PT2138848E

PT2138848E - Método de diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga

Info

Publication number: PT2138848E
Application number: PT07788578T
Authority: PT
Inventors: Antonio Alcaraz Asensio; Lourdes Mengual Brichs; Moises Burset Albareda; Maria Jose Ribal Caparros; Elisabet Ars Criach
Original assignee: Fina Biotech Slu
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2011-02-08
Also published as: DK2138848T3; ES2304306A1; DE602007010360D1; JP5314667B2; US20100086932A1; ES2304306B1; EP2138848B1; US9097715B2; JP2010521981A; PL2138848T3; CN101730848A; CA2693847C; ES2357784T3; ATE487140T1; SI2138848T1; EP2138848A1; CA2693847A1; WO2008113870A1; EP2138848A4

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO DE DIAGNÓSTICO E/OU PROGNÓSTICO DO CANCRO DA BEXIGA"

Campo de invenção O campo de aplicação da presente invenção é o domínio dos cuidados de saúde, designadamente o domínio da "urologia oncológica" e da "biologia molecular". A presente invenção tem por objectivo, concretamente, métodos de diagnóstico e de prognóstico do cancro da bexiga.

Antecedentes da invenção 0 cancro da bexiga, ou cancro vesical, é o segundo tumor mais frequente do tracto genitourinário, logo a seguir ao cancro da próstata [Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M. Câncer statistics, 2002. CA Câncer J Clin 2002; 52.-23-47]. Num contexto global, representa aproximadamente 3% e 1%, respectivamente em homens e mulheres, de todas as mortes provocadas pelo cancro. Em valores absolutos, isto significa que morrem anualmente, com esta patologia, cerca de 95 000 homens e cerca de 35 000 mulheres. A razão entre incidência e morte é diferente, dependendo do grau de desenvolvimento de cada país. Como exemplos extremos, poder-se-ia dizer que na região da América do Norte esta proporção pode ser próxima de 0,2, ao passo que nas regiões sub-sarianas pode aumentar até 0,6 [Edwards BK, Brown ML, Wingo PA et al. Annual report to the nation on the status of câncer, 1975-2002, featuring population-based trends in 2 câncer treatment. J Natl Câncer Inst 2005; 97:1407-27; Pisani P, Parkin DM, Bray F, Ferlay J. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int J Câncer 1999; 83:18-29].

Ao contrário de outros tumores, não foram detectados, virtualmente, até ao momento presente, nenhuns factores familiares de predisposição genética. Por outro lado, foram detectados diversos factores ambientais fortemente conotados com os tumores da bexiga. Um dos factores mais importantes, não só pela sua relação com a patologia mas também com a sua incidência na população, é o acto de fumar. Confirmou-se que nos fumadores o risco de desenvolvimento de um tumor da bexiga é três vezes maior do que nos não fumadores. Na realidade, um terço dos tumores da bexiga está associado ao consumo de tabaco. Infelizmente, ainda não foram claramente identificados os agentes carcinogénicos presentes no tabaco [Burch JD, Rohan TE, Howe GR et al. Risk of bladder câncer by source and type of tobacco exposure: a case-control study. Int J Câncer 1989; 44:622-28; Zeegers MP, Kellen E, Buntinx F, van den Brandt PA. The association between smoking, beverage consumption, diet and bladder câncer: a systematic literature review. World J Urol 2004; 21:392-401]. É possível encontrar diferentes tipos de patologias na bexiga, a nível celular. Há modificações benignas, tais como hiperplasias epiteliais, metaplasias uroteliais e ninhos de Von Brunn, entre outras. Por outro lado, as displasias poderiam corresponder a patologias que são mais ou menos intermédias entre o epitélio normal e o carcinoma. Finalmente, encontram-se na bexiga diferentes tipos de carcinomas uroteliais, que podem ser divididos em 3 adenocarcinomas, tumores escamosos e carcionomas de células de transição (CCT).

Mais de 90% dos tumores da bexiga são CCT. No momento do seu diagnóstico, aproximadamente 75% são tumores superficiais, 20% são tumores que invadem as camadas musculares (CCT infiltrantes ou invasivos) e 5% são já metastáticos. Entre os casos superficiais, aproximadamente 20% são curados por meio de uma intervenção cirúrgica simples, ao passo que entre 50 e 70% reaparecem uma ou mais vezes após a cirurgia, mas nunca se transformam em tumores infiltrantes. Entre 10 e 30% destes tumores superficiais passam a ser tumores infiltrantes. Estes tumores são agressivos, são tumores de prognóstico difícil com uma mortalidade, decorridos 5 anos, igual a 50%, e nos casos com metástases, a mortalidade após 2 anos é de 100% [Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder câncer using cDNA microarrays: defining histogenesis and biological phenotypes. Câncer Res 2002;62:6973-80; Adshead JM, Kessling AM, Ogden CW. Genetic initiation, progression and prognostic markers in transitional cell carcinoma of the bladder: a summary of the structural and transcriptional changes, and the role of developmental genes. Br J Urol 1998;82:503-12; Babaian RJ, Johnson OF, Llamas L, Ayala AG. Metastases from transitional cell carcinoma of urinary bladder. Urology 1980; 16:142-44].

As vias genéticas dos CCT superficiais e invasivos, embora conotadas, parecem ser bastante diferentes. A progressão mais vulgar dos tumores superficiais parece ser a hiperplasia, a atipia e finalmente os CCT papilares de gravidade menor. Nos tumores invasivos, é mais vulgar que 4 estes progridam de atipia para uma displasia, para passarem depois a um tumor in situ (Tis), terminando finalmente num tumor infiltrante [Knowles MA. What we could do now: molecular pathology of bladder câncer. Mol Pathol 2001; 54:215-21].

Os sistemas de diagnóstico actualmente existentes baseiam-se numa combinação de citologia urinária (a partir da existência de células escamosas na urina) e a observação directa da bexiga por meio de cistoscopia. Esta última metodologia é, presentemente, a técnica principal de diagnóstico e de acompanhamento da evolução de tumores. É realizada por via transuretral e consequentemente representa para os pacientes uma técnica invasiva e bastante desagradável. Considera-se que a sensibilidade e a especificidade desta técnica são bastante elevadas, embora os aperfeiçoamentos introduzidos na técnica presentemente existente (cistoscopia por fluorescência) indiquem que isso não é provavelmente assim e que parte da recorrência observada em tumores superficiais pode ser devida, eventualmente, à falta de ressecção total nas suas partes não visíveis [Jones JS. DNAbased molecular cytology for bladder câncer surveillance. Urology 2006; 67:35-45]. Por sua vez, a citologia urinária é uma técnica de diagnóstico não invasiva, com uma elevada sensibilidade e uma elevada especificidade para tumores muito graves. No entanto, esta técnica tem limitações em termos de detecçâo de tumores de fraca gravidade [Bastacky S, Ibrahim S, Wilczynski SP, Murphy WM. The accuracy of urinary cytology in daily practice. Câncer 1999; 87.118-28]. Além disso, a interpretação da citologia é fortemente dependente do observador, pelo que 5 pode haver diferenças interobservadores, especialmente no caso dos tumores de fraca gravidade.

Todas estas limitações conduziram à pesquisa de marcadores não invasivos e mais fiáveis para o cancro da bexiga. A existência de um marcador não invasivo, com uma elevada sensibilidade e uma elevada especificidade para os CCT da bexiga, pode vir a ser muito útil para a prática clinica. Na realidade, há diversos estudos que descrevem novos marcadores tumorais na urina, tais como o teste do antigénio NMP22 do tumor da bexiga [Wiener HG, Mian C, Haitel A, Pycha A, Schatzl G, Marberger M. Can urine bound diagnostic tests replace cystoscopy in the management of bladder câncer? J Urol 1998;159:1876-80; Soloway MS, Briggman V, Carpinito GA et al. Use of a new tumor marker, urinary NMP22, in the detection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinary tract following surgical treatment. J Urol 1996;156:363-67], produtos de degradação da fibrina [Schmetter BS, Habicht KK, Lamm DL et al. A multicenter trial evaluation of the fibrin/fibrinogen degradation products test for detection and monitoring of bladder câncer. J Urol 1997;158:801-5.], telomerase [Takihana Y, Tsuchida T, Fukasawa M, Araki I, Tanabe N, Takeda M. Real-time quantitative analysis for human telomerase reverse transcriptase mRNA and human telomerase RNA component mRNA expressions as markers for clinicopathologic parameters in urinary bladder câncer. Int J Urol 2006;13:401-8], testes baseados na hibridação fluorescente in situ [Halling KC, King W, Sokolova IA et al. A comparison of BTA stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Urol 2002; 167:2001-6], ou 6 a citometria de fluxo [Takahashi C, Miyagawa I, Kumano S, Oshimura M. Detection of telomerase activity in prostate câncer by needle biopsy. Eur Urol 1997; 32:494-98; Trott PA, Edwards L. Comparison of bladder washings and urine cytology in the diagnosis of bladder câncer. J Urol 1973; 110:664-66], mas embora a maior parte deles tenham uma sensibilidade superior à da citologia urinária, esta última metodologia continua a ser a mais especifica [Bassi P, De Μ, V, De Lisa A et al. Non-invasive diagnostic tests for bladder câncer: a review of the literature. Urol Int 2005; 75:193-200].

Sabe-se que há inúmeras e bastantes patologias genéticas diferentes nos tumores uroteliais, pelo que a tendência actualmente existente vai no sentido de se pesquisar marcadores genéticos (quer ao nível do ADN, ARN ou das proteínas) que possam indicar a presença de carcinomas na amostra analisada. Por outro lado, considera-se que seria bastante interessante poder discriminar a agressividade do tumor de um paciente com estes mesmos marcadores, e que isso pudesse permitir um tratamento muito mais personalizado e eficaz. Finalmente, considera-se que estes marcadores possam vir a ser possíveis agentes terapêuticos relevantes para o desenvolvimento de novos fármacos para combater o cancro.

Até há muito pouco tempo, a capacidade para se analisar os padrões de expressão génica estava limitada a alguns genes, em cada experiência. As novas tecnologias, tais como as micromatrizes de ADN, alteraram completamente este cenário. É possível analisar presentemente milhares de genes num único ensaio [Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat Genet 7 1999;21:10-14; Granjeaud S, Bertucci F, Jordan BR. Expression profiling: DNA arrays in many guises. Bioessays 1999/21: 781-90]. Assim sendo, começaram a aparecer, na literatura, resultados maciços da expressão de todos os tipos de tumores, incluindo os tumores da bexiga [Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder câncer using cDNA microarrays: defining histogenesis and biological phenotypes. Câncer Res 2002/62:6973-80/ Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass câncer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sei USA 2001.98:15149-54/ Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Lozano JJ et al. Gene discovery in bladder câncer progression using cDNA microarrays. Am J Pathol 2003/163:505-16/ Sanchez-Carbayo M, Capodieci P, Cordon-Cardo C. Tumor suppressor role of KiSS-1 in bladder câncer: loss of KiSS-1 expression is associated with bladder câncer progression and clinicai outeome. Am J Pathol 2003/ 162:609-17/ Dyrskjot L, Thykjaer T, Kruhoffer M et al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet 2003/ 33:90-96], embora a maior parte dos resultados não tenha sido tornada pública na sua globalidade. No entanto, até ao momento presente, os estudos efectuados com marcadores específicos do cancro da bexiga incidiram em um ou em muito poucos genes [Olsburgh J, Harnden P, Weeks R et al. Uroplakin gene expression in normal human tissues and locally advanced bladder câncer. J Pathol 2003/199:41-49/ Fichera E, Liang S, Xu Z, Guo N, Mineo R, Fujita-Yamaguchi Y. A quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction assay for human IGF-II allows direct comparison of IGF-II mRNA leveis in cancerous breast, bladder, and prostate tissues. Growth Horm IGF Res 2000/10:61-70/ Simoneau M, Aboulkassim TO, LaRue H, Rousseau F, Fradet Y. Four tumor suppressor loci on chromosome 9q in bladder câncer: evidence for two novel candidate regions at 9q22.3 and 9q31. Oncogene 1999; 18:157-63].

Tendo em conta que a natureza destes tumores é bastante heterogénea, não parece muito provável que seja possível identificar a totalidade ou a maior parte dos carcinomas com um único marcador. Assim sendo, para que se possa caracterizar a maior parte dos tumores parece ser essencial combinar vários dos melhores marcadores, de uma forma algo complexa.

Além disso, embora a análise directa do tecido urotelial seja a alternativa mais confortável para o desenvolvimento de um método de diagnóstico rotineiro, considera-se que seria bastante interessante, conforme se disse anteriormente, que o referido método não fosse invasivo, uma vez que um método destes diminui a qualidade de vida dos pacientes e corresponde a cuidados de saúde com custos muito mais elevados.

Os fluidos vesicais (urina ou efluentes de lavagem da bexiga) que estão em contacto com todo o epitélio vesical, e consequentemente com a massa tumoral, parecem ser uma boa alternativa para a detecção de marcadores tumorais, tendo em consideração que representam uma via fácil e não invasiva para se obter as amostras que se pretende analisar. Assim sendo, foram feitas inúmeras pesquisas que incidiram no estudo de marcadores tumorais na urina, para se encontrar um método de diagnóstico não invasivo para os CCT vesicais. Com efeito, foram já comercializados diversos testes com este objectivo (NNMP22, UroVysion, ImmunoCyt, Accu-Dx, etc.) . 9

Uma alternativa, que ainda não foi comercializada, é a detecção de CCT vesicais em amostras de urina, mediante a determinação da expressão génica de marcadores de cancros vesicais. Na realidade, há diversos estudos que sugerem a utilidade desta metodologia, embora tenham sido efectuados com um ou com alguns genes marcadores [Parekattil SJ, Fisher HA, Kogan BA. Neural network using combined urine nuclear matrix protein-22, monocyte chemoattractant protein-1 and urinary intercellular adhesion molecule-1 to detect bladder câncer. J Urol 2003; 169:917-20; Eissa S, Kenawy G, Swellam M, EI Fadle AA, Abd EI-Aal AA, EI Ahmady O. Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided urine samples as diagnostic tools for bladder carcinoma. Clin Biochem 2004;37:803-10; Larsson PC, Beheshti B, Sampson HA, Jewett MA, Shipman R. Allelic deletion fingerprinting of urine cell sediments in bladder câncer. Mol Diagn 2001; 6: 181-88].

