ES2304306A1 - Metodo de diagnostico y/o pronostico de cancer vesical. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical. La presente invención se refiere a un método in vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer vesical basado en la detección y cuantificación en fluidos vesicales de la expresión génica de determinados genes y/o sus combinaciones que actúan como marcadores genéticos de dicha enfermedad. Asimismo, se contempla un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical basado en el empleo de un set de sondas adecuado para la detección y cuantificación del patrón de expresión de dichos genes.
Description
Método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer
vesical.
La presente invención tiene su campo de
aplicación dentro del sector sanitario, principalmente en los
campos de la "Urología Oncológica" y "Biología Molecular".
En concreto, esta invención está dirigida a métodos de diagnóstico
y pronóstico del cáncer vesical.
El cáncer de vejiga, o cáncer vesical, es el
segundo tumor más frecuente del tracto
genito-urinario, después del cáncer de próstata
[Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Cancer statistics, 2002.
CA Cancer J Clin 2002; 52:23-47]. En un contexto
global representa aproximadamente el 3 y el 1%, en hombres y
mujeres respectivamente, de todas las muertes por cáncer. En
valores absolutos, esto significa que unos 95.000 hombres y unas
35.000 mujeres mueren cada año debido a esta patología. La
proporción entre incidencia y muerte es distinta dependiendo del
grado de desarrollo de cada país. Como ejemplos extremos, podríamos
comentar que en la zona de América del norte esta proporción se
encontraría próxima a 0,2, mientras que en las regiones
sub-saharianas aumentaría hasta 0,6 [Edwards BK,
Brown ML, Wingo PA et al. Annual report to the nation on the status
of cancer, 1975-2002, featuring
population-based trends in cancer treatment. J Natl
Cancer Inst 2005; 97:1407-27; Pisani P, Parkin DM,
Bray F, Ferlay J. Estimates of the worldwide mortality from 25
cancers in 1990. Int J Cancer 1999;
83:18-29].
A diferencia de otros tumores, por el momento no
se han detectado prácticamente factores genéticos familiares de
predisposición. En cambio, si se han detectado diversos factores
ambientales fuertemente relacionados con los tumores de vejiga. Uno
de los factores más importantes, no solo por su relación con la
enfermedad sino también por su incidencia en la población, es el
tabaquismo. Se ha observado que los fumadores tienen un riesgo tres
veces superior a los no fumadores de desarrollar un tumor de
vejiga. De hecho, un tercio de los tumores de vejiga se encuentran
asociados al consumo de tabaco. Desgraciadamente, los agentes
carcinógenos presentes en el tabaco aún no han sido claramente
identificados [Burch JD, Rohan TE, Howe GR et al. Risk of
bladder cancer by source and type of tobacco exposure: a
case-control study. Int J Cancer 1989;
44:622-28; Zeegers MP, Kellen E, Buntinx F, van den
Brandt PA. The association between smoking, beverage consumption,
diet and bladder cancer: a systematic literature review. World J
Urol 2004; 21:392-401].
A nivel celular podemos encontrar distintos
tipos de alteraciones en la vejiga. Existen cambios benignos como
las hiperplasias epiteliales, las metaplasias uroteliales y los
nidos de Von Brunn, entre otras. Las displasias en cambio,
corresponderían a alteraciones más o menos intermedias entre el
epitelio normal y el carcinoma. Finalmente, nos encontramos con
distintos tipos de carcinomas uroteliales en la vejiga, que podemos
dividir en adenocarcinomas, tumores escamosos y carcinomas de
células transicionales (CCT).
Más del 90% de los tumores de vejiga son CCTs.
En el momento de su diagnóstico, aproximadamente el 75% son tumores
superficiales, el 20% están invadiendo las capas musculares (CCTs
infiltrantes o invasivos) y un 5% ya son metastáticos. De los casos
superficiales, aproximadamente un 20% se curan mediante una única
intervención quirúrgica, mientras que entre un 50 y un 70% recurren
tras la cirugía una o más veces, pero nunca se transforman en
infiltrantes. Entre un 10 y un 30% de estos tumores superficiales
se transforman en infiltrantes. Éstos son tumores agresivos, de mal
pronóstico, con una mortalidad a los 5 años del 50% y en aquellos
casos metastatizados la mortalidad a dos años es del 100%
[Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Chatytonowicz E et
al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNA microarrays:
defining histogenesis and biological phenotypes. Cancer Res 2002;
62:6973-80; Adshead JM, Kessling AM, Ogden CW.
Genetic initiation, progression and prognostic markers in
transitional cell carcinoma of the bladder: a summary of the
structural and transcriptional changes, and the role of
developmental genes. Br J Urol 1998; 82:503-12;
Babaian RJ, Johnson DE, Llamas L, Ayala AG. Metastases from
transitional cell carcinoma of urinary bladder. Urology 1980;
16:142-44].
Las vías genéticas de los CCTs superficiales e
invasivos, aunque relacionadas, parecen ser bastante distintas. La
progresión más habitual en los tumores superficiales parece ser la
hiperplasia, la atipia y, finalmente, los CCTs papilares de bajo
grado. En los tumores invasivos lo más habitual es progresar desde
una atipia a una displasia, para luego pasar a un tumor in
situ (Tis) y terminar en un tumor infiltrante [Knowles MA.
What we could do now: molecular pathology of bladder cancer. Mol
Pathol 2001; 54:215-21].
Los sistemas de diagnóstico actuales se basan en
una combinación de la citología urinaria (a partir de células
descamadas en la orina) y de la observación directa de la vejiga
mediante cistoscopia. Esta última es de hecho la principal técnica
diagnóstica y de seguimiento de los tumores. Se realiza vía
transuretral, por lo que es una técnica invasiva y bastante molesta
para los pacientes. La sensibilidad y especificidad de esta técnica
se creían bastante elevadas, aunque mejoras en la propia técnica
(cistoscopia fluorescente) nos indican que probablemente no sea así
y que parte de la recurrencia observada en los tumores
superficiales podría ser debida a la falta de resección total de
partes no visibles de los mismos [Jones JS.
DNA-based molecular cytology for bladder cancer
surveillance. Urology 2006; 67:35-45]. La
citología urinaria, por su parte, es una técnica diagnóstica no
invasiva y con una alta sensibilidad y especificidad para los
tumores de alto grado. Sin embargo, esta técnica muestra
limitaciones para la detección de los tumores de bajo grado
[Bastacky S, Ibrahim S, Wilczynski SP, Murphy WM. The accuracy
of urinary cytology in daily practice. Cancer 1999;
87:118-28]. Además, la interpretación de la
citología es altamente observador-dependiente, con
lo que pueden existir diferencias inter-observador,
especialmente en los tumores de bajo grado.
Todas estas limitaciones han llevado a la
búsqueda de marcadores de cáncer de vejiga no invasivos más
fiables. Encontrar un marcador no invasivo, con una alta
sensibilidad y especificidad para el CCT de vejiga sería de gran
ayuda a la práctica clínica. De hecho, varios estudios describen
nuevos marcadores tumorales en orina, como el test para el antígeno
de tumor de vejiga NMP22 [Wiener HG, Mian C, Haitel A, Pycha A,
Schatzl G, Marberger M. Can urine bound diagnostic tests replace
cystoscopy in the management of bladder cancer? J Urol 1998;
159:1876-80; Soloway MS, Briggman V, Carpinito GA et
al. Use of a new tumor marker, urinary NMP22, in the detection of
occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the
urinary tract following surgical treatment. J Urol 1996;
156:363-67], productos de degradación de la
fibrina [Schmetter BS, Habicht KK, Lamm DL et al. A multicenter
trial evaluation of the fibrin/fibrinogen degradation products test
for detection and monitoring of bladder cancer. J Urol 1997;
158:801-5.], telomerasa [Takihana Y,
Tsuchida T, Fukasawa M, Araki 1, Tanabe N, Takeda M.
Real-time quantitative analysis for human telomerase
reverse transcriptase mRNA and human telomerase RNA component mRNA
expressions as markers for clinicopathologic parameters in urinary
bladder cancer. lnt J Urol 2006; 13:401-8],
tests basados en hibridación in situ fluorescente
[Hailing KC, King W, Sokolova IA et al. A comparison of BTA
stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for
the detection of urothelial carcinoma in urine. J Urol 2002;
167:2001-6] o citometría de flujo [Takahashi
C, Miyagawa I, Kumano S, Oshimura M. Detection of telomerase
activity in prostate cancer by needle biopsy. Eur Urol 1997;
32:494-98; Trott PA, Edwards L. Comparison of
bladder washings and urine cytology in the diagnosis of bladder
cancer. J Urol 1973; 110:664-66], pero aunque
la mayoría de ellos tienen una mayor sensibilidad que la citología
urinaria, ésta sigue siendo la más específica [Bassi P, De M, V,
De Lisa A et al. Non-invasive diagnostic tests for
bladder cancer: a review of the literature. Urol Int 2005;
75:193-200].
Conocemos que las alteraciones genéticas que
encontramos en los tumores uroteliales son elevadas y muy variadas,
por ello, la tendencia actual es la búsqueda de marcadores
genéticos (ya sea a nivel de DNA, RNA o proteínas) que nos puedan
indicar la presencia de carcinomas en la muestra analizada. Además,
sería muy interesante poder discriminar con estos mismos marcadores
la agresividad del tumor que presenta un paciente, ya que esto nos
podría permitir un tratamiento mucho más personalizado y efectivo.
Finalmente, algunos de estos marcadores podrían ser posibles dianas
terapéuticas para desarrollar nuevas drogas de lucha contra el
cáncer.
Hasta hace poco tiempo, la capacidad de análisis
de los patrones de expresión génica se encontraba limitada a pocos
genes por experimento. Nuevas tecnologías, como los microarrays de
DNA, han cambiado completamente el panorama. Actualmente, se pueden
analizar miles de genes en un único ensayo [Duggan DJ, Bittner M,
Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cDNA
microarrays. Nat Genet 1999; 21:10-14; Granjeaud S,
Bertucci F, Jordan BR. Expression profiling: DNA arrays in many
guises. Bioessays 1999; 21:781-90]. Por tanto,
han empezado a aparecer en la literatura resultados de expresión
masivos de todos los tipos tumorales, entre los que se encuentran
los tumores de vejiga [Sanchete-Carbayo M, Socci
ND, Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder cancer
using cDNA microarrays: defining histogenesis and biological
phenotypes. Cancer Res 2002; 62:6973-80; Ramaswamy
S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass cancer diagnosis using
tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 2001.
