ES2305573T3

ES2305573T3 - Uso de metantes de quimiocinas cc ccl5/rantes contra transtornos del higado.

Info

Publication number: ES2305573T3
Application number: ES03812076T
Authority: ES
Inventors: Amanda Proudfoot; Maureen Ajuebor; Mark Swain
Original assignee: Laboratoires Serono SA
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2023-12-22
Also published as: US20060228327A1; NO20053364L; EP1575608A2; ATE394117T1; CA2507008A1; AU2003302755B2; AU2003302755A1; NO20053364D0; EP1575608B1; US7476381B2; WO2004062688A2; DE60320848D1; WO2004062688A3; JP2006514699A

Abstract

Uso de un mutante de quimiocina CC que tiene una actividad reducida de unión a GAG para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas, en donde la quimiocina CC es CCL5/RANTES y el mutante es el mutante triple de RANTES en 40''''s (SEC ID NO:1).

Description

Uso de mutantes de quimiocinas CC CCL5/rantes contra trastornos del hígado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas aplicaciones terapéuticas de mutantes de quimiocinas CC que tienen actividad reducida de unión a GAG (glicosaminoglicanos).

Antecedentes de la invención

Las quimiocinas son proteínas proinflamatorias secretadas de dimensiones pequeñas (70-130 aminoácidos) involucradas principalmente en la migración direccional y la activación de células, en especial la extravasación de los leucocitos desde la sangre a las localizaciones tisulares que necesitan el reclutamiento de estas células (Baggiolini M et al., 1987; Rossi D y Zlotnik. 2800; Fernandez EJ y Lolis E, 2802). Usualmente, las quimiocinas se producen en el sitio de una lesión, inflamación u otra alteración del tejido en forma paracrina o autocrina, desencadenando la migración y activación de tipos celulares específicos.

De acuerdo con la cantidad y la posición de las cisteínas conservadas en la secuencia, las quimiocinas se clasifican en quimiocinas C, CC, CXC y CX_{3}C. Dentro de cada una de estas familias, las quimiocinas se pueden agrupar adicionalmente de acuerdo con la homología de la secuencia completa o de segmentos específicos.

Una serie de receptores heptahelicoidales de membrana acoplados a proteínas G, son los compañeros de unión que permiten que las quimiocinas ejerzan sus actividades biológicas en las células blanco, que presentan combinaciones específicas de receptores de acuerdo con su estado y/o tipo. Se ha propuesto una nomenclatura unificada para los ligandos y receptores de quimiocinas, que originalmente fueron denominados por los científicos que los descubrieron en una forma muy heterogénea, que asocia cada una de estas moléculas a un nombre sistémico que incluye un número progresivo: CCL1, CCL2, etc. para las quimiocinas CC; CCR1, CCR2, etc. para los receptores de quimiocinas CC y así sucesivamente.

Los efectos fisiológicos de las quimiocinas provienen de un sistema complejo e integrado de interacciones concurrentes. Los receptores con frecuencia presentan una especificidad de ligando superpuesta, de modo que un único receptor puede unirse a quimiocinas diferentes, además de que una única quimiocina puede unirse a receptores diferentes. En particular, el dominio N-terminal de las quimiocinas está involucrado en la unión al receptor y el procesamiento N-terminal puede activar las quimiocinas o volver las quimiocinas completamente inactivas.

Entre todas las quimiocinas caracterizadas hasta el momento, las quimiocinas CC, tales como CCL5 (también conocida como RANTES: Appay V y Rowland-Jones SL, 2001) o CCL3 (también conocida como MIP-1 alfa, US 6.355.476), se han estudiado intensamente para identificar moléculas terapéuticamente útiles. Las variantes de las quimiocinas CC, que pierden hasta nueve aminoácidos N-terminales, han sido examinadas para determinar su actividad como inhibidores o antagonistas de las formas naturales. Estas moléculas son inactivas en los monocitos y son útiles como antagonistas de los receptores (Gong JH et al., 1996; WO 99/16877). Alternativamente, la extensión N-terminal de la quimiocina CC madura con una metionina origina una inactivación casi completa de la molécula, que también se comporta como antagonista para la molécula auténtica (WO 96/17935).

Más aún, con el fin de realizar el análisis de la estructura y función de las quimiocinas CC, se han examinado variantes que contienen sustituciones o modificaciones químicas en posiciones internas diferentes, como así también péptidos derivados de quimiocinas CC, para determinar las interacciones con los receptores u otras moléculas. Se ha descrito que algunas de estas variantes tienen propiedades de unión significativamente alteradas, y algunas veces son activas como antagonistas de quimiocinas CC, teniendo potenciales aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la infección por VIH y algunas enfermedades inflamatorias o alérgicas (WO99/33989 Nordese V et al, 2001). En particular, se han estudiado intensamente los determinantes de unión y la relevancia fisiológica de las interacciones de las quimiocinas, por medio de restos básicos específicamente ubicados, con glicosaminoglicanos (GAG) (WO 02/28410; Vives R et al., 2002; McCormack MA et al., 2003; Stringer SE et al., 2002; Fukui S et al., 2002; Laurence JS et al., 2001; Martin L et al., 2001; Koopman W y Krangel MS, 1997).

