ES2310018T3 - Tetraciclinas no antibacterianas para el tratamiento de la esclerosis multiple. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto de tetraciclina químicamente modificada sustancialmente sin actividad antimicrobiana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.
Description
Tetraciclinas no antibacterianas para el
tratamiento de la esclerosis múltiple.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere a la
fabricación de medicamentos para el tratamiento de trastornos y
enfermedades asociados a actividades elevadas del factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-\alpha), en particular de la
esclerosis múltiple.
Las dos isoformas de la ciclooxigenasa,
ciclooxigenasa 1 y 2 (COX-1 y
COX-2), también denominadas prostaglandina
endoperóxido sintasa 1 y 2, son enzimas claves en la conversión del
ácido araquidónico en prostaglandinas, tromboxanos y otros
eicosanoides. Se cree que la COX-1 y
COX-2 tienen funciones fisiológicas diferentes
debido a diferencias llamativas en su expresión y regulación
tisular. La COX-1 es una enzima constitutiva que
está presente en todo momento en el cuerpo y es responsable de la
producción de prostaglandinas citoprotectoras importantes para
funciones homeostáticas, tales como el mantenimiento de la
integridad de la mucosa gástrica, la mediación en la función
plaquetaria normal, y la regulación del flujo sanguíneo renal. Por
el contrario, la COX-2 es una forma de
ciclooxigenasa rápidamente inducible que da lugar a la producción de
prostaglandinas proinflamatorias. Aunque la expresión de la
COX-2 está muy restringida en condiciones basales,
está drásticamente sobrerregulada durante la inflamación.
Las prostaglandinas se producen a niveles
elevados en tejidos inflamados incluyendo la sinovia reumatoide.
Las prostaglandinas PGE_{1} y PGE_{2} contribuyen a la
inflamación sinovial incrementando el flujo sanguíneo local y
potenciando los efectos de mediadores, tales como la bradiquinina y
la IL-1\beta, que inducen la permeabilidad de los
vasos. También se ha demostrado que la PGE_{2} estimula la
resorción ósea osteoclástica, lo que sugiere que esta molécula
puede contribuir a la patofisiología de la erosión articular en la
artritis reumatoide. La implicación de la COX-2 y
la producción elevada de prostaglandinas están asociadas a una
variedad de enfermedades y trastornos, tales como isquemia
cerebral y cánceres, así como enfermedades y trastornos en los que están presentes niveles elevados de óxido nítrico.
cerebral y cánceres, así como enfermedades y trastornos en los que están presentes niveles elevados de óxido nítrico.
Hay estudios que indican que el óxido nítrico
(NO), un mediador multifuncional identificado recientemente
producido por y que actúa sobre diversas células, modula la
actividad de la COX-2 (Salvemini y col., 1993) y
participa en la destrucción tisular mediada por procesos
inflamatorios y autoinmunitarios. El efecto del NO sobre la
COX-2 depende de la dosis. Niveles bajos de NO
activan la COX-2. Por el contrario, grandes
cantidades de NO producidas por la óxido nítrico sintasa inducible
(iNOS) pueden inhibir la inducción de la COX-2 y
suprimen la formulación de los metabolitos de la
COX-2. Salvemini y sus colaboradores han demostrado
recientemente la inhibición de la respuesta inflamatoria mediante
la modulación de la producción de NO en diversos modelos de
inflamación animal. Se ha encontrado que la formación de óxido
nítrico se incrementa en enfermedades autoinmunitarias (artritis
reumatoide, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerativa,
enfermedad de Crohn), y diversos síntomas inflamatorios clásicos
(eritema, derrames vasculares) revierten mediante los inhibidores de
la NOS. No obstante, aunque los inhibidores de la NOS, tales como
el acetato de
N^{G}-monometil-L-arginina
(L-NMMA), inhiben la producción de NO, también
parecen tener la propiedad de aumentar la producción de PGE_{2}
debido a la atenuación de la infrarregulación de la producción de
PGE_{2} inducida por NO. Así, la mayoría de los inhibidores de la
NOS sobrerregulan la COX-2 y la producción de
PGE_{2} de manera dependiente del NO.
El factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-\alpha), una citoquina pleiotrópica, produce
un amplio espectro de efectos nocivos que también la convierten en
una diana importante para la intervención terapéutica. El
TNF-\alpha está involucrado en la patofisiología
de la artritis, SIDA, cáncer, enfermedades autoinmunitarias
(enfermedades inmunitarias complejas), fibrosis pulmonar, esclerosis
múltiple, reacciones DTL de la piel, e infecciones bacterianas y
parasitarias. El gen del TNF-\alpha humano
codifica una prohormona que se inserta en la membrana celular en
forma de polipéptido con un peso molecular de 26 kDa. Esta forma del
TNF-\alpha unido a membrana es bioactiva en
ensayos de citotoxicidad celular y se la ha implicado en las
actividades paracrinas del TNF-\alpha en tejidos.
En respuesta al lipopolisacárido (LPS) y a otros estímulos, la forma
de 26 kDa del proTNF-\alpha se escinde
proteolíticamente (mediante una metalaproteasa denominada
TNF-\alpha convertasa) en un polipéptido soluble
de 17 kDa. El TNF-\alpha se une a sus receptores
análogos (p55 y p75) como un trímero bioactivo, y es señalizado en
el interior de la célula.
La exposición sistémica al
TNF-\alpha recombinante soluble (en cantidades que
podrían ser producidas endógenamente por el hospedador durante la
infección) provoca un síndrome de shock agudo y lesiones tisulares
que es virtualmente indistinguible del síndrome de shock séptico. A
este efecto le sigue el síndrome de derrame capilar, hipoxia, edema
pulmonar, y fallo orgánico múltiple. Esas observaciones resaltan la
importancia del TNF-\alpha como una diana
terapéutica importante para diversas dolencias patofisiológicas.