98:15149-54; Sanchez-Carbayo M,
Socci ND, Lozano JJ et al. Gene discovery in bladder cancer
progression using cDNA microarrays. Am J Pathol 2003;
163:505-16; Sanchez-Carbayo M,
Capodieci P, Cordon-Cardo C. Tumor suppressor role
of KiSS-1 in bladder cancer: loss of
KISS-1 expression is associated with bladder cancer
progression and clinical outcome. Am J Pathol 2003;
162:609-17; Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M et
al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using
microarrays. Nat Genet 2003; 33:90-96], aunque
la gran mayoría de resultados no se han hecho públicos en su
totalidad. Sin embargo, hasta el momento, los estudios que se han
realizado con marcadores específicos de cáncer de vejiga se han
centrado en uno o en muy pocos genes [Olsburgh J, Harnden P,
Weeks R et al. Uroplakin gene expression in normal human tissues
and locally advanced bladder cancer. J Pathol 2003;
199:41-49; Fichera E, Liang S, Xu Z, Guo N, Mineo R,
Fujita-Yamaguchi Y. A quantitative reverse
transcription and polymerase chain reaction assay for human
IGF-II allows direct comparison of
IGF-II mRNA levels in cancerous breast, bladder,
and prostate tissues. Growth Horm IGF Res 2000;
10:61-70; Simoneau M, Aboulkassim TO, LaRue H,
Rousseau F, Fradet Y. Four tumor suppressor loci on chromosome 9q
in bladder cancer: evidence for two novel candidate regions at
9q22.3 and 9q31. Oncogene 1999; 18:157-63].
Dado que la naturaleza de estos tumores es muy
heterogénea, parece poco probable poder identificar todos o la gran
mayoría de carcinomas con un único marcador. Así, para poder
caracterizar la mayoría de los tumores parece imprescindible
combinar varios de los mejores marcadores en algún tipo de
medida.
Por otro lado, aunque el análisis de tejido
urotelial directo sea la alternativa más cómoda para desarrollar un
método diagnóstico rutinario, sería de gran interés, como se ha
comentado anteriormente, que dicho método no fuera invasivo, ya que
éstos disminuyen la calidad de vida de los pacientes y representan
una carga económica para la sanidad mucho mayor.
Los fluidos vesicales (orina o lavado vesical)
que están en contacto con todo el epitelio vesical, y por lo tanto
con la masa tumoral, parecen una buena alternativa para la
detección de marcadores tumorales, dado que representan una manera
fácil y no invasiva de obtención de la muestra a analizar. Así, un
gran número de trabajos se ha centrado en el estudio de marcadores
tumorales en orina en busca de un método diagnóstico no invasivo
para el CCT de vejiga. De hecho, se han comercializado diferentes
tests con este objetivo (NMP22, UroVysion, ImmunoCyt,
Accu-Dx, etc.).
Una alternativa, que aún no ha sido
comercializada, es la detección del CCT de vejiga en muestras de
orina mediante la determinación de la expresión génica de marcadores
de cáncer vesical. De hecho, hay algunos estudios que sugieren la
utilidad de esta metodología, aunque se han realizado con uno o
pocos genes marcadores [Parekattil SJ, Fisher HA, Kogan BA.
Neural network using combined urine nuclear matrix protein- 22,
monocyte chemoattractant protein-1 and urinary
intercellular adhesion molecule-1 to detect bladder
cancer. J Urol 2003; 169:917-20; Eissa S, Kenawy G,
Swellam M, El Fadle AA, Abd El-Aal AA, El Ahmady O.
Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided urine
samples as diagnostic tools for bladder carcinoma. Clin Biochem
2004; 37:803-10; Larsson PC, Beheshti B, Sampson HA,
Jewett MA, Shipman R. Allelic deletion fingerprinting of urine cell
sediments in bladder cancer. Mol Diagn 2001;
6:181-88].
En respuesta a estas necesidades, los autores de
la invención, tras una importante labor de investigación, han
identificado 14 genes marcadores del tumor vesical, a partir de los
cuales han desarrollado un método de diagnóstico y pronóstico de
cáncer vesical basado en la detección y cuantificación de la
expresión génica de estos genes mediante PCR cuantitativa a tiempo
real, en RNA extraído de fluidos vesicales, y su posterior
combinación informática mediante un "sistema de alarmas".
Figura 1: Electroferogramas obtenidos con el
Bioanalyzer Agilent 2100 de las muestras de RNA intacto y
parcialmente degradado de lavado vesical (LV), tumor de vejiga (T)
y pool de muestras control (C) y gel con las bandas de los
RNAs ribosómicos (28S y 18S) de cada una de las muestras
analizadas. Los números 0, 1, 2 y 3 se asignan a las muestras
en orden creciente de degradación y para las muestras con RNA de
calidad comparable.
Figura 2: (a) Semi-matriz de
comparación entre parejas de arrays de los 100 genes más
diferencialmente expresados en cada array. La parte superior e
inferior sombreada en gris de la semi-matriz
muestra el porcentaje de genes diferencialmente expresados en común
entre las parejas de arrays de lavado vesical (LV) y entre las
parejas de arrays de tumores (T), hibridados con RNA de diferente
grado de degradación. La parte no sombreada de la
semi-matriz corresponde al porcentaje de genes
expresados diferencialmente en común entre las parejas de arrays de
lavado vesical y tumor. (b) Cluster no supervisado de todos los
clones contenidos en el microarray, incluyendo los duplicados con
intercambio de fluorocromos (dye swap) (DS).
Figura 3: Validación mediante
RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(qRT-PCR) de 4 genes (KRT20, GSN, IGF2 y CCL2)
expresados diferencialmente en los microarrays de cDNA y
relacionados con cáncer de vejiga, en 36 muestras adicionales de
lavado vesical tumoral. Los valores positivos indican
sobre-expresión en los lavados vesicales tumorales
respecto a los controles. Las muestras están agrupadas en el gráfico
en función del log2ratio según estadio y grado tumoral: tumores
superficiales de bajo grado (8 pTa y 3 pT1), tumores superficiales
de alto grado (5 pTa, 5 pT1 y 4 pTis) y tumores invasivos (9 pT2 y
2 pT4).
Figura 4: Clasificación de las muestras
mediante cluster global no supervisado (distancia euclidiana y
UPGMA). pT2_1, pT2_2 y pT2_3 (tumores infiltrantes); pT1
AG_1, pT1 AG_2 y pT1 AG_3 (tumores superficiales de alto grado);
pT1 BG_1, pT1 BG_2, pT1 BG_3 (tumores superficiales de bajo
grado).
Figura 5: Resultados de PCR cuantitativa a
tiempo real (qRT-PCR) de los pooles y las muestras
individuales contenidos en los mismos. La tabla se encuentra
dividida en ponles (parte izquierda) y en muestras individuales
(derecha). Las columnas de los pooles indican el número de
pool (No.), los niveles de expresión observados en los
microarrays (\muarrays) y los niveles cuantificados
mediante qRT-PCR (qRT-PCR).
La primera columna de las muestras individuales corresponde a la
media aritmética de las expresiones de las muestras individuales
contenidas en el pool (media), las cuales se indican
en las columnas siguientes (1-5). Cada fila
corresponde a un gen (TCN1, SORBS1, MYH11, SRPX, CRH, KRT14, RRM2,
FOSB, CEACAM6, CES1), con los diferentes niveles de expresión para
cada
pool.
pool.
Figura 6: Clasificación de las 60 muestras
individuales de fluidos vesicales mediante un cluster global no
supervisado de 384 genes (distancia euclidiana y UPGMA). La
nomenclatura de las muestras sigue la siguientes normas: si la
muestra empieza con la letra "B", se refiere a una
muestra de fluido vesical tumoral; si empieza por "CB",
se refiere a una muestra de fluido vesical control; si después del
número de muestra aparecen las iniciales "RV", se
refiere a una muestra de lavado vesical; si por el contrario
aparece la inicial "O", se refiere a una muestra de
orina y después del guión bajo se indica el grado tumoral y el
estadio patológico de la muestra tumoral. Las flechas indican una
mala clasificación de la muestra que señalan en relación a las
categorías establecidas: T_AG (tumores de alto grado);
T_BG (tumores de bajo grado), y C (controles).
Figura 7: Clasificación de las 140 muestras
individuales de fluidos vesicales mediante un cluster global no
supervisado de 96 genes (distancia euclidiana y UPGMA). Las
flechas indican una mala clasificación de la muestra que señalan en
relación a las categorías establecidas (C, controles y
T, muestras tumorales). La nomenclatura de las muestras
sigue la siguiente norma: si la muestra empieza con la letra
"B", se refiere a una muestra de fluido vesical tumoral;
si empieza por "CB", se refiere a una muestra de fluido
vesical control; si después del número de muestra aparece la
inicial "R", se refiere a una muestra de lavado vesical;
si por el contrario aparece la inicial "O", se refiere
a una muestra de orina.
Figura 8: Listado de 384 genes de
diagnóstico, pronóstico y controles endógenos para cáncer
vesical. Este listado se ha obtenido del análisis mediante
microarrays de Affymetrix de pooles de muestras de tejido
tumoral de vejiga de diferentes estadios y grados tumorales y de
muestras de mucosa vesical control.
Figura 9: Listado de 96 genes de diagnóstico,
pronóstico y controles endógenos para cáncer vesical. Este
listado se ha obtenido mediante el análisis de 60 muestras de
fluidos vesicales en tarjetas microfluídicas que contienen los 384
genes de la figura 8. Se indica el símbolo del gen y el nombre del
TaqMan Gene Expression Assay seleccionado para la tarjeta
microfluídica TaqMan Low Density Array.
Figura 10: Listado de 48 genes de
diagnóstico, pronóstico y controles endógenos para cáncer
vesical. Este listado se ha obtenido mediante el análisis de 140
muestras de fluidos vesicales en tarjetas microfluídicas que
contienen los 96 genes de la figura 9. Se indica el símbolo del gen
y el nombre del TaqMan Gene Expression Assay seleccionado para la
tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array.