Aun cuando existen potenciales inconvenientes para utilizar quimiocinas como agentes terapéuticos (tendencia a agregarse, unión promiscua), estas moléculas ofrecen la posibilidad de una intervención terapéutica en estados patológicos asociados con dichos procesos, en particular por la inhibición/antagonismo de quimiocinas específicas y sus receptores en el ámbito de impedir el reclutamiento y la activación excesivos de células, en particular leucocitos, para una variedad de indicaciones relacionadas con enfermedades inflamatorias y autoinmunes, cánceres e infecciones bacterianas o virales (Schneider GP et al., 2001; Baggiolini M, 2001; Godessart N y Kunkel SL, 2001).

Las aplicaciones terapéuticas posibles de los compuestos relacionados con quimiocinas contra las enfermedades hepáticas han sido intensamente estudiadas, tal como se revisó recientemente (Ajuebor MN et al., 2002; Marra F. 2002, Colletti LM, 1999). En particular, la inflamación hepática específica está mediada por las células T CD4(+) activadas y dirigidas por una regulación por aumento de la expresión hepática de IFN gamma, pero los mecanismos que gobiernan la migración de las células T desde la sangre a los tejidos durante la hepatitis mediada por células T aún no están completamente comprendidos, ya que los mediadores endógenos que promueven el reclutamiento de las células T al hígado durante las enfermedades hepáticas mediadas por las células T han sido escasamente caracterizados.

Se ha demostrado que algunas quimiocinas se expresan abundantemente y son importantes para el reclutamiento de los linfocitos que infiltran el hígado en modelos animales relacionados con la hepatitis (inducida por acetaminofeno, inducida por concanavalina A, inducida por adenovirus o hepatitis B específica del virus), lo que sugiere un papel específico de estas moléculas en el desarrollo de la hepatitis (Bautista AP, 2002; Lalor PF et al., 2002; Hogaboam CM et al., 2000; Kusano F et al., 2000).

Algunos antagonistas de quimiocinas CC de amplio espectro se describieron en relación con las enfermedades hepáticas (WO 00/73327; WO 01/58916; US6495515). Las quimiocinas CXC son capaces de inducir la proliferación rápida de hepatocitos y la regeneración hepática después de una lesión (WO 01/10899). Se pueden usar antagonistas de CCR1 o MIP-1 alfa para inhibir las disfunciones hepáticas relacionadas con el injerto o con la isquemia/reperfusión (WO 00/44365; Murai M et al., 1999).

Sin embargo, en la técnica anterior no se describe ninguna eficacia terapéutica de un mutante de quimiocina CC específico aislado generado por sustitución de restos internos, contra enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas.

Compendio de la invención

La presente solicitud se refiere al uso de un mutante de quimiocina CC que tiene una actividad de unión a GAG en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas, en donde la quimiocina CC es CCL5/RANTES y el mutante es el mutante triple de RANTES en 40's (SEC ID NO:1).

Se ha hallado en forma sorprendente que un mutante de CCL5/RANTES que tiene propiedades reducidas de unión a GAG, resultantes de la sustitución de restos internos específicos, contrarresta la lesión fibrótica hepática en un modelo animal relevante.

Estas evidencias demuestran la posibilidad de usar este y otros mutantes de quimiocinas CC (tales como CCL3/
MIP-1 alfa o CCL4/MIP-1beta) que tengan similar actividad reducida de unión a GAG en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas. Se prefieren particularmente los mutantes de CCL5 que son mutantes de CCL5 con unión a GAG defectuosa generados por la mutagénesis apropiada del dominio de unión a GAG de CCL5.

Las características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción de las figuras

Figura 1: Efecto del tratamiento con un mutante de CCL5 con unión a GAG defectuosa (mutante triple de RANTES en 40's) en un modelo animal para enfermedades hepáticas basado en la administración de concanavalina A (Con A) y medición de alanina transaminasa (ALT) sérica. El asterisco indica la significación estadística de la diferencia medida (P<0,05) cuando se compara con los controles tratados con PBS.

Figura 2: Análisis del tiempo del efecto de la administración de Con A (Con A) sobre la ALT sérica (A) y sobre los niveles de MIP-1 alfa (B) en ratones.

Figura 3: Efecto del tratamiento con Con A o PBS en ratones control (MIP-1\alpha WT) y deficientes en MIP-1 alfa (MAP-1\alpha KO) sobre los niveles séricos de ALT (A) o IFN-gamma (B) en ratones. Los niveles se midieron 8 horas después de la administración de PBS o Con A. El asterisco indica la significación estadística de la diferencia medida (P<0,05) cuando se compara con los controles tratados con PBS.

