ES2309064T3 - Composiciones inmunoestimulantes que comprenden un fosfato de aminoalquil glucosaminida y qs-21. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunoestimulante en una formulación acuosa que comprende QS-21 y RC-529 de fórmula I: (Ver fórmula) y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Composiciones inmunoestimulantes que comprenden un fosfato de aminoalquil glucosaminida y QS-21.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a formulaciones de vacunas, a métodos para su producción y a su uso en la vacunación profiláctica y/o terapéutica. Más en particular, la presente invención se refiere a un sistema adyuvante que comprende QS-21 en combinación con un fosfato de aminoalquil glucosaminida, que comprende la sal de trietilamonio de 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-\beta-D-glucopiranósido.

Antecedentes de la invención

La inmunidad humoral y la inmunidad mediada por células son las dos ramas principales de la respuesta inmunitaria en mamíferos. La inmunidad humoral implica la generación de anticuerpos hacia antígenos extraños. Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B. La inmunidad mediada por células implica la activación de los linfocitos T, que actúan sobre células infectadas que albergan antígenos extraños o que estimulan a otras células para que actúen sobre las células infectadas. Ambas ramas del sistema inmunitario mamífero son importantes en la lucha contra la enfermedad. La inmunidad humoral es la línea de defensa principal contra patógenos bacterianos. En caso de enfermedad viral, la inducción de los linfocitos T citotóxicos (LTCs) parece ser crucial para la inmunidad protectora. Así, una vacuna eficaz estimula preferiblemente ambas ramas del sistema inmunitario para proteger contra la enfermedad.

Las vacunas presentan antígenos extraños de agentes que provocan enfermedades a un hospedador, de forma que el hospedador puede generar una respuesta inmunitaria protectora. Con frecuencia, los antígenos de vacunas son formas inactivadas o atenuadas de los microbios que provocan la enfermedad. La presencia de componentes y antígenos no esenciales en estas vacunas inactivadas o atenuadas ha fomentado intentos considerables de perfeccionar los componentes de las vacunas, lo que incluye el desarrollo de antígenos sintéticos bien definidos mediante el uso de técnicas químicas y recombinantes. El perfeccionamiento y la simplificación de las vacunas microbianas, sin embargo, han conducido a una pérdida concomitante de potencia. Los antígenos sintéticos de bajo peso molecular, aunque están desprovistos de contaminantes potencialmente dañinos, con frecuencia no son lo suficientemente inmunógenos por sí mismos. Estas observaciones han llevado a los investigadores a añadir estimuladores del sistema inmunitario, conocidos como adyuvantes, a las composiciones de vacunas para potenciar la actividad de los componentes de las vacunas.

Los adyuvantes inmunitarios son compuestos que, cuando se administran a un individuo o se ensayan in vitro, incrementan la respuesta inmunitaria hacia un antígeno en el sujeto al que se administra el antígeno, o incrementan ciertas actividades de las células del sistema inmunitario. Se han preparado y ensayado varios compuestos que exhiben grados variables de actividad adyuvante (véase, por ejemplo, Shimizu et al. 1985, Bulusu et al. 1992, Ikeda et al. 1993, Shimizu et al. 1994, Shimizu et al. 1995, Miyajima et al. 1996). Sin embargo, estos y otros sistemas adyuvantes anteriores exhiben con frecuencia propiedades tóxicas, son inestables y/o tienen efectos inmunoestimuladores inaceptablemente bajos.

En la actualidad, el único adyuvante autorizado para uso humano en los Estados Unidos es el alumbre, un grupo de sales de aluminio (p.ej., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) en el cual se formulan los antígenos de las vacunas. Los vehículos particulados como el alumbre supuestamente estimulan la captación, el procesamiento y la presentación de los antígenos solubles por los macrófagos. El alumbre, sin embargo, no carece de efectos secundarios, y desafortunadamente se limita solamente a la inmunidad humoral (anticuerpos).

Los documentos WO 96/33739 y WO 95/17210 describen la saponina QA-21 en combinación con un esterol tal como monofosforil lípido A (MPL) desacilado en posición 3 y un antígeno para el uso como una composición de vacuna.