El objeto de la presente invención se refiere a
un método in vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico
de cáncer vesical basado en la detección y cuantificación en fluidos
vesicales de la expresión génica de determinados genes y/o sus
combinaciones que actúan como marcadores genéticos de dicha
enfermedad.
Asimismo, es objeto de la presente invención el
empleo de dichos genes como marcadores genéticos de diagnóstico y/o
pronóstico de cáncer vesical.
Finalmente, otro objeto de la invención se
refiere a un kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical
basado en el empleo de dichos genes como marcadores genéticos de la
enfermedad.
La presente invención tiene como principal
objetivo el desarrollo de un método in vitro no invasivo
para diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical basado en la
detección y cuantificación de determinados genes que actúan como
marcadores genéticos de la enfermedad.
Para la realización del método se parte de una
muestra de fluido vesical obtenida de un sujeto sobre la que se
lleva a cabo un análisis para la detección y cuantificación del
patrón de expresión de determinados genes y/o sus combinaciones. Los
resultados obtenidos se comparan con los valores normales de
referencia para dichos genes en fluidos vesicales para así
establecer el diagnóstico y/o pronóstico.
El término "sujeto" empleado en la presente
invención se refiere a un ser humano.
La muestra de fluido vesical obtenida del sujeto
puede ser una muestra de orina o de lavado vesical y puede ser
obtenida mediante cualquier método convencional.
En la presente invención, se entiende como
método de diagnóstico de cáncer vesical a aquel que permite
detectar y cuantificar genes diferencialmente expresados entre
tumores y muestras control (de individuos sanos) (genes de
diagnóstico).
El método de pronóstico se refiere a aquellos
que permiten detectar genes diferencialmente expresados en los
diferentes tipos de tumores (genes de pronóstico), lo que permite
clasificar los tumores según agresividad y personalizar el
tratamiento en cada caso.
La clasificación tumoral de los diferentes tipos
de carcinomas de células transicionales (CCTs) se basa actualmente
en la observación macroscópica y microscópica en el laboratorio de
anatomía patológica. Mediante unas observaciones más o menos
estandarizadas, basadas en la profundidad del tumor y en el aspecto
microscópico de las células, se decide su clasificación. Estudios
moleculares recientes parecen indicar que en realidad hay dos
perfiles genéticos diferenciales que mayoritariamente separan los
tumores de tipo superficial y los tumores infiltrantes.
Así, los carcinomas superficiales de vejiga se
denominan como Ta, Tis y T1. El carcinoma Ta
es un carcinoma exofitico no invasivo o confinado al epitelio.
Tis es un carcinoma in situ (tumor superficial plano)
y T1 es un tumor que invade el tejido conectivo subepitelial
o que invade la lámina propia.
En la presente invención se emplea las siglas
AG para determinar tumores de Alto Grado y BG para
aquellos de Bajo Grado.
Los carcinomas Ta y T1 se pueden
extirpar mediante resección transuretral (RTU). Los Tis y
T1 de Alto Grado (AG), aunque son carcinomas superficiales
confinados a la mucosa, por ser tumores de Alto Grado se ha
demostrado con técnicas de biología molecular y por la experiencia
clínica, que tienen gran potencial de malignidad y de
invasión.
invasión.
Por otra parte, los carcinomas infiltrantes de
vejiga se clasifican en T2, T3 y T4. Así, T2
se refiere a un tumor que invade la capa muscular vesical. A su vez,
este tipo se divide en T2a, que invade la capa muscular
superficial o la mitad interna y T2b, que invade la capa
muscular profunda o la mitad externa. T3 se refiere a un
tumor que invade más allá de la capa muscular o que invade la grasa
perivesical. A su vez, este tipo se divide en T3a, de
invasión microscópica y T3b, de invasión macroscópica.
Finalmente T4 se refiere a un tumor que invade estructuras
adyacentes a la vejiga urinaria y que se divide a su vez en
T4a, con invasión de la próstata, útero o vagina y
T4b, con invasión de la pared pélvica o pared abdominal.
La detección y cuantificación de la expresión
génica de los genes se puede llevar a cabo mediante cualquier
técnica de Biología molecular no invasiva adecuada a los fines de
la invención, como por ejemplo microarrays de expresión, PCR
cuantitativa a tiempo real, northern blot, PCR convencional,
etc.
Concretamente, el empleo de arrays de DNA
permite obtener resultados de expresión de un número de genes muy
elevado, permitiendo testar miles de genes en cada experimento. El
empleo de esta técnica requiere grandes cantidades de RNA y de
buena calidad (no degradado).
De forma preferida, en la presente invención se
emplea la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real
(qRT-PCR) para detectar y cuantificar los genes de
diagnóstico y/o pronóstico. Esta técnica es más precisa, además de
permitir la utilización de RNA con importante grado de degradación,
sin que esto afecte al resultado final. Asimismo, permite
cuantificar el RNA específico de los genes de interés. En
realizaciones particulares, las sondas de hibridación empleadas son
sondas Taqman.
Los resultados obtenidos en la detección y
cuantificación de la expresión de los genes en la muestra de fluido
vesical, se comparan con los valores normales, de referencia, para
dichos genes en muestras procedentes de sujetos sanos. En general,
el incremento o la disminución en los niveles de los genes
marcadores se estiman mediante la comparación de los resultados
obtenidos de los análisis de las muestras correspondientes a los
sujetos del ensayo con los resultados de las muestras controles,
que se analizan en paralelo. La decisión final de clasificación de
cada muestra se lleva a cabo mediante un "sistema de alarmas"
basado en los valores de expresión de los genes marcadores, de
forma que si alguno de los valores observados muestra una
desviación muy significativa respecto a lo esperado en una muestra
control, aumenta mucho la probabilidad de que la clasificación final
sea tumoral, independientemente del gen que haya "dado al
alarma".
De forma más concreta, en un aspecto principal
de la invención, el método de diagnóstico y/o pronóstico, no
invasivo, de cáncer vesical descrito comprende recoger una muestra
de fluido vesical de un sujeto para llevar a cabo la detección y
cuantificación en dicha muestra del patrón de expresión de la
combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9,
KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10. Los
resultados obtenidos se comparan con los valores normales de
referencia para dichos genes en fluidos vesi-
cales.
cales.
De forma preferida, la muestra de fluido vesical
es orina, dado que su obtención es mucho más sencilla. No obstante,
el lavado vesical, en ocasiones, se hace de manera rutinaria y se
obtiene un RNA de mejor calidad.
El gen ANXA 10 (annexin A10) (también denominado
ANX14), localizado en 4q32.3, participa en la regulación de la
división celular y en diferentes vías de transducción de señales,
pero su función exacta todavía no ha sido determinada.
El gen C14orf78 (chromosome 14 open reading
frame 78) (también denominado AHNAK2 o KIAA2019), está localizado
en 14q32.33. Su función aún no ha sido determinada.
El gen CTSE (catepsine E) (también denominado
CATE), localizado en 1q31, codifica para una proteasa
intracelular.
El gen CRH (corticotropin releasing hormone)
(también denominado CRF), localizado en 8813, codifica para la
hormona de liberación de la corticotropina, segregada en el
hipotálamo en respuesta al estrés.
El gen IGF2 (insulin-like growth
factor 2 (somatomedin A)) (también denominado 11orf43, FLJ22066,
FLJ44734, INSIGF), localizado en 11p15.5, codifica para el factor
de crecimiento similar a la insulina.
El gen KLF9 (Kruppel-like factor
9) (también denominado BTEB1), codifica para un factor de
transcripción.
El gen KRT20 (Keratine 20) (también denominado
K20; CK20; KRT21; MGC35423), localizado en 17q21.2, codifica para
una proteína que forma parte de los filamentos intermedios
responsables de dar la estructura e integridad a las células
epiteliales.
El gen MAGEA3 (melanoma antigen family A, 3)
(también denominado HIPE; HYPD; MAGE3; MAGEA6; MGC14613), está
localizado en X828. Su función es desconocida.
\newpage
El gen POSTN (periostin, osteoblast specific
factor) (también denominado PN; OSF-2; PDLPOSTN;
MGC119510; MGC119511; periostin; RP11-412K4.1), está
localizado en 13q13.3, y tiene una función relacionada con la
movilidad celular.
El gen PPP1R14D (protein phosphatase 1,
regulatory (inhibitor) subunit 14D) (también denominado
GBPI-1; FLJ20251; MGC119014; MGC119016;
CPI17-like), está localizado en 15q15.1 y codifica
para una fosfatasa.
El gen SLC1A6 (solute carrier family 1 (high
affinity aspartate/glutamate transporter), member 6) (también
denominado EAAT4; MGC33092; MGC43671), localizado en 19p13.12,
participa en el transporte intracelular.
El gen TERT (telomerase reverse transcriptase)
(también denominado TP2; TRT; EST2; TCS1; hEST2), localizado en
5p15.33, codifica para una polimerasa de los telómeros con
actividad transcriptasa reversa.
El gen ASAM (adipocyte-specific
adhesion molecule) (también denominado ASAM; ACAM; CLMP; FLJ22415),
localizado en 11q24.1, participa en la adhesión celular.
Finalmente, el gen MCM10 (minichromosome
maintenance deficient 10 (S. cerevisiae)) (también denominado
CNA43; PRO2249; MGC126776), localizado en 10p13, codifica para una
proteína implicada en el inicio de la replicación genómica.
En otro aspecto de la invención, el método in
vitro no invasivo para diagnosticar y/o pronosticar cáncer
vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un
sujeto para llevar a cabo la detección y cuantificación en dicha
muestra del patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10,
CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10. Los
resultados obtenidos se comparan con los valores normales de
referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de la invención, el método in
vitro no invasivo de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer
vesical comprende recoger una muestra de fluido vesical de un
sujeto para llevar a cabo la detección y cuantificación en dicha
muestra de fluido vesical de la expresión de un gen seleccionado
entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones.
Los resultados obtenidos se comparan con los valores normales de
referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
Así, en un aspecto particular de la invención,
se contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en
la detección y cuantificación individual de la expresión del gen
C14orf78.
