MX2009013223A - Composicion adyuvante a base de la porina de omps1 de salmonella enterica serovar typhi. - Google Patents

Abstract

La presente invención es relativa al uso de la porina OmpS1 de Salmonella enterica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante, así como para preparar una composición de vacuna que comprende a la porina OmpS1 más uno más antígenos de origen microbiano y/o tumoral.

Description

COMPOSICIÓN ADYUVANTE A BASE DE LA POR1NA OMPS1 DE Salmonella entérica serovar Typhi CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a la utilización de la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante útil para la producción de vacunas, así como una composición adyuvante que contiene a dicha porina, y una composición de vacuna que comprende a la porina OmpS1 más un antígeno de origen bacteriano o tumoral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cuando el sistema inmunológico es retado con un antígeno extraño este responde al iniciar una respuesta protectora. Esta respuesta se caracteriza por la interacción del sistema inmunológico innato y adquirido.

La respuesta innata, activada a los pocos minutos de la infección, es la primera línea de defensa contra patógenos invasores, dando tiempo suficiente para la activación de la respuesta adaptativa madura.

La respuesta adaptativa, efectiva en algunos días o semanas, proporciona la especificidad requerida para la completa eliminación del patógeno y la generación de una memoria inmunológica. Esta respuesta es mediada principalmente por células B y T y se caracteriza por una alta especificidad y la capacidad de generar memoria inmunológica. Una vez que la respuesta adaptativa ha madurado, la exposición subsecuente al patógeno resulta en su rápida eliminación.

La respuesta adaptativa es afectada principalmente por dos miembros independientes: la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral mediada por anticuerpos. La inmunidad mediada por células involucra la activación de linfocitos T que actúan directamente eliminando células infectadas o estimulan otras células que actuaran sobre las células infectadas. Esta rama del sistema inmunológico por consiguiente es eficaz eliminando a las células que son cancerosas o están infectadas con patógenos. La otra rama de la respuesta adaptativa involucra la generación de anticuerpos contra antígenos extraños por parte de los linfocitos B. Este miembro mediado por anticuerpos ataca y neutraliza antígenos extraños extracelulares.

En algunos casos la respuesta inmunológica puede inclinarse hacia la inducción de alguno de estos dos tipos de respuesta después de la exposición al antígeno. En particular, existen dos citocinas que tienen papeles primarios en la determinación de la trayectoria de la respuesta inmunológica. La interleucina-12 (IL-12), secretada por los macrófagos, induce preferencialmente la respuesta de tipo celular estimulando las células T a la diferenciación de células Th1. Por su parte, la interleucina-10 (IL-10) inhibe dicha respuesta, conduciendo así a una respuesta tipo Th2.

Las respuestas tipo Th1 y tipo Th2 se pueden diferenciar entre ellas en base de ciertos cambios fenotípicos. Estos cambios fenotípicos se caracterizan, por lo menos en parte, por la naturaleza de los citocinas secretadas por las células de T cooperadoras polarizadas. Las células Th1 producen citocinas que incluyen TNF, de IL-1 , de IL-2, IFN-gamma, IL-12 y/o IL-18. Las citocinas Th1 están implicadas en la activación de macrófagos y las células Th1 favorecen las respuestas de tipo celular. En contraste, las células Th2 producen citocinas que incluyen IL4, IL-5, IL-10 e IL-13. Los citocinas Th2 promueven la producción de anticuerpos y pueden suprimir la respuesta del tipo Th1.

Las vacunas son formulaciones que son capaces de inducir la generación de respuestas inmunológicas protectoras ya sea con fines terapéuticos o profilácticos en contra de diversos agentes patógenos. La mayoría de las vacunas exitosas utilizadas actualmente contienen componentes antigénicos de un patógeno además de los denominados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP por sus siglas en inglés) los cuales son capaces de activar a las células de la respuesta inmune innata cuando son reconocidas a través de los receptores de reconocimiento de patrón (PRR por sus siglas en inglés). Tales vacunas están basadas en formas atenuadas o muertas de los microbios, y pueden ser agentes terapéuticos profilácticos extremadamente potentes. No obstante, la presencia de otros componentes presentes en los microorganismos en vacunas a base de microorganismos atenuados o muertos, no esenciales para el establecimiento de la respuesta inmune, puede llevar a la aparición de efectos adversos serios en los organismos receptores de la vacuna, disminuyendo la seguridad de la preparación vacunal. Esto ha limitado el uso de vacunas a base de células completas y ha estimulado esfuerzos considerables para purificar los componentes de la vacuna y ha fomentado el desarrollo de las vacunas de subunidad, vacunas conjugadas y vacunas de ADN. Las vacunas de subunidad están basadas en los antígenos aislados de microorganismos o de antígenos sintéticos generados utilizando técnicas químicas y/o recombinantes. Las vacunas conjugadas implican el acoplamiento de antígenos relativamente no inmunogénicos a las proteínas acarreadoras. Las vacunas de DNA liberan el antígeno en la forma de ácido nucleico codificante y así permitir, después de la administración, la expresión endógena del ADN codificante. Tales vacunas requieren normalmente un vector apropiado para liberar el ácido nucleico codificante a un compartimiento apropiado del hospedero.