El descubrimiento y el desarrollo de sistemas adyuvantes eficaces es esencial para mejorar la eficacia y la seguridad de las vacunas existentes y futuras. Así, existe una necesidad constante de sistemas adyuvantes nuevos y mejorados, en particular aquellos que controlan ambas partes efectoras del sistema inmunitario, para facilitar el desarrollo de una próxima generación de vacunas sintéticas. La presente invención satisface ésta y otras necesidades.

Resumen de la invención

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunoestimulante que comprende QS-21 y RC-529 de fórmula I mostrada más adelante, en una formulación acuosa.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones de vacuna que comprenden las composiciones inmunoestimulantes anteriores en combinación con al menos un antígeno. Los antígenos pueden proceder de cualquiera de una diversidad de fuentes, y más generalmente procederán de una bacteria o virus, o pueden proceder de antígenos asociados al cáncer, trastornos autoinmunitarios u otras diversas enfermedades mamíferas.

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En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero que padece o es susceptible a una infección patogénica, cáncer o un trastorno autoinmunitario.

En otro aspecto de la presente invención, el medicamento anterior es para incrementar la respuesta inmunitaria en un mamífero, y el medicamento incluye opcionalmente uno o más antígenos.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones inmunoestimulantes que comprenden QS-21 y RC-529 en una formulación acuosa que comprende uno o más tensoactivos fosfolipídicos.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida (AGP) comprenden en general una 2-desoxi-2-amino-\alpha-D-glucopiranosa (glucosaminida) con un enlace glicosídico con un grupo aminoalquilo (aglicón). Los compuestos de AGP, y los métodos para su síntesis y uso, se describen en general en la patente de EE.UU. 6.113.918 (que fue expedida de la solicitud de patente de EE.UU. de nº de serie 08/853.826), el documento WO 98/50399, las solicitudes de patentes de EE.UU. de nºs de serie 09/074.720 y 09/439.839, y Johnson et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2273-2278.

El compuesto de AGP de la presente invención, denominado RC-529, se describe estructuralmente mediante la fórmula I siguiente:

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y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Un compuesto RC-529 particularmente preferido es una sal de trietilamonio de 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-\beta-D-glucopiranósido.

La saponina QS-21 empleada en las composiciones de vacunas de la presente invención se puede purificar a partir de corteza de Quillaja saponaria Molina, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.057.540, cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad. Brevemente, los extractos acuosos de corteza de Quillaja saponaria Molina se dializan con agua y el extracto dializado se liofiliza hasta sequedad, se extrae con metanol, y el extracto soluble en metanol se fracciona posteriormente mediante cromatografía con gel de sílice y mediante cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RP-HPLC). Las saponinas individuales se pueden separar después mediante HPLC en fase inversa. Al menos 22 picos (denominados QA-1 a QA-22, también denominados en esta memoria QS-1 a QS-21) son separables mediante el uso de esta aproximación, y cada pico corresponde a un pico de carbohidrato y exhibe una única banda en una cromatografía en capa fina en fase inversa. Los componentes individuales se pueden identificar específicamente mediante sus tiempos de retención en una columna de HPLC C4, por ejemplo.

La saponina QS-21 sustancialmente pura se caracteriza porque tiene actividad de adyuvante inmunitario, contiene alrededor de un 22% de carbohidrato (analizado mediante antrona) en peso seco, tiene un máximo de absorción UV a 205-210 nm, un tiempo de retención de aproximadamente 51 minutos en RP-HPLC en una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, poro de 330 angstroms, 4,6 mm de D.I. X 25 cm de L en un disolvente de ácido acético 40 mM en metanol/agua (58/42; v/v) a un caudal de 1 ml/min, mediante elución con un 69 a un 70% de metanol de una columna Vydac C_{4} que tiene un tamaño de partícula de 5 \mum, poro de 330 angstroms, 10 mm de D.I. X 25 cm de L en un disolvente de ácido acético 40 mM con una elución en gradiente del 50 al 80% de metanol, con una concentración micelar critica de alrededor del 0,03% (p/v) en agua y del 0,02% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato, que provoca la hemolisis de eritrocitos de cabra a concentraciones de 25 \mug/ml o más, y contiene los monosacáridos ramnosa terminal, arabinosa terminal, apiosa terminal, xilosa terminal, 4-ramnosa, glucosa terminal, galactosa terminal, 2-fucosa, 3-xilosa, 3,4-ramnosa, y ácido 2,3-glucurónico.

