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Die Erfindung betrifft ein Präparat zur gezielten Unterdrückung von Pathogenen in der Rhizosphäre von Kulturpflanzen gemäß dem ersten Patentanspruch.
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Viele Agrochemikalien und Schadstoffe werden in Pflanzen durch Konjugation mit Glutathion (GSH) entgiftet. Die im Zuge der Entgiftung entstehenden GSH-Konjugate und deren Abbauprodukte γGC- und Cys-X werden zum Teil durch Pflanzenwurzeln transportiert und an den Boden abgegeben.
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Eine landwirtschaftliche Produktion ist in der heutigen Zeit ohne Pflanzenschutzmittel (PSM) nicht mehr vorstellbar. Im Jahr 2002 wurden allein in Deutschland etwa 35.000 t PSM ausgebracht. Etwa die Hälfte aller eingesetzten PSM sind Herbizide.
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Stand der Technik
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Seit etwa Mitte der 70er Jahre ist die Entstehung von Fremdstoff-Metaboliten in Pflanzen bekannt, es lagen jedoch noch kaum Untersuchungen zur Translokation der Metabolite innerhalb der Pflanze vor. Die vorhandenen Arbeiten befassen sich ausschliesslich mit der Kompartimentierung der Konjugate innerhalb der Zelle. Aussagen über eine Exudation der Metaboliten zusammen mit Zuckern und anderen organischen Molekülen an den Boden finden sich nur verstreut. Über einen eventuellen Einfluss der Metaboliten auf die Bodenlebewelt finden sich entsprechend wenige Angaben. Dabei ist die Rhizosphäre ein empfindliches Klein-Ökosystem, dessen Beeinflussung gravierende Folgen für die Pflanzengesundheit haben kann.
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Als sessile Organismen haben Pflanzen nicht die Möglichkeit, (Umwelt-)Giften auszuweichen. Für ihr Überleben ist die Fähigkeit zur Entgiftung dieser Schadstoffe daher von entscheidender Bedeutung. Bei diesen Umweltgiften handelt es sich um die unterschiedlichsten chemischen Substanzen unterschiedlichster Herkunft, die durch ihre Verwendung, Schadensfälle und durch unkorrekte Handhabung in die Umwelt gelangen. Andererseits sind bestimmte Substanzen wie Herbizide im Rahmen einer landwirtschaftlichen Produktion einsetzbar, eine Applikation unterliegt dabei einer landwirtschaftlichen Praxis.
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Die Entgiftung organischer Schadstoffe und Herbizide folgt in groben Zügen dem Schema, das bereits 1905 für die Entgiftung von Fettsäuren, die mit einem Phenolrest substituiert waren, im Säugerorganismus vorgestellt wurde. Dieses Entgiftungsschema setzt sich aus drei Phasen zusammen: erstens der Aktivierung des Schadstoffes, zweitens der Konjugation mit einem Biomolekül (z. B. Zucker oder GSH) und drittens eine anschliessende Ausscheidung. Es wurde erstmalig 1976 auf den pflanzlichen Organismus übertragen und Mitte der 90er Jahre neueren Erkenntnissen angepasst. Aufgrund seiner Analogien zum Säugermetabolismus wurde vom ”Konzept der Grünen Leber” gesprochen ().
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Der erste Entgiftungsschritt ist – wie auch anhand des Säugermetabolismus darstellbar – die Aktivierung der Schadstoffe durch Reduktion, Oxidation oder Hydrolyse mit Hilfe der entsprechenden Enzyme. Damit wird der zu entgiftende Stoff zwar zunächst noch giftiger, ist aber dadurch reaktiv genug, um in einem zweiten Schritt an ein Biomolekül konjugiert zu werden. Mit der Konjugation ist oft eine drastische Vergrößerung des Moleküls verbunden, häufig ändern sich dadurch auch dessen chemische Eigenschaften. Beides führt dazu, dass der Schadstoff als solcher nicht mehr erkannt wird und damit seine Giftigkeit für die Zellen und Gewebe verliert (Coleman et al. 1997).
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Verfügt der tierische Organismus nun über die Möglichkeit der quantifizierten Ausscheidung der chemisch entgifteten Stoffe über Darm und Niere, müssen die Pflanzen andere Wege nutzen.
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Mit dem Begriff Ausscheidung ist die vollständige Verfrachtung des Stoffes aus dem Organismus heraus gemeint, also der Abgabe von Substanzen an die angrenzende Umwelt. Er ist mit Blick auf die Pflanze nicht ganz eindeutig, da er eine Exudation über die Wurzeln, aber auch über Sprossteile wie z. B. Guttation der Blätter meint. Eine Ausscheidung liegt auch dann vor, wenn der Stoff lediglich aus dem ”lebenden Teil” des Organismus entfernt wird. Die betreffende Substanz liegt nicht mehr im Cytosol vor und kann von dort aus wirksam sein, sondern wird zunächst in die Vakuole verfrachtet.
