la construcción según una de las formas de realización 4 a 9 se expresa en una célula huésped adecuada y la proteína se aísla dado el caso.
14. Procedimiento según la forma de realización 13, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina preparado se modifica de forma natural o química.
15. Procedimiento según la forma de realización 14, caracterizado porque la modificación es una reticulación transversal o un enlace covalente en un antígeno.
16. Procedimiento según una de las formas de realización 13 a 15, caracterizado porque la expresión se lleva a cabo en una célula huésped según una de las formas de realización 10 a 12.
Para el especialista en la técnica son conocidos múltiples procedimientos para la expresión de secuencias de ADN, véanse Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, tomo 62, Humana Press Totowa New Jersey (1995). La expresión puede ser tanto constitutiva como también inducible, siendo conocidos por el especialista en la técnica inductores como por ejemplo IPTG y Zn^{2+}. La hemocianina preparada se pudo fusionar en caso de una His-Tag en el término NH_{2} de la hemocianina, purificándose mediante formación de quelato en una columna de níquel. Se encuentran procedimientos para la purificación de hemocianina, de forma particular KLH, en Harris y col., Micron 26 (1995), 201-212. Preferiblemente se purifica la hemocianina mediante cromatografía de intercambio de iones y/o cromatografía de filtración en gel. La realización de estas técnicas es conocida por el especialista en la técnica.
En una forma de realización preferida adicional se modifica la hemocianina preparada de acuerdo con la invención. Las modificaciones comprenden a este respecto la di-, oligo- y polimerización del producto de partida monomérico, por ejemplo, mediante reticulación transversal, por ejemplo, con diciclohexilcarbodiimida o pegilación o asociación (auto-ensamblaje). Los di-, oligo- y polímeros así preparados se pueden separar unos de otros mediante filtración en gel. De forma particular se pretende la formación de decámeros, didecámeros o multi-decámeros. Otras modificaciones comprenden modificaciones de cadenas laterales, por ejemplo, de restos de \varepsilon-amino-lisina de hemocianina, o modificaciones de terminales amino o carboxi. Es particularmente preferida la modificación de la hemocianina mediante enlace covalente a un antígeno, en donde el antígeno puede hacerse reaccionar estequiométricamente o no estequiométricamente con la hemocianina. El antígeno se selecciona preferiblemente de antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes patógenos como se indicó anteriormente. Otras modificaciones comprenden resultados post-traduccionales, por ejemplo, la glicosilación o la desglicosilación parcial o completa de la
proteína.
En una forma de realización preferida la hemocianina obtenida con expresión recombinante en organismos procarióticos u organismos eucarióticos con déficit de glicosilación no está glicosilada. Con igual consideración se hace referencia a hemocianina de acuerdo con la invención que está glicosilada mediante expresión recombinante en organismos eucarióticos con capacidad de glicosilación como células de levadura, células de plantas, células de insectos o células de mamíferos como células CHO o células HeLa.
En una forma de realización adicional se ponen a disposición polipéptidos de hemocianina que comprenden una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos es codificada por una o varias moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención:
17. Polipéptido de hemocianina, que comprende una secuencia de aminoácido que es codificada por una o varias moléculas de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3.
18. Polipéptido de hemocianina según la forma de realización 17, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
\quad
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completo),
\quad
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
\quad
o
(b)
un polipéptido de hemocianina, cuya secuencia es en una región parcial de al menos 90 aminoácidos, al menos 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).
19. Polipéptido de hemocianina recombinante, que se puede obtener mediante el procedimiento según una de las formas de realización 13 a 16 o modificaciones de las mismas, en donde las modificaciones son
a)
di-, oligo- y polímeros del polipéptido de hemocianina que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con una de las formas de realización 13 a 16,
b)
modificaciones de cadenas laterales del mismo,
c)
proteínas de fusión, obtenidas mediante unión a un antígeno o
d)
polipéptidos, obtenidos mediante episodio post-traduccional.
20. Polipéptido de hemocianina recombinante según la forma de realización 18, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina comprende bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 48 o bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48 y KLH2 es de Megathura crenulata, pudiendo estar reemplazada respectivamente la secuencia SEC ID Nº 44 por SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46 por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
21. Polipéptido de hemocianina recombinante según la forma de realización 17 a 20, caracterizado porque está unido de forma covalente a virus, constituyentes de virus, bacterias, constituyentes de bacterias, ADN, constituyentes de ADN, moléculas inorgánicas u orgánicas como, por ejemplo, péptidos de hidratos de carbono y/o glicoproteínas.
22. Polipéptido de hemocianina recombinante según una de las formas de realización 17 a 21, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina no está glicosilado.
23. Polipéptido de hemocianina recombinante según una de las formas de realización 17 a 21, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina está glicosilado.
24. Composición farmacéutica, que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3 y/o una construcción según una de las formas de realización 4 a 9 y aditivos fisiológicamente aceptables.
25. Composición farmacéutica según la forma de realización 24, caracterizada porque se usa para el tratamiento de tumores mediante terapia génica.
26. Composición farmacéutica, que contiene un polipéptido de hemocianina según una de las formas de realización 17 a 23 y aditivos fisiológicamente aceptables.
27. Composición farmacéutica según la forma de realización 26, caracterizada porque se usa como agente antiparasitario, agente antivirus o como agente anti-tumoral.
28. Composición farmacéutica según la forma de realización 26, caracterizada porque se usa para el tratamiento de una de las siguientes enfermedades: esquitosomiasis, hipertensión, carcinomas superficiales de la vejiga urinaria, carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios y carcinoma colorrectal.
29. Composición farmacéutica según la forma de realización 24, caracterizada porque se usa como vacuna.
30. Composición farmacéutica según la forma de realización 25, caracterizada porque se usa para la prevención de abuso de cocaína.
31. Uso de polipéptido de hemocianina según una de las formas de realización 17 a 23 como vehículo para medicamentos.
32. Liposoma, que comprende una molécula de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3, una construcción según una de las formas de realización 4 a 9 y/o un polipéptido de hemocianina según una de las formas de realización 17 a 23.
33. Liposoma según la forma de realización 32, caracterizado porque el liposoma comprende además moléculas de reconocimiento de células.
34. Anticuerpos, que se pueden obtener mediante inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de hemocianina recombinante que se selecciona de al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completo),
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
\vskip1.000000\baselineskip
35. Procedimiento de rastreo para la identificación de ADN específico de tumor en una célula que comprende:
a)
poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico según una de las formas de realización 1 a 3 y/o del anticuerpo según la forma de realización 34 y
b)
la detección de unión específica.
36. Procedimiento de rastreo según la forma de realización 35, caracterizado porque el tumor que se va a detectar es carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o carcinoma colorrectal.
Igualmente están comprendidos en la invención polipéptidos de hemocianina cuya secuencia presenta en una región parcial de al menos 90 aminoácidos al menos un 60% o 70%, preferiblemente al menos un 80%, con especial preferencia al menos un 90% o 95% de homología con una de las secuencias de aminoácidos según SEC ID Nº: 33 a 48 y SEC ID Nº: 63 a 79.