En una realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas, p.ej., composiciones de vacunas, que comprenden una combinación sinérgica de RC-529 y QS-21. Se puede decir que esta combinación adyuvante actúa de forma sinérgica porque tiene un efecto que es mayor que la suma de los efectos por separado de cada adyuvante. Por ejemplo, este sistema adyuvante puede incrementar de manera sinérgica las respuestas inmunitarias hacia un antígeno coadministrado. La sinergia entre estos dos tipos de adyuvantes para la inducción de LTC tiene implicaciones importantes para el uso de moléculas recombinantes como vacunas para la inducción de la inmunidad mediada por LTC.

La inducción de LTC se observa generalmente cuando un antígeno seleccionado como objetivo se sintetiza de forma intracelular (p.ej., en infecciones por virus, bacterias intracelulares, o en tumores), porque los péptidos generados por la ruptura proteolítica del antígeno pueden incorporarse a la ruta de procesamiento apropiada, lo que conduce a la presentación en asociación con moléculas de clase I en la membrana celular. Sin embargo, en general, el antígeno soluble preformado no alcanza esta ruta de procesamiento y presentación, y no provoca LTC limitados a la clase I. Por lo tanto, las vacunas inactivadas convencionales, aunque provocan respuestas de anticuerpos y de células T auxiliares, no son eficaces en general en la inducción de inmunidad mediada por LTC. Las combinaciones de adyuvantes de esta memoria superan esta limitación de las vacunas basadas en proteínas recombinantes, e inducen un espectro más amplio de respuestas inmunitarias.

Los sistemas adyuvantes descritos que comprenden RC-529 y QS-21 pueden incrementar también la producción de interferón (IFN) gamma. La secreción de IFN-gamma está asociada a respuestas protectoras contra patógenos intracelulares, que incluyen parásitos, bacterias y virus. La activación de los macrófagos mediante IFN-gamma incrementa la destrucción intracelular de microbios, e incrementa la expresión de receptores de Fc. También se puede dar la citotoxicidad directa, especialmente de forma sinérgica con linfotoxina (otro producto de las células TH1). IFN-gamma también es tanto un inductor como un producto de las células NK, que son los efectores innatos principales de la protección. Las respuestas de tipo TH1, ya sean por medio de IFN-\gamma o de otros mecanismos, proporcionan una cooperación preferente para los isotipos de inmunoglobulinas IgG2a.

Así, los sistemas adyuvantes de la invención son especialmente ventajosos para fabricar y usar composiciones de vacunas para inducir una inmunidad activa hacia antígenos en mamíferos, preferiblemente en humanos. La preparación de vacunas es una técnica muy desarrollada, y se dispone fácilmente de una orientación general para la preparación y la formulación de vacunas de cualquiera de una diversidad de fuentes. Un ejemplo es New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., EE.UU., 1978.

La cantidad óptima de una composición de vacuna dada a ser administrada variará, no obstante tal información se determina fácilmente mediante el uso de procedimientos habituales. Por ejemplo, la actividad inmunógena de una cantidad dada de una composición de vacuna de la presente invención se puede determinar monitorizando el incremento del título de anticuerpos contra el antígeno usado en la composición de vacuna (Dalsgaard, K. Acta Veterinia Scandinavica 69:1-40 (1978)). Otro método habitual implica inyectar de forma intradérmica a ratones CD-1 diversas cantidades de una composición de vacuna, recoger más tarde los sueros de los ratones y analizar el anticuerpo anti-inmunógeno, p.ej., mediante ELISA. Estas y otras aproximaciones similares serán aparentes para el técnico experto.