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Lange Zeit wurde davon ausgegangen, dass der größte Teil der entgifteten Stoffe in der Vakuole dauerhaft eingelagert wird. In den letzten Jahren wurde jedoch immer klarer, dass die Konjugate in der Vakuole lediglich zwischengelagert werden und dort weiteren Stoffwechselprozessen unterliegen.
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Weiterhin ist bekannt, dass die Konjugate und deren Metabolite aus der Vakuole wieder herausbefördert werden. Transport-Studien haben bisher gezeigt, dass die Fremdstoff-Metabolite vom Spross in die Wurzel transportiert werden. Dort kommt es dann zu einer Anreicherung in der Wurzelspitze und/oder einer Verteilung in den Wurzelhaaren. Ein Rücktransport der Konjugate aus der Wurzel in den Spross findet offenbar nicht statt.
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Als Rhizosphäre wird der Boden bezeichnet, der die Wurzel unmittelbar umgibt. Hier lebende Mikroorganismen und die angrenzenden Pflanzenwurzeln beeinflussen sich gegenseitig (Walker et al. 2003).
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Durch die Exudation einer Vielzahl an Stoffen beeinflussen Wurzeln die Bodenlebewelt in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft in hohem Masse. Dabei werden Herbivore und Pathogene abgewehrt, vorteilhafte Symbiosen mit Pilzen und Bakterien gefördert, chemische und physikalische Eigenschaften des Bodens verändert und das Wachstum konkurrierender Nachbarpflanzen gehemmt (Walker et al. 2003).
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Die Pflanzenwurzel exudiert Stoffe, die von den Bodenorganismen direkt als Energiequelle genutzt werden. Daneben können Wurzelexudate das Milieu der Bodenlösung verändern und damit die Verfügbarkeit von Nährstoffen beeinflussen (Nardi et al. 2000). Dies ist vor allem für die Verfügbarkeit von Phosphor untersucht worden ().
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Weiterhin bekannt ist, dass Wurzelexudate das Hyphenwachstum von arbuskulären Mykorrhizapilzen anregen () oder deren Sporenkeimung stimulieren.. Es konnte gezeigt werden, dass zunächst eine Gen-Aktivierung in Glomus erfolgt, sobald Wurzelexudate zugegeben wurden. Dem folgen Veränderungen im Pilz auf physiologischer und abschliessend auf morphologischer Ebene. Der Mykorrhizapilz bildet als Antwort auf die Exudate ein extensiv verzweigtes Hyphengeflecht. Gleichzeitig konnte aber auch nachgewiesen werden, dass eine besondere Art der Exudat-Zusammensetzung das Mykorrhiza-Wachstum unterbinden kann ()
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Ikeda et al. 1997 offenbart mögliche Veränderungen in der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft im Boden durch Wurzelexudate. In ungünstigsten Fall werden Pathogene (hier: Pseudomonas spp.) stärker begünstigt als andere Bakterien. In Walker et al. 2003 wird ferner ein Zusammenhang zwischen Wurzelexudaten und Insekten diskutiert.
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Aufgabenstellung
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Davon ausgehend liegt die Aufgabe der Erfindung darin, eine Verwendung eines Präparats vorzuschlagen, die eine Unterdrückung von Pathogenen bei gleichzeitiger gezielter Förderung von PGPR in der Rhizosphäre von Kulturpflanzen bewirkt.
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Die Aufgabe wird durch die Merkmalskombination in Anspruch 1 gelöst. Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen wieder.
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Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, dass das Präparat Glutathionhaltig, vorzugsweise Oligopeptid-haltig ist, dessen zentrales Molekül Cystein umfasst. Weiter bevorzugt enthält das Oligopeptid ein Mono-, Di- oder Tri-Peptid, vorzugsweise Dinitrobenzyl-Glutathion (GS-DNB), Dinitrobenzyl-γ-Glutamylcystein, Dinitrobenzyl-Cystein (vgl. 1) oder weitere analoge Konjugaten, bei denen der Dinintrobenzyl-Rest durch andere geeignete Fremdstoffreste ersetzt ist (z. B. Triazine, Chlorazetanilide, substituierte Phenole).
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Im Rahmen von Untersuchungen war nachweisbar, dass Rhizosphären-Organismen von den vorgenannten Glutathion-haltigen Präparaten in ihrem Wachstum und in ihrer Substratverwertung beeinflusst werden. So sind verschiedene Bodenbakterien gezielt durch die Gabe eines Glutathion-Konjugates daran hinderbar, auf einem bestimmten C-haltigen Substrat zu wachsen, bzw. kann das Wachstum von Bakterien auf anderen C-Quellen gefördert werden.