A este respecto la expresión "al menos un 70%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos un 90% de homología" se refiere a la concordancia en el plano de la secuencia de aminoácidos, que se puede determinar según procedimientos conocidos, por ejemplo, de comparación de secuencias asistida informáticamente (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul y col., J. Mol. Biol. 215 (1990). 403-410).
La expresión "homología" conocida por el especialista en la técnica designa en esta invención el grado de analogía entre dos o más moléculas de polipéptido, que se determina con la concordancia entre las secuencias, en donde con concordancia se debe entender tanto concordancia de igualdad como también intercambio de aminoácidos conservativo. El porcentaje de "homología" resulta del porcentaje de regiones concordantes en dos o más secuencias considerando huecos u otras particularidades de la secuencia.
El término "intercambio de aminoácidos conservativo" se refiere a un intercambio de un resto aminoácido con otro resto de aminoácido, sin que el intercambio lleve a una modificación de la polaridad o carga. Un ejemplo de un intercambio de aminoácidos conservativo es el intercambio de un resto aminoácido no polar con otro resto aminoácido no polar.
La homología entre moléculas de polipéptido análogas se puede determinar con ayuda de procedimientos conocidos. Por lo general se usan programas informáticos especiales con algoritmos que incluyen los requerimientos especiales de cálculo. Procedimientos preferidos para la determinación de la homología dan en primer lugar la mayor concordancia entre las secuencias en estudio. Programas informáticos para la determinación de homología entre dos secuencias comprenden, sin limitarse a estos, el programa GCG, incluyendo GAP ((Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). El programa BLAST X de Nacional Centre for Biotechnology Information (NCBI) y al que se refieren otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S., y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S. y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). También se puede usar el algoritmo de Smith Waterman conocido para la determinación de homología.
Parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleico comprenden los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89:10915 a 10919 (1992)
Valor de huecos (Gap Penalty): 12
Valor de longitud de huecos (Gap Lenght Penalty): 4
Valor umbral de la similitud: 0
El programa GAP es también adecuado para el uso con los parámetros precedentes. Los parámetros precedentes son los parámetros estándar (parámetros de defecto) para comparación de secuencia de ácido nucleico, en donde no se reducen los huecos en los extremos del valor de homología. En secuencias muy cortas en comparación con la secuencia de referencia puede ser necesario adicionalmente aumentar el valor esperado hasta 100.000 (expected value) y dado el caso reducir la longitud de palabra (word size) hasta 2.
Se pueden usar por ejemplo otros algoritmos, valores de huecos-aberturas (gap opening penalties), valores de extensión de huecos (gap extension penalties), matrices de comparación incluyendo el Wisconsin-Paket en el Programm-Handbuch, versión 9, Septiembre 1997, conocidos. La elección depende de la comparación que se va a llevar a cabo y además de si se lleva a cabo la comparación entre pares de secuencias, en donde se prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una base de datos de secuencia extensa, en donde se prefieren FASTA o BLAST.
Una concordancia determinada con el algoritmo anteriormente citado del 60% se designa en el marco de esta solicitud como 60% de homología. Esto es correspondientemente válido para grados de homología superiores.
En una forma de realización adicional la invención proporciona polipéptidos de hemocianina que se pueden obtener mediante el procedimiento de preparación recombinante o modificaciones del mismo.
Se prefieren polipéptidos de hemocianina, de las formas de realización anteriormente representadas, que comprenden cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 25 a 32, en donde la secuencia SEC ID Nº: 25 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 63 y/o SEC ID Nº: 32 por SEC ID Nº: 64. Se prefieren igualmente polipéptidos de hemocianina que comprenden las secuencias SEC ID Nº: 33 a 39 o las secuencias SEC ID Nº: 65, 66, 34 a 39, en donde SEC ID Nº: 35 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 67 y/o SEC ID Nº: 36 por SEC ID Nº: 68. Los polipéptidos de hemocianina se tratan con especial preferencia de hemocianina 2 de Haliotis tuberculata.
Adicionalmente se prefiere de forma particular hemocianina 2 de Haliotis tuberculata, que presenta un peso molecular visible de 370 kDa en SDS-PAGE PAGE en condiciones reductoras. Las hemocianinas se pueden obtener mediante el procedimiento de disociación selectivo descrito en los ejemplos a partir de hemocianina completa de Haliotis tuberculata.
Adicionalmente se prefieren polipéptidos de hemocianina de las formas de realización anteriormente representadas, que comprenden cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 40 a 43 o las secuencias SEC ID Nº: 40 a 43 y SEC ID Nº: 71 a 73, en donde respectivamente la secuencia SEC ID Nº: 40 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 66 y/o SEC ID Nº: 43 con SEC ID Nº: 70. Se prefieren igualmente polipéptidos de hemocianina que bien comprenden cualquiera de las secuencias SEC ID Nº: 44 a 48 o bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48, en donde respectivamente la secuencia SEC ID Nº: 44 puede estar reemplazada por SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46 por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
Estos polipéptidos de hemocianina se tratan con especial preferencia de hemocianina 2 completa (KLH2) de Megathura crenulata.
Adicionalmente se proporciona polipéptido de hemocianina no glicosilado y glicosilado, que se pueden obtener mediante expresión en células huésped con capacidad y sin capacidad de glicosilación. Según cada uso previsto del polipéptido de hemocianina se puede preferir el modelo de glicosilación de levadura, de forma particular levadura metilótrofa, de células de plantas o de células COH o HeLa.
La invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y aditivos fisiológicamente aceptables que son conocidos del estado de la técnica. Preferiblemente se usan las composiciones farmacéuticas para la inmunoestimulación inespecífica en forma de una terapia génica, en donde se expresan tras transformación con un vector adecuado polipéptidos de hemocianina y sirven para la antigenización del tejido.
De forma particular la presente invención prevé el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que está unida a una secuencia de ADN que codifica el antígeno, para la inmunización específica frente a este antígeno. La inmunización se basa a este respecto, sin unirse a esta teoría, en la estimulación inespecífica del sistema inmunológico con epítopos de polipéptido de hemocianina y la inmunización sobre todo específica con reconocimiento de epítopos de antígeno por el sistema inmunológico.
Una inmunización de este tipo es especialmente valiosa en lo que respecta a antígenos de agentes patógenos, pero muy especialmente en lo que respecta a antígenos tumorales. La aplicabilidad de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención para el tratamiento de enfermedades tumorales resulta también de la reactividad cruzada de los anticuerpos específicos de hemocianina formados con restos de hidratos de carbono que aparecen sobre la superficie de tumores como, por ejemplo, el antígeno de Thomsen-Friedenreich que se presenta en múltiples tumores humanos como carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios y carcinoma de vejiga urinaria.
Adicionalmente se pueden usar las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención para el tratamiento de enfermedades parasitarias como esquistosomiasis y para la prevención del abuso de cocaína.