Aunque las vacunas de subunidad, conjugadas o de ADN son por lo general bien toleradas y no provocan reacciones secundarias indeseables generalmente carecen de los PAMPs que son requeridas para la activación de la respuesta innata. De esta forma, exhiben típicamente una menor potencia cuando se comparan con vacunas compuestas por microorganismos completos, por lo cual a pesar de que carecen de contaminantes potencialmente peligrosos dada su baja inmunogenicidad no son una opción viable para la generación de nuevas vacunas.

Por lo tanto, un reto del diseño moderno de vacunas es desarrollar estrategias para inducir de forma eficiente la respuesta innata y la adaptativa para imitar una infección natural y para alcanzar respuestas potentes en contra délos antígenos definidos, con una baja toxicidad. Este esfuerzo se centra principalmente en el diseño de los adyuvantes de la respuesta inmunológica, los cuales son esenciales para generar nuevos tipos de vacunas, viables, más eficaces, y seguras y que impliquen procesos de fabricación más baratos.

Un adyuvante es cualquier compuesto o composición que aumenta la intensidad y/o duración de una respuesta inmunológica en contra de un antígeno extraño cuando son coadministrados en comparación con la presentada con la administración del antígeno solo. Entre las cualidades principales de un adyuvante se inclu yen su habilidad para aumentar una respuesta inmunológica apropiada contra el antígeno blanco, seguridad a largo término en aplicación extensiva, y flexibilidad en uso con diferentes antígenos /enfermedades. El desarrollo de los adyuvantes ha sido empírico, ya que los mecanismos de acción de la mayoría de los adyuvantes solo han sido parcialmente descritos.

El único adyuvante actualmente con licencia para uso humano con cualquier antígeno es la alúmina (sales de aluminio). Esta puede precipitar antígenos solubles en el área cercana al sitio de la inyección, en donde los macrófagos y las células dendríticas lo pueden procesar. De esta forma, actúa como vehículo liberador de antígeno, mediando una presentación más efectiva del antígeno al sistema innato.

No obstante, un estudio reciente ha presentado que la alúmina también tiene un efecto potenciador vía el control mediado por citocinas de la respuesta Th1/Th2 (Brewer et al. 1999. The Journal of Immunology, 163: 6448-6454). El estímulo inmunológico exhibido por la alúmina es polarizado fuertemente hacia una respuesta tipo Th2. Esto es una limitación importante, puesto que ahora se reconoce que la respuesta inmunológica del tipo Th1 es esencial para generar inmunidad protectora contra muchos agentes infecciosos (virales, bacterianas, y protozoarios intracelulares).

La endotoxina lipopolisacárido bacteriana (LPS), y específicamente su porción activa, el lípido A, es otro potente adyuvante inmunológico. El lípido A nativo es reactogénico y pirogénico; sin embargo, las modificaciones químicas al lípido A han dado lugar a preparaciones no tóxicas que conservan su actividad adyuvante. Se han efectuado ensayos clínicos con el lípido A purificado de Salmonella minnesota R595 y detoxificado al remover el grupo fosfato del extremo reductor del esqueleto del disacárido por hidrólisis ácida, para producir monofosforil lipido A (MPL). Este MPL puede ser además detoxificado por 3-O-acetilación con una hidrólisis ligera alcalina y se puede encapsular en liposomas compuestos de fosfolípidos y colesterol.

Por otro lado, la solicitud de patente norteamericana US 2003091599 describe oligonucleótidos adyuvantes que tienen al menos un dinucleótido CpG no metilado y describe que el ADN CpG induce un patrón Th1 de producción de citocinas dominadas por la IL-12 y el IFN-gamma, con una pequeña secreción de citocinas del tipo Th2. de este modo, el CpG activa directamente monocitos, macrófagos, y células dendríticas para que secreten una variedad de citocinas, incluyendo altos niveles de IL-12. Esas citocinas estimulan a las células NK para que secreten IFN-gamma y también aumentan su actividad lítica.

También se han realizado estudios con una emulsión que consiste de escualeno, polímero plurónico L121 , y Tween 80 en amortiguador de fosfatos (SAFm), sola o en combinación con treonil muramil dipéptido (termutido; N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina; MDP). Los estudios demostraron que el adyuvante SAFm, conjuntamente con inmunógenos de la gripe, HSV gD2, y HIV-1 , exhibió mayor potencia adyuvante que la alúmina y (en algunos casos) que el MF59.

El muramil dipéptido (MDP) es otro adyuvante conocido, el cual representa la unidad mínima de la pared células de las micobacterias que genera la actividad adyuvante observada con el adyuvante completo de Freund (Ellouz et al, 1974, Biochem. Biophys. Res. Comm., 59: 1317). Muchos análogos sintéticos de MDP se han generado y estos exhiben una amplia gama de potencia adyuvante y de efectos secundarios (Chedid et al., 1978, Prog. Alergy, 25: 63). Tres análogos que pueden ser especialmente útiles como adyuvantes de vacunas son derivados treonil del MDP, derivados n-butil, y un derivado lipofílico del muramil tripéptido. Estos compuestos pueden estimular la respuesta inmune con bajos niveles de toxicidad.