Estudios en modelos animales de artritis y
artritis reumatoide humana indican que el
TNF-\alpha puede ser una citoquina fundamental
involucrada en estos procesos patológicos. La inyección de
anticuerpos anti-TNF-\alpha y/o
del receptor del TNF-\alpha soluble ha demostrado
ser muy eficaz en la reducción de los signos y síntomas clínicos en
estudios controlados. La extensión de estos estudios en ensayos
clínicos en fase II y III (en artritis reumatoide) ha proporcionado
resultados muy esperanzadores, indicando de nuevo que la
neutralización de los efectos del TNF-\alpha
puede tener efectos profundos sobre la progresión de la enfermedad
en diversas enfermedades inflamatorias, incluyendo la artritis.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Desde hace tiempo se ha identificado que las
metaloproteasas de matriz (MMPs) desempeñan un papel importante en
la degradación del cartílago tanto en artritis reumatoide (AR) como
en artrosis (OA). La sinovia y el cartílago son las fuentes de
enzimas degradativas más importantes que contribuyen a la
patofisiología de la OA y la AR. Estas enzimas incluyen
metaloproteasas, serinproteasas, proteoglicanasas y tiolproteasas.
Las dos familias principales de MMP que se cree que son
responsables de la degradación del cartílago son las colagenasas y
las proteoglicanasas.
Los primeros estudios de tres grupos
independientes han demostrado que los inhibidores de amplio espectro
de las metaloproteasas de matriz pueden inhibir específicamente la
liberación del proTNF-\alpha de la membrana (pero
no la IL-1\beta o IL-6) de
diversas superficies celulares, incluyendo cultivos celulares de
sinovia de artritis reumatoide. Este inhibidor del procesamiento
del proTNF-\alpha podría proteger a ratones contra
una dosis administrada letal de endotoxina. La actividad de la
"TNF-\alpha convertasa" se aisló usando estos
inhibidores como ligandos mediante purificación por afinidad que
dio como resultado la identificación de una proteína de 80 kDa con
la capacidad de escindir la secuencia
Gln-Ala-\downarrow-Val-Arg
(ID SEQ Nº:1) del proTNF-\alpha.
La doxiciclina y la minociclina son miembros de
la familia de antibióticos de amplio espectro tetraciclina. Durante
los últimos años se ha establecido que las tetraciclinas, que se
absorben rápidamente y tienen una semi-vida
prolongada, ejercen efectos biológicos independientes de su
actividad antimicrobiana (Golub y col., 1991; Golub y col., 1992;
Uitto y col., 1994). Tales efectos incluyen la inhibición de las
metaloproteasas de matriz, incluyendo la actividad de la colagenasa
(MMP-1), de la gelatinasa (MMP-2) y
de la estromelisina (MMP-3), y la prevención de la
destrucción tisular patogénica (Golub y col., 1991). En enfermedades
artríticas inflamatorias tales como la artritis reumatoide, estas
metaloproteasas de matriz se han identificado en homogeneizados y
cultivos de sinovia reumatoide, se han detectado en fluidos
sinoviales inflamatorios y se han localizado inmunológicamente y
mediante hibridación in situ en pannus y sinovia
proliferativos (Brinckerhoff, 1991). Se sabe que estas
metaloproteasas están reguladas con su aumento en articulaciones
afectadas por OA (Greenwald, 1994; Mohtai y col., 1993). De manera
interesante, Yu y col. (1992) también han demostrado que la
administración profiláctica de doxiciclina reduce notablemente la
gravedad de la OA en modelos en perro. Para valorar la seguridad y
eficacia de la minociclina (una tetraciclina semisintética) en el
tratamiento de la artritis, un ensayo multicéntrico doble ciego
aleatorio indicó que el fármaco era seguro y eficaz para pacientes
con artritis suave y moderada (Tilley y col., 1995). Además,
estudios recientes también han sugerido que las tetraciclinas y los
inhibidores de las metaloproteasas inhiben la progresión tumoral
(DeClerck y col., 1994), la resorción ósea (Rifkin y col., 1994) y
la angiogénesis (Maragoudakis y col., 1994), y pueden tener
propiedades anti-inflamatorias (Ramamurthy y col.,
1994).
El laboratorio de los presentes inventores
recientemente ha observado que la tetraciclina y las tetraciclinas
químicamente modificadas inhiben la producción de óxido nítrico en
macrófagos y en cartílago afectado por OA donde la expresión de la
NOS está inhibida en el momento de la modificación
post-transcripcional de la NOS (Amin y col., 1995b,
1997b). El laboratorio de los presentes inventores recientemente ha
observado que el cartílago humano afectado de artritis en
condiciones ex vivo (en ausencia o en presencia de citoquinas
+ endotoxinas) libera una cantidad sustancial de NO y PGE_{2}, y
la inhibición específica de la producción de NO aumenta la
producción de PGE_{2} de manera dependiente del NO (Amin y col.,
1997a).
También se ha encontrado que las tetraciclinas
son eficaces para el tratamiento de la actividad de la colagenasa en
la enfermedad periodontal y en la diabetes (patente de EE.UU. Nº
4.666.897 y Nº 4.704.383), para la inhibición de la actividad
excesiva de la fosfolipasa A_{2} (patente de EE.UU. Nº 5.523.297),
y para la inhibición de la actividad de la elastasa (patente de
EE.UU. Nº 5.773.430).