Como forma de realización adicional de la presente invención se disponen composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido de hemocianina de acuerdo con la invención en unión con uno o varios aditivos fisiológicamente aceptables. Como ya se citó anteriormente, puede suponerse que un polipéptido de hemocianina de este tipo está constituido por una subunidad de hemocianina completa, por uno o varios dominios así como por uno o varios fragmentos de tales dominios, presentando estos fragmentos aún las propiedades inmunológicas de al menos de un dominio de una hemocianina. Una composición farmacéutica de este tipo es adecuada bien por la inmunoestimulación inespecífica, que se atribuye sólo a la hemocianina, o bien por la reacción inmune específica sobre el antígeno asociado a la hemocianina, por ejemplo, como agente antiparasitario, agente antivírico o agente antitumoral. De este modo se puede usar, por ejemplo, para el tratamiento de esquistosomiasis, carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma colorrectal, carcinoma de mama, carcinoma de los bronquios y carcinomas de la vejiga urinaria, siendo también adecuado no obstante para el tratamiento de la hipertensión. El tratamiento de la hipertensión se consigue llevando a cabo una inmunización con ayuda de construcciones de péptido del receptor hemocianina-\beta-adrenérgico y/o proteínas de fusión.
En una forma de realización adicional se usan las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención como vacunas. Estas pueden provocar por tanto una contribución valiosa para la profilaxis de enfermedades provocadas por agentes patógenos conocidos. Esto es válido particularmente para composiciones farmacéuticas en las que está unida un polipéptido de hemocianina a un virus, componente de virus, bacterias muertas, componentes de bacterias, de forma particular proteínas de superficie de envolturas de virus o de bacterias, ADN, componentes de ADN, moléculas inorgánicas u orgánicas, por ejemplo, hidratos de carbono, péptidos y/o glicoproteínas.
Según una forma de realización preferida adicional se usa la composición farmacéutica de acuerdo con la invención para la prevención del abuso de cocaína.
Para la administración tanto de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención como también de polipéptidos de hemocianina son adecuados de forma particular liposomas. En consecuencia la presente invención comprende liposomas que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una construcción de acuerdo con la invención o un polipéptido de hemocianina de acuerdo con la invención.
El especialista en la técnica conoce distintos procedimientos para la preparación de liposomas, que son de utilidad para fines farmacéuticos. La selectividad de los liposomas que contienen las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos de hemocianina de acuerdo con la invención se puede aumentar con la formación adicional de moléculas de reconocimiento de células en los liposomas que se unen de forma selectiva a células diana. A tal fin son adecuados de forma particular ligandos receptores que se unen a receptores o células diana, o, especialmente en el caso de tumores, anticuerpos que están dirigidos contra antígenos de superficie de células diana tomadas como objetivo
respectivamente.
Los polipéptidos de hemocianina de acuerdo con la invención están previstos además como moléculas vehículo para medicamentos como, por ejemplo, citostáticos. El aumento del peso molecular prologa el semiperíodo de vida fisiológico de los medicamentos considerablemente, ya que se reduce claramente la pérdida por ultrafiltración en los riñones.
La preparación de las vacunas se realiza según procedimientos conocidos por el especialista en la técnica; en algunas formas de realización se prevé el uso adicional de adyuvantes como, por ejemplo, adyuvante de Freundlich o polisacáridos.
La invención proporciona además anticuerpos que reaccionan específicamente con el polipéptido de hemocianina de acuerdo con la invención y que se pueden obtener mediante inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de hemocianina. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante inmunización, por ejemplo, de conejos y a continuación obtención de antisueros. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales según procedimientos convencionales mediante inmunización, por ejemplo, de ratones, obtención e inmortalización de células del bazo y clonación de hibridomas que producen anticuerpos específicos para la hemocianina.
Adicionalmente se proporciona un procedimiento de rastreo para la identificación de ADN específico de tumor en una célula que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o el anticuerpo de acuerdo con la invención y
b)
la detección de la unión específica.
Preferiblemente el tumor que se va a detectar es un carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o carcinoma colorrectal.
Se pretende aclarar la invención con las figuras y ejemplos siguientes, pero sin limitar la misma en modo alguno. Son accesibles para el especialista en la técnica en base a la descripción y los ejemplos otras formas de realización que están comprendidas igualmente.
La figura 1 muestra la caracterización y purificación de hemocianina de Haliotis tuberculata (HtH):
(a) microscopía electrónica de HtH completo coloreado negativamente, que se purificó mediante ultracentrifugación de hemolinfa libre de células;
(b) electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de HtH1 en comparación con KLH (peso molecular de 370 kDa);
(c) electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (5% de poliacrilamida) del preparado de subunidades de HtH, en donde el ánodo se encuentra en el borde inferior;
(d) inmunoelectroforesis cruzada de ambas subunidades de HtH con uso de anticuerpos de anti-HtH de conejos;
(e) microscopía electrónica de didecámeros de HtH1 que quedan (flechas blancas) tras la disociación selectiva de HtH2 (flechas negras);
(f) perfil de elución de cromatografía de filtración en gel (Biogel A15m) en presencia de solución de molibdato de amonio/polietilenglicol (pH 5,9) tras la disociación selectiva de HtH2 en su subunidad y subsiguiente enriquecimiento de HtH1 mediante ultracentrifugación;
(g) electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (6,5% de poliacrilamida) de subunidades de HtH1 y HtH2 purificadas mediante cromatografía en gel en comparación con el material de partida;
(h, i) inmunoelectroforesis cruzada de subunidades de HtH purificadas cromatográficamente; y
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(j, m) inmunoelectroforesis cruzada de subunidades de HtH purificadas con uso de anticuerpos anti-KLH de conejos, que son específicas de KHL1 o KLH2.
La figura 2 muestra el estudio de organización de subunidades de HtH1, en donde se usaron para la inmunoelectroforesis anticuerpos anti-HtH1 de conejos y se encontraba el ánodo en los lados izquierdo:
(a) inmunoelectroforesis cruzada tras proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de elastasa:
(b) electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de subunidad de HtH1 escindida de elastasa;
(c, d, g-j, l, n, p) inmunoelectroforesis cruzada de productos de escisión de elastasa de la subunidad de HtH1;
(e) inmunoelectroforesis cruzada tras proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de proteasa V8;
(f) electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (7,5% de poliacrilamida) de subunidad de HtH1 escindida con proteasa V8 y
(k, m, o) inmunoelectroforesis cruzada tras proteolisis limitada de HtH1 con ayuda de tres proteasas dadas.
La figura 3 muestra la separación de productos de escisión proteolíticos de la subunidad de HtH1 con ayuda de HPLC.
La figura 4 muestra la secuencia genómica del gen de HtH1.
La figura 5 muestra la estructura primaria derivada de la proteína de HtH1.
La figura 6 muestra la secuencia genómica del gen de HtH2.
La figura 7 muestra la estructura primaria derivada de la proteína de HtH2.
La figura 8 muestra la secuencia genómica del gen de KLH 1.
La figura 9 muestra la estructura primaria derivada de la proteína de KLH1.
La figura 10 muestra la secuencia genómica del gen de KLH2.
La figura 11 muestra la estructura primaria derivada de la proteína de KLH2.