Otro adyuvante conocido, es aquél descrito en la patente norteamericana US 5976539; dicha patente describe el uso potencial de la IL-12 como un adyuvante y subraya su potencial como un activador de inmunidad celular. Su potencial se acentúa en vacunas contra infecciones que requieren una respuesta inmunológica mediada por células para la protección eficaz contra la infección por un patógeno. Sin embargo, el costo para producir y formular la IL-12 es alto, y su uso en seres humanos no es recomendable, debido a su alta reactogenicidad y sus efectos pleiotrópicos (que puedan dar lugar a problemas de dosificación y efectos secundarios inesperados).

Por otro lado, la solicitud internacional de patente W08809336 describe varias fracciones de saponinas inmunológicamente activas que tienen actividad adyuvante (conocidas genéricamente como adyuvantes saponina). Las fracciones se han utilizado con éxito en la práctica veterinaria y se derivan de la corteza del árbol suramericano Quillajasaponana. Las saponinas substancialmente puras tienen actividad adyuvante a una concentración mucho menor que las preparaciones heterogéneas de saponinas, y no exhiben sus efectos tóxicos. Por ejemplo la QS-21, también conocida como QA21 , es una fracción purificada por HPLC divulgada (como QA21) en la patente US 5057540. Los adyuvantes de saponina QS-21 estimulan la respuesta inmunológica tipo Th1 y Th2 y se han utilizado con gran éxito en ensayos clínicos a gran escala de vacunas profilácticas y terapéuticas.

Adicionalmente, la solicitud internacional de patente W09014837 describe varias emulsiones submicrón aceite/agua así como su uso como adyuvantes. En particular, este documento describe las composiciones adyuvantes que comprenden un aceite metabolizable y un agente emulsificante, en donde el aceite y el agente emulsificante están presentes en forma de una emulsión de aceite/agua que tiene gotitas del aceite substancialmente menores de 1 micrón de diámetro. Una de las emulsiones descritas, un sistema de emulsión microfluidizado que consiste de polisorbato 80 y sorbitan trioleato MF59, se ha sido recientemente aprobado en Italia para su uso en una vacuna de la gripe. Sin embargo, MF59, al igual que la alúmina, estimula una respuesta tipo Th2 fuertemente polarizada.

De esta forma, existe la necesidad de generar adyuvantes y sistemas de adyuvantes de baja toxicidad, que estimulen ambos miembros del sistema inmunológico, que mejoren la seguridad y la eficacia de vacunas existentes y sean convenientes para el uso con las vacunas sintéticas y basadas en células.

En este sentido la presente invención es relativa a un nuevo adyuvante, la porina OmpS1 de S. typhi. Esta porina se caracteriza porque su expresión se libera cuando se recorta una región de 222 pares de bases (pb), río arriba del promotor 1 (P1) el cual es dependiente de OmpR; además se identificó un promotor 2 (P2), el cual requiere de OmpR para activarse. También se ha determinado que la expresión de OmpS1 no se induce en varias de las condiciones probadas, tales como los cambios en la osmolaridad o en condiciones de estrés, como lo son los cambios de pH y temperatura o en anaerobiosis o en presencia de sales biliares y péptidos catiónicos (Oropeza y col. 1999, Mol.Microbiol. 32:243-252).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona una composición adyuvante a base de la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar composiciones adyuvantes útiles para la elaboración de vacunas.

Aún en otro aspecto de la invención, se proporciona una vacuna que comprende una composición adyuvante de porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi y uno o más antígenos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza aquí, el término vacuna terapéutica intenta definir una subclase de vacunas las cuales tienen propiedades terapéuticas (y no sólo profilácticas). Dichas vacunas pueden tener una actividad profiláctica además de su potencial terapéutico. Ellas encuentran aplicación en el tratamiento de enfermedades, infecciones o condiciones existentes. Ellas vienen a ser de gran importancia como agentes para el tratamiento de cáncer, SIDA y malaria.

Cualquier antígeno o combinación de antígenos se puede utilizar en las vacunas de la invención, incluyendo por ejemplo ácidos nucleicos los cuales codifican uno o más proteínas antigénicas o péptidos; glicoproteínas, polisacáridos y otros carbohidratos; proteínas de fusión; lípidos; glicolípidos, péptidos semejantes a polisacáridos; carbohidratos y proteínas en mezcla; conjugados carbohidrato-proteína; células o extractos de las mismas; células muertas o atenidas o extractos de las mismas, células tumorales o extractos de las mismas; partículas virales (por ejemplo, partículas virales atenuadas o componentes virales) y alérgenos. El antígeno puede comprender un antígeno bacteriano, viral, fúngico, protozoario o priónico. Otros antígenos disponibles incluyen neoantígenos, antígenos asociados a tumor, y autoantígenos.

El término neoantígeno es utilizado aquí para definir cualquier determinante antigénica expresada nuevamente. Los neoantígenos pueden producirse a partir de cambios conformacionales en una proteína, con determinantes expresadas nuevamente (especialmente sobre la superficie de células infectadas o transformadas), o como resultado de una formación compleja de una o más moléculas o como resultado del corte de una molécula con una presentación resultante de nuevas determinantes antigénicas.

El término antígeno asociado a tumor es utilizado aquí para definir un antígeno presente en células transformadas (malignas o tumorales) el cual ésta ausente (o presente en bajas cantidades o en un compartimiento celular diferente) en células normales del tipo sobre el cual el tumor se origino. Los virus oncogénicos también pueden inducir la expresión de antígenos tumorales, los cuales a menudo son proteínas del hospedero inducidas por el virus.