Em resposta a estas solicitações, os inventores, após um importante trabalho de pesquisa, identificaram 14 genes marcadores de tumores vesicais, a partir dos quais desenvolveram um método de diagnóstico e de prognóstico do cancro vesical, com base na detecção e na quantificação da expressão génica destes genes, por meio de uma PCR quantitativa em tempo real com ARN extraído de fluidos da bexiga, e sua subsequente combinação computacional por meio de um "sistema de alarme".

Descrição abreviada dos desenhos

Figura 1 (A-J): electroferogramas, obtidos com o bioanalisador 'Agilent 2100', de amostras de ARN intacto (BWO) 10 (figura l.A) e ARN parcialmente degradado (BW1, BW2, BW3) (figuras l.B, l.C, l.D) de efluentes de lavagem da bexiga, tumores vesicais (TO, Tl, T2, T3) (figuras l.E, l.F, l.G, l.H) e uma mistura de amostras de referência (C) (figura 1.1) e gel com as faixas dos ARN ribossómicos (28S e 18S) de cada uma das amostras analisadas (figura l.J). Os números 0, 1, 2 e 3 são atribuídos às amostras por ordem crescente da degradação ou servem para as amostras com ARN de uma qualidade comparável.

Figura 2: (a) semimatriz de comparação entre pares de matrizes dos 100 genes expressos mais diferenciadamente em cada matriz. As partes superior e inferior sombreadas a cinzento na semimatriz ilustram a percentagem de genes expressos diferencialmente em comum entre os pares de matrizes de efluentes de lavagem da bexiga (BW) e entre os pares de matrizes de tumores (T), hibridados com ARN de um grau diferente de degradação. A parte não sombreada da semimatriz corresponde à percentagem de genes expressos diferencialmente em comum entre os pares de matrizes de efluentes de lavagem da bexiga e de tumores, (b) Grupo não inspeccionado de todos os clones contidos na micromatriz, incluindo os duplicados com permuta de corantes (DS).

Figura 3: validação por meio de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) de 4 genes expressos diferencialmente (KRT20, GSN, IGF2 e CCL2) em micromatrizes de ADNc e conotados com o cancro vesical, em 36 amostras suplementares de efluentes de lavagem de bexigas com tumores. Os valores positivos indicam a sobrexpressão nos efluentes de lavagem de bexigas com tumores, comparativamente com as contraprovas de referência. As amostras são agrupadas no gráfico, ordenadas pelo coeficiente, na escala de log2, correspondente à fase e grau de gravidade do tumor: tumores superficiais de fraca 11 gravidade (8 pTa e 3 pTl), tumores superficiais de elevada gravidade (5 pTa, 5 pTl e 4 pTis) e tumores invasivos (9 pT2 e 2 pT4) .

Figura 4 : classificação das amostras por meio do grupo aglomerado não inspeccionado (distância euclidiana e UPGMA). pT2_l, pT2_2 e pT2_3 (tumores infiltrantes); pTl HG_1, pTl HG_2 e pTl HG_3 (tumores superficiais de elevada gravidade); pTl LG_1, pTl LG_2, pTl LG_3 (tumores superficiais de fraca gravidade).

Figura 5: resultados da PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) obtidos com as misturas e com as amostras individuais nelas contidas. O quadro está dividido em resultados das misturas (parte esquerda) e das amostras individuais (direita). As colunas das misturas indicam o número da mistura (N°), os niveis de expressão observados nas micromatrizes (ymatrizes) e os níveis quantificados por meio de qRT-PCR. A primeira coluna das amostras individuais corresponde à média aritmética das expressões das amostras individuais contidas na mistura (média), que estão indicadas nas colunas seguintes (1-5) . Cada fileira corresponde a um gene (TCN1, S0RBS1, MYH11, SRPX, CRH, KRT14, RRM2, FOSB, CEACAM6, CES1), com os diferentes níveis de expressão para cada mistura.

Figura 6: classificação das amostras de fluidos da bexiga de 60 indivíduos por meio de um aglomerado global não inspeccionado de 384 genes (distância euclidiana e UPGMA). A nomenclatura das amostras obedece às regras seguintes: se a amostra começar com a letra "B", corresponde a uma amostra de efluentes de lavagem de uma bexiga com um tumor; se começar por "CB", corresponde a uma amostra de um fluido vesical de contraprova de referência; 12 se aparecerem as iniciais "RV" a seguir ao número da amostra, esta corresponde a uma amostra de efluentes de lavagem da bexiga; por outro lado, se aparecer a inicial "0", corresponde a uma amostra de urina e a gravidade tumoral e o estado patológico da amostra tumoral estão indicados a seguir ao traço de sublinhado. As setas indicam uma má classificação da amostra, tomando como referencial as categorias definidas: T_HG (tumores de elevada gravidade); T_LG (tumores de fraca gravidade) e C (contraprovas de referência).

Figura 7 (A e B): classificação das amostras de fluidos das bexigas de 140 indivíduos, por meio de um agregado global não inspeccionado de 96 genes (distância euclidiana e UPGMA). As setas indicam uma má classificação da amostra relativamente as categorias definidas (C, contraprovas de referência na figura 7. A, e T, amostras tumorais na figura 7.B). A nomenclatura das amostras obedece às regras seguintes: se a amostra começar com a letra "B" corresponde a uma amostra de fluidos de uma bexiga com tumor; se começar por "CB", corresponde a uma amostra de um fluido vesical de contraprova de referência; se aparecer a inicial "R" a seguir ao número da amostra, esta corresponde a uma amostra de efluentes de lavagem da bexiga; por outro lado, se aparecer a inicial "O", corresponde a uma amostra de urina.

Figura 8 (A-T): lista de 384 genes endógenos de contraprova de referência para o diagnóstico e 0 prognóstico do cancro da bexiga. Esta lista foi obtida a partir de análises por meio de micromatrizes 'Affymetrix' de misturas de amostras de tecidos de tumores de bexigas com tumores em diferentes fases de desenvolvimento e 13 diferentes graus de gravidade e também com amostras de contraprova de referência de mucosas da bexiga.

Figura 9 (A-D): lista de 96 genes endógenos de contraprova de referência para o diagnóstico e o prognóstico do cancro da bexiga. Esta lista foi obtida a partir de análises de 60 amostras de fluidos da bexiga em cartões de microfluídica contendo os 384 genes da figura 8. Estão indicados os símbolos dos genes e o nome do ensaio 'TaqMan' de expressão de genes seleccionados para o cartão de microfluídica da matriz de baixa densidade 'TaqMan'.

Figura 10 (A e B): lista de 48 genes para diagnóstico, prognóstico e contraprova de referência endógena para o cancro da bexiga. Esta lista foi obtida por meio de análise de 140 amostras de fluidos da bexiga em cartões de microfluídica contendo os 96 genes da figura 9. Estão indicados os símbolos dos genes e o nome do ensaio 'TaqMan' de expressão de genes para o cartão de microfluídica da matriz de baixa densidade 'TaqMan'.

Objecto da invenção O objecto da presente invenção diz respeito a um método de diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, não invasivo, in vitro, que tem por base a detecção e a quantificação, em fluidos da bexiga, da expressão génica de determinados genes e/ou suas combinações que actuam como marcadores genéticos da referida doença.

De igual modo, a utilização dos referidos genes, como marcadores genéticos para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, é também um objecto da presente invenção. 14

Finalmente, um outro objecto da presente invenção diz respeito a um estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, com base na utilização dos referidos genes como marcadores genéticos da doença.

Descrição da invenção 0 objectivo principal da presente invenção consiste em desenvolver um método in vitro, não invasivo, para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, com base na detecção e na quantificação de determinados genes que actuam como marcadores genéticos da doença.

Para a execução do método, o ponto de partida é uma amostra de um fluido vesical proveniente de um indivíduo ao qual esteja a ser feita a análise para a detecção e quantificação do padrão de expressão de determinados genes e/ou suas combinações. Os resultados obtidos são comparados com valores normais de referência para os referidos genes nos fluidos vesicais, para assim se estabelecer o diagnóstico e/ou prognóstico. 0 termo "indivíduo", tal como utilizado na presente invenção, designa um ser humano. A amostra de fluido vesical proveniente do indivíduo pode ser uma amostra de urina ou uma amostra de efluentes de lavagem da bexiga e pode ser obtida por meio de qualquer processo convencional.

Na presente invenção, subentende-se que o método de diagnóstico do cancro da bexiga é tal que permite detectar e quantificar genes expressos diferencialmente, entre tumores e amostras de contraprova de referência 15 (provenientes de indivíduos saudáveis) (genes de diagnóstico). O método de prognóstico é um daqueles que permite detectar genes expressos diferencialmente nos diferentes tipos de tumores (genes de prognóstico), permitindo classificar os tumores de acordo com a sua agressividade e permitindo personalizar o tratamento em cada caso. A classificação tumoral dos diferentes tipos de carcinomas de células de transição (CCT) baseia-se, presentemente, na observação macroscópica e microscópica feita num laboratório de anatomia patológica. A sua classificação é decidida mediante o recurso a observações mais ou menos normalizadas, com base na profundidade do tumor e no aspecto microscópico das células. Estudos moleculares recentes parecem indicar que há realmente dois perfis genéticos diferenciais que permitem distinguir fundamentalmente entre tumores de tipo superficial e tumores infiltrantes.

Os tumores vesicais superficiais são assim designados por Ta, Tis e Tl. 0 carcinoma Ta é um carcinoma exofítico que é não invasivo ou que está confinado ao epitélio. 0 Tis é um carcinoma in situ (tumor superficial plano) e o Tl é um tumor que invade o tecido conjuntivo subepitelial ou que invade a lâmina própria.

Na presente invenção utiliza-se a abreviatura HG para identificar tumores de elevada gravidade e utiliza-se a abreviatura LG para identificar tumores de fraca gravidade.

Os carcinomas Ta e Tl podem ser extirpados por meio de ressecção transuretral (RTU). Embora os tumores Tis e Tl de elevada gravidade (HG) sejam carcinomas superficiais confinados à mucosa, devido ao facto de serem tumores de 16 elevada gravidade foi já demonstrado, por meio de técnicas da biologia molecular e pela experiência clinica, que têm um elevado potencial maligno e invasivo.

Além disso, os carcinomas vesicais infiltrantes são classificados em T2, T3 e T4 . Deste modo, ο T2 é um tumor que invade a camada muscular da bexiga. Por sua vez, este tipo divide-se em T2a, que invade a camada muscular superficial ou a metade interior, e T2b, que invade a camada muscular profunda ou metade exterior. 0 T3 é um tumor que invade para além da camada muscular ou que invade a gordura perivesical. Por sua vez, este tipo divide-se em T3a, com invasão microscópica, e T3b, com invasão macroscópica. Finalmente, ο T4 é um tumor que invade as estruturas adjacentes à bexiga urinária e que se divide, por sua vez, em T4a, com invasão da próstata, útero ou vagina, e T4b, com invasão da parede pélvica ou da parede abdominal. A detecção e a quantificação da expressão génica dos genes pode ser efectuada por meio de todas as técnicas da biologia molecular, não invasivas, adequadas aos propósitos da presente invenção, por exemplo, micromatrizes de expressão, PCR quantitativa em tempo real, absorção 'Northern', PCR convencional, etc..

Concretamente, a utilização de matrizes de ADN permite obter resultados de expressão de um número muito elevado de genes, o que vai permitir testar milhares de genes em cada experiência. A utilização desta técnica exige grandes quantidades de ARN com uma boa qualidade (não degradado). A técnica de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) é utilizada, preferencialmente, na presente invenção para a detecção e quantificação dos genes de diagnóstico e/ou prognóstico. Esta técnica é mais rigorosa, para além de 17 permitir a utilização de ARN com um grau considerável de degradação, sem que isso afecte o resultado final. De igual modo, permite quantificar o ARN especifico dos genes relevantes. Em formas particulares de realização, as sondas de hibridação utilizadas são sondas 'TaqMan'.

Os resultados obtidos na detecção e quantificação da expressão dos genes na amostra de fluido vesical são comparados com valores normais de referência observados para os referidos genes em amostras provenientes de indivíduos saudáveis. 0 aumento ou a diminuição dos níveis dos genes marcadores são estimados, geralmente, comparando resultados obtidos nas análises das amostras correspondentes aos indivíduos donde provieram, com os resultados das amostras de contraprova de referência que são analisadas em paralelo. A decisão final da classificação de cada amostra é feita por meio de um "sistema de alarme" que tem por base os valores de expressão dos genes marcadores, de tal modo que, no caso de algum dos valores observados corresponder a um desvio muito significativo em relação àquilo que é esperado numa amostra de contraprova de referência, aumenta bastante a probabilidade de a classificação final ser uma classificação de tumor, independentemente do gene que "deu o alarme".

Mais concretamente, de acordo com um aspecto fundamental da invenção, o método não invasivo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga prevê a detecção e a quantificação, numa amostra de um fluido vesical proveniente de um indivíduo, do padrão de expressão da combinação dos genes ANXA 10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM e MCM10. Os resultados obtidos são comparados com os valores 18 normais de referência para os referidos genes nos fluidos vesicais.