El sistema adyuvante de la presente invención exhibe efectos adyuvantes intensos cuando se administra en un intervalo amplio de dosis y en un intervalo amplio de proporciones. La proporción de QS-21:RC-529 estará generalmente en el orden de 1:10 a 10:1; más generalmente alrededor de 1:5 a 5:1, y con frecuencia sustancialmente 1:1. Generalmente para administración humana, QS-21 y RC-529 estarán presentes en una composición de vacuna en el intervalo de 1 \mug-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis.

La cantidad de proteína antigénica en cada dosis de vacuna se selecciona en general como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee y cómo esté presentado. En general, se espera que cada dosis comprenda alrededor de 1-1000 \mug de proteína, lo más generalmente alrededor de 2-100 \mug, preferiblemente alrededor de 5-50 \mug. Por supuesto, la dosis administrada puede depender de la edad, peso, tipo de tratamiento concurrente, si existe, y de la naturaleza del antígeno administrado.

El antígeno puede proceder y/o aislarse básicamente de cualquier fuente deseada. A modo de ilustración, los antígenos pueden proceder de fuentes virales, tales como virus de la gripe, virus de la leucemia felina, virus de la inmunodeficiencia felina, VIH-1, VIH-2, virus de la rabia, sarampión, hepatitis B, o fiebre aftosa. Los antígenos ilustrativos pueden proceder también de fuentes bacterianas, tales como carbunco, difteria, enfermedad de Lyme, malaria, tuberculosis, leishmaniasis, T. cruzi, Ehrlichia, Candida, etc., o de protozoos tales como Babeosis bovis o Plasmodium. El/los antígeno(s) consistirá(n) generalmente en aminoácidos naturales o sintéticos, p.ej., en forma de péptidos, polipéptidos o proteínas, puede(n) consistir en polisacáridos, o puede(n) ser mezclas de los mismos. Los antígenos ilustrativos se pueden aislar a partir de fuentes naturales, sintetizarse por medio de síntesis en fase sólida, o se pueden obtener por medio de técnicas de ADN recombinante.

En otra realización, el sistema adyuvante de la presente invención se usa en composiciones de vacunas profilácticas y/o terapéuticas para el cáncer. Las células cancerosas tienen con frecuencia antígenos característicos en sus superficies, tales como factor de crecimiento epidérmico truncado, proteína de unión de folato, mucinas epiteliales, melanoferrina, antígeno carcinoembrionario, antígeno de membrana específico de próstata, HER2-neu, que son candidatos para el uso en vacunas terapéuticas para el cáncer. Debido a que los antígenos tumorales son normales o están relacionados con componentes normales del organismo, con frecuencia el sistema inmunitario no es capaz de generar una respuesta inmunitaria eficaz contra esos antígenos para destruir las células tumorales. Para conseguir tal respuesta, se pueden utilizar los sistemas adyuvantes descritos en esta memoria. Como resultado, las proteínas exógenas pueden incorporarse a la ruta de procesamiento de antígenos endógenos, lo que lleva a la producción de células T citolíticas o citotóxicas (LTC). Este efecto adyuvante facilita la producción de LTCs específicos del antígeno que buscan y destruyen las células tumorales que portan en su superficie el/los antígeno(s) tumoral(es) usado(s) para la inmunización. Los tipos de cáncer ilustrativos para los que se puede usar esta aproximación incluyen el cáncer de próstata, colon, mama, ovárico, pancreático, de cerebro, cabeza y cuello, melanoma, leucemia, linfoma, etc.

En otra realización de la invención, el sistema adyuvante de la presente invención se puede administrar solo, es decir, sin antígeno coadministrado, para potenciar el sistema inmunitario para el tratamiento de enfermedades infecciosas crónicas, en especial en pacientes inmunodeprimidos. Los ejemplos ilustrativos de enfermedades infecciosas para las cuales se puede emplear esta aproximación para el tratamiento terapéutico o profiláctico se pueden hallar en la pat. de EE.UU. nº 5.508.310. La potenciación del sistema inmunitario de esta manera puede ser útil también como medida preventiva para limitar el riesgo de infecciones nosocomiales y/o postoperatorias.

