ES2312858T3

ES2312858T3 - Peptidos que tienen un alto contenido en cisteina.

Info

Publication number: ES2312858T3
Application number: ES03813865T
Authority: ES
Inventors: Franz Kerek
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-12-21
Filing date: 2003-12-20
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2023-12-20
Also published as: AU2003296543A1; US7750114B2; JP2006524985A; WO2004058813A3; DE10260537A1; DE50310131D1; US20060183679A1; JP4353425B2; AU2003296543A8; EP1572226A2; WO2004058813A2; DE10394174D2; EP1572226B1; ATE400288T1

Abstract

Péptidos que contienen cisteína y tienen la siguiente estructura (Ver fórmula) y apoyan las defensas inmunitarias naturales de plantas y animales u organismos humanos para combatir bacterias, hongos, virus u otros patógenos, en las que las líneas continuas representan los puentes disulfuro y en las que X independientemente representa cualquier aminoácidos natural.

Description

Péptidos que tienen un alto contenido en cisteína.

Campo técnico

La presente invención se refiere a péptidos que tienen un alto contenido en cisteína, a secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos, a vectores que comprenden dichas secuencias, así como a preparaciones farmacéuticas que contienen dichos péptidos y al uso de las mismas como productos farmacéuticos.

Técnica anterior

Un microorganismo (bacteria, virus, levadura, etc.) o un agente transferible (toxina, etc.) se consideran patógenos que pueden causar una enfermedad o una infección asintomática de una planta, un animal o un organismo humano. En el sentido más amplio, los insectos o nematodos también se consideran como patógenos capaces de transferir agentes infecciosos a organismos. Los organismos biológicos están provistos de un sistema de defensa complejo y muy eficaz para la protección frente al ataque de patógenos. La función principal de este sistema de defensa e inmunitario, respectivamente, es evitar la invasión de patógenos y destruir a aquellos que ya han invadido el organismo. Con respecto a esto, los animales inferiores también presentan varios agentes de defensa y mecanismos de protección. El sistema inmune de vertebrados es un entramado muy complejo de mecanismos celulares y humorales que incluye la capacidad adicional de ser capaz de formar anticuerpos específicos frente a patógenos individuales y, por tanto, de destruirlos.

Cuando las propias defensas del organismo no son suficientes para destruir al patógeno deben utilizarse medios auxiliares adicionales, como por ejemplo, antibióticos, fungicidas, antivirales y otros agentes. Sin embargo, un problema grave de este control químico de patógenos consiste en el hecho de que las cepas del patógeno se vuelven muy a menudo resistentes a los medios aplicados. Esta adaptación puede superarse temporalmente aumentado las dosis del principio activo pero, a largo plazo, se requerirán siempre nuevos medios químicos y biológicos para combatir a los patógenos.

Los péptidos son compuestos formados por aminoácidos que, dependiendo del número de unidades de aminoácidos que contienen, se denominan di, tri, oligo o polipéptidos. Las proteínas son polipéptidos con una masa molar que excede de 10 kDa. Dentro del marco de la presente invención, el término "péptido" se utiliza para polipéptidos con una masa molar menor de 10 kDa. Proteínas y péptidos, respectivamente, están implicados de forma significativa en prácticamente todos los procesos celulares. Su posición central en los procesos vitales se refleja en que la información genética se expresa, finalmente, en forma de polipéptidos.

Según sus funciones biológicas, las proteínas se denominan enzimas, proteínas de transporte, proteínas estructurales, proteínas de defensa, proteínas contráctiles, proteínas receptoras, etc. En el caso de los péptidos y en una mayoría de las proteínas más pequeñas son más importantes otras funciones biológicas, como el efecto como hormona (por ejemplo, insulina u oxitocina), transmisión de señales a los receptores (por ejemplo, encefalinas), control de la defensa inmunitaria (citoquinas) o defensa no específica (por ejemplo, defensina). Generalmente, muchos péptidos biológicamente muy eficaces se liberan a partir de proteínas precursoras más grandes justo en el sitio de acción. Por tanto, pueden ser óptimamente eficaces.

El uso de péptidos como agentes farmacéuticos es muy limitado a pesar de su elevada eficacia farmacológica, su baja toxicidad y su buena biocompatibilidad. Una barrera básica consiste en que estos péptidos se descomponen muy rápidamente en el organismo y, por tanto, se vuelven ineficaces. Se ha intentado durante mucho tiempo evitar esta rápida metabolización mediante la integración de elementos estructurales resistentes a la hidrólisis como, por ejemplo, D-aminoácidos o mediante algún otro sistema. El problema consiste en el hecho de que la eficacia terapéutica se ve afectada muy fuertemente por estos cambios estructurales.

Las proteínas o péptidos administrados por vía oral se descomponen en el tracto gastrointestinal y, de este modo, se vuelven prácticamente ineficaces. Por tanto, esta ruta de administración es muy problemática en el caso de los productos farmacéuticos peptídicos. Debido a esta razón, los péptidos que son idénticos al organismo, como insulina, eritropoyetina, etc. que se utilizan en terapia, se administran predominantemente (> 90%) sólo por vía parenteral (mediante inyecciones). Otro problema técnico para la aplicación de péptidos más grandes es la preparación de los mismos a escala industrial, que se ha podido resolver satisfactoriamente sólo en muy pocos casos hasta ahora.

En contraste con los propios péptidos del organismo, la aplicación parenteral de polipéptidos extraños tiene que superar una dificultad básica. El sistema inmunitario de todos los organismos superiores forma anticuerpos específicos frente a estos péptidos "no propios" que intentan neutralizar y eliminar, respectivamente, al péptido extraño. Dicha antigenicidad de los péptidos extraños puede suprimirse sólo artificialmente, por ejemplo, mediante inmunosupresores o constructos complicados, por lo que pueden causarse efectos secundarios adicionales. Como el ejemplo más novedoso, puede mencionarse etanercept (proteína anti-receptor del TNF), que se usa en el tratamiento de la artritis reumatoide.

Los polipéptidos extraños son digeridos por las enzimas proteolíticas del organismo. Los segmentos peptídicos más pequeños formados de este modo inducen reacciones frente al antígeno que llevan a la formación de anticuerpos. Los polipéptidos, que son estables con respecto a las enzimas proteolíticas, también deberían mostrar, principalmente, una antigenicidad claramente menor. Pueden usarse sustancias que inhiban de forma eficaz las enzimas proteolíticas en el tratamiento de patologías graves. Estas proteasas ya se han utilizado para el tratamiento de las infecciones por VIH.

Las tioninas son péptidos pequeños muy básicos de origen vegetal, que se caracterizan por un contenido inusualmente alto de cisteína. Las tioninas están compuestas principalmente por 45 a 48 unidades de aminoácidos (Römpp Lexikon der Chemie 9^{a} Edición, Thieme Verlag Stuttgart 1992). La mayoría contienen grupos de 6 u 8 cisteínas, que forman en consecuencia 3 ó 4 puentes disulfuro intramoleculares (-S-S-) y, por tanto, estabilizan adicionalmente la estructura del péptido. Debido a su relativamente bajo peso molecular (aproximadamente 5 kDa) y su estructura excepcionalmente estable, se prevé que las tioninas muestren propiedades farmacológicamente más específicas que, sin embargo, han sido reconocidas y utilizadas sólo en grado mínimo hasta el momento.

En la bibliografía técnica sólo se han descrito hasta el momento aproximadamente 50 tioninas individuales. Las tioninas mejor conocidas son las viscotoxinas del muérdago (Viscum album), las hordotioninas de cebada (Hordeum vulgaris), las purotioninas del trigo (Triticum sativum), las avenotioninas de avena (Avena sativa), las pirulariationinas de la nuez de areca (Pyrularia pubera) y la crambina de Crambus abessinicus (D.E.A. Florack y W.J. Stiekema, Plant. Mol. Biol. 26, 25-37 (1994)).

El efecto fisiológico exacto de las tioninas vegetales no ha podido ser aclarado hasta el momento. En el caso de algunas plantas que producen tioninas, se ha observado que en los casos de infecciones con bacterias u hongos, dichas plantas reaccionan aumentando la expresión de sus tioninas. Por dicha razón, se ha supuesto que las tioninas podrían asumir cierto tipo de función como agente de defensa. En consecuencia, se llevó a cabo la integración de los genes de las tioninas de la avena (Avena sativa) en otras plantas de interés económico que no contenían tioninas con la intención de cultivar nuevos tipos de plantas de interés comercial (por ejemplo, arroz o patata) con un aumento de la resistencia frente a hongos y bacterias (documentos US 5.942.663 y US 6.187.995).

Por ejemplo, mediante la integración de las secuencias génicas de la alfa-tionina de cebada en el genoma de la planta del tabaco, se obtuvo un tipo de tabaco con resistencia frente a Pseudomonas syringae (M.J. Carmona, A. Molina, J.A. Lopez-Fando y F. Garcia-Olmedo, Plant J. 3, 457-462 (1993)). También se describió la inhibición de Phytophora infestans sobre la hoja de patata por las tioninas (A. Molina, P.A. Groy, A. Fraile, R. Sánchez-Monge y F. García-Olmedo, Plant Science 92, 672-679 (1993)).

La integración de los genes que producen tioninas abre la vía para el cultivo de una gran variedad de nuevos tipos de plantas con un claro aumento de la resistencia frente a plagas. Por consiguiente, podría reducirse claramente el uso de pesticidas, que son sumamente contaminantes para los seres humanos y para el medio ambiente. La condición previa esencial para este tipo de uso, además de la elevada eficacia de las tioninas utilizadas, es su preferiblemente baja toxicidad en animales y en seres humanos. La eficacia de una tionina en particular se muestra preferiblemente con respecto a plagas y patógenos específicos, respectivamente, de modo que es necesario encontrar nuevas estructuras de tionina para combatir patógenos posteriores.

Las tioninas se consideran muy a menudo generalmente tóxicas para animales, insectos, bacterias, levaduras y células de mamíferos (D.E.A. Florack y W.J. Stiekema, Plant. Mol. Biol. 26, 25-37 (1994)). Sin embargo, las tioninas individuales tienen una toxicidad que difiere muchísimo entre sí, lo que depende tanto de la estructura de las tioninas como del procedimiento preciso de administración. La viscotoxina B, por ejemplo, muestra una toxicidad baja, aunque su estructura sólo difiere en 4 posiciones de aminoácidos de la secuencia de la viscotoxina A-1, claramente más tóxica. El efecto tóxico de las diferentes tioninas se explica, en general, por la permeabilización de la membrana citosólica a los iones alcalinos y la necrosis de las células causada de este modo. Se ha investigado en detalle el mecanismo de acción a nivel celular de algunos casos como, por ejemplo, la formación de canales iónicos de membrana por las tioninas de Pyrularia (Hughes P. y col. J. Biol. Chem. (2000) 275, 823-827). Sin embargo, en un estudio realizado recientemente se ha demostrado que las viscotoxinas son tóxicas en linfocitos humanos mientras las purotioninas de trigo no muestran efecto tóxico sobre los mismos linfocitos (Büssing A. y col. Eur. J. Biochem. (1999) 262,
79-87).

