ES2312369T3 - Nuevos peptidos quimericos analgesicos. - Google Patents

Abstract

Un péptido quimérico que consiste en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 42 o ID SEC Nº: 43, en el que dicho péptido quimérico induce analgesia.

Description

Nuevos péptidos quiméricos analgésicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos y composiciones para el tratamiento del dolor. Más específicamente, la presente invención se refiere a péptidos quiméricos nuevos para el tratamiento del dolor.

Antecedentes de la invención

Dos millones de personas padecen dolor crónico en los Estados Unidos. El dolor está provocado por una percepción sumamente compleja de una sensación aversiva o desagradable. La sensación de dolor comienza con la estimulación nociva de terminaciones nerviosas libres, lo que conduce a la activación de diferentes tipos de fibras aferentes nociceptivas. Estas fibras incluyen las fibras A\delta y las fibras C. Las fibras A\delta son fibras de diámetro pequeño, con una cubierta fina de mielina que transmiten un dolor agudo, punzante. Las fibras C no están mielinizadas y conducen más lentamente, y transmiten un dolor sordo, continuo. La estimulación repetida de las fibras del dolor puede conducir a hiperalgesia, o una disminución del umbral de la activación de los nociceptores.

Las fibras aferentes primarias A\delta o C de las sinapsis periféricas dañadas liberan una diversidad de mediadores químicos. Estos mediadores incluyen glutamato y sustancia P ("SP"), un péptido nociceptivo. SP se ha reconocido e identificado desde hace tiempo como un neurotransmisor íntimamente asociado a la transferencia de estímulos dolorosos o nociceptivos desde los campos receptores periféricos hacia el SNC. Este neuropéptido está implicado en la señalización del dolor y en el mantenimiento del estado de dolor crónico. SP es el miembro prototípico de una familia de péptidos relacionados denominados taquicininas, los cuales se caracterizaron inicialmente por la actividad contráctil en preparaciones de músculo liso aislado. SP también se halla en el cerebro, médula espinal, ganglios espinales e intestino de todos los vertebrados, incluido el hombre.

SP está presente en las fibras sensitivas de diámetro pequeño que actúan como mediadores de las señales de entrada nociceptivas en la médula espinal, y excita específicamente las neuronas nociceptivas de esta región. SP se libera en la médula espinal in vivo, tras la activación de las fibras sensitivas primarias nociceptivas. La aplicación directa de dosis de microgramos de SP en el espacio subaracnoideo espinal lumbar produce hiperalgesia, es decir, una sensibilidad incrementada al dolor. La liberación de SP se puede bloquear mediante la administración de morfina y péptidos opioides in vivo e in vitro. Por ejemplo, la administración intratecal de morfina bloquea los efectos hiperalgésicos de la SP administrada de forma exógena. Véase, Hyden y Wilcox, Eur. J. Pharmacol., 86: 95-98 (1983); y J. Pharmacol. Exp. Ther. 226: 398-404 (1983).

Aunque los opioides pueden ser eficaces para el tratamiento del dolor crónico, con frecuencia tienen efectos secundarios, que incluyen depresión respiratoria, retención urinaria, náuseas y vómitos, prurito y sedación. Además, la administración diaria repetida de opioides produce finalmente tolerancia, por lo que la dosis del fármaco se debe incrementar para mantener una analgesia adecuada, y también puede comenzar la dependencia física. Si se desarrolla tolerancia y el nivel de opioides es insuficiente, pueden aparecer síntomas de abstinencia, tales como diarrea, sudoración, temblores, ansiedad y fiebre. Estos problemas han dado lugar a la búsqueda de nuevos analgésicos con efectos secundarios limitados y que muestren una susceptibilidad disminuida a la tolerancia.

International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 39, nº 6, 1 de junio de 1991, páginas 516-522, describe el diseño de ligandos peptídicos quiméricos para los receptores de galanina y para los receptores de sustancia P.

Anaesthesiology, vol. 91, nº 3A, 1999, página A944, describe un péptido quimérico que se une a los receptores opioides y de la sustancia P para el tratamiento del dolor agudo y crónico.

Analgesia, vol. 3, 1998, páginas 259-268, describe las interacciones funcionales dobles de la sustancia P y los opioides en la transmisión nociceptiva.

Letters in Peptide Science, vol. 5, nº 5-6, octubre de 1998, páginas 395-398, describe formas alternativas de interacción de la sustancia P y los opioides en la transmisión nociceptiva.

La presente invención proporciona un péptido quimérico que consiste en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 42 o ID SEC Nº: 43, en el que dicho péptido induce analgesia.

La presente invención proporciona así un péptido quimérico nuevo que tiene un resto opioide que se une a un receptor opioide y un resto nociceptivo que se une al receptor nociceptivo NK_{1}. El resto opioide se dirige al receptor opioide \mu.

El péptido quimérico incluye un resto opioide de unión al receptor \mu y un resto de SP de unión a NK_{1}. En una realización, este péptido quimérico tiene la secuencia: Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH_{2} (ID SEC Nº:42).

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Los péptidos quiméricos se pueden diseñar para que tengan una diversidad de restos de SP y una diversidad de restos opioides. La diversidad de restos opioides se puede dirigir al mismo tipo de receptor, o, de forma alternativa, la diversidad de restos opioides se puede dirigir a diferentes tipos de receptores opioides.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen péptidos quiméricos y un vehículo farmacéuticamente aceptable, útiles para el tratamiento del dolor.

La invención también proporciona el uso de los péptidos quiméricos de la invención anteriormente mencionados para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor. El péptido quimérico se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina estéril farmacéutica. El péptido puede ser para la administración de forma intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV) o sistémica, por ejemplo, intraperitoneal (IP). La solubilidad de los péptidos quiméricos se puede incrementar mediante la mezcla con un agente solubilizante, por ejemplo, ciclodextrano. De forma alternativa, el péptido quimérico es para la administración junto con uno o más fármacos opioides no quiméricos.