En otro aspecto particular de la invención se
contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en la
detección y cuantificación individual de la expresión del gen
KLF9.
En otro aspecto particular de la invención se
contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en la
detección y cuantificación individual de la expresión del gen
POSTN.
En otro aspecto particular se contempla dicho
método de diagnóstico y/o pronóstico basado en la detección y
cuantificación individual de la expresión del gen PPPIR14D.
En otro aspecto particular de la invención se
contempla dicho método de diagnóstico y/o pronóstico basado en la
detección y cuantificación individual de la expresión del gen
ASAM.
En otra realización particular de la invención
se contempla un método in vitro no invasivo para diagnosticar
y/o pronosticar cáncer vesical basado en la detección y
cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN,
PPP1 R14D, ASAM y sus combinaciones y, adicionalmente, al menos un
gen seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3,
SLC1A6, TERT y MCM10.
En otro aspecto de la invención se contempla un
método in vitro no invasivo centrado en el diagnóstico de
cáncer vesical que comprende recoger una muestra de fluido vesical
de un sujeto para llevar a cabo la detección y cuantificación del
patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, C14orf78,
CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y
TERT, según el método descrito anteriormente. Los resultados
obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para
dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de la invención el método in
vitro no invasivo de diagnóstico de cáncer vesical comprende
recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a
cabo la detección y cuantificación del patrón de expresión de la
combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6
y TERT. Los resultados obtenidos se comparan con los valores
normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En otro aspecto de la invención el método in
vitro no invasivo de diagnóstico de cáncer vesical comprende
recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto para llevar a
cabo la detección y cuantificación de la expresión de un gen
seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus
combinaciones. Los resultados obtenidos se comparan con los valores
normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
En una realización particular de la invención,
dicho método de diagnóstico se basa en la detección y
cuantificación del gen C14orf78.
En otra realización particular de la invención,
dicho método de diagnóstico se basa en la detección y
cuantificación del gen KLF9.
En otra realización particular de la invención,
dicho método de diagnóstico se basa en la detección y
cuantificación del gen POSTN.
En otra realización particular de la invención,
dicho método de diagnóstico se basa en la detección y
cuantificación del gen PPPIR14D.
En otra realización particular de la invención
dicho método de diagnóstico se basa en la detección y
cuantificación de la expresión de un gen seleccionado entre
C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones y,
adicionalmente, al menos, un gen seleccionado entre ANXA10, CTSE,
CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
En otro aspecto de la invención se contempla un
método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical
que comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto
para llevar a cabo la detección y cuantificación del patrón de
expresión de la combinación de genes ASAM y MCM10. Los resultados
obtenidos se comparan con los valores normales de referencia para
dichos genes en fluidos vesicales.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método in vitro no invasivo para pronosticar cáncer vesical
que comprende recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto
para llevar a cabo la detección y cuantificación de la expresión
del gen ASAM. Los resultados obtenidos se comparan con los valores
normales de referencia para dicho gen en fluidos vesicales.
En otro aspecto de la invención, se contempla el
empleo de la combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH,
IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y
MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer
vesical.
Otro aspecto de la invención se centra en el
empleo de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20,
MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o
pronóstico del cáncer vesical.
En otro aspecto de la invención se contempla el
empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN,
PPP1R14D, ASAM y sus combinaciones, como marcadores de diagnóstico
y/o pronóstico del cáncer vesical.
En una realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen C14orf78 como marcador de
diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen KLF9 como marcador de diagnóstico
y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen POSTN como marcador de diagnóstico
y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención
se contempla el empleo del gen PPP1 R14D como marcadores de
diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen ASAM como marcador de diagnóstico
y/o pronóstico del cáncer vesical.
Otro aspecto de la invención se centra en el
empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1
R14D, ASAM y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen
seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6,
TERT y MCM10, como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del
cáncer vesical.
Otro aspecto de la invención se refiere al
empleo de la combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH,
IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 y TERT como
marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
Otro aspecto de la invención se centra en el
empleo de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20,
MAGEA3, SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico del cáncer
vesical.
Otro aspecto de la invención se refiere al
empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPPIR14D
y sus combinaciones como marcadores de diagnóstico del cáncer
vesical.
\newpage
En una realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen C14orf78 como marcador de
diagnóstico del cáncer vesical.
Asimismo, en otra realización particular de la
invención se contempla el empleo del gen KLF9 como marcador de
diagnóstico del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen POSTN como marcador de diagnóstico
del cáncer vesical.
En otra realización particular de la invención,
se contempla el empleo del gen PPP1 R14D como marcadores de
diagnóstico del cáncer vesical.
En otro aspecto de la invención, se contempla el
empleo de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1
R14D y sus combinaciones, en combinación con al menos un gen
seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y
TERT, como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
En otro aspecto de la invención se contempla el
empleo de la combinación de genes ASAM y MCM10 como marcadores de
pronóstico del cáncer vesical. En otro aspecto de la invención se
contempla el empleo del gen ASAM como marcador de pronóstico del
cáncer vesical.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit
de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical que comprende un
set de sondas adecuado para la detección y cuantificación del
patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, C14orf78,
CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6,
TERT, ASAM y MCM10.
En otro aspecto de la invención, el kit de
diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical comprende un set de
sondas adecuado para la detección y cuantificación del patrón de
expresión de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20,
MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
En otro aspecto de la invención se contempla un
kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical basado en un
set de sondas adecuado para la detección y cuantificación de un gen
seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus
combinaciones.
En una realización particular de la invención,
dicho kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical, basado
en el set de sondas para la detección y cuantificación de un gen
seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM y sus
combinaciones, comprende adicionalmente un set de sondas adecuado
para la detección y cuantificación de un gen seleccionado entre
ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLCIA6, TERT y MCM10.
En otro aspecto de la invención, se contempla un
kit de diagnóstico del cáncer vesical, basado en un set de sondas
adecuado para la detección y cuantificación del patrón de expresión
de la combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9,
KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT.
En otro aspecto de la invención, el kit de
diagnóstico del cáncer vesical, comprende un set de sondas adecuado
para la detección y cuantificación del patrón de expresión de la
combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6
y TERT.
En otro aspecto de la invención se contempla el
kit de diagnóstico del cáncer basado en un set de sondas adecuado
para la detección y cuantificación de un gen seleccionado entre
C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D y sus combinaciones.
En otro aspecto de la invención, dicho kit,
basado en el set de sondas adecuado para la detección y
cuantificación de un gen seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN,
PPP1 R14D y sus combinaciones, comprende, adicionalmente, sondas
adecuadas para la detección y cuantifiación de al menos un gen
seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y
TERT.
En otro aspecto de la invención se contempla un
kit de pronóstico del cáncer vesical, basado en un set de sondas
adecuado para la detección y cuantificación del patrón de expresión
de la combinación de genes ASAM y MCM10.
En otro aspecto de la invención, el kit de
pronóstico se basa en una sonda adecuada para la detección y
cuantificación del gen ASAM.
En la tabla 1 se pueden observar los 14 genes
identificados como marcadores genéticos de diagnóstico y/o
pronóstico de cáncer vesical. Los genes ASAM y MCM10 son los 2
genes específicos para pronóstico.
A continuación se presentan algunos ejemplos que
sirven para ilustrar pero no limitar la presente invención.
Para llevar a cabo el objetivo final de la
invención, en primer lugar fue necesario conocer el impacto que
tenían diferentes niveles de degradación del RNA en los perfiles de
expresión génica, dado que la calidad del RNA obtenido de los
fluidos vesicales (orina y/o lavado vesical) es generalmente baja.
También debía determinarse si los perfiles de expresión génica
obtenidos de los fluidos vesicales se correspondían con los
obtenidos en los correspondientes tumores.
Se seleccionó una muestra de tejido tumoral (T)
y de lavado vesical (LV) de un mismo paciente diagnosticado como
pT2 alto grado (G3) [según los métodos descritos en
Lopez-Beltran A, Sauter G, Gasser T, Hartmann A,
Schmitz-Dräger BJ, Helpap B, Ayala AG, Tamboni P,
Knowles MA, Sidransky D, Cordon-Cardo C, Jones PA,
Cairns P, Simon R, Amin MB, Tyczynsky JE. Tumours of the Urinary
System. In: Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Sesterhenn IA (eds.),
Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male
Genital Organs. World Health Organization Classification of Tumours.
Lyon: IARC Press; 2004: 89-157; Sobin LH, Wittekind
CH. TNM Classification of Malignant Tumours. International Union
Against Cancer., 6th ed. New York: Jonh Wiley & Sons;
2002]. Se extrajo el RNA de ambas muestras (T0 y LV0) con TRIzol
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del
proveedor. Seguidamente, se degradaron alícuotas de ambos RNAs (T0
y LV0) incubándolos a 80ºC durante 15 (T1 y LV1), 30 (T2 y LV2) y
60 (T3 y LV3) minutos, obteniendo tres niveles de degradación, tal
y como se describe en Xiang CC, Chen M, Ma L et al. A new
strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for
microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31:53, con la
excepción de que se utilizó agua en vez de un tampón básico.
También se recolectaron muestras de mucosa
vesical sana de 4 pacientes sin evidencia de patología vesical
(muestras control), se obtuvo RNA de la misma manera que se
procedió con las muestras anteriores y se mezclaron los 4 RNAs en
proporciones equimolares (C0).
Un \mul de cada uno de los RNAs, intactos y
degradados, se analizaron en el Bioanalyzer Agilent 2100
Bioanalyzer para determinar la calidad de cada RNA (según el método
descrito en Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V et al. Towards
standardization of RNA quality assessment using
user-independent classifiers of microcapillary
electrophoresis traces. Nucleic Acids Res 2005; 33:e56) (Figura
1). En la figura 1 también se muestra el gel con las bandas de los
RNAs ribosómicos (28S y 18S) de cada una de las muestras analizadas
donde se observa la degradación progresiva de estas bandas.