Las vacunas de la invención pueden usarse en el tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades y desórdenes. Los blancos virales incluyen enfermedades y desórdenes en los cuales cualquiera de los siguientes virus (o clases de virus) están implicados: Retroviridae, Picomaviridae, Calciviridae, Togaviridae, Flaviridae, Coronoviridae, Rhabdoviradae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bungaviridae, Arenaviridae, Birnaviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Iridoviridae y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etnológicos de encefalopatías espongiformes), virus HCV (causante de la hepatitis no A ni B), virus Norwalk y relacionados. De los arriba mencionados, particularmente se prefieren los virus HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, rabia, poliovirus, influenza, meningitis, viruela, rubéola, encefalitis, papiloma, fiebre amarilla, sincitial respiratorio, parvovirus, chikungunya, fiebre hemorrágica y Herpes. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antlgenos presentes en virus ocurridos naturalmente.

Los blancos bacterianos incluyen a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Ejemplos de bacterias las cuales pueden ser blanco por las vacunas de la invención incluyen, pero no se limitan a: Helicobacter pylorí, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacterium spp (por ejemplo M. tuberculosis, M. leprae, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii y M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococos del Grupo A), Streptococcus agalactie (Estreptococos del Grupo B), Streptococcus viridans, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, cualquiera de la especies anaerobias del género Streptococcus, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter spp., Enterococcus spp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium spp. (incluyendo C. diphtheriae), Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebslella spp (incluyendo K. pneumoniae), Pasteurella multocida, Bacteroides spp., Fusobacteríum nucleatum, Streptobacillus monilijormis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira spp., Rickettsia spp. y Actinomyces spp. (incluyendo A. israelil). En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antígenos presentes en bacterias ocurridas naturalmente (o expresadas/inducidas durante la infección).

Los blancos fúngicos incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis y Candida albicans. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas deriva de aquellos antígenos presentes en fungís ocurridas naturalmente (o expresadas/inducidas durante la infección).

Los blancos prozoarios incluyen Plasmodium spp. (incluyendo Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax), Toxoplasma spp. (incluyendo 7. gondii y T. crut), Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, y Leishmania spp.

Los cáncer y desórdenes proliferativos incluyen cáncer de tejido sólido y aquellos de los sistemas linfático y sanguíneo (incluyendo la enfermedad de Hodgkin, leucemias, linfomas, mieloma múltiple, y enfermedad de Waldenstrom), melanomas (incluyendo melanoma del ojo), adenomas, sarcomas, carcinomas de tejidos sólidos, melanoma, cáncer de pulmón, tiroides, glándulas salivares, pierna, lengua, labios, conductos biliares, pelvis, mediastino, uretra, Sarcoma de Kaposi (por ejemplo cuando están asociados al SIDA; cáncer de piel (incluyendo melanoma maligno), cáncer del tracto digestivo (incluyendo cáncer de cabeza, cuello, esófago, estómago, páncreas, hígado, colon, recto, y ano), cáncer del sistema genital y urinario (incluyendo cáncer de riñón, vejiga, testículo, y próstata), cáncer en mujeres (incluyendo cáncer de seno, cervicouterino, ovario, y coriocarcinoma), así como también cáncer de cerebro, hueso, nasofaríngeo, retroperitoneal, y cáncer de sitio primario desconocido. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas son los neoantígenos a antígenos asociados a tumor presentes en las células malignas y/o tejidos.

Los desórdenes alérgicos incluyen alergia atópica, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica, hipereosinofilía, síndrome del intestino irritable, migraña inducida por alérgeno, alergia bacteriana, alergia bronquial (asma), alergia de contacto (dermatitis), alergia al polen, alergia a medicamentos, alergia a piquetes, alergia a alimentos, alergia físicas (incluyendo urticaria al frío o angioedema), alergia al calor (urticaria colinérgica) y fotosensibilidad. En tales incorporaciones el antígeno seleccionado para uso en vacunas son derivados de aquellos antígenos presentes en el alérgeno, incluyendo polen, veneno de insectos, esporas de fungis, y medicamentos y proteínas específicas a los siguientes géneros: Canis, Dermatophagoides, Felis, Ambrosia, Lolium, Cryptomeria, Alder, Agnus, Betula, Quercus, Festuca y Bromus.

Las composiciones y vacunas de la invención contienen a la Porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi, opcionalmente junto con uno o más adyuvantes auxiliares y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Cuando la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi es formulada junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, cualquier excipiente puede ser utilizado, incluyendo por ejemplo diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos.

Las composiciones adyuvantes o de vacuna pueden tomar cualquier forma disponible, e incluyen por ejemplo tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, gránulos y aerosoles.

Las tabletas para uso oral pueden contener la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi mezcladas con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes de unión, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y preservativos. Los diluyentes inertes disponibles incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido alglnico están disponibles como agentes disgregantes. Los agentes de unión pueden incluir almidón y gelatina, mientras que los agentes lubricantes, si están presentes, serán generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.

Las cápsulas para uso oral incluyen cápsulas duras de gelatina, en las cuales la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar se mezcla con un diluyente sólido, y las cápsulas de gelatina suave, en donde el ingrediente activo es mezclado con agua o un aceite tal como el aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las formulaciones para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base disponible que comprende por ejemplo mantequilla de cocoa o un salicilato.