No se pretende que la cita de cualquier
documento en esta memoria se considere como una admisión de que ese
documento pertenece a la técnica anterior, o que se considera
material para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la
presente solicitud. Cualquier afirmación sobre el contenido o la
fecha de cualquier documento está basada en la información
disponible para el solicitante en el momento de presentación y no
constituye una admisión de la corrección de tal afirmación.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de que tetraciclinas químicamente modificadas (CMT)
con actividad antimicrobiana mínima son una nueva clase de fármacos
antiinflamatorios no esteroides (NSAID) que inhiben la actividad del
factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), en
particular de la esclerosis múltiple.
Por consiguiente, es un objeto de la invención
proporcionar un uso de un compuesto tetraciclina químicamente
modificada sustancialmente sin actividad antimicrobiana para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis
múltiple.
La Figura 1 muestra el efecto de la
CMT-3 y el NMMA sobre la producción de nitrato y
PGE_{2} en células RAW 264.7 estimuladas con LPS.
La Figura 2 muestra el efecto de la
CMT-3 y la tunicamicina sobre la producción de
nitrito y PGE_{2} en células RAW 264.7. M.Kloppenburg y col.,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Abril 1996,
934-940 y S.Milano y col., Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, Enero 1997, 117-121 describen
tetraciclinas antimicrobianas (minociclina, tetraciclina,
doxiciclina) que afectan a la producción y secreción de
citoquinas.
La Figura 3 muestra el efecto de la
CMT-3 sobre la producción de nitrito y PGE_{2} en
condrocitos bovinos estimulados con lipopolisacárido.
Las Figuras 4A y 4B muestran las transferencias
Western de extractos celulares de macrófagos murinos (Fig. 4A) y
condrocitos bovinos (Fig. 4B) para anticuerpos
anti-COX-2.
La Figura 5 muestra el efecto de la
CMT-8 sobre la producción espontánea de nitrito y
PGE_{2} por cartílago afectado de OA.
La Figura 6 muestra el efecto de tetraciclinas
sobre la liberación de TNF-\alpha al medio de
células HEK 293 humanas permanentemente transfectadas con
proTNF-\alpha humano.
La Figura 7 muestra el efecto de la
CMT-3 sobre la liberación de
TNF-\alpha al medio por células HEK 293
permanentemente transfectadas con proTNF-\alpha
humano.
La Figura 8 muestra la liberación de
TNF-\alpha de células HEK 293 permanentemente
transfectadas con proTNF-\alpha silvestre o
proTNF-\alpha mutante humano.
La Figura 9 muestra el efecto de la
CMT-8 sobre la producción de nitrito y PGE_{2} en
condrocitos bovinos estimulados con lipopolisacárido.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que tetraciclinas químicamente modificadas inhiben
el TNF-\alpha. Estas tetraciclinas químicamente
modificadas contienen cambios en la estructura básica del sistema
anular de la tetraciclina o la sustitución de sustituyentes en las
posiciones 1-4 ó 10-12 del sistema
anular. Estas tetraciclinas químicamente modificadas, que tienen una
actividad antimicrobiana mínima o carecen completamente de ella, se
usan en un procedimiento para inhibir el
TNF-\alpha.
El laboratorio de los presentes inventores
evaluó la acción de tetraciclinas químicamente modificadas sobre la
liberación espontánea de PGE_{2} de cartílago humano afectado de
OA en condiciones ex vivo y sobre la COX-2
en macrófagos murinos estimulados con LPS, y se encontró que la
tetraciclina químicamente modificada,
6-desmetil-6-desoxi-4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-3), que previamente se había demostrado que
inhibía la actividad de la NOS, también inhibe la actividad de la
COX-2 independientemente de las concentraciones
intracelulares de NO.
Además, la adición de una tetraciclina
químicamente modificada, la
6-\alpha-desoxi-5-hidroxi-4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-8), a cartílago humano afectado de OA que
libera espontáneamente NO y PGE_{2} inhibe tanto la producción de
NO como la de PGE_{2}. Sin estar limitado por la teoría, se cree
que esta inhibición de la COX-2 se puede deber a la
inhibición de la glicosilación de la COX-2, un
mecanismo que afecta a la expresión de la COX-2
pero que sería distinto del observado con la iNOS, en el que las
tetraciclinas químicamente modificadas bloquean la expresión del
ARNm de la iNOS (Amin y col., 1997b). No obstante, también es
posible que la inhibición de la COX-2 sea debida al
truncamiento de la COX-2 o a una combinación de las
dos posibilidades anteriores puesto que hay evidencias (Ejemplo 4)
de que, en presencia de tetraciclinas químicamente modificadas, hay
una reducción en el peso molecular de la COX-2.
Al igual que el inhibidor NMMA de la NOS, las
tetraciclinas comerciales con actividad antimicrobiana, tales como
las doxiciclinas y las minociclinas, también inhiben la producción
de NO. Se encontró que las tetraciclinas químicamente modificadas,
CMT-3 y CMT-8, sin actividad
antimicrobiana, comparten con las tetraciclinas la propiedad de
inhibir la producción de NO inhibiendo la expresión del ARNm de la
iNOS. No obstante, mientras que la doxiciclina y la minociclina,
como la mayoría de los otros inhibidores de la NOS, sobrerregulan la
expresión de la COX-2 y la producción de PGE_{2}
de una forma dependiente del NO, se descubrió inesperadamente que
CMT-3 y CMT-8 también inhiben la
expresión de COX-2 y la producción de PGE_{2}.
Esta propiedad divergente de las tetraciclinas químicamente
modificadas también se observó en otros tipos celulares, tales como
condrocitos bovinos y macrófagos murinos.
Los fármacos antiinflamatorios no esteroides
(NSAID) son una clase de fármacos estructuralmente diversa, que
incluyen la aspirina y el salicilato sódico, que comparten la
propiedad importante de inhibir la biosíntesis de prostaglandinas.
