ES2312780T3 - Afecciones autoinmunes y deficiencias de oxidasa nadph. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para determinar una susceptibilidad de un mamífero a desarrollar una afección autoinmune o para diagnosticar una afección autoinmune, dicha afección autoinmune se ha seleccionado de artritis y esclerosis múltiple, dicho método comprende determinar si o no dicho mamífero comprende una variante genética del gen que codifica la oxidasa NADPH, en donde la presencia de dicha variante genética indica que dicho mamífero tiene o es susceptible a desarrollar dicha afección autoinmune.
Description
Afecciones autoinmunes y deficiencias de oxidasa
NADPH.
La invención se relaciona con métodos y
materiales involucrados en el diagnóstico y tratamiento de
afecciones autoinmunes. En particular, la invención se relaciona
con métodos y materiales involucrados en el diagnóstico de
afecciones de artritis que están acompañadas por deficiencia de
oxidasa NADPH, métodos y materiales involucrados en el tratamiento,
prevención, o retraso del inicio de las afecciones de artritis que
están acompañadas por una deficiencia de oxidasa NADPH, cualquier
método del material involucrado en identificar agonista y
antagonistas de la actividad de oxidasa NADPH.
Las afecciones autoinmunes son afecciones en
donde un sistema inmune del mamífero empieza a reaccionar contra
sus propios tejidos. Tales afecciones incluyen, sin limitación,
artritis (por ejemplo, artritis reumatoide) (RA)), esclerosis
múltiple, lupus, uveítis autoinmune. Diabetes tipo I, asma
bronquial, artritis séptica inducida por estafilococos o
estreptococos, y enfermedades cardiovasculares que involucran
vasculitis.
El RA es una enfermedad inflamatoria crónica que
se puede encontrar en aproximadamente 1-2% de la
población. El RA afecta principalmente las articulaciones
periféricas en donde la sinovitis inflamatoria conduce a la
destrucción del cartílago, erosión del hueso, y finalmente la
deformidad de la articulación y la pérdida de la función articular.
El RA es una compleja enfermedad en la que los factores ambientales
así como también múltiples regiones cromosomitas están involucrados
en la susceptibilidad al RA. Los inductores de la artritis en los
modelos animales incluyen adyuvantes, colágeno (por ejemplo,
colágeno tipo II) (artritis inducida por colágeno (CIA)),
hexadecano (artritis inducida por hexadecano (HIA)), aceite (por
ejemplo. Adyuvante incompleto de Freund), escualeno (arthritis
inducida por escualeno (SIA), y pristano (artritis inducida pro
pristano (PIA)). Las regiones cromosómicas conocidas por estar
asociadas con el desarrollo del RA incluyen la principal región
compleja de histocompatibilidad. Adicionalmente las diferentes
regiones genómicas se conocen por controlar diferentes fases de la
enfermedad tal como inicio, severidad durante la fase de inicio
aguda, y la severidad de la destrucción en la fase de recaída
crónica.
La invención proporciona métodos y materiales
relacionados con el diagnóstico y tratamiento de afecciones
autoinmunes tal como artritis (por ejemplo, RA), esclerosis
múltiple, lupus, uveítis autoinmune diabetes, tipo I, asma
bronquial, artritis séptica inducida por estafilococos o
estreptococos, y enfermedad cardiovascular que involucra
vasculitis. Por ejemplo, la invención proporciona métodos y
materiales involucrados en diagnosticar afecciones autoinmunes que
están acompañadas por una deficiencia de oxidasa NADPH, métodos y
materiales involucrados en tratar, prevenir y/o retardar el inicio
de las afecciones autoinmunes que están acompañadas por deficiencia
de oxidasa NADPH, y métodos y materiales involucrados en identificar
agonista y antogosnista de la actividad oxidasa NADPH. Las
afecciones autoinmunes que están acompañadas por una deficiencia de
oxidasa de NADPH incluyen, sin limitación, artritis (por ejemplo,
RA), esclerosis múltiple, lupus, uveítis autoinmune diabetes, tipo
I, asma bronquial, artritis séptica inducida por estafilococos o
estreptococos, y enfermedades cardiovasculares que involucran
afecciones de vasculitis que coexiste con o se originan por una
deficiencia en la actividad oxidasa NADPH. Para el propósito de
esta invención, el término "artritis acompañada por deficiencia de
oxidasa NADPH" (abreviado a "AANOD") se refiere a cualquier
afección de artritis que coexiste con o se origina por una
deficiencia de la actividad oxidasa NADPH. Tal una deficiencia puede
ser la falta completa de actividad oxidasa NADPH o una reducción
parcial en la actividad oxidasa NADPH. Por ejemplo, un mamífero
puede tener AANOD cuando el mamífero tiene artritis así como
también las células que exhiben o tienen actividad oxidasa NADPH a
un grado menor que aquel normalmente exhibido por mamíferos
saludable de la misma especie. De la misma forma, un mamífero puede
tener esclerosis múltiple acompañada por una deficiencia de oxidaba
NADPH cuando ese mamífero tiene esclerosis múltiple así como
también células que exhiben actividad oxidasa NADPH a un grado
menor de aquel que exhibe normalmente mamíferos saludables de la
misma especie.
Cabe notar que los métodos y materiales para
diagnosticar y tratar el AANOD descrito aquí se pueden utilizar
para diagnosticar y tratar otras afecciones autoinmunes que están
acompañadas por la deficiencia de oxidasa NADPH. Por ejemplo, se
pueden utilizar los métodos y materiales descritos aquí para
diagnosticar y tratar afecciones de esclerosis múltiple que se
acompañan por deficiencia de oxidasa NADPH. A este respecto, la
encefalitis alérgica (autoinmune) experimental (EAE) es un modelo
útil para esclerosis múltiple.
Diagnosticar pacientes que tiene una afección
autoinmune acompañada por una deficiencia de oxidasa NADPH (por
ejemplo, AANOD) puede ayudar a los médicos a determinar los
tratamientos apropiados para aquellos pacientes. Por ejemplo, un
médico que diagnostica a un paciente que tiene AANOD puede tratar
ese paciente con medicamentos que mejoran la artritis del paciente
y la deficiencia de la oxidasa NADPH. En algunos casos, se puede
utilizar medicación única para mejorar un nivel de actividad
oxidasa NADPH del paciente de tal manera que se alivian o reducen
los síntomas de artritis del paciente. Así, tratar un paciente que
tienen AANOD al modular las actividades oxidasa NADPH pueden
mejorar la salud del paciente y la calidad de vida, por ejemplo, al
reducir los síntomas o la severidad de los síntomas asociados con
la artritis o retraso del inicio de la artritis.
Adicionalmente, la identificación de los
agonistas y antagonistas de la actividad oxidasa NADPH puede ayudar
a los médicos y pacientes. Por ejemplo, los métodos y materiales
descritos aquí se pueden utilizar para identificar agentes que
incrementan la actividad oxidasa NADPH de tal manera que los
pacientes con una afección autoinmune acompañada por deficiencia de
oxidasa NADPH (por ejemplo, AANOD) se pueden tratar
exitosamente.
La invención se basa en el descubrimiento que la
artritis puede estar asociada con u originada por un nivel reducido
de la actividad oxidasa NADPH. Por ejemplo, el desarrollo de los
síntomas de artritis severa en modelos de artritis en animales
puede ser, por lo menos parcialmente, dependiente de la presencia de
la baja actividad oxidasa NADPH. La invención también se basa en el
descubrimiento que el nivel reducido de la actividad oxidasa NADPH
responsable de la susceptibilidad a la artritis se puede originar
por variaciones de secuencia (por ejemplo, sitios de fosforilación
mutados) en un componente polipéptido (por ejemplo, polipéptido
P47PHOX) de una enzima oxidasa NADPH de mamífero. Adicionalmente,
la invención se basa en el descubrimiento de que los mamíferos
propensos a desarrollar artritis se pueden proteger al suministrar a
aquellos mamíferos niveles normales de actividad de oxidasa NADPH.
Por ejemplo, un modelo de animal propenso a desarrollar síntomas de
artritis severa se puede rescatar al proporcionar a ese animal una
ruta de oxidasa NADPH completamente funcional.
En general, la invención describe un método para
evaluar una susceptibilidad del mamífero al desarrollar una
afección autoinmune (por ejemplo, artritis o esclerosis múltiple),
el método incluye: (a) proporcionar, de un mamífero, una muestra de
fluido sinovial o sangre que contiene una célula; (b) determinar el
nivel de actividad oxidasa NADPH de la célula después de poner en
contacto la célula con un activador de oxidasa NADPH; (c) determinar
si o no el nivel es menor que un nivel de control de la actividad
oxidasa NADPH, en donde el nivel de control es la cantidad promedio
de la actividad oxidasa NADPH de células de control de una población
de mamíferos sin la afección autoinmune (por ejemplo, mamíferos no
artríticos), y en donde los mamíferos sin la afección autoinmune
son de la misma especie del mamífero; (d) identificar el mamífero
por ser susceptible a desarrollar la afección autoinmune cuando el
nivel es menor que el nivel de control. El activador de oxidasa
NADPH puede ser norfloxacin, ácido fosfatídico, diacilglicerol,
ácido araquidónico, acetato miristato forbol, lisofosfatidilcolina,
fMLP, pristano, fitol, octano, decano, undecano, dodecano,
tridecano, tetradecano, hexadecano, hexadeceno, heptadecano,
octadecano, galectina 1, o galectina 3. La actividad oxidasa NADPH
se puede determinar al medir las especies de oxígeno reactivo
superóxido. La población puede contener por lo menos 10 mamíferos.
La etapa (c) puede incluir determinar si o no el nivel está entre 5
y 75 por ciento menos que el nivel de control, en donde la etapa
(d) incluye identificar el mamífero por ser susceptible a
desarrollar la afección autoinmune cuando el nivel está entre 5 y
75 por ciento menos que el nivel de control. La Etapa (c) puede
incluir determinar si o no el nivel está entre 25 y 55 por ciento
menos que el nivel de control, en donde la etapa (d) incluye
identificar el mamífero por ser susceptible a desarrollar la
afección autoinmune cuando el nivel está entre 25 y 55 por ciento
menos que el nivel de control.
La invención también describe un método para
evaluar una susceptibilidad del mamífero a desarrollar una afección
autoinmune (por ejemplo, artritis o esclerosis múltiple), el método
contiene: (a) proporcionar, de un mamífero, una muestra de fluidos
sinovial o sangre; (b) determinar el nivel de sangre o componente de
fluido sinovial que refleja la actividad oxidasa NADPH; (c)
determinar si o no el nivel es menor que un nivel de control, en
donde el nivel de control es la cantidad promedio del componente en
las muestras de control de una población de mamíferos sin a la
afección autoinmune (por ejemplo, mamíferos no artríticos), y en
donde los mamíferos sin la afección autoinmune son de la misma
especie como el mamífero; y (d) identificar el mamífero por ser
susceptible a desarrollar la afección autoinmune cuando el nivel es
menor que el nivel de control. El componente que refleja la
actividad oxidasa NADPH puede ser dialdehído malónico.
Una modalidad de la invención representa una
método para evaluar una susceptibilidad del mamífero al desarrollar
una afección autoinmune seleccionada entre artritis o esclerosis
múltiple, el método contiene determinar si o no un mamífero
contiene una variante genética de gen que codifica la oxidasa NADPH
en donde la presencia de la variante genética indica que el
mamífero es susceptible a desarrollar la afección autoinmune. La
variante genética puede codificar un polipéptido mutante. El
polipéptido mutante puede ser una polipéptido GP91PHOX, polipéptido
P22PHOX, polipéptido P40PHOX, polipéptido P47PHOX, o polipéptido
P67PHOX. Por ejemplo, el polipéptido por ejemplo, el polipéptido
mutante puede ser un polipéptido P47PHOX. El mamífero puede ser un
humano, y el polipéptido P47PHOX mutante puede contener la
secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6 con por lo menos dos
sustituciones de aminoácidos. El polipéptido P47PHOX mutante puede
contener una secuencia de aminoácidos que tiene un residuo de
aminoácidos diferente a valina en la posición que se alinea con la
posición 106 de la SEQ ID NO: 4 o un residuo de aminoácido
diferente de treonina en la posición que se alinea con la posición
153 de la SEQ ID NO: 4. la variante genética puede contener una
mutación en una secuencia reguladora del gen.
La invención describe un método para
diagnosticar una afección autoinmune acompañada por deficiencia de
oxidasa NADPH (por ejemplo, AANOD o esclerosis múltiple acompañada
por deficiencia de oxidasa NADPH) en un mamífero que tiene una
afección autoinmune, el método contiene: (a) proporcionar, del
mamífero, una muestra que contiene una célula; (b) determinar el
nivel de actividad oxidasa NADPH de la célula después de entrar en
contacto a la célula con el activador de oxidasa NADPH; (c)
determinar si o no el nivel es menor que un nivel de control de
actividad oxidasa NADPH en donde el nivel de control es la cantidad
promedio de actividad oxidasa NADPH de la células de control de una
población de mamíferos sin la afección autoinmune (por ejemplo,
mamíferos no artríticos), y en donde los mamíferos sin la afección
autoinmune son de la misma especie que del mamífero; y (d)
identificar el mamífero por tener una afección autoinmune asociada
por deficiencia de oxidasa NADPH cuando el nivel es menor que el
nivel de control. El activador de oxidasa NADPH puede ser
norfloxacina, ácido fosfatídico, diacilglicerol, ácido
araquidónico, acetato miristato forbol, lisofosfatidilcolina, fMLP,
pristano, fitol, octano, decano, undecano, dodecano, tridecano,
tetradecano, hexadecano, hexadeceno, heptadecano, octadecano,
galectina 1, o galectina 3. El nivel de actividad oxidasa NADPH se
puede determinar al medir las especies superóxido u oxígeno
reactivo. La población puede contener por lo menos 10 mamíferos sin
las afecciones autoinmunes. La Etapa (c) puede incluir determinar
si o no el nivel está entre 5 y 75 por ciento menos que el nivel de
control, en donde la etapa (d) incluye identificar al mamífero por
ser susceptible a desarrollar la afección autoinmune asociada por
la deficiencia de oxidasa NADPH cuando el nivel está entre 5 y 75
por ciento menos que el nivel de control. La etapa (c) puede
incluir determinar si o no el nivel está entre el 25 y 55 por
ciento menos que el nivel de control, en donde la etapa (d) incluye
identificar el mamífero por ser susceptible a desarrollar la
afección autoinmune asociada por la deficiencia de oxidasa NADPH
cuando el nivel está entre 25 y 55 por ciento menos que el nivel de
control.