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Ejemplos
Que aclaran la presente invención
Materiales y procedimientos 1. Obtención de hemolinfa y aislamiento de hemocianina
Se prepararon individuos de oreja de mar europeo Haliotis tuberculata de la zona de la costa atlántica francesa de S.M.E.L. (Blainville sur Mer, Francia) y de la compañía Biosyn (Fellbach, Alemania). Se mantuvieron los animales en un acuario de agua de mar de 300 l a 17ºC y se alimentaron con algas pardas. Para la extracción de la hemolinfa se colocaron las orejas de mar en un saco de plástico cerrado en hielo. Después de una hora se había segregado grandes volúmenes de hemolinfa a través de su piel. Se deduce que la hemocianina obtenida con este procedimiento es idéntica a la hemocianina que se pudo reunir mediante incisión de una concavidad en el pie de caracoles de mar enfriados con uso de un escalpelo. Las células sanguíneas se separaron de la hemolinfa mediante centrifugación a 800 g durante 30 minutos a 4ºC. Sedimentó inmediatamente después toda la hemocianina mediante ultracentrifugación preparativa a 30000 g durante 4 horas a 4ºC. El sobrenadante se desechó y se suspendió el agregado de hemocianina azul durante la noche en "tampón de estabilización" (Tris 0,05 M, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 5 mM, NaCl 0,15 mM, PMSF 1 mM, pH 7,4) y se conservó a 4ºC.
Se obtuvo HtH1 intacto con uso del procedimiento descrito por Harris y col., 1995, véase anteriormente, a partir de HtH completo mediante disociación selectiva de HtH2 en solución de molibdato de amonio/polietilenglicol (1%/0,2%), pH 5,9 y subsiguiente ultracentrifugación. Se disolvió el agregado de HtH1 parcialmente purificado que se genera y se purificó mediante filtración en gel sobre un dispositivo de Biogel A15m hasta la homogeneidad. La última etapa dio pequeñas cantidades de HtH2 purificado. Se disoció HtH1 y HtH2 nativos mediante diálisis contra "tampón de disociación" (glicina 0,13 M/NaOH, pH 9,6) a 4ºC durante la noche cuantitativamente en las subunidades; no se requirió la presencia de EDTA. Se añadió PMSF 1 mM en cada etapa de purificación para inhibir la proteolisis.
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2. Microscopía electrónica
Se llevó a cabo "tinción negativa" convencional con el procedimiento de gotas individuales (Harris y Horne en Harris, J.R. (editor) Electron microscopy in biology, (1991), IRL Press Oxford, páginas 203-228). Se sometieron a descarga luminiscente láminas portadoras de carbono inicialmente durante 20 segundos para hacerlas hidrófilas y adsortivas para la proteína. Se deja adsorber las muestras de proteína en las láminas de carbono durante 60 segundos. Entre tanto se separan las sales tampón mediante lavado secuencial con cuatro gotas de agua de 20 \mul una tras otra. Se colorean negativamente las retículas finalmente con una gota de 20 \mul de molibdato de amonio al 5% acuoso, que contiene 1% de trehalosa (pH 7,0) y se dejan secar a temperatura ambiente. Para el estudio de microscopía electrónica se usa un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 900.
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3. Electroforesis en gel de poliacrilamida e inmunoelectroforesis
Se llevó a cabo electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) según el procedimiento de Laemmli (Nature 227 81970), 670-685). Para la PAGE nativa se usó un sistema alcalino según Markl y col. (1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175 con un Tris/borato 0,33 M, pH 9,6 como tampón de gel y Tris/borato 0,065 M, pH 9,6 como tampón de electrodos. Se llevaron a cabo inmunoelectroforesis (IE) cruzada y "de línea cruzada" según Weeke (Scand. J. Immunol. 2 (1973), Suppl. 1, 47-56) o bien Kroll (Scand. J. Immunol. 2, Suppl. 1 (1973), 79-81). Se produjeron anticuerpos de conejo de Charles River Deutschland (Kisslegg, Alemania) contra HtH completo disociado y HtH1 purificado. El procedimiento de inmunización se llevó a cabo según Markl y Winter (J. Comp. Physiol. 159B (1989), 139-151).
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4. Proteolisis limitada y aislamiento de fragmentos
La proteolisis limitada se llevó a cabo a 37ºC en glicina 0,13 M/NaOH, pH 9,6 mediante incorporación posterior de un enzima (Sigma, Deisenhofen, Alemania) que se había disuelto en NH_{4}HCO_{3} 0,1 M, pH 8,0: proteasa V8 tipo XVII (8400) de Staphylococcus aureus, papaína tipo II de leche de papaya (P-3125), pancreasa-elastasa de ternera tipo IV (E-0258), quimotripsina y tripsina. La concentración de hemicianina se encontraba entre 1 y 10 mg/ml. La concentración final del enzima fue de 2% (peso/peso). La proteolisis finalizó después de 5 horas tras congelación a -20ºC. El procedimiento de HPLC se llevó a cabo en un dispositivo de Applied Biosystems (BAI, Bensheim, Alemania) que se equipó con un detector de dispositivo de diodos modelo 1000S. Se aplicaron los fragmentos proteolíticos a una columna de intercambio iónico mono-Q (Pharmacia, Friburgo, Alemania) que se había equilibrado con Tris/HCl 0,02 M, pH 8,0 y se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio lineal (CaCl 0,0 M a 0,5 M) en el mismo tampón a una caudal de flujo de 1 ml/min. Se aislaron alternativamente los fragmentos proteolíticos mediante recorte de las bandas de geles de PAGE nativos (Markl. y col., 1979) J. Comp. Physiol. 133 B, 167-175, después de que estos se hubiesen coloreado inversamente previamente con el sistema Roti-White (Roth, Karlsruhe, Alemania) según Fernandez-Patron y col. (1995) Anal. Biochem. 224, 203-211. Para la escisión subsiguiente se dializaron con un segundo enzima los fragmentos aislados primero frente a glicina/NaOH 0,13 M, pH 9,6 para separar el
NaCl.
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5. Análisis de secuencia de aminoácidos
Las proteínas obtenidas mediante el procedimiento de HPLC se desnaturalizaron en tampón de muestra que contiene SDS y se separaron mediante SDS-PAGE (Laemmli, 1970, véase anteriormente; 7,5% de poliacrilamida). Para impedir el bloqueo del término NH_{2} se añadió 0,6% (peso/peso) de ácido tioglicólico al tampón del cátodo (Walsh y col., Biochemistry 27 (1988), 6867-6876). Se trasladaron las bandas de proteínas mediante electrotransferencia sobre membranas ProBlot (Applied Biosystems, Alemania) a una cámara de trazado vertical (tampón de borato 25 mM, pH 8,8, que contiene EDTA 2 mM; 10 minutos/100 mA, 15 minutos/200 mA, 12 horas/300 mA). La detección de los polipéptidos individuales se llevó a cabo sobre las membranas con la coloración Ponceau-S. Se recortaron las bandas de polipéptido de interés y se secuenciaron en un dispositivo de secuenciación de proteínas 477A de Applied Biosystems. Las cantidades de los polipéptidos aplicados al dispositivo de secuenciación se encontraban por debajo del orden de pmol.