De preferência, a amostra de fluidos vesicais é a urina, uma vez que é obtida muito mais facilmente. No entanto, ocasionalmente, de uma forma rotineira, faz-se uma lavagem da bexiga e o efluente dai proveniente proporciona ARN de melhor qualidade. 0 gene ANXA 10 (anexina AIO) (também designado por ANX14), localizado em 4q32.3, participa na regulação da divisão celular e em diferentes vias de transdução do sinal, mas a sua função exacta ainda não foi determinada. O gene C14orf78 (grelha de leitura aberta 78 do cromossoma 14) (também designado por AHNAK2 ou KIAA2019) está localizado em 14q32.33. A sua função ainda não foi determinada. O gene CTSE (catepsina E) (também designado por CATE), localizado em lq31, codifica uma protease intracelular. O gene CRH (hormona libertadora da corticotropina) (também designado por CRF), localizado em 8ql3, codifica a hormona libertadora da corticotropina, segregada no hipotálamo em resposta ao stress. O gene IGF2 (factor 2 de crescimento de tipo insulinico (somatomedina A)) (também designado por llorf43, FLJ22066, FLJ44734, INSIGF), localizado em llpl5.5, codifica o factor de crescimento de tipo insulinico. O gene KLF9 (factor 9 de tipo Kruppel) (também designado por BTEB1) codifica um factor de transcrição. O gene KRT20 (queratina 20) (também designado por K20; CK20; KRT21; MGC35423) , localizado em 17q21.2, codifica uma proteína que faz parte dos filamentos intermediários 19 responsáveis por conferirem uma estrutura e integridade às células epiteliais. 0 gene MAGEA3 (familia A3 do antigénio associado ao melanoma) (também designado por HIP8; HYPD; MAGE3; MAGEA6; MGC14613) está localizado em Xq28. A sua função é desconhecida. 0 gene POSTN (factor especifico dos osteoblastos de periostina) (também designado por PN; OSF-2; PDLPOSTN; MGCll9510; MGC119511; periostina; RP11-412K4.1) está localizado em 13ql3.3 e desempenha uma função relacionada com a mobilidade celular. O gene PPP1R14D (proteína fosfatase 1, subunidade reguladora 14D (inibidor)) (também designado por GBPI-1; FLJ20251; MGC119014; MGC119016; de tipo CPI17) está localizado em 15ql5.1 e codifica uma fosfatase. O gene SLC1A6 (família 1 do veículo osmótico (transportador glutamato/aspartato de elevada afinidade), elemento 6) (também designado por EAAT4; MGC33092; MGC43671), localizado em 19pl3.12, participa no transporte intracelular. O gene TERT (transcriptase inversa da telomerase) (também designado por TP2; TRT; EST2; TCS1; hEST2), localizado em 5pl5.33, codifica uma polimerase de telómeros com actividade de transcriptase inversa. O gene ASAM (molécula de adesão específica dos adipócitos) (também designado por ASAM; ACAM; CLMP; FLJ22415), localizado em llq24.1, participa na adesão celular.

Finalmente, o gene MCM10 (minicromossoma 10 de manutenção imperfeita (S. cerevisiae)) (também designado por CNA43; PR02249; MGC126776), localizado em 10pl3, codifica uma proteína implicada no começo da replicação genómica. 20 A invenção descreve também o método de diagnóstico e/ou prognóstico de cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, que consiste em recolher uma amostra de fluido vesical proveniente de um indivíduo, para se realizar nessa amostra a detecção e a quantificação do padrão de expressão da combinação dos genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT e MCM10. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes nos fluidos vesicais. A invenção descreve também o método de diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, que consiste em recolher uma amostra de fluido vesical proveniente de um indivíduo, para se realizar na referida amostra de fluido vesical a detecção e a quantificação da expressão de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM e suas combinações. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes nos fluidos vesicais.

Também se descreve 0 método de diagnóstico e/ou prognóstico com base na detecção e na quantificação individual da expressão do gene C14orf78. Também se descreve 0 método de diagnóstico e/ou prognóstico com base na detecção e na quantificação individual da expressão do gene KLF9. Também se descreve 0 método de diagnóstico e/ou prognóstico com base na detecção e na quantificação individual da expressão do gene POSTN, Também se descreve o método de diagnóstico e/ou prognóstico com base na detecção e na quantificação individual da expressão do gene PPPIR14D. 21

Também se descreve o método de diagnóstico e/ou prognóstico com base na detecção e na quantificação individual da expressão do gene ASAM. Também se descreve um método de diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, com base na detecção e quantificação de um gene seleccionado entre Cl4orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM e suas combinações e, complementarmente, pelo menos mais um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT e MCM10.

Na presente invenção está contemplado um método, in vitro e não invasivo, que visa o diagnóstico do cancro da bexiga, o qual consiste em recolher uma amostra de um fluido vesical de um indivíduo, para aí se realizar a detecção e a quantificação do padrão de expressão da combinação de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6 e TERT, de acordo com o método anteriormente descrito. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes de fluidos vesicais. 0 método de diagnóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, consiste em recolher uma amostra de um fluido vesical proveniente de um indivíduo, para aí se realizar a detecção e a quantificação do padrão de expressão da combinação de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLCl A6 e TERT. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes de fluidos vesicais. 0 método de diagnóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, consiste em recolher uma amostra de um fluido vesical proveniente de um indivíduo, para aí se 22 realizar a detecção e a quantificação do padrão de expressão da combinação de genes C14orf78, KLF9, POSTN, PPPl R14D e suas combinações. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes de fluidos vesicais. A invenção proporciona também um método de diagnóstico com base na detecção e na quantificação do gene Cl4orf78. A invenção proporciona também um método de diagnóstico com base na detecção e na quantificação do gene KLF9. A invenção proporciona também um método de diagnóstico com base na detecção e na quantificação do gene POSTN. A invenção proporciona também um método de diagnóstico com base na detecção e na quantificação do gene PPPIR14D. A invenção proporciona também um método de diagnóstico com base na detecção e quantificação da expressão de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPPl R14D e suas combinações e, complementarmente, pelo menos mais um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 e TERT.

Está previsto também um método para o prognóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, que consiste em recolher uma amostra de fluido vesical de um indivíduo para ai se realizar a detecção e a quantificação do padrão de expressão da combinação dos genes ASAM e MCM10. Os resultados obtidos são comparados com os valores normais de referência para os referidos genes de fluidos vesicais. A invenção proporciona também um método de prognóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, que consiste em recolher uma amostra de fluido da bexiga de um paciente para ai se realizar a detecção e a quantificação do padrão de expressão do gene ASAM. Os resultados obtidos são 23 comparados com os valores normais de referência para os referidos genes de fluidos da bexiga.

De acordo com um outro aspecto da invenção, esta prevê a utilização da combinação de genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM e MCM10 como marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga. A invenção prevê também a utilização da combinação dos genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT, e MCM10 como marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Também está prevista a utilização de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM e suas combinações como marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene C14orf78 como marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene KLF9 como marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene POSTN como marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene PPP1 R14D como marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene ASAM como marcador para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

Um outro aspecto da invenção incide sobre a utilização de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D, ASAM e suas combinações, combinadamente pelo menos com mais um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, 24 CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1 A6, TERT e MCM10, enquanto marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito à utilização de uma combinação dos genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPPl R14D, SLC1A6 e TERT, enquanto marcadores para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Um outro aspecto da presente invenção incide sobre a utilização da combinação de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 e TERT como marcadores para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito à utilização de um gene seleccionado entre Cl4orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D e suas combinações, enquanto marcadores para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Também está prevista a utilização do gene C14orf78 como marcador para o diagnóstico do cancro da bexiga.

De igual modo, está prevista a utilização do gene KLF9 como marcador para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Também está prevista a utilização do gene POSTN como marcador para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Também está prevista a utilização do gene PPP1R14D como marcador para o diagnóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização de um gene seleccionado entre Cl4orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D e suas combinações, combinadamente pelo menos com mais um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 e TERT, enquanto marcadores para o diagnóstico do cancro da bexiga. 25

Está prevista a utilização da combinação dos genes ASAM e MCM10 como marcadores para o prognóstico do cancro da bexiga.

Está prevista a utilização do gene ASAM como marcador para o prognóstico do cancro da bexiga.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, o qual compreende um conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação do padrão de expressão da combinação dos genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1 R14D, SLC1A6, TERT, ASAM e MCM10

De acordo com um outro aspecto, o estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, compreende um conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação do padrão de expressão da combinação de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6, TERT e MCM10.

De acordo com um outro aspecto, está previsto um estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, com base num conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM e suas combinações. 0 estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, com base no conjunto de sondas para a detecção e quantificação de um gene seleccionado entre Cl4orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D, ASAM e suas combinações, compreende complementarmente um conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação de um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLCl A6, TERT e MCM10. 26

De acordo com um outro aspecto, está previsto um estojo para o diagnóstico do cancro da bexiga, com base num conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação do padrão de expressão da combinação dos genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 e TERT.

De acordo com um outro aspecto, o estojo para o diagnóstico do cancro da bexiga, compreende um conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação do padrão de expressão da combinação de genes ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1A6 e TERT.

De acordo com um outro aspecto, está previsto um estojo para o diagnóstico do cancro da bexiga, com base num conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação de um gene seleccionado entre Cl4orf78, KLF9, POSTN, PPP1R14D e suas combinações.

De acordo com um outro aspecto, o referido estojo, com base num conjunto de sondas para a detecção e quantificação de um gene seleccionado entre C14orf78, KLF9, POSTN, PPP1 R14D e suas combinações, compreende complementarmente sondas adequadas para a detecção e quantificação pelo menos de mais um gene seleccionado entre ANXA10, CTSE, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, SLC1 A6 e TERT.

De acordo com um outro aspecto, está previsto um estojo para o prognóstico do cancro da bexiga, com base num conjunto de sondas adequadas para a detecção e quantificação do padrão de expressão da combinação dos genes ASAM e MCM10.

De acordo comum outro aspecto, o estojo de prognóstico tem por base uma sonda adequada para a detecção e quantificação do gene ASAM. 27 0 Quadro 1 ilustra os 14 genes identificados como marcadores genéticos para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga. Os genes ASAM e MCM10 são dois genes específicos para prognóstico.

Seguidamente são apresentados vários exemplos considerados úteis, a título ilustrativo mas não limitativo da presente invenção

Exemplos

Exemplo 1. Determinação da importância da degradação nas amostras de fluidos vesicais

Para se levar à prática o objectivo final da presente invenção foi necessário conhecer o impacto de diferentes níveis de degradação de ARN sobre os perfis de expressão génica, tendo em conta que a qualidade do ARN obtido a partir dos fluidos vesicais (urina e/ou efluentes de lavagem da bexiga) é geralmente fraca. Também teve de se determinar se os perfis de expressão génica obtidos a partir dos fluidos vesicais condiziam com os obtidos em tumores correspondentes.

1. Selecção de amostras e preparação de ARN

Seleccionou-se uma amostra de tecido tumoral (T) e de efluente de lavagem da bexiga (BW) proveniente apenas do mesmo paciente ao qual se diagnosticou pT2 de gravidade elevada (G3) [em conformidade com os métodos descritos nas obras de Lopez-Beltran A, Sauter G, Gasser T, Hartmann A, Schmitz-Dráger BJ, Helpap B, Ayala AG, Tamboni P, Knowles 28 MA, Sidransky D, Cordon-Cardo C, Jones PA, Cairns P, Simon R, Amin MB, Tyczynsky JE. Tumours of the Urinary System. In: Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Sesterhenn IA (eds.), Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. World Health Organization Classification of Tumours. Lyon: IARC Press; 2004: 89-157; Sobin LH, Wittekind CH. TNM Classification of Malignant Tumours. International Union Against Câncer., 6th ed. New York: Jonh Wiley & Sons; 2002] . Extraiu-se o ARN de ambas as amostras (TO e BWO) com TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.), em conformidade com as instruções do fornecedor. Seguidamente foram degradadas aliquotas das duas amostras de ARN (TO e BWO), mantendo-as a incubar a 80°C durante 15 (Tl e BWl), 30 (T2 e BW2) e 60 (T3 e BW3) minutos, para se obter três níveis de degradação, conforme descrito por Xiang CC, Chen M, Ma L et al. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31:53, com a excepção de se ter utilizado água em vez e um tampão alcalino.

Efectuou-se também a colheita de amostras de mucosa de bexigas saudáveis provenientes de quatro indivíduos sem evidência de patologia vesical (amostras de contraprova), tendo o ARN sido obtido da mesma maneira praticada com as amostras anteriores e tendo sido as quatro amostras de ARN misturadas em proporções equimolares (C0).

Efectuou-se a análise de 1 pL de cada uma das amostras de ARN intacto e degradado, utilizando para tal um bioanalisador 'Agilent 2100' que serviu para determinar a qualidade de cada ARN (em conformidade com o método descrito por Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V et al., 29 apropriado para a normalização de avaliações de qualidade de ARN, utilizando classificadores, independentes do utilizador, de vestígios de electroforese microcapilar. Nucleic Acids Res 2005; 33:e56) (Figuras l.A-H). A figura 1 (J) mostra o gel com as bandas dos ARN ribossómicos (28S e 18S) de cada uma das amostras analisadas, em que se observa a degradação progressiva destas bandas.

Além disso, efectuou-se a colheita de 36 efluentes de lavagem de bexigas com tumores (8 pTa de fraca gravidade (LG) , 5 pTa de elevada gravidade (HG), 3 pTl LG, 5 pTl HG, 4 pTis, 9 pT2 HG e 2 pT4 HG) e 14 efluentes de lavagem de bexigas de contraprova de referência, de indivíduos sem patologia vesical, e extraiu-se o ARN da mesma maneira descrita nos casos anteriores. 2. Amplificação e marcação de ARN in vitro

Efectuou-se a amplificação de 5 yg de ARN intacto (TO e BWO) e de ARN degradado (Tl, T2, T3, BW1, BW2 e BW3), utilizando iniciadores com uma sequência aleatória de 9 nucleótidos (iniciadores nonaméricos aleatórios) modificados pela adição, em 3', da sequência do promotor de T3 (T3N9) (de acordo com Xiang CC, Chen M, Ma L et ai. A new strategy to amplify degraded RNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003; 31:e53). As sondas foram sintetizadas por meio de um método de marcação directa (em conformidade com Richter A, Schwager C, Hentze S, Ansorge W, Hentze MW, Muckenthaler M. Comparison of fluorescent tag DNA labeling methods used for expression analysis by DNA microarrays. Biotechniques 2002; 33:620-8, 630). 30 3. Processamento matricial e análise de dados

Foram utilizadas micromatrizes de ADNc humano em lamelas de 'Oncochip-V2' ((http: // grupos.cnio.es/ genomica/ arrays/ reports/ochip_v2.xis) para co-hibridar cada uma das quatro aliquotas de ARN degradado progressivamente, quer de tumores quer de efluentes de lavagem da bexiga (TO, Tl, T2, T3, BWO, BW1, BW2 e BW3), com a mistura dos ARN das amostras de mucosas de bexigas saudáveis (CO). As imagens fluorescentes foram obtidas com o sistema de varrimento de micromatrizes 'G2565BA' (Agilent, Technologies, Waldbronn, Alemanha) e efectuou-se a quantificação das imagens obtidas por TIFF, utilizando o programa 'Spot' (http:// experimental.act.cmis.csiro.au/Spot) em ambiente estatístico R (http://www.r-project.org). A medição da intensidade final de cada ponto da micromatriz foi calculada conforme já anteriormente sugerido (http: //www.stat.berkeley.edu/ users/ terry/ zarray/ Html/ image.html) (dados acessíveis a todas as pessoas no banco de dados 'GEO'; GSE3192). Finalmente, foram obtidos 1111 clones válidos que estavam em conformidade com todos os critérios de qualidade e os 100 clones mais diferencialmente expressos de cada matriz foram escolhidos para se fazer uma comparação entre matrizes e para se calcular as percentagens de genes comuns entre eles. Detectou-se uma percentagem elevada de genes diferencialmente expressos em comum, entre as matrizes de tecidos tumorais (85 a 91%) e entre as matrizes de efluentes de lavagem das bexigas (78 a 93%) (figuras 2A), o que indicou que a degradação do ARN não afectou, virtualmente, os perfis de expressão génica.