La invención describe un método para
diagnosticar una afección autoinmune asociada por la deficiencia de
la oxidasa NADPH (por ejemplo, AANOD o esclerosis múltiple
acompañada por deficiencia de oxidasa NADPH) en un mamífero que
tiene una afección autoinmune, el método contiene: (a) suministrar,
del mamífero, una muestra del fluido sinovial o sanguíneo; (b)
determinar el nivel de componente de fluido sinovial o sanguíneo que
refleja la actividad oxidasa NADPH; (c) determinar si o no el nivel
es menor que un nivel de control, en donde el nivel de control es
la cantidad promedio del componente en muestras de control de una
población de mamíferos sin la afección autoinmune (por ejemplo,
mamíferos no artríticos), y en donde los mamíferos sin la afección
autoinmune son de la misma especie que el mamífero; y (d)
identificar el mamífero por tener la afección autoinmune asociada
por la deficiencia de oxidasa NADPH cuando el nivel es menor que el
nivel de control.
La invención describe un método para
diagnosticar una afección autoinmune acompañada por deficiencia de
oxidasa NADPH (por ejemplo., AANOD o esclerosis múltiple acompañada
por deficiencia de oxidasa NADPH) en un mamífero que tiene una
afección autoinmune, el método incluye: (a) proporcionar una muestra
de fluido sanguíneo o sinovial del mamífero; (b) determinar el
nivel de un componente de fluido sinovial o sanguíneo que refleja la
actividad oxidasa NADPH; (c) determinar si o no el nivel es menor
que un nivel de control de la actividad oxidasa NADPH, cuando el
nivel de control es la cantidad promedio de actividad oxidas NADPH
de las células de control de una población de mamíferos sin la
afección autoinmune, y en donde los mamíferos sin la afección
autoinmune son de la misma especie que el mamífero; (d) identificar
al mamífero por tener la afección autoinmune acompañada por la
deficiencia de oxidasa NADPH cuando el nivel es menor que el nivel
de control. El componente que refleja la actividad oxidasa NADPH
puede ser dialdehído malónico.
Una modalidad de la invención representa un
método para diagnosticar una afección autoinmune seleccionada entre
artritis y esclerosis múltiple en un mamífero el método incluye
determinar si o no el mamífero contiene una variante genérica del
gen que codifica la oxidasa NADPH, en donde la presencia de la
variante genérica indica que el mamífero tiene la afección
autoinmune acompañada por deficiencia de oxidasa NADPH. La variante
geneática puede codificar un polipéptido mutante. El polipéptido
mutante puede ser un polipéptido GP91PHOX, polipéptido P22PHOX,
polipéptido P40PHOX polipéptido P47PHOX, o polipéptido P67PHOX. Por
ejemplo, el polipéptido mutante puede ser una polipéptido P47PHOX.
El mamífero puede ser un humano, y el polipéptido mutante P47PHOX
puede contener la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6 con por
lo menos dos sustituciones de aminoácidos. El polipéptido P47PHOX
mutante puede contener una secuencia de aminoácido que tiene un
residuo de aminoácido diferente de valina en la posición que se
alinea con la posición 106 de la SEQ ID NO: 4 o un residuo
aminoácido diferente de treonina en la posición que se alinea con
la posición 153 de la SEQ ID NO: 4. la variante genérica puede
contener una mutación en una secuencia reguladora del gen.
La invención describe un método para tratar un
mamífero que tiene una afección autoinmune acompañada por
deficiencia de oxidasa NADPH (por ejemplo, AANOD o esclerosis
múltiple acompañada por deficiencia de oxidasa NADPH), el método
incluye administrar, al animal un agente que mejora la actividad
oxidasa NADPH. El agente puede ser norfloxacina, ácido fosfatídico,
diacilglicerol, ácido araquidónico, acetato miristato forbol,
lisofosfatidilcolina, fMLP, pristano, fitol, octano, decano,
undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano, hexadeceno,
heptadecano, octadecano, galectina 1, o galectina 3.
Alternativamente, el agente puede ser un derivado más polar de los
compuestos mencionados anteriormente. Por ejemplo, los agentes
pueden ser un derivado alqueno de los compuestos mencionados
anteriormente (por ejemplo, undeceno, hexadeceno), o un derivado
ácido de los compuestos mencionados anteriormente. En una
modalidad, se utiliza hexadeceno. En otra modalidad, se utiliza
undecano. El agente se puede administrar
intra-dérmicamente,
intra-peritonealmente, o intranasalmente. En otra
modalidad, la invención representa el uso de un agente en la
fabricación de un medicamento para tratar una afección autoinmune
seleccionada entre artritis y esclerosis múltiple, en donde la gente
mejora la actividad de oxidasa NADPH en un mamífero y es fitol,
undecano, o hexadeceno.
La invención describe un método para formular un
medicamento para el tratamiento de una afección autoinmune, el
método incluye: (a) poner en contacto una muestra que comprende
células o una fracción celular que tiene actividad NADPH con un
agente de prueba, (b) determinar el nivel de actividad oxidasa NADPH
en la muestra, (c) determinar si o no el nivel es mayor que un
nivel de control de la actividad oxidasa, en donde el nivel de
control es la cantidad de actividad oxidasa NADPH en una muestra de
control que le falta el agente de prueba, (d) identificar el agente
de prueba como un agente útil para el tratamiento de la afección
autoinmune cuando el nivel de la actividad oxidasa NADPH es mayor
que el nivel de control, y (e) formular un medicamento del agente
para el tratamiento de la afección autoinmune. La afección
autoinmune puede ser artritis o esclerosis múltiple.
La invención describe un método para identificar
un agente que active la actividad oxidasa NADPH en una célula, en
donde la célula es de un animal no humano susceptible de inducción
de artritis, el método que comprende determinar si el nivel de
actividad oxidasa NADPH se incrementa en la célula después que la
célula se trata con una agente de prueba, en donde un incremento en
el nivel indica que el agente de prueba activa la actividad oxidasa
NADPH. La célula puede ser una célula de una rata DA. La célula
puede ser un linfocito. El animal no humano puede ser susceptible a
artritis inducida por pristano, o artritis inducida por colágeno, o
artritis inducida por adyuvante, o artritis inducida por aceite, o
artritis inducida por hexadecano, o artritis inducida por escualeno
o artritis inducida por avridina. El nivel de actividad oxidasa
NADPH se puede determinar al medir las especies de oxígeno reactivo
o superóxido, por ejemplo, mediante un ensayo citocromo o ensayo
WST-1 o ensayos basado (por ejemplo, FASC)
utilizando un clitómetro de flujo, por ejemplo, dihidrorodamina 123
(DHR-123).
La invención describe un método para identificar
una agente útil en el tratamiento de una afección autoinmune, el
método incluye (a) poner en contacto una muestra que comprende
células o una fracción celular que tiene una actividad NADPH con un
agente de prueba, (b) determinar el nivel de actividad oxidasa NADPH
en la muestra, (c) determinar si o no el nivel es mayor que un
nivel de control de la actividad oxidasa NADPH, en donde el nivel
de control es la cantidad de actividad oxidasa NADPH en una muestra
de control que le falta al agente de prueba, y (d) identificar el
agente de prueba como un agente útil para el tratamiento de la
afección autoinmune cuando el nivel de actividad oxidasa NADPH es
mayor que el nivel de control. La afección autoinmune puede ser
artritis o esclerosis múltiple.
La invención describe un método para identificar
un agente útil en el tratamiento de una afección autoinmune, el
método incluye (a) poner en contacto una muestra que comprende
células o una fracción celular que tiene una actividad NADPH con un
agente de prueba, (b) poner en contacto la muestra con un activador
de oxidasa NADPH, (c) determinar el nivel de actividad oxidasa
NADPH en la muestra, (d) determinar si o no el nivel es mayor que
un nivel de control de la actividad oxidasa NADPH, en donde el nivel
de control es la cantidad de actividad oxidasa NADPH en una muestra
de control tratada con el activador en la ausencia del agente de
prueba y (identificar el agente de prueba como un agente útil para
el tratamiento de la afección autoinmune cuando el nivel de
actividad oxidasa NADPH es mayor que el nivel de control. La
afección autoinmune puede ser artritis o esclerosis múltiple.
En otra modalidad, la invención representa un
método para identificar un agente que mejora la actividad oxidasa
NADPH en una célula, en donde la célula es de un animal no humano
susceptible a la inducción de artritis, el método incluye: (a)
poner en contacto la célula con un activador de oxidasa NADPH y un
agente de prueba para formar una célula de prueba; (b) determinar
el nivel de actividad oxidasa NADPH en la célula de prueba; (c)
determinar si o no el nivel es mayor que un nivel de control de
actividad oxidasa NADPH, en donde el nivel de control es la
cantidad de actividad oxidasa NADPH en una célula de control tratada
con un activador en la ausencia del agente de prueba; y (d)
identificar el agente por mejorar la actividad oxidasa NADPH cuando
el nivel es mayor que el nivel de control. La célula puede ser una
célula de una rata DA. La célula puede ser un linfocito. El animal
no humano puede ser susceptible a artritis inducida por pristano o
artritis inducida por colágeno, o artritis inducida por adyuvante,
o artritis inducida por aceite, o artritis inducida por hexadecano
o artritis inducida por escualeno, o artritis inducida por avridina.
El activador de NADPH puede ser norfloxacina, ácido fosfatídico,
diacilglicerol, ácido araquidónico, acetato miristato forbol,
lisofosfatidilcolina, fMLP, pristano, fitol, octano, decano,
undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano, hexadeceno,
heptadecano, octadecano, galectina 1, o galectina 3. El nivel de
actividad oxidasa NADPH se puede determinar al medir las especies
de oxígeno reactivo o superóxido, por ejemplo, mediante un ensayo
citocromo o ensayo WST-1 o ensayos basados (por
ejemplo, FASC) utilizando un clitómetro de flujo, por ejemplo,
dihidrorodamina 123 (DHR-123).
La invención describe un método para identificar
un agente que inhibe la actividad oxidasa NADPH en una célula, en
donde la célula es de un animal no humano susceptible a inducción de
artritis, el método comprende: (a) poner en contacto la célula con
un activador oxidasa NADPH y un agente de prueba para formar una
célula de prueba; (b) determinar el nivel de actividad oxidasa
NADPH en la célula de prueba; (c) determinar si o no el nivel es
menor que un nivel de control de actividad oxidasa NADPH en donde el
nivel de control es la cantidad de actividad oxidasa NADPH en una
célula de control tratada con el activador en la ausencia del agente
de prueba; (d) identificar el agente por inhibir la actividad
oxidasa NADPH cuando el nivel es menor que el nivel de control. La
célula puede ser una célula de una rata DA. La célula puede ser un
linfocito. El animal no humano puede ser susceptible a artritis
inducida por pristano o artritis inducida por colágeno, o artritis
inducida por aceite, o artritis inducida por hexadecano o artritis
inducida por escualeno, o artritis inducida por avridina. El
activador de oxidasa NADPH puede ser norfloxacina, ácido
fosfatídico, diacilglicerol, ácido araquidónico, acetato miristato
forbol, lisofosfatidilcolina, fMLP, pristano, fitol, octano, decano,
undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano, hexadeceno,
heptadecano, octadecano, galectina 1, o galectina 3. El nivel de
actividad oxidasa NADPH se puede determinar al medir las especies de
oxígeno reactivo o superóxido.
En otra modalidad, la invención representa un
método para identificar un agente que reduce la activación de las
células T, el método incluye: (a) determinar si o no un agente de
prueba incrementa la actividad de oxidasa NADPH; y (b) clasificar
el agente de prueba como un agente que reduce la activación de las
células T cuando el agente de prueba incrementa la actividad
oxidasa NADPH.
La invención describe una rata congénica a una
segunda rata, en donde por lo menos un lugar difiere genéricamente
entre la rata y la segunda rata, en donde la segunda rata es
susceptible de inducción de artritis, en donde la rata contiene
células T de la segunda rata, y en donde la rata tiene artritis. La
rata puede ser una rata DA. E3c12-/-. La segunda rata puede ser una
rata DA. Por lo menos un lugar puede contener ácido nucleico que
codifica un polipéptido P47PHOX. En algunas modalidades, no más de
un lugar puede diferir genéticamente entre la rata y la segunda
rata. En aquellos casos, el lugar puede contener ácido nucleico que
codifica un polipéptido P47PHOX.