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6. Clonación de ADNc y análisis de secuencia
Se preparó una biblioteca de expresión de ADNc lambda de poli(A^{+})-ARN a partir de tejido de envoltura de Haliotis con uso del vector Lambda ZAP Express® según las instrucciones del fabricante (Stratagene, Heidelberg, Alemania). Se aislaron los clones con uso de anticuerpos de conejo específicos de HtH. Se llevó a cabo la secuenciación de nucleótidos en ambas hebras con uso del tinte Taq desoxy Terminador®-Systems. La asignación de secuencias se llevó a cabo con el software CLUSTAL W (1,7)® y TREEVIEW ® (Thompson y col., Nucl. Acids. Res. 22 (1994), 4673-7680).
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Ejemplo 1
Aislamiento de HtH y separación de dos tipos distintos (HtH1 y HtH2)
Se obtuvo hemolinfa de orejas de mar adultas. Se separaron las células sanguíneas mediante centrifugación y se sedimentó la hemocianina entre tanto mediante ultracentrifugación. Se disolvió de nuevo el agregado de hemocianina azul en "tampón de estabilización" (pH 7,4) y se estudió en el microscopio electrónico (figura 1a). Consistía principalmente en di-decámeros típicos, acompañados de una pequeña proporción en decámeros y tridecámeros. La desnaturalización en 2% de SDS en presencia de sustancias reductoras y a continuación separación por SDS-PAGE dio una banda individual que correspondía al polipéptido con un peso molecular aparente de 370 kDa, que sólo se encuentra mínimamente por debajo del peso de las subunidades visibles de KLH (figura 1b). La disociación completa de los oligómeros como los di-decámeros en los polipéptidos nativos (subunidades) se consiguió mediante diálisis durante la noche de HtH en "tampón de disociación" (pH 9,6). Procedimiento PAGE nativo, que se usó sobre estas muestras, dio un componente principal y uno secundario (figura 1c). La inmunoelectroforesis cruzada (IE cruzada) con uso de anticuerpos de conejo policlonales producidos en HtH completo purificado dio dos componentes que son inmunológicamente distintos, sin embargo presentan la reacción clásica de una identidad parcialmente inmunológica (figura 1d). Su aislamiento preparativo (figura 1e-i) mostró que representan las subunidades de dos tipos de HtH distintas, designadas como HtH1 y HtH2, y se pudieron asignar a cada uno individualmente el modelo de PAGE nativo y procedimiento de IE cruzada (figura 1 c, d).
La separación de HtH1 y HtH2 se llevó a cabo según el procedimiento para la disociación selectiva según Harris y col., 1995, véase anteriormente. En molibdato de amonio/polietilenglicol, HtH1 en el estado oligomérico (di-decámeros) era completamente estable, mientras que HtH2 se disociaba completamente en las subunidades (figura 1e). Esto posibilitó la sedimentación cuantitativa de HtH1 en el ultracentrifugado, en donde permanecía frente a la mayor proporción del HtH2 en el sobrenadante. Del agregado nuevamente disuelto se purificaron grandes cantidades en HtH1 mediante cromatografía de filtración en gel hasta la homogeneidad, que dieron también pequeñas cantidades de HtH2 puro (figura 1f). Se estudiaron las fracciones mediante PAGE nativo (figura 1g) y IE cruzada (figura 1H, i). La forma de proceder de disociación selectiva de tri-decámeros completos separados de HtH2 de las muestras, da a entender que están constituidos en última instancia por HtH2, pero no por HtH1 (figura 1 e). El comportamiento de disociación selectiva de HtH2 y también la capacidad de formar agregados que son mayores que los di-decámeros in vivo, corresponde a las propiedades de KLH2. Inversamente, la estabilidad de HtH1 en estas condiciones y su incapacidad para ensamblar agregados mucho mayores que di-decámeros, se parece al comportamiento de KLH1. Esta analogía se confirma de nuevo mediante la reacción de anticuerpos anti-KLH1 o anti-KLH2 frente a los dos tipos de HtH (figura 1j-m).
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Ejemplo 2
Análisis de la organización de la subunidad de HtH1
Las ocho unidades funcionales (FU, frecuentemente designadas como "dominios funcionales") que forman una subunidad de Hemocianina de moluscos, se diferencian en la estructura primaria y no presentan reactividad cruzada inmunológica alguna, como resulta de la IE cruzada. En el caso de la subunidad de HtH1 purificada (figura 1g, h) se usaron cinco concentraciones bajas de distintas proteasas (elastasa, proteasa V8, papaína, tripsina y quimotripsina), que habían escindido los enlaces peptídicos entre FU adyacentes de KLH1 y KLH2 (Gebauer y col., 1994, véase anteriormente, Söhngen y col., 1997, véase anteriormente). Los productos de escisión se investigaron mediante IE cruzada y SDS-PAGE (figura 2). El tratamiento con elastasa produce ocho FU individuales, derivadas del número de picos de inmunoprecipitación distintos en la IE cruzada (figura 2a) y con el peso molecular aparente de 50 kDa de la parte principal de los productos de escisión en SDS-PAGE (figura 2b). Se reconoció un pico de precipitación adicional como dímero de FU, que se generó mediante escisión incompleta del segmento ab (figura 2a). Se obtuvieron mediante procedimientos de HPLC con una columna mono-Q (figura 3a) dos de los productos de escisión de elastasa con una pureza suficiente para hacer posible mediante "IE de línea cruzada" su asignación clara a dos de los ocho picos de precipitación (fig. 2c, d). Las otras cuatro proteasas muestran distintos modelos de escisión que consistía en mezclas de FU individuales y fragmentos mayores, que contienen dos, tres o varias FU (por ejemplo, fig. 2e, f). Muchas de ellas se enriquecieron con el procedimiento de HPLC en cantidad suficiente (fig. 3b-e) para hacer posible su identificación en su modelo de SDS-PAGE y IE cruzada correspondiente. Una cantidad de estos componentes se secuenció en terminal N mediante transferencia Blot de geles SDS a membranas Pro-Blot® (tabla 1). Los resultados se compararon con secuencias de terminales N que se habían obtenido de la proteína ortogonal visible en Megathura crenulata, KLH1 (tabla 1), del que está disponible la disposición de FU completa (Söhngen y col., 1997, véase anteriormente; véase la fig. 5b). El resultado de todo el preparado condujo a la determinación de la disposición FU completa dentro de la subunidad de HtH1 (figura 2a).