Descripción detallada de la invención

El principal objeto de la presente invención es el uso de mutantes de quimiocinas CC que tienen actividad reducida de unión a GAG para el tratamiento de enfermedades fibróticas inflamatorias y/o autoinmunes hepáticas. En particular, el uso del mutante de quimiocina CC que tiene una actividad de unión a GAG para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas, en donde la quimiocina CC es CCL5/RANTES y el mutante es el mutante triple de RANTES en 40's (SEC ID NO:1). Los mutantes de quimiocinas CC ya están descritos en la técnica anterior para las quimiocinas CC CCL3/MIP-1 alfa, CCL4/MIP-1 beta o CCL5/RANTES (WO 82/28419, Laurence JS et al, 2001; Koopmann W y Krangel MS, 1997).

En particular, estos mutantes de quimiocinas CC tienen la secuencia de los descritos en la técnica anterior bajo los nombres de mutante triple de RANTES en 40's (SEC ID NO:1), mutante triple de MIP-1 alfa (SEC ID NO: 2) y mutante triple de MIP-1 beta (SEC ID NO: 3). Sin embargo es evidente que se puede usar cualquier otro mutante correspondiente de CCL3/MIP-1 alfa, CCL4/MIP-1 beta o CCL5/RANTES que tenga propiedades reducidas de unión a GAG resultantes de la sustitución de los mismos restos descritos en la técnica anterior pero con un aminoácido diferente (es decir, el resto básico está sustituido con un aminoácido no polar diferente de Ala o con un resto ácido), o resultante de una sustitución en otra(s) posiciones tal como se describe en la presente memoria.

Estos polipéptidos se pueden preparar por síntesis química, por técnicas de mutagénesis dirigida al sitio o cualquier otra técnica conocida adecuada de estas, que proporcione un conjunto finito de péptidos mutados o acortados sustancialmente correspondientes o polipéptidos que puedan ser obtenidos y examinados en forma rutinaria por los expertos en la técnica mediante las enseñanzas presentadas en la técnica anterior y en los Ejemplos de la presente solicitud de patente. Compuestos similares también pueden provenir de la técnica convencional de mutagénesis del ADN codificante, de tecnologías combinatorias a nivel de la secuencia del ADN codificante (tal como transposición de ADN, despliegue/selección de fagos), o de estudios de diseño asistidos por ordenador basados en la estructura tridimensional y otros ensayos funcionales de quimiocinas, en presencia o ausencia de GAG (Rajarathnam K. 2002; Vives R et al., 2002; McCormack MA et al., 2003; Stringer SE et al, 2003; Fukui S et al., 2002; Martin L et al., 2001).

La técnica anterior citada previamente sobre mutantes de quimiocinas CC con unión a GAG defectuosa no logra identificar enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas como indicaciones terapéuticas en las que estas moléculas puedan proporcionar un efecto beneficioso. Debido a que existen actualmente terapias sólo parcialmente efectivas y/o aceptables para tratar enfermedades tales como enfermedades hepáticas alcohólicas, hepatitis viral o autoinmune, los mutantes de quimiocinas CC descritos representan compuestos terapéuticos alternativos posiblemente mejor aceptados y eficientes que las terapias actuales.

La frase "actividad reducida de unión a GAG" o "unión defectuosa a GAG" significa que los mutantes de quimiocinas CC tienen una menor capacidad para unirse a los GAG, es decir, un menor porcentaje de cada uno de estos mutantes se une a los GAG (como sulfato de heparina) con respecto a la correspondiente molécula de tipo salvaje, medido con los ensayos de la técnica anterior mencionados previamente que describen dichos mutantes.

Además de la mutación en las posiciones específicas que llevan a la afinidad disminuida por los GAG, los mutantes de quimiocinas CC pueden incluir otras modificaciones con respecto a la molécula de tipo salvaje, que generan variantes activas de dichos mutantes de quimiocinas CC en las que se han agregado, suprimido o sustituido uno o más aminoácidos en una forma conservadora. Estas modificaciones adicionales deben estar destinadas a mantener, o aun mejorar, las propiedades de los mutantes específicos o por cualquier otro medio relevante conocido en la técnica, hacerlas igualmente útiles para tratar enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas. Otros cambios preferidos adicionales en estas variantes activas se conocen comúnmente como sustituciones "conservadoras" o "seguras", es decir, con aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares, con el fin de mantener la estructura y la función biológica del mutante de quimiocina CC. Es evidente que también se pueden realizar inserciones y supresiones de aminoácidos en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su función, en particular si las inserciones o supresiones sólo incluyen unos pocos aminoácidos, por ej. menos de 10, y con preferencia menos de tres, y no eliminar ni desplazar aminoácidos que son críticos para la conformación funcional de una proteína o un péptido.