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Daraus ergibt sich in vorteilhafter Weise die Möglichkeit der gezielten Förderung von positiven sog. PGPRs bzw. Unterdrückung von Pathogenen in der Rhizosphäre von Kulturpflanzen. Anwendungen
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Ein weiter Vorteil der Erfindung besteht darin, dass mit den vorgenannten Glutathionhaltigen Präparaten es möglich ist, ohne Gabe weiterer Umwelt belastender Chemikalien eine gesunde Rhizosphärenflora für Kulturpflanzen zu schaffen.
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Die vorgenannten Glutathion-haltigen Präparate sind sowohl synthetisch als auch im pflanzlichen Metabolismus, d. h. auf natürlichem Wege herstellbar.
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Speziell durch Kombination eines Thiol-Konjugat und einer Kohlenstoff-Quelle (C-Quelle) können Bakterien, die für die Pflanze von Nutzen sind, begünstigt werden, während die ausgebrachte Thiol-C-Quellen-Mischung gleichzeitig wurzelpathogene Bakterien zurückdrängt.
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Wichtig ist, dass die Konjugate nicht nur selbst und direkt in Mischung auf den Boden aufgebracht werden können, um zum Wirkort (Wurzelzone) zu gelangen, sondern dass der pflanzliche Stoffwechsel unter geeigneten Bedingungen (Blattapplikation von Ausgangssubstanzen) die Komponenten selbst erzeugen und durch die Wurzel in den Boden transportieren kann.
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Die Erfindung ist auch für die Diagnostik von Pathogenen nutzbar, in einer bevorzugten Weise auch von Humanpathogenen.
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Ausführungsbeispiel
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Die Erfindung wird anhand von Anwendungsbeispielen und folgender Figuren näher erläutert. Es zeigen
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1 die chemische Strukturformeln von Dinitrobenzyl-Glutathion (GS-DNB) (links), Dinitrobenzyl-γ-Glutamylcystein (mitte) und Dinitrobenzyl-Cystein (rechts),
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2 die Belegung der Wells einer Mikrotiterplatte mit Kohlenstoffsubstraten der Kohlenstoffquellen im Rahmen des ersten Anwendungsbeispiels,
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3 die Einteilung der untersuchten Präparate nach den chemischen Gruppen in der Mikrotiterplatte gem. 2 (BIOLOG® Microplates), dargestellt in einem Kreisdiagramm sowie
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4 bis 9 Veränderungen des bakteriellen Wachstums nach Zugabe der jeweils in der Fig. links angegebenen Lesung in je einer Bildtafel mit je acht Kreisdiagramme.
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Die 4 bis 9 geben jeweils für verschiedene die Veränderungen des bakteriellen Wachstums nach Zugabe der in der jeweiligen Figur über der linken Spalte angegebenen Lösung (c1 = 0,45 mM, c2 = 2,2 mM) t3 = drei Stunden Inkubation (jeweils linke Spalte), t24 = 24 Stunden Inkubation (jeweils rechte Spalte) in Bildtafeln wieder (vgl. auch nachfolgende Anwendungsbeispiele).
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Der in jedem Kreisdiagramm um den Mittelpunkt angedeutete Ring gibt jeweils die unbeeinflusste Kontrolle als Verhältnis zu sich selbst an. Die sich um den Mittelpunkt erstreckenden sternförmige Flächen stellen das jeweiligen Verhältnis von Behandlung zur Kontrolle dar. Die geometrischen Anordnungen der sechs chemischen Gruppen der C-Quellen sind in allen Kreisdiagrammen der 4 bis 9 identisch, entsprechen exakt der in 3 wiedergegebenen und sind somit auf die jeweilig zur Anwendung gekommenen Mikrotiterplatteneinteilung gemäß 2 reproduzierbar rückführbar. Die Schraffierungen in 2 und
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3 entsprechen jeweils den gleichen C-Verbindungen, nämlich Amine und Amide (a), Aminosäuren (b), Polymere (c), Kohlenhydrate (d), Carboxylsäuren (e) und alle weiteren C-Verbindungen (f) (vgl. auch Schraffurmuster in 2). Die Bezeichnungen a bis f finden sich jeweils in den Kreisdiagrammen in 3 und in den 4 bis 9 (nur im Diagramm links oben) wieder.
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Anwendungsbeispiel 1:
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Allgemeine Versuchsführung
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Das zur Anwendung gekommene Mikrotiterplattensystem (BIOLOG®-System,) ist ursprünglich dafür entwickelt worden, um im medizinischen Bereich auf einfach Weise Bakterien identifizieren zu können. Für jede Gattung, teilweise sogar einzelne Arten, entstehen charakteristische Muster aus gefärbten und ungefärbten well in den Mikrotiterplatten (BIOLOG®-Platten, je nachdem, ob die im well vorliegende C-Quelle umgesetzt werden konnte. Diese Mikrotiterplatten eignen sich auch zur Bestimmung von Veränderungen der Organismengemeinschaft im Boden nach PSM-Einsatz.