En la mayoría de los tipos de maíz utilizados para nutrición están presentes cantidades considerables de tioninas; también están contenidas en numerosos alimentos y artículos comestibles. Se encontró que la toxicidad oral de estas tioninas, en la mayoría de los casos, no era significativa en humanos y animales probablemente debido a la descomposición de la tioninas en el tracto gastrointestinal y a la descomposición térmica en el horno.

Hasta ahora, no se ha descrito en la bibliografía técnica ningún uso terapéutico directo en humanos de una tionina como sustancia pura o de una mezcla estandarizada de tioninas puras.

Es sabido que algunas preparaciones de muérdago (Viscum album), que se han utilizado durante una considerable cantidad de tiempo en el tratamiento auxiliar del cáncer, contienen pequeñas cantidades de tioninas, que se denominan viscotoxinas. Sin embargo, con respecto a la eficacia oncológica de estas viscotoxinas no existe un conocimiento actual fiable. Incluso algunos autores sugieren explícitamente que las viscotoxinas no son relevantes para la eficacia terapéutica de las preparaciones de muérdago (documento US 5.547.674) en el tratamiento del cáncer.

Por esta razón, las preparaciones de muérdago disponibles en el mercado no están estandarizadas con respecto a su contenido en viscotoxina. Su concentración real de viscotoxinas es variable aunque es inferior al límite de 1 \mug/ml en todos los casos. Por tanto, según la dosis normal de 2 a 4 ml de solución de extracto de muérdago inyectada, un paciente recibe un máximo de 0,004 mg de viscotoxina al día. La toxicidad de las viscotoxinas determinada para mamíferos de DL_{50} = 0,1 a 1 mg/kg puede no causar ningún efecto citotóxico destacable que pudiera causar la muerte de las células tumorales en lo que respecta a un ser humano maduro (peso corporal de 70 kg).

En la bibliografía técnica, la eficacia oncológica de las preparaciones de muérdago se atribuye predominantemente a las lectinas (proteínas que se unen a azúcar) contenidas en el extracto (documento DE 4.221.836). Estas lectinas de muérdago muestran un efecto inmunoestimulante a bajas dosis (1 ng/kg), lo cual se ha confirmado in vitro varias veces (documento EP-A-0.602.696). Como resultado, se ha estandarizado el contenido de lectinas de muérdago de varias preparaciones de muérdago comercializadas. Sin embargo, la eficacia terapéutica in vivo de las lectinas de muérdago aisladas y puras en el tratamiento del cáncer no ha podido confirmarse. Por tanto, varios autores sugieran una influencia de los polisacáridos del muérdago o de otros componentes de los extractos de muérdago que aún no han sido identificados (J.R. Ochocka y A. Piotrowski, Can. J. Plant. Pathol. 24, 21-28 (2002)).

Recientemente, se ha propuesto el uso del efecto inmunoestimulante de la tionina de Pyrularia, observado a bajas concentraciones para el control de tumores (documento WO 02/22159). El documento WO 02/22159 también describe el uso de la tionina en combinación con la fuertemente estimulante IL-2. En este contexto, debe apreciarse que, debido a una inmunoestimulación fuerte, pero no específica, el crecimiento de las células cancerígenas normalmente también aumenta y según la experiencia, incluso más que el crecimiento de las células normales.

La publicación de F. Garcia-Olmedo y col. "Plant defense Peptides", Biopolymers, vol. 47, páginas 479-491 describe, entre otras, las tioninas como péptidos antimicrobianos que tienen una estructura compacta estabilizada mediante 2 a 6 puentes disulfuro. Los autores proporcionan ilustraciones detalladas con respecto a la estructura espacial de las tioninas y sus características biológicas.

Las tioninas que tienen un efecto tóxico significativamente mayor sobre las células cancerígenas que sobre las células normales serían muy adecuadas para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, puede que estas tioninas no hayan sido identificadas hasta el momento. Se ha propuesto (documento WO 96/41608) la unión de una tionina de Pyrularia a un anticuerpo anti-CD5^{+} en particular que están dirigidos específicamente frente a células cancerígenas. A continuación, dicho complejo se usaría para el control selectivo de las células cancerígenas.

El término cáncer no hace referencia a una enfermedad específica sino que es un término genérico para más de 200 formas diferentes de enfermedades malignas. Prácticamente cada tejido puede producir degeneraciones similares al cáncer, algunas veces incluso de varios tipos diferentes. A pesar de esta variedad, todos los tumores están causados, obviamente, por la degeneración de procesos básicos similares.

Los tratamientos establecidos para el cáncer intentan revertir las características básicas de la enfermedad, en concreto el crecimiento, la invasión y la metástasis. En el tratamiento del cáncer, los agentes quimioterapéuticos son medios muy importantes que se utilizan junto con la cirugía y la radiación. Los tumores especialmente malignos (cáncer de testículo) pueden tratarse de forma eficaz con citostáticos. Desafortunadamente, los tumores malignos más frecuentes (cáncer de mama, pulmón y próstata, así como de colon) no pueden curarse mediante la quimioterapia. Si no puede detenerse el desarrollo del tumor, las células cancerígenas se vuelven más y más agresivas y empiezan a extenderse tras una fase determinada (metástasis) y dañan órganos vitales hasta que estos pierden su funcionalidad causando, de este modo, la muerte de los pacientes.

Una desventaja fundamental de los tratamientos citotóxicos frente al cáncer que actúan de forma no selectiva consiste en que también matan a numerosos células sanas. Además, en caso de que se usen, deben tenerse en cuenta sus efectos secundarios graves. Otra desventaja de las quimioterapias actuales es que las células tumorales desarrollan resistencias frente a los citostáticos utilizados durante el tratamiento. Esto requiere un aumento constante de la tasa de dosis aplicada, lo que está simultáneamente unido a un aumento de los efectos secundarios tóxicos, o el uso de una mezcla de varios citostáticos.

El SIDA es un síndrome complejo causado por un daño crónico de los linfocitos T4 y de otras células inmunes y es debido a una infección por el retrovirus VIH. La deficiencia inmune común denominada SIDA sólo aparece una vez que el sistema inmunitario ha perdido la batalla contra la infección En la fase de SIDA, el paciente no tiene ninguna defensa inmune frente a diversas infecciones principalmente menores y muere como consecuencia de estas enfermedades.

Durante la búsqueda de factores que participan en la regulación de los procesos inmunitarios celulares y humorales se han descubierto recientemente, además de los polipéptidos, la nueva clase de los derivados del subóxido de carbono (documentos DE 196 00 301 y EP 0874 851). Estos compuestos naturales derivados de subóxido de carbono inorgánico C_{3}O_{2} sorprendentemente muestran, inter alia, una interacción específica con determinadas proteínas de importancia inmunológica, como las inmunoglobulinas (Ig) o los receptores de Fc. Adicionalmente, se ha encontrado que estos derivados del subóxido de carbono son capaces de influir significativamente sobre las propiedades farmacológicas o toxicológicas de los péptidos descritos en este documento así como sobre otros péptidos que tienen un alto contenido en cisteínas.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar péptidos de apoyo a las defensas inmunitarias naturales de plantas y animales o de organismos humanos para combatir a bacterias, hongos, virus u otros patógenos. Este objeto se consigue según la invención mediante los péptidos que contienen cisteína según la reivindicación independiente 1, mediante la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación independiente 4, mediante el vector de ADN según la reivindicación independiente 9, mediante la preparación farmacéutica según las reivindicación independiente 15 y mediante el procedimiento según la reivindicaciones independientes 18, 20 y 22. Otros aspectos ventajosos, detalles y realizaciones de la invención son el resultado de las reivindicaciones dependientes, la descripción y los dibujos.

La estructura de los péptidos según la invención se muestra en el código de una letra de los aminoácidos como sigue, en concreto: A: alanina, C: cisteína, D: ácido aspártico, E: ácido glutámico, F: fenilalanina, G: glicina, H: histidina, I: isoleucina, K: lisina, L: leucina, M: metionina, N: asparragina, P: prolina, Q: glutamina, R: arginina, S: serina, T: treonina, V: valina, W: triptófano e Y: tirosina.

Las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de los péptidos se definen significativamente mediante el tipo de cadenas laterales de los aminoácidos que componen los respectivos péptidos. En este contexto, los aminoácidos naturales pueden dividirse en grupos, siendo el criterio de clasificación el tipo de cadena lateral. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas con grupo hidroxilo son serina y treonina. Los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano. Los aminoácidos con cadenas laterales básicas son lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos con cadenas laterales con grupos ácidos son ácido aspártico y ácido glutámico. Los aminoácidos con cadenas laterales amida son asparragina y glutamina. Los aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. El aminoácido prolina tiene un grupo amino secundario y no puede clasificarse dentro de ninguna de las clases mencionadas. Una significación especial consiste en que la estructura tridimensional y, por tanto, también la eficacia biológica se ven influenciadas por la formación de los derivados éster de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo. Preferiblemente, el éster puede formarse con ácido fosfórico. Esta derivatización puede realizarse mediante síntesis química o enzimáticamente mediante las enzimas denominadas fosfocinasas.

La presente invención se refiere a péptidos que contienen cisteína con la estructura XXCCXXXXXXXCXXXCXX
XXXXQXXCXXXCXCXXXXXXXCXXXXXX; la estructura XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXCXXXC
XCXXXXTXXCXXXXXX y la estructura XXCCXXXXXXXCXXXCXXXXXXXXXXCXXXCXCXXXX-XXXX
CXXXXXX; en las que que X representa un carácter de sustitución. Cada X puede seleccionarse independientemente una de otra y representa cualquiera de los aminoácidos naturales mencionados anteriormente.

Además de los L-aminoácidos normales, también se incluyen entre los aminoácidos naturales los D-aminoácidos y derivados de aminoácidos como, por ejemplo, 4-hidroxiprolina, N,N,N-trimetillisina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, O-fosfoserina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N-acetillisina, \omega-N-metilarginina, citrulina u ornitina.

Los puentes disulfuro se forman, preferiblemente, entre las cisteínas mostradas a continuación, lo que lleva a las siguientes estructuras preferidas.

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La presente invención se refiere a péptidos que contienen cisteína que tienen la siguiente estructura:

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que apoyan las defensas inmunitarias naturales de las plantas y animales u organismos humanos para combatir bacterias, hongos, virus u otros patógenos, en las que las líneas continuas representan los puentes disulfuro y donde cada X independientemente una de otra representa cualquier aminoácidos natural.