La bibliografía proporciona muchos modelos en los que se puede realizar la selección de sustituciones conservadoras de aminoácidos sobre la base de estudios estadísticos y fisicoquímicos de la secuencia y/o la estructura de la proteína natural (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001). Los experimentos de diseño de proteínas han demostrado que el uso de subconjuntos específicos de aminoácidos puede producir proteínas plegables y activas, contribuyendo a la clasificación de las sustituciones de aminoácidos "sinónimos", que se pueden acomodar más fácilmente en la estructura proteica, y que se pueden usar para detectar homólogos y parálogos funcionales y estructurales (Murphy LR et al., 2000). Los grupos de aminoácidos sinónimos y grupos sinónimos más preferidos son los que se definen en la Tabla I.

Alternativamente, los mutantes de quimiocinas CC activos pueden contener uno o más derivados de aminoácidos no naturales que son "sinónimos" a un aminoácido natural, y son los que se definen en la Tabla II. Por "derivado de aminoácido" se entiende un aminoácido o especie química semejante a aminoácido diferente de uno de los aminoácidos naturales genéticamente codificados. En particular, el derivado de aminoácido puede contener restos alquilo lineales, ramificados o cíclicos sustituidos o no sustituidos, y pueden incluir uno o más heteroátomos. Los derivados de aminoácidos se pueden preparar de novo u obtenerse de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem AG, Suiza; Sachem, USA). Se describen en la bibliografía varias metodologías para incorporar derivados de aminoácidos no naturales en las proteínas, que utilizan sistemas de traducción in vitro e in vivo, para investigar y/o mejorar la estructura y función de las proteínas (Dougherty DA, 2000).

El término "activo" significa que dichos compuestos alternativos deben mantener las propiedades terapéuticas de los mutantes de quimiocinas CC contra las enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas descritas en la presente invención, y deben ser además aceptables y útiles para uso farmacéutico.

En otra realización, también se puede usar un polipéptido que comprende el mutante de quimiocina CC de unión a GAG defectuosa y una secuencia de aminoácidos perteneciente a una secuencia de proteína diferente de la quimiocina CC correspondiente para tratar enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas. La secuencia heteróloga está destinada a proporcionar propiedades adicionales sin deteriorar en forma considerable la actividad terapéutica. Ejemplos de dichas propiedades adicionales son un procedimiento de purificación más sencillo, una vida media de duración más prolongada en los fluidos corporales, un resto de unión adicional, la maduración por medio de una digestión endoproteolítica o la localización extracelular. Esta última característica es de particular importancia para definir un grupo de fusión específico o proteínas quiméricas incluidas en la definición anterior ya que permite que los mutantes de quimiocinas CC se localicen en el espacio donde no sólo se facilitan el aislamiento y la purificación de estos polipéptidos, sino también donde las quimiocinas CC interactúan naturalmente con los receptores y otras moléculas. El diseño de los restos, ligandos y conectores, además de los métodos y estrategias para la construcción, purificación, detección y uso de proteínas de fusión se describen ampliamente en la bibliografía (Nilsson J et al., 1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137).

Se pueden elegir secuencias proteicas adicionales entre los dominios extracelulares de proteínas unidas a membrana, regiones constantes de inmunoglobulinas, dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que contienen un péptido señal, proteínas que contienen señales de exportación. La elección de una o más de estas secuencias que se fusionan a los mutantes de quimiocinas CC es funcional para el uso, administración y/o método de preparación deseados.

Los mutantes de quimiocinas CC de unión a GAG defectuosa también se pueden proveer para el tratamiento de enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas en la forma del correspondiente precursor, sal, derivado, conjugado o complejo activo. Se pueden preferir estas formas alternativas de acuerdo con el método deseado de administración y/o producción.

Los "precursores" son compuestos que se pueden convertir en otros compuestos por procesamiento metabólico y enzimático antes o después de la administración a las células o al organismo.

El término "sales" en la presente memoria se refiere a sales de grupos carboxilo y a sales de adición con ácidos de grupos amino de los péptidos, polipéptidos o sus análogos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de zinc y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición con ácidos incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Cualquiera de dichas sales debe tener una actividad sustancialmente similar al polipéptido original.

El término "fracciones" como se usa en la presente memoria se refiere a derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos N- o C-terminales de acuerdo con métodos conocidos. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y derivados N-acilados de los grupos amino libres o derivados O-acilados de los grupos hidroxilo libres y se forman con grupos acilo como, por ejemplo, grupos alcanoílo o aroílo. Alternativamente, los derivados pueden contener grupos azúcares o fosfatos unidos a los grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoácidos. Dichas moléculas pueden provenir de procesos in vivo o in vitro que normalmente no alteran la secuencia primaria, por ejemplo modificación química de péptidos (acetilación o carboxilación), fosforilación (introducción de restos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina) o glicosilación (por exposición del péptido a enzimas que afectan la glicosilación, por ej. enzimas de glicosilación o desglicosilación de mamíferos).