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Bei den im Versuch eingesetzten Bakterien handelte es sich um die drei typischen Bodenbakterien Serratia liquefaciens und Burkholderia sacchari sowie der phytopathogenen Burkholderia cepacia.
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2 gibt die Belegung der Wells einer Mikrotiterplatte mit Kohlenstoffsubstraten verschiedener, in 3 angegeben Gruppen (gleiche Schraffierung bzw. Einfärbung pro Kohlenstoffsubstratgruppen in beiden Figuren), wieder. Als Gruppen kommen Carbonylsäuren, Kohlenhydrate, Polymere, Aminosäuren, Amide sowie sonstige Gruppen zum Einsatz. Die Einteilung des in 3 dargestellten Kreisdiagramms entspricht der in den Kreisdiagrammen gemäß 4 bis 9.
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Der Einfluss der Thiol-Konjugate auf das bakterielle Wachstum wurde mit Hilfe des vorgenannten BIOLOG®-Systems untersucht. Der Versuch ist ein Substrat-Nutzungstest, bei dem 95 verschiedene Substrate (und Wasser) in einer 96-Well-Mikrotiterplatte einem Organismus angeboten und verstoffwechselt werden. Ist der Organismus in der Lage, das Substrat umzusetzen, erfolgt ein Farbumschlag. Dieser wurde photometrisch gemessen.
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Die Beeinflussung der Thiol-Konjugate wurde überprüft, indem diese mit den Organismen gemeinsam in die Mikrotiter-Testplatten gegeben wurde. Ein Vergleich mit den unbehandelten Mikrotiterplatten sollte die Wirkung der Konjugate auf das Wachstum aufzeigen.
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Das BIOLOG®-System ist ein von der Firma Oxoid entwickeltes Verfahren zur Identifizierung von Bakterien und neuerdings auch Pilzen. Hauptkomponente des Systems sind spezielle Versuchsplatten, die mit 95 verschiedenen Substraten aus 6 chemischen Gruppen belegt sind (vgl. 2). Wird ein Substrat metabolisiert und kommt es so zu einer Vermehrung der Bakterien, verfärbt sich das betreffende Well der Platte rot-violett. Auf diese Weise entsteht ein Muster, das auf Artebene für jedes Bakterium charakteristisch ist. Anhand dieses Musters ist eine Identifizierung von unbekannten Organismen möglich.
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Um die Farbumschläge der einzelnen Wells detailliert unterscheiden zu können, werden die Microplates in einem Platereader (Fa. Molecular devices) bei 590 nm Wellenlänge gelesen.
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Mikrotiterplattensysteme allgemein und das eingesetzte BIOLOG®-System im Speziellen eignen sich hervorragend auch zur Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften. Damit lassen sich insbesondere und in vorteilhafter Weise Einflüsse durch landwirtschaftliche Kulturmaßnahmen, Schwermetalle oder Bodenremediation messen.
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Im Rahmen des Anwendungsbeispiels wurden zunächst die charakteristischen, unbeeinflussten Färbemuster von den Bakterien Serratia liquefaciens, Burkholderia cepacia und B. sacchari ermittelt. Dazu wurde jedes dieser gram-negativen Bakterien nach dem Standardprotokoll der Fa. Oxoid auf BIOLOG-Universal-Growth (BUG) Medium über Nacht kultiviert (Oxoid 2001).
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Der entstandene Bakterienschleim wurde mit einem sterilen Glasspatel abgekratzt und in 100 ml des sterilen Puffers (Inoculating fluid von Oxoid) gegeben. Diese Suspensionen (pro Organismus dreimal 100 ml) wurden dann in die Microplates pipettiert (100 μl pro well, je drei Platten pro Organismus und Behandlung).
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Anwendungsbeispiel 2:
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Versuch mit thiolischen Konjugaten (”Parent Mix”)
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Der eigentliche Versuch bestand nun darin, das Wachstum der Bakterien unter Konjugat-Einfluss zu bestimmen. Es wurden hierfür 0,307 g GSH bzw. 0,121 g Cys bzw. 0,025 g γGC in jeweils 7,3 ml Puffer (Tris/HCl, pH 7,8) gelöst und mit jeweils 0,183 g CNBD (gelöst in 2,7 ml Ethanol) versetzt. Bei erfolgreicher Konjugation erhält man 10 ml einer 90 mmol Lösung, die eine deutliche Gelbfärbung aufweist. Die Lösungen wurden bei der Zugabe zu den Bakterien-Suspensionen steril filtriert.
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Um unterschiedliche Konjugat-Konzentrationen, aber immer mehr oder weniger konstante Bakterien-Mengen zu erlangen, wurden in die verbleibenden Bakterien-Suspensionen (nachdem die Kontrollplatten pipettiert waren) zunächst 0,5 ml Konjugat-Lösung gegeben. Diese Bakterium-Konjugat-Lösungen wurden in jeweils drei Platten gegeben.