Las formulaciones para administración vaginal pueden presentarse como presentaciones de tampones, cremas, geles, pastas, espumas o espray conteniendo además del agente activo, ingredientes tales como acarreadores apropiados bien conocidos en el estado del arte.

Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo e intravenoso, la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi generalmente se proporcionara en soluciones o suspensiones acuosas estériles, amortiguadas a un pH e isotonicidad apropiados.

Cuando se utilizan adjuntamente, la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi se puede formularse con uno o más medicamentos. En particular, se pueden utilizar en combinación con agentes antitumorales, antimicrobianos, antiinflamatorios, antiproliferativos, y/o ¡nmunoestimulatorios. Por ejemplo, las porinas se pueden usar con agentes antiproliferativos tales como citocinas, incluyendo IL-2 e IL_12, interferones e inductores de los mismos, TNF, TGF, así como con agentes mielosupresivos y/o quimioterapéuticos (tales como doxorubicin, 5-fluorouracil, ciclofosfamida y metotrexato), isoniazida (por ejemplo en la prevención o tratamiento de neuropatía periférica) y con analgésico (por ejemplo NSAIDs) para la prevención y tratamiento de úlceras gastroduodenales.

La cantidad de la porina administrada puede variar extensivamente de acuerdo a la unidad de dosis empleada, el período de tratamiento, la edad, peso, clase de tratamiento adjunto, y sexo del paciente a tratar, la naturaleza y extensión del desorden a tratar, la naturaleza del antígeno administrado.

Las vacunas de la invención pueden ser administradas por rutas oral o parenteral, incluyendo intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdermal, mucosal, aérea, rectal, vaginal y tópica (incluyendo bucal y sublingual).

La invención será ahora descrita con referencia a ejemplos específico. Ellos son únicamente para propósitos ilustrativos y no intentan de forma alguna limitar en cualquier sentido el propósito de la invención descrita. Dichos ejemplos constituyen hasta ahora el mejor método actualmente contemplado para la práctica de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Purificación de la porina OmpS1.

La obtención de la porina OmpS1 de S. typhi se realiza a través del método de Nikaido modificado. Se cultivó S. typhi pTrc99A-S1, en 10 L. de medio mínimo A ( 70g K2HP04, 30g KH2P04, 10g (NH4) 2S04, 5g citrato de sodio, 10g extracto de levadura, 50g de glucosa, 0.1% MgS04 ) hasta obtener una densidad óptica de 1.0 a 540 nm que corresponde a la fase logarítmica tardía del crecimiento de la bacteria. Se cosechó centrifugando a 7,000 rpm 15 minutos a 4°C. La biomasa bacteriana se pesó y se resuspendió en solución de Tris-CI 0.05M (pH 7.7) hasta obtener 50 mL de suspensión bacteriana. Se rompió por sonicación (Sonicator Ultra Sonio) durante una hora treinta minutos y la suspensión de bacteria rota se centrifugó a 7,000 rpm 30 minutos a 4°C.

El sobrenadante se retiró y se trató con 25µ? de DNAsa 10 000 U/mL y 25µ? de RNAsa 10 000 U/mL y 2.77 mL de solución de MgCI2 1M por cada 10g de biomasa húmeda obtenida de la cosecha, por 30 minutos a 37°C 120 rpm para eliminar el DNA y RNA. Se ultracentrífugó a 45 000 rpm durante 45 minutos a 4°C. El botón se resuspendió en 100 mL de solución de Tris HCI-SDS 2%, se incubó 30 minutos a 32°C 120 rpm y se ultracentrífugó a 40 000 rpm, 30 minutos a 20°C. El botón resultante se resuspendió en 25 mL de solución de Tris HCI-SDS 2%, se incubó nuevamente por 30 minutos a 32°C 120 rpm y se ultracentrífugó a 40,000 rpm 30 minutos 20°C. El botón se resuspendió en 20 mL de amortiguador de Nikaido SDS 1% (Tris 0.05M, NaCI 0.4M, EDTA 0.005M) pH 7.7. Se incubó 2 horas a 37°C 120 rpm y se ultracentrífugó a 40 000 rpm 45 minutos a 20eC. Se recuperó el sobrenadante.

El sobrenadante se purificó en una columna de Sephacryl S-200 (XK100 Pharmacia) a un flujo de 5mL min con amortiguador de Nikaido SDS 0.5% pH 7.7. Se colectó el pico obtenido en el cromatograma y se dializó con solución de PBS durante 4 días para disminuir la cantidad SDS presente en el producto de la purificación obtenida.

La porina OmpS1 se obtiene en las fracciones 70 a la 90 del cromatograma. Posteriormente se lleva a cabo un corrimiento electroforético en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), para tinción con azul de coomasie y otro para tinción con plata y poder corroborar la presencia de la porina, así como la integridad de la misma. La porina OmpS1 se observa como una banda de 41 kDa.

Ejemplo 2. Efecto de la porina OmpS1 sobre monocitos de ratón.