El término "derivados" como se usa en la presente memoria se refiere a derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos N- o C-terminales de acuerdo con métodos conocidos. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y derivados N-acilados de grupos amino libres o derivados O-acilados de grupos hidroxilo libres y se forman con grupos acilo, como por ejemplo grupos alcanoílo o aroílo.

Alternativamente, se pueden generar conjugados o complejos útiles de los mutantes de quimiocinas CC utilizando moléculas y métodos conocidos en el arte para mejorar la detección de la interacción con otras proteínas (marcadores radioactivos o fluorescentes, biotina), la eficacia terapéutica (agentes citotóxicos, isótopos), o la eficacia de administración del fármaco, tal como polietilenglicol y otros polímeros naturales o sintéticos (Pillai O y Panchagnula R, 2001). En el último caso, se puede introducir una modificación dirigida al sitio de un resto apropiado, presente en la secuencia natural o introducido por mutación de la secuencia natural, en una posición interna o terminal. Ya se han descritos similares modificaciones para las quimiocinas (WO 02/04499; WO 02/04015; Vita C et al., 2002).

Se puede usar cualquier resto para la unión, con la condición de que sea una cadena lateral apta para la unión al polímero (es decir, la cadena lateral de un aminoácido que porta un grupo funcional, por ej. lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, etc.). Alternativamente, un resto de estos sitios se puede reemplazar con un aminoácido diferente que tenga una cadena lateral apta para la unión con el polímero. Los polímeros adecuados para estos propósitos son biocompatibles, concretamente son no tóxicos para los sistemas biológicos y muchos de estos polímeros son conocidos. Dichos polímeros pueden ser de naturaleza hidrofóbica o hidrofílica, biodegradables, no biodegradables o una combinación de estos. Estos polímeros incluyen polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido hialurónico), además de polímeros sintéticos (tales como poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos). Los ejemplos de polímeros no degradables hidrofóbicos incluyen polidimetilsiloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetilenos, polietilenos, poli(cloruros de vinilo) y poli(metacrilatos de metilo). Los ejemplos de polímeros no degradables hidrofílicos incluyen poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(alcohol vinílico), poli(N-vinilpirrolidona), polialquilenos, poliacrilamida y sus copolímeros. Los polímeros preferidos comprenden óxido de etileno como unidad repetitiva sucesiva, tales como polietilenglicol (PEG).

El método preferido de unión emplea una combinación de síntesis de péptidos y ligadura química. En forma ventajosa, la unión de un polímero hidrosoluble será a través de un conector biodegradable, en especial en la región N-terminal de una proteína. Dicha modificación actúa para suministrar la proteína en forma de "profármaco" que, tras la degradación del conector, libera la proteína sin la modificación con polímero.

Los mutantes de quimiocinas CC de unión a GAG defectuosa se pueden preparar por cualquier procedimiento apropiado de la técnica, tal como tecnologías relacionadas con ADN recombinante que implican la expresión en células eucariotas (por ej., levaduras, células de insecto o mamífero) o células procariotas. Los métodos detallados para producir los mutantes de quimiocinas CC de unión a GAG defectuosa se pueden hallar en la técnica anterior que los describió originalmente (WO 02/28419; Laurence JS et al., 2001; Koopmann W y Krangel MS, 1997), como así también en otros protocolos característicos de la bibliografía para la producción de quimiocinas (Edgerton MD et al., 2000) o técnicas comunes de biología molecular para la producción de proteínas recombinantes en células huésped procariotas o eucariotas, tales como algunos títulos de la serie "A Practical Approach" publicada por la Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).

Alternativamente, los mutantes de quimiocinas CC de unión a GAG defectuosa se pueden preparar por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, en particular por los procedimientos de síntesis química bien establecidos, que se pueden aplicar eficientemente en estas moléculas dada su corta longitud. Se describen en la bibliografía quimiocinas totalmente sintéticas, que también contienen grupos químicos adicionales, (Brown et al, 1996; Vita C et al., 2002).

Ejemplos de tecnologías de síntesis química son la síntesis en fase sólida y en fase líquida. Como ejemplo de síntesis en fase sólida, el aminoácido correspondiente al extremo N-terminal del péptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos y por repetición alternada de reacciones, una en la cual los aminoácidos con sus grupos amino y grupos funcionales de la cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno en orden desde el extremo C-terminal al N-terminal, y una en la cual se liberan los aminoácidos unidos a la resina o el grupo protector de los grupos amino de los péptidos, y en consecuencia, de este modo la cadena peptídica se extiende. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican sobre todo en el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo de grupo protector usado. Habitualmente los grupos protectores usados incluyen tBoc (terbutoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencensulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Cl2-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (ter-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis, el péptido deseado se somete a la reacción de desprotección y se remueve del soporte sólido. Dicha reacción de remoción del péptido se puede llevar a cabo con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometansulfónico para el método Boc y con TFA para el método Fmoc. Finalmente, los péptidos de longitud completa intactos se purifican y se pliegan química o enzimáticamente (incluyendo la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas) para dar los correspondientes mutantes de quimiocinas CC.