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Zu den wiederum verbleibenden Lösungen wurden nochmals 1,5 ml Konjugat gegeben, um eine höhere Konzentrationsstufe prüfen zu können. So ergab sich eine Konzentrationssteigerung um den Faktor 5. Auch diese Lösung wurde in dreifacher Wiederholung auf die Platten gegeben.
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Die Platten wurden zu Beginn (t0), nach drei Stunden (t3) und nach 24 Stunden (t24) Inkubation bei 590 nm Wellenlänge photometrisch gemessen.
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Schließlich konnte aufgereinigtes GS-DNB zu den Bakterien gegeben werden. Durch die Aufreinigung mit den SPE-Säulen enthielt die Lösung kein freies Thiol (GSH) und kein freies Xenobiotikum (CDNB) mehr, sondern nur noch das Konjugat. Die 10 mM Lösung wurde in bekannter Weise zugegeben (vgl. Punkt 3. Burkholderia cepacia).
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Anwendungsbeispiel 3:
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Auswertung und Darstellung der Versuchsergebnisse
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Zunächst wurde die Extinktionsänderung über die Zeit für jedes Well bestimmt und aus den drei Mikrotiterplatten (Microplates) einer Behandlung gemittelt. Diese Werte wurden dann für jeden Organismus getrennt ins Verhältnis zu den Werten der jeweiligen unbehandelten Platte gesetzt (vgl. folgende Gleichungen 1 und 2, Extinktion = E, Extinktionsänderung = ΔE).
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Für eine grafische Darstellung der Ergebnisse wurden die Substrate der Platte ihrer chemischen Gruppen nach sortiert.
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Der Blank über alle 96 Wells, als Verhältnis zu sich selbst und damit 1, wurde als roter Ring im Diagramm abgebildet. Die Werte der Behandlungen wurden gemäß ihrer Höhe in das Diagramm eingetragen.
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Messwerte, die über denen des Blanks liegen und so als Produkt > 1 ergeben, stehen außerhalb des Ringes. Sie bedeuten eine Förderung des bakteriellen Wachstums in dem jeweiligen well. Extinktionsänderungen unterhalb des Blanks, also < 1, wurden innerhalb des Ringes eingetragen und verweisen auf eine Wachstumshemmung.
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Ergebnisse:
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1. Wirkung auf Bodenbakterien
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In den vorgenannten Versuchen wurden definierte Bakterien in die Mikrotiterplatten gegeben. Dabei wurde überprüft, ob einzelne Bakterien-Arten durch Zugabe von GSH-Konjugaten und deren Abbauprodukten γGC-X und Cys-X gezielt im Wachstum gefördert oder gehemmt werden können. Hierdurch sind Rückschlüsse auf eine Beeinflussung der Rhizosphären-Flora möglich.
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Sämtliche Messergebnisse sind als Kreisdiagramme (wie oben beschrieben) abgebildet. Der Maßstab ist in allen Diagrammen gleich. Die Einteilung erfolgte gemäß den sechs chemischen Gruppen (vgl. 3).
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2. Serratia liquefaciens
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Das GSH-Konjugat übt bereits drei Stunden nach Inkubation einen fördernden Einfluss auf die Bakterien aus (4). Dabei bewirkt der Einfluss der Konzentration im Gesamtbild etwa eine Verdopplung der Bakterien gegenüber der Kontrolle. Es fällt allerdings auf, dass die geringe Konzentration das Wachstum in Kombination mit einer Carboxylsäure (Sebacinsäure) und 2,3-Butanediol stark fördert, wohingegen die höhere Konzentration das Wachstum in Kombination mit Lactulose fördert.
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Nach 24 Stunden sind die Wachstumsunterschiede geringer. Zeigt die gering konzentrierte Variante ein Muster, das dem nach drei Stunden mehr oder weniger ähnelt, sind die Unterschiede in der höher konzentrierten Variante stärker. In einigen Wells konnte schließlich kein Wachstum mehr festgestellt werden. Einzig unter Sebacinsäure-Einfluss ist noch eine deutliche Förderung des Wachstums messbar (4).
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Werden die Bakterien mit reinem GS-DNB inkubiert, so wird zunächst das Wachstum gehemmt (4). Diese Hemmung fällt in der geringer konzentrierten Variante stärker aus als in der höher konzentrierten.
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Nach 24 Stunden zeigen sich keine Unterschiede, weder gegenüber der Kontrolle noch der verwendeten Konjugat-Konzentration.
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Gibt man zu den Bakterien γGC-DNB, so ist hier das Wachstum zunächst gehemmt (5). Mehr Konjugat hemmt weniger, vor allem im Zusammenhang mit Carboxylsäuren (Sebacinsäure). Mehr Konjugat führt eher zu einer Wachstumsförderung.