En otra realización, el antígeno presente en las composiciones de vacunas no es un antígeno extraño, sino que es un autoantígeno, p.ej., la composición de vacuna se dirige hacia una enfermedad autoinmunitaria tal como la diabetes tipo 1, enfermedades autoinmunitarias convencionales específicas de órgano, enfermedades neurológicas, enfermedades reumáticas, psoriasis, enfermedades del tejido conectivo, citopenias autoinmunitarias, y otras enfermedades autoinmunitarias. Tal autoinmunidad convencional específica de órgano puede incluir tiroiditis (de Graves + Hashimoto), gastritis, adrenalitis (de Addison), ovaritis, cirrosis biliar primaria, miastenia gravis, insuficiencia gonadal, hipoparatiroidismo, alopecia, síndrome de malabsorción, anemia perniciosa, hepatitis, enfermedades por anticuerpos anti-receptor y vitíligo. Tales enfermedades neurológicas pueden incluir esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, depresión, hipofunción hipofisaria, diabetes insípida, síndrome seco y esclerosis múltiple. Tales enfermedades reumáticas/enfermedades del tejido conectivo pueden incluir artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES) o Lupus, esclerodermia, polimiositis, enfermedad inflamatoria intestinal, dermatomiositis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, vasculitis, artritis psoriásica, dermatitis psoriásica exfoliativa, pénfigo vulgar, síndrome de Sjögren. Otras enfermedades relacionadas con la autoinmunidad pueden incluir uveoretinitis autoinmunitaria, glomerulonefritis, síndrome de cardiotomía tras infarto de miocardio, hemosiderosis pulmonar, amiloidosis, sarcoidosis, estomatitis aftosa, y otras enfermedades relacionadas con la inmunidad, como se presentan en esta memoria y se conoce en las técnicas relacionadas.

En una realización, el sistema adyuvante descrito en esta memoria se usa en la preparación de composiciones de vacunas basadas en ADN. Las vacunas ilustrativas de este tipo contienen ADN que codifica uno o más antígenos polipeptídicos, de forma que el antígeno se genera in situ. El ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de administración conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica, que incluyen los sistemas de expresión de ácidos nucleicos, los sistemas de expresión bacterianos y virales. Se conocen en la técnica muchos métodos de administración de genes, tales como los descritos por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, y las referencias citadas en ese documento. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tales como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus Calmette-Guerin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido en su superficie celular o que secreta tal epítopo. En una realización preferida, el ADN se introduce mediante un sistema de expresión viral (p.ej., vaccinia u otros poxvirus, retrovirus o adenovirus), que implica generalmente el uso de un virus apatógeno (incompleto), de replicación competente. Los sistemas ilustrativos se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; pat. de EE.UU. nºs 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973; pat. de EE.UU. nº 4.777.127; documento GB 2.200.651; documento EP 0.345.242; documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidas para las personas de experiencia habitual en la técnica. De forma alternativa, el ADN puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993, y se resume en Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. La captación de ADN desnudo se puede incrementar revistiendo el ADN en microesferas biodegradables que son transportadas de manera eficaz al interior de las células. Será evidente que una vacuna puede comprender un componente tanto polinucleotídico como polipeptídico, si se desea.

Además, será evidente que una vacuna puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los antígenos deseados de polinucleótidos, polipéptidos y/o carbohidratos. Por ejemplo, tales sales se pueden preparar a partir de bases atóxicas farmacéuticamente aceptables, que incluyen bases orgánicas (p.ej., sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y de aminoácidos básicos), y de bases inorgánicas (p.ej., sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).

Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido para las personas de experiencia habitual en la técnica en las composiciones de vacunas de esta invención, el tipo de vehículo variará generalmente dependiendo del modo deseado de administración. Las composiciones de la presente invención se pueden formular para cualquier forma de administración apropiada, que incluye, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprenderá con frecuencia agua, solución salina, alcohol, un lípido, una cera o un tampón. Para la administración oral, con frecuencia se pueden usar los vehículos anteriores, o también se puede emplear un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato magnésico. También se pueden emplear microesferas biodegradables (p.ej., polilactato-poliglicolato) como vehículos para las composiciones de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nºs 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344 y 5.942.252. También son adecuados los sistemas portadores de proteína del núcleo modificada de la hepatitis B, tales como los descritos en el documento WO/99 40934, y en las referencias citadas en ese documento. También se puede emplear un vehículo que comprende complejos partícula-proteína, p.ej., como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.928.647, cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad, que son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos limitada a la clase I en un hospedador.