Preparou-se também um aglomerado não inspeccionado de todos os clones contidos na micromatriz, utilizando a 31 metodologia UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) e a correlação de Pearson. Este aglomerado indicou que a percentagem de genes em comum, identificada entre as duas matrizes hibridadas com ARN com um nivel de degradação diferente (por exemplo, BWO e BW1) foi, ocasionalmente, superior à percentagem entre duplicados com permuta de corantes (DS) da mesma matriz (por exemplo, BWO vs. BWO-DS) (figura 2b), o que vem reforçar a conclusão de que os perfis de expressão génica não são virtualmente alterados quando se trabalha com ARN parcialmente degradado.

Para se determinar se os perfis de expressão génica obtidos a partir das amostras de efluentes das lavagens de bexigas condizem com os obtidos nos tumores correspondentes, comparou-se a percentagem de genes expressos diferencialmente em comum entre as matrizes de tecidos tumorais e as matrizes de efluentes de lavagem das bexigas. Obteve-se uma similaridade elevada entre amostras tumorais e efluentes de lavagem de bexigas (52 a 60%), sendo esta similaridade independente do estado de degradação do ARN.

Em conclusão, estes dados sugerem que o ARN de efluentes de lavagem de bexigas, parcialmente degradado, poderia ser utilizado para estudos de expressão génica utilizando micromatrizes, e que este ARN é um reflexo da expressão génica do tumor. 4. PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Para se validar o facto de os resultados obtidos na micromatrizes de um paciente particular poderem ser extrapolados para um grupo maior, foram analisados quatro 32 genes expressos diferencialmente nas matrizes, os quais estavam conotados com o processo de carcinogénese vesical, de acordo com o publicado na literatura (KRT20, IGF2, GSN e CCL2), por meio de qRT-PCR. Para esta validação foram utilizados mais 36 efluentes de lavagens de bexigas com tumores e mais 14 efluentes de lavagens de bexigas de contraprova de referência.

Sintetizou-se o ADNc a partir de 1 pg de ARN, utilizando o estojo 'High-Capacity cDNA Archive' (Applied Biosystems, Foster City, E.U.A.), em conformidade com as instruções do fornecedor, com a excepção de se ter reduzido o volume final da reacção para 50 pL. Utilizou-se o gene GUSB como referência endógena. Os protocolos de PCR foram efectuados utilizando os produtos de expressão génica 'Assays-on-Demand™' num sistema ΆΒΙ PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems, Foster City, EUA), em conformidade com as instruções do fornecedor, com a excepção de se ter reduzido o volume da reacção para 20 pL.

Utilizou-se o método ΔΔ0Τ (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2: Relative Quantification of Gene Expression P/N 4303859) para calcular a quantidade relativa de expressão de cada gene em relação à média da expressão das 14 amostras de referência. Para se estabelecer o valor de referência nas contraprovas, obteve-se a média aritmética dos valores de expressão dos 14 efluentes de lavagem de bexigas de contraprova provenientes de pacientes sem patologia vesical.

Os resultados desta análise, expressos como coeficientes de log2, definidos como sendo a proporção ou a divisão (coeficiente) entre as duas condições comparadas (neste caso, a referência endógena perante cada gene indicado), expressos 33 em termos do logaritmo de base 2, confirmaram os resultados das micromatrizes em 81% das amostras para o KRT20, em 89% para o GNS, em 64% para o IGF2 e em 89% para o CCL2 (figura 3) . A elevada consistência entre os dados das micromatrizes, obtidos com as análises feitas a um único paciente, e os dados de qRT-PCR obtidos com as análises feitas a um grupo de 36 pacientes suplementares confirmou que os perfis de expressão génica obtidos nas micromatrizes não se deveram à análise de um único paciente. 5. Conclusão do exemplo 1 É possível utilizar ARN dos efluentes de lavagem de bexigas para se deduzir os perfis de expressão génica dos correspondentes tumores vesicais, quer por meio de micromatrizes de ADNc quer por qRT-PCR.

Exemplo 2. Determinação inicial dos genes elegíveis para o modelo de prognóstico

No momento em que se soube que era possível determinar os perfis de expressão génica em amostras de fluidos vesicais, o objectivo subsequente foi o de se obter dados característicos da expressão génica que fossem tão exaustivos quanto possível. A decisão foi tomada para acompanhar a estratégia de se começar pela análise do maior número possível de genes num número reduzido de amostras, com o intuito de se analisar progressivamente uma quantidade cada vez mais pequena e mais seleccionada de genes numa série mais extensa de amostras, em fases sucessivas. 34

Por sua vez, o protocolo implicou a criação de contraprovas de referência de qualidade bastante rigorosa em todos os passos criticos do processo. Isto implicou a obtenção de amostras biológicas com as caracteristicas desejadas, na sala de operações, por cirurgiões da equipa da 'Fundació Puigvert', armazenagem e conservação das amostras em condições convenientes, as análises anatómicas e patológicas das amostras e o processamento molecular por meio de equipamento laboratorial. 1. Obtenção e selecção de amostras biológicas

As amostras de tecidos foram obtidas na sala de operações, utilizando um instrumento de ressecção com pinças a frio (amostras tumorais) ou directamente com tesouras (amostras de contraprova de referência). Parte do tecido obtido foi imediatamente congelada a -80°C, até ser subsequentemente processada para extracção de ARN, e a parte restante foi enviada para o Departamento de Anatomia Patológica para que fosse feita uma análise anatómica-patológica. Para a extracção do ARN, os tecidos foram homogeneizados mecanicamente e os ARN foram extraídos em conformidade com o protocolo de TRlzol (Invitrogen, Calsbad, CA, EUA). Finalmente, os ARN foram quantificados medindo espectrofotometricamente a absorvência a 260 nm. 2. Grupos de amostras para estudo

Atendendo a que os tumores superficiais e os tumores invasivos parecem ter perfis genéticos diferentes, tomou-se a decisão de comparar os grupos de tumores classificados 35 nos extremos mais afastados (tumores superficiais de fraca gravidade comparados com os tumores infiltrantes) . Além disso, tomou-se também a decisão de encontrar o perfil molecular de um tipo de tumor com um comportamento clinico pouco claro, uma vez que estes tumores são superficiais mas têm um elevado grau de aberrações celulares (classificados como Tl de elevada gravidade, pTl HG) e em muitos casos (cerca de 50%) acabam por ser tumores infiltrantes. Assim, foram definidos quatro grupos de estudo: - Grupo 1: amostras de tumores superficiais de fraca gravidade (LG) que invadem apenas a mucosa vesical (classificados patologicamente como sendo pTa LG); - Grupo 2: amostras de tumores superficiais de elevada gravidade (HG) que invadem o tecido conjuntivo subepitelial (classificados patologicamente como sendo pTl HG); - Grupo 3: amostras de tumores infiltrantes e de elevada gravidade (classificados patologicamente como sendo pT2) ; - Grupo 4: amostras de mucosas de bexigas saudáveis (contraprovas de referência).

Com a finalidade de se reduzir a variância biológica, que era bastante elevada, foram produzidas misturas de amostras de um só e do mesmo tipo de tumor, isto é, com a mesma classificação anatómica e patológica. Assim, foram preparadas 3 misturas de 4-5 amostras de tumores para cada um dos grupos; pTa LG, pTl HG, pT2 HG e contraprovas de referência. 3. Micromatrizes 'Affymetrix'

Embora se tivesse trabalhado previamente com uma plataforma de micromatrizes baseadas no ADNc, sabia-se da 36 literatura que havia outras plataformas comerciais, à base de oligonucleótidos, que poderiam servir para se obter resultados de expressão de um número superior de genes. Finalmente, tomou-se a decisão de utilizar a plataforma 'Affymetrix' (http://www.affymetrix.com/index.affx), atendendo a que há uma grande quantidade de dados disponíveis na base de dados pública para esta plataforma; virtualmente, todas as referências mencionavam a sua elevada qualidade dos resultados e tinha acabadou de ser lançada no mercado uma nova micromatriz (U133 plus 2.0) que permitia determinar a expressão génica da maior parte dos genes humanos.

As micromatrizes 'Affymetrix' foram hibridadas e pesquisadas por uma empresa especializada (Progenika) e os dados de expressão não processados (ou ficheiros de células) foram analisados directamente em ambiente estatístico R, utilizando o algoritmo RMA (Robust Multi array Analysis). 4. Análise de micromatrizes 'Affymetrix'

Depois de obtidos os dados de expressão normalizados para cada clone, tomou-se a decisão de estudar o modo como as diferentes amostras, que haviam sido seleccionadas e aglomeradas conjuntamente, preparando um aglomerado não inspeccionado (figura 4) . Neste último caso, foi possível observar que todas as contraprovas de referência se aglomeravam entre si e que se diferenciavam claramente dos tumores, o que indicou que há muitos genes diferencialmente expressos entre tumores e contraprovas de referência (genes de diagnóstico). Além disso, observou-se também que as três misturas de tumores infiltrantes (pT2_l, pT2_2 e pT2_3) e de tumores superficiais de elevada gravidade (pTl HG 1, pTl HG 2 e pTl HG 3) se aglomeravam 37 conjuntamente e que se diferenciavam das três misturas de tumores superficiais de fraca gravidade (pTl LG_1, pTl LG_2, pTl LG_3), o que deveria permitir localizar genes marcadores de qualquer das vias (genes de prognóstico).

Como sistema de classificação, para comparar os diferentes grupos e para se obter os melhores genes diferencialmente expressos, tomou-se a decisão de se utilizar o quociente entre o valor da intensidade máxima do grupo com a média mais baixa e o valor da intensidade mínima do grupo com a média mais elevada, numa escala logarítmica. Esta medição é equivalente à variação mínima duplicativa que pode ser obtida comparando qualquer réplica de um grupo com qualquer réplica do outro grupo. 0 resultado final obtido correspondeu literalmente a milhares de genes com diferenças de expressão suficientemente significativas entre tumores e contraprovas de referência. 5. Validação dos resultados das micromatrizes por meio de PCR quantitativa em tempo real

Depois de os genes terem sido ordenados, por ordem decrescente da expressão diferencial, tomou-se a decisão de verificar os resultados obtidos com uma técnica totalmente independente e, de acordo com a literatura, muito mais rigorosa, a PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Efectuou-se a selecção de 10 dos genes mais diferencialmente expressos para se executar esta verificação técnica e quantificou-se a sua expressão génica por meio de qRT-PCR, utilizando exactamente as mesmas misturas hibridadas nas micromatrizes (com o objectivo de permitir fazer a comparação dos resultados de ambas as técnicas) e utilizando amostras individuais de cada mistura (com o objectivo de permitir 38 estudar a replicabilidade da técnica qRT-PCR agora existente) (figura 5) . Obteve-se um coeficiente de regressão igual a 0,978 na comparação entre micromatrizes e qRT-PCR, o que indica a existência de uma replicabilidade muito boa entre as duas técnicas. Quando se fez a comparação das médias aritméticas de amostras individuais obtidas por meio de qRT-PCR e a sua expressão nas misturas por meio da mesma técnica, o coeficiente de regressão foi de 0, 995, o que vem confirmar, pelos dados bibliográficos, o facto de a quantificação por meio de qRT-PCR ter uma qualidade técnica excelente. 6. Conclusão do Exemplo 2

Tomando em consideração os resultados observados por meio da quantificação da expressão génica, utilizando duas técnicas totalmente independentes num pequeno grupo de genes, é possivel concluir por extrapolação, que as expressões observadas por meio de micromatrizes parecem ser suficientemente fiáveis para que possam ser utilizadas para definir um grupo robusto de genes elegíveis para uma análise subsequente, mais minuciosa e específica.

Paralelamente, concluiu-se que, embora as micromatrizes fossem adequadas para quantificar as expressões génicas, a técnica de qRT-PCR foi ainda mais exacta, para além de permitir níveis mais elevados de degradação do ARN na amostra, sem que isso afectasse negativamente o resultado final.

Exemplo 3. Primeira selecção de genes elegíveis O objectivo final deste estudo consistiu em seleccionar um grupo reduzido de genes conotados com os CCT da bexiga e 39 permitir obter informação para diagnóstico e prognóstico de tumores, mediante a quantificação da sua expressão. Para tal, verificou-se que é possível utilizar duas técnicas, a das micromatrizes de ADN e a de PCR quantitativa em tempo real. Por meio da tecnologia das micromatrizes, são testados milhares de genes em cada experiência e para a realização das experiências é necessária uma quantidade de ARN maior e de melhor qualidade do que com a metodologia de qRT-PCR. Além disso, esta última tecnologia é de maior exactidão e é possível quantificar o número exacto de genes relevantes. Assim sendo, tomou-se a decisão de utilizar a tecnologia das matrizes de baixa densidade 'TaqMan' (TLDA), com base na qRT-PCR, nas fases subsequentes do estudo. 1. Selecção de 384 genes para os cartões de matrizes de baixa densidade 'TaqMan' (TLDA)

Os cartões para TLDA são cartões de microfluídica que contêm os iniciadores liofilizados e a sonda 'TaqMan' para um máximo de 384 genes (há diferentes configurações de TLDA que permitem analisar 384 genes em um e único cartão e até 48 genes em 8 amostras em uma e única amostra). Posto isto, a partir das experiências anteriormente efectuadas por meio das micromatrizes 'Affymetrix' hibridadas com ARN tecidual, é necessário passar à selecção de um subgrupo de 384 genes. Efectuou-se a selecção dos genes mais diferencialmente expressos entre tumores e contraprovas de referência (genes de diagnóstico) e também dos genes diferencialmente expressos entre os três grupos de tumores: pTa LG, pTl HG pT2 HG (genes de prognóstico).