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Über die Zeit verschwindet die Hemmwirkung der γGC-Konjugate. Besonders bei Anwesenheit von Sebacinsäure wird das Wachstum gegenüber der Kontrolle gefördert.
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Über die Zeit ist kein Einfluss der Konjugate auf das bakterielle Wachstum messbar, höher konzentriertes Konjugat scheint aber in allen Fällen einen positiven Einfluss zu haben.
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Der Einfluss des Cys-Konjugates ähnelt im Wesentlichen dem Einfluss des γGC-Konjugates. Das Wachstum ist zunächst gehemmt gegenüber der Kontrolle, später ist es jedoch wieder ausgeglichen. Eine höhere Konjugat-Konzentration hat leicht wachstumsfördernden Einfluss.
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Auf das Cystein-Konjugat reagiert Serratia liquefaciens ähnlich: in der geringen Konzentration entspricht der Umsatz der unbeeinflussten Kontrolle, hohe Konzentrationen bewirken, dass einige Carboxylsäuren überhaupt nicht mehr genutzt werden können (5).
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Die höher konzentrierten Konjugat-Lösungen haben einen stärkeren Einfluss auf das bakterielle Wachstum als die geringer konzentrierten.
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Anfängliche Wachstumsschwierigkeiten werden übel die Zeit ausgeglichen. Unter GS-X-Einfluss wird das Wachstum von Serratia liquefaciens gefördert. Cys-X und γGC-X, die sich in ihrer Wirkung kaum unterscheiden, hemmen das Wachstum zunächst, es erfolgt jedoch ein Ausgleich mit Anpassung an die Entwicklung in den Kontrollplatten. Das überdurchschnittliche Wachstum wie unter GS-X-Einfluss wird jedoch nie erreicht.
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3. Burkholderia cepacia
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Burkholderia cepacia reagiert auf das GSH-Konjugat relativ verhalten, zeigt aber einen deutlichen Wachstumsschub, sobald Glucose-1-Phosphat im well enthalten ist (6).
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Ist die Konjugat-Lösung höher konzentriert, sind die Unterschiede zwischen den einzelnen Substraten grösser, auch der fördernde Einfluss tritt deutlicher hervor.
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Die Unterschiede zwischen den beiden Konzentrationsstufen verwischen im Laufe der Zeit und es entstehen zwei nahezu identische Muster.
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Der Einfluss des GSH-Konjugates auf Burkholderia cepacia ist stets ein positiver, der sich in einer Förderung des Wachstums äußert.
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Wird zu Burkholderia cepacia gering konzentrierte GS-DNB-Lösung gegeben, ist das Wachstum im Vergleich zur Kontrolle in den ersten drei Stunden ausgeglichen. Eine Erhöhung der Konzentration bewirkt eine Förderung (6).
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24 Stunden nach Inkubation ist das bakterielle Wachstum unter Einfluss der gering konzentrierten Lösung in allen Wells stark gehemmt. Ist die Lösung höher konzentriert, bestehen keine Unterschiede zur unbeeinflussten Kontrolle.
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Nach Zugabe von γGC-X bleibt das bakterielle Wachstum in den ersten drei Stunden hinter der Kontrolle deutlich zurück. Ausnahmen bilden die Wells, in denen Thymidin (gering) bzw. Glucose-1-Phosphat (hoch) enthalten ist. Dort wird das Wachstum gefördert (7).
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Nach 24 Stunden ist das Wachstum der gering konzentrierten Variante fast vollständig unterdrückt. In der höher konzentrierten Variante zeichnet sich vereinzelt eine leichte Wachstumsförderung ab.
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Das gering konzentrierte Cys-Konjugat unterdrückt das Wachstum von Burkholderia cepacia während der ersten drei Stunden Bei Zugabe höherer Konzentrationen reicht das Wachstum fast an das der Kontrolle heran, in Ausnahmefällen (Thymidin/Glucose-1-Phosphat) ist das Wachstum deutlich verbessert (7).
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Über die Zeit gleichen sich in der gering konzentrierten Variante die Unterschiede an, und das Wachstum ist nur geringfügig anders als das in den Kontrollplatten.
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Hochkonzentriertes Cys-X bewirkt über die Zeit eine recht starke Wachstumsförderung.
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Die höher konzentrierten Parent-Mix-Lösungen bewirken langfristig eine leichte Wachstumsförderung. GS-DNB kann, gering konzentriert, das Wachstum hemmen, höher konzentriert hat es keinen Einfluss auf Burkholderia cepacia.
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4. Burkholderia sacchari
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Auf das GS-X reagiert Burkholderia sacchari sehr differenziert. Drei Stunden nach der Zugabe kommt es in einigen Wells zu einem sprunghaften Anstieg des Wachstums gegenüber der Kontrolle. Dieser Wachstumsschub ist in der höher konzentrierten Variante noch ausgeprägter (8).