Adicionalmente, se prefieren los siguientes péptidos de estructura 1, en los que el aminoácido G se localiza en la posición 15 y/o el aminoácido T se localiza en la posición 19 y/o el aminoácido Q se localiza en la posición 27 y/o el aminoácido R se localiza en la posición 28 y/o el aminoácido H se localiza en la posición 34 y/o el aminoácido T se localiza en la posición 38 y/o el aminoácido S se localiza en la posición 43 y/o el aminoácido H se localiza en la posición 44 y/o el aminoácido S se localiza en la posición 46.

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Adicionalmente, se prefieren los siguientes péptidos de estructura 2, en los que se presentan las siguientes combinaciones de aminoácidos:

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Adicionalmente, se prefieren los siguientes péptidos de estructura 1, en los que están presentes las siguientes combinaciones de aminoácidos:

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Los péptidos que contienen cisteína más preferidos son los que tienen las siguientes estructuras

KSCCRNTLGRNCYNGCRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS	(helletionina A),

KSCCRNTLGRNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS	(helletionina B1),

KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS	(helletionina B2),

KSCCRNTLGRNCYNACRLPGTPQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR	(helletionina B3),

KSCCRNTLARNCYNACRFTGTSQPYCARLCDCIHVTTPTCPSSHPR	(helletionina B4),

KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR	(helletionina B5),

KSCCRNTLARNCYNVCRFGGGSQAYCARFCDCIHVTTSTCPSSHPS	(helletionina B6),

KSCCRNTLGRNCYNACRLTGTSQATCATLCDCIHVTATTCRPPYPS	(helletionina C),

KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGILCDCIHVTTTTCPSSHPS	(helletionina D),

KSCCRNTLGRNCYAACRLTGLFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS	(helletionina E1),

KSCCRNTLGRNCYAACRLTGTFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS	(helletionina E2)

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Adicionalmente, se prefieren especialmente los derivados de las helletioninas mencionadas anteriormente, es decir, derivados de helletionina A, helletionina B1, helletionina B2, helletionina B3, helletionina B4, helletionina B5, helletionina B6, helletionina C, helletionina D y helletionina E1, en el que los siguientes aminoácidos (AA inicial) han sido sustituidos por los aminoácidos (AA de sustitución) enumerados en la segunda columna:

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Además, también es posible el uso de peptidomiméticos. Dichos peptidomiméticos con sustancias químicas que imitan a uno de los péptidos mencionados anteriormente.

La presente invención también comprende derivados éster, derivados amida, sales derivadas, derivados cíclicos y derivados con un esqueleto modificada de los péptidos mencionados.

Los aminoácidos con grupos carboxilato pueden convertirse, por ejemplo, en sales o en un éster, preferiblemente un éster C_{1}-C_{16} o en una amida, opcionalmente con uno o dos restos alquilo, preferiblemente con restos alquilo C_{1}-C_{16}. Los grupos hidroxilo, por ejemplo de tirosina o serina, pueden convertirse en un éster o éter. Adicionalmente, también es posible la formación de acetales, cetales o carbonatos. Preferiblemente, estos restos están compuestos de 1 a 16 átomos de carbono. Adicionalmente, pueden utilizarse todos los demás grupos OH protegidos. Los restos alquilo usados de los grupos protegidos pueden llevar además sustituyen, por ejemplo, halógenos, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos carbonilo, grupos tioles, grupos arilo, cadenas laterales alquilo, grupos carboxilo, grupos nitro, grupos amida y/o grupos ésteres.

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Dentro el alcance de la presente invención, se prefieren más los siguientes compuestos peptídicos que contienen cisteína: helletionina A, helletionina B1, helletionina B2, helletionina B3, helletionina B4, helletionina B5, helletionina B6, helletionina C, helletionina D, helletionina E1 y helletionina E2 así como los derivados de estos compuestos peptídicos que contienen cisteína con variaciones de aminoácidos hasta en 15 posiciones del compuesto peptídico que contiene cisteína respectivamente hasta en 15 posiciones de los derivados de estos compuestos peptídicos que contienen cisteína, mientras que el aminoácido cisteína no se somete a variación con respecto a su posición y tipo. Se prefiere especialmente que las variaciones de aminoácidos tengan lugar en hasta 13 posiciones, hasta 11 posiciones, hasta 9 posiciones, hasta 7 posiciones, hasta 5 posiciones, hasta 4 posiciones, hasta 3 posiciones, hasta 2 posiciones o, respectivamente sólo en una posición de los compuestos peptídicos o, respectivamente, de los derivados de los compuestos peptídicos.

Se prefiere especialmente que los compuestos peptídicos que contienen cisteína helletionina A, helletionina B1, helletionina B2, helletionina B3, helletionina B4, helletionina B5, helletionina B6, helletionina C, helletionina D, helletionina E1 y helletionina E2, así como derivados de estos compuestos peptídicos que contienen cisteína incluyan una de las cantidades de variaciones de aminoácidos mencionadas anteriormente y que, simultáneamente, el aminoácido K se localice en la posición 1 y/o el aminoácido S se localice en la posición 2 y/o el aminoácido R se localice en la posición 5 y/o el aminoácido N se localice en la posición 6 y/o el aminoácido T se localice en la posición 7 y/o el aminoácido L se localice en la posición 8 y/o el aminoácido R se localice en la posición 10 y/o el aminoácido N se localice en la posición 11 y/o el aminoácido Y se localice en la posición 13 y/o el aminoácidos R se localice en la posición 17 y/o el aminoácido G se localice en la posición 20.

Las realizaciones especialmente preferidas de la presente invención se refieren a péptidos que contienen cisteína de las estructuras generales mencionadas, en las que los aminoácidos se localizan en posiciones particulares del péptido, que se seleccionan entre un grupo en particular de aminoácidos definidos anteriormente. Se prefieren los péptidos, en los que un aminoácido con cadena lateral básica se localiza en la posición 1 y/o un aminoácido con la cadena lateral alifática con grupo hidroxilo se localiza en la posición 2 y/o un aminoácido con cadena lateral básica se localiza en la posición 5 y/o un aminoácido con una cadena lateral amida se localiza en la posición 6 y/o un aminoácido con cadena lateral alifática con grupo hidroxilo se localiza en la posición 7 y/o un aminoácido con cadena lateral alifática se localiza en la posición 8 y/o un aminoácido con cadena lateral básica se localiza en la posición 10 y/o un aminoácido con cadena lateral amida se localiza en la posición 11 y/o un aminoácido con cadena lateral aromática se localiza en la posición 13 y/o un aminoácido con cadena lateral básica se localiza en la posición 17 y/o un aminoácido con cadena lateral alifática se localiza en la posición 20.

Evidentemente, la presente invención también comprende péptidos de las estructuras generales mencionadas que portan modificaciones funcionales en uno o en ambos de sus extremos. En particular, también comprende péptidos que tienen cadenas más largas, es decir, péptidos, cuya cadena de aminoácidos excede de las estructuras generales mencionadas. Por tanto, en estos casos los péptidos según la invención representan sólo una sección de un péptido mayor. La funcionalidad de los péptidos según la invención, es decir, su eficacia, puede no estar influenciada significativamente por estas modificaciones funcionales.

A partir de las estructuras 1 y 2 según la invención, entre estos péptidos están comprendidos aquellos que portan cualquier grupo funcional antes de la K en la posición 1 y/o las K de las posiciones 46 y 47, respectivamente, o están provistos con aún otra cadena oligopeptídica con hasta 50 aminoácidos, preferiblemente hasta 30 aminoácidos, más preferiblemente con hasta 15 aminoácidos y, lo más preferible, con hasta 7 aminoácidos.

Además, la presente invención se refiere a las secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos que contienen cisteína mencionados y también a las correspondientes secuencias de ARN y las correspondientes secuencias de ADN, así como el correspondiente ADN complementario y el correspondiente ARN complementario. La presente invención también comprende vectores de ADN y constructos de ADN que contienen un ADNc o ADN correspondiente a un péptido según la invención, así como un promotor adecuado y un potenciador adecuado, si es necesario.

Además, también están comprendidos los anticuerpos monoclonales que se dirigen frente a un epítopo de los péptidos que contienen cisteína mencionados.

Los péptidos que tienen un alto contenido en cisteína según la invención están compuestos de 46 o, respectivamente, de 48 aminoácidos. Las posiciones se calculan a partir del extremo NH_{2} libre de la cadena de aminoácidos.

A partir de las helletioninas mencionadas anteriormente, se aislaron individualmente los péptidos denominados helletionina A (HT-A), helletionina C (HT-C) y helletionina D (HT-D) mediante los procedimientos que se describen a continuación. En el caso de helletionina B y de helletionina E, se presenta una mezcla de varias isoformas, en la que se han caracterizado las secuencias de aminoácidos de seis isoformas (HT-B1, HT-B2, HT-B3, HT-B4, HT-B5 y HT-B6) o, respectivamente, de dos isoformas (HT-E1 y HT-E2). Los péptidos según la invención pueden usarse como sustancias puras, como mezcla de isoformas o como mezcla de isoformas junto con una o más helletioninas diferentes, preferiblemente como una mezcla de varias helletioninas.

La secuencia de aminoácidos de los péptidos aislados o producidos sintéticamente según la invención se determinó mediante degradación sucesiva de la cadena peptídica según el procedimiento de Edman y la posterior identificación por HPLC de los derivados PTH (feniltiohidantoina). No fue posible realizar directamente la fragmentación enzimática de los péptidos aplicados normalmente a este procedimiento debido al aumento de su estabilidad enzimática. Por esta razón, fue necesaria la reducción o la apertura respectiva de los puentes disulfuro, lo cual se realizado mediante la reacción con vinilpiridina.

Se realizó otra confirmación de la composición de aminoácidos de los péptidos según la invención mediante la determinación de sus masas molares. Con este fin, se utilizó la espectrometría de masas con las técnicas ESI (ionización por electropulverización) y MALDI (desorción/ionización mediante láser asistida por matriz).

En la figura 1 se muestra la estructura tridimensional del péptido HT-D determinada por espectroscopia RMN. La estructura total es similar a la forma de la letra griega gamma mayúscula (\Gamma). El brazo largo de esta analogía de estructura está formado por las dos hélices opuestas, mientras que el brazo corto está compuesto por la lámina beta corta. Ambas hélices están conectadas a través de un lazo entre los aminoácidos de las posiciones 17 y 24.