Por otro lado, se recolectaron 36 lavados
vesicales tumorales (8 pTa bajo grado (BG), 5 pTa alto grado (AG),
3 pT1 BG, 5 pT1 AG, 4 pTis, 9 pT2 AG and 2 pT4 AG) y 14 lavados
vesicales controles de pacientes sin patología vesical y se extrajo
el RNA de la misma manera que en los casos anteriores.
Se amplificaron 5 \mug de RNA intacto (T0 y
LV0) y degradado (T1, T2, T3, LV1, LV2 y LV3) mediante la
utilización de cebadores de secuencia al azar de 9 nucleótidos
(random nonamer primers) modificados por la adición en 3' de
la secuencia promotora del T3 (T3N9) (según Xiang CC, Chen M, Ma
L et al. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue
samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31:e53).
Las sondas se sintetizaron mediante un método de marcaje directo
(según Richter A, Schwager C, Hentze S, Ansorge W, Hentze MW,
Muckenthaler M. Comparison of fluorescent tag DNA labeling methods
used for expression analysis by DNA microarrays. Biotechniques
2002; 33:620-8, 630).
Se utilizaron los Oncochip-v2
glass human cDNA microarrays
(http://grupos.cnio.es/genomica/arrays/reports/
ochip v2.xls) para co-hibridar cada una de las cuatro alícuotas de RNA progresivamente degradadas, tanto de tumor como de lavado vesical (T0, T1, T2, T3, LV0, LV1, LV2 y LV3), con el pool de los RNAs provenientes de las muestras de mucosa vesical sana (CO). Las imágenes fluorescentes se obtuvieron con el G2565BA Microarray Scanner System (Agilent, Technologies, Waldbronn, Germany) y las imágenes TIFF fueron cuantificadas utilizando el programa Spot (http://experimental.act.cmis.csiro.au/Spot) bajo el entorno estadístico R (http://www.r-proyect.org). La medida final de intensidad de cada punto del microarray fue calculada tal y como se había sugerido previamente (http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/image.html) (datos accesibles públicamente en la base de datos GEO; GSE3192). Finalmente se obtuvieron 1111 clones válidos que cumplían todos los criterios de calidad y se escogieron los 100 más diferencialmente expresados de cada array para comparar entre arrays y calcular los porcentajes de genes en común entre ellos. Se detectó un elevado porcentaje de genes en común diferencialmente expresados entre los arrays de tejido tumoral (85 al 91%) y entre los arrays de lavado vesical (78 al 93%) (Figura 2a), lo que indicaba que degradación del RNA prácticamente no afectaba los perfiles de expresión génica.
ochip v2.xls) para co-hibridar cada una de las cuatro alícuotas de RNA progresivamente degradadas, tanto de tumor como de lavado vesical (T0, T1, T2, T3, LV0, LV1, LV2 y LV3), con el pool de los RNAs provenientes de las muestras de mucosa vesical sana (CO). Las imágenes fluorescentes se obtuvieron con el G2565BA Microarray Scanner System (Agilent, Technologies, Waldbronn, Germany) y las imágenes TIFF fueron cuantificadas utilizando el programa Spot (http://experimental.act.cmis.csiro.au/Spot) bajo el entorno estadístico R (http://www.r-proyect.org). La medida final de intensidad de cada punto del microarray fue calculada tal y como se había sugerido previamente (http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/image.html) (datos accesibles públicamente en la base de datos GEO; GSE3192). Finalmente se obtuvieron 1111 clones válidos que cumplían todos los criterios de calidad y se escogieron los 100 más diferencialmente expresados de cada array para comparar entre arrays y calcular los porcentajes de genes en común entre ellos. Se detectó un elevado porcentaje de genes en común diferencialmente expresados entre los arrays de tejido tumoral (85 al 91%) y entre los arrays de lavado vesical (78 al 93%) (Figura 2a), lo que indicaba que degradación del RNA prácticamente no afectaba los perfiles de expresión génica.
También se realizó un cluster no supervisado de
todos los clones contenidos en el microarray utilizando UPGMA
(Unweighted Pair-Group Meted with Arithmetic Mean) y
la correlación de Pearson. Este cluster indicaba que el porcentaje
de genes en común identificados entre 2 arrays hibridados con RNA
de diferente nivel de degradación (por ejemplo, LV0 y LV1), era en
ocasiones más alto que el porcentaje entre duplicados dye
swap (DS) del mismo array (por ejemplo, LV0 vs
LV0-DS) (Figura 2b), lo que reforzaba la conclusión
de que los perfiles de expresión génica no quedaban prácticamente
alterados al trabajar con RNA parcialmente degradado.
Para determinar si los perfiles de expresión
génica obtenidos de las muestras de lavado vesical se correspondían
con los obtenidos en el correspondiente tumor, se comparó el
porcentaje de genes en común diferencialmente expresados entre los
arrays de tejido tumoral y los de lavado vesical. Se obtuvo una
elevada similaridad entre el tumor y el lavado vesical (52 al 60%)
y esta similaridad resultó ser independiente del estado de
degradación del RNA.
En conclusión, estos datos sugirieron que el RNA
parcialmente degradado de lavado vesical podía ser utilizado para
estudios de expresión génica utilizando microarrays y que este RNA
es un reflejo de la expresión génica del tumor.
Para validar que los resultados obtenidos en los
microarrays de un paciente particular eran extrapolables a una
cohorte más larga, se analizaron mediante qRT-PCR 4
genes diferencialmente expresados en los arrays y que estaban
relacionados con el proceso de carcinogénesis vesical según la
literatura (KRT20, IGF2, GSN y CCL2). Para esta validación
se utilizaron 36 lavados vesicales tumorales adicionales y 14
lavados vesicales controles.
El cDNA se sintetizó a partir de 1 ug de RNA
utilizando el High-Capacity cDNA Archive Kit
(Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones
del proveedor, excepto que se disminuyó el volumen final de la
reacción a 50 \mul. El gen GUSB se utilizó como control
endógeno. Las PCRs se realizaron utilizando
Assays-on-Demand^{TM} Gene
Expression Products en un ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems,
Foster City, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor,
excepto que el volumen de la reacción se disminuyó a 20 \mul.
El método del \Delta\DeltaCt (ABI PRISM 7700
Sequence Detection System User Bulletin #2: Relative Quantification
of Gene Expression P/N 4303859) se utilizó para calcular la
cantidad relativa de expresión de cada gen en relación a un promedio
de la expresión de las 14 muestras controles. Para establecer el
valor de referencia en los controles se obtuvo la media aritmética
de los valores de expresión de los 14 lavados vesicales controles
provenientes de pacientes sin patología vesical.
Los resultados de este análisis, expresados como
log2ratio, definido como la proporción o división (ratio) entre las
2 condiciones comparadas (en este caso el control endógeno contra
cada gen indicado) expresado como logaritmo en base 2, confirmaron
los resultados de los microarrays en un 81% de las muestras para
KRT20, en un 89% para GNS, en un 64% para IGF2 y en
un 89% para CCL2 (Figura 3). La elevada concordancia entre
los datos de microarrays obtenidos del análisis de un solo paciente
y los de qRT-PCR obtenidos del análisis de una
cohorte de 36 pacientes adicionales confirmaban que los perfiles de
expresión génica obtenidos en los microarrays no eran debidos al
análisis de un solo paciente.
Es posible la utilización de RNA de lavado
vesical para inferir los perfiles de expresión génica de los
correspondientes tumores vesicales, tanto mediante microarrays de
cDNA como de qRT-PCR.
Una vez conocido que era posible determinar los
perfiles de expresión génica en las muestras de fluido vesical, el
siguiente objetivo era obtener datos propios de expresión génica lo
más extensos posibles. La estrategia que nos propusimos seguir fue
empezar analizando la mayor cantidad posible de genes en un numero
reducido de muestras, para en fases sucesivas ir analizando
progresivamente cada vez una cantidad menor y más seleccionada de
genes en una serie más extensa de muestras.
El protocolo a su vez pasaba por el
establecimiento de unos controles de calidad muy estrictos en todos
los pasos críticos del proceso. Esto incluía la obtención de las
muestras biológicas con las características deseadas en el
quirófano, por parte de los cirujanos del equipo de la Fundació
Puigvert, el almacenaje y conservación de las muestras en las
condiciones adecuadas, el análisis
anatomo-patológico de las muestras y el procesado
molecular por el equipo de laboratorio.
Las muestras de tejido fueron obtenidas en
quirógrafo utilizando un resector de pinza fría (muestras
tumorales) o directamente con tijeras (muestras control). Parte del
tejido obtenido fue inmediatamente congelado a -80ºC hasta ser
procesados posteriormente para la extracción de RNA y la parte
restante fue enviado al departamento de Anatomía Patológica para su
análisis anatomo-patológico. Para la extracción de
RNA los tejidos fueron homogeneizados mecánicamente y los RNAs
fueron extraídos siguiendo el protocolo del TRIzol (Invitrogen,
Calsbad, CA, USA). Finalmente, los RNAs se cuantificaron midiendo
espectrofotométricamente la absorbancia a 260 nm.
Dado que los tumores superficiales y los
invasivos parecen tener perfiles genéticos distintos, se decidió
comparar los grupos tumorales más extremos (superficiales de bajo
grado versus infiltrantes). Además también decidimos averiguar el
perfil molecular de un tipo de tumor de comportamiento clínico poco
claro, ya que son superficiales pero con un alto grado de
aberraciones celulares (clasificados como T1 de alto grado, pT1 AG)
y en muchos casos (alrededor del 50%) acaban siendo infiltrantes.
Así se definieron cuatro grupos de estudio:
- -
- Grupo 1; muestras de tumores superficiales de bajo grado (BG) y que invadiesen solamente la mucosa vesical (patológicamente clasificadas como pTa BG).
- -
- Grupo 2: muestras de tumores superficiales de alto grado (AG) y que invadiesen el tejido conectivo subepitelial (patológicamente clasificadas como pT1 AG).
- -
- Grupo 3: muestras de tumores infiltrantes (patológicamente como mínimo pT2) y alto grado.
- -
- Grupo 4: muestras de mucosa vesical sana (control).
Con la intención de reducir la varianza
biológica, que era bastante elevada, se realizaron pooles de
muestras de un mismo tipo tumoral, es decir, con una misma
clasificación anatomo-patológica. Así se realizaron
3 pooles de 4-5 muestras tumorales para cada
uno de los grupos; pTa BG, pT1 AG, pT2 AG y controles.