No obstante, estas acciones son insuficientes para explicar todos
los efectos de los NSAID. Algunos miembros de los NSAID parecen
tener propiedades anticarcinógenas como se recoge en estudios
epidemiológicos con seres humanos y en estudios de carcinogénesis
experimental con animales. Aunque se desconoce el mecanismo del
efecto anticarcinógeno de los NSAID, se ha sugerido que están
involucrados en la inhibición de la COX-2 y la
reducción posterior de los niveles de prostaglandinas en
tejidos.
Como inhibidores de la COX-2,
los presentes inventores consideran que las tetraciclinas
químicamente modificadas son una nueva clase de NSAID que parecen
bloquear la actividad de la NOS mediante mecanismo(s)
bastante diferen-
te(s) de los inhibidores conocidos de la COX-2, tales como los NSAID convencionales. Los efectos de los NSAID convencionales generalmente se producen a niveles de dosificación elevados y a veces están asociados a toxicidad gástrica y renal. Las CMT evitan estos efectos secundarios adversos.
te(s) de los inhibidores conocidos de la COX-2, tales como los NSAID convencionales. Los efectos de los NSAID convencionales generalmente se producen a niveles de dosificación elevados y a veces están asociados a toxicidad gástrica y renal. Las CMT evitan estos efectos secundarios adversos.
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Una característica importante de las
tetraciclinas químicamente modificadas que inhiben la NOS y la
COX-2 es su incapacidad de inhibir completamente la
producción de NO o PGE_{2}. En vez de eso, estas tetraciclinas
químicamente modificadas inhiben amortiguando la sobreproducción de
NO y PGE_{2}. Ésta es una propiedad valiosa debido a que tanto el
NO como la PGE_{2} son moléculas pleiotrópicas con respecto a las
funciones celulares, y la inhibición completa de la NOS y la
COX-2 puede ser perjudicial, por ejemplo, bajos
niveles de PGE_{2} y NO pueden ser importantes para la homeostasis
y las funciones celulares normales.
Aparte de la capacidad para inhibir la
COX-2, las tetraciclinas químicamente modificadas,
tales como la 4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-1), CMT-3 y
CMT-8, también tienen la propiedad importante de
inhibir el TNF-\alpha. Las células HEK 293
humanas permanentemente transfectadas con un ADNc de
proTNF-\alpha liberan espontáneamente
TNF-\alpha al medio de cultivo. Se encontró que
esta liberación del TNF-\alpha se bloquea con la
adición de bajos niveles de tetraciclinas químicamente modificadas,
similar a lo que se observó con la cicloheximida. Las tecnologías
actuales para el bloqueo de la actividad del TNF están dirigidas a
bloquear los receptores para el TNF o a neutralizar la actividad
del TNF con anticuerpos. Por el contrario, se cree que las
tetraciclinas químicamente modificadas bloquean la liberación de
TNF de la superficie celular o bloquean la biosíntesis de proTNF
dentro de la célula.
Como una nueva clase de NSAID, las tetraciclinas
químicamente modificadas preferentemente son aquellas que carecen
del grupo dimetilamino en posición 4 de la estructura anular. Las
tetraciclinas químicamente modificadas preferidas incluyen la
4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-1),
6-desmetil-6-desoxi-4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-3), y
6-\alpha-desoxi-5-hidroxi-4-desdimetilaminotetraciclina
(CMT-8). Las CMT se describen en las patentes de
EE.UU. Nº 4.704.383, Nº 4.935.411, Nº 4.935.412, Nº 5.459.153, Nº
5.523.297, Nº 5.773.430 y Nº 5.789.395.
Según la presente invención, se usa una cantidad
eficaz de una tetraciclina químicamente modificada en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
o un trastorno asociado a niveles elevados de
TNF-\alpha, que da lugar a, por ejemplo, aumento
en la producción de PGE_{2}. Una cantidad eficaz de una
tetraciclina químicamente modificada es una cantidad que es eficaz
para inhibir o amortiguar la expresión o la actividad del
TNF-\alpha y que es suficiente para reducir el
nivel de los productos del TNF-\alpha, por
ejemplo, la PGE_{2}, en el sistema biológico o sujeto tratado.
La patente de EE.UU. Nº 5.789.395 describe la
inhibición de la NOS usando tetraciclinas químicamente modificadas.
Aunque también se puede inhibir la actividad de la NOS, está
previsto que las formas de realización de la presente invención se
dirijan a la inhibición del TNF-\alpha en
enfermedades y trastornos asociados a niveles elevados del mismo,
en particular, la esclerosis múltiple. Preferentemente, el presente
procedimiento trata enfermedades y trastornos en los que el
TNF-\alpha es elevado pero no lo es el nivel de
NO.
Los ejemplos de otras enfermedades y trastornos
asociados a niveles elevados de TNF-\alpha
incluyen shock séptico, enfermedad periodontal, enfermedad de
injerto contra hospedador, malaria cerebral y caquexia asociada a
cáncer o infección por VIH.
Como se usa en el presente documento, el término
"prevención" de una dolencia, en un sujeto que lo necesite,
supone la administración de la tetraciclina químicamente modificada
como principio activo antes del comienzo clínico de la enfermedad o
trastorno. Los términos "tratamiento" o "tratar" suponen
la administración del principio activo, preferentemente en una
composición, después del comienzo clínico de la enfermedad. Por
ejemplo, la administración con éxito de tetraciclinas químicamente
modificadas, después del desarrollo de los síntomas, comprende el
"tratamiento" de la enfermedad o trastorno. Aunque la invención
es particularmente útil en el tratamiento de seres humanos, también
está prevista para usos veterinarios.