De forma particular la escisión de la subunidad de HtH1 (1-abcdefgh) con proteasa V8 dio cuatro picos de precipitación en la IE cruzada (fig. 2e). El procedimiento de SDS-PAGE mostró cinco fragmentos distintos (fig. 2f): 220 kDa (5 FU), 185 kDa (4 FU), 100 kDa (2 FU), 55 kDa (1 FU) y 46 kDa (1 FU). El fragmento de 100 kDa se aisló mediante el procedimiento de HPLC (fig. 3b) y se identificó como 1-ab mediante secuenciación en el terminal N, ya que la secuencia era idéntica a la respectiva de la subunidad intacta (tabla 1). En el procedimiento de IE "de línea cruzada" se fusionó 1-ab con tres picos de precipitación del modelo de escisión de elastasa. En base a la evaluación resultó que los fragmentos representaban 1-ab, 1-a ó 1-b (fig. 2g). Sin embargo no quedaba claro qué pico representaba 1-a y cuál 1-b. En una segunda etapa se escindió 1-ab purificado por HPLC con elastasa en sus componentes FU, a partir de ellos se pudo eluir uno con el procedimiento de bandas de gel de PAGE nativo y se asignó al modelo de elastasa mediante el procedimiento de IE de "línea cruzada" (figura 2h) y se suspendió en el terminal N. Este componente mostró la misma secuencia N-terminal que toda la subunidad y por tanto era idéntico a 1-a. Por tanto la segunda FU del fragmento de 100 kDa es 1-b (fig. 2a; tabla 1). Así mismo se obtuvieron 1-c y 1-h purificados por HPLC (fig. 3b), se identificaron mediante similitudes de secuencia N-terminal con los FU correspondientes en KLH1 (tabla 1) y se asignaron con el procedimiento de IE "de línea cruzada" sus picos de precipitación correspondientes al modelo de elastasa (fig. 2i, j). Adicionalmente se identificaron 1-a, 1-b, 1-c y 1-h (fig. 2a). Con uso de papaína para la escisión de subunidades se obtuvieron cinco picos distintos en el procedimiento de IE cruzada (fig. k). A partir de una muestra de este tipo se purificó un fragmento de 100 kDa (2 FU) mediante el procedimiento de HPLC (fig. 3c), que contenía según el procedimiento de IE "de línea cruzada" la FU 1-h ya identificada y una de las cuatro FU aún no identificadas y por tanto debe representar 1-gh (figs. 2k, 3c). En realidad este fragmento presentaba una secuencia N-terminal que mostraba similitudes con KLH1-g (tabla 1). Para la confirmación adicional se escindió el fragmento purificado por HPLC 1-gh con elastasa en su componente FU, se purificó 1-g a partir de estos y se identificó mediante secuenciación en el terminal N. Se asignó mediante procedimiento de IE "de línea cruzada" su pico al modelo de escisión de elastasa (fig. 2I).
Se purificó el fragmento de 220 kDa de la escisión de proteasa V8 (fig. 2e, f) por HPLC (fig. 3b) y se fusionó en el procedimiento de IE "de línea cruzada" con 1-h, 1-g y tres picos aún no identificados del modelo de escisión de elastasa. Además se obtuvo el fragmento de 185 kDa en pureza suficiente (fig. 2e, f; 3b), y se demostró que estos contenían los mismos componentes con excepción de 1-h. Esto supone que el fragmento de 22 kDa y el de 185 kDa son 1-defgh o 1-defg. En realidad la secuencia N-terminal era prácticamente idéntica y mostraba además similitudes con KLH1-d (tabla 1). La escisión de la subunidad de HtH1 con tripsina dio una pluralidad de componentes en el intervalo de pesos moleculares de uno a dos FU (fig. 2m). Se enriquecieron varios de los componentes en fracciones de HPLC (fig. 3d). Un fragmento de 100 kDa demostró ser especialmente útil ya que presentaba la misma secuencia N-terminal que el fragmento 1-defg de la escisión de proteasa V8 (tabla 1); por tanto debió representar el fragmento de 100 kDa 1-de. En el procedimiento de IE "de línea cruzada" este componente se fusionó con dos de los tres picos de FU aún no identificados del modelo de escisión de elastasa (fig. 2n), que debía representar por tanto 1-d y 1-e, y por tanto dajaba alguna posibilidad para 1-f. El procedimiento de IE "de línea cruzada" mostró también que en la fracción 1-de estaba presente además la FU 1-f (fig. 2n). La identificación de 1-f se confirmó mediante escisión de la subunidad con quimotripsina (fig. 2o) y subsiguiente procedimiento por HPLC (fig. 3e). Esta escisión dio entre otros un fragmento de 95 kDa (2 FU) que se fusionó en el procedimiento de IE "de línea cruzada" con 1-g y un segundo pico (2p) y por tanto podría ser bien 1-gh (que se pudo excluir, ya que 1-h ya se había identificado) o bien 1-fg (que no tenía sentido debido al pico adicional encontrado, que era idéntico al candidato que quedaba). Realmente este fragmento mostraba una secuencia N-terminal que es de alguna forma similar a KLH1-f (tabla l). El último problema consistía en asignar dos picos de FU que quedan 1-d o 1-e. Esto se consiguió con uso de FU aisladas por HPLC de muestras en las que la subunidad se había escindido con elastasa (fig. 2c, d, 3a). El componente ácido en el procedimiento de IE cruzado era 1-d derivado de su secuencia N-terminal, que es idéntico al de 1-defgh (fig. 2c; tabla 1), mientras que el componente básico del par 1-d/1-g presentaba una nueva secuencia N-terminal (tabla 1) y por tanto debía ser 1-e (fig. 2a). Por tanto se aclaró la estructura de las unidades funcionales de la subunidad de
HtH1.
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Ejemplo 3
Comparación de pesos moleculares y secuencias de terminales N de las unidades funcionales aisladas bioquímicamente (FU) de HtH1 y KLH1. Las distintas FU, cada una con un punto de unión a cobre binuclear intacto, se liberaron mediante proteolisis limitada como segmentos globulares de su unidad mayor; véase el párrafo "aislamiento y análisis de las unidades de HtH1". Los datos de KLH1 se tomaron de Söhngen y col., véase anteriormente. La asignación como unidad real se realizó en base al peso molecular y al comportamiento inmunológico (véase la fig. 2). El peso molecular inhabitualmente bajo de HtH1-d aislado pudo significar que se escindió un gran péptido de terminal
C.
TABLA I
1
Ejemplo 4
Clonación de ADNc de hemocianina
1.
Para la clonación de ADNc de hemocianina se aisló ARNm del tejido de la envoltura de moluscos respectivos. Se obtuvo la primera hebra de ADNc mediante transcripción inversa con Oligo(dT) como cebador. La segunda hebra se obtuvo mediante síntesis convencional con cebadores aleatorios. El ADNc así obtenido se clonó en un vector de expresión lambda con formación de una biblioteca de expresión de ADNc. Con uso de un anticuerpo de hemocianina se investigó la biblioteca en condiciones adecuadas obteniéndose clones positivos. Estos clones positivos se aislaron, secuenciaron y caracterizaron.
2.
Del intervalo N-terminal de un clon positivo obtenido se preparó una sonda de ADNc con la que se investigó la biblioteca de ADNc. Se aislaron, secuenciaron y caracterizaron de nuevo los clones positivos obtenidos.
3.
Para obtener otra secuencia dispuesta en 5' se preparó una biblioteca de expresión adicional de ADNc, que se obtuvo con ayuda de una combinación de cebador específico de hemocianina y "aleatorio". Esta biblioteca de ADNc se investigó con sondas de ADNc que corresponden a regiones "N-terminal" de los clones positivos obtenidos en 2. Se aislaron, secuenciaron y caracterizaron los clones positivos obtenidos.
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Ejemplo 5
Clonación de genes de hemocianina
Se aisló ADN genómico según procedimientos convencionales. La reacción de PCR se llevó a cabo con ayuda de cebadores específicos de hemocianina para amplificar los segmentos de genes de hemocianina de interés. Se clonaron, secuenciaron y caracterizaron los productos de amplificación obtenidos en un vector adecuado (por ejemplo, pGem T o pGem T easy (Promega, Mannheim).