En una realización ilustrativa, las formulaciones de vacunas se administran en las mucosas, en particular en la cavidad oral, y preferiblemente en un sitio sublingual, para provocar una respuesta inmunitaria. Se puede preferir en muchos casos la administración en la cavidad oral frente a la administración parenteral tradicional, debido a la facilidad y a la comodidad ofrecida por las técnicas de administración no invasivas. Además, esta aproximación proporciona un medio para provocar la inmunidad de las mucosas, que con frecuencia puede ser difícil de conseguir con la administración parenteral tradicional, y que puede proporcionar protección contra patógenos y/o alergenos transmitidos por el aire. Una ventaja adicional de la administración en la cavidad oral es que se puede mejorar el cumplimiento por parte del paciente con la administración sublingual de las vacunas, especialmente para aplicaciones pediátricas o para aplicaciones que tradicionalmente requieren muchas inyecciones a lo largo de un período de tiempo prolongado, tal como con las terapias de desensibilización para las alergias.

Las composiciones de vacunas pueden comprender también tampones (p.ej., solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato, o tampones de fosfato sin solución salina), carbohidratos (p.ej., glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicocola, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (p.ej., hidróxido de aluminio), solutos que hacen isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica la formulación respecto de la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. De manera alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden formular en forma de un liofilizado. Las composiciones también se pueden encapsular dentro de liposomas mediante el uso de técnicas bien conocidas.

Para ciertas aplicaciones, una formulación acuosa de RC-529 y QS-21 proporciona una actividad adyuvante inesperadamente intensa. Por lo tanto, en una realización, la composición de vacuna es una formulación acuosa que comprende uno o más tensoactivos. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una dispersión micelar que comprende al menos un tensoactivo adecuado, p.ej., un tensoactivo fosfolipídico. Los ejemplos ilustrativos de fosfolípidos incluyen diacil fosfatidil gliceroles, tales como dimiristoil fosfatidil glicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG), y diestearoil fosfatidil glicerol (DSPG), diacil fosfatidil colinas, tales como dimiristoil fosfatidilcolina (DPMC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), y diestearoil fosfatidilcolina (DSPC); ácidos diacil fosfatídicos, tales como ácido dimiristoil fosfatídico (DPMA), ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA), y ácido diestearoil fosfatídico (DSPA); y diacil fosfatidil etanolaminas tales como dimiristoil fosfatidil etanolamina (DPME), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE) y diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPE).

Generalmente, una proporción molar tensoactivo:adyuvante en una formulación acuosa será de alrededor de 10:1 a alrededor de 1:10, más generalmente de alrededor de 5:1 a alrededor de 1:5, sin embargo, se puede usar cualquier cantidad eficaz de tensoactivo en una formulación acuosa para adaptarse mejor a los objetivos específicos de interés.

En otra realización, la composición es una emulsión, tal como una emulsión agua en aceite o una emulsión aceite en agua. Tales emulsiones son en general bien conocidas para los expertos en esta técnica.

El sistema adyuvante de la presente invención se puede emplear como el único sistema adyuvante, o, de manera alternativa, se puede administrar junto con otros adyuvantes o inmunoefectores. A modo de ilustración, tales adyuvantes pueden incluir los adyuvantes basados en aceite (por ejemplo, adyuvante completo e incompleto de Freund), liposomas, sales minerales (por ejemplo, AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}), sílice, alumbre, Al(OH)_{3}, Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín, y carbono), polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), polímeros (por ejemplo, polímeros en bloque no iónicos, polifosfacenos, cianoacrilatos, polimerasa-(DL-lactida-co-glicósido), entre otros, y ciertas sustancias naturales (por ejemplo, lípido A y sus derivados, cera D de Mycobacterium tuberculosis, así como sustancias halladas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, y miembros del género Brucella), albúmina de suero bovina, toxoide diftérico, toxoide tetánico, edestina, hemocianina de lapa californiana, toxina A de Pseudomonas, colerágeno, toxina del cólera, toxina tosferínica, proteínas virales, y proteínas eucarióticas tales como interferones, interleucinas, o factor de necrosis tumoral. Tales proteínas se pueden obtener de fuentes naturales o recombinantes según métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Cuando se obtiene de fuentes recombinantes, el adyuvante puede comprender un fragmento de proteína que comprende al menos la porción inmunoestimuladora de la molécula. Otras macromoléculas inmunoestimuladoras conocidas que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, polisacáridos, ARNt, polímeros sintéticos no metabolizables tales como polivinilamina, poli(ácido metacrílico), polivinilpirrolidona, policondensados mixtos (con un peso molecular relativamente elevado) de ácido 4',4-diaminodifenilmetano-3,3'-dicarboxílico y ácido 4-nitro-2-aminobenzoico (véase Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)) o glicolípidos, lípidos o carbohidratos.