La contribución especial a la estabilidad de los péptidos según la invención está garantizada por el total de los cuatro puentes disulfuro entre las unidades de cisteína en las posiciones 3-40 (o respectivamente 42), 4-32, 12-30 (o respectivamente 31) y 16-26 (o respectivamente 27). La extraordinaria estabilidad con respecto a enzimas proteolíticos y de otros tipos obtenida de este modo es una propiedad específica de gran importancia para el uso de los péptidos descritos en este documento.

Los péptidos preferidos en el alcance de la presente invención se caracterizan por una constancia asombrosamente alta en sus secuencias de aminoácidos. Dicha constancia está relacionada con 36 posiciones, por tanto, aproximadamente los 3/4 de la cadena completa. Las variaciones en la composición de la cadena polipeptídica se limitan principalmente a 15 o incluso menos posiciones.

Las posiciones de los restos de cisteína, que se localizan en los péptidos según la invención en las posiciones 3, 4, 12, 16, 26 o respectivamente 27, 30 o respectivamente 31, 32 y 40 o, respectivamente 42 son especialmente constantes. En las secuencias referidas como HT-E1 y HT-E2, cada una de las tres últimas unidades de cisteína se desplazan una (27 en lugar de 26) (31 en lugar de 30) o dos posiciones (42 en lugar de 40). Las unidades de cisteína se conectan por pares mediante puentes disulfuro. A partir del mayor número de combinaciones posibles de unidades de cisteína en los péptidos según la invención, se forman preferiblemente las conexiones 3 \rightarrow 40 (o respectivamente 42), 4 \rightarrow 32, 12 \rightarrow 30 (o respectivamente 31) y 16 \rightarrow 26 (o respectivamente 27) definiendo, por tanto, una particular estructura secundaria en los péptidos según la invención.

El uso de los péptidos según la invención proporciona varias ventajas cuando se compara con las tioninas con 3 puentes disulfuro conocidas hasta el momento. En primer lugar, debido a la presencia del puente de cisteína adicional, los péptidos según la invención tienen una mejor estabilidad cuando se compara con respecto a las enzimas proteolíticas y, en consecuencia, muestran una inmunogenicidad menor que, por ejemplo, las viscotoxinas ya mencionadas. Otra ventaja de los péptidos según la invención consiste en su sorprendente buena hidrosolubilidad y la mejor biodisponibilidad alcanzada de este modo. Este ventaja es especialmente clara al comparar con las tioninas con 4 puentes disulfuro conocidas hasta ahora. Los péptidos de tionina descritos previamente con 4 puentes disulfuro como, por ejemplo, purotioninas, avenotioninas u hordotioninas son muy básicas y muy lipófilas y, por tanto, sólo escasamente hidrosolubles. Se extraen de las correspondientes semillas de cereales mediante solventes no polares como el éter de petróleo. Por tanto, es difícil obtener soluciones acuosas de estos péptidos y son difíciles de usar.

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Aislamiento y preparación de los péptidos según la invención

La presente invención también comprende procedimientos para obtener los péptidos que contienen cisteína según la invención. Este procedimiento según la invención está representado por la extracción a partir de la especie vegetal Helleborus. Se prefiere especialmente en este caso, como primer paso del procedimiento, la reducción de la cantidad de lípidos del material vegetal usando solventes no polares, o mezclas de solventes no polares, usando especialmente metil terc-butil éter. El aislamiento de los péptidos de la invención que tienen un alto contenido en cisteína o de mezclas de los péptidos según la invención se realiza a partir de plantas de la familia Ranunculaceae (la familia del ranúnculo) y, preferiblemente, de plantas del género Helleborus (rosa de navidad). Para el aislamiento se utiliza material vegetal secado al aire, preferiblemente de las partes subterráneas de la planta (raíces y rizomas). En primer lugar, la reducción de la cantidad de lípidos preferida del material vegetal se realiza con un solvente no polar, preferiblemente BTM (metil terc-butil éter). Posteriormente, las raíces con un contenido en lípidos reducido y secas al aire se extraen con mezclas de alcohol/ácido orgánicos, preferiblemente metanol/ácido fórmico, o con mezclas de solventes que contiene agua, preferiblemente agua/etanol, respectivamente con ácidos diluidos, preferiblemente ácido acético al 0,1-12%.

La solución de extracción filtrada se reduce a vacío hasta un volumen 1/10 del inicial y, a continuación, se trata con un material de adsorción, preferiblemente carbono activo. El filtrado se reduce a vacío y el residuo seco se disuelve de nuevo en una cantidad mínima de agua. El valor de pH de la solución acuosa se ajusta en la región ácida, preferiblemente a pH 0,1-3,0, añadiendo ácido clorhídrico diluido. La solución acuosa se mezcla con un múltiplo de volumen, preferiblemente diez veces, de un solvente orgánico o mezcla de solventes en frío, preferiblemente etanol/acetona 1:3. El precipitado amarillento que se forma se recoge por filtración, se seca a vacío y se usa para el procedimiento adicional de purificación.

Un procedimiento alternativo para la extracción de los péptidos según la invención se lleva a cabo utilizando su interacción selectiva con resinas de intercambio iónico, preferiblemente con intercambiadores iónicos ligeramente ácidos. Los péptidos unidos a la resina se eluyen mediante un tratamiento con soluciones fuertemente iónicas, preferiblemente HCl o NaCl.

El aislamiento de los péptidos según la invención también puede realizarse mediante la interacción selectiva con fases sólidas especiales, preferiblemente a fase sólidas que permiten un aislamiento especialmente selectivo a través de la interacción antígeno-anticuerpo o interacciones altamente específicas similares.

Otro procedimiento para obtener los péptidos según la invención consiste en la separación de sus mezclas originales mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en escala preparativa. Se usan como eluyentes mezclas con un gradiente lineal de acetonitrilo/agua. Se establece un pH de entre 1 y 1,5 mediante la adición de un ácido fuerte, preferiblemente ácido trifluoroacético.

Además, la presente invención se refiere también a procedimientos para la generación sintética de los péptidos que contienen cisteína según la invención y a derivados funcionales de estos péptidos mediante síntesis peptídica. La generación por síntesis de los péptidos según la invención se realiza escalonadamente uniendo las unidades individuales de aminoácidos. Por tanto, se utilizan procedimientos automáticos de síntesis peptídica, en los que se prefieren procedimientos en fase sólida y procedimientos en fase líquida. Los procedimientos se describen en detalle en M. Bodanszky. Principles of Peptide Síntesis (B.M. Trost Edit.) Springer Verlag 1994.

Además, la presente invención comprende la preparación de los péptidos que contienen cisteína según la invención mediante procedimientos del campo de la ingeniería genética. La integración de genes de los péptidos según la invención en el material genético de una planta, preferiblemente de los tipos para cultivo que tienen un elevado rendimiento proteico, es el procedimiento de preparación preferido derivado del campo de la ingeniería genética. Una realización especialmente preferida en este contexto es la sustitución de los genes de tionina de un cultivo que produce tionina por los genes de tionina de la especie Helleborus.

Los péptidos según la invención también pueden prepararse mediante la expresión transgénica de las secuencias de ADNc. Los segmentos de ADN identificados (como clones de ADNc, clones de ADN genómico o segmentos de ADN preparados para la síntesis de oligonucleótidos) pueden expresarse en un sistema biológico. Los sistemas biológicos preferidos para la expresión de los péptidos que contienen cisteína según la invención son cultivos de determinados microorganismos fácilmente disponibles como Escherichia coli, Pseudomonas o levaduras.

Los cultivos de células vegetales, dentro de las cuales están integradas las secuencias génicas que codifican los péptidos según la invención, también proporcionan buenos resultados para la preparación de los péptidos según la invención. Se usan procedimientos conocidos para la transformación de las células vegetales utilizadas. Preferiblemente, se usan plásmidos Ti de Agrobacterium, electroporación o microinyección. Las células vegetales genéticamente alteradas también pueden regenerarse como plantas, en las que las secuencias génicas que codifican los péptidos según la invención permanecen integradas de forma estable en el genoma.

Puede realizarse modificaciones químicas especiales de los péptidos, mediante los cuales se logra un aumento de la biodisponibilidad para que los péptidos según la invención se usen en el campo farmacéutico. Por tanto, la invención también se refiere a la modificación química de los péptidos según la invención mediante su transformación en un compuesto macrocíclico, preferiblemente formando un enlace adicional entre los dos aminoácidos al inicio y al final o en las proximidades de ambos extremos de la cadena peptídica. El péptido macrocíclico sintetizado tiene propiedades fisiológicas ventajosas, especialmente un aumento de la estabilidad con respecto a enzimas proteolíticas y de otro tipo. Para la preparación de los compuestos cíclicos se utilizan reactivos convencionales como carbodiimidas, especialmente 1-etil-3-(e-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC).

Dentro del marco de la presente invención, las helletioninas también pueden modificarse mediante la sustitución directa de una o más unidades de aminoácidos por un aminoácido natural o sintético, preferiblemente por un aminoácido aromático como tirosina. Esta modificación de la secuencia de aminoácidos puede realizarse mediante mutaciones dirigidas del segmento génico que expresa una secuencia de ADN del péptido según la invención. En este contexto, se usa preferiblemente el procedimientos ISP (incorporación selectiva de presión) (C. Minks y col., en Tetrahedron, 56 (2000) 9431-9442).

También es parte de la presente invención un derivado, que puede generarse mediante la conversión química menor de uno o más unidades de aminoácidos de las helletioninas. Esta derivatización conduce a un cambio dirigido de las propiedades terapéuticas de los péptidos. Se prefiere la conversión de los aminoácidos que contienen grupos hidroxilo, como treonina o tirosina, en derivados éster o derivados halogenados. La conversión de los aminoácidos que contienen restos COOH libres en derivados éster o derivados amida también forma parte de la presente invención. La alquilación, preferiblemente metilación, de los grupos amino libres o de otros grupos funcionales conduce a una mejor biodisponibilidad y también forma parte de la presente invención.

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Uso de los péptidos

Los péptidos que contienen cisteína según la invención, las mezclas de estos péptidos que contienen cisteína y los derivados funcionales de estos péptidos pueden usarse en el tratamiento de enfermedades, especialmente en el tratamiento de enfermedades causadas por patógenos.

Además, los péptidos que contienen cisteína según la invención, las mezclas de estos péptidos que contienen cisteína y los derivados funcionales de estos péptidos pueden usarse en el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias, hongos o virus.

Los péptidos que contienen cisteína según la invención, las mezclas de estos péptidos que contienen cisteína y los derivados funcionales de estos péptidos pueden usarse en el tratamiento de enfermedades de seres humanos y animales, especialmente en el caso de animales grandes, preferiblemente caballos.