Ratones de la cepa BALB/c se sacrificaron mediante dislocación cervical y se fijaron a una plantilla para ratón. Se extrajeron ambos fémur y se colocaron en un tubo con PBS. En la campana de seguridad biológica se lavaron los fémures con alcohol al 70% durante 0 segundos y posteriormente 3 veces con PBS. Se cortaron los extremos del fémur dejando expuesto el canal para extraer la médula ósea empleando 2.5 mL de medio DME suplementado para cada extremo. El extracto se colectó en tubos cónicos estériles de 15 mL y se centrifugó a 1100rpm/1min./4°C. El sobrenadante de cada tubo se transfirió a otro tubo cónico estéril y se centrifugaron a 1100rpm/10 min. /4°C. Se desechó el sobrenadante, se colectaron los botones de los tubos en uno solo y se resuspendió en un volumen final de 6mL con medio de Médula ósea. Se colocó 1 mL de la suspensión celular en cajas para cultivo celular de baja adherencia y se completó a un volumen final de 20mL con medio de Médula ósea. Las cajas se incubaron a 37°C con 5% de C02 durante 6 días.

Al tercer día se agregó a cada caja 5 mL de medio de Médula ósea. Al sexto día se desechó el medio de las cajas y se lavaron 2 veces con 10 mL de PBS frío y se dejaron en hielo con 10 mL de PBS. Se despegaron las células y las suspensiones se colocaron en tubos cónicos estériles de 15 mL los cuales se centrifugaron a 100rpm/10 m¡n./4°C. Se desechó el sobrenadante, se colectaron todos los botones en un solo tubo y se resuspendió en DMEM suplementado a un volumen conocido. Se obtuvo el número de células en el hematocitómetro asegurándose que más del 80% del cultivo se encontrara viable.

Se colocó en una placa de 6 pozos la cantidad necesaria de suspensión de células para que en cada uno de ellos hubieran 1 x106 células y se completó el volumen en cada pozo a 2mL con DMEM suplementado. Se incubó toda la noche antes del experimento a 37° C en atmósfera de 5% de C02. 1x 06 macrófagos derivados de médula ósea se estimularon con 1 pg de la porina OmpS1 o 100 o 2 ng de LPS £ coli 0111 :B4/mL (Sigma-Aldrich). Como control se emplearon células sin estimular. Se recuperó el sobrenadante de cultivo y se almacenó a -70°C hasta su análisis. Se determinó el perfil de citocinas inducido utilizando el KIT CBA Beckton Dickinson.

La porina OmpS1 de S. typhi indujo un perfil de citocinas caracterizado por la presencia de MCP-1, TNFa e IL-6. MCP-1 se indujo a las 12 y 24 horas. TNFa fue la citocina que se indujo en mayor cantidad a las 12 y 24 horas. También se observó la presencia de IL-6 únicamente a las 24 horas.

El efecto de probable contaminación por LPS se descartó del experimento ya que se estimularon a las mismas células con 2 ng de LPS el cual es el límite de detección en la prueba para determinar la cantidad de LPS presente en los lotes de porinas y en los cuales no se ha alcanzado a detectar presencia del mismo. 2ng de LPS no indujeron la producción de citocinas en el sistema. Una mayor cantidad de LPS (100 ng) fue utilizado como control positivo del sistema induciendo un perfil muy amplio y significativo de citocinas.

Ejemplo 3. Efecto adyuvante de la porina OmpS1 sobre la inmunización con ovoalbúmina (OVA) Grupos de ratones BALB/c fueron inmunizados i. p. con 100pg de OVA en ausencia o presencia de adyuvante (10 µg OmpS1 , 10 µg porinas). Los ratones control recibieron solución salina isotónica. Muestras de sangre se colectaron de la vena facial a diferentes tiempos según se indica en las gráficas. Las muestras individuales de suero se congelaron a -20°C hasta su análisis.

Por vía i.p y ausencia de adyuvante se inmunizaron grupos de 3 ratones (día 0) con los siguientes antígenos: 1 ,10 y 50pg OmpS1 , 10 g OmpC o solución salina isotónica (SSI). Se tomaron muestras de sangre de la vena facial y se centrifugó a 3000rpm/5 minutos/4°C. Las muestras se almacenaron a -20°C hasta su análisis.

Se fijaron placas de 96 pozos (Corning) con 10?µ?_ de solución de antígeno (10 g/mL de OmpS1 o 10pg/mL de porinas, o 150 µg/mL OVA) en solución amortiguadora de carbonatos pH 9,5, incubando 1 hora a 37°C y posteriormente toda la noche a 4°C. Se realizaron 4 lavados con solución H20 destilada-Tween20 0.1 %. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon con solución PBS pH 7.4-leche descremada 2%, incubando 1 hora a 37°C, seguido de 4 lavados con solución H20 destilada-Tween20 0.1 %. Se adicionaron diluciones seriadas en factor de 2, iniciando con dilución 1/40 de los sueros inmunes (100µ?/????), incubando 1.5 horas a 37°C. Después de 4 lavados con solución H20 destilada-Tween20 0.1 % se adicionó a cada pozo 100 L de una dilución 1 : 1000 en solución de bloqueo del anticuerpo secundario (HRP anti-IgM, HRP anti-lgG, HRP anti-lgG1 , HRP anti-lgG2a, HRP anti-lgG2b (Jackson Immunochemicals o Zymed (1 : 1000)), HRP anti-lgG3 (Rockland)), incubando 1 hora a 37°C se realizó una última serie de lavados con solución H20 destilada-Tween20 0.1 %. Para la detección se agregó a cada pozo 100µ? de solución de revelado (OPD SIGMA + peróxido de hidrógeno al 20%) incubando 10minutos a 37°C, la reacción se detuvo agregando 100 L H2S04 2.5N. Se determinó la absorbancia a 450nm en un lector automático de ELISA. El título de anticuerpos se interpreta como 3 veces el promedio de la absorbancia de los controles negativos.