Aunque anteriormente se había trabajado con una
plataforma de microarrays basados en cDNA, era conocido por la
bibliografía que existían otras plataformas comerciales basadas en
oligonucleotidos que permitirían obtener resultados de expresión de
un número de genes más elevado. Finalmente, se decidió utilizar la
plataforma de Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx),
dado que eran muchos los datos de los que se disponía en las bases
de datos públicas para esta plataforma, prácticamente todas las
referencias comentaban su alta calidad de resultados y acababa de
salir al mercado un nuevo microarray (U133 plus 2.0) que permitía
determinar la expresión génica de la gran mayoría de los genes
humanos.
Los microarrays de Affymetrix fueron hibridados
y escaneados por una compañía especializada (Progenika) y los datos
crudos de expresión (o ficheros cel) fueron directamente analizados
por nosotros bajo el entorno estadístico R utilizando el algoritmo
RMA (Robust Multi array Analysis).
Una vez obtenidos los datos normalizados de
expresión para cada clon se decidió estudiar como se agrupaban las
distintas muestras que habíamos seleccionado realizando un cluster
no supervisado (Figura 4). En éste se podía observar que todos los
controles agrupaban juntos y claramente diferenciados de los
tumores, lo que indicaba que existen muchos genes diferencialmente
expresados entre tumores y controles (genes de diagnóstico). Por
otro lado, también se observa que los 3 pooles de tumores
infiltrantes (pT2_1, pT2_2 y pT2_3) y tumores superficiales de alto
grado (pT1 AG_1, pT1 AG_2 y pT1 AG_3) agrupan juntos y
diferenciados de los 3 pooles de tumores superficiales de
bajo grado (pT1 BG_l, pT1 BG_2, pT1 BG_3), lo que debería permitir
localizar genes marcadores de una u otra vía (genes de
pronóstico).
Como sistema de clasificación (ranking)
para comparar los distintos grupos y obtener los mejores genes
diferencialmente expresados se decidió utilizar la proporción entre
el valor de intensidad máximo del grupo con la menor media y el
valor de intensidad mínimo del grupo con la mayor media, en escala
logarítmica. Esta medida es equivalente al menor nivel de cambio
(minimum fold change) que podríamos obtener comparando
cualquier réplica de un grupo contra cualquier réplica del otro
grupo. El resultado final que obtuvimos fueron literalmente miles
de genes con diferencias de expresión entre tumores y controles
suficientemente significativas.
Una vez ordenados los genes, de más a menos
diferencialmente expresados, se decidió verificar los resultados
obtenidos con una técnica completamente independiente y, según la
literatura, mucho más precisa, la PCR cuantitativa a tiempo real
(qRT-PCR). Se seleccionaron 10 de los genes más
diferencialmente expresados para realizar esta verificación técnica
y se cuantificó su expresión génica mediante qRT-PCR
tanto usando exactamente los mismos pooles hibridados en los
microarrays (para poder comparar los resultados de ambas técnicas),
como utilizando las muestras individuales de cada pool (para
poder estudiar la replicabilidad de la propia técnica de
qRT-PCR) (Figura 5). En la comparación entre
microarrays y qRT-PCR obtuvimos un coeficiente de
regresión de 0.978, lo que nos indicaba una muy buena
replicabilidad entre las 2 técnicas. Cuando comparamos las medias
aritméticas de las muestras individuales obtenidas mediante
qRT-PCR y su expresión en los pooles mediante
la misma técnica el coeficiente de regresión fue de 0.995, lo que
confirmaba los datos bibliográficos de que la cuantificación
mediante qRT-PCR tiene una calidad técnica
excelente.
Teniendo en cuenta los resultados observados
mediante la cuantificación de la expresión génica utilizando dos
técnicas completamente independientes en un pequeño grupo de genes,
podemos extrapolar que las expresiones observadas mediante
microarrays parecen ser suficientemente fiables como para ser
utilizadas para definir un grupo de genes candidatos robusto para
un análisis posterior más extenso y específico. Paralelamente, se
concluyó que aunque los microarrays eran adecuados para cuantificar
las expresiones génicas, la qRT-PCR era aún más
precisa, además de permitir unos niveles de degradación del RNA
mayores en la muestra sin que esto perjudicara el resultado
final.
final.
El objetivo final de este estudio era
seleccionar un conjunto reducido de genes relacionados con CCT de
vejiga y que al cuantificar su expresión se obtuviera información
diagnóstica y pronóstica del tumor. Para ello, se ha comprobado que
se pueden utilizar dos técnicas; los microarrays de DNA y la PCR
cuantitativa a tiempo real. Mediante la tecnología de microarrays
se testan miles de genes en cada experimento y se necesita mayor
cantidad de RNA y de mejor calidad para realizar los experimentos
que con la metodología de la qRT-PCR. Además, ésta
última es una tecnología más precisa y se puede cuantificar el
número exacto de genes de interés. Por ello se decidió utilizar en
las siguientes fases del estudio la tecnología TaqMan Low Density
Arrays (TLDA), basada en qRT-PCR.
Las TLDA son tarjetas microfluídicas que
contienen liofilizados los primers y la sonda TaqMan para un
máximo de 384 genes (existen diferentes configuraciones de TLDA que
permiten analizar en una misma tarjeta desde 384 genes y una sola
muestra hasta 48 genes y 8 muestras). Por lo tanto, de los
experimentos realizados previamente mediante microarrays de
Affymetrix hibridados con RNA de tejido se tenía que seleccionar un
sub-conjunto de 384 genes. Se seleccionaron los
genes más diferencialmente expresados entre tumores y controles
(genes de diagnóstico) y también aquellos genes diferencialmente
expresados entre los tres grupos tumorales: pTa BG, pT1 AG y pT2 AG
(genes de pronóstico).
Por otro lado, dado que uno de los objetivos del
proyecto era trabajar con fluidos vesicales, en esta fase del
proyecto se pretendía poder estudiar estos 384 genes no con RNA de
tejido, como se había estado haciendo hasta ahora, sino directamente
con fluidos vesicales (orina o lavados vesicales).
Las muestras de lavado vesical fueron recogidas
por barbotage intraoperatoriamente, antes de la resección del tumor
vesical o antes de la cistectomía. Las muestras de orina fueron
recogidas por micción espontánea antes de que el paciente entrase en
la cirugía. Tanto las muestras de lavado vesical como las de orina
eran transportadas al laboratorio en hielo inmediatamente después
de ser recogidas. Las muestras se mezclaban con 1/25 volúmenes de
0.5M EDTA, pH8.0 y se centrifugaban a 1000 Xg durante 10 minutos.
Los pellets celulares se resuspendían en 1 ml de TRIzol (Invitrogen,
Calsbad, CA, USA) y se congelaban a -80ºC hasta la extracción del
RNA.
Se recogieron y almacenaron 425 muestras de
lavado vesical tumoral, 30 muestras de lavado vesical control, 43
muestras de orinas tumorales y 158 muestras de orinas
controles.
Los RNAs fueron extraídos siguiendo el protocolo
del TRIzol (Invitrogen, Calsbad, CA, USA) y se cuantificaron
midiendo espectrofotométricamente la absorbancia a 260 nm.
El cDNA se sintetizó a partir de 1 ug de RNA
utilizando el High-Capacity cDNA Archive Kit
(Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las instrucciones
del proveedor, excepto que se disminuyó el volumen final de la
reacción a 50 \mul.
Una vez conocidos los genes de interés, se
seleccionaron los primers y sonda fluorescente (TaqMan
Assays-on-Demand^{TM} Gene
Expression Products) para la cuantificación de la expresión génica
mediante qRT-PCR en la web de Applied Biosystems
(http://www.appliedbiosystems.com/).
Se configuró una tarjeta multifluídica (TaqMan
Low Density Array, TLDA) que contenía 384 ensayos que correspondían
tanto a genes de diagnóstico, como a genes de pronóstico, como a
los genes controles endógeno (figura 8). Esta configuración de TLDA
permite analizar una sola muestra por tarjeta. En la tabla de la
figura 8 se indica el nombre y símbolo del gen, así como el clon de
Affymetrix en el que se encontró la expresión diferencial del gen.
También se define el nombre del TaqMan Gene Expression Assay
(http://www.appliedbiosystems.com/) seleccionado para la
tarjeta microfluídica TaqMan Low Density Array. Este nombre de
ensayo a su vez está indicando la región génica que se amplificará
en la qRT-PCR. Finalmente, se indica uno de los
transcritos mayoritarios que se amplificará con este ensayo (Ref Seq
o Gene Bank mRNA).
Las PCRs se realizaron en un ABI PRISM 9700 HD
SDS (Applied Biosystems, Foster City, USA) siguiendo las
instrucciones del proveedor.
Se analizaron mediante TLDA de 384 genes un
total de 60 muestras:
- -
- 39 muestras de lavado vesical tumoral 15 muestras de lavado vesical control
- -
- 3 muestras orina tumoral
- -
- 3 muestras de sangre periférica; esto se realizó dado que en el análisis anterior, basado en microarrays de Affymetrix, habíamos observado contaminación de tejido muscular en las supuestamente muestras puras de mucosa vesical y teníamos indicios para sospechar que en las muestras de fluidos vesicales pudiese haber contaminación debida al sistema inmune. Por ello se decidió analizar 3 muestras de linfocitos para poder eliminar por comparación aquellos genes que se expresasen mucho en sangre (dado que la sangre sería un contaminante constante en las muestras de fluido vesical procedente de pacientes con tumor vesical).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez realizadas todas las PCRs se
establecieron los niveles de corte (thresholds) y niveles
basales (baseline) más apropiados para cada gen y se
calcularon los Ct (cicle threshold) o datos de expresión
crudos mediante el programa SDS 2.1 (Applied Biosystems).