Es especialmente ventajoso el uso de los péptidos que contienen cisteína según la invención, mezclas de estos péptidos que contienen cisteína y derivados funcionales de estos péptidos para el tratamiento de enfermedades que pueden estar causadas por una biorregulación defectuosa del sistema inmunitario o que van acompañadas de una biorregulación defectuosa del sistema inmunitario.

Además, los péptidos que contienen cisteína según la invención, las mezclas de estos péptidos que contienen cisteína y los derivados funcionales de estos péptidos pueden usarse con especial eficacia en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en el tratamiento del cáncer y en el tratamiento del SIDA.

Aparte, la presente invención comprende composiciones farmacéuticas, que contienen uno o más péptidos que contienen cisteína según la invención y/o derivados funcionales de estos péptidos. Se prefieren especialmente las composiciones farmacéuticas que adicionalmente contienen al menos un derivado de subóxido de carbono.

Dentro del marco de la presente invención, la expresión "derivados de subóxido de carbono" se refiere a sustancias naturales que derivan del subóxido de carbono inorgánico C_{3}O_{2}, como los que se describen en los documentos DE 196 00 301, EP 0 874 851 B1 y en Kerek y col., Biochim. Biophys. Acta 1567, 213-220 (2002) En este contexto, las descripciones de los documentos DE 196 00 301 y EP 0 874 851 B1 se incorporan a la presente invención por referencia. Por tanto, si se menciona un "derivado de subóxido de carbono" dentro del marco de la presente invención, dicha expresión comprende todos los compuestos químicos descritos en el documento DE 196 00 301. La preparación y caracterización de los derivados de subóxido de carbono también se describen en los documentos DE 196.00.301 y EP 0.874.851 B1.

Por tanto, la presente invención se refiere especialmente también a preparaciones de combinación de al menos uno de los compuestos según la invención y de al menos un derivado de subóxido de carbono como se describe anteriormente y en los documentos DE 196.00.301, EP.0.874.851 B1 y en Kerek y col., Biochim. Biophys. Acta 1567, 213-220 (2002).

La presente invención también comprende los péptidos que contienen cisteína según la invención, las mezclas de estos péptidos que contienen cisteína, los derivados funcionales de estos péptidos y/o sales farmacéuticamente aceptables de estos péptidos que contienen cisteína para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades, especialmente para el tratamiento de enfermedades causadas por patógenos.

En este contexto, la preparación de una composición farmacéutica es especialmente ventajosa con respecto a la profilaxis y/o tratamiento del cáncer, como de melanoma coroidal, leucemia aguda, neurinoma del acústico, carcinoma ampular, carcinoma anal, astrocitoma, carcinoma basocelular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, carcinoma bronquial, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, cáncer del cuerpo del útero, síndrome de COD, cáncer de intestino grueso, cáncer de intestino delgado, tumores del intestino delgado, cáncer de ovario, carcinoma de endometrio, ependimoma, cánceres epiteliales, tumores de Ewing, cánceres gastrointestinales, cáncer de vesícula biliar, cáncer uterino, cáncer de cuello de útero, gioblastoma, cánceres ginecológicos, tumores de oído, nariz y garganta, neoplasias hematológicas, cáncer de células pilosas, cáncer de uretra, cáncer de piel, tumores encefálicos (gliomas), metástasis encefálicas, cáncer de testículo, cáncer de ganglio linfático (Hodgkin/No Hodgkin), tumor de hipófisis, carcinoides, sarcoma de Kaposi, cáncer de laringe, tumor de células germinales, osteosarcoma, carcinoma colorrectal, tumores de cabeza y cuello, cánceres de cabeza y cuello, carcinoma de colon, craniofaringiomas, cáncer en el área de la boca y del labio, cáncer del sistema nervioso central, hepatoma, metástasis hepáticas, leucemia, tumor en el párpado, cáncer de pulmón, linfomas, cáncer de estómago, melanoma maligno, carcinoma de mama, cáncer rectal, meduloblastomas, melanoma, meningiomas, enfermedad de Hodgkin, fungoides micosis, cáncer de nariz, neurinoma, cáncer de riñón, linfomas no Hodgkin, oligodendroglioma, carcinoma de esófago, osteosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma en el pene, plasmacitoma, carcinoma de próstata, cáncer de garganta, carcinoma rectal, retinoblastoma, cáncer de vagina, carcinoma de tiroides, cáncer de pulmón de Schneeberg, cáncer de esófago, carcinoma espinocelular, linfoma de células T (micosis fungoides), timoma, carcinoma de la trompa de Falopio, tumores oculares, tumores urológicos, carcinoma urotelial, carcinoma de vulva, aparición de verrugas, tumores de tejidos blandos, tumor de Wilm y cáncer de lengua.

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Preferiblemente, el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de colon, cáncer de estomago, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, glioblastomas, cáncer de próstata, cáncer de testículo, leucemia, hepatoma, cáncer de riñón y tipos epiteliales de cáncer.

Las preparaciones de combinación de al menos uno de los compuestos mencionados anteriores según la invención junto con un agente citostático son otra materia de la invención. Los posibles agentes citostáticos incluyen agentes alquilantes, antibióticos con propiedades citostáticas, agentes antimetabólicos, alcaloides, podofilotoxinas, compuestos que contiene platino, taxanos, agentes citostáticos y anticuerpos monoclonales. Ejemplos de estas clases de compuestos incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, temozolomida, clorambucil, melfalán, busulfán, treosulfán, tiotepa, estramustina, nimustina, carmustina, lomustina, dacarbazina, procarbazina, adriamicina (doxorrubicina), epirubicina (4-epi-adriamicina), idarrubicina, actinomicina D, daunorrubicina, bleomicina, dactinomicina, mitomicina C, mitoxantrona, metotrexato, 5-fluorouracilo, capecitabina, citosina arabinósido, tioguanina, mercaptopurina, fludarabina, cladribina, gemcitabina, vincristina, vinblastina, vindesina, etopósido, tenipósido, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, paclitaxel, docetaxel, hidroxicarbamida (hidroxiurea), imatinib, miltefosina, amsacrina, topotecán (inhibidor de la topoisomerasa I), pentostatina, bexaroteno, tretinoina, asparraginasa, trastuzumab (Herceptin®), alemtuzumab (MabCampath®) y rituximab (MabThera®).

La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas, que contienen uno o más péptidos que contienen cisteína según la invención y/o derivados funcionales de estos péptidos. Se prefieren especialmente composiciones farmacéuticas que adicionalmente contienen al menos un derivado de subóxido de carbono y/o un compuesto citostático y citotóxico, respectivamente.

Los péptidos que contienen cisteína según la invención pueden usarse como agentes de defensa frente a patógenos o como agentes farmacéuticamente activos para combatir infecciones y enfermedades causadas por dichos patógenos. En particular, pueden usarse para tratar enfermedades caracterizadas por una inmunorregulación defectuosa crónica, como por ejemplo, enfermedades autoinmunes, cáncer o SIDA. Los péptidos que contienen cisteína según la invención pueden usarse independientemente como sustancias independientes, pero también como mezcla de varios péptidos o junto con otros principios activos y materiales de transporte ya conocidos.

Las preparaciones de combinación según la invención así como las composiciones farmacéuticas según la invención que contienen al menos un péptido según la invención, se preparan de forma conocida usando los vehículos o diluyentes sólidos o líquidos convencionales y los excipientes farmacéuticos usados convencionalmente, según el tipo de aplicación pretendida en una dosis adecuada. Las formulaciones o preparaciones farmacéuticamente preferidas tienen una forma de dosificación adecuada para la administración oral o para inhalación. Estas formas de dosificación incluyen, por ejemplo comprimidos, comprimidos con cubierta pelicular, comprimidos multicapa, comprimidos recubiertos, cápsulas, microcápsulas, píldoras, granulados, polvos, soluciones, dispersiones, suspensiones, supositorios, emulsiones, dispersiones, geles, pomadas, jarabe y formas de liberación mantenida, soluciones para inhalación o polvos para inhalación, respectivamente. Además, las composiciones farmacéuticas según la invención comprenden formulaciones como comprimidos multicapa para la liberación controlada y/o continua del principio activo así como microencapsulaciones como formas especiales de dosificación.

Estas composiciones farmacéuticas son, inter alia, adecuadas para la aplicación por inhalación o intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucocutánea, bucal, rectal, transdérmica, tópica, intradérmica, intragástrica, intracutánea, intravaginal, intranasal, intrabucal, percutánea o sublingual. Las formas de dosificación especialmente ventajosas incluyen la administración oral, mediante inyección así como por inhalación.

Pueden obtenerse los comprimidos correspondientes, por ejemplo, mezclando el compuesto que puede usarse según la invención y/o sus sales con excipientes conocidos, como diluyentes inertes tales como dextrosa, azúcar, sorbitol, manitol, polivinilpirrolidona, agentes de disgregación, tales como almidón de maíz o ácido algínico, aglutinantes como almidón o gelatina, lubricantes como estearato de magnesio o talco y/o agentes para producir un efecto de liberación controlada, como carboxilpolimetileno, carboximetilcelulosa, acetato ftalato de celulosa o acetato de polivinilo. Los comprimidos también pueden estar compuestos por múltiples capas.

Por consiguiente, las píldoras pueden producirse recubriendo los núcleos producidos de forma análoga a los comprimidos, en concreto con los agentes que se utilizan normalmente en el recubrimiento de píldoras, por ejemplo, polivinilpirrolidona o goma laca shellac, goma arábiga, talco, dióxido de titanio o azúcar. La píldora recubierta también puede estar compuesta por múltiples capas, en las que también pueden usarse los excipientes mencionados anteriormente para los comprimidos.

Las soluciones o suspensiones con el principio activo que pueden usarse según la invención pueden además contener potenciadores del sabor, como sacarina, ciclamato o azúcar, así como sabores como vainilla o extracto de naranja. Además puede contener adyuvantes para la suspensión como carboximetilcelulosa sódica o conservantes como p-hidroxibenzoatos. Las cápsulas que contienen principios activos pueden producirse, por ejemplo, mezclando el principio activo con un sustrato inerte como lactosa o sorbitol y encapsularse dentro de cápsulas de gelatina.

Pueden obtenerse supositorios adecuados, por ejemplo, mediante la mezcla con vehículos como grasas neutras o polietilenglicol o derivados respectivos de los mismos.

Por ejemplo, estas composiciones farmacéuticas son adecuadas para inhalación o la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, mucocutánea, bucal, rectal, transdérmica, tópica, intradérmica, intragástrica, intracutánea, intravaginal, intranasal, intrabucal, percutánea o sublingual.

Pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables lactosa, almidón, sorbitol, sacarosa, celulosa, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, sulfato cálcico, talco, manitol, alcohol etílico y similares. Los polvos así como los comprimidos pueden estar compuestos por un vehículo en un grado del 5 al 95%.