El principio activo usado en la presente
invención se puede administrar por cualquier medio que consiga
su
propósito previsto, por ejemplo, para tratar enfermedades o trastornos asociados a niveles elevados de PGE_{2} y
TNF-\alpha.
propósito previsto, por ejemplo, para tratar enfermedades o trastornos asociados a niveles elevados de PGE_{2} y
TNF-\alpha.
Por ejemplo, la administración puede ser a
través de diversas vías parenterales, tales como vía subcutánea,
intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal,
intranasal, transdérmica o bucal. Alternativa o simultáneamente, la
administración puede ser por vía oral. La administración parenteral
puede ser por inyección de bolo o por perfusión gradual a lo largo
del tiempo. La administración perioral puede ser por comprimidos,
cápsulas (incluyendo cápsulas de liberación controlada), o una
suspensión, jarabe u otra formulación líquida.
Un régimen típico para la prevención, supresión,
o tratamiento de una dolencia asociada a niveles elevados de
PGE_{2} y/o TNF-\alpha, comprende la
administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la
tetraciclina químicamente modificada administrada durante un período
de tiempo, de hasta e incluyendo entre una semana y 12 meses
aproximadamente.
Se entiende que la dosificación administrada
dependerá de la edad, sexo, estado de salud, y peso del receptor,
el tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, la frecuencia de
tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos de
dosis eficaces proporcionados a continuación no se pretende que sean
limitantes y representan intervalos de dosificación preferidos. No
obstante, la dosificación más preferida se ajustará al sujeto
individual, tal como lo entiende y lo puede determinar alguien con
conocimientos en la materia. Véase, por ejemplo, Avery's Drug
Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and
Therapeutics, 3ª Edición, ADIS Press, LTD., Williams y Wilkins
(Baltimore, MD, 1987); Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co.
(Boston, 1985), cuyas referencias se incorporan en su totalidad en
el presente documento por referencia.
La dosis total necesaria para cada tratamiento
se puede administrar mediante dosis múltiples o en una sola dosis.
La tetraciclina químicamente modificada se puede administrar sola o
junto con otros compuestos terapéuticos dirigidos a tratar la
dolencia, o dirigidos a otros síntomas de la dolencia.
Preferentemente, una CMT se administra en un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La frase
"farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades
moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y
normalmente no producen una reacción alérgica o una reacción
adversa similar, tal como trastornos gástricos, mareos y similares,
cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, como se usa
en el presente documento, el término "farmacéuticamente
aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del
gobierno federal o estatal o listada en la farmacopea de EE.UU. u
otra farmacopea reconocida de manera general para uso en animales,
y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo"
se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o portador con el
que se administra el compuesto. Esos vehículos farmacéuticos pueden
ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo
aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales
como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de
sésamo y similares. El agua o las disoluciones acuosas salinas y
las disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean
preferentemente como vehículos, particularmente para disoluciones
inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences de F. W. Martin.
Las cantidades terapéuticamente eficaces de las
tetraciclinas químicamente modificadas están entre 0,1
aproximadamente y 100 mg/kg de peso corporal/día aproximadamente y
cualquier intervalo dentro del anterior, preferentemente entre 1
aproximadamente y 18 mg/kg de peso corporal/día aproximadamente.
Las preparaciones para administración parenteral
incluyen disoluciones, suspensiones, y emulsiones acuosas y no
acuosas estériles, que pueden contener agentes o excipientes
auxiliares que son conocidos en la materia. Según los procedimientos
rutinarios también se pueden preparar composiciones farmacéuticas,
tales como comprimidos y cápsulas. Las composiciones que se pueden
administrar rectalmente incluyen supositorios.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
las tetraciclinas químicamente modificadas para su uso según los
procedimientos de la presente invención incluyen todas las
composiciones en las que una tetraciclina químicamente modificada
está contenida en una cantidad eficaz para conseguir su propósito
previsto. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener
vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden
excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de
los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar
farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas en general
contienen entre el 0,01 y el 99% aproximadamente, preferentemente
entre el 20 y el 75% aproximadamente del principio activo
(tetraciclinas químicamente modificadas) junto con el
excipiente.
Las formulaciones adecuadas para administración
parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos
en formas solubles en agua, por ejemplo, sales solubles en agua.
Además, se puede administrar una suspensión de los compuestos
activos en forma de suspensiones oleosas adecuadas para inyección.
Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen ácidos
grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos
sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las
suspensiones acuosas para inyección que pueden contener sustancias
que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen, por
ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, y/o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión también puede contener
estabilizantes.
Habiendo descrito ahora la invención en general,
la misma se entenderá más fácilmente en referencia a los siguientes
ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y no está
previsto que sean limitantes de la presente invención.
Macrófagos murinos (células RAW 264.7) crecidos
en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) conteniendo suero fetal
bovino al 10%, glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina y 50 \mug/ml
de estreptomicina, se estimularon con 100 ng/ml de LPS para inducir
tanto la NOS como la COX-2 en 16 horas. La adición
de N-monometilarginina (L-NMMA), un
inhibidor competitivo de la NOS, a las 0 horas bloquea la producción
de NO pero aumenta la producción de PGE_{2} como se observa a las
16 horas después de la estimulación tal y como se muestra la Figura
1. La adición de CMT-3 bloquea la producción de
ambos NO y PGE_{2}. La adición de ambas (CMT-3 +
L-NMMA) bloquea el aumento de PGE_{2} inducido por
L-NMMA, que indica que la CMT-3
bloquea la producción de PGE_{2} inducida por
L-NMMA (Figura 1). La CMT-3 y la
L-NMMA comparten la propiedad de inhibir la
producción de NO, pero son distintos en sus propiedades de
modulación de la producción de PGE_{2}. Los datos representados en
la Figura 1 representan la media \pm DE según se examina mediante
el test t donde n = 3.