La invención describe un mamífero no humano que
tiene una ruta oxidasa NADPH deficiente, en donde el mamífero no
humano exhibe síntomas de una enfermedad auto inmune. La enfermedad
autoinmune puede se artritis, esclerosis múltiple, lupus, uveítis
autoinmune, diabetes tipo 1, asma bronquial, artritis séptica
inducida por estafilococos o estreptococos, o enfermedad
cardiovascular que involucra vasculitis. Por ejemplo, el animal no
humano puede exhibir síntomas de artritis. La artritis puede ser
artritis inducida por adyuvante, artritis inducida por colágeno o
artritis inducida por pristano, o artritis inducida por hexadecano o
artritis inducida por avridina, o artritis inducida por escualeno o
artritis inducida por aceite. La ruta de oxidasa NADPH deficiente de
puede indicar por una actividad oxidasa NADPH reducida. La
actividad oxidasa NADPH puede ser un resultado de un polipéptido
mutante en donde el polipéptido mutante funciona en la ruta oxidasa
NADPH. Por ejemplo, el polipéptido mutante puede ser un polipéptido
GP91PHOX, polipéptido P22PHOX, polipéptido P40PHOX, polipéptido
P47PHOX, o polipéptido, P67PHOX. Por ejemplo, el polipéptido
mutante puede ser un polipéptido P47PHOX. El polipéptido P47PHOX
puede contener las secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6 con por
lo menos dos sustituciones de aminoácidos. El polipéptido P47PHOX
puede contener una secuencia de aminoácido que tiene un residió de
aminoácido diferente a valina en la posición que se alinea con la
posición 106 de la SEQ ID NO: 4 o un residuo de aminoácido
diferente a treonina en la posición que se alinea con la posición
153 de SEQ ID NO: 4. en otras modalidades, la actividad oxidasa
NADPH reducida puede ser un resultado de una eliminación del gen o
lugar que codifica el Ncfl (p47phox). La eliminación puede ser
heterocigoto u homocigoto en el mamífero no humano. El mamífero no
humano puede ser un ratón.
La invención describe un método para detectar un
agente para determinar si el agente retrasa el inicio de la
artritis. El método incluye: (a) proporcionar un mamífero no humano
que tiene una ruta oxidasa NADPH deficiente; (b) administrar al
mamífero no humano el agente; (c) inducir artritis en el mamífero no
humano; (d) determinar si el agente retrasa el inicio de la
artritis en el mamífero no humano. La ruta oxidasa NADPH deficiente
puede ser como se describió previamente. Determinar si el agente
retrasa el inicio de la artritis puede incluir etapas tales como:
(a) determinar un día de inicio del valor artritis para el mamífero
no humano; (b) comparar el día de inicio del valor de artritis para
el mamífero no humano con un día de control de inicio del valor de
artritis. El día de control de inicio del valor de artritis se puede
determinar al determinar un día de inicio del valor de artritis
para un mamífero no humano de control al que no se ha administrado
el agente. El día de inicio de la artritis en el mamífero no humano
se puede considerar retrasado si este está después del día del
control del valor de inicio. La artritis inducida puede ser artritis
inducida por adyuvante, artritis inducida por colágeno, o artritis
inducida por pristano, o artritis inducida por hexadecano o artritis
inducida por avridina, o artritis inducida por escualeno. y/o
artritis inducida por aceite.
La invención describe un método para detectar un
agente para determinar si el agente trata la artritis. El método
incluye (a) proporcionar un mamífero no humano que tiene una ruta
oxidasa NADPH deficiente, en donde el mamífero no humano exhibe
síntomas de una artritis (por ejemplo, artritis inducida por
adyuvante, artritis inducida por colágeno, artritis inducida por
pristano, artritis inducida por hexadecano, artritis inducida por
avridina, artritis inducida por escualeno, o artritis inducida por
aceite; (b) administrar al mamífero no humano el agente; y (c)
determinar si el agente trata la artritis en el mamífero no
humano.
Tal una etapa de determinación puede involucrar
(a) calcular una clasificación de artritis en el mamífero no
humano: y (b) comparar la clasificación de la artritis con una
clasificación de artritis de control. La clasificación de la
artritis de control se puede determinar al calcular una
clasificación de artritis para un mamífero no humano de control al
que no se ha administrado el agente. El agente se puede determinar
para tratar la artritis si la clasificación de artritis en el
animal no humano es menor que la clasificación de artritis de
control.
La invención describe un método para detector un
agente para determinar si el agente evita la artritis. El método
incluye: (a) proporcionar un mamífero no humano que tiene una ruta
oxidasa NADPH deficiente; (b) administrar al mamífero no humano el
agente; (c) administrar un compuesto conocido por inducir la
artritis al mamífero no humano; y (d) determinar si el agente evita
la artritis inducida por el compuesto en el mamífero no humano.
Determinar si el agente evita la artritis puede incluir evaluar
dicho mamífero no humano para síntomas de artritis. Tal una
evaluación puede ocurrir durante un periodo de tiempo, por ejemplo,
por hasta 20 días, hasta 30 días, hasta 50 días, o hasta 70 días.
Determinar si el agente evita la artritis puede incluir comparar
cualquier síntoma de la artritis y su día de inicio con los síntomas
y día de inicio de un mamífero no humano de control al que dicho
agente no se ha administrado. El compuesto conocido por inducir la
artritis puede ser un adyuvante, colágeno, pristano, hexadecano,
avridina, escualeno, y/o aceite. El colágeno puede ser colágeno
tipo II; el aceite puede ser adyuvante incompleto de Freund y el
adyuvante puede ser derivado de micobacterias.
La invención describe un método para identificar
un agente que inhibe la actividad oxidasa NADPH en un linfocito, en
donde el linfocito es de una rata DA. El método incluye: (a) poner
en contacto el linfocito con PMA y un agente de prueba para formar
una célula de prueba; (b) determinar el nivel de actividad oxidasa
NADPH en la célula de prueba al medir el superóxido; (c) determinar
si o no el nivel es menor que un nivel de control de actividad
oxidasa NADPH, en donde el nivel de control es la cantidad de
actividad oxidasa NADPH en una célula de control tratada con PMA en
la ausencia del agente de prueba; y (d)identificar el agente
por inhibir la actividad oxidasa NADPH cuando el nivel es menor que
el nivel de control.
La invención describe una rata no DA que
comprende células T heterólogas de un animal no humano susceptibles
a inducción de artritis, en donde la rata no DA tiene artritis. La
rata puede ser una rata E3. El animal no humano puede ser una rata
DA.
A menos que se defina otra cosa, todos los
términos científicos y técnicos utilizados aquí tienen el mismo
significado como lo entiende comúnmente un experto en la técnica a
la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos
o materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en
la práctica o prueba de la presente invención, adelante se
describen métodos y materiales adecuados.
En caso de conflicto, la presente
especificación, que incluye definiciones, prevalecerá.
Adicionalmente, los materiales como métodos y ejemplos solo son de
ilustración y no se pretende se sean limitantes. Otras
características y ventajas de la invención serán evidentes a partir
de la siguiente descripción detallada, y de las
reivindicaciones.
La Figura 1 es una gráfica que compara la
clasificación de la artritis clínica media determinada en el día
10,14, 19,24, y 28 después de inyección de pristano de ratas DA,
ratas DA. E3chrl2+/-, y ratas DA. E3chrl2-/-.
La Figura 2 es un mapa físico de la región Pia4
construida utilizando clones PAC y clones EST.
La Figura 3 es una alineación de la secuencias
de cAND de E3 y DA p47phox amplificadas de el ARNA de ratas E3 y
DA.
La Figura 4 es un conjunto de gráficas de barra
que demuestran que los niveles de plasma de cartílago de proteína
de matriz oligometica (COMP; Figura 4A) y glicoproteína de ácido
\alpha 1 (AGP; Figura 4B) son significativamente menores en ratas
congénita DA. E3chrl2 que en camadas de ratas de control DA
(p<0.005).
La Figura 5 es un conjunto de curvas de
absorbancia que ilustran la producción de especies reactivas al
oxigeno en una rata DA (Figura 5A), una rata E3 (Figura 5B), una
rata DA. E3c12+/- (Figura 5C), y una rata DA. E3cl2-/- (Figura
5D).
La Figura 6 es una gráfica que ilustra la
severidad incrementada de la artritis en ratas tratada con un
inhibidor NADPH, cloruro de difenilenoyodo (DPI).
La Figura 7 es una gráfica de barras que ilustra
que las ratas tratadas con DPI tienen mayores calificaciones de
artritis acumulada que las ratas de control.
La Figura 8 es un gráfica de barras que ilustran
que la transferencia de células T activadas con Conconavalin A
(ConA) de una rata DA produce artritis severa en camadas de ratas de
control DA (DA), en rata DA. E3chrl2 +/- (HET), y en ratas DA.
E3chrl2-/- (E3).
La Figura 9 es un conjunto de gráficas que
muestran la activación de la absorción rápida de las células
peritoneales de rata E3 (Figura 9A) y células HL60 (Figura 9B)
después de tratamiento con alcanos in Vitro. La absorción
rápida oxidativa se mide con el ensayo WST-1.
La Figura 10 es un conjunto de gráficas que
demuestran los efectos de los alcanos que inducen artritis
12-31 días después de administración.
La Figura 10A demuestra la clasificación media;
La Figura 10B demuestra la clasificación aditiva; y La Figura 10C
demuestra la clasificación máxima de acuerdo con el sistema de
clasificación extendido descrito aquí después de la inyección de
alcanos intra-dérmicamente en la base de la
cola.
La Figura 11 es un conjunto de gráficas de
demuestran la severidad del PIA en ratas DA tratadas con undecano o
undecanol en puntos de tiempo variantes. La Figura 11A demuestra la
clasificación media; La Figura 11B demuestra la clasificación
aditiva y La Figura 11C demuestra la clasificación máxima.
La Figura 12 es un conjunto de gráficas que
demuestran la severidad de la artritis inducida por hexadecano
después de tratamiento con hexadeceno en el día -5 o en el día +5.
La Figura 12A demuestra la clasificación media; La Figura 12B
demuestra la clasificación aditiva; y La Figura 12C demuestra la
clasificación máxima.
La Figura 13 es una gráfica de barras que
demuestra la severidad del artritis en ratas tratadas con aceite
etiquetados radiactivamente.
La Figura 14 es una gráfica de barras que
ilustra la distribución de tejido de los aceites 14C etiquetados en
10,20, y 30 días post-inyección. La actividad se
mide en un contador \beta durante in minuto. Note que LN = nodos
linfáticos.
La Figura 15 es una gráfica de barras que
ilustra la distribución de
[1-14C]-hexadecano para los nodos
linfáticos según se mide en el contador \beta (Beckman) durante
un minuto.
La Figura 16 es un conjunto de gráficos de
barras que demuestran el efecto del fitol en el desarrolla del EAE
en ratas DA tratadas con fitol en el día -10,-5 o el día +5. La
Figura 16A demuestra la clasificación aditiva; La Figura 16B
demuestra la clasificación máxima. Se utiliza aceite de oliva como
control.
La Figura 17 es un conjunto de gráficas que
demuestran el efecto del tratamiento del fitol en el desarrollo de
PIA con diferentes rutas de administración de fitol. La Figura 17A
demuestra la clasificación media; La Figura 17B demuestra la
clasificación aditiva; y La Figura 17C demuestra la clasificación
máxima.
La Figura 18 es un conjunto de gráficas que
ilustran el inicio del CIA en ratones deficientes Ncfl (p47phox),
ambos homocigotos y heterocigotos, según se compara con ratones B
10.Q. La Figura 18A demuestra la clasificación media; La Figura 18B
demuestra la clasificación máxima; La Figura 18C demuestra la
clasificación aditiva.
La Figura 19 es una gráfica de barras que
muestra el día medio de inicio del CIA en ratones deficientes Ncfl,
ambos homocigotos o heterocigotos, según se compara con ratones B
10.Q.
La Figura 20 es una gráfica de barras que
muestran los niveles COMP en suero en ratones deficientes Ncfl,
ambos homocigotos y heterocigotos, según se compara con ratones B10.
Q luego de inducción de CIA por inyección de CII en rata.
La Figura 21 es una gráfica de barras que
muestra los niveles de anticuerpos anti-colágeno en
ratones deficientes Ncfl ambos homocigotos y heterocigotos, según
se compara con ratones B10. Q luego de inducción de CIA por
inyección de ratos CII.
La Figura 22 es una gráfica que demuestra el
efecto del tratamiento de fitol de CIA utilizando diferentes rutas
de administración.
La Figura 23 es un conjunto de gráficas que
demuestran el efecto del tratamiento del PIA activo utilizando
diferentes agentes activos y rutas de administración. Se
administran. 200 \muL de fitol (Figura 23A) o undecano (Figura
23B) en el día 21 y día 26.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona métodos y materiales
relacionados con el diagnóstico y tratamiento de afecciones
autoinmunes (por ejemplo, artritis). Específicamente, la invención
proporciona métodos y materiales involucrados en diagnosticar
mamíferos susceptibles a la artritis y mamíferos que tienen AANOD.
Adicionalmente, la invención proporciona métodos y materiales
involucrados en tratar mamíferos susceptibles a la artritis y
mamíferos que tienen AANOD. Adicionalmente, la invención
proporciona métodos y material involucrados en identificar agonistas
y antagonistas de la actividad oxidasa NADPH.
La invención proporciona métodos para evaluar
una susceptibilidad de mamífero a desarrollar artritis. El mamífero
puede ser un humano, mono, cabra, caballo, vaca, cerdo, perro, gato,
ratón, o rata. En resumen, una susceptibilidad de mamífero a
desarrollar artritis se puede determinar al examinar el nivel de
actividad oxidasa NADPH presente dentro de las células del
mamífero. Este nivel de actividad oxidasa NADPH se puede comparar
luego con un nivel de control, y el mamífero se puede clasificar
por ser susceptible a desarrollar artritis si el nivel de oxidasa
NADPH en las células del mamífero es menor que el nivel de control
como se describe adicionalmente adelante.
El nivel de activada oxidasa NADPH en una célula
de mamífero se puede determinar utilizando un método conocido. Por
ejemplo, la actividad oxidasa NADPH se puede evaluar al medir la
cantidad de especies de oxígeno reactivas generadas. Como se
utiliza aquí, el término "especies de oxígeno reactivas"
incluyen, sin limitación especies parcialmente reducidas de oxigeno
tal como Ion superóxido (O_{2}*), peróxido hidrógeno
(H_{2}O_{2}), radical hidroxilo (OH*) e ión hidróxido. La
cantidad de especies de oxigeno reactivo generadas se pueden medir
utilizando métodos estándar tal como aquellos que involucran medir
la reducción de citocromo C, luminiscencia de lucigenina,
luminiscencia de luminol, y fluorescencia DCFDA. Alternativamente,
el nivel de actividad oxidasa NADPH en una célula de mamífero se
puede determinar al medir el nivel de los componentes conocidos para
reflejar la actividad oxidasa NADPH. Tales componentes incluyen,
sin limitación hacer circular dialdehído malónico.