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Ejemplo 6
Expresión recombinante de hemocianina
Se llevó a cabo una reacción de PCR con un clon de ADNc que contenía la secuencia de codificación de HtH-1 para amplificar específicamente la secuencia de codificación del dominio 1d. Como cebadores se usaron oligonucleótidos preparados sintéticamente.
El cebador 1 (aguas arriba) comprende seis nucleótidos del final del dominio HtH-1c, un punto de corte SacI y 12 nucleótidos del final del dominio HtH-1d.
El cebador 2 (aguas abajo) comprende seis nucleótidos del comienzo del dominio HtH1-e, un punto de corte Sa/I y una secuencia específica de HtH1-d.
Condiciones de PCR: 2 min 95ºC
30 seg 95ºC
30 seg 55ºC
1 min 72ºC
35 ciclos
10 min 72ºC
El amplificado se clonó en el vector de clonación pGEM T easy PCR (Promega) en XL-1 Blue (Stratagene). Tras aislamiento del plásmido recombinante y restricción con Sacl y Sa/I se pudo aislar el ADNc del dominio 1-d. El vector de expresión pQE30 (Quiagen) se restringió igualmente con los enzimas correspondientes.
A continuación se llevó a cabo la ligadura entre el HtH-1d-ADNc (restringido a SacI y Sa/I) y pQE (restringido a SacI y Sa/I). Por tanto es posible una clonación dirigida del ADNc, que codifica para HtH-1d, en un vector de expresión. La expresión de HtH1-d en pQE en XL-1 Blue se realizó según las instrucciones del fabricante. Se pudo realizar de forma análoga la expresión de otros dominios de HtH1, HtH2 o KLH1 o KLH2.
<110> Biosyn Arzneimittel GmbH
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<120> Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT1220-01966
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
4 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1003
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0,8cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 967
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
18 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 949
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 760
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 988
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 422
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (15)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
26 
\hskip0,8cm
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip0,8cm
28 
\hskip0,8cm
29 
\hskip0,8cm
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
31 
\hskip0,8cm
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip0,8cm
33 
\hskip0,8cm
34 
\hskip0,8cm
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
36 
\hskip0,8cm
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip0,8cm
38 
\hskip0,8cm
39 
\hskip0,8cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 403
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
41 
\hskip0,8cm
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
43 
\hskip0,8cm
44 
\hskip0,8cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
46 
\hskip0,8cm
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip0,8cm
48 
\hskip0,8cm
49 
\hskip0,8cm
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
51 
\hskip0,8cm
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip0,8cm
53 
\hskip0,8cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
55 
\hskip0,8cm
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
57 
\hskip0,8cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 515
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
59 
\hskip0,8cm
60 
\hskip0,8cm
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
62 
\hskip0,8cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
64 
\hskip0,8cm
65 
\hskip0,8cm
66 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip0,8cm
67 
\hskip0,8cm
68 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
69 
\hskip0,8cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 317
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
71 
\hskip0,8cm
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
73 
\hskip0,8cm
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
76 
\hskip0,8cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
78 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 569
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1246
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 943
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
93 
\hskip0,8cm
94 
\hskip0,8cm
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
96 
\hskip0,8cm
97 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
98 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
99 
\hskip0,8cm
100 
\hskip0,8cm
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
102 
\hskip0,8cm
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
104 
\hskip0,8cm
105 
\hskip0,8cm
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
107 
\hskip0,8cm
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
109 
\hskip0,8cm
110 
\hskip0,8cm
111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
112 
\hskip0,8cm
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
116 
\hskip0,8cm
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip0,8cm
118 
\hskip0,8cm
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
120 
\hskip0,8cm
121 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
122 
\hskip0,8cm
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
124 
\hskip0,8cm
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
126 
\hskip0,8cm
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1266
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
132 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
133 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip0,8cm
134 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip0,8cm
135 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis assimilis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
139 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
141 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1548
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haliotis tuberculata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 966
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
144 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
145 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
146 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
147 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
148 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 942
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
150 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
151 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
152 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1251
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
154 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1185
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
155 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Megathura crenulata 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
156

Claims (36)

1. Molécula de ácido nucleico, que comprende
(i)
una secuencia que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o una variante según la reivindicación 1 (c)
(ii)
y al menos una secuencia de intrón,
en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona de:
(a)
secuencias de ácido nucleico que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de sus secuencias de ARN correspondientes, o que las contienen:
\quad
SEC ID Nº: 9 (dominio b de HtH2 parcial)
\quad
SEC ID Nº: 10 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 11 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 12 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 13 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 14 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 15 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 20 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 21 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 22 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 23 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 24 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 50 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 51 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 52 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 53 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 57 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 58 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 59 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 60 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 61 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 62 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 88 (dominio a'' de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 89 (dominio b'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 90 (dominio c'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 91 (dominio d'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 92 (dominio e'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 93 (dominio f' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 94 (dominio g'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 95 (dominio h'' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 102 (dominio b'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 103 (dominio c'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 104 (dominio d'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 105 (dominio e'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 106 (dominio f' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 107 (dominio g'' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 108 (dominio h'' de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 157 (dominio a de KLH2 completa);
(b)
secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
\quad
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
\quad
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
(c)
Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos, que son al menos un 60% idénticas a una secuencia de la reivindicación 1b, calculándose la identidad de secuencia en 90 aminoácidos.
2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de intrón se selecciona de:
(i)
secuencias de ácido nucleico, que se seleccionan del grupo de las secuencias de ADN dadas a continuación o de las secuencias de ARN que corresponden a estas, o que las contienen:
\quad
SEC ID Nº: 147 (intrón 2B/2C de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 148 (intrón 2C/2D de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 149 (intrón 2D/2E de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 150 (intrón 2E/2F de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 151 (intrón 2F de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 152 (intrón 2F-2/2G de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 153 (intrón 2G-1/2G-2 de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 154 (intrón 2G-2/2G-3 de KHL2),
\quad
SEC ID Nº: 155 (intrón 2G/2H de KHL2);
(ii)
secuencias de ácido nucleico, que se hibridan con la contrahebra de una secuencia de ácido nucleico según (i);
(iii)
secuencias de ácido nucleico que son idénticas al menos en el 60% con una de las secuencias de ácido nucleico dadas en (i);
(iv)
variantes de las secuencias dadas en (i) a (iii), en donde las variantes presentan frente a las secuencias dadas en (i) a (iii), adiciones, deleciones, inserciones o inversiones; y
(v)
combinaciones de varias de las secuencias de ADN dadas en (i) a (iv).
3. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque es una molécula de ácido desoxirribonucleico.
4. Construcción que comprende una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Construcción según la reivindicación 4, que comprende además un promotor adecuado para el control de la expresión, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de la misma se encuentra bajo el control del promotor.
6. Construcción según la reivindicación 4 ó 5, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno, que está unida directamente con la secuencia de ácido nucleico que codifica una hemocianina, un dominio de hemocianina o un fragmento funcional de la misma.