La purificación de las proteínas naturales, sintéticas o recombinantes se lleva a cabo por cualquiera de los métodos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que se puede usar con preferencia en la purificación de la proteína es la cromatografía de afinidad que utiliza anticuerpos monoclonales, heparina o cualquier otro ligando adecuado que pueda unir la proteína blanco con alta eficiencia y pueda estar inmovilizado en una matriz de gel contenida en una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se pasan a través de la columna. La proteína se unirá a la columna por medio de este ligando mientras que las impurezas pasarán a través de ella. Después del lavado, la proteína se eluye del gel por un cambio de pH o fuerza iónica. Alternativamente, también se puede usar HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución).

En la presente memoria se describe el uso de un mutante de quimiocinas CC, donde la quimiocina CC es CCL3/
MIP-1 alfa, CCL4/MIP-1 beta o CCL5/RANTES, que tiene actividad reducida de unión a GAG para la preparación de una composición farmacéutica para enfermedades inflamatorias y/o fibróticas hepáticas, en particular cuando se formula en combinación con vehículos, excipientes, estabilizantes, adyuvantes o diluyentes aceptables para uso farmacéutico.

Una lista no limitante de los trastornos que involucran daño hepático en los cuales se puede usar el mutante de quimiocina CC que tiene actividad reducida de unión a GAG incluye enfermedades hepáticas alcohólicas (cirrosis, esteatosis), una hepatitis viral, una hepatitis autoinmune o cualquier otra degeneración fibrótica hepática.

Los mutantes de quimiocinas CC se pueden usar solos o con otra composición terapéutica que actúe en forma sinérgica o de una manera coordinada/sucesiva con ellos en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias y/o fibróticas hepáticas. Por ejemplo, se han demostrado propiedades sinérgicas similares de los mutantes de quimiocinas CC en combinación con ciclosporina (WO 00/16796).

En vista de los usos y métodos reivindicados del tratamiento, se prefiere cualquier método de administración de fármaco que permita la selección del blanco del mutante de quimiocina CC de unión a GAG defectuosa. Se conocen métodos similares en la técnica y pueden involucrar la conjugación del mutante de quimiocina CC con albúmina galactosilada o manosilada (Chuang VT et al., 2002) o la síntesis de nanopartículas poliméricas a partir de un conjugado que contiene azúcar compuesto de ácido lactobiónico, polietilenglicol terminado en diamina) y ácido cólico (Kim IS y Kim SH, 2002).

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de componentes activos que es suficiente para afectar al curso y gravedad de la enfermedad, que lleva a la reducción o remisión de la patología hepática. La cantidad efectiva dependerá de la vía de administración y la condición del paciente.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en cualquier forma aceptable que cumpla con las necesidades de la modalidad de administración para tratar enfermedades hepáticas. Por ejemplo, se describe en la bibliografía el uso de materiales biológicos y otros polímeros para la administración del fármaco, además de las diferentes técnicas y modelos para validar una modalidad específica de administración, (Luc B y Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001).

"Aceptable para uso farmacéutico" abarca cualquier vehículo que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica del componente activo y que no sea tóxico para el huésped al que se administra. Los vehículos se pueden seleccionar también de almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerilo, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, que incluyen los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético (aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo). Por ejemplo, para la administración parenteral, los anteriores componentes activos se pueden formular en forma de dosis unitaria para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina sérica y solución de Ringer.

Además del vehículo aceptable para uso farmacéutico, las composiciones de la invención también pueden comprender cantidades menores de aditivos, tales como estabilizantes, excipientes, soluciones tampón y conservantes que pueden facilitar el procesamiento de los compuestos activos para dar preparaciones que se puedan usar como fármacos. Más aún, estas composiciones pueden contener otro componente activo que puede actuar en forma sinérgica o coordinada con los mutantes de quimiocinas CC.

La administración de dicho componente activo puede ser por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Otras vías de administración, que pueden establecer los efectos deseados de los componentes respectivos en el hígado, están comprendidas por la presente invención. Por ejemplo, la administración puede ser por diversas vías parenterales tales como subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, oral o bucal. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones en depósito, bombas osmóticas y similares para la administración prolongada del polipéptido a una velocidad predeterminada, con preferencia en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas.