Después de determinar el nivel de actividad
oxidasa NADPH presente dentro de las células de los mamíferos, este
nivel de actividad oxidasa NADPH se puede comparar con un nivel de
control de actividad oxidasa NADPH para esa especie particular. El
nivel de control de la actividad oxidasa NADPH para una especie
particular es el nivel promedio de actividad oxidasa NADPH medido
en las células de una población de miembros saludable de esa
especie particular. En el caso de los humanos, el nivel de control
de la actividad oxidasa NADPH puede ser el nivel promedio de la
actividad oxidasa NADPH en células de 5, 10,20, 30,40, 50, o más
humanos saludables. Si el nivel de actividad oxidasa NADPH en una
célula de mamífero es menor que el nivel de control, entonces el
mamífero se puede clasificar por ser susceptible a la artritis. Por
ejemplo, un mamífero que tiene una actividad oxidasa NADPH que no
es mayor del 85 por ciento (por ejemplo, no mayor del 75,65, 55,45,
35,25, 15,5,o menos) del nivel de control se pueden clasificar por
ser susceptibles a la artritis.
Alternativamente, un mamífero (por ejemplo,
humano) que tiene actividad oxidasa NADPH deteriorada se pueden
clasificar por ser susceptible a la artritis. Por ejemplo, un humano
que tiene actividad oxidasa NADPH deteriorada tal que una muestra
de aproximadamente 1 x 10^{6} granulocitos de ese humano exhibe
menos de 0.3 a 0.4 unidades de absorbancia (550nm) de reducción de
citocromo C después de aproximadamente 7 minutos de tratamiento con
0. 01 \muM fMLP se puede clasificar por ser susceptible a la
artritis. En una modalidad, un humano que tiene células con no más
de aproximadamente 85 por ciento (por ejemplo, no más de 75,65,
55,45, 35,25, 15,5, o menos) de este nivel de actividad se
clasifica por ser susceptible a la artritis.
La células se pueden tratar con activadores
diferentes de fMLP tal como agentes que afectan la señalización
celular al modular la fosforilación (por ejemplo, PMA) agentes que
desestabilizan las membranas celulares (por ejemplo pristano,
escualeno, fitol, y hexadecano), y agentes que unen receptores de
superficie celular (por ejemplo, galectina 1 y galectina 3).
Cualquier tipo de muestra se puede utilizar para
determinar el nivel de actividad oxidasa NADPH en una célula de
mamífero. Por ejemplo, la muestra puede ser sangre, fluido sinovial,
o células que contienen fluido linfático (por ejemplo, PBMC) que
tienen una actividad oxidasa NADPH. Las células que tienen actividad
oxidasa NADPH incluyen, sin limitación, macrófagos, neutrófilos,
granulocitos, leucocitos polimorfonucleares, y células
mononucleares. Los métodos estándar se pueden utilizar para obtener
tales muestras de los mamíferos. Por ejemplo, se puede obtener una
muestra de sangre por punción venosa. La muestra se puede someter a
cualquier procedimiento preparatorio estándar necesario antes de
evaluar la actividad oxidasa NADPH. Por ejemplo. Las células que
contienen muestras de sangre se pueden someter a centrifugación y/o
etapas de lavado para aislar las células de las cuales el nivel de
actividad oxidasa NADPH se puede medir.
En otra modalidad, una susceptibilidad de
mamífero a desarrollar artritis se puede determinar al examinar por
lo menos una porción de la secuencia de aminoácido de un polipéptido
dentro de la ruta oxidasa NADPH de mamífero. Tales polipéptidos
incluyen, sin limitación, polipéptidos GP91PHOX polipéptidos
P22PHOX, polipéptidos P40PHOX, polipéptidos P47PHOX, y polipéptidos
P67PHOX. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de polipéptidos
P47PHOX de mamífero se puede determinar. Se puede utilizar cualquier
método para determinar la secuencia de aminoácido de un
polipéptido. Por ejemplo, las técnicas de secuenciamiento de
aminoácido estándar se pueden utilizar para determinar la secuencia
de aminoácido de una preparación de polipéptido P47PHOX purificada.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido se
puede secuenciar utilizando técnicas de secuenciamiento de ácidos
nucleicos estándar. Una vez se determina la secuencia de ácido
nucleico, se puede deducir la secuencia de aminoácido del
polipéptido codificado.
Después de determinar por lo menos una porción
(por ejemplo aproximadamente 10,20, 30,40, 50,60, 70,80, 90, o 100
por ciento) de la secuencia de aminoácido de un polipéptido dentro
de la ruta oxidasa NADPH de mamífero, la secuencia de aminoácido se
puede comparar con la secuencia de aminoácido de un polipéptido de
referencia comparable que funciona en la ruta oxidasa NADPH de tal
manera que se observa por lo menos aproximadamente el 70 por ciento
(por ejemplo por lo menos aproximadamente 75,80, 85,90, 95, o 99 por
ciento) de actividad oxidasa NADPH máxima. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácido de un polipéptido P47PHOX de mamífero se
puede comparar con la secuencia de aminoácido de un polipéptido
P47PHOX que permite que una célula exhiba por lo menos
aproximadamente 70 por ciento de actividad oxidasa NADPH máxima. De
la misma manera, la secuencia de aminoácido de un polipéptido
GP91PHOX de mamífero se puede comparar con la secuencia de
aminoácido de un polipéptido GP91PHOX que permite que una célula
exhiba por lo menos aproximadamente 70 por ciento de actividad
oxidasa NADPH máxima.
El término "actividad oxidasa NADPH máxima"
como se utiliza aquí se refiere al nivel máximo promedio de
actividad oxidasa NADPH medida en células de los miembros saludable
de una especie particular. Por ejemplo, en ratas, la actividad
oxidasa NADPH máxima cuando se mide el superóxido libera de
aproximadamente 5 x 10^{6} neutrófilos peritoneal utilizando
reducción de citoctomo C que puede ser de 0.15-0.25
unidades de absorbancia (550 nm) en aproximadamente 1000 segundos
luego de estimulación con PMA. Las células se pueden tratar con
activadores diferentes de PMA tal como fMLP, los agentes que
desestabilizan las membranas celulares (por ejemplo, pristano,
escualeno, fitol, y hexadecano), y agentes que unen los receptores
de superficie celular (por ejemplo, galectina 1 y
galectina 3).
galectina 3).
En razón a que las células de las ratas E3
exhiben por lo menos aproximadamente 70 de su actividad, las
secuencias de aminoácidos de los polipéptidos que funcionan en la
ruta oxidasa NADPH de la rata E3 se pueden utilizar como
polipéptidos de referencia. Por ejemplo, una secuencia de aminoácido
de rata de un polipéptido P47PHOX se puede comparar con la
secuencia de aminoácido del polipéptido P47PHOX de ratas E3, que se
establece en la SEQ ID NO: 4. en humanos, la actividad oxidasa
NADPH máxima cuando se mide la liberación del superóxido de
aproximadamente 1 x 10^{6} granulocitos utilizando reducción de
citocromo C puede ser 0.3 a 0.4 unidades de absorbancia (550 nm)
aproximadamente 7 minutos luego de estimulación con 0. 01 \muM de
fMLP. Así, los polipéptidos que funcionan en la ruta oxidasa NADPH
de células humanas que exhiben por lo menos 70 por ciento de esa
actividad se pueden utilizar como polipéptidos de referencia. Cuando
se evalúa un polipéptido P47PHOX de humano, el polipéptido P47PHOX
de humano que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ
ID NO: 6 se puede utilizar como un polipéptido de referencia.
Si el mamífero que se trata contiene un
polipéptido mutante cuando se compara con un polipéptido de
referencia comparable, entonces el mamífero se puede clasificar por
ser susceptible a desarrollar artritis. El polipéptido mutante
puede ser un polipéptido que contiene adiciones de aminoácidos,
sustracciones, sustituciones, o combinaciones de estos cuando se
comparan con la secuencia de un polipéptido de referencia
comparable. Por ejemplo, un polipéptido mutante puede ser una
polipéptido que tiene cualquier número de diferencias de aminoácidos
(por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, o más
adiciones, sustracciones, o sustituciones de aminoácidos) cuando se
compara con un polipéptido de referencia comparable. Así, en una
modalidad, un humano se puede clasificar por ser susceptible a
desarrollar artritis si ese humano contiene un polipéptido P47PHOX
que tiene una secuencia de aminoácido con una o más sustituciones
de aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, o más) cuando se compara con la secuencia de aminoácido
establecida en la SEQ ID NO: 6. alternativamente, se puede
clasificar un humano por ser susceptible a desarrollar artritis si
ese humano contiene un polipéptido P47PHOX que tienen una secuencia
de aminoácido con un residuo aminoácido diferente de valina en la
posición que alinea con la posición 106 de la SEQ ID NO: 4.
Adicionalmente, un polipéptido mutante puede ser
un polipéptido que le falta uno o más sitios de fosforilación.
Típicamente, los sitios de fosforilación son residuos de serina,
treonina, o tirosina. Así, a un polipéptido que le falta uno o más
residuos de serina, treonina, o tirosina cuando se compara con un
polipéptido de referencia comparable puede ser un polipéptido
mutante. En una modalidad, se puede clasificar un humano por se
susceptible a desarrollar artritis si ese humano contiene un
polipéptido P47PHOX que tienen una secuencia de aminoácido que le
falta uno o más residuos serina, treonina o tirosina (por ejemplo
mas de 2,3, 4,5, 6,7, 8,9, o 10) cuando se compara con las
secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 6.,
alternativamente, se puede clasificar un humano por ser susceptible
a desarrollar artritis si ese humano contiene un polipéptido
P47PHOX que tiene una secuencia de aminoácido con un residuo
aminoácido diferente a treonina en la posición que alinea con la
posición 153 de SEQ ID NO: 4.
Adicionalmente para utilizar la presencia de un
polipéptido mutante para determinar si o no un mamífero particular
es susceptible a la artritis, las secuencias reguladoras (por
ejemplo promotores, mejoradores, y silenciadores) que controlan la
expresión de un polipéptido que funciona en la ruta oxidasa NADPH se
pueden examinar. Por ejemplo, las secuencias promotoras que
controlan la expresión del polipéptido P47PHOX se pueden comparar
con aquellas secuencias promotoras que controlan la expresión del
polipéptido P47PHOX normal en humanos saludables. En este caso, un
humano que tiene una secuencia promotora reguladora mutada se puede
clasificar por ser susceptible a desarrollar artritis.
La invención proporciona métodos para determinar
si un mamífero tiene un tipo de artritis particular.
Específicamente, se puede diagnosticar un mamífero por tener AANOD
si ese mamífero tiene (1) síntomas clínicos de artritis y (2) las
células que tienen un nivel de actividad oxidasa NADPH que es menor
que un valor de control o está deteriorado. Adicionalmente, un
mamífero puede ser diagnosticado por tener AANOD si ese mamífero
tiene (1) síntomas clínicos de artritis y (2) un polipéptido que
funciona en la ruta oxidasa NADPH y que contiene una mutación
cuando se compara con un polipéptido de referencia comparable como
se describe aquí.
Los síntomas clínicos de la artritis incluyen,
sin limitación, inflamación de los tendones, ligamentos,
articulaciones, o huesos. Los síntomas de la artritis también
incluyen dolor, hinchamiento, y rigidez en las articulaciones que
pueden conducir a debilidad, perdida de la movilidad, y deformidad
en el mamífero. Ejemplos de artritis incluyen, sin limitación,
artritis bacteriana, osteoartritis, artritis reumatoide (RA),
artritis inducida por colágeno (CIA), artritis inducida por
hexadecano(HIA), artritis inducida por pristano (PIA),
artritis inducida por avridina, artritis inducida por adyuvante,
artritis inducida por escualeno (SIA), y artritis inducida por
aceite (OIA).
El nivel de actividad oxidasa NADPH dentro de
una célula de mamífero se puede evaluar cómo se describe aquí. De
la misma manera, los métodos y materiales descritos aquí se pueden
utilizar para determinar si o no un mamífero contiene un
polipéptido mutante que funciona en la ruta oxidasa NADPH.
La invención proporciona métodos y materiales
para tratar artritis (por ejemplo, AANOD) en un mamífero. Los
métodos para tratar la artritis tal como AANOD incluye administrar
un agente que incrementa el nivel de actividad oxidasa NADPH en el
mamífero. Por ejemplo, un agente que incrementa una producción de
células de especies de oxígeno reactivo de puede administrar a un
mamífero con artritis. Tales agente incluyen, sin limitación,
norfloxacina, ácido fosfatídico, diacilglicerol, ácido araquidónico,
acetato miristato forbol, lisofosfatidilcolina, fMLP, octano,
decano, undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano,
heptadecano, octadecano; agentes que desestabilizan las membranas
celulares (por ejemplo, pristano, scualeno, fitol, y hexadecano), y
agentes que unen los receptores de superficie celular (por ejemplo,
galectina l y galectina 3). Alternativamente, el agente puede ser
un derivado más polar de los compuestos mencionados anteriormente.
Por ejemplo, el agente puede ser un undeceno, hexadeceno), o un
derivado ácido de los compuestos mencionados anteriormente. En una
modalidad, se utiliza hexadeceno. En otra modalidad se utiliza
undecano.
Los agentes que incrementan la actividad oxidasa
NADPH se pueden administrar en cualquier forma estándar utilizando
cualquier método estándar. Por ejemplo, los agentes que incrementa
la actividad oxidasa NADPH pueden estar en la forma de comprimidos
o capsulas (por ejemplo, capsulas de liberación en el tiempo) que se
toman oralmente. Alternativamente, los agentes pueden estar en una
forma líquida y se pueden tomar oralmente o por inyección. Los
agentes también pueden estar en la forma de supositorios.