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Besonders drastisch entwickelt sich das Wachstum über die Zeit. Dann kommt es zu einer regelrechten Explosion des Wachstums.
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Die GS-DNB-Lösung zeigt kaum Wirkung auf das bakterielle Wachstum. In der gering konzentrierten Variante bleibt das Wachstum gegenüber der Kontrolle leicht zurück, höher konzentriert entspricht das Wachstum etwa dem der Kontrolle (8).
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Diese leichten Unterschiede verwischen mit der Zeit, und es ist keine Beeinflussung der Konjugat-Lösung gegenüber der Kontrolle messbar.
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Die bei GS-X (Parent Mix) festgestellte, anfängliche Wachstumsförderung zeigt sich noch deutlicher nach Zugabe von γGC-X. In Kombination mit β-Methyl-D-Glucosid erfährt das Wachstum eine starke Förderung. Der Einfluss ist in der höher konzentrierten Variante deutlicher (9).
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Im Laufe der Zeit ist das Wachstum zwar generell verbessert gegenüber der unbehandelten Kontrolle, im Vergleich zu GS-X jedoch schwächer.
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Wie auch schon für die anderen Konjugate festgestellt, ist auch für das Cys-X zu verzeichnen, dass das Wachstum extrem gefördert werden kann. Traf dies für die anderen Konjugate besonders zu, wenn ein Substrat aus der Gruppe der Kohlenhydrate beteiligt war, so gilt dies im Fall des Cys-X für Aminosäuren wie z. B. L-Phenylalanin, L-Alanin oder L-Pyro-glutaminsäure (9).
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Wird die Konjugat-Konzentration erhöht, ergibt sich ein vollständig anderes Bild. Nun erfolgt die Förderung vor allem dann, wenn eine Substanz aus der Gruppe der Kohlenhydrate, z. B. β-Methyl-D-Glucosid, zugegen ist.
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Über die Zeit gleichen sich die anfänglichen Wachstumsförderungen an. Im Gegensatz dazu wird das Wachstum in anderen Wells stark gefördert.
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Unter Einfluss des gering konzentrierten Cys-X ist das Wachstum besser als unter hoch konzentriertem.
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Die Konjugat-Lösungen haben auf Burkholderia sacchari vergleichbare Wirkungen wie auch auf Burkholderia cepacia. Die Parent-Mix-Lösungen fördern das Wachstum langfristig, während GS-DNB keinen Einfluss hat.
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Auffallend ist, dass die Burkholderien stets kräftiger wachsen als Serratia liquefaciens.
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Diskussion der Ergebnisse
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Der Einfluss der Konjugate auf die Bakterien ist sehr ausgeprägt. Gegenüber den unbeeinflussten Kontroll-Suspensionen ist das Wachstum durch die Thiol-Konjugate unabhängig von der Konzentration vermindert.
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Das Wachstum von Serratia liquefaciens wird langfristig stimuliert, wenn zu den Bakterien Sebacinsäure und ein thiolisches Konjugat gegeben wird.
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Eine Wachstumsförderung von Burkholderia cepacia ist möglich nach Zugabe von β-Methyl-D-Glucosid.
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Auch Burkholderia sacchari wird durch eine Mischung von CDNB und GSH gefördert, vor allem in Kombination mit α-Cyclodextrin, Gentiobiose oder Uridin.
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Das Wachstum von Serratia liquefaciens und Burkholderia sacchari wird kaum durch das GS-DNB beeinflusst.
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Eine geringe Menge dieser Substanz hemmt dagegen das Wachstum von Burkholderia cepacia.
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Die positiven Wirkungen von Bodenbakterien auf das pflanzliche Wachstum sind seit langem bekannt und wurden von vielen Stellen berichtet. Serratia fördert das pflanzliche Wachstum vor allem dann, wenn die Temperatur etwa 25°C beträgt. Doch auch bei geringen Temperaturen konnte ein positiver Effekt gemessen werden.
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Burkholderia cepacia hat durch die Ausscheidung verschiedener Stoffe fungizide Wirkung (). Es konnte gezeigt werden, dass dieses Bakterium Pilze aus der Gattung Fusarium zurückdrängen kann bzw. Pflanzen bei Burkholderia cepacia-Besiedlung einem Angriff dieser Pilze besser standhalten können ().
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Burkholderia cepacia zeigt besondere Affinität zu Toluen. Das Bakterium schwimmt zu dieser Substanz und leitete so dessen Abbau ein.
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Die vorteilhafte Wirkung von Burkholderia cepacia auf das pflanzliche Wachstum ist bestätigt worden.
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Die Wirkungen von Burkholderia sacchari sind bislang nicht erforscht, da es sich bei diesem Bakterium um eine sehr neue Art handelt, die 2001 erstmalig beschrieben wurde.