Adicionalmente, pueden usarse como aglutinantes almidón, gelatina, azúcares naturales, gomas naturales tanto como sintéticas como goma de acacia o goma guar, alginato sódico, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y ceras. Los lubricantes adecuados incluyen ácido bórico, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico y similares.

Adicionalmente, pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas agentes de desintegración, agentes colorantes, agentes aromatizantes y/o aglutinantes.

Las composiciones líquidas comprenden soluciones, suspensiones, nebulizadores y emulsiones, tal como las soluciones para inyección a base de agua o a base de agua y propilenglicol para inyecciones parenterales.

Para la preparación de supositorios se usan preferiblemente ceras con punto de fusión bajo, ésteres de ácido graso y glicéridos.

Las cápsulas se preparan, por ejemplo, a partir de metilcelulosa, alcoholes polivinílicos o gelatina desnaturaliza o almidón.

Entre los posibles agentes de desintegración se incluyen almidón, carboximetil sódico de almidón, gomas naturales y sintéticas como por ejemplo, harina de algarroba, karaya, guar, tragacanto y agar, así como derivados de celulosa tales como metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa microcristalina así como alginatos, arcillas y bentonitas. Estos componentes pueden utilizarse en cantidades del 2 al 30% en peso.

Entre los posibles aglutinantes que pueden añadirse se incluyen azúcares, almidón de maíz, arroz o patata, gomas naturales como goma de acacia, gelatina, tragacanto, ácido algínico, alginato sódico, alginato de amonio y calcio, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, así como compuestos inorgánicos como silicato de aluminio y magnesio. Los aglutinantes pueden añadirse en cantidades del 1 al 30% en peso.

Los posibles lubricantes que pueden usarse incluyen estearatos como el estearato de magnesio, estearato cálcico, estearato de potasio, ácido esteárico, ceras de punto de ebullición alto, así como lubricantes solubles en agua como cloruro sódico, benzoato sódico, acetato sódico, oleato sódico, polietilenglicol y aminoácidos como leucina. Estos lubricantes pueden utilizarse en cantidades del 0,05 al 15% en peso.

Una aplicación preferida de los péptidos que contienen cisteína según la invención consiste en el apoyo a las defensas de los organismos biológicos, especialmente de plantas, frente a bacterias, hongos, virus u otros patógenos. La aplicación puede realizarse añadiendo el péptido a los nutrientes o líquidos incorporados por la planta o aplicando la solución que contiene el péptido sobre la superficie de las hojas de la planta.

La presente invención también comprende la integración genética de las secuencias génicas que expresan un péptido según la invención en el genoma de un organismo amenazado por una enfermedad, preferiblemente dentro del genoma de las plantas. Debido al aumento de la resistencia del nuevo organismo causada por esta alteración genética, se proporciona una protección significativamente más moderada a los seres humanos y al medioambiente frente a patógenos que la proporcionada por los pesticidas químicos conocidos hasta ahora.

Los péptidos según la invención pueden usarse de forma similar para aumentar preventivamente las defensas de otros organismos, especialmente organismos animales, frente a diferentes tipos de infecciones causadas por patógenos. Debido a este tipo de aplicación, es posible luchar de forma eficaz frente a insectos, nematodos y otros patógenos portadores. Por tanto, la transmisión o, respectivamente, la liberación de los patógenos se previenen de forma muy eficaz, posiblemente incluso antes de que ejerzan su efecto patogénico.

Otra aplicación de los péptidos según la invención consiste en la aplicación a un organismo biológico, especialmente un animal, ya infectado con un patógeno. Por tanto, se neutralizan o, al menos se minimizan las consecuencias dañinas de las infecciones bacterianas, víricas o de otro tipo. Para tal objeto, el péptido o la mezcla que contiene el péptido se usan de modo que, en combinación con las defensas del propio organismo, se consigue un control significativamente más eficaz del patógeno.

Los péptidos según la invención inducen una reducción significativa de la expresión de algunas citoquinas proinflamatorias en seres humanos y en animales, especialmente de IL-2, IL-3, IL-4 e \gamma-IFN. Por tanto, los péptidos según la invención son capaces de reducir significativamente los procesos de autoagresión dirigidos directamente frente a los propios tejidos, especialmente en el caso de enfermedades autoinmunes.

Mediante la estimulación de citoquinas inhibidoras, especialmente del TGF beta, los péptidos según la invención son capaces de reducir la actividad de las principales células inmunes humanas, que están patológicamente sobreactivadas en el caso de las enfermedades autoinmunes. Se obtuvieron resultados experimentales especialmente prometedores con la aplicación tópica de los péptidos según la invención en el caso de enfermedades cutáneas de carácter autoinmune, especialmente en el tratamiento de la psoriasis.

Mediante la estimulación de la producción de la citoquina IL-10, que tiene un efecto supresor y posiblemente regulador, los péptidos según la invención reestablecen el equilibrio normal entre las citoquinas pro y antiinflamatorias, que está descontrolado en el caso de las enfermedades autoinmunes y en otras enfermedades crónicas.

Los péptidos según la invención ejercen una inhibición eficaz y parcialmente selectiva sobre la propagación de las células malignas cancerígenas. Esto podría confirmarse mediante experimentos de cultivos celulares.

La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas y fármacos que contienen un péptido según la invención o una mezcla de péptidos según la invención como la porción eficaz. La presente invención además comprende composiciones farmacéuticas y productos farmacéuticos que contienen un péptido según la invención o una mezcla de péptidos según la invención junto con al menos un principio activo ya conocido y/o junto con compuestos y sustratos farmacéuticamente aceptables y adecuados.

El uso de un péptido según la invención junto con los derivados de subóxido de carbono denominados MCS, da lugar a una biodisponibilidad claramente mejorada y a una eficacia inmunorreguladora del péptido, especialmente en el caso de aplicaciones oncológicas (véanse los ejemplos).

Aumentando la selectividad en la lucha contra células malignas tumorales, los péptidos según la invención pueden unirse con antígenos específicos del tumor. Según una realización preferida, el péptido con la secuencia HT-C1 se une al anticuerpo, generado frente a las células de carcinoma de próstata humana, y se aísla mediante cromatografía de afinidad. La unión se realiza mediante reactivos de conjugación establecidos como las carbodiimidas, preferiblemente con la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC) hidrosoluble.

En comparación con el uso de péptidos individuales según la invención, el uso de una mezcla de los péptidos según la invención ofrecía ventajas claras. Cuando se comparaba con la presencia de un agente único, la mezcla de varios principios activo complicaba el desarrollo de la resistencia al patógeno. Se obtienen las mismas ventajas tanto con la defensa biológica mediante la expresión transgénica de la mezcla de péptidos como con el control de la enfermedad mediante la administración del péptido al organismo ya afectado.

Por tanto, los péptidos según la invención pueden usarse como principios activos de las formas descritas anteriormente. Además del uso de los péptidos individuales según la invención, los péptidos según la invención se usan como mezcla de varios péptidos así como junto con otras sustancias, especialmente junto con derivados de subóxido de carbono. Las formas de administración que han de considerarse son inyecciones, nebulizadores y aplicación
tópica.

En todos los tipos de aplicación, los péptidos según la invención se usan en una solución del 0,0001 a 10%, especialmente en una solución del 0,01 al 1%, más preferiblemente en una solución de aproximadamente el 0,2%. Más preferiblemente, se usa una mezcla acuosa de péptidos. Por ejemplo, el tratamiento puede consistir en la administración diaria de 3 x 10 ml de la solución de péptidos acuosa.

Los péptidos según la invención pueden administrarse a los seres humanos, animales o plantas que se van a tratar, como un compuesto puro o como una composición farmacéutica, donde se administran en una dosis terapéuticamente eficaz en una mezcla con sustratos o diluyentes. Estas dosis terapéuticamente eficaces pueden administrarse independientemente o en conexión con otros compuestos terapéuticos. En caso de que se usen para el tratamiento del cáncer, se considerarán los siguientes: agentes antiproliferativos y antiangiogénicos como agentes citostáticos o citotóxicos antitumorales tales como 5FU, cisplatino o también inhibidores de la proteína cinasa como el inhibidor Flk-1/KDR, CGP 79787, compuestos de la clase de los indolocarbazoles como Gö7612, compuestos de la clase de las bisindolilmaleimidas como LY 333531, GF109203x, Ro 32-0432, Ro 31-8220, compuestos de la clase de los derivados de balanol, como SPC 100840, compuestos de la clase de los oligodesoxinucleótidos complementarios como CGP 64128A y oligonucleótidos complementarios de VEGF, compuestos de la clase de los alquil lisofosfolípidos, como ET-18-OCH3, inhibidores de la activación del receptor del factor de crecimiento, como el anticuerpo anti-HER2/neu, trastuzumab (Herceptin), inhibidores de la actividad cinasa del receptor del factor de crecimiento como compuestos de la clase de las fenilaminoquinazolinas, como PQ 153035, ZD 1839 y CP-358774, compuestos de la clase de las pirimidinas sustituidas que comprenden pirido, pirrolo, pirazol, pirimido y fenilaminopirimidinas, como PD 158780, PD 166285, CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, compuestos de la clase de las tirfostinas AG1478, RG 13022 y AG 825, compuestos de la clase de las lavendustinas, como lavendustina A, compuestos de la clase de las dianilinoftalimidas, como CGP54698, así como compuestos elegidos entre el grupo compuestos por los inhibidores de MAPKKK, inhibidores de MAPKK, inhibidores de MAPK como PD098059, U0126 o SB203580, interferón alfa, factor 4 recombinante de las plaquetas sanguíneas, angiostatina o el compuesto polianiónico suramina. La presente invención también comprende la combinación de los péptidos según la invención con uno de los compuestos indicados anteriormente.

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Las técnicas para la formulación y administración de los péptidos según la invención pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton PA. Una composición que comprende uno de los péptidos según la invención, puede presentarse en forma de solución del péptido según la invención, en un sustrato farmacéutico líquido o en cualquier otra formulación como comprimidos, píldoras, píldoras recubiertas, cápsulas, gel, jarabe, suspensión, pasta, suspensión y similares.

Breve descripción de los dibujos

A continuación la invención se explicará con mayor detalle en base a las realizaciones y en el contexto de las figuras.

Fig. 1 muestra la estructura de la helletionina HT-D;

Fig. 2 muestra un diagrama de HPLC de una mezcla de helletioninas;

Fig. 3 muestra el efecto de las diferentes concentraciones de la helletionina HT-C sobre células de cáncer de mama del tipo MCF-7.