La administración parenteral puede ser por inyección en bolo o perfusión gradual durante un tiempo. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, que pueden contener agentes o excipientes auxiliares conocidos en la técnica y se pueden preparar de acuerdo con métodos de rutina. Además, se puede administrar la suspensión de los compuestos activos en suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas que pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. Las composiciones farmacéuticas incluyen soluciones adecuadas para la administración por inyección y contienen de aproximadamente 0,01 a 99,99 por ciento, con preferencia de aproximadamente 20 a 75 por ciento del compuesto activo junto con el excipiente.

La dosis óptima del componente activo puede seleccionarse en forma apropiada de acuerdo con la vía de administración, condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, estado sanitario, tamaño), grado de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento y efecto deseado. El ajuste y manipulación de los intervalos de dosis establecidos están dentro de la capacidad de los expertos.

Usualmente una dosis diaria de componente activo puede ser aproximadamente de 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Habitualmente una cantidad de 1 a 40 miligramos por kilogramo por día suministrada en dosis divididas o en forma de liberación sostenida es efectiva para obtener los resultados deseados. La segunda administración o las posteriores se pueden realizar en una dosis, que sea igual, menor o mayor que la dosis inicial o previa administrada al individuo.

La presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones específicas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones, que puedan ser realizadas por un expertos en la técnica sin extenderse más allá del significado y propósito de las reivindicaciones.

La invención se describirá ahora por medio de los Ejemplos siguientes, que no se deben interpretar de ningún modo como una limitación de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas a continuación en la presente.

Ejemplos Ejemplo 1 Eficacia de un mutante de CCL5 diferente que tiene actividad reducida de unión a GAG en un modelo de hepatitis

La lesión hepática inducida por Concanavalina A (Con A) depende de la activación del reclutamiento de las células T CD4(+) por los macrófagos. En general, las células T son la fuerza impulsora subyacente de los trastornos hepáticos mediados inmunológicamente, haciendo, por lo tanto, que el modelo de Con-A sea altamente relevante para estudiar la fisiopatología de enfermedades tales como la hepatitis autoinmune o aguda (Takeda K et al., 2000; Tiegs G et al., 1992).

El ensayo incluye la medición de alanina aminotransferasa (ALT) sérica, una enzima hepática contenida en los hepatocitos y liberada al suero cuando estas células resultan dañadas. La ALT es el marcador más ampliamente usado en seres humanos y animales para demostrar daño y destrucción de las células hepáticas (como en la hepatitis) y, en general, la concentración de ALT se correlaciona con los cambios histológicos.

Como ejemplo de quimiocina CC que tiene una actividad reducida de unión a GAG, se eligió el mutante de CCL5 llamado mutante triple de RANTES en 40's y se expresó en E. coli y se purificó como se describió previamente (WO 02/28419).

Se trataron ratones macho C57BL/6 libres de patógenos específicos (peso corporal de 21-23 gramos; Charles River Breeding Farms) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; control de vehículo; 0,1 ml), o con uno de los mutantes de CCL5 descritos anteriormente (30 microgramos/ratón en 0,1 ml de PBS). Los ratones (5-10 por grupo) fueron inyectados por vía s.c. 1 hora antes de la inyección i.v de Con-A (Con A tipo V recién preparada, 0,25 mg/ratón en 0,1 ml de PBS; Sigma). 8 horas después de la administración de Con A y bajo anestesia con halotano, se recogió sangre para la medición de la ALT plasmática usando un kit comercial para la determinación de ALT (Sigma).

Este enfoque bioquímico para cuantificar el daño hepático mostró que el mutante triple de RANTES en 40's es capaz de reducir la concentración de ALT en suero de los animales pretratados en forma estadísticamente significativa (figura 1).

Ejemplo 2 Relevancia de la expresión de MIP-1 alfa en los modelos de ratón con Concanavalina A (no forma parte de la invención)

Se realizó un experimento de curso temporal en ratones normales para verificar si existe alguna correlación entre los niveles de ALT y la concentración de proteína hepática CCL3/MIP-1 alfa en ratones machos C57BL/6J control y ratones C57BL/6J deficientes en CCL3/ MIP-1 alfa (Cook DN et al., 1995).

Los ratones (peso corporal de 21-23 gramos; 5-6 semanas; disponibles en el comercio a través de Jackson Laboratories y Charles River Breeding Farms) se inyectaron por vía intravenosa con Concanavalina A recién preparada (Con A; 13,5 mg/kg; Sigma) en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), o con 0,1 PBS solo (control de vehículo).

Se midieron los niveles de alanina transaminasa (ALT) sérica usando un kit comercial (Sigma). Se recogió sangre de los ratones a los 30 minutos, 90 minutos, 8 horas y 24 horas después de la administración de Con A y bajo anestesia de halotano.