Los efectos de las CMT 1, 2, 3, 5 y 8 sobre la
acumulación de PGE_{2} y NO en células RAW 264.7 se evaluó
adicionalmente como se ha descrito anteriormente para la
CMT-3. Los resultados se presentan en la Tabla
1.
\newpage
Los macrófagos murinos (células RAW 264.7) se
estimularon con LPS (100 ng/ml) en presencia de 40 \mug/ml de
minociclina, hidrocortisona 10 \muM y 10 \mug/ml de CMT por
triplicado durante 16 horas. Los datos se expresan en forma de
PGE_{2} o nitrito acumulado en determinantes triplicados (n = 3).
Los resultados estadísticos (entre células estimuladas con LPS y los
experimentos) se obtuvieron usando el test t de Student desapareado.
P = ^{a} \leq 0,4; ^{b} \leq 0,1; ^{c} \leq 0,01; ^{d}
\leq 0,01; ^{e} \leq 0,00001. NR = No realizado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer células RAW 263.7 como se ha
descrito previamente (Amin y col., 1995b). Macrófagos murinos
estimulados con 100 ng/ml de LPS se incubaron con
CMT-3 o tunicamicina (un inhibidor de la
glicosilación). Como se muestra en la Figura 2, la tunicamicina y la
CMT-3 inhiben tanto la expresión de la
NOS/COX-2 como la producción de NO/PGE_{2}. El
nitrito y la PGE_{2} se estimaron como se ha descrito previamente
(Amin y col., 1995b). Es bastante posible que la
CMT-3 pueda inhibir la producción de
COX-2 y PGE_{2} mediante modificación
post-traduccional de la COX-2 que
puede ser similar a la inhibición de la tunicamicina. Los datos
representan la media \pm DE evaluada mediante el test t (n =
3).
Los condrocitos bovinos se aislaron mediante el
procedimiento normal de Aydelotte y col. (1988) con pequeñas
modificaciones. Resumiendo, el cartílago bovino normal se lavó en
RPMI-1640 y se cortó en piezas pequeñas y se digirió
con enzimas. Las piezas de cartílago se incubaron con tripsina
(0,25%) en RPMI-1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)
durante 30 minutos a 37ºC antes de que se lavasen y se volviesen a
incubar en hialuronidasa (0,2%) y colagenasa (0,2%), y se disolvió
en RPMI-1640 conteniendo suero fetal bovino al 5%
(FBS) durante 16 horas a 37ºC con agitación continua (100 rpm). Las
células se pasaron a través de una red de nailon de 75 \mum y se
lavaron dos veces con PBS para retirar los restos celulares. Las
células liberadas se suspendieron en RPMI-1640 + FBS
al 10% + antibióticos y se pusieron en placa. Después de 48 horas el
medio se cambió y las células se incubaron con CMT-3
o N-monometil arginina (NMMA) durante 2 horas antes
de estimularlas con 100 \mug/ml de LPS. Se usó DMSO como vehículo
para los moduladores y la concentración de DMSO se mantuvo
(<0,01% en v/v) en los cultivos. También se añadieron cantidades
equivalentes de DMSO a los cultivos control. Los niveles de
liberación de PGE_{2} dependientes de la COX-2 se
sometieron a ensayo después de 72 horas por radioinmunoensayo. Como
se observa con las células de macrófago murino, el
L-NMMA aumenta la producción de PGE_{2} e inhibe
la producción de NO. La CMT-3 y la
CMT-8 inhiben ambas la producción de NO y PGE_{2}
(Figuras 3 y 9). Los resultados en las Figuras 3 y 9 también
demuestran que la CMT-3 y la CMT-8
inhiben la regulación del aumento de la PGE_{2} inducida por
L-NMMA en condrocitos bovinos, un efecto que también
se observó en macrófagos murinos. Los datos representan la media
\pm DE que se evaluó mediante el test t donde n = 3.
Se cultivaron células de macrófago murino como
se ha descrito previamente (Amin y col., 1995b). Se estimularon
células RAW 267.3 con 100 ng/ml de LPS en presencia de
CMT-3, CMT-5 y un inhibidor de la
glicosilación, la tunicamicina. Las células se crecieron durante 16
horas y se recogieron. Los extractos celulares libres se prepararon
como se ha descrito previamente (Amin y col., 1995b). En la Figura
4A, se cargaron 50 \mug de proteína en cada pocillo y se corrió
sobre geles SDS-PAGE y se transfirieron sobre geles
de transferencia Western usando un anticuerpo específico
anti-COX-2 como se ha descrito
previamente (Amin y col., 1997a). El control positivo es una
COX-2 patrón. En las células tratadas con
CMT-3, hay un descenso en el tamaño de la
COX-2. El tamaño es aproximadamente 2000 Da más
pequeño (forma de la CMT-3) que la
COX-2 nativa presentada como patrón. La
CMT-5 no tiene un efecto significativo mientras que
las células tratadas con tunicamicina eran mucho más pequeñas que la
forma nativa (forma de la tunicamicina). Estos experimentos indican
que la CMT-3 induce la modificación de la proteína
COX-2. El análisis de la SDS-PAGE y
la transferencia Western de la COX-2 se llevó a
cabo como se ha descrito anteriormente.