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Modos de realización de la invención Ejemplo 1 Extracción de una mezcla de péptidos

Aproximadamente 10 kg de raíces o rizomas más o menos molidas de Helleborus niger (familia Ranunculaceae) se tratan durante 6 horas con 50 l de una mezcla de BTM/hexano (1:1). El material vegetal con una cantidad de lípidos reducida y secado al aire se extrae dos veces con 60 l de EtOH al 50%, respectivamente, durante aproximadamente 24 h con agitación ligera a temperatura ambiente. Las soluciones alcohólicas acuosas combinadas se reducen en el evaporador rotatorio a vacío a 70ºC hasta sequedad. El residuo seco se trata tres veces con 3 l de ácido clorhídrico 0,05 N, las emulsiones acuosas resultantes se combinan y extraen sucesivamente con 10 l de hexano, cloroformo y BTM, respectivamente. La fase acuosa se reduce a vacío hasta aproximadamente 10 l de volumen y la solución se trata con aproximadamente 200 g de carbono activo (2 horas). El filtrado se reduce a vacío a 1 l. El concentrado acuoso se ajusta a un pH de 1,2 mediante una solución de HCl 1N y se vierte sobre diez volúmenes de acetona fría (10ºC) con agitación fuerte. El precipitado blanco formado se separa del sobrenadante mediante centrifugación y se seca a vacío. El precipitado seco se disuelve posteriormente en una cantidad mínima de agua y se vierte sobre aproximadamente diez volúmenes de acetona fría con agitación. Este procedimiento de precipitación se repite una vez más, la mezcla resultante de los péptidos que contienen cisteína se disuelve en agua y se liofiliza.

La mezcla de los péptidos según la invención se caracteriza por HPLC (figura 2). Se uso una columna Nucleosil 100-7, C-18 (Macherey-Nagel Düren) con una longitud de 250 mm y 21 mm de DI. Con un flujo de 3 ml/min y un gradiente de elución lineal de acetonitrilo del 20 al 50% en 25 min, los péptidos según la invención eluyen como sigue:

Helletionina A: 14,4 min.

Helletionina B1 a helletionina B6: 16,1 min.

Helletionina C: 16,9 min.

Helletionina D: 18,3 min.

Helletionina E1, helletionina E2: 20,1 min.

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Ejemplo 2 Extracción del péptido HT-D puro

Se extrae aproximadamente 1 kg de raíces trituradas de la planta Helleborus purpurascens con 10 l de ácido acético diluido (5% en agua) a 40ºC durante 4 horas. La solución filtrada se reduce a 1 l a vacío. A continuación, se disuelven en la solución aproximadamente 400 g de sulfato amónico. El precipitado formado se separa mediante centrifugación, se disuelve en una cantidad mínima de agua y, a continuación, se añade a una mezcla de 3,6 l de acetona y 1,4 l de etanol con agitación fuerte. La formación del precipitado en la mezcla de acetona/etanol se repite dos veces y la mezcla peptídica en crudo resultante se disuelve en agua y se liofiliza.

A continuación, 5 g de la mezcla del péptido en crudo liofilizada de la especie Helleborus se disuelven en 100 ml de acetonitrilo al 20%/agua con un contenido de ácido trifluoroacético del 0,1% y se separa en sus componentes individuales mediante una cromatografía líquida de alta presión (HPLC) preparativa. Con este fin, la solución mezcla se añade en cantidades alícuotas a una columna de Nucleosil 100-7, C-18 (Macherey-Nagel, Düren) con una longitud de 250 nm y un DI (diámetro interno) de 21 mm. La separación se realiza a un flujo de 3 ml/min mediante un gradiente de elución lineal de acetonitrilo del 20 al 50% durante 30 minutos. Los péptidos individuales puros se recogen mediante un colector de muestras del tipo FRAC-100 de Pharmacia-Biotech. El péptido HT-D puro se recoge en el intervalo de tiempo de retención de 17,9 a 18,7 min.

La pureza del péptido helletionina D aislado se comprueba mediante HPLC analítico usando una columna "Luna-CN" de Phenomenex (Offenbach) con una longitud de 200 mm y un diámetro de 4 mm usando un gradiente lineal de acetonitrilo del 5 al 85% durante 40 minutos.

El espectro de RMN ^{1}H de la helletionina D pura en agua se correlacionó con la secuencia de aminoácidos determinada mediante degradación de Edman y las señales individuales se asignaron mediante espectros NOESY y TOCSY. La tabla 1 muestra las señales de resonancia individuales para HT-D obtenidas mediante esta correlación.

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TABLA 1 Asignación de señal RMN ^{1}H para helletionina D

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Ejemplo 3 Efecto del péptido HT-A sobre la producción de citoquina por las principales células inmunitarias humanas

El efecto del péptido HT-A sobre la producción de citoquinas por las principales células inmunitarias humanas se determinó midiendo la concentración de citoquinas en cultivos de linfocitos obtenidos a partir de sangre humana. Se usaron dosis de 4 a 200 \mug/ml de la helletioninas, que se obtuvieron añadiendo las dosis calculadas en forma de solución madre. La concentración de las citoquinas individuales en las muestras tratadas y control se determina en placas de ELISA comercializadas como "Quantikine" de R&D Biosystems, Minneapolis, EE.UU. Los resultados se compararon con las muestras control, es decir con el cultivo de linfocitos sin la adición del péptido.

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En el caso de los cultivos de linfocitos (4 millones de células por ml) tratados con 4 \mug y 200 \mug del péptido HT-A, respectivamente, se obtuvieron las siguientes concentraciones de citoquinas (y receptor de citoquina) [pg/ml] en comparación con la muestra control (sin el péptido):

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Estos datos muestran que el péptido HT-A inhibe la expresión de varias citoquinas proinflamatorias como, por ejemplo IL-2, IL-3, IL-4 y \gamma-IFN. Suprimiendo la producción de estas citoquinas, el uso del péptido da lugar a la reducción deseada de los procesos autoagresivos dañinos de las enfermedades autoinmunes.

Además, el péptido HT-A muestra una estimulación de la citoquinas con acción supresora como IL-10 y TGF-\beta2. Interesantemente, la estimulación de estas citoquinas en el caso de una concentración de péptidos baja (4 \mug/ml) es claramente más fuerte que en el caso de una dosis mayor (200 \mug/ml). Se asume que en el caso de una concentración de péptido superior, la toxicidad celular no específica del péptido cubre la estimulación observada en el caso de tasas de dosis menores.

El péptido HT-A probado no muestra influencia significativa sobre la producción de determinadas citoquinas como IL-6 o TNF-\alpha, y sobre la expresión del receptor de IL-1.

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Ejemplo 4 Efecto del péptido HT-C sobre la proliferación de células cancerígenas humanas

Las investigaciones se realizaron con células de carcinoma de mama en cultivo de la línea celular MCF-7. Sirvió para comparar una línea celular en cultivo de células epiteliales de mama no diferenciadas del tipo MCF-10A. Las células correspondientes (aproximadamente 10^{5}/ml de muestra) se estimularon inicialmente en el medio de cultivo convencional DMEM. Después de 24 horas, se añadió el péptido HT-C y las concentraciones se ajustaron entonces entre 0,2 y 400 \mug/ml. El examen de las alteraciones causadas por el péptido se realizó a intervalos de 24 horas durante un periodo de hasta 6 días. El péptido HT-C causa incluso a bajas concentraciones, en concreto desde aproximadamente 2 \mug/ml, una inhibición muy clara de la propagación de las células MCF-7 (figura 3).

En las mismas condiciones el péptido HT-C tenían un efecto inhibidor significativamente menor sobre la propagación de las células epiteliales no malignas del tipo MCF-10.

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Ejemplo 5 Efecto de las mezclas de péptidos sobre el desarrollo de tumores en ratones

En este estudio se investigó el efecto de las mezclas de péptidos según la invención sobre el desarrollo de tumores en hembras inoculando células WAZ-2T a ratones hembra del tipo BALB/c con un peso corporal de 20 a 24 g. Inicialmente la patogenicidad de la cepa celular se determinó mediante la inoculación de una tasa de dosis creciente de 0 a 10^{6} células tumorales en la almohadilla de grasa de la mama derecha de los animales (12 animales/dosis). Este experimento previo mostraba que el uso de una dosis de 2,5 x 10^{3} células tumorales daba lugar a una incidencia del tumor del 66,7%, es decir, un tumor palpable desarrollado en dos de cada tres ratones. El diámetro del tumor se midió diariamente y se corrigió con respecto al espesor de la piel del animal con un valor de 0,1 cm. El volumen se calculó asumiendo una forma esférica del tumor. Los ratones se sacrificaron el día 120 o antes si el tumor había alcanzado un diámetro de más de 1,8 cm. Los 80 animales se agruparon en cuatro grupos (I a IV) con 20 ratones cada uno. A día cero, se inoculó a todos los animales una suspensión de 2,5 x 10^{3} células tumorales.

Los animales del grupo I (grupo control) recibieron su comida normal sin adición de la mezcla de péptido. En el caso de los animales que reaccionaba positivamente, el desarrollo del tumor podía medirse a partir de la cuarta semana tras la inoculación. A día 50 tras la inoculación, se había desarrollado un tumor fácil de medir en el caso de un total de 14 animales de este grupo. Por tanto, la incidencia del tumor a día 50 era del 70%. En los animales con crecimiento positivo se determinaron los siguientes volúmenes medios del tumor:

Día 50: 0,81 cm^{3}

Día 60: 1,23 cm^{3}

Día 70: 1,74 cm^{3}

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Los animales del grupo II recibieron desde el primer día de inoculación 0,4 \mug de la mezcla de péptidos según la invención añadidos a su comida. A día 50 tras la inoculación se podía medir bien un tumor palpable sólo en el caso de 4 animales. Por tanto, la incidencia del tumor a día 50 era del 25%. En los animales con crecimiento positivos se determinaron los siguientes volúmenes medios del tumor:

Día 50: 0,32 cm^{3}

Día 60: 0,57 cm^{3}

Día 70: 0,71 cm^{3}

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En el caso de los animales del grupo III el tratamiento con la mezcla de péptidos se inició sólo el día 7 tras la inoculación. Se añadió a la comida una dosis diaria de 0,4 \mug de la mezcla de péptidos por animal A día 50 tras la inoculación se podía medir bien un tumor palpable sólo en el caso de 9 animales. Por tanto, la incidencia del tumor a día 50 era del 45%. En los animales con crecimiento positivos se determinaron los siguientes volúmenes medios del tumor:

Día 50: 0,48 cm^{3}

Día 60: 0,77 cm^{3}

Día 70: 0,93 cm^{3}

En consecuencia, los péptidos según la invención causan una inhibición significativa de la tasa de enfermedad maligna de los animales y una regresión del desarrollo del tumor.