En un conjunto de experimentos separados, se determinaron los niveles de CCL3/MIP-1 alfa o IFN gamma hepáticos en ratones control y ratones deficientes en CCL3/MIP-1 alfa que se inyectaron con Con A o PBS solo. Los ratones se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados después de la inyección de Con A o PBS y se perfundieron los hígados con PBS estéril enfriado en hielo para eliminar los elementos de la sangre. Los hígados perfundidos individuales se homogenizaron en buffer PBS enfriado en hielo que contenía un cóctel inhibidor de proteasas (Sigma) inmediatamente después de su extracción, los homogenatos de tejido se centrifugaron dos veces y los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de 0,45 mm y se conservaron a -80ºC hasta que se usaron para la determinación de proteína. Se midieron los niveles de CCL3/MIP-1 alfa e IFN gamma hepáticos por ELISA murino específico siguiendo un protocolo publicado (Bone-Larson CL et al., 2001), y usando anticuerpos comerciales (R&D Systems). Se calculó la concentración de proteína total en los homogenatos empleando un ensayo de proteína colorimétrico comercial (Bio-Rad Laboratories).

Los datos demostraron que tanto la lesión hepática máxima, evaluada utilizando la concentración de ALT, como los niveles máximos de CCL3/MIP-1 alfa hepáticos se pueden observar a 8 horas después de la administración intravenosa de una dosis única de Con A (13,5 mg/kg). Este compuesto provocó un aumento de más de 100 veces en los niveles de ALT (figura 2A) en forma paralela con un aumento de más de cinco veces en la expresión de la proteína hepática CCL3/MIP-1 alfa (figura 2B) por encima de la inyección con PBS control.

Se examinó el efecto de la administración de Con A en ratones transgénicos que carecen del gen de CCL3/MIP-1 alfa para verificar si la deficiencia de CCL3/MIP-1 alfa altera el desarrollo de la lesión hepática inducida por Con A. En efecto, los ratones deficientes en CCL3/MIP-1 alfa exhibieron una lesión hepática significativamente menor 8 horas después de la inyección de Con A respecto de los ratones control, según se demostró bioquímicamente por una reducción significativa (aproximadamente cinco veces) del nivel de ALT (figura 3A). Más aún, la concentración hepática de IFN gamma, una de las citoquinas implicadas en la patogénesis de una hepatitis inducida por Con A, debido a que esta es producida por células T CD4(+) reclutadas al hígado (Mizuhara H et al., 1996), está significativamente reducida en ratones deficientes en CCL3/MIP-1 alfa 8 horas después de la administración de Con A, cuando se la compara con los ratones control (figura 3B).

Todos los datos se muestran como media \pm desviación típica. Para las comparaciones de las medias entre dos grupos experimentales (n=4-10 ratones por grupo) se usó una prueba t de Student no apareada, considerando un valor de P<0,05 estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron usando el programa de computación GraphPad Instat (versión 3.00).

Conclusiones

El análisis de los datos generados con el mutante CCL5 sustituido demuestra cómo se puede obtener un sorprendente efecto terapéuticamente relevante mediante un mutante de quimiocina CC único que tiene el perfil de unión específico caracterizado en la técnica anterior (WO 02/28419; Laurence JS et al., 2001; Koopmann W y Krangel MS, 1997), lo que sugiere el uso de moléculas similares para el tratamiento de enfermedades fibróticas hepáticas que involucran reacciones inflamatorias y/o autoinmunitarias. La comparación con los resultados obtenidos usando otros modelos animales para dichas enfermedades (hepatitis inducida por acetaminofeno o inducida por adenovirus), puede proporcionar una confirmación adicional de la aplicabilidad terapéutica de este mutante de quimiocina CC específico.

TABLA I

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TABLA II

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<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

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<120> MUTANTES DE QUIMIOCINAS CC CONTRA ENFERMEDADES HEPÁTICAS

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<130> WO801

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<160> 3

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 68

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<212> PRT

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<213> construcción sintética

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<220> Mutante triple de RANTES en 40's

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<221> fuente

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<212> PRT

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<213> construcción sintética

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<220> Mutante triple de MIP-1alfa

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<221> fuente

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<223>

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<212> PRT

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<213> construcción sintética

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<220> Mutante triple de MIP-1beta

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<221> fuente

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<223>

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<400> 3

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Claims

1. Uso de un mutante de quimiocina CC que tiene una actividad reducida de unión a GAG para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias fibróticas y/o autoinmunes hepáticas, en donde la quimiocina CC es CCL5/RANTES y el mutante es el mutante triple de RANTES en 40's (SEC ID NO:1).

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el mutante de quimiocina CC es una variante activa de dicho mutante de quimiocina CC en el que uno o más aminoácidos se han insertado, suprimido o sustituido en forma conservadora.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde el mutante de quimiocina CC está comprendido en un polipéptido que adicionalmente comprende una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia proteica diferente de la correspondiente quimiocina CC.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el mutante de quimiocina CC se encuentra en forma de precursor, sal, derivado, conjugado o complejo activos.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad hepática es una enfermedad hepática alcohólica, una hepatitis viral o una hepatitis autoinmune.