Adicionalmente, los agentes que incrementan la actividad oxidasa
NADPH pueden estar en la forma de cremas, geles, y espumas que se
pueden aplicar a la piel. Adicionalmente, los agentes pueden estar
en la forma de un inhalante que se aplica nasalmente. Los agentes
se pueden administrar intra-dérmicamente,
intra-peritonealmente o
intra-nasalmente.
Los agentes que incrementan la actividad oxidasa
NADPH se pueden administrar en cualquier dosis que sea suficiente
para incrementar la actividad oxidasa NADPH en células que tienen
baja actividad. Tales dosis se pueden tomar durante un periodo de
años para evitar y/o retrasar la progresión de la artritis o para
reversar la progresión de la artritis. Las dosis se pueden
seleccionar con base en la efectividad y la toxicidad del agente
particular utilizando técnicas de farmacología estándar.
La invención proporciona método y materiales
para identificar agentes que modulas la actividad Oxidasa NADPH.
Los agentes que modulan la actividad oxidasa NADPH pueden
incrementar o reducir la actividad oxidasa NADPH. Ejemplos de
agentes que incrementan la actividad oxidasa NADPH incluyen, sin
limitación, norfloxacina, ácido fosfatídico, diacilglicerol, ácido
araquidónico, acetato miristato forbol, lisofosfatidilcolina, fMLP,
octano, decano, undecano, dodecano, tridecano, tetradecano,
hexadecano, heptadecano, octadecano; agentes que desestabilizan las
membranas celulares (por ejemplo, pristano, escualeno, fitol, y
hexadecano), y agentes que unen los receptores de superficie
celular (por ejemplo, galectina l y galectina 3). Ejemplos de
agentes que reducen la actividad oxidasa NADPH incluyen, sin
limitación, difenileno de yodo, fenoles, apocinina, quinona,
ligandos haem, piroxicam,
(2,3-dimetil-6
(2-dimetilaminoetil)-6H-indolo-(2,3-b)quinoxalina)
B220, lidocaína, gliotoxina, hidrocortisona, (ácido
6-[2-(3,4-dietoxifenil)tiazol-4-il]-piridino-2-carboxílico)
OPC-6535 y cromolin.
Para identificar agentes que incrementan o
reducen la actividad oxidasa NADPH, se puede mezclar un agente de
prueba con una muestra que contiene células o fracciones celulares
que tienen actividad oxidasa NADPH. Tales células se pueden ser
humanos (por ejemplo, pacientes humanos saludables o con artritis) o
animales no humanos (por ejemplo, animales saludables no humanos o
animales no humanos susceptible a la artritis tal como aquellos
susceptibles a la inducción de artritis). Un animal es susceptible a
la inducción de artritis si ese animal desarrolla una afección de
artritis en respuesta al tratamiento con un agente inductor (por
ejemplo, colágeno o pristano). Tales animales incluyen aquellos
susceptibles a CIA, PIA, HIA, SIA, y OIA. El animal no humano puede
ser cualquier tipo de animal que incluye, sin limitación, monos (por
ejemplo, chimpancés) caballos, cabras, vacas, cerdos, y roedores
(por ejemplo, ratones y ratas).
Un ejemplo de un animal no humano que es
susceptible a la artritis es una rata que es susceptible a PIA tal
como la rata DA. Una rata se puede identificar como un miembro de la
cepa DA (o cualquier cepa de interés) utilizando métodos estándar.
Por ejemplo, las técnicas de secuenciamiento de ácido nucleico
estándar se pueden utilizar para comparar secuencias de ácido
nucleico mitocondrial o genomitas que incluyen, sin limitación, (1)
secuencias de microsatélite, (2) secuencias de ácido nucleico que
codifican complejos de histocompatibilidad principal, o (3)
secuencias de ácido nucleico que codifican ARN ribosómico 18S. la
comparación de la secuencia de ácido nucleico de dos animales se
puede lograr utilizando herramientas de análisis genético tal como
métodos basados en polimorfismos de longitud de fragmento de
restricción (RFLP) y métodos basados en ADN polimórfico amplificado
aleatorio (RAPD). Dos animales pueden ser excluidos por ser de la
misma cepa si las secuencias de ácidos nucleico de ambos animales
tienen características similares cuando se analizan por RFLP o
RAPD.
Después de ser tratados con el agente de prueba,
se puede determinar el nivel de actividad oxidasa NADPH. La muestra
puede ser cualquier tipo de muestra que contiene una célula o una
fracción celular que tienen actividad oxidasa NADPH. La muestra
puede ser sangre, linfocitos, o líquido sinovial. La célula puede
ser un linfocito, granulocito (por ejemplo, neutrófilos) o
macrófago.
La actividad oxidasa NADPH determinada en la
presencia de un agente de prueba se puede comparar con la actividad
oxidasa NADPH determinada en la ausencia del agente de prueba. Los
agentes que incrementan la actividad oxidasa NADPH son aquellos que
conducen a un incremento en la actividad oxidasa NADPH mediante
cualquier cantidad (por ejemplo, un incremento del
5,10,20,30,40,50,75,100,125,150,200, o más por ciento) cuando se
compara con el nivel de actividad oxidasa NADPH observada en la
ausencia del agente de prueba. Agentes que reducen la actividad
oxidasa NADPH son aquellas que conducen a una reducción en la
actividad oxidasa NADPH mediante cualquier cantidad (por ejemplo,
una reducción de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, o más por ciento) cuando
se compara con el nivel de actividad oxidasa NADPH observado en la
ausencia del agente de prueba.
En otra modalidad, los agentes que incrementan o
reducen la actividad oxidasa NADPH se pueden identificar en una
mezcla de ensayo que incluye oxidasa NADPH, un activador, y un
agente de prueba. En estas modalidades, la actividad oxidasa NADPH,
determinada en la presencia de un activador y un agente de prueba,
se puede comparar con la actividad oxidasa NADPH determinada en la
presencia del activador sin el agente de prueba. Como se describe
aquí, los agentes que incrementan la actividad oxidasa NADPH son
aquellos que, cuando están presente en la mezcla de ensayo oxidasa
NADPH, conducen a un incremento en la actividad oxidasa NADPH
mediante cualquier cantidad (por ejemplo, un incremento de 5, 10,
20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, o más por ciento) cuando se
compara con un nivel de actividad oxidasa NADPH observado en la
ausencia del agente de prueba, cuando los agentes que reducen la
actividad oxidasa NADPH son aquellos que, cuando están presente en
la mezcla de ensayo oxidasa NADPH, conducen a una reducción en la
actividad oxidasa NADPH mediante cualquier cantidad (por ejemplo,
una reducción del 5,10,20,30,40,50,75, o más por ciento) cuando se
compara con el nivel de actividad oxidasa NADPH observado en la
ausencia del agente de prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona métodos y materiales
para general un animal (por ejemplo, un roedor tal como una rata o
ratón) que tiene células T heterólogas en combinación con una nueva
forma de artritis inducible (por ejemplo, artritis inducida por
células; TIA). El TIA se puede generar en un animal al introducir el
animal receptor, las células T de un animal donante que tiene
artritis. Los animales receptores y donantes pueden ser de
diferentes cepas o pueden ser miembros del mismo grupo innato de
animales que difieren solo con respecto a (1) el QTL que contribuye
a susceptibilidad artrítica tal como QTL Pia4 o (2) la secuencia del
gen p47phox. Las células T se pueden aislar de un animal utilizando
cualquier procedimiento estándar que incluye homogenización del
bazo. La transferencia de células T se puede desarrollar utilizando
cualquier procedimiento convencional. Un animal con TIA se puede
utilizar como se describe aquí para identificar agentes que
modifique la actividad oxidasa NADPH.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la invención representan métodos
y materiales para proporcional un mamífero no humano que tiene una
ruta oxidasa NADPH deficiente, en donde el mamífero no humano exhibe
síntomas de una enfermedad autoinmune. El mamífero puede ser un
mono, cabra, caballo, vaca, cerdo, perro, gato, ratón o rata. La
enfermedad autoinmune puede ser artritis, esclerosis múltiple,
lupus, uveítis autoinmune, diabetes tipo I, asma bronquear,
artritis séptica inducida por estafilococos o estreptococos, o
enfermedades cardiovasculares que involucran vasculitis. Por
ejemplo, el mamífero no humano puede exhibir síntomas de artritis.
La artritis se puede inducir por técnicas estándar conocidas en el
arte y pueden ser, por ejemplo, artritis inducida por adyuvante CIA,
PIA, HIA, artritis inducida por avridina, SIA, o OIA.
La ruta oxidasa NADPH en el mamífero no humano
se puede indicar mediante una actividad oxidasa NADPH. La actividad
oxidasa NADPH reducida puede ser un resultado de un polipéptido
mutante en donde el polipéptido mutante funciona en la ruta oxidasa
NADPH. Por ejemplo, el polipéptido mutante puede ser un polipéptido
GP91PHOX, polipéptido P22PHOX, polipéptido P40PHOX, polipéptido
P47PHOX, o polipéptido P67PHOX. Por ejemplo, el polipéptido mutante
puede ser un polipéptido P47PHOX. El polipéptido P47PHOX mutante
puede contener la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6 con por
lo menos dos sustituciones de aminoácido. El polipéptido P47PHOX
mutante puede contener una secuencia de aminoácido que tiene un
residuo de aminoácido diferente a valina en la posición que se
alinea con la posición 106 de SEQ ID NO: 4 o un residuo de
aminoácido diferente a treonina en la posición que se alinea con la
posición 153 de SEQ ID NO: 4. en otras modalidades, la actividad
oxidasa NADPH reducida puede ser un resultado de una eliminación
del gen o lugar que codifica el Ncfl (p47phox). La eliminación puede
ser heterocigoto o homocigoto en el mamífero no humano. En una
modalidad, el mamífero no humano puede ser un ratón. Por ejemplo,
el ratón puede tener el gen para Ncfl (p47phox) transgénico
utilizando técnicas estándar en el arte, o el ratón puede expresar
uno de los polipéptidos P47PHOX mutantes como se describió
precisamente (por ejemplo, un ratón transgénico).
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En otra modalidad, la invención proporciona un
método para detectar una agente para determinar si el agente
retrasa el inicio de la artritis. El método incluye: (a)
proporcionar un mamífero no humano que tiene una ruta oxidasa NADPH
deficiente; (b) administrar al mamífero no humano el agente; (c)
inducir artritis en el mamífero no humano; y (d) determinar si el
agente retrasa el inicio de la artritis en el mamífero no
humano.
El mamífero que tiene una ruta oxidasa NADPH
deficiente se puede obtener como se describió previamente.
Determinar si el agente retrasa el inicio de la artritis puede
incluir etapas tales como: (a) determinar un día de inicio del
valor de artritis para el mamífero no humano; y (b) comparar el día
de inicio del valor de artritis para dicho mamífero no humano con
un día de control de inicio de valor de artritis. El inicio de la
artritis se puede monitorear utilizando un sistema de clasificación
microscópico, en donde el punto 1 se da para cada dedo rojo o
hinchado, un punto para cada parte media del pie, dedo o nudillo
hinchado, y 5 puntos para un tobillo hinchado, dando una
clasificación máxima de 15 por miembro y un total de 60. La
clasificación puede ser una clasificación media, clasificación
aditiva, o calcificación máxima. El mamífero se puede monitorear 1
a 4 veces por semana durante 1 a 2 meses después de inducción de
artritis. El día de control de inicio del valor de artritis se
puede determinar al determinar un día de inicio del valor de
artritis para un mamífero no humano de control al que no se ha
administrado el agente. El DIA de inicio de la artritis en el
mamífero no humano se puede considerar retrasado si este está
después del día de control del valor de inicio. La artritis se
puede inducir por medios convencionales y puede ser artritis
inducida por adyuvante, CIA, PIA, HIA, SIA, inducida por avridina,
o OIA.
La invención también proporciona métodos para
detectar un agente para determinar si el agente trata la artritis.
El método incluye (a) proporcionar un mamífero no humano que tiene
una ruta oxidasa NADPH deficiente, en donde los mamíferos exhiben
síntomas de una artritis (por ejemplo, artritis inducida por
adyuvante, CIA, PIA, HIA, SIA, artritis inducida por avridina, u
OIA); (b) administrar al mamífero no humano el agente; (c)
determinar si el agente trata la artritis en el mamífero no humano.
Tal una etapa de determinación puede involucra (a) calcular una
clasificación de artritis en el mamífero no humano; y (b) comparar
la clasificación de artritis con una clasificación de artritis de
control. El mamífero que tiene una ruta oxidasa NADPH deficiente
exhibe síntomas de artritis que se pueden obtener como se describió
anteriormente. La clasificación de artritis de control se puede
determinar al calcular una clasificación de artritis para un
mamífero no humano de control al que no se ha administrado el
agente. La clasificación de artritis se puede determinar utilizando
el sistema de clasificación microscópico descrito previamente, y
pude ser una clasificación media, clasificación de aditivo o
clasificación máxima. El agente se puede determinar para tratar la
artritis si la clasificación de artritis en el animal no humano es
menor que la clasificación de artritis de
control.
control.
En otra modalidad, se suministra un método para
detector un agente para determinar si el agente evita la artritis.
El método incluye: (a) proporcionar un mamífero no humano que tiene
una ruta oxidasa NADPH deficiente; (b) administrar al mamífero no
humano el agente; (c) administrar un compuesto conocido por inducir
artritis al mamífero no humano; y (d) determinar si el agente evita
la artritis inducida por el compuesto en el mamífero no humano.
Determinar si el agente que evita la artritis puede incluir evaluar
dicho mamífero no humano para síntomas de artritis. Tal una
evaluación puede ocurrir durante un periodo de tiempo, por ejemplo,
durante hasta 20 días, hasta 30 días, hasta 50 días, o hasta 70
Díaz. Determinar si el agente que evita la artritis puede incluir
comparar cualquier síntoma de artritis y su día de inicio con los
síntomas y el día de inicio de un mamífero no humano de control al
que no se ha administrado dicho agente. El sistema de clasificación
microscópico como se describió anteriormente se puede utilizar en la
evaluación y comparación. El compuesto conocido por inducir
artritis puede ser un adyuvante, colágeno, pristano, hexadecano,
escualeno, avridina, o aceite. El colágeno puede ser colágeno tipo
II; el aceite puede será adyuvante incompleto de Freund; y el
adyuvante puede ser derivado de micobacterias.