La porina OmpS1 mostró un fuerte efecto adyuvante en respuesta IgG total específica frente a OVA, alcanzando títulos de 7 y manteniendo esta respuesta hasta el día evaluado (día 30). El grupo que solo fue Inmunizado con OVA, no mostró títulos de anticuerpos.

Por su parte la respuesta de la subclase lgG1 frente a OVA también mostró un efecto adyuvante con un título de 8 a partir del día 8 y manteniéndolo hasta el día 30, en este caso el grupo que fue inmunizado con OVA únicamente, indujo bajos títulos de anticuerpos específicos (título de 2) comparados con el grupo que fue inmunizado con la porina OmpS1. En cuanto a la respuesta de lgG2a frente a OVA se observa también efecto adyuvante con un título máximo de 5 al día 12 en el grupo que fue co-administrada la porina OmpS1 mientras que el grupo que solo fue inmunizado con OVA no mostró títulos de anticuerpos. El efecto adyuvante inducido por la porina OmpS1 también se sigue observando en la subclase lgG2b, mientras que el grupo que fue inmunizado con OVA únicamente no mostró títulos de anticuerpos específicos con esta subclase.

Ejemplo 4. Reconocimiento de la porina OmpS1 por TLRs de la línea celular HEK-293.

Se utilizaron células HEK-293, las cuales presentan una transfección permanente con un plásmido que tiene el gen de TLR-2, 4, 2/CD14, 2/6 y 5 humano bajo el control del promotor de la L-selectina, que se activa por NF-KB. El antibiótico de selección para el plásmido fué blasticidina S (Blasticidin InVivoGen). Estas células se usaron para determinar el reconocimiento de la porina OmpS1 a través del TLR codificado en plásmido transfectado. Las Células HEK fueron colocadas en placas para cultivo de células de 12 pozos (Corning incorporated Cat. 3526). Se colocaron 300,000 células por pozo y fueron estimuladas con 1 pg de las porinas OmpS . Las células se incubaron durante 24 horas a 37C. Como control se utilizó LPS de E. coli (10 g/mL o 2ng/ml), Zimosan (10 pg/mL) , flagelina (1 \ig/rr L) y la porina OmpC, OmpSl y OmpS2 degradada con proteinasa K (0.5 pg/mL de proteinasa por cada 10 pg de porina). Posterior a la incubación se tomaron los sobrenadantes y se les determinó la concentración de IL-8 como medida del reconocimiento de las porinas a través del TLR transfectado en las células.

La porina OmpSl indujo la producción de IL-8 en las células HEK que codifican el gen para TLR-4, pero no para las células HEK que codifican para TLR-2, TLR2/6, TLR2/CD14 Y TLR-5 lo que indica que fue reconocida por TLR-4 sobre-expresado en estas células. Se corroboró el reconocimiento de la porina por TLR-4 mediante la degradación enzimática de la porina con proteinasa k, lo cual eliminó la respuesta observada con la proteína estructuralmente intacta.

Ejemplo 5. Efecto antigénico de la porina OmpSl Por vía ip y en ausencia de adyuvante se inmunizaron grupos de 6 ratones (día 0) con los siguientes antígenos: 10pg OmpSl , 10pg OmpC o solución salina isotónica (SSI). Al día 15, se administró i. p. un refuerzo con 10pg OmpSl ó 10pg OmpC en ausencia de adyuvante. Al día 25 los ratones fueron retados i. p. con 20 ó 100 LD50 de Sálmonella typhl (ATCC 9993) resuspendida en 500pL buffer TE (50mM Tris, pH 7,2, 5mM EDTA) 5% mucina gástrica (Sigma). La protección se definió como el porcentaje de sobrevivientes durante los 10 días posteriores al reto. En nuestras manos 1 LD50 = 90 000 UFC.

La porina OmpS1 fue capaz de inducir la producción de anticuerpos IgM específicos con las tres dosis probadas. Se observó un efecto de dosis respuesta, ya que 1 pg de OmpS1 indujo los menores títulos de anticuerpos, mientras que 10 y 50 g indujeron mayores títulos. Los títulos de anticuerpos se indujeron a partir del día 4 para este isotipo de inmunoglobulina y obteniendo el mayor título al día 2 el cual se mantuvo hasta el día evaluado en las tres dosis. En el caso de la respuesta de IgG inducida por la porina OmpS1 se observan títulos a partir del día 12 los cuales se mantienen hasta el día evaluado, al igual que en la respuesta de IgM, se observó un efecto dosis respuesta sin existir grandes diferencias entre ellos de acuerdo a las dosis administradas.