Entre las ventajas de la invención está que los péptidos quiméricos producen una analgesia eficaz y sin embargo inhiben el desarrollo de tolerancia.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción adjunta más adelante. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en esta memoria en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones. En la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo imponga claramente de otra manera. A menos que se defina de otra manera, todas las expresiones técnicas y científicas usadas en esta memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente alguien de experiencia habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. A menos que se indique expresamente de otra manera, las técnicas empleadas o contempladas en esta memoria son metodologías generales muy conocidas para alguien de experiencia habitual en la técnica. Los ejemplos de las realizaciones tienen únicamente fines ilustrativos

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una representación esquemática del péptido quimérico ESP7.

La Fig. 2 es una representación esquemática del péptido quimérico ESP6.

La Fig. 3 es un gráfico que ilustra la afinidad de unión de ESP7 al receptor \mu.

La Fig. 4 es un gráfico que ilustra la afinidad de unión de ESP7 al receptor NK_{1}.

La Fig. 5 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 1,0 \mug de ESP7 administrado de forma intratecal.

La Fig. 6 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 0,2 \mug de ESP7 administrado de forma intratecal.

La Fig. 7 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas de 0,05 \mug de ESP7 administrado de forma intratecal.

La Fig. 8 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 0,2 \mug de ESP7 antagonizado en los días 2 y 4 con 0,2 \mug de naltrexona.

La Fig. 9 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 1,0 \mug de ESP7 antagonizado con RP67580 en los días 1-4.

La Fig. 10 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 0,1 \mug de ESP7 administrado de forma intracerebroventricular.

La Fig. 11 es un gráfico que ilustra el efecto analgésico en ratas a lo largo del tiempo de 1 mg de ESP7 administrado de forma intraperitoneal.

La presente invención proporciona un péptido quimérico que tiene un resto de unión a receptores opioides y un resto de unión a receptores nociceptivos (es decir, sustancia P). Las moléculas peptídicas quiméricas están diseñadas para unirse a los receptores opioides \mu que se sabe que están implicados en la mediación del dolor. Véase la revisión de Lipkowski y Carr, Peptides: Synthesis, Structures, and Applications, Gutte, ed., Academic Press, págs. 287-320 (1995). Aunque los péptidos opioides exhiben frecuentemente cierta reactividad cruzada con tipos de receptores diferentes, se pueden caracterizar en general por el grado de afinidad para un tipo de receptor particular. Estos receptores incluyen el receptor \mu, el receptor \delta y el receptor \kappa.

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Los distintos restos se pueden sintetizar químicamente y purificarlos o aislarlos de fuentes naturales, y después entrecruzarlos químicamente para formar el péptido quimérico. De manera alternativa, la quimera se puede sintetizar químicamente en forma de una molécula. En otra realización, los péptidos quiméricos se producen mediante técnicas de ADN recombinante, y se aíslan de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado con el uso de técnicas habituales de purificación de proteínas.

Síntesis química

Los péptidos quiméricos, y los restos individuales o los análogos y derivados de los mismos, se pueden sintetizar químicamente. Son habituales en la técnica una diversidad de métodos de síntesis de proteínas, que incluyen la síntesis mediante el uso de un sintetizador de péptidos. Véase, p. ej., Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Bodasnsky, Ed. Springer-Verlag, 1988; Merrifield, Science 232: 241-247 (1986); Barany, et al, Intl. J. Peptide Protein Res. 30: 705-739 (1987); Kent, Ann. Rev. Biochem. 57: 957-989 (1988), y Kaiser, et al, Science 243: 187-198 (1989). Los péptidos se purifican de forma que están sustancialmente exentos de precursores químicos o de otros productos químicos, mediante el uso de técnicas habituales de purificación de péptidos. La expresión "sustancialmente exentos de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye las preparaciones de péptido en las que el péptido está separado de los precursores químicos o de otros productos químicos que están implicados en la síntesis del péptido. En una realización, la expresión "sustancialmente exentos de precursores químicos o de otros productos químicos" incluye las preparaciones de péptido que tienen menos de alrededor del 30% (en peso seco) de precursores químicos o de productos químicos no peptídicos, más preferiblemente menos de alrededor del 20% de precursores químicos o de productos químicos no peptídicos, aún más preferiblemente menos de alrededor del 10% de precursores químicos o de productos químicos no peptídicos, y lo más preferiblemente menos de alrededor del 5% de precursores químicos o de productos químicos no peptídicos.

La síntesis química de los péptidos facilita la incorporación de aminoácidos modificados o no naturales, que incluyen D-aminoácidos y otras moléculas orgánicas pequeñas. La sustitución de uno o más L-aminoácidos en un péptido con las isoformas de D-aminoácidos correspondientes se puede usar para incrementar la resistencia de los péptidos a la hidrólisis enzimática, y para incrementar una o más propiedades de los péptidos biológicamente activos, es decir, la unión al receptor, la potencia funcional o la duración de la acción. Véase, p. ej., Doherty, et al., 1993, J. Med. Chem. 36: 2585-2594; Kirby, et al., 1993, J. Med. Chem. 36: 3802-3808; Morita, et al., 1994, FEBS Lett. 353: 84-88; Wang, et al., 1993, Int. J. Pept. Protein Res. 42: 392-399; Fauchere y Thiunieau, 1992, Adv. Drug Res. 23: 127-159.

La introducción de entrecruzamientos covalentes en una secuencia peptídica puede restringir conformacionalmente y topográficamente el esqueleto del péptido. Esta estrategia se puede usar para desarrollar análogos peptídicos de los péptidos quiméricos con una potencia, selectividad y estabilidad incrementadas. Debido a que la entropía conformacional de un péptido cíclico es menor que la de su homólogo lineal, la adopción de una conformación específica se puede dar con una disminución menor de entropía para un análogo cíclico que para un análogo acíclico, por lo que se hace que la energía libre de la unión sea más favorable. La macrociclación se lleva a cabo a menudo formando un enlace amida entre los extremos N- y C-terminal del péptido, entre una cadena lateral y el extremo N- o C-terminal [p. ej., con K_{3}Fe(CN)_{6} a pH 8,5] (Samson et al., Endocrinology, 137: 5182-5185 (1996)], o entre dos cadenas laterales de aminoácidos. Véase, p. ej., DeGrado, Adv Protein Chem, 39: 51-124 (1988). También se introducen puentes disulfuro en secuencias lineales para reducir su flexibilidad. Véase, p. ej., Rose, et al., Adv Protein Chem, 37: 1-109 (1985); Mosberg et al., Biochem Biophys Res Commun, 106: 505-512 (1982). Además, la sustitución de los residuos de cisteína con penicilamina (Pen, 3-mercapto-(D) valina) se ha usado para incrementar la selectividad de ciertas interacciones opioide-receptor. Lipkowski y Carr, Peptides: Synthesis, Structures, and Applications, Gutte, ed., Academic Press, págs. 287-320 (1995).