Los condrocitos bovinos se aislaron como en el
Ejemplo 3. Después de 48 horas, el medio se cambió y las células se
incubaron con CMT-3 durante 2 horas antes de
estimularlas con 100 \mug/ml de LPS. Se usó DMSO como vehículo
para los moduladores y la concentración de DMSO se mantuvo
(<0,01% en v/v) en los cultivos. También se añadieron cantidades
equivalentes de DMSO a los cultivos control. Se examinó la expresión
de COX-2 mediante análisis de transferencia Western
(Figura 4B) como se ha descrito anteriormente.
El cartílago humano afectado de artrosis libera
espontáneamente óxido nítrico (NO) y PGE_{2} al medio como se ha
informado previamente (Amin y col., 1995a; 1997a). Se acondicionaron
cultivos de órganos con artrosis como se ha descrito (Amin y col.,
1995a; 1997a). Resumiendo, se extrajo todo el cartílago articular de
la rodilla procedente de la meseta tibial y el cóndilo femoral de
pacientes afectados de artrosis. El cartílago se mezcló y se cortó
en discos de 3 mm y 4-6 discos se pusieron por
triplicado o cuadruplicado, en una placa de 24 pocillos en 2,0 ml de
medio F-12 de Ham suplementado con el 0,2% de
albúmina humana exenta de endotoxina, Hepes 10 mM, pH 7,4 y
antibióticos en presencia de diversos moduladores, como se ha
descrito previamente (Amin y col., 1995a; 1997a). Se usó
CMT-8 a concentraciones farmacológicamente
relevantes en DMSO (< 0,01% de la concentración final) como
vehículo. También se añadió una cantidad equivalente de DMSO a los
cultivos control.
El inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS),
L-NMMA, inhibe la producción de NOS y NO pero
aumenta la producción de PGE_{2} (Amin y col., 1997a). Por el
contrario, otro inhibidor de la NOS, la CMT-8, no
sólo inhibe la producción de NOS y NO, sino que también inhibe la
PGE_{2} de una forma dependiente de la dosis (Figura 5 y Tabla 2,
a continuación). El valor de p entre los valores control y los
valores tratados con la CMT-8 para la PGE_{2}
fueron \leq 0,1 (no significativo) mientras que los valores de p
entre el cartílago tratado con NMMA y el cartílago tratado con
CMT-8 fueron \leq 0,001 (significativo). Los datos
están representados como la media \pm DE según se examina mediante
el test t cuando n = 3. Los resultados para la CMT 1, 2, 3, 5 y 8 se
muestran en la Tabla 2 a continuación. Los datos representan la
media \pm el valor de la DE según se determina mediante el test t
de Student para n = 4. Los valores de p descritos se comparan con el
cartílago artrósico control sin estimular. Los datos representan uno
de los dos experimentos similares. Los valores de p para la
PGE_{2} y el nitrito = ^{a} \leq 0,5; ^{b} \leq 0,1;
^{c} \leq 0,05; ^{d} \leq 0,01.
Los datos en la Tabla 2 anterior demuestran la
capacidad de la CMT-3 y la CMT-8
para inhibir significativamente la generación espontánea de NO y
PGE_{2} por el cartílago humano afectado de artrosis. Los datos
demuestran la superioridad de las CMT sobre la minociclina, que
suprime la producción de NO, pero estimula la producción de
PGE_{2}.
Se hicieron crecer células HEK 293 humanas (ATCC
1573-CRL) en medio esencial mínimo
(Gibco-BRL), FCS al 10%, glutamina 2 mM, penicilina
(50 \muM/ml) y estreptomicina (50 \mug/ml) como se describe por
la American Type Culture Collection (ATCC). Las células HEK 293 se
transfectaron con el ADNc del proTNF-\alpha
(silvestre) para preparar una línea celular estable. Las células HEK
se transfectaron usando el método del fosfato de calcio según
describe el proveedor (Gibco BRL, Cat. Nº
18306-019). La secuencia de escisión de la
TNF-\alpha convertasa,
Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser
(ID SEQ Nº: 2), se eliminó del proTNF-\alpha
parental para generar un proTNF-\alpha mutante.
Una forma mutante del ADNc del proTNF-\alpha que
no se podía escindir mediante la TNF-\alpha
convertasa endógena (TACE) para liberar el
TNF-\alpha soluble también se transfectó en
células HEK 293 humanas distintas. El TNF-\alpha
soluble se estimó mediante ELISA de las células transfectadas de
tipo silvestre y mutante procedentes del medio (Figura 8). Las
células control sin transfectar no liberaron cantidades detectables
de TNF-\alpha soluble al medio. El
proTNF-\alpha unido a membrana del tipo silvestre
transfectado en células HEK 293 escindió el
proTNF-\alpha al TNF-\alpha
soluble y lo liberó al medio. No obstante, el
proTNF-\alpha mutante, que estaba expresado en
células HEK 293 no pudo ser reconocido por la
TNF-\alpha convertasa endógena y por tanto no se
pudo observar una cantidad detectable de
TNF-\alpha en el medio. Estas líneas celulares son
herramientas excelentes para seleccionar compuestos que inhiben la
actividad TACE endógena estimando el TNF-\alpha
soluble en el medio.
Se hicieron crecer células HEK 293 como se ha
descrito previamente por la American Type Culture Collection (ATCC).
Estas células se transfectaron permanentemente con el ADNc del
proTNF-\alpha y estas células permanentemente
transfectadas liberaron espontáneamente TNF-\alpha
al medio que se estimó por ELISA. Las células HEK 293 se incubaron
con CMT-3 para examinar los efectos de la
CMT-3 sobre la liberación de
TNF-\alpha al medio. La Figura 7 muestra que la
CMT-3 inhibe la liberación de
TNF-\alpha al medio de manera dependiente de la
dosis. La cicloheximida, como se esperaba, también inhibió la
liberación de TNF-\alpha al medio.