En una realización, el sistema adyuvante está diseñado preferiblemente para inducir una respuesta inmunitaria predominantemente de tipo Th1. Los niveles elevados de citocinas de tipo Th1 (p.ej., IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células hacia un antígeno administrado. En contraste, los niveles elevados de citocinas de tipo Th2 (p.ej., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Tras la aplicación de una vacuna tal como se proporciona en esta memoria, un paciente mantendrá una respuesta inmunitaria que incluye las respuestas de tipo Th1 y Th2. En una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de las citocinas de tipo Th1 se incrementará en un grado mayor que el nivel de las citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas se pueden determinar fácilmente mediante el uso de ensayos habituales. Para un resumen de las familias de citocinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Por ejemplo, los adyuvantes adicionales para el uso en la generación de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes de MPL están disponibles de Corixa Corporation (Seattle, WA; véanse las pat. de EE.UU. nºs 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG está sin metilar) también inducen predominantemente una respuesta Th1. Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las pat. de EE.UU. nºs 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras se describen también, por ejemplo, en Sato et al., Science 273:352, 1996. Otros adyuvantes ilustrativos que se pueden incluir en las composiciones de vacunas incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Detox (Corixa, Hamilton, MT).

Las composiciones descritas aquí se pueden administrar como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula, esponja o gel (compuesta de polisacáridos, por ejemplo) que efectúa la liberación lenta de un compuesto tras la administración). Tales formulaciones se pueden preparar en general mediante el uso de técnicas bien conocidas (véase, p.ej., Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438, 1996) y se pueden administrar, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio deseado seleccionado como objetivo. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo dispersado en una matriz de vehículo y/o contenido dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de la velocidad de liberación. Los vehículos para el uso en tales formulaciones son biocompatibles, y pueden ser también biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Tales vehículos incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros vehículos de liberación retardada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (p.ej., un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véase, p.ej., la pat. de EE.UU. nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida en una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, de la velocidad y la duración esperada de la liberación y de la naturaleza de la enfermedad a tratar o prevenir.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

Este ejemplo demuestra la sinergia del adyuvante QS-21 cuando se combina con el adyuvante RC-529, de forma que se inducen niveles mayores de actividad de LTC y de secreción de interferón-gamma con la combinación que con cada adyuvante solo, o en ausencia de adyuvante. Este experimento empleó un antígeno polipeptídico recombinante de M. tuberculosis, denominado rDPV, para inmunizar ratones C57BL/6 de forma subcutánea. Brevemente, se inmunizaron grupos de cuatro ratones C57BL/6 hembra de 6-8 semanas de edad de forma subcutánea con 5 \mug de rDPV combinados con 10 \mug de RC-529, 10 \mug de QS-21 o una combinación de los dos, formulados tanto en formulaciones acuosas (AF) como en emulsiones oleosas (SE). Las formulaciones acuosas de RC-529 comprenden el tensoactivo DPPC, en las que la proporción molar DPPC:529 es de alrededor de 8:1. Los ratones adicionales recibieron la dosis equivalente de antígeno formulada en combinaciones de adyuvantes que comprendían MPL (Corixa Corp., Seattle, WA) y QS-21 en formulaciones acuosas y de emulsiones aceitosas. Los ratones de control se inmunizaron con PBS. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en las semanas 0, 3 y 7, y los bazos se recogieron 2 semanas más tarde. Se estimularon suspensiones de esplenocitos individuales in vitro con células EL-4 transducidas de manera estable para que expresasen DPV. Trece días después se analizó en estas células la actividad de LTC contra EL-4-DPV mediante técnicas habituales de liberación de cromo. Se estimularon esplenocitos recientes adicionales in vitro con 5 \mug/ml de rDPV y los sobrenadantes se recogieron 3 días más tarde y se analizó el IFN-\gamma mediante ELISA. Los resultados de los experimentos anteriores se resumen en las Tablas 1 y 2 a continuación.