Se han usado otros métodos de manera satisfactoria para introducir restricciones conformacionales en secuencias peptídicas para mejorar su potencia, selectividad por el receptor y semivida biológica. Estos incluyen el uso de (i) C_{\alpha}-metilaminoácidos (véase, p. ej., Rose, et al., Adv Protein Chem, 37: 1-109 (1985); Prasad y Balaram, CRC Crit Rev Biochem, 16: 307-348 (1984)); (ii) N_{\alpha}-metilaminoácidos (véase, p. ej., Aubry, et al., Int J Pept Protein Res, 18: 195-202 (1981); Manavalan y Momany, Biopolymers, 19: 1943-1973 (1980)); y (iii) aminoácidos \alpha,\beta-insaturados (véase, p. ej., Bach y Gierasch, Biopolymers, 25: 5175-S192 (1986); Singh, et al., Biopolymers, 26: 819-829 (1987)). Estos y otros muchos análogos de aminoácidos están disponibles comercialmente, o se pueden preparar fácilmente. Además, se puede usar la sustitución del ácido C-terminal con una amida para mejorar la solubilidad y el aclaramiento de un péptido.

Péptidos recombinantes

De forma alternativa, los péptidos se pueden obtener mediante métodos bien conocidos en la técnica para la expresión y la purificación de péptidos recombinantes. Se puede generar una molécula de ADN que codifica un péptido quimérico. La secuencia de ADN se deduce de la secuencia de la proteína basándose en el uso conocido de los códones. Véase, p. ej., Old y Primrose, Principles of Gene Manipulation, 3ª ed., Blackwell Scientific Publications, 1985; Wada et al., Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118, (1992). Preferiblemente, la molécula de ADN incluye una secuencia adicional, p. ej., sitios de reconocimiento para enzimas de restricción que facilitan su clonado en un vector de clonado adecuado, tal como un plásmido. La invención proporciona los ácidos nucleicos que comprenden las regiones codificantes, las regiones no codificantes, o ambas, solas o clonadas en un vector recombinante, así como los oligonucleótidos y los cebadores relacionados y los pares de cebadores correspondientes. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los vectores de la invención pueden ser vectores de expresión. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos quiméricos se pueden obtener mediante cualquier método conocido en la técnica (p. ej., mediante amplificación con PCR con el uso de cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia, y/o mediante clonado a partir de una biblioteca genómica o de cADN con el uso de una secuencia oligonucleotídica específica para la secuencia génica dada, o similares). Los ácidos nucleicos se pueden generar también mediante síntesis química.

Los ácidos nucleicos son hibridables, o complementarios, a los ácidos nucleicos que codifican los péptidos quiméricos. El complemento inverso de los ácidos nucleicos hibridables a los ácidos nucleicos codificantes (es decir, el complemento inverso de una cadena de ácido nucleico tiene la secuencia complementaria dispuesta en orientación inversa respecto de la cadena, de forma que el complemento inverso hibridaría con pocos o ningún emparejamiento incorrecto a la cadena de ácido nucleico). Las moléculas de ácidos nucleicos pueden codificar derivados y análogos de un péptido quimérico, o ácidos nucleicos complementarios de los mismos.

Se puede usar cualquiera de las metodologías conocidas en la técnica relevante con respecto a la inserción de fragmentos de ácidos nucleicos en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico compuesto de las señales de control transcripcional/traduccional apropiadas y las secuencias codificantes del péptido. Las secuencias promotoras/potenciadoras de los vectores de expresión pueden usar secuencias reguladoras de vegetales, animales, insectos u hongos.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, el péptido se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, hongos o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas. Se puede expresar un ácido nucleico que codifica el péptido en células mamíferas mediante el uso de un vector de expresión de mamíferos. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195). Además, también se pueden usar animales transgénicos que contienen ácidos nucleicos que codifican un péptido quimérico para expresar los péptidos.

El ADN del vector se puede introducir en las células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usan en esta memoria, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir un ácido nucleico ajeno (p. ej., ADN) en una célula hospedadora, que incluyen la co-precipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras se pueden hallar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio.

Más habitualmente, las células hospedadoras se pueden usar para producir (es decir, sobreexpresar) el péptido en cultivo. Por lo tanto, se proporcionan métodos para producir un péptido mediante el uso de células hospedadoras. Un método puede comprender cultivar la célula hospedadora (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica el péptido) en un medio adecuado, de forma que se produzca el péptido. El método implica además aislar el péptido del medio o de la célula hospedadora. Ausubel et al., (Eds). En: Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1998.

Un péptido recombinante "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente exento de material celular o de otras proteínas contaminantes procedentes de la fuente celular o tisular de la que deriva el péptido de interés. La expresión "sustancialmente exento de material celular" incluye las preparaciones en las que el péptido está separado de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aísla o se produce de forma recombinante. En una realización, la expresión "sustancialmente exento de material celular" incluye las preparaciones de péptido que tienen menos de alrededor del 30% (en peso seco) de péptidos distintos del péptido deseado (también denominado en esta memoria "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de alrededor del 20% de proteína contaminante, aún más preferiblemente menos de alrededor del 10% de proteína contaminante, y lo más preferiblemente menos de alrededor del 5% de proteína contaminante. Cuando el péptido o la porción biológicamente activa del mismo se produce de forma recombinante, preferiblemente también está sustancialmente exento de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de alrededor del 20%, más preferiblemente menos de alrededor del 10%, y lo más preferiblemente menos de alrededor del 5% del volumen de la preparación de péptido.

Las células modificadas para sobreexpresar un péptido quimérico se pueden introducir también in vivo con fines terapéuticos mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitación, la implantación o el trasplante de células en un sujeto hospedador, en el que las células pueden estar "desnudas" o encapsuladas antes de la implantación. Las células se pueden cribar antes de la implantación en función de diversas características que incluyen, pero sin limitación, el nivel de péptido secretado, la estabilidad de la expresión, y similares.