Se hicieron crecer células HEK 293 en las
condiciones descritas previamente por la ATCC. Diversos compuestos,
incluyendo la CMT-3 y doxiciclina/minociclinas se
incubaron con células HEK 293 transfectadas con
proTNF-\alpha que liberan
TNF-\alpha al medio en 16 horas. La liberación
espontánea de TNF-\alpha por las células HEK 293
proTNF-\alpha^{+} permanentemente transfectadas
se muestra la Figura 6-8 como control en este
experimento. El TNF-\alpha soluble se estimó por
ELISA del medio. Como se esperaba, se demostró que la cicloheximida
inhibe la liberación de TNF-\alpha (Figura 6). En
la Figura 6, la CMT-3, CMT-8 y
CMT-1, pero no la CMT-2 y
CMT-5, inhiben la liberación espontánea de
TNF-\alpha. De manera similar, la doxiciclina y la
minociclina también inhiben la liberación de
TNF-\alpha. Este experimento demuestra que un
número seleccionado de CMT tienen la propiedad de inhibir la
liberación de TNF-\alpha o la actividad de la
enzima TNF-\alpha convertasa (TACE).
Se estimularon células RAW 264.7 con LPS y se
prepararon extractos exentos de restos celulares de la manera
siguiente. Las células RAW 264.7 se indujeron con LPS (100 ng/ml) en
presencia o ausencia de tetraciclinas o hidrocortisona durante
14-20 horas. Después de la inducción, las células se
dejaron en reposo a 4ºC y se resuspendieron en tampón Tris: 10 mM,
pH 7,4 que contiene 10 \mug/ml cada uno de quimostatina,
antipaina, leupeptina y pepstatina, DDT 1 mM y PMSF 1 mM. Las
células se lisaron en un homogeneizador Polytron PA 1200 (Kinematica
AG, Suiza) con el cóctel de inhibidores de la proteasa después de
tres ciclos de congelación-descongelación rápida. El
lisado se centrifugó a 18.000 rpm a 4ºC en una centrífuga Eppendorf,
y el sobrenadante resultante se usó como extracto exento de restos
celulares. La proteína se midió mediante el reactivo del ensayo BCA
(Pierce, Rockford, IL) usando BSA como patrón. El ensayo enzimático
exento de restos celulares se llevó a cabo como se ha descrito
previamente por Vane y col. (1994) usando extractos celulares
totales sin fraccionar, y la cantidad de PGE_{2} se estimó
mediante RIA. La actividad enzimática específica se definió como ng
de PGE_{2} liberados/mg de proteína/37ºC durante 20 minutos.
La adición de 10 \mug/ml de
CMT-3 (27 \muM) y CMT-8 (27
\muM), al igual que aspirina (56 \muM) e indometacina (28
\muM), a los extractos exentos de restos celulares inhibió
significativamente la actividad específica de la
COX-2, mientras que el análogo inactivo de las CMT
(CMT-5) no tuvo un efecto significativo (Tabla 3).
Estos experimentos sugieren que la CMT-3 y la
CMT-8 interfieren con la actividad enzimática de la
COX-2 en extractos exentos de restos celulares, y su
capacidad para inhibir la producción in vitro de PGE_{2}
mediada por COX-2 fue similar a la de aspirina e
indometacina. Estos experimentos también muestran un nuevo mecanismo
de acción de las CMT sobre la COX-2 y las separan de
las tetraciclinas genéricas. La posibilidad de unión de estas CMT a
la COX-2 (como la aspirina) no se puede descartar.
Aunque hay un incremento significativo en la acumulación de la
proteína COX-2 sobre el total, estos experimentos
también pueden explicar el descenso neto en la acumulación de
PGE_{2} en células tratadas con CMT.
Se estimularon células RAW 264.7 con 1 \mug/ml
de LPS durante 16 horas y los extractos exentos de restos celulares
se prepararon como se ha descrito anteriormente. Los extractos se
incubaron con diferentes moduladores durante 20 minutos a 37ºC antes
de añadir el sustrato para iniciar la reacción enzimática, que se
detuvo después de 30 minutos por inactivación térmica. Los datos
representan uno de los dos experimentos, el análisis de la PGE_{2}
de cada muestra se realizó por triplicado, n = 3. El valor de p es
una comparación entre el control y los experimentos.
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solicitante solamente es para comodidad del lector. No forma parte
del documento de patente europea. A pesar de que se ha tenido mucho
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descartar errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad
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Rheum., 1992, vol. 35, 1150-1159
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<110> AMIN, Ashok
\hskip1cmABRAMSON, Steven
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<120> PROCEDIMIENTO PARA INHIBOR LA
CICLOOXIGENASA-2 Y EL FACTOR ALFA DE NECROSIS
TUMORAL
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<130> amin2.seq
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<140> aún no recibido
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<141>
18-12-1998
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<151>
19-12-1997
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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TUMORAL
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Claims (5)
1. Uso de un compuesto de tetraciclina
químicamente modificada sustancialmente sin actividad antimicrobiana
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la
esclerosis múltiple.
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el compuesto de tetraciclina químicamente modificada sustancialmente
sin actividad antimicrobiana se selecciona del grupo constituido por
CMT-1, CMT-3, y
CMT-8.
3. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el compuesto de tetraciclina químicamente modificada sustancialmente
sin actividad antimicrobiana se selecciona del grupo constituido por
CMT-3 y CMT-8.
4. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el compuesto de tetraciclina químicamente modificada sustancialmente
sin actividad antimicrobiana es CMT-3.
5. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el compuesto de tetraciclina químicamente modificada sustancialmente
sin actividad antimicrobiana es CMT-8.
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