Além disso, tendo em consideração que um dos objectivos deste projecto era o de trabalhar com fluidos vesicais, a 40 intenção nesta fase do projecto foi a de permitir estudar estes 384 genes, não com ARN tecidual, conforme era feito até ao momento presente, mas sim directamente com fluidos vesicais (urina ou efluentes de lavagem da bexiga). 2. Recolha e processamento de efluentes de lavagem da bexiga e de urina

As amostras dos efluentes de lavagem da bexiga foram obtidas por injecção e aspiração repetidas de um fluido intraoperativamente, antes da ressecção do tumor vesical ou antes da cistectomia. As amostras de urina foram colhidas por micção espontânea antes de o paciente ser submetido à cirurgia. Tanto as amostras dos efluentes de lavagem da bexiga como as amostras de urina foram transportadas para o laboratório em gelo, imediatamente após terem sido colhidas. As amostras foram misturadas com 1/25 volume de EDTA 0,5 M a pH 8,0 e foram centrifugadas a 1000 x g. Com as massas celulares preparou-se nova suspensão em 1 mL de TRlzol (Invitrogen, Calsbad, CA, EUA), tendo sido congeladas a -80°C, até à extracção do ARN.

Foram colhidas e guardadas 425 amostras de efluentes de lavagem de bexigas com tumores, 30 amostras de efluentes de lavagem de bexigas de contraprova, 43 amostras de urina de bexigas com tumores e 158 amostras de urina de contraprova. 3. Extracção de ARN e sintese de ADNc

Os ARN foram extraídos em conformidade com o protocolo de TRlzol (Invitrogen, Calsbad, CA, E.U.A.) e foram quantificados por medição espectrofotométrica da absorvência a 260 nm. 41

Sintetizou-se o ADNc a partir de 1 yg de ARN, utilizando o estojo 'High-Capacity cDNA Archive' (Applied Biosystems, Foster City, EUA), em conformidade com as instruções do fornecedor, com a excepção de se ter reduzido o volume final da reacção para 50 yL. 4. Selecção dos "produtos de expressão génica TagMan" e PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Logo que os genes relevantes foram conhecidos, efectuou-se a selecção dos iniciadores e da sonda fluorescente (TaqMan Assays-on-Demand™ Gene Expression Products) para a quantificação da expressão génica por meio de qRT-PCR, no endereço electrónico da Applied Biosystems (http://www.appliedbiosystems.com/).

Configurou-se um cartão de microfluidica (TaqMan Low Density Array, TLDA) que continha 384 análises correspondentes a genes de diagnóstico e a genes de prognóstico e a genes de contraprova endógenos (figura 8). Esta configuração de TLDA permite analisar uma única amostra por cartão. O quadro da figura 8 indica o nome do gene e o símbolo correspondente, e também o clone 'Affymetrix' em que foi observada a expressão diferencial do gene. Também está definido o nome da análise 'TaqMan Gene Expression Assay (http://www.appliedbiosystems.com/), seleccionada para o cartão de microfluidica da matriz de baixa densidade 'TaqMan'. Por usa vez, o nome desta análise indica a região do gene que irá ser amplificada pela técnica de qRT-PCR. Finalmente, está indicado um dos transcritos principais que irá ser amplificado nesta experiência (ARNm da Seq Ref ou do Gene Bank). 42

Os protocolos de PCR foram realizados num aparelho "ABI PRISM 9700 HD SDS" (Applied Biosystems, Foster City, EAU) , em conformidade com as instruções do fornecedor.

Efectuou-se a análise de um total de 60 amostras por meio da técnica de TLDA para 384 genes: - 39 amostras de efluentes de lavagem de bexigas com tumores - 15 amostras de efluentes de lavagem de bexigas de contraprova - 3 amostras de urina de bexigas com tumores - 3 amostras de sangue periférico; estas análises foram feitas atendendo a que, em análises anteriores, baseadas na micromatriz 'Affymetrix', havia sido observada contaminação de tecidos musculares nas amostras de mucosa vesical supostamente pura e porque houve sinais que levaram a suspeitar que poderia haver contaminação nas amostras de fluidos vesicais, devido ao sistema imunitário. Assim sendo, tomou-se a decisão de analisar 3 amostras linfociticas com a finalidade de se conseguir eliminar, por comparação, os genes que são altamente expressos no sangue (considerando que o sangue poderia ser um contaminante constante nas amostras de fluidos vesicais de pacientes com tumores vesicais). 5. Análise da TLDA de 384 genes

Depois de terem sido efectuadas as PCR, definiu-se os níveis críticos e os níveis de referência considerados mais convenientes para cada gene e os valores Ct (limites do ciclo) ou os dados de expressão não processados, recorrendo ao programa informático SDS 2.1 (Applied Biosystems). 43

Depois disso, calculou-se o valor relativo da expressão de cada gene ou ACt (o valor Ct do gene relevante menos o valor Ct do gene de contraprova endógeno, GUSB no caso vertente) e estudou-se a forma como as amostras individuais se aglomeravam conjuntamente, por meio de um aglomerado não inspeccionado (utilizando distâncias euclidianas e UPGMA) (figura 6) . 0 primeiro nível de classificação que foi observado neste aglomerado é a diferenciação entre as 3 amostras de sangue periférico e as amostras de fluidos vesicais (efluentes de lavagem das bexigas e urina). Além disso, os fluidos vesicais dão origem a subaglomerados num grupo de amostras que se aglomeram entre si na parte superior do aglomerado (desde a amostra B155-RV_T2grave até à amostra B288-RVl_TaG2grave), o qual é formado apenas por amostras de fluidos de bexigas com tumores, e num outro grupo de amostras na parte inferior do aglomerado (desde a amostra B71-RV_TaG2fracoCIS até à amostra B109-RV_T2grave), o qual é formado por uma mistura de fluidos de bexigas com tumores e de contraprova de referência. No interior do aglomerado superior, é possível distinguir, por sua vez, tumores de elevada gravidade e de fraca gravidade, ao passo que no aglomerado inferior há um agrupamento constituído quase apenas pelas amostras de contraprova e um outro agrupamento constituído por uma mistura de amostras de contraprova e amostras tumorais. Convém tomar em consideração que se fez uma modificação ao passar das análises das massas de tecidos para as análises de fluidos vesicais em amostras individuais, pelo que esta perda de poder de discriminação por meio de um aglomerado foi relativamente previsível. 0 objectivo desta análise consistiu em reduzir os genes que se pretendia estudar na fase seguinte, com o número mais 44 elevado de amostras, de 384 para 96. Foram tomados em consideração diferentes parâmetros para o processo de selecção dos melhores genes, incluindo o parâmetro estatístico anteriormente descrito (modificação mínima de duplicação), mas também a proporção em escala logarítmica das medianas dos dois grupos comparados (modificação mediana de duplicação) e uma análise manual individualizada, por genes dos diferentes valores de intensidade. Isto permitiu reduzir o grupo inicial de 384 genes para os 96 genes necessários para a fase subsequente de experiências (figura 9).

Exemplo 4. Segunda selecção de genes para aumentar o poder de diaqnóstico/prognóstico

Nesta fase do trabalho, o objectivo consistiu em aumentar o poder de discriminação entre amostras tumorais e as amostras de contraprova. Para tal, a intenção foi a de se analisar um número mais elevado de amostras de fluidos vesicais e reduzir, se possível, pelo menos para metade o número de genes em que deveria basear-se o protótipo inicial deste sistema de diagnóstico e de prognóstico. 1. Amostras a analisar e TLDA de 96 genes

Foram utilizados cartões de microfluídica (TaqMan Low Density Arrays) que continham 96 análises (figura 9) , os quais foram configurados e tratados de maneira idêntica à descrita para os 384 genes, com a diferença de que esta configuração de TLDA permite analisar 4 amostras por cartão. 45

Analisou-se um total de 80 amostras por meio da técnica de TLDA de 96 genes: - 42 amostras de efluentes de lavagem de bexigas com tumores - 8 amostras de efluentes de lavagem de bexigas de contraprova de referência - 15 amostras de urina de bexigas com tumores - 15 amostras de urina de bexigas de contraprova de referência. 2. Análise das TLDA de 96 genes

Tendo em conta que a tecnologia utilizada na fase anterior das experiências (exemplo 3) foi exactamente a mesma que é utilizada neste exemplo e que os genes analisados nesta fase foram já incluídos nas TLDA dos 384 genes anteriormente analisados, tomou-se a decisão de extrair e acrescentar as 60 amostras do exemplo 3, com os dados das novas 80 amostras (total = 140 amostras).

Efectuou-se uma primeira análise por meio de um aglomerado não inspeccionado das 140 amostras com as expressões dos 96 genes, tendo sido possível observar dois grupos grandes claramente distintos (figura 7). No primeiro grupo (figura 7.B) todas as amostras são tumorais, sem excepção. Pelo contrário, no segundo grupo (figura 7.A) a maior parte das amostras são de contraprova, mas há algumas amostras tumorais, com um perfil genético que não é possível distinguir de uma amostra normal. A conclusão que é possível extrair deste estudo é a de que a maior parte dos tumores apresentava perfis genéticos característicos que eram diferenciados relativamente às amostras de 46 contraprova, embora houvesse alguns casos em que o perfil geral não se distinguia do perfil de uma amostra normal e, consequentemente, não podiam ser detectados. Observou-se um efeito idêntico ao descrito no exemplo 3, embora a capacidade de discriminação nas amostras fosse agora superior.

Com base nos dados observados a partir destes aglomerados e em análises exploratórias adequadas, com o objectivo de se utilizar outros algoritmos de classificação (tais como a análise de discriminação linear, confinante k mais próximo (KNN), etc.), foi possível observar que persistia o problema da discriminação de alguns tumores relativamente às amostras de contraprova. A nova hipótese de trabalho consistiu em admitir que qualquer sistema para o cálculo global de um valor de discriminação, utilizando um grupo específico de genes, tinha o mesmo problema. Isto consistiu no facto de ser relativamente fácil, devido à elevada heterogeneidade dos tumores, reconhecer os perfis da maior parte deles, os quais iriam ter alterações bastante semelhantes, embora pudesse haver sempre uma minoria de casos em que o comportamento global dos genes seleccionados para as suas análises pudesse não permitir fazer a distinção relativamente a amostras de contraprova, uma vez que poderiam ter vias minoritárias alteradas.

Para se detectar quer os tumores maioritários quer os tumores minoritários, definiu-se um "sistema de alarme" mediante a elaboração de um conjunto de valores entre os quais variam as amostras de contraprova e acrescentando-lhes um intervalo de confiança de modo a que pudesse ser determinado um ponto a partir do qual uma expressão que fosse superior a esse valor (ou inferior, no caso dos genes subexpressos) 47 indicaria a existência de um tumor, independentemente dos valores de expressão observados nos outros genes. A vantagem deste sistema, apesar de o tumor possuir perfis de expressão gerais semelhantes aos de amostras saudáveis, reside no facto de permitir, se um dos genes de alarme for accionado, afirmar que a amostra é uma amostra tumoral. 0 primeiro passo para o desenvolvimento do referido sistema consistiu em estimar os intervalos de expressão dos genes de contraprova e os seus intervalos de confiança. Uma vez que era muito importante que os valores das contraprovas de referência não tivessem erros técnicos que pudessem alterar falsamente os intervalos de variação, tomou-se a decisão de eliminar as contraprovas que não tivessem um nível de qualidade mínima. Para se calcular estes valores de qualidade, foram utilizados 3 genes (GUSB, 18S e PPIA) que foram suplementarmente utilizados como contraprovas endógenas (por cálculo da sua média geométrica) para a quantificação relativa de todos os genes. Analisando o comportamento individual da distribuição de cada gene, foi possível verificar que havia uma correspondência suficiente com uma distribuição normal, pelo que não foi possível estabelecer intervalos de confiança com base na sua variância. Em alternativa, tomou-se a decisão de definir intervalos de confiança arbitrários e fixos com diferentes níveis de rigor (tomou-se a decisão de considerar, como valor crítico, um valor igual a 2 vezes, 4 vezes ou 8 vezes o valor da contraprova, com valores de expressão que fossem semelhantes aos dos tumores).

Depois de determinado o ponto crítico para cada gene, toda esta informação foi agrupada numa matriz onde estavam inscritos os valores para os 96 genes, comparativamente com 48 as amostras tumorais. Os valores que não excederam o valor crítico receberam a notação 0 e os que efectivamente o excederam receberam a notação 1 (para cada nível de rigor). Para a selecção dos melhores genes (com os quais houve a intenção de reduzir o perfil pelo menos para 48) , foram consideradas duas propriedades: 1) que o gene pudesse detectar um número elevado de tumores (pesquisando aquele que tivesse a mais elevada soma de valores 1), e 2) que esta detecção fosse tão independente quanto possível relativamente a outros genes de alarme (com a finalidade de se poder detectar o máximo de vias minoritárias).

Como resultado, foi possível reduzir o número de genes relevantes para um valor inferior a 48, embora tivesse sido tomada a decisão, por razoes técnicas e em termos conservadores, de manter este número para as suas análises em fases subsequentes, uma vez que alguns intervalos de confiança podem não ser totalmente correctos (devido ao diminuto número de amostras de contraprova analisadas até ao momento presente).

No caso do segundo ficheiro de

Para se automatizar o processo para analisar novas amostras com os perfis genéticos dos 48 genes seleccionados (figura 10) , desenvolveu-se um programa informático que permite realizar uma previsão de diagnóstico, começando com os valores de Ct obtidos pela técnica de qRT-PCR. Este programa informático permite utilizar diferentes ficheiros de parâmetros (consoante o rigor nos intervalos) , pelo que os valores de sensibilidade (SN) e de especificidade (SP) variam. Utilizando o ficheiro de parâmetros de menor rigor (sendo o ponto crítico o dobro do valor de contraprova que é o mais próximo para os tumores), obteve-se os valores SN=100% e SP=100%. 49 parâmetros (aquele em que o valor crítico é 4 vezes o valor de contraprova que é o mais próximo para os tumores), obteve-se os valores SN=98,96% e SP=100%. No último caso (aquele em que o valor crítico é 8 vezes o pior valor de contraprova), obteve-se os valores SN=97,93% e SP=100%. É importante indicar que estes resultados foram obtidos com as mesmas amostras utilizadas para gerar os ficheiros de parâmetros, ocorrendo por isso, provavelmente, um ajustamento excessivo que será necessário avaliar em experiências subsequentes com novas amostras.