Producción de derivados y análogos

Las variantes de los péptidos funcionan como agonistas (moléculas miméticas) o como antagonistas. Las variantes de un péptido originario se pueden generar mediante mutagénesis, p. ej., mutación puntual específica. Un agonista de un péptido originario puede conservar sustancialmente las mismas, o un subgrupo de, las actividades biológicas de la forma natural del péptido originario. Un antagonista del péptido puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural del péptido originario, por ejemplo, uniéndose de forma competitiva al receptor. Así, se pueden generar efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante con una función limitada. El tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subgrupo de las actividades biológicas de la forma natural del péptido puede tener menos efectos secundarios en el sujeto respecto del tratamiento con la forma natural del péptido originario.

Los análogos, las variantes o los péptidos derivados pueden ser funcionalmente activos. Como se usa en esta memoria, la expresión "funcionalmente activos" se refiere a especies que exhiben uno o más atributos funcionales conocidos de un péptido de tamaño completo. "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido, pero que conserva sus propiedades esenciales. En general, las variantes son en conjunto muy similares, y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes, o ambas.

Las variantes de los péptidos que funcionan como agonistas (moléculas miméticas) o como antagonistas se pueden identificar cribando bibliotecas combinatorias de mutantes del péptido originario en función de la actividad agonista o antagonista de los péptidos. Se puede generar una biblioteca diversa de variantes mediante mutagénesis combinatoria del ácido nucleico, y está codificada por una biblioteca génica diversa. Se puede producir una biblioteca diversa de variantes, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de forma que sea expresable un grupo degenerado de secuencias potenciales en forma de péptidos individuales, o, de manera alternativa, en forma de un grupo de proteínas de fusión mayores (p. ej., para la expresión en fagos) que contienen el grupo de secuencias en ellas. Existe una diversidad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. Se puede llevar a cabo la síntesis química de una secuencia génica degenerada en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético se liga después en un vector de expresión apropiado. El uso de un grupo degenerado de genes permite el suministro, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el grupo deseado de secuencias potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, p. ej., Narang (1983), Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu Rev Biochem 53:323; Itakura et al. (1984), Science 198:1056; Ike et al. (1983), Nucl Acid Res
11:477.

Los derivados y análogos de los péptidos quiméricos o de los restos individuales se pueden producir mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas se pueden modificar mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook, et al., 1990, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY). Las manipulaciones pueden incluir la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, la unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, y similares. Se puede utilizar cualquiera de las numerosas metodologías de modificación química conocidas en la técnica que incluyen, pero sin limitación, la escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH_{4}, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. Se puede modificar un péptido mediante la incorporación de un reactivo heterofuncional, en el que dicho reactivo heterofuncional se puede usar para conectar el resto opioide al resto nociceptivo.

Los derivados, fragmentos y análogos se definen como secuencias de al menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) o al menos 4 aminoácidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir la hibridación específica en el caso de los ácidos nucleicos o para permitir el reconocimiento específico de un epítopo en el caso de los aminoácidos, respectivamente. Los fragmentos son, como máximo, de un ácido nucleico menos o de un aminoácido menos que la secuencia de tamaño completo de tipo natural. Los derivados y análogos pueden ser de tamaño completo o de un tamaño distinto del tamaño completo, si dicho derivado o análogo contiene un ácido nucleico o aminoácido modificado, como se describe más adelante. Los derivados o análogos de los péptidos quiméricos incluyen, pero sin limitación, moléculas que comprenden regiones que son sustancialmente homólogas en diversas realizaciones, de al menos una identidad de aminoácidos del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o preferiblemente 95% cuando: (i) se comparan con una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico; (ii) se comparan con una secuencia alineada en la que la alineación se lleva a cabo mediante un programa informático de homología conocido en la técnica (p. ej., el soporte informático Wisconsin GCG) o (iii) el ácido nucleico codificante es capaz de hibridar a una secuencia que codifica los péptidos anteriormente mencionados en condiciones rigurosas (preferidas), moderadamente rigurosas, o no rigurosas. Véase, p. ej., Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1993.

Los derivados de los péptidos quiméricos se pueden producir mediante la alteración de sus secuencias mediante sustituciones, adiciones o deleciones que dan como resultado moléculas funcionalmente equivalentes. Las secuencias de ADN pueden codificar sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos. Se puede sustituir uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de interés por otro aminoácido de una polaridad y carga neta similares, lo que da como resultado una alteración conservativa. Los sustitutos para un aminoácido de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos apolares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicocola, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

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Los péptidos quiméricos están relacionados con los opioides de animales (p. ej., ratón, rata, cerdo, vaca, perro, mono, rana), o de humanos. Los homólogos (es decir, los ácidos nucleicos que codifican péptidos derivados de especies distintas de la humana) u otras secuencias relacionadas (p. ej., parálogos) se pueden obtener también mediante hibridación con rigurosidad baja, moderada o elevada con toda o parte de la secuencia humana particular como sonda mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica para la hibridación y el clonado de ácidos nucleicos. Véase, p. ej., Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

Una secuencia de ácido nucleico es hibridable a una secuencia de ácido nucleico (o un complemento de la anterior) que codifica los péptidos quiméricos en condiciones de rigurosidad elevada: Etapa 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 8 horas durante la noche a 65ºC en un tampón compuesto de SSC 6X, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65ºC en la mezcla de prehibridación anterior, a la que se añaden 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: Los filtros se lavan durante 1 hora a 37ºC en una disolución que contiene SSC 2X, 0,01% de PVP, 0,01% de Ficoll, y 0,01% de BSA. Esto va seguido de un lavado en SSC 0,1X a 50ºC durante 45 minutos. Etapa 4: Los filtros se autorradiografían. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de rigurosidad elevada que se pueden usar.