Al evaluar las subclases de IgG; lgG1 , lgG2a, lgG2b e lgG3 específicas inducidas por la porina OmpS1 se observó un fenómeno similar al observado en los isotipos IgM e IgG total, ya que el efecto dosis respuesta se mantiene para estas subclases en donde 10 y 50 pg inducen el mayor título además de que el título entre estas dos dosis es muy parecido. La cinética de título de anticuerpos en las subclases evaluadas fue diferencial ya que en el caso de lgG2b, se observa un pico de titulación al día 12, el cual comienza a disminuir sin desaparecer hasta el día evaluado. lgG3 muestra el título más alto al día 12 y disminuye ligeramente hasta el día evaluado. lgG1 e lgG2a tienen una cinética similar ya que inducen su título más alto al día 30 y se mantiene hasta el día evaluado.

Por su parte la porina OmpC resultó ser más inmunogénica que la porina OmpS1 en los isotipos evaluados. Los resultados muestran que la porina OmpS1 es capaz de inducir títulos de anticuerpos y que la menor dosis a la cual observamos una buena respuesta de anticuerpos son 10 pg de la porina OmpS1.

Como se observó en el resultado anterior, la porina OmpS1 de S. typhi es un antígeno inmunogénico, capaz de inducir una respuesta de anticuerpos con una sola administración del antígeno. Aunado a la capacidad inmunogénica, el desarrollo de una vacuna implica también que el antígeno sea capaz de generar un estado inmune en el individuo que entre otras cosas requiere la inducción de altos títulos de anticuerpos y que además, se mantengan durante mucho tiempo, es decir; generar anticuerpos de larga duración con actividad biológica.

La inmunización con una sola dosis de la porina fue capaz de inducir títulos de anticuerpos IgG específicos hasta el día evaluado. Los títulos de anticuerpos IgG frente a la porina OmpS1 aparecen a partir del día 12 teniendo su título máximo en el día 30 (titulo de 6) y manteniéndose alrededor de este con ligera disminución hasta el día evaluado (360). En cuanto a la inducción de anticuerpos Ig específicos, se observa una respuesta a partir del día 4 y el título más alto (título de 3) se observa al día12 el cual se mantiene hasta el día 90 y a partir de este día comienza a disminuir hasta el día analizado sin desaparecer.

Con respecto a las subclases de IgG, se observaron títulos de anticuerpos hasta el día evaluado (día 360). Se llevó a cabo el análisis de las subclases de IgG y en el caso de lgG2a muestra títulos a partir del día 12 manteniéndose en este título (título de 2) hasta el último día evaluado, Para la subclase lgG2b muestra una cinética en la cual se observa un título alto (título de 8) al día 12 y este comienza a disminuir gradualmente hasta el día evaluado llegando hasta un título de 2 sin desaparecer. La subclase lgG3 mostró una cinética de anticuerpos con títulos más altos que el control, alcanzando el pico más alto (título de 5) al día 20 y comenzando a disminuir con respecto al tiempo, los títulos no desaparecen al igual que el resto de las subclases. Por su parte la inducción de lgG1 por la porina muestra su título más alto al día 12 y se mantiene con este título hasta el día evaluado. Con estos resultados podemos decir, que al igual que la porina OmpC, OmpS1 es un antígeno capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de larga duración.

Ejemplo 6. Inducción de protección contra la bacteria S. typhi utilizando la porina OmpS1.

Como se ha observado, la porina OmpS1 de S. typhi es un antígeno inmunogénico capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de larga duración, los cuales podrían mediar la protección frente a la infección. Para poder corroborar esto, se decidió inmunizar grupos de 6 ratones con 10 pg de la porina OmpS1 o 10 pg de OmpC como grupo control vía i. p.

Los grupos de ratones recibieron una reinmunización con la misma dosis al día 15. Diez días después de la reinmunización los grupos de ratones fueron infectados con 20 y 100 D.Lso por vía i.p. Se analizó el % supervivencia de los ratones durante 10 días después del reto.

La porina OmpS1 de S. typhi fue capaz de proteger en un 50 % contra el reto de 100 D.Lso y un 100% de protección con un reto de 20 D.Lso. Estos datos demuestran que la porina OmpS1 de S. typhi es un antígeno inmunogénico capaz de inducir protección frente a la infección con la bacteria.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. El uso de la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi para preparar una composición adyuvante útil para la elaboración de vacunas.

2. Una composición adyuvante útil para la elaboración de vacunas caracterizada porque contiene la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi

3. Una composición de vacuna que comprende: a) una composición adyuvante que contiene a la porina OmpS1 de Salmonella entérica serovar Typhi, y b) un antígeno o combinación de antígenos.

4. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 3, en donde el antígeno se selecciona entre el grupo de: ácidos nucleicos codificantes de péptidos, glicoproteínas, polisacáridos, proteínas de fusión, lípidos, glicolípidos, péptidos semejantes a polisacáridos, conjugados carbohidrato-proteína, células o extractos de las mismas, células muertas o atenidas o extractos de las mismas, células tumorales o extractos de las mismas, partículas virales atenuadas o componentes virales, y alergénos. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-4, en donde el antígeno se selecciona del grupo: antfgenos bacterianos, virales, fúngícos, protozoarios, priónicos, neoantígenos, antígenos asociados a tumor, y autoantígenos. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-5, caracterizada porque contiene adicionalmente un adyuvante auxiliar y excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 3-6, caracterizadas porque están adaptadas farmacéuticamente en forma de tabletas, cápsulas, soluciones, suspensiones, polvos, gránulos o aerosoles.