Exemplo 5. Desenvolvimento de um modelo de diagnóstico final

Os objectivos nesta fase do projecto consistiram em testar e aperfeiçoar o modelo de previsão de tumores e também reduzir, para um valor mínimo, o número de genes utilizados para a realização da previsão.

Para esta fase foi necessário amplificar muito mais o grupo de amostras tumorais e de contraprova. Foram analisadas 440 novas amostras por meio de cartões de microfluídica com 48 genes, os quais foram acrescentados aos dados do exemplo 3 (60 amostras) e do exemplo 4 (80 amostras).

Depois de terem sido efectuadas as verificações de qualidade mínima nas amostras, estas foram analisadas por meio do modelo de alarme qualitativo previamente descrito. O resultado obtido (SN=0,81 e SP=0,81) foi bastante diferente daquele que é obtido com o modelo final do exemplo 4, pelo que se tomou a decisão de procurar aperfeiçoá-lo, porque tinha provavelmente muito treino excessivo. 50 A partir da observação dos histogramas de frequência discretos de cada um dos genes, foi possível inferir o modo de distribuição das amostras tumorais e de contraprova. Devido ao facto de se ter aumentado bastante o número de amostras, o limite de sobreposição entre as distribuições foi consideravelmente reduzido. Também foi possível observar, embora com uma frequência bastante diminuta, que alguns casos de contraprova de referência tinham níveis de expressão que eram bastante semelhantes aos dos tumores.

Embora a um nível conceptual, o sistema de alarme quantitativo, agora desenvolvido, fosse considerado como uma boa aproximação ao comportamento celular das expressões génicas, a impossibilidade de quantificar a importância de cada um dos genes constitui uma limitação muito significativa ao seu poder de previsão.

Com base no mesmo conceito de alarme, tomou-se a decisão de procurar desenvolver um modelo quantitativo, o que foi possível recorrendo ao teorema das probabilidades condicionais de Bayes.

Uma vez que o número de amostras analisadas é suficientemente elevado, dado um valor de expressão, é possível estimar as probabilidades de que a amostra seja quer uma amostra tumoral quer uma amostra de contraprova, a partir das frequências de expressão observadas.

Uma das vantagens de um modelo que tenha por base o teorema de Bayes reside no facto de poder ser aplicado independentemente a cada gene detector. A expressão génica observada irá modificar a probabilidade de ser, a priori, um tumor, gerando uma probabilidade a posteriori, que pode ser utilizada novamente como probabilidade a priori para o 51 gene seguinte. Na realidade, a independência entre os diferentes genes está a ser assumida implicitamente. 0 número final de amostras com que foi possível aplicar o modelo foi de 380 amostras tumorais e 156 amostras de contraprova de referência.

Quando este modelo foi aplicado, de forma iterativa, aos 48 genes, obteve-se um aperfeiçoamento significativo no poder de previsão do modelo qualitativo anterior (SN=0,86 e SP=0,92), embora ao estudar-se os histogramas de frequência se pudesse observar que muitos genes pareciam não contribuir com nenhuma informação significativa para o modelo final. Assim sendo, foi proposto que se fizesse a selecção do subgrupo de genes suficientes e necessários para capturarem o máximo de informação de diagnóstico das amostras. Não houve nenhuma maneira clara de se realizar a selecção dos genes mais relevantes com recurso ao modelo quantitativo. O antigo modelo qualitativo permitiu, realmente seleccionar os genes mais informativos e, por sua vez, com uma mais elevada independência entre eles. O facto de se utilizar os melhores genes detectados com o modelo qualitativo (CTSE, MAGEA3, CRH, SLC1A6, PPP1R14D, IGF2, C14orf78 e KLF9), comparativamente com o novo modelo quantitativo, revelou uma melhoria importante nos resultados (SN=0,89 e SP=0,96).

Em qualquer dos casos, tomou-se a decisão de experimentar outras aproximações. A partir da análise visual dos histogramas de frequência dos 48 genes, efectuou-se a selecção do subgrupo aparentemente mais informativo (ANXA10, CRH, IGF2, KRT20, MAGEA3, POSTN, SLC1A6 e TERT) e com histogramas que revelaram a maior 52 variação entre uns e outros (esperando-se que este facto possa indicar uma maior independência entre eles). Os resultados obtidos revelaram também uma melhoria significativa em relação à análise dos 48 genes (SN=0,90 e SP=0,96).

Finalmente, uma vez que tanto o subgrupo de genes obtidos por meio do modelo qualitativo como os genes seleccionados visualmente revelaram melhorias em relação ao modelo quantitativo inicial, tomou-se a decisão de combinar os genes das duas aproximações (ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6 e TERT) . 0 resultado do modelo combinado foi ligeiramente melhor do que com qualquer um deles (SN=0,91 e SP=0,96).

Depois de o modelo ter sido obtido, tomou-se a decisão de se estudar se havia algum padrão comum, tanto nas amostras tumorais como nas de contraprova, que tivesse sido classificado incorrectamente. No caso das amostras de contraprova, foi possível detectar uma presença significativa de amostras com tumores em contacto com o sistema urinário (sobretudo da próstata, rins e pénis) . Estes tipos de amostras têm provavelmente padrões de expressão comuns com os tumores vesicais, pelo que podem enganar o modelo de previsão. Por tal motivo, tomou-se a decisão de se eliminar das amostras de contraprova de referência todos os casos com tumores que pudessem eventualmente estar em contacto com o sistema urinário. 0 número de amostras de contraprova de referência diminui de 156 para 126, havendo no entanto 308 amostras tumorais. Observou-se uma melhoria importante (SN=0,90 e SP=0,93) utilizando o modelo quantitativo com os 48 genes nesta nova população. No caso dos 8 genes mais 53 independentes, foram obtidos os valores SN=0,91 e SP=0,97. No subgrupo com os histogramas mais interessantes, foram obtidos os valores SN=0,91 e SP=0,97. Finalmente, no subgrupo de genes combinados foram obtidos os valores SN=0,93 e SP=0,97. Calculando novamente os dados com cada subgrupo previamente seleccionado, é possível ver, geralmente, que o poder do modelo aumentou quando foram eliminados estes tipos de contraprovas de referência.

No que diz respeito ao estudo dos tumores erroneamente classificados, detectou-se um aumento significativo do número de cistectomias presentes neste grupo. Presume-se que a ressecção transuretral feita anteriormente (TUR), que é efectuada frequentemente num momento bastante próximo do momento da cirurgia radical, poderia ter alterado o perfil molecular que foi observado, uma vez que as massas tumorais haviam sido fisicamente removidas, parcial ou totalmente, das paredes epiteliais da bexiga. Embora neste estudo os casos de cistectomia não tenham sido eliminados, uma vez que os dados não são conclusivos, recomenda-se que não sejam incluídos estes tipos de amostras nas análises de novas populações.

Exemplo 6. Desenvolvimento de um modelo de prognóstico final

Embora a preocupação mais importante fosse a previsão de tumores (previsão de diagnóstico), também houve interesse em classificar os diferentes tipos de tumores (previsão de prognóstico), o que constitui o objectivo principal desta secção. Esta classificação poderia permitir personalizar ainda mais os tratamentos em cada caso. 54 A classificação de tumores baseia-se, presentemente, na observação macroscópica e microscópica feita em laboratório de anatomia patológica. A sua classificação é decidida por meio de observações mais ou menos normalizadas, com base na profundidade do tumor e no aspecto microscópico das células. Estudos moleculares recentes parecem indicar que há, presentemente, dois perfis genéticos diferentes que permitem diferenciar bastante bem tumores de tipo superficial e tumores infiltrantes.

Para se construir um modelo de classificação de prognóstico, os diferentes grupos de tumores têm de ser separados correctamente. As observações anatómicas e patológicas não garantem a concordância com o comportamento ao nivel molecular das amostras, pelo que não parece ser uma boa ideia deduzir um modelo de prognóstico apenas com base nesta classificação. Escolheu-se a utilização de um sistema de classificação por meio de um aglomerado não inspeccionado (que permite separar bastante bem as amostras em dois grandes grupos), para além de se ter levado em consideração a gravidade anatómica-patológica (AP).

Como grupo de amostras válidas de tumores superficiais foi necessário aglomerá-las conjuntamente, de acordo com o aglomerado no grupo que lhes corresponde e, de acordo com a gravidade AP, tinham de ser tumores Ta e TI de fraca gravidade e sem nenhum carcinoma associado in situ (CIS). Os tumores infiltrantes tinham de pertencer ao grupo correspondente do aglomerado e de acordo com a gravidade AP tinham de ser tumores Tl, T2, T3 ou T4 de elevada gravidade e nenhum dos tumores devia ter a presença de CIS.

No grupo de amostras definidas como sendo tumores superficiais, foram classificados 129 dos 308 tumores. No 55 grupo definido como tumores infiltrantes, foram classificados 100 dos 308 tumores. Finalmente, houve 79 amostras tumorais em que foram observadas discrepâncias entre a sua classificação anatómica-patológica e o seu perfil molecular ou então não ficaram claramente definidas dentro dos dois grupos principais do aglomerado. A metodologia utilizada para se criar um modelo que permitisse discriminar entre tumores superficiais e infiltrantes é exactamente a mesma que foi utilizada no exemplo 5 para se obter um modelo de diagnóstico.

Ao aplicar-se o teorema de Bayes, utilizando os 48 genes, obteve-se uma boa classificação (SN=0,97 e SP=0,96).

Foi possível observar que os genes relevantes para diagnóstico coincidiram, em grande medida, com os genes para prognóstico, ao analisar-se os histogramas de frequência. No entanto, houve alguns genes (MCM10 e ASAM) que não eram adequados para diagnóstico e eram adequados para prognóstico, pelo que estes dois genes foram acrescentados aos 12 genes previamente seleccionados. Comprovou-se que o modelo resultante com 14 genes funcionava quase perfeitamente (SN=0,99 e SP=1,00). O quadro 1 enumera os 14 genes, indicando o símbolo do gene e o nome do ensaio de expressão génica 'TaqMan' para o cartão de microfluídica da matriz de baixa densidade 'TaqMan'.

Quadro 1 Símbolo do gene Ensaio de expressão génica 'TaqMan' ANXA 10 Hs00200464 ml

Cl4orf78 Hs00746838 sl

CTSE

Hs00157213 ml 56 Símbolo do gene Ensaio de expressão génica 'TaqMan' CRH Hs00174941 ml IGF2 Hs00171254 ml KLF9 HS00230918 ml KRT20 Hs00300643 ml MAGEA3 Hs00366532 ml POSTN Hs00170815 ml PPP1R14D Hs00214613 ml SLC1A6 Hs00192604 ml TERT HsOO162669 ml ASAM Hs0029334 ml MCM10 Hs00218560 ml 57

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

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Lisboa, 07/02/2011

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, in vitro e não invasivo, o qual compreende os passos seguintes: a. detectar e quantificar numa amostra de fluido vesical, proveniente de um indivíduo, o padrão de expressão da combinação dos genes de anexina AIO (ANXA10); grelha 78 de leitura aberta do cromossoma 14 (C14orf78); catepsina E (CTSE); hormona libertadora de corticotropina (CRH); factor 2 de crescimento de tipo insulínico (somatomedina A) (IGF2); factor 9 de tipo Kruppel (KLF9); queratina 20 (KRT20); antigénio associado ao melanoma da família A3 (MAGEA3); periostina, factor específico dos osteoblastos (POSTN); proteína fosfatase 1, subunidade reguladora 14D (inibidor) (PPP1R14D); família 1 de veículos osmóticos (transportador de glutamato/aspartato de elevada afinidade), elemento 6 (SLC1A6); transcriptase inversa da telomerase (TERT); molécula de adesão específica dos adipócitos (ASAM) e minicromossoma 10 de manutenção imperfeita (S. cerevisiae) (MCM10); e b. comparar os resultados obtidos no passo a) com os valores normais de referência para os referidos genes em fluidos vesicais.

2. Processo in vitro e não invasivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a amostra de fluido vesical ser a urina.

3. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a quantificação da expressão dos 2 genes no passo a) ser efectuada por PCR quantitativa em tempo real.