Una secuencia de ácido nucleico es hibridable a una secuencia de ácido nucleico (o un complemento suyo) que codifica los péptidos quiméricos en condiciones de rigurosidad moderada: Etapa 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 6 horas a 55ºC en una disolución que contiene SSC 6X, disolución de Denhardt 5X, 5% de SDS y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: Los filtros se hibridan durante 18-20 horas a 55ºC en la misma disolución con 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: Los filtros se lavan a 37ºC durante 1 hora en una disolución que contiene SSC 2X, 0,1% de SDS, y después se lavan dos veces durante 30 minutos a 60ºC en una disolución que contiene SSC 1X y 0,1% de SDS. Etapa 4: Los filtros se secan y se exponen a autorradiografía. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de rigurosidad moderada que se pueden usar.

Un ácido nucleico es hibridable a una secuencia de ácido nucleico que codifica los péptidos anteriormente mencionados en condiciones de rigurosidad baja: Etapa 1: Se pretratan filtros que contienen ADN durante 6 horas a 40ºC en una disolución que contiene un 35% de formamida, SSC 5X, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, 0,1% de PVP, 0,1% de Ficoll, 1% de BSA, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Etapa 2: Los filtros se hibridan durante 18-20 horas a 40ºC en la misma disolución con la adición de un 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,2% de BSA, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 10% (p/vol) de sulfato de dextrano, y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. Etapa 3: Los filtros se lavan durante 1,5 horas a 55 ºC en una disolución que contiene SSC 2X, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y 0,1% de SDS. La disolución de lavado se sustituye con disolución fresca y se incuba durante 1,5 horas adicionales a 60ºC. Etapa 4: Los filtros se secan y se exponen a autorradiografía. Si es necesario, los filtros se lavan por tercera vez a 65-68ºC y se reexponen a la película. Se conocen bien en la técnica otras condiciones de rigurosidad baja que se pueden usar (p. ej., como se emplean en las hibridaciones entre especies). Véase también, Shilo y Weinberg, Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792 (1981).

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Diseño de péptidos quiméricos Péptidos con afinidad por el receptor \mu

Los agonistas de péptidos opioides exógenos para el tipo de receptor \mu incluyen los enumerados en la Tabla 1: \alpha-endorfina, endomorfina-1, endomorfina-2, dermorfina, \beta-casomorfina (bovina o humana), morficeptina, Leu-encefalina, Met-encefalina, DALDA, y PL107. Las modificaciones de los péptidos han dado como resultado ligandos del receptor \mu muy selectivos. Estas modificaciones pueden incluir la amidación del extremo carboxilo (-NH_{2}), el uso de (D) aminoácidos en el péptido (p. ej., DALDA), la incorporación de restos pequeños no peptídicos, así como la modificación de los propios aminoácidos (p. ej., la alquilación o la esterificación de los grupos R de la cadena lateral). Como, por ejemplo, en el compuesto DAMGO: Tyr-(D)Ala-Gly-Phe-NHCH_{2}CH_{2}OH.

TABLA 1

1

Péptidos con afinidad por el receptor \delta

Otros restos de péptidos opioides incluyen los agonistas del receptor \delta enumerados en la Tabla 2. Aquellos con la selectividad más elevada por el receptor son en general los péptidos derivados de encefalina. Por ejemplo, DADLE tiene una selectividad de tres a diez veces mayor por el receptor \delta que por el receptor \mu. Las modificaciones de la secuencia de encefalina originaria dan como resultado dos grupos de análogos peptídicos. El primer grupo es una serie de análogos lineales, por ejemplo, DSLET. El segundo grupo, todos análogos cíclicos regidos, incluye DPDPE (en el que Pen es penicilamina, o 3-mercapto-(D)Valina). En los ensayos de unión, estos análogos muestran una afinidad de 100 veces por el receptor \delta respecto del receptor \mu, y un incremento de 1000 veces respecto del receptor \kappa. Los análogos pseudopeptídicos adicionales, lineales o cíclicos, también exhiben una selectividad elevada hacia el receptor \delta, por ejemplo Tyr-Tic-Phe-Phe, en el que Tic es ácido L-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico. Schiller, et al., J. Med. Chem. 36: 3182-3187 (1993).

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TABLA 2

2

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Péptidos con afinidad por el receptor \kappa

Los restos opioides también incluyen los péptidos relacionados con dinorfina ("DYN"), que son agonistas peptídicos endógenos para el receptor \kappa. Se muestran algunos péptidos representativos en la Tabla 3. El propéptido, pro-dinorfina, se procesa hasta péptidos de longitudes diferentes y con selectividades diferentes por el receptor. Varios de estos péptidos, que incluyen dinorfina A, DYN (1-8) y DYN (1-13), se hallan en el SNC de los vertebrados en concentraciones fisiológicamente significativas. Se han generado varios análogos de dinorfina mediante la sustitución de D-aminoácidos en la posición 8 (Ile) o 10 (Pro). Además, se han generado análogos cíclicos de dinorfina con una selectividad elevada por el receptor \kappa: p. ej., Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Cys-Arg-Pro-Lys-Leu-Cys-NH_{2} (ID SEC Nº: 44), en la que las dos cisteínas forman parte de un enlace disulfuro, para crear un anillo de seis aminoácidos.

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TABLA 3

4

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Péptidos con afinidad por el receptor NK_{1}: Péptidos de la sustancia P

El resto de SP del péptido quimérico está diseñado para que se una al receptor NK_{1}. SP es un péptido de 11 aminoácidos, que tiene varios análogos naturales y sintéticos diferentes. Se muestra un grupo representativo en la Tabla 4 más adelante. Varios fragmentos aminoterminales y péptidos modificados de SP tienen un grado elevado de especificidad por el receptor NK_{1} respeto de los receptores NK_{2} y NK_{3}. Esta especificidad se puede incrementar mediante la esterificación de la amida carboxiterminal. Otras modificaciones incluyen la generación de moléculas cíclicas (p. ej., por medio de puentes disulfuro Cys-Cys), la incorporación de restos no peptídicos (p. ej. espirolactonas, como discute Ward en J. Med. Chem. 33: 1848-1851 (1990)). Además, SP y los análogos de SP se pueden hacer más estables mediante el uso de D-aminoácidos. Se proporciona una lista representativa de SP y de su familia de compuestos relacionados en la Tabla 4 siguiente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

5

6

El objetivo del péptido quimérico de la presente invención es el receptor \mu. Los péptidos quiméricos se pueden sintetizar para que tengan una diversidad de restos opioides. Estos restos opioides pueden estar dirigidos a cualquier combinación de los receptores opioides, o pueden estar dirigidos al mismo tipo de receptor. Además, se puede sintetizar una quimera para que contenga una diversidad de restos de SP por cada resto opioide. En una realización, el péptido quimérico nuevo es ESP7, ID SEC Nº:42 (Fig. 1). Debido a que incluye endomorfina-2 en el extremo N-terminal y SP (7-11) en el extremo C-terminal, ESP7 está diseñado para unirse al receptor \mu y al receptor NK_{1}. Un derivado de ESP7 es ESP6, o Pro 5 ESP7: Tyr-Pro-Phe-Phe-Pro-Leu-Met-NH_{2} (Fig. 2, ID SEC Nº:43).