La invención se describirá adicionalmente en los
siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de las invenciones
descritas en las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Cepas de rata (Rattus norvegicus)
utilizadas en los siguientes experimentos incluyen la sepa de DA,
que es altamente susceptible a PIA, y la cepa E3, que es resistente
al PIA, se obtienen ratas E3 y DA de Zentralinstitut fur
Versuchstierzucht, Hannover, Alemania, y se mantienen en
instalaciones animales que tienen ambientes climatizados
controlados con ciclos de 12 horas luz/oscuridad. Las ratas se
alojan en jaulas de poliestireno que contienen viruta de madera y
los roedores se alimentan con concentrado estándar y agua ad
libitum. Las ratas están libres de patógenos comunes,
incluyendo el virus Sendai, virus Hantaan, coronavirus, reovirus,
citomegalovirus, y Micoplasma pulmonis. La crianza de los
animales y la experimentación se desarrolla en las mismas
instalaciones de los animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se induce artritis en ratas en edad de 8 a 12
semanas por inyecciones intradérmicas de 150 \mul de pristano
(2,6,10,14-tetrametilpentadecano; Aldrich,
Milwaukee, WI) en las bases de las colas. Se monitorea el desarrollo
artrítico en todos los miembros utilizando un sistema de
clasificación microscópico. En resumen, se da un punto para cada
dedo rojo o hinchado, un punto para cada parte media del pie, dedo o
nudillo hinchado y 5 puntos para un tobillo hinchado. La
clasificación máxima para un miembro es 15 puntos y la clasificación
máxima para una rata es 60 puntos. Las ratas se examinan de una a
cuatro veces por semanas durante un mes después de inyección
pristano.
Para análisis histopatológico, a los 31 días
después de las inyecciones de pristano, se sacrifican las ratas, y
las patas traseras y las articulaciones del tobillo se preparan y
analizan como sigue. Las patas se fijan en 4% de paraformaldehido,
descalcificado en EDTA, embebido en parafina, y luego se seccionan y
tiñen con hematoxilin y eritrosina como se describe en in Jonsson
et al. (1986) J Immunol Methods 88:
109-14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un locus de rasgas cuantitativo (QTL), denotado
Pia4, se encuentra que está asociado con el PIA y CIA. Para
identificar y aislar los genes en Pia4 QTL que se asocia con la
artritis, un fragmento de 10 cM del cromosoma 12 de una rata E3
resistente al PIA se integra en una rata DA susceptible a PIA que
resulta en una rata congénica DA. E3chrl2. Otros genes E3 en el
fragmento 10 cM que no se asocial con RA se remueven en más de 10
retro cruces sucesivos con una rata DA. Las camadas de rata DA
obtenidas de entrecruces F2 entre ratas DA. E3chrl2 +/- se utilizan
como controles. El Pia4 QTL es heredado en una forma aditiva al DA
con ratas DA que tienen el alelo que promueve la severidad de la
artritis en los entrecruces F2 originales entre ratas E3 y DA. Las
diferencias genotípicas significativas observadas cuando una
progenie de rata se compara con una rata de control se puede
concluir que han surgido de diferencias genéricas en la región
Pia4.
Se induce artritis en 20 ratas DA, 40 ratas DA.
E3chrl2+/-, y 14 ratas DA. E3chrl2-/- por inyección con pristano, y
el desarrollo de la artritis clínica se evalúa como se describió
anteriormente, la Figura 1 es una comparación de clasificación de
artritis clínica determinada en el día 10,14, 19,24, y 28 después de
inyección de pristano de ratas DA, las ratas DA. E3chrl2+/-, y las
ratas DA. E3chrl2-/-. Se observan diferencias dramáticas en la
severidad de la artritis entre camadas de ratas de control DA y
ratas congénicas DA. E3chrl2 (p<0.0001). Las ratas DA.
E3chrl2-/- congénicas todavía son susceptibles a la artritis, pero
la inflamación es muy leve. Las incidencias de la artritis
observada en los días 31 después de inyección de pristano es 100%
entre ratas DA, 58% entre ratas DA. E3+/-, y 36% entre ratas DA.
E3-/-. Cuando las secciones de articulación de tobillo de pata
trasera de rata obtenidas 31 después de inyección de pristano se
tiñen hematoxilina y eritrosina y luego se examinan
microscópicamente en magnificación 100x, se observan infiltraciones
celulares en las articulaciones. Aunque el fenotipo E3 resistente
al PIA producido por el Pia4 QTL se encuentra que es casi protector
dominante, la progenie de ratas DA que llevan dos alelos E3 del
cromosoma 12 exhiben aún artritis menos severa (p < 0.05) que la
progenie de ratas DA que llevan un alelo E3 del cromosoma 12.
El fragmento E3 derivado que contiene el Pia4
QTL también se encuentra que suprime el CIA, HIA, y OIA (ver Tabla
1). Otros genes parecen involucrados en razón a que las ratas E3
congénicas para Pia4 derivado de DA, (por ejemplo, ratas E3. DA
chrl2-/-) es todavía resistente a la artritis.
\vskip1.000000\baselineskip
El valor P indica la significancia de la
diferencia observada entre ratas congénicas Pia4 y ratas DA, no se
detecta diferencia significativa entre el DA. E3chrl2 +/- y DA.
E3chrl2-/-.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La colección de cromosomas artificiales
derivados de P1 (PAC) de la rata BN (RPCI-31)
descrita en un et al. (1998) Genomics
50:306-16 se obtiene del Proyecto del Genoma Humano
Alemán del Centro de Investigaciones (RZPD) (ver RZPD (www.rzpd.de)
como grupos de ADN y filtros ensayados (librería colección 712).
También se obtiene clones PAC positivos del RZPD así como también
clones que tienen insertos de ADN que corresponden al ADN en la
vecindad de los microsatélites ligados al Pia4 (ver Gosele et
al (2000) Genomics 69:287-94,
www.mdc-berlin.de/ratgenom, y
www.molgen.mpg.de/\simratgenome). Los clones PAC se purifican
utilizando el kit de construcción grande Qiagen (Qiagen, Hilden,
Alemania) y se utilizan para el secuenciamiento final con los
cebadores T7 Y SP6 como se describe en un et al. (1998)
Genomics 50:306-16.
Las secuencias P47 phox, GRF2ird de cADN se
determinan como sigue. La secuencias públicamente disponibles que
corresponden a P47 phox de rata (número de acceso GenBank ay029167),
GTF2i de ratón (número de acceso GenBank AF017085) y las secuencias
GTF2ird de ratón (número de acceso GenBank NM_020331) se utilizan
para diseño de cebador. El ARN del E3, DA Y DA.E3 chr12 se aíslan
utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). Primero
se sintetiza la hebra de cADN del total de ARN utilizando el kit de
síntesis de cADN de primera hebra (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia). los fragmentos de cADN vicatenarios se generan
mediante PCR convencional y luego se ligan en el vector de clonación
pCR4-TOPO TA. Las construcciones de plásmido
resultantes se trasforman en E. coli competente (Invitrogen,
Paisley, UK), y luego se purifican de los transformantes E.
coli de acuerdo con la purificación de lisis alcalina
convencional. Se desarrolla secuenciamiento utilizando
secuenciadora MegaBACE 1000 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia). Y se analizan los datos obtenidos utilizando el análisis
de secuencia 2.1 y SeqMan 4.05.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prepara ADN a partir de biopsias de dedos del
pie y se ensayan con marcadores microsatélite por reacción de
cadena de polimerasa (PCR) analizado en MegaBACE 1000 (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Los datos cuantitativos se
expresan como media \pm de EM, y se desarrolla el análisis de
significancia utilizando la prueba no paramétrica
Mann-Whitney. Se determina la significancia los
datos de frecuencia por análisis Chi cuadrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para identificar los genes dentro de Pia4 QTL
que contribuyen al fenotipo resistente PIA en ratas E3, ratas
congénicas de DA. E3chrl2 se retrocruzan con ratas DA y un gran
número de progenie de ratas congénicas que llevan los fragmentos
Pia4 traslapantes de diferentes tamaños se utilizan en el siguiente
experimento. Se inicia el mapeo físico con un fragmento congénico
de 1 cM. La figura 2 en un mapeo físico de la región Pia4
construida y utilizando clones PAC y clones EST. Los microsatélites
conocidos (dl2rat72, dl2got45, dl2got46 y dl2rat26) en la región
Pia4 se utilizan para identificar el PAC que llevan los insertos que
corresponden a esta región. Los resultados del proyecto EST de rata
en la universidad de Iowa (ver www.ratEST.uiowa.edu) se utilizan
para identificar clones EST conocidos por contener las secuencias en
la región Pia4. Las secuencias finales de los clones PAC y las
secuencias cebadoras de los clones EST se utilizan para generar el
mapa físico de la región Pia4. Adicionalmente, la información de
secuencia de la región Pia4 en rata (clones PAC
RP31-78c13, RP31-485f9,
RP31-198113, RP31-75g22,
RP31-llm22, RP31-391d23
RP31-57j23), y clones BAC parcialmente secuenciados
que tienen insertos que corresponden a la región Pia4
(www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/rat/), y las secuencias de las
regiones homologas en ratones (números de acceso Genbank NT029829,
AF289665, AF139987 and AF267747; ver Kwitek et al. (2001)
Genome Res 11: 1935-43; Hoogenraad et al.
(1998) Genomics 53: 348-58; Valero et al.
(2000) Genomics 69: 1-13) and human (Genbank
accession number NT_007867; see Peoples et al. (2000) Am
JHum Genet 66: 47-68; Osborne et al. (2001)
Nat Genet 29: 321-5) se ensamblan para formar el
mapa Pia4 físico.
El mapa físico de la región Pia4 en combinación
con la susceptibilidad a la artritis de cepas congénicas aisladas
identifica una región mínima de 300 kilobases requerida pata el
fenotipo resistente al PIA. La región de 300 kilobase contiene dos
genes: el gen p47phox y GTF2i. El gen Thep47phox codifica el factor
Citosólico de Neutrófilo 1 (NCF1), una subunidad de complejo NADPH
que produce radicales oxigeno como un resultado de la infección
(ver Volpp et al. (1989) Proc Natl Acad Sci U S A 86:
7195-9). El gen GTF2i codifica la proteína asociada
Tirosina Kinasa Bruton (BTK) (BAP-135), un sustrato
del BTK involucrado en la ruta de señalización del receptor de
células B Ver Yang & Desiderio (1997) Proc Natl Acad Sci U S A
94: 604-9.
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Ejemplo
7
El polimorfismo de nucleótidos sencillo (SNPs)
que distingue los alelos de DA y E3 en la región Pia4 se identifican
al secuenciar el cADN utilizando Pyrosequencing (Pyrosequencing,
Uppsala, Suecia) de acuerdo con protocolos suministrados por el
fabricante. El SNPs se encuentra en los genes p47phox, GTF2i,
GTF2irdl y Cyln2 (AJ000485). Una comparación del cADN del DA
p47phox y el cADN del E3 p47phox cADN revela tres SNP (ver Figura
3). Todos los 3 polimorfismos son sustituciones base de las que dos
son no sinónimos y resultan en sustituciones en las posiciones
aminoácido 106 and 153. Estos polimorfismos de secuencia incluyen
(1) sustitución de una adenina con un nucleótido guanina en la
posición 330 en una rata E3 cuando se compara con una DA (DA/E3;
A330G) que resulta en reemplazo de un residuo metionina con un
residuo valina en la posición 106 (Metl06Val); (2) sustitución de
una timina con un nucleótido citosina en la posición 472 en una rata
E3 (DA/E3; T472C) que resulta en el reemplazo de un residuo
metionina con un residuo treonina en la posición 153 (Metl53Thr); y
(3) sustitución de una adenina con una citosina en el nucleótido
1161, una sustitución sinónima que no conduce a una alteración de
aminoácido. La secuencia del cADN p47phox de la rata DA es idéntica
a la secuencia publicada del p47phox (AY029167) de rata
Sprague-Dawley.
Una comparación de la secuencia cADN de DA GTF2i
con la secuencia E3 GTF2i revela que la secuencia de E3 tiene una
sustitución de nucleótido en la posición 2992. El nucleótido timina
en la posición 2992 en la secuencia DA se sustituye con una
nucleótido citosina en la secuencia E3 (DA/E3; T2992C). Esta
sustitución ocurre en una región no traducida y así no afecta la
secuencia de proteína GTF2i.
Comparaciones similares de los genes Cyln2 y
GTF2irdl de ratas DA y E3 revela SNPs en el nucleótido 4206 (DA/E3:
G4206A) en el gen Cyln2 y en el nucleótido 2823 (DA/E3: G2823C) en
el gen GTF2irdl.
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Ejemplo
8
La secuencia de los genes p47phox en otras sepas
de rata de crías y en ratas silvestres se analizan para la
presencia de tres polimorfismos en el alelo p47phox de E3 (Tabla 2).
Los altos grados de los polimorfismos en las ratas de cría así
compuesto también en las ratas silvestres se detectan. Esto sugiere
que estos polimorfismos no resultan de la domesticación o de
mutaciones generadas en ratas de cría en laboratorio. De hecho, los
alelos de DA y E3 ocurren en igual frecuencia lo que indica que
estos alelos se mantiene por selección natural.
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Un alotipo común presente en ratas BN incluye el
polimorfismos DA en el nucleótido 330 y el polimorfismo E3 en la
posición de nucleótido 472. Los cruces previamente publicados entre
ratas DA y BN exhiben afecciones de enfermedad similares a
esclerosis múltiple (ver Dahlman et al. (1999) J Immunol 162:
2581-8) o artritis (ver Griffiths et al.