4. Utilização in vitro da combinação dos genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM e MCM10 enquanto marcadores para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga

5. Estojo para o diagnóstico e/ou prognóstico do cancro da bexiga, para a execução do processo da reivindicação 1, o qual contém um conjunto de sondas adequadas para detectar e quantificar o padrão de expressão da combinação dos genes ANXA10, C14orf78, CTSE, CRH, IGF2, KLF9, KRT20, MAGEA3, POSTN, PPP1R14D, SLC1A6, TERT, ASAM e MCM10. Lisboa, 07/02/2011 1/43 Fluorescência

FIG. ΙΑ 2/43

FIG. 1B 3/43

FIG. 1C 4/43

FIG. 1D Tempo {segundos) 5/43 .2 õ c «u ο φ φ 1_ ο 3 LL 120- 110-100-90 -80-70-60 £ 50 40 30 20 ·| 10 0 -É- το ι , ι\ I t Μ j \ 1 \ ' - χ-' <0 ν· "'w^\ 'V- 19 24 29 34 39 44 49 Tempo (segundos) 54 59 6/43 110-Ε 10θ| 90 ! 801 iS 70 I 60 ΐ « 50- Ο o 40-Ε 30-201 1θ| 0 JU λ ! V, ; ι )! i ' 1 βν.... 19 24 29 34 39 44 49 Tempo (segundos) 54 59 64 69 FIG. 1F 7/43 Fluorescência

FIG, 1G 8/43 60-' Fluorescência

FIG. 1H 19 24 29 34 39 44 49 . 54 59 64 69 Tempo (segundos) 9/43 Fluorescência

FIG. II 10/43

FIG, IJ 11/43 »)

0.1000(30 HG. 2 12/43

FIG. 3 13/43 Ρ'ΪΪΜ ρϊΐ KGJ pT1 HGJ2 pTl HG_3 pT2_2 pT2„3 pia LGJ2 pTa IBJ pTa LGJ3 CReferência_2 - Referência_1 —Referência_3 4 14/43

FIG.5 15/43

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FIG. 6 “çTOT—™ C844-S0 w»-bjw*is wbw»jaeatBt a-íía-^jríai»Mwwjras BímVJWsb Btocd Jfr*93 Btaod J2-121 Bkwai J*~$4 Sangue 16/43