Composiciones farmacéuticas

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones comprenden típicamente el péptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en esta memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cierto medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. Se pueden hacer modificaciones al péptido de la presente invención para influir en la solubilidad o el aclaramiento del péptido. Estas moléculas se pueden sintetizar también con D-aminoácidos para incrementar la resistencia a la degradación enzimática. Si es necesario, los péptidos quiméricos se pueden co-administrar con un agente solubilizante, tal como ciclodextrano.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración deseada. Los ejemplos de rutas de administración incluyen la administración parenteral, p. ej., intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p. ej., inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede introducir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones, y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones inyectables estériles o dispersiones. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida, de manera que se pueda utilizar fácilmente con una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y las mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede llevar a cabo mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, carbohidratos, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico, en la composición. Se puede proporcionar una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (p. ej., el péptido quimérico) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por una esterilización mediante filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución de los mismos previamente esterilizada mediante filtración.

Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden introducir en cápsulas de gelatina, o se pueden comprimir en comprimidos. Para la administración oral terapéutica, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarlo en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales se pueden preparar también mediante el uso de un vehículo líquido para el uso en forma de un elixir bucal, en el que el compuesto en el vehículo líquido se aplica de forma oral, y se usa como enjuague y se expectora o se ingiere. Se pueden incluir agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato magnésico o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo, o aromatizante de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizador de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, p. ej., un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica puede ser también mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Tales agentes penetrantes se conocen en general en la técnica, e incluyen, por ejemplo para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede llevar a cabo por medio del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica.

Los compuestos se pueden preparar también en forma de supositorios (p. ej., con bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o de enemas de retención para la administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto de la eliminación rápida del organismo, tal como en una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales se pueden obtener también comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos hacia células infectadas con anticuerpos monoclonales hacia los antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según los métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la pat. de EE.UU. nº 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de las dosis. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en esta memoria, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. Las especificaciones para las formas farmacéuticas unitarias de la invención están impuestas por, y son directamente dependientes de, las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de los pacientes.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos quiméricos de la invención se pueden insertar en vectores y usarlos como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (véase la pat. de EE.UU. nº 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, p. ej., Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está incrustado el vehículo de administración génica. De forma alternativa, cuando se puede producir el vector de administración génica completo intacto a partir de células recombinantes, p. ej., vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de administración génica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.

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Tratamiento del dolor

La invención proporciona además el uso para la fabricación de un medicamento para tratar el dolor en un mamífero, para producir analgesia en el paciente. Un método para determinar las propiedades analgésicas de los péptidos quiméricos es el ensayo de sacudida de la cola, que se aplica en ratas tras la administración intratecal, intracerebroventricular e intraperitoneal. Los efectos de los antagonistas opioides (p. ej., naltrexona) y de los antagonistas de NK_{1} (p. ej., RP67580) sobre la actividad de los péptidos se pueden determinar según métodos habituales en la técnica.

Para que se pueda entender mejor esta invención, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos, y no se deben considerar limitantes del alcance de esta invención de ninguna manera.

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Ejemplo 1 Unión in vitro de ESP7 a receptores opioides y de SP en preparaciones de cerebro de rata

Para determinar la afinidad de unión de ESP7 a receptores opioides y de SP, se llevaron a cabo ensayos de unión a receptores opioides y de SP con membranas plasmáticas de cerebro de rata en bruto preparadas mediante el uso de un procedimiento modificado de Zadina. Zadina et al., Life Sci, 55: 461-466 (1994). Estos ensayos demostraron que ESP7 tiene una afinidad intensa tanto por el receptor \mu como por el receptor NK_{1} en cerebro de rata.

Para los ensayos de unión a los receptores opioides, se homogeneizaron cerebros de rata congelados (-80ºC) en 40 volúmenes de tampón Tris estándar (Tris HCl 50 mM (pH 7,4), 0,2 mg/ml de BSA, EDTA 2,5 mM, 40 \mug/ml de bacitracina, 30 \mug/ml de bestatina y MgCl_{2} 5 mM), y se centrifugaron a 15.000 x g durante 20 minutos. Se añadió NaCl 100 mM al tampón para eliminar los ligandos endógenos, y se repitió la centrifugación. Tras un lavado con un tampón estándar, la preparación de membranas se resuspendió finalmente en 10 volúmenes de tampón de incubación (tampón estándar con 4 \mug/ml de leupeptina y 2 \mug/ml de quimostatina). Se siguió el mismo procedimiento para el receptor de SP, excepto que se eliminó el lavado con NaCl, y el MgCl_{2} 5 mM se sustituyó por MnCl_{2} 3 mM. Los homogeneizados de cerebro se usaron en el día de la preparación.

Los ensayos de unión para el receptor \mu se llevaron a cabo a 4ºC durante 90 minutos, como se describe en Zadina et al., Life Sci, 55: 461-466 (1994). Se usó un volumen final de 0,35 mL que contenía el tampón de incubación (descrito anteriormente), el homogeneizado de cerebro, y [^{3}H]DAMGO 1,85 nM con o sin péptido competitivo (DAMGO o ESP7). La unión inespecífica se determinó con DAMGO 10 \muM. Tras la incubación, las muestras se filtraron con un recolector Brandell mediante el uso de un filtro GF/B apropiado empapado con Tris HCl 50 mM (pH 7,4) y un 0,5% de PEI. Se añadió líquido de centelleo a los filtros para solubilizar las membranas, y se usó un contador beta para cuantificar la radiactividad.