(2000) Arthritis Rheum 43: 1278-89) revela un lugar
con ubicación idéntica como Pia4 lo que sugiere que la protección
de la enfermedad se asocia con treonina en el aminoácido 153. En
razón a que la treonina es un sitio de fosforilación potencial, y
en razón a que la función del complejo NADPH humano se regula
altamente a través de la fosforilación del p47phox, es probable que
la actividad del P47phox y por lo tanto la actividad de la oxidasa
NADPH se afecta por el estado de fosforilación de este residuo. (ver
Faust et al. (1995) J Clin Invest 96: 1499- 505; El Benna
et al. (1996) J Biol Chem 271: 6374-8; Lal
et al. (1999) Biochem J 338: 359-66).
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Ejemplo
9
La expresión del gen p47phox en los tejidos de
nodos linfáticos y de bazo de ratas DA y DA. E3chr12 se analiza por
hibridación Northern blot. Tres ratas DA y DA. E3chrl2-/- se someten
a inyección de pristano. Ocho días después de las inyecciones de
pristano, 10 \mug de ARN total del bazo y del nodo linfático
inginal se aíslan. El ARN se separa en un gel azarosa/formaldehído,
se transfiere en una membrana de nailon, y se fija por irradiación
ultravioleta.
La línea de células de mieloma humano HL60 se
cultivan en medio completo de dulbecco con Hepes, 10% de suero de
becerro fetal y penicilina - estreptomicina. Las células HL60 se
diferencia con los neutrófilos - macrofages deis días después de
adicción de 1.25% de DMSO. Las células se centrifugan a 1200 rpm
durante 5 minutos y luego se lavan con PBS dos veces. Luego las
células se resuspenden en PBS a una concentración de aproximadamente
107 células/mL.
10 \muL de cada uno de los aceites a ser
probados se agrega con 9 \muL de WST1 a los pozos de una placa de
microtítulo de 96 pozos. Se agrega 106 células/mL (100 \muL de 107
células/mL) se agregan a cada pozo y la carga de color se mide en
un espectrofotómetro a 450 nm a 37ºC durante 60 minutos (una
medición/min).
10 \muL de cada uno de los aceites a ser
probados se agrega a los pozos de una placa de microtítulo de 96
pozos. 50 \muL de citocromo C (4 mg/mL) y 5X106 células/pozo (50
\muL de 107 células/mL) se agregan a cada pozo y se mide la
absorbancia en un espectrofotómetro a 550 nm a 37ºC durante 60
minutos (una medición/minuto).
Se preincuban células (2-5 x 105
pozo) durante 10 minutos a 37ºC con 1 \muM dihidrorodamina (DHR)
123 en una placa de 96 pozos en volumen total de 200 \muL. 10
\muL de cada uno de los compuestos (por ejemplo, aceites) a ser
probados se agregan a los pozos y se incuban 20 minutos
adicionalmente a 37ºC. la producción de oxidantes reactivos de
ensaya como formación de tinte fluorescente de rodamina 123
(RH)de dihidrorodamina 123 (DHR) utilizando citometría de
flujo.
Se prueban moléculas alcano saturadas con ensayo
de absorción rápida oxidativa para determinar activadores del
complejo NADPH. Los ensayos se prueban en células peritoneales de
rata E3 después de recuperación de tiogliocolato de los neutrófilos
(Figura 9A) y se células HL60 (Figura 9B). La prueba
WST-1 indica cambios en la concentración
extracelular de las especies de oxigeno reactivo (ROS). Ambos tipos
celulares demuestran las mismas tendencias generales. Por ejemplo,
en todos los ensayos, el undecano es un activador potente.
Los efectos que inducen las artritis de los
aceites se examina al inyecta los aceites intradérmicamente en
ratas DA. La clasificación muestra que los aceites mas de
aproximadamente 14 carbonos de longitud inducen la artritis,
mientras que cadenas de carbono más cortas no inducen la artritis
(Figuras 10A, 10B, y 10C). Note que p<0.05 para alcanos más
cortos que C15 comparado con C19. Todas las estadísticas se evalúan
con la prueba t de Student. N=4 para todos los grupos.
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Ejemplo
15
Los grupos de ratas Da se inyectan
intradérmicamente en la base de la cola con 200 \muL de los
aceites como se indica adelante:
- Undecano día -10, Pristano día 0;
- Aceite de Oliva DIA-10, Pristano día 0;
- Undecano día - 5, Pristano día 0;
- Undecanol día-5, Pristano día 0;
- Aceite de Oliva día -5, Pristano día 0;
- Undecano día - 5, Pristano día 0; y
- Aceite de Olive día 5, Pristano día 0.
Las ratas se clasifican cada tercer día
partiendo en el día once de acuerdo con el sistema de clasificación
extendido en donde cada dedo rojo o hinchado o parte media del pie
tiene un punto de clasificación, y un tobillo rojo o hinchado tiene
5 puntos de clasificación, dando un total de15 puntos/miembro y 60
puntos/rata. Se utiliza aceite de oliva y un decanol como
controles.
Se inyectan grupos de ratas DA i. d. en la base
de la cola como sigue:
- Hexadecano 200 \muL día 0;
- Hexadeceno 200 \muL día 0;
- Hexadeceno200 \muL día - 5, Hexadecano 200 \muL día 0;
- Aceite de oliva 200 \muL día -5, Hexadecano 200 \muL día 0;
- Hexadeceno 200 \muL día +5, Hexadecano 200 \muL día 0; y
- Aceite de oliva día 200 \muL +5, Hexadecano 200 \muL día 0.
- Las ratas se clasifican como se indico anteriormente. Se utiliza aceite de oliva como control.
Se examina undecano por su efecto preventivo
potencial sobre el desarrollo o la severidad del PIA. Se tratan las
ratas con undecano en el día -10, día -5, o día +5, y undecanol en
el día -5 (como un control). Todas las ratas se inyectan con
pristano en el día 0 (Figura 11A). Hubo una diferencia significativa
entre la clasificación aditiva (Figura 11B) y la clasificación
máxima (Figure 11 C) para ratas tratadas con undecano en el día -5
y las ratas que se tratan con aceite de oliva en el día -5. También
hubo una diferencia significativa para la clasificación aditiva
(Figura 11B) y la clasificación máxima (Figure 11C) entre le
tratamiento con undecano en el día -5 y el tratamiento con
undecanol en el día -5. Note también que las ratas que se tratan con
undecano en el día +5 tiene una clasificación ligeramente mayor que
las ratas que se tratan con undecano en el día -10 o en el día -5
antes de inyección con pristano.
Se evalúan todas las estadísticas con la prueba
t de Student p<0.05 para la diferencia en ambas clasificaciones
aditivas y clasificación máxima para undecano en el día -5 y aceite
de oliva en el día -5. p=0.05 para la diferencia en la
clasificación aditiva p<0.05 para la diferencia en la
clasificación máxima entre undecano en el día -5 y undecanol en el
día -5. N=6 para todos los grupos, excepto el grupo 4 en donde
N=12.
También se desarrolla un experimento similar
para evaluar el efecto protector del hexadeceno en la inducción de
la artritis mediante hexadecano. Se tratan ratas con el hexadeceno
en el día - 5, día +5, o no se tratan con hexadeceno. Todas las
ratas se inyectan con hexadecano en el día 0, excepto el grupo 3. Se
utiliza aceite de oliva como control. La clasificación de artritis
demuestra una diferencia significativa entre las capacidades que
inducen a artritis de las dos sustancias (Figuras 12A, 12B y 12C).
El Hexadecano induce la artritis mientras que el hexadeceno no. La
diferencia en clasificación entre las ratas que se tratan con
hexadeceno en el día -5 y en el día +5 y las ratas de control
también es significativa. Ninguna de las ratas tratadas con
hexadeceno desarrollo artritis.
Los grupos 3 y 4 se inyectan solo con hexadecano
o hexadeceno. Se evalúan todas las estadísticas con la prueba t de
Student. p<0.05 para la diferencia en ambas clasificaciones
aditivas y clasificación máxima para el tratamiento del día -5 y
día +5 contra ningún tratamiento (grupo 4). p<0.05 para la
diferencia en la clasificación aditiva y clasificación máxima entre
hexadecano y hexadeceno. También hay una diferencia entre grupos que
se inyectan con hexadeceno y aceite de oliva en el día +5
(p<0.01 en la clasificación aditiva y p<0.05 en la
clasificación máxima). N= 6 para todos los grupos excepto el grupo 3
y 4 en donde N=4.
Cuando se inyectan aceites en la base de las
colas de las ratas DA para determinar su capacidad de inducir
artritis, los alcanos mayores de aproximadamente 14 carbonos inducen
artritis, mientras que los más cortos no. Es interesante notar que
una comparación de la actividad de los aceites en los estudios de
absorción rápida de oxigeno y los estudios de inducción de artritis
indican tres mecanismos posibles para la participación de los
aceites en la inducción y/o el tratamiento de la artritis. Por
ejemplo, en los estudios de absorción de oxigeno, el undecano
activa el complejo NADPH, pero no induce a artritis en los estudios
de artritis de inyección de cola, mientras que el hexadecano no
solo activa el complejo sino que también induce a artritis. Una
comparación de los dos experimentos demuestra que el hexa-, hepta-,
y octa-decanos activan el complejo NADPH de acuerdo
con el ensayo WST-1 y también induce a artritis. El
pentadecano (15C), de otra parte, no activa el complejo NADPH, pero
induce a artritis, lo que sugiere un tercer mecanismo para la
participación en la inducción de la enfermedad.
También se ha visto una relación similar con el
hexadecano y el hexadeceno, y pristano y fitol, en donde el
hexadecano y el pristano inducen artritis, mientras en hexadeceno y
el fitol no (Lorenzen (1999) Scand. J. Immunol. 49:
45-50). Todas las cuatro sustancias activan el
complejo NADPH. La diferencia entre hexadecano y hexadeceno es un
enlace de carbonos sencillo - carbono doble en el hexadeceno,
mientras el pristano y el fitol difieren por un grupo ácido.
Mientras que no se desea estar unido por la teoría, es posible que
una polaridad incrementada facilite el metabolismo del hexadeceno y
el fitol y por lo tanto evita que induzcan a artritis. Las
moléculas con menor polaridad no se pueden metabolizar tan
fácilmente, y pueden permanecer mayor tiempo en los tejidos,
induciendo una respuesta inmune.
Investigamos las capacidades preventivas del
hexadeceno y undecano. Ninguna de las ratas tratadas con hexadeceno
muestra algún síntoma de artritis si ellas se inyectan con
hexadeceno en el día -5 o día +5. Adicionalmente, estos
experimentos verifican que el hexadecano induce artritis, mientras
que el hexadeceno no. El pre-tratamiento con
undecano puede ser más protector si lo hace en un mayor punto de
tiempo antes de la inducción de la artritis con pristano. Por
ejemplo, el tratamiento con undecano en el día +5 no muestra un
efecto preventivo como en el día -10 o en el día -5.
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Ejemplo
16
[1-14C]-Hexadecano
y ácido [1-14C]-oleico se compran de
Amersham. Los aceites se inyectan intradérmicamente en la base de
la cola en 18 ratas DA (200 \muL), En el día 10, los órganos
(nodos linfáticos, bazo, hígado y riñón) de las tres ratas de cada
grupo se recolectan. Los órganos se pesan y homogenizan en un
volumen total de 2 mL PBS y se congelan. El mismo procedimiento es
seguido en el día 20 y en el día 30. 1 mL de las muestra
homogenizadas se agregan luego a 10 mL de Ready Safe (Beckman) y se
cuentan en un contador beta. La distribución de hexadecano
etiquetado radioactivo para los nodos linfáticos también se
inspecciona en puntos de tiempo anteriores (día 3, día 6, día 10, y
día 13).
La distribución del hexadecano in vivo se
examina al inyectar hexadecano etiquetado radiactivamente y punto
de punto en la base de la cola de ratas DA. El ácido oleico
etiquetado radiactivamente se administra en la misma forma. La
clasificación de las ratas muestra que solo las ratas inyectadas con
hexadecano tienen artritis (Figura 13). La artritis es aguda y
tiene un involucramiento simétrico de las patas delantera y trasera.
Los análisis de diferentes órganos recolectados (LN, bazo, riñón e
hígado) en el contador \beta muestran que los aceites se acumulan
exclusivamente en los nodos linfáticos en todos los puntos de tiempo
medidos (Figura 14). El Hexadecano parece ser distribuido a los
nodos linfáticos en un mayor grado que el ácido oleico. La
distribución de los aceites a los nodos linfáticos parece reducir
con el tiempo sin incremento en los otros órganos analizados.
La distribución del hexadecano a los nodos
linfáticos en puntos de tiempo anteriores también se mide como se
describe. Se observa un incremento en la acumulación del hexadecano
en los nodos linfáticos hasta el día 10.
Se ha investigado previamente la distribución
del hexadecano etiquetado radiactivamente, que muestra el 14C
hexadecano etiquetado que se disemina predominantemente a los nodos
linfáticos (Kleinau et al., (1995). Int. J. Immunopharmac.,
17 (5): 393-401.).
Los experimento indican que el aceite de
hexadecano ejerce un efecto pro-artritogénico dentro
de los nodos linfáticos. La inyección de hexadecano etiquetado
radiactivamente y ácido oleico radió etiquetado sugiera que el
ácido oleico no induce a la artritis debido a que este no se
distribuye a los nodos linfáticos a tan alto grado como el
hexadecano. Adicionalmente, el hexadeno se acumula lentamente en los
nodos linfáticos con una máxima en el día 10, que se correlaciona
con el inicio normal de la enfermedad. Después del día 10, la
concentración del aceite de hexadecano se reduce lentamente (Figura
15).
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Ejemplo
17
Grupos de rata DA se inyectan en la base de la
cola con 200 \muL de fitol en el día -10, día -5, y día +5, se
utiliza aceite de oliva como un control. En el día 0, se tratan
todas las ratas (inmunizan) con 200 \muL de SCH (homogenato de
médula espinal DA, para inducir EAE) i. d. en la base de la cola.