La Tabla 1 ilustra la secreción de interferón-gamma de esplenocitos de ratones inmunizados tras la estimulación in vitro con 5 \mug/ml de proteína DPV recombinante. La concentración de IFN-\gamma se midió en sobrenadantes de 3 días mediante ELISA, y se expresa como la concentración media para los grupos de cuatro bazos de ratones.

TABLA 1

2

La Tabla 2 muestra la actividad de LTC de los esplenocitos estimulados durante 13 días in vitro con células EL-4 que expresan de manera estable DPV. El porcentaje de lisis específica (liberación de cromo) se expresa como la media de cuatro bazos de ratón por grupo, con la lisis de fondo contra las células EL-4 restada, y una proporción de efector respecto de objetivo de 100:1.

TABLA 2

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Claims (18)

1. Una composición inmunoestimulante en una formulación acuosa que comprende QS-21 y RC-529 de fórmula I:

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y sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la formulación acuosa comprende uno o más tensoactivos.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que la formulación acuosa comprende uno o más tensoactivos fosfolipídicos.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el tensoactivo se selecciona del grupo que consiste en diacil fosfatidil gliceroles, diacil fosfatidil colinas, ácidos diacil fosfatídicos y diacil fosfatidil etanolaminas.

5. La composición de la reivindicación 3, en la que el tensoactivo se selecciona del grupo que consiste en dimiristoil fosfatidil glicerol (DPMG), dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG), y diestearoil fosfatidil glicerol (DSPG), dimiristoil fosfatidilcolina (DPMC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), y diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), ácido dimiristoil fosfatídico (DPMA), ácido dipalmitoil fosfatídico (DPPA), y ácido diestearoil fosfatídico (DSPA), dimiristoil fosfatidil etanolamina (DPME), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE) y diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPE).

6. La composición de la reivindicación 1 que comprende además al menos un antígeno.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que el antígeno procede del grupo que consiste en el virus herpes simple de tipo 1, virus herpes simple de tipo 2, citomegalovirus humano, VIH, hepatitis A, B, C o E, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma humano, virus de la gripe, tuberculosis, leishmaniasis, T. cruzi, Ehrlichia, Candida, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium y Toxoplasma.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que el antígeno es un antígeno tumoral humano.

9. La composición de la reivindicación 10, en la que el antígeno tumoral humano deriva de un cáncer de próstata, colon, mama, ovárico, pancreático, de cerebro, cabeza y cuello, melanoma, leucemia o linfoma.

10. La composición de la reivindicación 7, en la que el antígeno es un autoantígeno.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que el autoantígeno es un antígeno asociado a una enfermedad autoinmunitaria.

12. La composición de la reivindicación 11, en la que la enfermedad autoinmunitaria es diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, miastenia gravis, artritis reumatoide o psoriasis.

13. La composición de la reivindicación 1, en la que QS-21 y RC-529 se administran en una proporción de QS-21:RC-529 de alrededor de 1:10 a alrededor de 10:1.

14. La composición de la reivindicación 1, en la que QS-21 y RC-529 se administran en una proporción de QS-21:RC-529 de alrededor de 2,5:1 a alrededor de 1:2,5.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que RC-529 de fórmula I es una sal de trietilamonio de 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-\beta-D-glucopiranósido.

16. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para el uso en terapia.

17. El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece o es susceptible a una infección patogénica, cáncer o un trastorno autoinmunitario.

18. El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la fabricación de un medicamento para incrementar la respuesta inmunitaria en un mamífero.