Se siguió un procedimiento similar al ensayo de unión de opioides para el receptor de SP, excepto que los ensayos de SP se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 75 minutos con el uso de 23 fmol de [^{125}I]BH-SP. SP 10 \muM definió la unión inespecífica. Tras la filtración, se determinó la radiactividad con un contador gamma.

Como se observa en la Fig. 3, DAMGO tuvo una K_{d} de aproximadamente 3 nM (Fig. 8). ESP7 tuvo una K_{d} de aproximadamente 300 nM, lo que ilustra que ESP7 posee una afinidad significativa por el receptor \mu. Como se observa en la Fig. 4, SP tuvo una K_{d} de aproximadamente 0,03 nM, mientras ESP7 tuvo una K_{d} de aproximadamente 200 nM. Así, ESP7 tiene una afinidad significativa por el receptor NK_{1}, y, como se esperaba, ESP7 se unió específicamente y tuvo una afinidad de unión significativa tanto por el receptor \mu como por el receptor NK_{1}.

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Ejemplo 2 Caracterización de las propiedades analgésicas de ESP7

ESP7 se ensayó clínicamente en ratas para determinar el efecto analgésico y la tolerancia. Se usó el ensayo clásico de sacudida de la cola para medir la respuesta al dolor, y el dolor térmico se imitó mediante el uso de una fuente de calor. Este sistema se controló mediante el uso de opioides habituales. El fármaco se administró con ciclodextrano para incrementar la solubilidad del péptido en una disolución acuosa.

2.1 Administración intratecal de ESP7 en ratas y efecto del bloqueo con naltrexona y RP67580

La administración intratecal de ESP7 produjo analgesia a largo plazo sin desarrollo significativo de tolerancia. El antagonista opioide naltrexona bloqueó esta analgesia, lo que indica que la analgesia fue de naturaleza opioide. Además, cuando la porción de SP se antagonizó con RP67580, un antagonista de NK_{1}, se desarrolló tolerancia hacia el fármaco en tres días. Estos resultados indican que el resto de SP de ESP7 no contribuye a la analgesia, sino que desempeña un papel esencial en la prevención del desarrollo de tolerancia.

Se implantaron catéteres intratecales permanentes crónicos a ratas Sprague Dawley macho adultas (200-250 g) mediante el uso de un protocolo modificado de Yaksh y Rudy, Physiol. Behav., 17: 1031-1036 (1976). Los catéteres estaban fabricados con tubo silástico, tenían un diámetro interno de 0,3 mm y un diámetro externo de 0,6 mm, y medían un total de 11,5 cm, con 7,5 cm insertados en el espacio intratecal en el nivel T13-L1. Las ratas se anestesiaron a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico con un 5,0% de isoflurano. El catéter se insertó a través de la membrana atlanto-occipital y en el espacio intratecal mediante el uso de un alambre guía. Se usaron suturas para asegurar la colocación del catéter. Se dejó que las ratas se recuperasen de la cirugía durante 3-4 días, y las ratas con alteraciones neurológicas no se usaron para las medidas analgésicas. Las ratas se albergaron por separado con un ciclo luz-oscuridad de 12 h con acceso libre a alimento y agua. Durante la recuperación de la cirugía, las ratas se habituaron al medio de laboratorio y al aparato de ensayo de analgesia.

Para la medida de las propiedades anti-nociceptivas térmicas de los péptidos de interés, se empleó el ensayo de sacudida de la cola. Las ratas se habituaron primero a la cámara de sacudida de la cola. Durante el ensayo, las ratas se colocaron en la cámara y se dirigió hacia su cola una fuente de luz que generaba calor. Se registró la latencia hasta la retirada de la cola. La latencia inicial fue de aproximadamente 3,5 seg, y la latencia límite fue de 10 seg para evitar el daño tisular. Se hicieron tres medidas en cada punto de tiempo pre- y postratamiento, y se calculó la media de los resultados. Las respuestas se expresaron como el % de efecto máximo posible:

% EMP= \frac{\text{Latencia postratamiento - latencia inicial}}{\text{Tiempo límite - inicial}} x 100

Tras el ensayo, las ratas se sacrificaron y se verificó la colocación correcta del catéter mediante la disección de la médula espinal.

Se administraron a las ratas dosis de 1,0 \mug (Fig. 5), 0,2 \mug (Fig. 6), y 0,05 \mug (Fig. 7) de ESP7. Se inyectó la concentración deseada del compuesto (en 10 \mul) en el catéter, seguido de 10 \mul de solución salina para rellenar el volumen muerto. ESP7 se combinó con dos moléculas de ciclodextrina (ESP7+2CD) para incrementar la solubilidad. En última instancia, la ciclodextrina puede formar complejos reversibles con compuestos lipófilos tales como ESP7 para incrementar su solubilidad, disminuir su aclaramiento de la médula espinal y aumentar la duración de su
acción.

Como se muestra en la Fig. 5, la dosis de 1,0 \mug produjo un nivel bajo de analgesia prolongada durante cinco días. Curiosamente, no se desarrolló tolerancia hacia el efecto de ESP7+2CD (p>0,05). Como se muestra en la Fig. 6, la analgesia producida mediante 0,2 \mug permaneció al mismo nivel durante cinco días (p>0,05). Como se muestra en la Fig. 7, sin embargo, pareció desarrollarse cierta tolerancia a la dosis de 0,05 \mug en el día 5 (p=0,014). Como control, se administró 1,0 \mug de 2-ciclodextrina de forma intratecal sin ningún efecto significativo (p>0,05) (datos no
mostrados).

Para examinar si la analgesia producida fue de naturaleza opioide, el receptor opioide se antagonizó con naltrexona. En los días indicados más adelante se administró naltrexona 10 min antes de ESP7+2CD. Como se muestra en la Fig. 8, 0,2 \mug de ESP7+2CD produjeron analgesia en los días 1, 3 y 5, pero no en los días 2 y 4 en los que se administró naltrexona (p=0,0042). Se observaron resultados similares con 1,0 \mug de ESP7+2CD, en los que la naltrexona bloqueó de forma significativa otra vez la analgesia (p=0,0009) (datos no mostrados). La naltrexona produjo en realidad cierta hiperalgesia cuando se administró con ambas dosis de ESP7+2CD, lo que desenmascaró la actividad nociceptiva de SP. Además, el bloqueo con naltrexona fue reversible una vez que se eliminó el fármaco. Un experimento de control ilustró que la naltrexona por sí sola no produjo cambios en la analgesia (p>0,05) (datos no mostrados).