Posteriormente, se calculó la medida de
expresión relativa de cada gen o delta Ct (Ct del gen diana - Ct
del control endógeno, GUSB en nuestro caso) y se estudió como
se agrupaban las muestras individuales mediante un cluster no
supervisado (usando distancias euclidianas y UPGMA) (Figura 6). El
primer nivel de clasificación que se observa en este cluster es la
diferenciación entre las 3 muestras provenientes de sangre
periférica y las muestras de los fluidos vesicales (lavados
vesicales y orinas). Por otro lado, los fluidos vesicales se
sub-agrupan en un conjunto de muestras que agrupan
en parte superior del cluster (desde la muestra
B155-RV_T2alto hasta la
B288-RV1_TaG2alto) y que está formado sólo por
muestras de fluidos vesicales tumorales, y otro conjunto de
muestras en la parte inferior del cluster (a partir de la muestra
B71-RV_TaG2bajoCIS hasta la
B109-RV_T2alto) que está formado por una mezcla de
fluidos vesicales tumorales y controles. A su vez, dentro del
cluster superior podemos diferenciar entre tumores de alto grado y
bajo grado, mientras que en el inferior aparece una agrupación con
casi sólo muestras controles y otra con mezcla de controles y
tumores. Se ha de tener en cuenta que se ha pasado de analizar
tejido en ponles a fluidos vesicales en muestras individuales, por
lo que era relativamente previsible esta pérdida de potencia de
discriminación mediante cluster.
El objetivo de este análisis era reducir el
número de genes a estudiar en la siguiente fase, con un número
mayor de muestras, de 384 a 96. Para el proceso de selección de los
mejores genes se tuvieron en cuenta distintos parámetros, entre
ellos el estadístico descrito anteriormente (minimum fold
change), pero también la proporción en escala logarítmica de
las medianas de los 2 grupos comparados (median fold change)
y un análisis manual individualizado por genes de los distintos
valores de intensidad. Esto nos permitió reducir el grupo inicial
de 384 genes a los 96 genes que requeríamos para la siguiente fase
de experimentos (figura 9).
En esta fase de nuestro trabajo el objetivo era
conseguir aumentar la potencia de discriminación entre muestras
tumorales y controles. Para ello, pretendíamos analizar un número
mayor de muestras de fluido vesical y reducir, si era posible, al
menos a la mitad el número de genes en los que se debería basar el
prototipo inicial de nuestro sistema de diagnóstico y
pronóstico.
Las tarjetas multifluídicas (TaqMan Low Density
Arrays) que contenían 96 ensayos (figura 9) se configuraron y
procesaron de la misma manera que se hizo con las de 384 genes, con
la diferencia que esta configuración de TLDA permite analizar 4
muestras por tarjeta.
Se analizaron mediante TLDA de 96 genes un total
de 80 muestras:
- -
- 42 muestras de lavado vesical tumoral
- -
- 8 muestras de lavado vesical control
- -
- 15 muestras orina tumoral
- -
- 15 muestras orina control
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que la tecnología utilizada en la fase
anterior de experimentos (ejemplo 3) era exactamente la misma que
en este ejemplo y los genes analizados en esta fase estaban ya
incluidos en las TLDA de 384 genes analizadas previamente, se
decidió extraer y sumar las 60 muestras del ejemplo 3, con los
datos de las nuevas 80 muestras (Total= 140 muestras).
Se realizó un primer análisis mediante cluster
no supervisado de las 140 muestras con las expresiones de los 96
genes y pudimos observar 2 grandes grupos claramente diferenciados
(Figura 7). En el primer grupo (parte inferior) todas las muestras
son tumorales sin excepción. En cambio, en el segundo grupo (parte
superior) la mayor parte de muestras son controles, pero hay
algunas muestras tumorales, con un perfil genético no distinguible
de las muestras normales. La conclusión que se podía extraer de
este resultado era que la mayor parte de tumores presentaban unos
perfiles genéticos característicos y diferenciados de las muestras
control, aunque había algunos casos en los que el perfil general no
se distinguía de una muestra normal y, por tanto, no podrían ser
detectados. Estábamos observando otra vez el mismo efecto que para
el ejemplo 3, aunque ahora nuestra capacidad de discriminación en
las muestras era superior.
Basándonos en los datos que se habían observado
de los clusters y en análisis exploratorios propios intentando
utilizar otros algoritmos de clasificación (como análisis lineal
discriminante, k-nearest neighbor (KNN), etc.) se
pudo observar que el problema de la discriminación de algunos
tumores respecto a las muestras control persistía. La nueva
hipótesis de trabajo fue que cualquier sistema de cálculo global de
una medida discriminatoria utilizando un grupo de genes concreto
tendría el mismo problema. Este consistía en que, debido a la
elevada heterogeneidad de los tumores, resultaba relativamente
fácil reconocer los perfiles de la mayoría, que tendrían
alteraciones mayoritariamente parecidas, aunque siempre habría una
minoría de casos para los que el comportamiento global de los genes
seleccionados para su análisis no se distinguiría de las muestras
controles, ya que tendrían alteradas vías minoritarias.
Para detectar tanto los tumores mayoritarios
como los minoritarios, se estableció un "sistema de alarmas"
mediante el establecimiento de un rango de valores entre los que
oscilaban las muestras control y añadiendo un intervalo de confianza
de manera que se pudiera determinar un punto a partir del cual una
expresión que estuviera por encima (o por debajo en caso de los
genes infraexpresados) fuera indicativa de tumor,
independientemente de los valores de expresión observados en los
otros genes. La ventaja de este sistema es que, aunque el tumor
presente perfiles generales de expresión parecidos a muestras
sanas, si uno de los genes alarma se dispara, permite afirmar que
nos encontramos frente a una muestra tumoral.
El primer paso en el desarrollo de dicho sistema
fue la estimación de los rangos de expresión de los controles y sus
intervalos de confianza. Ya que ahora era muy importante que en los
valores controles no hubiera errores técnicos, que alterarían
falsamente los rangos, se decidió eliminar aquellos controles que no
presentaran un nivel de calidad mínimo. Para calcular esta medida
de calidad se utilizaron 3 genes (GUSB, 18S y PPIA) que
además sirvieron como controles endógenos (calculando su media
geométrica) para la cuantificación relativa de todos los genes.
Analizando el comportamiento individual de la distribución de cada
gen no se pudo verificar que se cumpliera un ajuste suficiente a
una distribución normal, por lo que no se pudo establecer unos
intervalos de confianza basados en su varianza. Como alternativa, se
decidió establecer unos intervalos de confianza arbitrarios y fijos
con distintos niveles de estringencia (como punto de corte se
decidió utilizar el doble, 4 veces u 8 veces el valor del control
con valores de expresión más parecidos a los tumores).
Una vez determinado el punto de corte para cada
gen, se sumarizó toda esta información en una matriz con los 96
genes contra las muestras tumorales. Se marcaron con 0 los valores
que no superaron el nivel de corte y con 1 los que si lo superaron
(para cada nivel de estringencia). Para seleccionar los mejores
genes (con los que se pretendía reducir el perfil al menos a 48) se
tuvieron en cuenta dos propiedades: 1) que el gen pudiera detectar
un gran número de tumores (buscando los que tuvieran una mayor suma
de valores 1) y 2) que esta detección fuera el máximo de
independiente de otros genes alarma (para poder detectar el máximo
de vías minoritarias).
Como resultado, se hubiera podido reducir el
número de genes interesantes a menos de 48, aunque por razones
técnicas y siendo conservadores se decidió mantener este número
para su análisis en fases posteriores, ya que algunos intervalos en
los controles podrían no ser completamente correctos (debido al
bajo número de muestras control analizadas hasta el momento).
Para automatizar el proceso de análisis de
nuevas muestras a partir del perfil genético de los 48 genes
seleccionados (figura 10) se creó un programa informático que
partiendo de los resultados de Cts obtenidos de la
qRT-PCR es capaz de realizar una predicción
diagnóstica. Este programa es capaz de utilizar distintos ficheros
de parámetros (dependiendo de la estringencia en los intervalos),
con lo que los valores de sensibilidad (SN) y especificidad (SP)
varían. Utilizando el fichero de parámetros menos estringente
(punto de corte al doble del control más cercano a los tumores) se
obtuvo SN=100% y SP=100%. En el caso del segundo fichero de
parámetros (punto de corte 4 veces del control más cercano a los
tumores) se obtuvo SN=98,96% y SP=100%. En el último caso (punto de
corte 8 veces el peor control) se obtuvo SN=97,93% y SP=100%. Es
importante señalar que estos resultados se han obtenido sobre las
mismas muestras utilizadas para generar los ficheros de parámetros,
por lo que probablemente se esta produciendo una sobreestimación
(overfitting) que seria necesario estimar en experimentos
posteriores con muestras nuevas.
Los objetivos en esta fase del proyecto eran
probar y mejorar el modelo de predicción de tumores así como
reducir al mínimo el número de genes utilizados para realizar la
predicción.
Para esta fase fue necesario ampliar mucho más
el conjunto de muestras tanto tumorales como normales. Se
analizaron 440 nuevas muestras mediante tarjetas microfluídicas de
48 genes, que se han añadido a los datos del ejemplo 3 (60 muestras)
y del ejemplo 4 (80 muestras).
Una vez realizados los controles de calidad
mínimos en las muestras, se procedió a analizarlas mediante el
modelo cualitativo de alarmas descrito previamente. El resultado
que obtuvimos (SN=0.81 y SP=0.81) difería bastante del obtenido con
el modelo final del ejemplo 4, por lo que se decidió intentar
mejorarlo, ya que probablemente tenía bastante
sobreentrenamiento.
A partir de la observación de los histogramas de
frecuencias discretizadas de cada uno de los genes, se pudo
observar como se distribuían las muestras tanto tumorales como
controles. Debido al hecho de haber aumentado mucho el muestreo, el
límite de solapamiento entre las distribuciones se había reducido
de forma importante. También se pudo observar que, aunque en muy
baja frecuencia, algunos casos controles tenían unos niveles de
expresión muy parecidos a los tumores.
Aunque, a nivel conceptual, el sistema
cualitativo de alarmas desarrollado se seguía considerando una
buena aproximación al comportamiento celular de las expresiones
génicas, el no poder cuantificar la importancia de cada uno de los
genes representaba una seria limitación al poder predictivo del
mismo.
En base al mismo concepto de alarmas se decidió
intentar desarrollar un modelo cuantitativo, lo cual fue posible
utilizando el teorema de las probabilidades condicionadas de
Bayes.