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Die Ergebnisse und Aussagen, die man aufgrund des BIOLOG-Versuches treffen kann, sind stark abhängig vom Messzeitpunkt. Misst man die Platten drei Stunden nach der Inkubation, so ergibt sich ein völlig anderes Bild gegenüber der 24stündigen Inkubation.
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Vom Hersteller wird zwar empfohlen, einmalig nach 3stündiger Inkubation zu messen. Langfristige Folgen und Auswirkungen auf die betreffende Bakterien-Population treten jedoch erst nach längerer Inkubation hervor.
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Mit der modifizierten Auswertung kann im Gegensatz zur üblicherweise angewendeten Hauptkomponentenanalyse der Focus auf einzelne, ausgewählte C-Quellen gerichtet werden. So kann ermittelt werden, ob Effekte, die durch die Zugabe verschiedener Substanzen hervorgerufen werden, von einzelnen C-Quellen ausgeglichen oder sogar noch verstärkt werden können.
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Durch die Behandlung der Kulturpflanzen mit Herbiziden in der landwirtschaftlichen Produktion entstehen die GSH-Konjugate und ihre Metaboliten als Entgiftungsprodukte, die dann an den Boden abgegeben werden. Dort werden die Bodenbakterien im Wachstum gehemmt oder gefördert. Die Effekte sind abhängig von Bakterium, Konjugat und dessen Konzentration.
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Die Förderung kann nicht nur den ”positiven” Bakterien widerfahren, es können auch Pathogene begünstigt werden. Um nur durch die notwendige Maßnahme der Herbizid-Ausbringung mit ihrer anschließenden Abgabe von Metaboliten an den Boden keine Schädigung durch massenhafte Vermehrung pathogener Bakterien zu erzeugen, ist es von Vorteil zu wissen, mittels welcher Substanzen dies unterbunden werden kann. Der inverse Fall gilt für Bakterien, die das Wachstum von Pflanzen positiv beeinflussen, sog. PGPR.
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Mit diesen detaillierten BIOLOG-Ergebnissen ist es möglich, eine Kombination aus Xenobiotika-Metaboliten und C-Quelle zu finden, die es ermöglicht, pathogene Bakterien gezielt zu hemmen und PGPR zu fördern. Daraus ergibt sich eine Behandlung, die für die Kulturpflanzen sehr vorteilhaft ist.
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Für eine gezielte Bekämpfung pathogener Bodenbakterien mit gleichzeitiger Förderung der PGPR sind weitere Versuche mit entsprechenden Bakterien notwendig. Es müssten pathogene Bakterien unter gleichen Bedingungen in die BIOLOG® Micro Plates gefüllt werden und anschließend die Substrate ausgewählt werden, die das Wachstum hemmen. Die Substrate, bei denen die PGPR gefördert und gleichzeitig die Pathogene gehemmt werden, sind geeignet, eine gesunde Rhizoflora zu schaffen, bei der gesundes Pflanzenwachstum gewährleistet ist.
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Somit ergibt sich aus der vorliegenden Arbeit ein recht komplexes Bild des Verhaltens entgifteter Fremdstoff-Metaboliten durch die Pflanze und die Rhizosphäre. Diese Metaboliten besitzen, wie mehrfach gezeigt worden ist, hinreichend Signalcharakter für die Pflanze selbst, aber auch für andere Organismen, die die Rhizosphäre besiedeln. Durch die Exudation dieser Signalmoleküle in die Wurzelzone verändern Mykorrhizapilze ihren Stoffwechsel und Bakterien ihr Wachstum. Gerade letzteres Phänomen kann zu bisher nicht vorhersehbaren Veränderungen in der Rhizosphäre führen.
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Entscheidend ist es nun, Erkenntnisse darüber zu erlangen, wie die pflanzliche Gesundheit beeinflusst wird. Dabei sollte durchaus in Betracht gezogen werden, dass die Metaboliten von Agrochemikalien, die wir derzeit anwenden, um unsere Nutzpflanzen zu schützen, in der Rhizosphäre Effekte hervorrufen können, die uns zumindest unterwartet erscheinen.
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Literatur
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- Coleman et al. 1997:
Coleman J 0 D, Blake-Kalff M M A, Davies T G E (.1997) Detoxification of xenobiotics by plants: chemical modification and vacuolar compartmentation. Trends in Plant Science 2 (4) 144–151
- Ikeda et al. 1997:
Ikeda K, Toyota K, Kimura M (1997) Effects of soil compaction on the microbial populations of melon and maize rhizoplane. Plant and Soil 189 91–96
- Nardi et al. 2000:
Nardi S, Concheri G, Pizzeghello D, Sturaro A, Rella R, Parvoli G (2000) Soil organic matter mobilization by root exudates. Chemosphere 5 653–658
- Walker et al. 2003:
Walker T S, Bais H P, Grotewold E, Vivanco J M (2003) Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiol 132 44–51