Para examinar si la tolerancia reducida exhibida en ratas tratadas con ESP7 estuvo mediada por SP, se antagonizó el receptor NK_{1} con RP67580, un antagonista específico de NK_{1} con una afinidad elevada por el receptor NK_{1} de rata. RP67580 (250 pmol) se administró IT antes de 1,0 \mug de ESP7+2CD. Como se observa en la Fig. 9, ESP7+2CD produjo una analgesia significativa en el día 1, pero se desarrolló tolerancia a esta analgesia en tres días (p<0,0001). Hubo presente una hiperalgesia ligera en el día 4. En el día 5, el antagonista de NK_{1} se eliminó y se dio una recuperación parcial de la analgesia. El nivel de analgesia en el día 5 alcanzó un nivel similar al del día 2 (p>0,05). RP67580 por sí solo no tuvo efecto sobre el nivel de analgesia (p>0,05). Por lo tanto, ESP7 administrado de forma intratecal fue capaz de inducir analgesia a la vez que se minimizaba el desarrollo de tolerancia.

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2.2 Administración intracerebroventricular de ESP7 en ratas

Se usaron ratas Sprague Dawley macho adultas de 200-250 g. Antes de la cirugía, las ratas se anestesiaron con 0,2-0,3 mL de xilacina (10%) y ketamina (90%). Las ratas se colocaron en un aparato estereotáxico y se localizó el bregma. Para alcanzar el ventrículo lateral, se taladró un orificio de 0,8 mm en dirección caudal y 1,4-1,5 mm a la izquierda o derecha del bregma. El catéter se insertó con una profundidad de 4,5 mm en el cerebro y se conectaron 4,0 cm de tubo de polietileno al extremo del catéter. Se usaron tornillos y cemento dental para asegurar el catéter en su lugar. Después de suturar la piel, se dejó que las ratas se recuperasen de la cirugía durante 4-5 días. Cada rata se albergó por separado con un ciclo luz-oscuridad de 12 h con acceso libre a alimento y agua. Las ratas con problemas neurológicos no se usaron en el ensayo de analgesia.

Se usó el ensayo de retirada de la cola para medir la analgesia como se describió anteriormente en el Ejemplo 2.1. Brevemente, las ratas se habituaron primero a la cámara de sacudida de la cola. Durante el ensayo, las ratas se colocaron en la cámara y se dirigió hacia su cola una fuente de luz que generaba calor. Se registró la latencia hasta la retirada de la cola. La latencia inicial fue de aproximadamente 3,5 seg, y la latencia límite fue de 10 seg para evitar el daño tisular. Se hicieron tres medidas en cada punto de tiempo pre- y postratamiento, y se calculó la media de los resultados. Las respuestas se expresaron como el % de efecto máximo posible (EMP):

% EMP = \frac{\text{Latencia postratamiento - latencia inicial}}{\text{Tiempo límite - inicial}} x 100

Tras el reposo, las ratas se sacrificaron y se verificó la colocación correcta del catéter.

Como se muestra en la Fig. 10, 0,1 \mug de ESP7+2CD produjeron un nivel bajo de analgesia que se disipó después de una hora. ESP7 (1,0 \mug) también produjo analgesia (datos no mostrados).

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2.3 Administración intraperitoneal de ESP7 en ratas

ESP7 se administró de forma intraperitoneal para determinar la efectividad de ESP7 de forma sistémica. Se usó el ensayo de sacudida de la cola para medir la analgesia como se describió anteriormente en el Ejemplo 2.1. Brevemente, las ratas se habituaron primero a la cámara de sacudida de la cola. Durante el ensayo, las ratas se colocaron en la cámara y se dirigió hacia su cola una fuente de luz que generaba calor. Se registró la latencia hasta la retirada de la cola. La latencia inicial fue de aproximadamente 3,5 seg, y la latencia límite fue de 10 seg para evitar el daño tisular. Se hicieron tres medidas en cada punto de tiempo pre- y postratamiento, y se calculó la media de los resultados. Las respuestas se expresaron como el % de efecto máximo posible (EMP):

% EMP = \frac{\text{Latencia postratamiento - latencia inicial}}{\text{Tiempo límite - inicial}} x 100

Como se observa en la Fig. 11, 1 mg de ESP7 produjo analgesia, tal como se observó con la administración intratecal. Además, 3 mg de ESP7+2CD también produjeron una analgesia similar a la observada con la administración intratecal (datos no mostrados). Una dosis de 1 mg de ESP7+2CD fue ineficaz, así que se eligió una dosis de 3 mg para tomar en cuenta la presencia de dos moléculas de ciclodextrina (datos no mostrados).

A partir de la descripción detallada anterior de las realizaciones específicas de la invención, debería ser evidente que se han descrito péptidos analgésicos quiméricos únicos. Aunque se han descrito con detalle realizaciones particulares en esta memoria, esto se ha hecho únicamente a modo de ejemplo con fines ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes con respecto al alcance de las reivindicaciones adjuntas siguientes. En particular, el inventor considera que se pueden hacer diversas sustituciones, alteraciones y modificaciones a la invención sin alejarse del alcance de la invención definido por las reivindicaciones. Por ejemplo, se considera que la elección de un resto opioide particular o del resto de SP particular es una cuestión rutinaria para una persona de experiencia habitual en la técnica con el conocimiento de las realizaciones descritas en esta memoria.

Claims (6)

1. Un péptido quimérico que consiste en la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 42 o ID SEC Nº: 43, en el que dicho péptido quimérico induce analgesia.

2. Una composición farmacéutica que comprende un péptido quimérico según la reivindicación 1 y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, que comprende además un adyuvante.

4. El uso de un péptido según la reivindicación 1, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 2 ó 3, para la fabricación de un medicamento para tratar el dolor en un mamífero.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que el péptido se administra con un agente solubilizante.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que el agente solubilizante es ciclodextrano.