Ya que el número de muestras analizadas es
suficientemente elevado, se puede estimar a partir de las
frecuencias de expresión observadas las probabilidades de que dado
un valor de expresión la muestra sea o un tumor o un control.
Una de las ventajas de un modelo basado en el
teorema de Bayes es que se puede aplicar a cada gen sensor de forma
independiente. La expresión génica observada modificará la
probabilidad que se tenía a priori de ser un tumor dando una
probabilidad a posteriori, la cual podrá ser usada de nuevo
como probabilidad a priori para el siguiente gen. De hecho,
implícitamente se está asumiendo independencia entre los distintos
genes.
El número final de muestras sobre las que se ha
podido aplicar el modelo fue de 308 tumores y 156 controles.
Cuando se aplicó nuestro modelo iterativamente
sobre los 48 genes se obtuvo una mejora significativa en el poder
de predicción del modelo cualitativo anterior (SN=0.86 y SP=0.92),
aunque estudiando los histogramas de frecuencias pudimos observar
que muchos genes parecían no aportar información significativa al
modelo final. Por tanto, se propuso seleccionar el subconjunto de
genes suficiente y necesario para capturar el máximo de información
diagnóstica de las muestras.
Utilizando el modelo cuantitativo no se tenía
una forma clara de realizar la selección de genes más interesantes.
El antiguo modelo cualitativo si que permitía seleccionar los genes
más informativos y, a la vez, con una mayor independencia entre
ellos. El resultado de utilizar los mejores genes detectados con el
modelo cualitativo (CTSE, MAGEA3, CRH, SLCIA6, PPP1R14D, IGF2,
C14orf78 y KLF9) sobre el nuevo modelo cuantitativo mostró una
mejora importante en los resultados (SN=0.89 y SP=0.96).
De todas formas, se decidió intentar otras
aproximaciones. A partir del análisis visual de los histogramas de
frecuencias de los 48 genes, se seleccionó el subconjunto
aparentemente más informativo (ANXA10, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3,
POSTN, SLC1A6 y TERT) y con histogramas más variados entre si
(esperando que este hecho indicara una mayor independencia entre
ellos). El resultado obtenido también mostraba una mejora
significativa respeto al análisis de los 48 genes (SN=0.90 y
SP=0.96).
Finalmente, ya que tanto el subconjunto de genes
obtenidos mediante el modelo cualitativo como los genes
seleccionados visualmente mostraban mejoras respecto al modelo
cuantitativo inicial, se decidió combinar los genes de las 2
aproximaciones (ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20,
MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 y TERT). El resultado del modelo
combinado fue ligeramente mejor que cualquiera de ellos (SN=0.91 y
SP=0.96).
Una vez obtenido el modelo, se decidió estudiar
si existía algún patrón común tanto en los tumores como en los
controles mal clasificados. En el caso de los controles, se pudo
detectar una presencia significativa de muestras con tumores en
contacto con el sistema urinario (tumores de próstata, de riñón y
de pene principalmente). Probablemente, este tipo de muestras
tienen patrones de expresión comunes con los tumores de vejiga, con
lo que pueden confundir al método de predicción. Por tanto, se
decidió eliminar de las muestras control todos aquellos casos con
tumores que pudieran encontrarse en contacto con el sistema
urinario.
El número de muestras control descendió de 156 a
126, quedando igualmente 308 muestras tumorales. Utilizando el
modelo cuantitativo con los 48 genes sobre esta nueva población se
observó una mejora importante (SN=0.90 y SP=0.93). En el caso de
los 8 genes más independientes se obtuvo: SN=0.91 y SP=0.97. En el
subconjunto con los histogramas más interesantes se obtuvo: SN=0.91
y SP=0.97. Finalmente, en el subconjunto combinado de genes se
obtuvo: SN=0.93 y SP=0.97. Volviendo a calcular los datos con cada
subconjunto seleccionado previamente podemos ver que en general se
había conseguido aumentar la potencia del modelo eliminando este
tipo de con-
troles.
troles.
En lo referente al estudio de los tumores mal
clasificados, se detectó un incremento significativo en el número
de cistectomías presentes en este grupo. Se cree que la previa
resección transuretral (RTU) que frecuentemente se realiza muy
cercana en el tiempo a la cirugía radical podría estar alterando el
perfil molecular que se observó, ya que las masas tumorales han
sido retiradas físicamente de forma parcial o total de las paredes
epiteliales de la vejiga. Aunque en este estudio no se han eliminado
los casos de cistectomía por no ser los datos concluyentes, es
recomendable no incluir este tipo de muestras en el análisis de
nuevas poblaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la preocupación más importante era la
predicción tumoral (predicción de diagnóstico) también se estaba
interesado en clasificar los distintos tipos de tumores (predicción
de pronóstico), lo cual constituye el objetivo principal de este
apartado. Esta clasificación podría permitir personalizar más el
tratamiento en cada caso.
La clasificación tumoral se basa actualmente en
la observación macroscópica y microscópica en el laboratorio de
anatomía patológica. Mediante unas observaciones más o menos
estandarizadas basadas en la profundidad del tumor y en el aspecto
microscópico de las células se decide su clasificación. Estudios
moleculares recientes parecen indicar que en realidad hay dos
perfiles genéticos diferenciales que mayoritariamente separan los
tumores de tipo superficial y los tumores infiltrantes.
Para poder realizar un modelo de clasificación
de pronóstico se necesitaría tener los distintos grupos tumorales
correctamente separados. Las observaciones
anatomo-patológicas no garantizan la correspondencia
con el comportamiento a nivel molecular de las muestras, por lo que
no parecía buena idea derivar un modelo pronóstico únicamente a
partir de esta clasificación. Se optó por utilizar un sistema de
clasificación mediante cluster no supervisado (que mayoritariamente
separaba las muestras en 2 grandes grupos) además de tener en
cuenta la gradación anatomo-patológica (AP).
Como grupo de muestras tumorales superficiales
válidas era necesario que agruparan según el cluster en el conjunto
que les correspondía y según AP debían ser tumores Ta, T1 grado
bajo y sin carcinoma in situ (cis) asociado. Los tumores
infiltrantes debían pertenecer al grupo correspondiente del cluster
y según AP debían ser tumores tipo T1 alto grado, T2, T3 o T4 y
cualquier tumor con presencia de CIS.
En el grupo de muestras definido como
superficiales se clasificaron 129 de los 308 tumores. En el grupo
definido como infiltrantes se clasificaron 100 de los 308.
Finalmente, 79 muestras tumorales o presentaban discordancias entre
su clasificación por anatomo-patológica y su perfil
molecular o no quedaban claramente definidas dentro de los dos
grupos mayoritarios del cluster.
La metodología utilizada para crear un modelo
que discriminara entre tumores superficiales e infiltrantes es
exactamente la misma que la utilizada en el ejemplo 5 para obtener
un modelo diagnóstico.
Cuando se aplicó el teorema de Bayes utilizando
los 48 genes se obtuvo una buena clasificación (SN=0.97 y
SP=0.96).
Analizando los histogramas de frecuencias se
pudo observar que los genes interesantes para diagnóstico
coincidían en gran medida con los genes de pronóstico. Sin embargo,
había algunos genes (MCM10 y ASAM) que no eran adecuados para
diagnóstico y sí para pronóstico, por lo que estos dos fueron
añadidos a los 12 genes previamente seleccionados. El modelo de 14
genes resultante demostró funcionar casi a la perfección (SN=0.99 y
SP=1.00). En la tabla 1 se incluyen los 14 genes, indicando el
símbolo del gen y el nombre del TaqMan Gene Expression Assay
seleccionado para la tarjeta microfluídica TaqMan Low Density
Array.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Método in vitro no invasivo para
diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical que comprende:
- a.
- recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto;
- b.
- detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10; y
- c.
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
2. Método in vitro no invasivo, según la
reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de fluido
vesical es orina.
3. Método in vitro no invasivo para
diagnosticar y/o pronosticar cáncer vesical que comprende:
- a.
- recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto;
- b.
- detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10; y
- c.
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
4. Método in vitro no invasivo para
diagnosticar cáncer vesical que comprende:
- a.
- recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto;
- b.
- detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 y TERT; y
- c.
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales de referencia para dichos genes en fluidos vesicales.
5. Método in vitro no invasivo para
diagnosticar cáncer vesical que comprende:
- a.
- recoger una muestra de fluido vesical de un sujeto;
- b.
- detectar y cuantificar en dicha muestra de fluido vesical el patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLCIA6 y TERT; y
- c.
- comparar los resultados obtenidos en la etapa b) con los valores normales de referencia. para dichos genes en fluidos vesicales.
6. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
cuantificación de la expresión de los genes en b) se lleva a cabo
mediante PCR cuantitativa a tiempo real.
7. Empleo de la combinación de genes ANXA10,
C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D,
SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10 como marcadores de diagnóstico y/o
pronóstico del cáncer vesical.
8. Empleo de la combinación de genes ANXA10,
CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, y MCM10 como
marcadores de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer vesical.
9. Empleo de la combinación de genes ANXA10,
C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D,
SLC1A6 y TERT como marcadores de diagnóstico de cáncer vesical.
10. Empleo de la combinación de genes ANXA10,
CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT como marcadores de
diagnóstico del cáncer vesical.
11. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer
vesical, para llevar a cabo el método de la reivindicación 1, que
comprende un set de sondas adecuado para la detección y
cuantificación del patrón de expresión de la combinación de genes
ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN,
PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM y MCM10.
12. Kit de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer
vesical, para llevar a cabo el método de la reivindicación 3, que
comprende un set de sondas adecuado para la detección y
cuantificación del patrón de expresión de la combinación de genes
ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT y MCM10.
13. Kit de diagnóstico del cáncer vesical, para
llevar a cabo el método de la reivindicación 4, que comprende un
set de sondas adecuado para la detección y cuantificación del
patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, C14orf78,
CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLCIA6 y
TERT.
14. Kit de diagnóstico del cáncer vesical, para
llevar a cabo el método de la reivindicación 5, que comprende un
set de sondas adecuado para la detección y cuantificación del
patrón de expresión de la combinación de genes ANXA10, CTSE, CRH,
IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 y TERT.
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