Las ratas se clasifican luego de acuerdo con la siguiente escala
durante 40 días:
0=Normal
1=Debilidad en la cola
2=Parálisis de la cola
3=Parálisis de cola y cojera leve
4=Parálisis de cola y cojera severa
5=Parálisis de cola y parálisis de un
miembro
6=Parálisis de cola y parálisis de un par de
miembros
7=Tetra-paresia
8=Pre-mórbido o muerte.
El EAE empieza aparecer al rededor de día 6. Los
resultados muestran una diferencia significativa en la clasificación
aditivo (Figura 16A) y clasificación máxima (Figura 16B) entre las
ratas tratadas con fitol y las ratas de control en el día -10 y en
el día +5 (p<0.05).
Se evalúan todas las estadísticas con la prueba
T de Students p<0.05 para la diferencia en la clasificación
máxima entre el tratamiento con fitol y el tratamiento con aceite de
oliva en el día -10 y en el dia +5. Note que N= 6 para todos los
grupos.
El EAE y PIA, el SCH para inducir EAE y el
priestano para inducir PIA se inyectan intradérmicamente en la base
de la cola. El inicio de la enfermedad ocurre de manera general en
unas pocas semanas. Los activadores potenciales del complejo NADPH
pueden alterar la proliferación de las células T autoactivas. Y
reducen la incidencia, tasa de inicio, y severidad de las
enfermedades.
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Ejemplo
18
Se tratan grupos de ratas DA con fitol de
acuerdo con uno de los siguiente regímenes de tratamiento en el día
-5 y en el día +5. Se inyectan todas las ratas con pristano (200
\muL) en el día 0 intradérmicamente en la base de la cola. Se
administra fitol a los grupos de ratas como sigue:
25 \muL de fitol intranasalmente (i. n.);
200 \muL de fitol intraperitonealmente (i.
p.);
200 \muL de fitol intradérmicamente en la base
de la cola (i. d.); y
1 \muL de fitol per os (p. o.).
Las ratas se clasifican desde el día 9
utilizando el sistema de clasificación extendido (como se discutió
previamente). El experimento demuestra un alivio y un efecto
preventivo de administración i. d. las rutas de administración
intraperitoneal (i. p.) e intranasal (i. n.) también demuestran
efecto de alivio y prevención (ver Figuras 17A, 17B y 17C).
Note que el grupo intranasal se sesga por una
rata que exhibe artritis severa, mientras que el otro grupo de
ratas en el grupo son protegidas.
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Ejemplo
19
Se compran ratones (B6. Cg-m +/+
Lepr (db), anteriormente conocidos como aC57BL/6J-m
+/+ Lepr^{db}) deficientes para Ncfl debido a una mutación de
punto en el sitio de división de exón 8 (Huang et al., (2000)
J. Leukoc. Biol. 67: 210-215.) Del laboratorio
Jackson (Maine, USA). Los ratones se retrocruzan con B 10. Q
(originalmente del Profesor Jan Klein, Tiibingen, Alemania) durante
dos generaciones para producir el alotipo Q en MHC y perder el
defecto del receptor leptino (lepr). B10. Q Ncfl +/- se entrecruza
para experimentos de artritis inducida por colágeno (CIA) con el
fin de obtener camadas de animales de control. Todos los
experimentos de artritis se aprueban por el comité ética local
(Malmö/Lund, Suecia) licencia M7-01.
Se induce artritis en todos los ratones en la
edad de 9-15 semanas mediante inyección intradérmica
en la base de la cola de de ratas CII 150 \mug (colágeno II)
emulsificadas en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco, Detroit,
MI) en el día 0 en el día 35, a las ratones se le da una inyección
de refuerzo en la misma ubicación de 50 \mug a ratas CII en
adyuvante incompleto de Freund y (IFA). El desarrollo de la artritis
se monitorea en todos los cuatro miembros utilizando un sistema de
clasificación microscópico. En resumen, se da un punto para cada
dedo rojo o hinchado. Un punto para cada parte media del pie
hinchado, dedo, o novillo y 5 puntos para un tobillo hinchado,
produciendo una clasificación máxima por miembro de 15 y 60 en
total. Se examinan los ratones de 1 a 4 veces por semanas durante 2
meses después de la inmunización. En el día 40, se obtiene suero a
través de sangrado de la cola y se mantiene a -20ºC hasta que se
ensaya.
La concentración de proteína matriz oligomérica
de cartílago en suero (COMP) se determina utilizando un ensayo
inmunosorbente de inhibición ligado a enzimas (ELISA). El COMP de
ratas se utiliza para cubrir las placas de microtítulo y para
preparar la cuerva estándar para placa. El COMP de plasma de detecta
al utilizar un antisuero policlonal que surge contra el COMP
(suministrado generosamente por el profesor Dick Heinegard) como se
captura el anticuerpo.
Anticuerpos contra cartílago de rata en plasma
se analizan con ELISA en placas de 96 pozo (Costar, Cambridge, MA),
se cubren durante la noche a 4ºC con 50, \mug/pozo de PBS que
contiene 10, \mug/mL de colágeno II de rata. Todos los lavados se
desarrollan utilizando solución salina
tris-amortiguada (NaCl 1.3M, Tris 0. 1M, pH 7,4)
que contiene 0.1% Tween20 (Tris/Tween). El plasma se diluye en
PBS/0.1% Tween y se analiza por duplicado. Las cantidades de
anticuerpos IgG unidos se estima después de incubación con un IgG
antiratón de burro acoplado con peroxidasa (Jackson Immunoresearch,
Westgrove, PA) y ABTS como sustrato, seguido por detección por un
SpectraMax (Molecular Devices) la cantidad relativa de anticuerpos
en el plasma se determina por comparación con un control positivo
de un anticolágeno II estándar.
Con el fin de determinar el papel de los
defectos o deficiencias del Ncfl funcional y/o el complejo oxidasa
NADPH en la artritis, se investiga el desarrollo de CIA (artritis
inducida por colágeno) en la deficiencia de Ncfl de ratones B10.Q.
Los ratones B10.Q tipo silvestre desarrollan normalmente una
artritis leve/media-severa, después del inicio de
la inmunización al aumentar la presión (Svensson et al.
(1998) Clin. Exp. Immunol. 111: 521-526). Los
resultados indican un inicio temprano (Figure 19) y se incrementa la
severidad de la artritis (P< 0.001) (Figuras 18A, 18B, 18C) en
los ratones con deficiencia de Ncfl como se compara para ratones
B10.Q. Los ratones heterozigotos por el defecto Ncf1 muestran una
artritis leve con inicio tardío que los ratones deficientes
homozigotos
(P< 0.005).
(P< 0.005).
La cuantificación de los niveles de suero de
COMP (Proteína de Matriz Oligomérica de Cartílago) se observa como
una medición de la erosión del cartílago de las articulaciones
periféricas. EL suero COMP se eleva altamente (P<0.0001) en el
Ncfl -/- ratones como se compara para Ncfl +/- y controles tipo
silvestre (Figura 20). Adicionalmente, en ratones con deficiencia
de Ncfl hay una respuesta de anticuerpo fuerte contra el colágeno
II en el día 40 después de la primera inmunización (Figura 21).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se desarrolla un experimento para determinar los
aceites que compiten por el espacio disponible en los nodos
linfáticos y si tal una competición es la razón para los efectos
preventivos de pretratamiento con hexadeceno y undecano. En el día
-5, las ratas DA se inyectan con una de las siguientes cantidades de
hexadeceno: 0 \muL, 50 \muL, 100 \muL, o 200 \muL. En el
día 0, todas las ratas se inyectan intradérmicamente con
14C-hexadecano en la base del tallo. En el día 10,
las ratas se sacrifican y los nodos linfáticos se recolectan y se
colocan en PBS, se homogenizan, y se enfrían. Luego se transfiere 1
mL del homogenato para Ready Safe (Beckman) y se analiza en un
contador \beta (Beckman).
La cantidad de hexadecano que induce artritis en
nodos linfáticos de drenaje no se afecta por grandes cantidades de
hexadeceno protector. Estos resultados indican que no hay
competición por el espacio en los nodos linfáticos de drenaje que
es de importancia para el efecto protector del aceite.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Las ratas DA se tratan de acuerdo con una de las
siguientes alternativas:
200 \muL fitol intradérmicamente en la base
del tallo en el día -10
200 \muL fitol intradérmicamente en la base
del tallo en el día -5
200 \muL fitol intraperitoneal en el día -5 y
el día +5
control no tratado
El CIA se induce en todos los animales en el día
0 al inyectar 150 PL del colágeno II disuelto en 75 PL 0.1 M de
ácido acético y se emulsifica en 75 PL de IFA. Las ratas se
clasifican a partir del día 10 utilizando el sistema de
clasificación extendido (ver anterior).
El tratamiento intraperitoneal e intradérmico
con fitol previene el desarrollo de la artritis en el modelo de
ratas CIA (Figura 22).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Los grupos de Ratas DA se inyectan con pristano
en el día 0. El pristano (150 PL) se inyecta intradérmicamente en
la base del tallo. Las ratas se clasifican a partir del día 9
utilizando el sistema de clasificación extendido (ver anterior).
Luego, las ratas se tratan en el día 21 y en el día 26 con una de
las siguientes alternativas:
200 \muL fitol intraperitoneal
200 \muL fitol intradérmicamente en la base
del tallo
200 \muL undecano intraperitoneal
200 \muL undecano intradérmicamente en la base
del tallo
control no tratado
Todos los tratamientos con fitol y undecano son
efectivos contra la artritis activa en el modelo de rata PIA
(Figuras 23A, 23B).
Se debe entender que mientras la invención se ha
descrito en conjunto con la descripción detallada de esta, la
anterior descripción pretende ilustrar y no limitar el alcance de la
invención, que se define mediante el alcance de las
reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas, y
modificaciones están dentro del alcance de las siguientes
reivindicaciones.
<110> Arexis AB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Condiciones Autoinmunes y defectos
de NADPH Oxidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 11145-024WO1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/380,904
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-05-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/429,609
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-11-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ de Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (18)
1. Un método in vitro para determinar una
susceptibilidad de un mamífero a desarrollar una afección autoinmune
o para diagnosticar una afección autoinmune, dicha afección
autoinmune se ha seleccionado de artritis y esclerosis múltiple,
dicho método comprende determinar si o no dicho mamífero comprende
una variante genética del gen que codifica la oxidasa NADPH, en
donde la presencia de dicha variante genética indica que dicho
mamífero tiene o es susceptible a desarrollar dicha afección
autoinmune.
2. El método de la reivindicación 1 en donde
dicho método es para determinar una susceptibilidad de un mamífero
a desarrollar una afección autoinmune.
3. El método de la reivindicación 1 en donde
dicho método es para diagnosticar una afección autoinmune acompañada
por La deficiencia de oxidasa NADPH en un mamífero que tiene una
afección autoinmune.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en donde dicha variante
genética codifica un polipéptido mutante.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
dicho polipéptido mutante es un polipéptido a GP91 PHOX, Polipéptido
P22PHOX, Polipéptido P4OPHOX, Polipéptido P47PHOX, o Polipéptido
P67PHOX.
6. El método de la reivindicación 5, en donde
dicho polipéptido mutante es un Polipéptido P47PHOX.
7. El método de la reivindicación 6, en donde
dicho mamífero es un humano, y en donde dicho polipéptido mutante
P47PHOX comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 6 con
por lo menos dos sustituciones de aminoácido.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en donde dicha variante
genética comprende una mutación en una secuencia reguladora de
dicho gen.
9. El uso de fitol, undecano, o hexadeceno en la
fabricación de un medicamento para tratar una afección autoinmune
en un mamífero, dicha afección autoinmune se ha seleccionado de
artritis y esclerosis múltiple.
10. Un método para identificar un agente que
mejora la actividad oxidasa NADPH en una célula, en donde dicha
célula es de un animal no humano susceptible a la inducción de
artritis, dicho método comprende:
(a) poner en contacto dicha célula con un
activador oxidasa NADPH y un agente de ensayo para formar un ensayo
celular,
(b) determinar el nivel de la actividad oxidasa
NADPH en dicho ensayo celular,
(c) determinar si o no dicho nivel es mayor que
un nivel de control de la actividad oxidasa NADPH, en donde dicho
nivel de control es la cantidad de la actividad oxidasa NADPH en un
control celular tratado con dicho activador en la ausencia de dicho
agente de ensayo, e
(d) identificar dicho agente como mejorador de
la actividad oxidasa NADPH cuando dicho nivel es mayor que dicho
nivel de control.
11. El método de la reivindicación 10, en donde
dicha célula es una célula de una rata DA.
12. El método de la reivindicación 10, en donde
dicha célula es un linfocito.
13. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho animal no humano es susceptible a artritis inducida por
pristano, artritis inducida por colágeno, artritis inducida por
adyuvante, artritis inducida por aceite, artritis inducida por
hexadecano, o artritis inducida por avridina.
14. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho activador oxidasa NADPH es norfloxacina, ácido fosfatídico,
diacilglicerol, ácido araquidónico, acetato miristato forbol,
lisofosfatidilcolina, fM LP, pristano, fitol, octano, decano,
undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, hexadecano, heptadecano,
octadecano, galectina 1, o galectina 3.
15. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho nivel de la actividad oxidasa NADPH se determina al medir el
superóxido.
16. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho nivel de la actividad oxidasa NADPH se determina al medir las
especies de oxígeno reactivas.
17. El método de la reivindicación 10, en donde
dicho nivel de la actividad oxidasa NADPH se determina con un
ensayo de citocromo C o ensayo WST-1.
18. Un método in vitro para identificar
un agente que reduce la activación de célula T, dicho método
comprende:
(a) determinar si o no un agente de ensayo
incrementa la actividad oxidasa NADPH; y
(b) clasificar dicho agente de ensayo como un
agente que reduce la activación de célula T cuando dicho agente de
ensayo incrementa la actividad oxidasa NADPH.
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