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Ejemplo 6 Efecto de los péptidos sobre macrófagos peritoneales de ratón

Se usaron macrófagos peritoneales murinos extraídos de ratones CD1. Se realizó un lavado peritoneal usando 5 ml de PBS. Después de tres etapas de lavado con RPMI 1640, las células se colocaron en una placa de cultivo de 96 pocillos con una concentración de 1 x 10^{6} células/ml (200 \mul/pocillo) en medio RPMI 1640 con FCS al 10% y se mantuvieron durante 24 horas. Tras la incubación, las células se lavaron tres veces con RPMI 1640 y se resuspendieron en medio RPMI 1650 con FCS al 10% (100 \mul/pocillo) en presencia (estimulado) o ausencia (sin estimulación) de diferentes agentes estimulantes. Después de 24 horas de incubación se determinaron los niveles de NO, IL-10 y TNF-\alpha en el sobrenadante de los cultivos.

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El péptido HT-C mostraba un efecto citotóxico claramente más potente que HT-D frente a los macrófagos peritoneales de los ratones examinados en el experimento. Los péptidos probados no inducen síntesis de NO en los macrófagos peritoneales murinos.

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Ejemplo 7 Efecto de los péptidos por separado y mezclados con el compuesto de subóxido de carbono (MCS-18) sobre las células cancerígenas de la línea COLO-205 Procedimientos

Línea celular: Línea celular de cáncer de colon. Colo 205 (Nº ATCC: CCL-222), organismo: Homo sapiens, bibliografía: Cancer Res., 38, 1345-1355, 1978. PNAS, 99, 10718-10723, 2002.

Después de la adherencia de las células (incubación durante 24 h, número de células 1 x 10^{4} células por lote), éstas se trataron durante 24 h con MCS y/o péptidos (CZT, DZT) y, posteriormente se determinó el porcentaje de células vivas mediante la prueba del MTT.

Línea celular: línea celular de carcinoma pulmonar: A549 (Nº ATCC: CCL-185), organismo: Homo sapiens, bibliografía: Giard DJ , y col. J. Natl. Cancer Inst. 51: 1417-1423, 1973.

Después de la adherencia de las células (incubación durante 24 h, número de células 5 x 10^{3} células por lote), éstas se trataron durante 72 h con MCS y/o péptidos (CZT, DZT) y, posteriormente, se determinó el porcentaje de células vivas mediante la prueba del AlamarBlue.

Prueba del MTT

La prueba de crecimiento celular con MTT se realizó según describen Alley y col. (M.C. Alley y col., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 27:389, 1986; M.C. Alley y col., Cancer Res 48:589-601, 1988). La concentración final de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio era de 0,4 mg/ml.

La prueba de crecimiento celular con AlamarBlue^{TM} se realizó según las especificaciones del fabricante (Serotec, Oxford, Inglaterra, www.serotoc.com).

Resultados

Como se muestra en la tabla 2, el crecimiento de las células Colo 205 se inhibía fuertemente incluso después de 24 horas a la concentración de 100 \mug/ml en presencia de los péptidos CZT y DZT. La cantidad de células vivas era sólo de aproximadamente el 50%. Cuando se añadía la sustancia MCS 18 además del péptido CZT, se podía observar un efecto inhibitorio del péptido incluso mejorado. A una concentración de 100 \mug/ml, MCS 18 por si sólo no tenía ningún efecto inhibitorio sobre el crecimiento de las células Colo 205 (tabla 3). Por tanto, la combinación del péptido CZT y MCS podría llevar a un aumento de la actividad antitumoral en el caso del cáncer de colon.

Los péptidos BZT, CZT y CZT eran también capaces de inhibir el crecimiento de líneas celulares de carcinoma pulmonar a una concentración de 100 \mug/ml (véase la figura 4). Después de 72 h podía determinarse sólo aproximadamente un 50% de células vivas.

TABLA 2

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TABLA 3

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Claims

1. Péptidos que contienen cisteína y tienen la siguiente estructura

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y apoyan las defensas inmunitarias naturales de plantas y animales u organismos humanos para combatir bacterias, hongos, virus u otros patógenos, en las que las líneas continuas representan los puentes disulfuro y en las que X independientemente representa cualquier aminoácidos natural.

2. Péptidos que contienen cisteína según la reivindicación 1, en los que el aminoácido G se localiza en la posición 15 y/o el aminoácido T se localiza en la posición 19 y/o el aminoácido Q se localiza en la posición 27 y/o el aminoácido R se localiza en la posición 28 y/o el aminoácido H se localiza en la posición 34 y/o el aminoácido T se localiza en la posición 38 y/o el aminoácido S se localiza en la posición 43 y/o el aminoácido H se localiza en la posición 44 y/o el aminoácido S se localiza en la posición 46.

3. Péptidos que contienen cisteína según una cualquier de las reivindicaciones precedentes, en concreto

KSCCRNTLGRNCYNGCRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS (helletionina A), KSCCRNTLGRNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS (helletionina B1), KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGRLCDCIHVTTTTCPSSHPS (helletionina B2), KSCCRNTLGRNCYNACRLPGTPQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR (helletionina B3), KSCCRNTLARNCYNACRFTGTSQPYCARLCDCIHVTTPTCPSSHPR (helletionina B4), KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCATLCDCIHVTTPTCPSSHPR (helletionina B5), KSCCRNTLARNCYNVCRFGGGSQAYCARFCDCIHVTTSTCPSSHPS (helletionina B6), KSCCRNTLGRNCYNACRLTGTSQATCATLCDCIHVTATTCRPPYPS (helletionina C), KSCCRNTLARNCYNACRFTGGSQPTCGILCDCIHVTTTTCPSSHPS (helletionina D), KSCCRNTLGRNCYAACRLTGLFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS (helletionina E1), KSCCRNTLGRNCYAACRLTGTFSQEQCARLCDCITVTTPTPCPRTHPS (helletionina E2)

4. Secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que contiene cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

5. Secuencia de ARN según la reivindicación 4.

6. Secuencia de ADN según la reivindicación 4.

7. Derivados éster, derivados amida, derivados halogenados, derivados metilados, sales, derivados cíclicos y derivados que tienen un esqueleto modificado, de los péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Vector de ADN o constructo que incluye una secuencia según la reivindicación 6.

9. Anticuerpos monoclonales dirigidos frente a un epítopo de los péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Uso de péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y de mezclas de dichos péptidos que contienen cisteína para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades.

11. Uso de péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y de mezclas de dichos péptidos que contienen cisteína para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades causadas por patógenos; para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias, hongos o virus; para el tratamiento de enfermedades en seres humanos y animales, especialmente en caballos; para el tratamiento de enfermedades causadas por biorregulación defectuosa del sistema inmunitario o que se acompaña de una biorregulación defectuosa del sistema inmunitario; para el tratamiento de enfermedades autoinmunes; para el tratamiento de cánceres y para el tratamiento del SIDA.

12. Péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, mezclas de dichos péptidos que contienen cisteína y/o sales farmacéuticamente aceptables de dichos péptidos que contienen cisteína para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades.

13. Péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, mezclas de dichos péptidos que contienen cisteína y/o sales farmacéuticamente aceptables de dichos péptidos que contienen cisteína para la preparación de una formulación farmacéutica para al tratamiento de enfermedades causadas por patógenos así como para la preparación de una formulación farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento del cáncer.

14. Péptidos que contienen cisteína según la reivindicación 13, en los que el cáncer es un cáncer seleccionado entre el grupo compuesto por: melanoma coroidal, leucemia aguda, neurinoma del acústico, carcinoma ampular, carcinoma anal, astrocitoma, carcinoma basocelular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, carcinoma bronquial, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, cáncer del cuerpo del útero, síndrome de COD, cáncer de intestino grueso, cáncer de intestino delgado, tumores del intestino delgado, cáncer de ovario, carcinoma de endometrio, ependimoma, cánceres epiteliales, tumores de Ewing, cánceres gastrointestinales, cáncer de vesícula biliar, cáncer uterino, cáncer de cuello de útero, glioblastoma, cánceres ginecológicos, tumores de oído, nariz y garganta, neoplasias hematológicas, cáncer de células pilosas, cáncer de uretra, cáncer de piel, tumores encefálicos (gliomas), metástasis encefálicas, cáncer de testículo, cáncer de ganglio linfático (Hodgkin/No Hodgkin), tumor de hipófisis, carcinoides, sarcoma de Kaposi, cáncer de laringe, tumor de células germinales, osteosarcoma, carcinoma colorrectal, tumores de cabeza y cuello, cánceres de cabeza y cuello, carcinoma de colon, craniofaringiomas, cáncer en el área de la boca y del labio, cáncer del sistema nervioso central, hepatoma, metástasis hepáticas, leucemia, tumor en el párpado, cáncer de pulmón, linfomas, cáncer de estómago, melanoma maligno, carcinoma de mama, cáncer rectal, meduloblastomas, melanoma, meningiomas, enfermedad de Hodgkin, micosis fungoides, cáncer de nariz, neurinoma, cáncer de riñón, linfomas No Hodgking, oligodendroglioma, carcinoma de esófago, osteosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma pancreático, carcinoma en el pene, plasmacitoma, carcinoma de próstata, cáncer de garganta, carcinoma rectal, retinoblastoma, cáncer de vagina, carcinoma de tiroides, cáncer de pulmón de Scheneeberg, cáncer de esófago, carcinoma espinocelular, linfoma de células T (micosis fungoides), timoma, carcinoma de la trompa de Falopio, tumores oculares, tumores urológicos, carcinoma urotelial, carcinoma de vulva, aparición de verrugas, tumores de tejidos blandos, tumor de Wilm y cáncer de lengua.

15. Preparación farmacéutica que comprende uno o más péptidos que contiene cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

16. Preparación farmacéutica según la reivindicación 15, que comprende uno o más péptidos que contienen cisteína según las reivindicaciones 1 a 3 y al menos un derivado de subóxido de carbono.

17. Preparación farmacéutica según la reivindicación 15 ó 16, que contiene uno o más péptidos que contienen cisteína según las reivindicaciones 1 a 3 y al menos un compuesto que tiene actividad citostática y/o citotóxica.

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18. Procedimiento para obtener dichos péptidos que contienen cisteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 mediante la extracción a partir de la especie vegetal Helleborus.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la primera etapa del procedimiento consiste en reducir la cantidad de lípidos del material vegetal usando disolventes no polares, especialmente usando metil terc-butil éter.

20. Procedimiento para obtener los péptidos que contienen cisteína según las reivindicaciones 1 a 3 usando procedimientos del campo de la tecnología genética.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que los genes de tionina de un cereal que produce tionina se sustituyen por los genes de tionina de la especie vegetal de Helleborus.

22. Procedimiento para la producción sintética de los péptidos que contienen cisteína según las reivindicaciones 1 a 3 usando síntesis de péptidos.