7. Construcción según la reivindicación 6, en donde el antígeno se selecciona de: antígenos tumorales, antígenos de virus y antígenos de agentes patógenos bacterianos o parasitarios.
8. Construcción según una de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la construcción contiene al menos una parte de un vector, en donde el vector se selecciona de: bacteriófagos, andenovirus, virus de vacunas, baculovirus, virus SV-40 y retrovirus.
9. Construcción según una de las reivindicaciones 4 a 8, en donde la construcción comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica His-Tag y la expresión de la construcción conduce a la formación de una proteína de fusión con un His-Tag.
10. Célula huésped, que contiene una construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9, en donde la célula huésped es una célula procariótica o eucariótica adecuada para la expresión de la construcción.
11. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada porque la célula huésped procariótica se selecciona de E. coli y Bacillus subtilis.
12. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada porque la célula huésped eucariótica se selecciona de células de levadura, células de plantas, células de insectos y células de mamíferos, preferiblemente de células CHO, células COS y células HeLa.
13. Procedimiento para la preparación de un polipéptido de hemocianina, en donde la molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o la construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9 se expresa en una célula huésped adecuada y dado el caso se aísla la proteína.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina preparado se modifica de forma natural o química.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la modificación es una reticulación transversal o un enlace covalente en un antígeno.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la expresión se lleva a cabo en una célula huésped según una de las reivindicaciones 10 a 12.
17. Polipéptido de hemocianina, que comprende una secuencia de aminoácido que es codificada por una o varias de las moléculas de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.
18. Polipéptido de hemocianina según la reivindicación 17, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo:
\quad
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
\quad
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
\quad
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de HtH2),
\quad
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
\quad
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
o
(b)
un polipéptido de hemocianina, cuya secuencia es en una región parcial de al menos 90 aminoácidos, al menos un 60% idéntica a una secuencia de aminoácidos de (a).
19. Polipéptido de hemocianina recombinante, que se puede obtener mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16 o modificaciones del mismo, en donde las modificaciones son
a)
di-, oligo- y polímeros del polipéptido de hemocianina que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 16,
b)
modificaciones de cadenas laterales del mismo,
c)
proteínas de fusión, obtenidas mediante unión a un antígeno o
d)
polipéptidos, obtenidos mediante episodios post-traduccional.
20. Polipéptido de hemocianina recombinante según la reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina comprende bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 48 o bien las secuencias SEC ID Nº: 44 a 46, 77, 78, 47, 48 y KLH2 es de Megathura crenulata, pudiendo estar reemplazada respectivamente la secuencia SEC ID Nº 44 por SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 45 por SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 46 por SEC ID Nº: 76 y/o SEC ID Nº: 47 por SEC ID Nº: 79.
21. Polipéptido de hemocianina recombinante según la reivindicación 17 a 20, caracterizado porque está unido de forma covalente a virus, constituyentes de virus, bacterias, constituyentes de bacterias, ADN, constituyentes de ADN, moléculas inorgánicas u orgánicas como, por ejemplo, péptidos de hidratos de carbono y/o glicoproteínas.
22. Polipéptido de hemocianina recombinante según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina no está glicosilado.
23. Polipéptido de hemocianina recombinante según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque el polipéptido de hemocianina está glicosilado.
24. Composición farmacéutica, que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o una construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9 y aditivos fisiológicamente aceptables.
25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque se usa para el tratamiento de tumores mediante terapia génica.
26. Composición farmacéutica, que contiene un polipéptido de hemocianina según una de las reivindicaciones 17 a 23 y aditivos fisiológicamente aceptables.
27. Composición farmacéutica según la reivindicación 26, caracterizada porque se usa como agente antiparasitario, agente antivirus o como agente anti-tumoral.
28. Composición farmacéutica según la reivindicación 26, caracterizada porque se usa para el tratamiento de una de las siguientes enfermedades: esquitosomiasis, hipertensión, carcinomas superficiales de la vejiga urinaria, carcinomas epiteliales, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios y carcinoma colorrectal.
29. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque se usa como vacuna.
30. Composición farmacéutica según la reivindicación 25, caracterizada porque se usa para la prevención del abuso de cocaína.
31. Uso de polipéptido de hemocianina según una de las reivindicaciones 17 a 23 como vehículo para medicamentos.
32. Liposoma, que comprende una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, una construcción según una de las reivindicaciones 4 a 9 y/o un polipéptido de hemocianina según una de las reivindicaciones 17 a 23.
33. Liposoma según la reivindicación 32, caracterizado porque el liposoma comprende además moléculas de reconocimiento de células.
34. Anticuerpos, que se pueden obtener mediante inmunización de un animal de ensayo con un polipéptido de hemocianina recombinante que se selecciona de al menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos:
SEC ID Nº: 33 (dominio b de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 34 (dominio c de HtH2),
SEC ID Nº: 35 (dominio d de HtH2),
SEC ID Nº: 36 (dominio e de HtH2),
SEC ID Nº: 37 (dominio f de HtH2),
SEC ID Nº: 38 (dominio g de HtH2),
SEC ID Nº: 39 (dominio h de HtH2),
SEC ID Nº: 44 (dominio b de KLH2),
SEC ID Nº: 45 (dominio c de KLH2),
SEC ID Nº: 46 (dominio d de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 47 (dominio g de KLH2),
SEC ID Nº: 48 (dominio h de KLH2 parcial),
SEC ID Nº: 65 (dominio a de HtH2 parcial),
SEC ID Nº: 156 (dominio a de HtH2 completa),
SEC ID Nº: 66 (dominio b' de HtH2),
SEC ID Nº: 67 (dominio d' de HtH2),
SEC ID Nº: 68 (dominio e' de KLH2),
SEC ID Nº: 74 (dominio b' de KLH2),
SEC ID Nº: 75 (dominio c' de KLH2),
SEC ID Nº: 76 (dominio d' de KLH2),
SEC ID Nº: 77 (dominio e de KLH2),
SEC ID Nº: 78 (dominio f de KLH2),
SEC ID Nº: 79 (dominio g' de KLH2),
SEC ID Nº: 158 (dominio h de KLH2 parcial).
35. Procedimiento de rastreo para la identificación de ADN específico de tumor en una célula que comprende:
a)
poner en contacto ADN celular y/o proteínas celulares con una sonda que comprende la secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3 y/o del anticuerpo según la reivindicación 34 y
b)
la detección de la unión específica.
36. Procedimiento de rastreo según la reivindicación 35, caracterizado porque el tumor que se va a detectar es carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, carcinoma de bronquios o carcinoma colorrectal.
ES00956469T 1999-08-20 2000-08-21 Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una hemocianina, y al menos una secuencia de intron. Expired - Lifetime ES2315239T3 (es)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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FR2598147B1 (fr) 1986-04-30 1988-08-26 Pasteur Institut Immunogene isole de mollusques, son procede de preparation, reactifs de diagnostic des bilharzioses humaines, vaccins contre les schistosomiases et compositions immunisantes comprenant ledit immunogene.
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US5831033A (en) 1997-02-14 1998-11-03 Children's Medical Center Of Boston Human thymosin β15 gene, protein and uses thereof
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