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17/43

B?~fc B3fc~R esra-ií BS17-R eaes-R easo-i* 0934-0 84f,J..O B4S5-B 8437-'« £378-R cosa-e Bais-ft 075>-ft BTa-R éi94“'R ©484-S esça-fi: m*2-a 8493-ft sast-R ssaa-R 6177-» 8146-R B4 14-JS essi-R β£41-Κ »210-R Í52Ç-6-1Í SS4S-R 0439-(¾ SÍM-RJ? SlOS-R 0457-R B472-R m?-i* 9ja*-R ei26-e^a B544-R 6474 R mi*g f54Çi-ft sias-R eaie-fi 6.1-87-8 8*iS"R ests-s Bi ií3-W eríi-a 0261-R B47.1-0 8471-« B449-B S1M41 6474-ft 0479-0 sea-H eaçfe-R 8lSl~fi Ç»3íS«t-~f? B1-17-R 85 OS-S 651,9-8 as 09-0 B46S-0 SSSU-R B144-S 6SÍMM* OSOS-RJl oí’«a~s· BlS-.fi 8176-» 64S5-R T 18/43 Símbolo do gene Clone da Affymetrix Ensaio TaqMan de expressão do gene Seq. De Ref. do banco ARNm dos genes Nome do gene ABCA8 ABL1 204719 at Hs00200350 ml Hs00245445 ml NM 007168 2 RefSeqs Membro 8 ABC1 da subfamília A de cassete de ligação de ATP Homólogo 1 do oncogene virai da leucemia dos murinos de Abelson-abl ADAM19 209765 at Hs00224960 ml 2RefSeqs MAtriz β do domínio 19 de uma metaloprotease e um desintegrina ADAMTS1 22162 s at Hs00198608 ml NM 006988 Reprolisina de uma metaloprotease e de tipo desintegrina com o motivo 1 da trombospondina de tipo 1 AEBP1 201792 at HS00371239 ml NM 001129 Proteína 1 de ligação AIM2 206513 at HS00175457 ml NM 004833 Ausente no melanoma AKR1B10 AL137566 ANK2 206561 s at 228554 at 202920 at HS00252524 ml Hs00612017sl Hs00159998 ml NM 020299 AL 137566 Aldose-reductase do membro B10 da fanília 1 de aldo-ceto-reductase Anquirina neuronal 2 ANLN 222608 s at HS00218803 ml NM018685 Anilina, proteína de ligação da actina (fragmentos homólogos, Drosophila) ANXAl 233011 at Hs00167549 ml NM 000700 Anaxina AI ANXA10 233011 at HS00200464 ml NM 007193 Anaxina 10 AOC3 204894 s at HS00186647 ml NM 003734 Amina oxidase com cobre, contendo 3 proteínas 1 de adesão vascular APOBEC3B 206632 s at Hs00358981 ml NM 004900 Enzima que edita o ARNm da apolipoproteína B, polipeptido catalítico de tipo 3B AREG 205239 at Hs00155832 ml NM 001657 Factor de crescimento de anfirregulina, derivadode schwannona ARGBP2 225728 at HS00221428 ml NM 021069 Proteína ArgBP2 interactuante com Abl ASAM 226834 at HS00293345 ml NM 024769 Molécula de adesão específica dos adipócitos AS PM 219918 s at HS00411505 ml NM 018136 Asp (de tipo poliforme anormal), associado à microcefalia (Drosophila) FIG. 8A 19/43 ATF3 ATP5B ATP8B2 202672 s at 226771 at Ha00231069 ml Ha00266077 ml Hg00393111 ml NM 001686 NM 020452 activação do factor 3 de transcrição ATPase, Classe I, tipo 8B, membro 2. DKKFZP566K1924. Grelha 32 de C2orf32 226751 at Hg00384403 ml NM 015463 OLFMLI 217525 at H300416948 ml NM 198474 leitura aberta do cromossoma 2 MVAL564 UN0564. Olfactomedina de BAG2 209406 at H300188716 ml NM 004282 tipo 1, OLFMLI Proteína Bcl-2 reguladora da MGC16635 236285 at Hs00536653 sl NM 138433 apoptose Proteína BC009980 hipotética. LOC387882 BMP5 225105 at 205431 s at Hg00329098 ml Hs00234930 ml NM 207376 NM 021073 LOC113730. Repetição de Kelch. Proteína 5 morfogénica dos ossos. KLF9 203542 g at HS00230918 ml NM 001206 Proteína 1 de ligação ao elemento BOB19 203755 at H300176169 ml NM 001211 de transcrição básico BUB1, gemação não inibida por C10orf3 218542 at Hs00216688 ml NM 0181 leveduras β homólogas de benzimidazaóis 1 Grelha 3 de leitura aberta do ClOorf87 1552566 at Hs00332436 ml NM 144587 cromossoma 10. Grelha 87 de leitura aberta do C14orf78 C2orf23 212992 at 204364 s at Hs00746838 sl Hs00224761 ml NM 022912 cromossoma 10. Grelha 78 de leitura aberta do cromossoma 14. Grelha 23 de leitura aberta do C6orfl09 218683 g at HS00209864 ml NM 015388 cromossoma 2. Proteína conotada com T82/DP1 e HVA22. Proteína 1 que interactua com o C7 202992 at Hs00175109 ml NM 000587 antigénio nuclear latente KSHV. KLIP1. Componente 7 do complemento CA2 209301 at HS00163869 ml NM 000067 Anidrase II carbónica. CALD1 CAPNS2 205525 at 223832 s at Hs00189021 ml HS00260517 gl NM 032330 Caldesmon 1. Subunidade 2 pequena de calpaína. FIG. 8B 20/43 CAVl 212097 at HS00184697 ml NM 001753 Proteína caveolina 1 caveolae de 22 kDa. CBFA2T1 228827 at HS00231702 ml 4 Refseqs Factor de ligação central, domínio de perda, subunidade 2 a; translocado para 1; conotado com a ciclona D. CCL11 210133 at HS00237013 ml NM 002986 Ligndo 11 (motivo C-C) das quimioquinas. CCL18 209924 at HS00268113 ml NM 002988 Ligando 18 (motivo C-C) das quimioquinas (quimioquina pulmonar e regulada por activação). CCL2 216598s at HS00234140 ml NM 002982 Ligando 2 (motivo C-C) das quimioquinas. CCNA2 203418 at Hs00153138 ml NM 001237 Ciclina A2. CCNB1 214710 s at HS00259126 ml NM 031966 Ciclina Bl. CCNB2 CCND1 202705 at HS00270424 ml HS00277039 ml NM 004701 NM 053056 Ciclina B2. Ciclina Dl (PRAD1: adenomatose 1 da paratiróide). CCND2 CCNE1 200953 s at HS00233356 ml HS00277041 ml 2 RefSeqs NM 001759 Ciclina El. Ciclina D2. Regulação do ciclo celular. Citocinese. CDC2 210559 s at HS00364293 ml NM 001786 Ciclo de divisão celular 2, de Gl para S e de G2 para M CDC20 202870 s at Hs00415851 gl NM 001255 CDC20 - homólogo 20 do ciclo de divisão celular (s. cerevisiae) CDC6 203967 at Hs00154374 ml NM 001254 CDC6 - homólogo 6 do ciclo de divisão celular (S. cerevisiae) CDCA1 223381 at Hs00230097 ml 2 RefSeqs Associado 1 do ciclo de divisão celular CDCA3 CDH1 223307 at HS00229905 ml Hs00170423 ml NM 031299 NM 004360 Associado 3 do ciclo de divisão celular CAedrina 1, tipo 1, caedrina E (epitelial) CDH11 207173 x at Hs00156438 ml 2 RefSeqs Caedrina 11, tipo 2, caedrina =B (de osteoblastos) CDH19 CDKN2A 206898 at Hs00253534 ml HS00233365 ml NM 021153 3 RefSeqs CAedrina 19, tipo 2 Inibidor 2A da cinase, dependente da ciclina (melanoma, pl6) inibe CDK4 CDKN2B 236313 at HS00365249 ml NM 078487 Inibidor 2B da cinase, dependente da ciclina (pl5) inibe CDK4 FIG. 8C 21/43 CDKN3 209714 s at HS00193192 ml NM 005192 Inibidor da cinase dependente da ciclina (fosfatase de especificidade dupla associada a CDK2) CEACAM6 211657 at Hs00366002 ml NM 002483 Molécula 6 de adesão celular conotada com o antigénio carcinoembriónico (antigénio com reacções cruzadas não especificas) CEACAM7 206199 at Hs00185152 ml NM 006890 Molécula 7 de adesão celular conotada com o antigénio carcinoembriónico CENPA 204962 -P 1 CQ HS00156455 ml NM 001809 Proteína A do centrómerc ) (17 kDa) CENPF 207828 s at Hs00193201 ml NM 016343 Proteína F do centrómero, 350/400 (mitosina) CFL2 224663 s at Hs00368395 gl Cofilina 2 (músculo) ChGn 219049 at HS00218054 ml NM 018371 Condroítina β 1,4-N- acetilgalactosaminil-transferase CHI3L1 209395 at Hs00609691 ml NM 001276 Proteína 1 de tipo quitinase 3 (glicoproteína 39 da cartilagem) CKS2 204170 s at HS00854958 gl NM 001827 Subunidade 2 reguladora da cinase da proteína CDC28 CLCA2 206165 s at HS00197957 ml NM 006536 Membro 2 da família dos canais de cloreto, activado pelo cálcio CLCN3 201733 at HS00156527 ml NM 001829 Canal 3 do cloreto CLIC3 219529 at Hs00362166 gl NM 004669 Canal 3 intracelular do cloreto CLIC4 201560 at HS00749895 gl NM 013943 Canal 4 intracelular do cloreto C0L14A1 212865 -P 1 co Hs00385388 ml Colagénio, tipo XIV, al, undulina C0L15A1 203477 at HS00266332 ml Colagénio, NM 001855 tipo XV, al C0L1A2 202403 s at 11S00164099 ml NM 000089 Colagénio, tipo I, a2 C0L3A1 215076 -P 1 co Hs00164103 ml NM 000090 Colagénio, tipo III, al, síndroma de Ehlers-Danlos, dominante autossémica, tipo IV COL5A2 221730 at HS00169768 ml NM 000393 Colagénio, tipo V, a2. e/ou manutenção celular Crescimento C0L6A1 213428 s at HS00242448 ml NM 001848 Colagénio, tipo VI, al. Adesão celular COL6A2 209156 s at HS00242484 ml NM 001849 Colagénio, tipo VI, a2. Adesão celular à célula FIG. 8D 22/43 C0LEC12 221019 s at Ha00560477 ml 2 Refseqs Membro 12 da subfamilia da colectina CPA3 205624 at Ha00157019 ml NM 001870 Carboxipeptidase (mastocitos) CPE 201116 s at H300175676 ml NM 001873 Carboxipeptidase E CRH 205630 at Hs00174941 ml NM 000756 Hormona libertadora de corticotropina CRTAC1 221204 s at Hs00216208 ml NM 018058 Proteína 1 acldica das cartilagens CTGF 209101 at Ha00170014 ml NM 001901 Factor de crescimento do tecido conjuntivo CTSE 205927 g at Hs00157213 ml Catepsina E CTTN Hs00193322 ml 2 RefSeqs Cortactina VSIG2 228232 g at Ha00204823 ml NM 014312 Receptor dos linfócitos corticais (tipo X. Laevis CTX) C0GBP2 202157 a at Ha00272516 ml NM 006561 Proteína 2 de ligação do ARN da repetição do tripleto CDG CXCL12 209687 at Ha00171022 ml Factor 1 derivado de células de estrona do ligando 12 (motivo C-X-C) da quimioquina CXCR4 217028 at Hs00237052 ml NM 003467 Rceptor 4 (motivo C-X-C) da quimioquina CYBRD1 222453 at Hs 00227411 ml NM 024843 Reductase 1 do citocromo b. Transporte de electrões CYP24A1 Hs00167999 ml NM 000782 Polipeptido 1 da subfamilia A da família 24 do citocromo P450 CYR61 201289 at Hs00155479 ml NM 001554 Indutor 61 anigiogénico rico em cisteína. Regulação do crescimento celular D4S234E 209569 x at Hs00205189 ml NM 014392 Segemento de ADN na sequência expressa 234 do cromossoma 4 (único) DBC1 Hs00180393 ml NM 014618 Suprimido no cancro 1 vesical DCN 209335 at HS00266491 ml Decorina. Organogénese DF 205382 s at Hs00157263 ml NM 001928 Componente D da adipsina do complemento DKFZp434B044 221541 at Hs00230322 ml NM 031476 Proteína DKFZp434B044 hipotética FIG. 8E 23/43 DKFZp56400823 225809 at HS00209875 ml NM 015393 Proteína DKFZP564O0823 DKFZp586H2123 213661 at Hs00405837 ml NM 015430 Proteína DKFZP586H2123 DKKI 204602 at HS00183740 ml NM 012242 Homólogo 1 Dickkopf, Xeiiopus laevis DLG7 203764 at HS00207323 ml NM 014750 Homólogo 7 de discos largos, Drosophila D0C1 1554966 a at HS00706279 sl Diminuição por externalização em cancro 1 do ovário DPT 213068 at HS00170030 ml NM 001937 Dermapontina. Adesão celular DPYSL3 201431 s at HS00181665 ml NM 001387 Di-hidropirimidinase, tipo 3 DSCR1L1 203498 at HS00195165 ml NM 005822 Gene 1, tipo 1, da região crítica da sindrome de Down DTR 203821 at HS00181813 ml NM 001945 Factor de crescimento epidermal de ligação a heparina/receptor de toxina Difteria de tipo factor de crescimento DUSP1 201041 s at HS00610256 gl NM 004417 Fosfatase 1 de dupla especificidade E2F3 HS00605457 ml NM 001949 Factor de transcrição E2F EBF 227646 at Hs00395513 ml NM 024007 Factor de células B precoce ECRG4 223623 at HS00260897 ml NM 032411 Proteína 4 do gene conotado com o cancro do esófago ECT2 219787 s at HS00216455 ml NM 018098 Oncogene 2 da sequência de transformadora de células epiteliais EDNRÃ 204464 s at Hs00609865 ml NM 001957 Receptor de endotelina, tipo A EGR1 201694 s at Hs00152928 ml NM 001964 Resposta 1 de crescimento precoce ENTPD3 206191 at HS00154325 ml NM 001248 Trifosfato-difosfo-hidrolase 3 de ectonucleósidos ΕΡΗΔ3 206070 s at HS00178327 ml NM 005233 EphA3 ΕΡΗΔ7 229288 at HS00177891 ml NM 004440 EphA7 ERBB2 HS00170433 ml 2 RefSeqs Homólogo 2 do oncogene virai de leucemia eritroblástica V-erb-b2, homólogo do oncogene de neuro/glioblastoma de aves FIG. 8F 24/43 F3 204363 at Hs00175225 ml NM 001993 Factor tecidual de tromboplastina III, factor de coagulação FABP4 203980 at Hs00609791 ml NM 001442 Adipócito 4 da proteína de ligação a ácidos gordos FABP6 210445 at Hs00155029 ml NM 001445 Gastrotropina ilegal 6 da proteína de ligação a ácidos gordos FAP 209955 s at Hs00189476 ml NM 004460 Proteína a de activação de fibroblastos FSLN1 202994 s at Hs00242545 ml 4 Refseqs Fibulina 1 FBLN5 203088 at HS00197064 ml NM 006329 Fibulina 5 FBN1 202766 s at Hs00171191 ml NM 000138 Fibrilina 1, síndrome de Marfan FBN2 203184 at HS00417208 ml NM 001999 Fibrilina 2, aracnodactililo contractural congénito FBX032 225328 at HS00369714 ml Proteína 32 única, F-box FEN1 204768 s at Hs00748727 sl NM 004111 Endonuclease específica abalada FGF3 HS00173742 ml NM 005247 Factor 3 de crescimento de fibroblastos (homólogo oncogénico do local de integração do vírus no tumor mamário de murinos (v-int-2)) FGFR1 HS00241111 ml 9 RefSeqs Receptor 1 do factor de crescimento de fibroblastos (tirosina-cinase conotada com fms, síndrome de Pfeiffer) FGFR3 204380 s at HS00179829 ml 2 Refseqs Receptor 3 do factor de crescimento de fibroblastos (acondroplasia tanatofórica, nanismo) FGL2 227265 at Hs00173847 ml NM 006682 FLJ10159 218974 at HS00215979 ml NM 018013 Proteína FLJ10159 hipotética FLJ10719 213007 at Hs00289551 ml NM 016193 Proteína FLJ10719 hipotética FLJ11029 228273 at HS00383634 ml NM 018304 Proteína FLJ11029 hipotética FLJ13710 222835 at Hs00388227 ml NM 024817 Proteína FLJ13710 hipotética TSC 218872 at HS00215487 ml NM 017899 Proteína FLJ20607 hipotética FLJ20701 219093 at Hs00374054 gl Proteína FLJ20701 hipotética FIG. 8G 25/43 FLJ21986 228728 at HS00227735 ml NM 024913 Proteína FLJ21986 hipotética FLJ23191 219747 at HS00375503 ml NM 024574 Proteína FLJ23191 hipotética SPOCD1 235417 at HS00375905 ml NM 144569 Proteína FLJ2234 hipotética. Factor de alongamento da transcrição, região central S-II. FLJ31052 238452_at HS00708284 sl NM 152378 Proteína FLJ31052 hipotética FLJ32569 239929 at HS00611179 ml NM 152491 Poteólise e peptidólise FLJ38736 227174_at HS00419054 ml NM 182758 Proteína FLJ38736 hipotética FN1 211719 x at Hs00365058 ml 7 Refseqs Fibronectina 1 FNBP1 212288 at HS00390705 ml NM 015033 Proteína 1 de ligação a formina FOS 209189 at HS00170630 ml NM 005252 Homólogo oncogénico virai de osteosarcoma de murino FBJ V-fos FOSB 202768 at Hs00171851 ml NM 006732 Homólogo B oncogénico virai de osteosarcoma de murino FBJ FOXF1 205935 at Hs00230962 ml NM 001451 Caixa F1 de 'Forkhead' FOXM1 202580 X at HS00153543 ml 2 Refseqs Caixa Ml 'Forkhead' FYN 210105 s at Hs00176628 ml 3 Refseqs Oncogene FYN conotado com SRC FGR YES FZDT 203706 s at Hs00275833 sl NM 003507 Homólogo 7 erugado, Drosophila GATA6 210002 at HS00232018 ml NM 005257 Proteína 6 de ligação a GATA GEM 204472 at Hs00170633 ml NM 005261 Proteína de ligação a GTP sobreexpressa nos músculos do esqueleto GGH 203560 at HS00608257 ml NM 003878 γ-glutamil-hidrolase (conjugase, folilpoligamaglutamil-hidrolase) GHR 205498 at HS00174872 ml NM 000163 Receptor da hormona do crescimento GJB2 223278 at HS00269615 sl NM 004004 Proteína de junção de abertura, β2, 26 kDa (conexina 26). Sinalização célula-célula GJS6 231771 at HS00272726 sl NM 006783 Proteína de junção de abertura, β6 (conexina 30). FIG. 8H 26/43 GKNl 220191 at Hs00219734 ml NM 019617 Gastroquina 1 GMNN 218350 s at HS00210707 ml NM 015895 Geminina, inibidor de replicação de ADN GPC6 227059 at HS00170677 ml NM 005708 Glipicano 6. Crescimento e/ou manutenção celular GPM6B 209167 at HS00383529 ml 4 RefSeqs Glicoproteína M68 GPR124 221814 at Hs00262150 ml NM 032777 Receptor 124 acoplado a proteína G GREM1 218469 at HS00171951 ml MM 013372 Gremlina 1, superfamília de nós cistéina, homólog (Xenopus laevis) GSN HS00609276 ml 2 RefSeqs Gelsolina, amiloidose de tipo Finlandês GOLP1 204235 s at HS00169604 ml NM 016315 Adaptador engolfado PTB do domínio GOLP, que contém 1 GOSB HS99999908 ml NM 000181 H19 224646 x at Hs00399294 gl H19, impressão de ARNm não traduzido expresso maternalmente HE PH 203903 s at Hs00207710 ml Hefaestina CFH 213800 at HS00164830 ml NM 000186 Complemento do factor 1 H HIST1H1C 209398 at Hs00271185 sl NM 005319 Histona 1 Hlc HIST1H2BD 209911 x at HS00371070 ml NM 138720 Histona 1 H2bd HIST1H2BG 210387 at Hs00374317 sl NM 003518 Histona 1 H2bg HIST2H2AA 214290 g at Hg00358508 sl NM 005316 Histona 2 H2aa HIST2H2BE 202708 s at Hs00269023 sl NM 003528 Histona 2 H2be HMGB2 208808 s at HS00357789 gl NM 002129 Caixa 2 de grupo com elevada mobilidade HMOX1 203665 at HS00157965 ml NM 002133 Heme-oxigenase 1 (desciclização) HN1 217755 at Hs00602957 ml 3 Refseqs Expressão 1 hematológica e neurológica FIG. 81 27/43 HOP 211597 s at Hs00261238 ml 3 RefSeqs Proteína apenas com hoemodomínio HOXBG 205366 s at HS00255831 sl 3 Refseqs Caixa B6 homeo HDXD4 205522 at Hs00429605 ml NM 014621 Caixa D4 homeo HPRT HRAS HSPC150 223229 at HS99999909 ml Hs00610483 ml HS00204359 ml NM 000194 NM 005343 NM 014176 Proteína HSPC150 idêntica à enzima HSPCB HTR1F IER3 201631 s at Hs00607336 gH Hs00265296 sl Hs00174674 ml NM 007355 NM 000866 NM 003897 conjugadora de ubiquitina Receptor 1F de 5-hidroxitriptamina-serotonina Resposta 3 precoce imediata IGF1 209541 at HS00153126 ml NM 000618 Factor 1 de crescimento de IGF2 210881 s at HS00171254 ml NM 000612 somatomedina C de tipo insulina Factor 2 de crescimento de IGFBP3 210095 s at HS00181211 ml NM 000598 somatomedina A de tipo insulina Proteína 3 de ligação ao factor de IGFBP5 211959 at HS00181213 ml NM 000599 crescimento de tipo insulina Proteína 5 de ligação ao factor de IGHM IL6 216491 x at 205207 at HS00376512 ml Hs00174131 ml NM 000600 crescimento de tipo insulina Constante pesada um de imunoglobulina Interleucina 6, interferão β 2 INA 204465 s at HS00190771 ml NM 032727 Proteína α dos filamentos INHBA 210511 s at Hs00170103 ml NM 002192 intermédios neuronais de internexina Inibina, βΑ (activina A, activina IQGAP3 229490 s at HS00603642 ml NM 178229 AB, polipeptido a) Motivo IQ que contém a proteína 3 de ITGA8 ITM2A AA903473 202746 at Hs00233321 ml Hs00191609 ml NM 003638 NM 004867 activação de GTPase. Proteína de activação GTPAse Ras Proteína 2A da membrana integral FIG. 8J 28/43 JAM2 229127 at Hs00221894 ml NM 021219 Molécula 2 de adesão de junções JAM3 212813 at HS00230289 ml NM 032801 Molécula 3 de adesão de junções JONB Hs00357891 sl NM 002229 proto-oncogene Jun B KCNG1 214595 at HS00158410 ml NM 002237 Membro 1 da subfamília G do canal de potássio dependente de voltagem KDELR3 204017 at HS00423556 ml 2 RefSeqs Receptor 3 de retenção da proteína de retículos endoplásmicos de KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) KIAA0101 202503 s at Hs00207134 ml NM 014736 Produto génico KIAA0101 KIAA0186 206102 at HS00221421 ml NM 021067 Produto génico KIAA0186 KIAA0992 200897 s at Hs00363101 ml NM 016081 Paladina KIF11 204444 at HS00189698 ml NM 004523 Membro 11 da família da cinesina KIF14 206364 at Hs00208408 ml NM 014875 Membro 14 da família da cinesina KIF20A 218755 at HS00194882 ml NM 005733 Membro 20A da família da cinesina KIF2C 209408 at Hs00199232 ml NM 006845 Membro 2C da família da cinesina KIF4A 218355 at HS00602211 gl NM 012310 Membro 4A da família da cinesina KISS1 Hs00158486 ml NM 002256 Supressor de metástases KISS-1 KLHL7 220239 at HS00375239 ml NM 018846 Kelch tipo 7, Drosophila KPNA2 201088 at Hs00818252 gl NM 002266 Carioferina α 2 (coorte 1 RAG, importina α 1) KRT14 209351 at Hs00265033 ml NM 000526 Ceratina 14 (epidermosa bolhosa simples, Dowling-Meara, Koebner) KRT20 213953 at Hs00300643 ml NM 019010 Ceratina 20 KRT7 209016 s at HS00818825 ml NM 005556 Ceratina 7 LAF4 227198 at Hs00171448 ml NM 002285 Proteína nuclar linfóide conotada com AF4 FIG. 8K 29/43 LEPR 209894 at Hs00174497 ml NM 002303 Receptor de leptina LGALS1 201105 at HS00169327 ml NM 002305 Galectina 1 (lectina, ligação a galactósidos, solúvel, 1) LIFR 225575 at HS00158730 ml NM 002310 Receptor do factor inibitório de leucemia LOC83468 227070 at HS00229917 ml NM 031302 Glicosil-transferase LOX 215446 s at Hs00184700 ml NM 002317 Lisil-oxidase LPPR4 213496 at HS00322721 ml NM 014839 Gene 1 conotado com a plasticidade ROM 229554 at Hs00158940 ml NM 002345 Lumicano LY6D 206276 at HS00170353 ml NM 003695 Complexo 6 de antigénio linfócitos, locus D MAD2L1 203362 s at HS00829154 gl NM 002358 MAD2 mitótico deficiente de paragem, de tipo 1 (levedura) MAGEA3 209942 x at HS00366532 ml NM 005362 Família A3 de antigénios de melanoma MAGEA9 210437 at Hs00245619 gl NM 005366 Família A9 de antigénios de melanoma MAMDC2 228885 at HS00299196 ml NM 153267 Domínio MAM que contém 2 MAN1C1 214180 at Hs00220595 ml NM 020379 Membro 1 de classe 1C de manosidase MAP1B 226084 at Hs00195487 ml 2 RefSeqs a Proteína 18 conotada com microtúbulos MCM10 220651 s at Hs00218560 ml 2 Refseqs Microssoma de manutenção deficinete em 10S MCM2 202107 s at Hs00170472 ml NM 004526 MCM2, microssoma de manutenção deficiente e mitotina S 2 MDM2 Hs00242813 ml 3 RefSeqs Mdm2 (células 3T3 transformadas de duplo minuto 2, proteína de ligação p53 (murganho)) MELK 204825 at HS00207681 ml NM 014791 cinase de fecho entrelaçado de leucina embriónica materna MFAP2 203417 at Hs00250064 ml 2 RefSeqs Proteína 2 conotada com microfibrilar MFAP4 212713 at HS00412974 ml NM 002404 Proteína 4 conotada com microfibrilar FIG. 8L 30/43 TOBB6 209191 at HS00603164 ml NM 032525 Tubulina β, MGC4083 MGC45780 229839 at Hs00382351 ml NM 173833 Proteína hipotética MGC57827 225834 at HS00822131 ml NM 207418 Semelhante ao gene 2700049P18 de ADN de RIKEN MGP 202291 s at HS00179899 ml NM 000900 Proteína Gla de matriz MKI67 212021 s at Hs00606991 ml NM 002417 Antigénio identificado pelo anticorpo monoclonal Ki-67 MMD 203414 at Hs00202450 ml NM 012329 Associado à diferenciação entre monócitos e macrófagos MMP1 204475 at Hs00233958 ml NM 002421 Metaloproteinase 1 de matriz, colagenase intersticial MMP12 204580 at Hs00159178 ml NM 002426 Metaloproteinase 12 de matriz, elastase de macrófagos MRS2L 218538 s at Hs00252895 ml NM 020662 MRS2, tipo factor de homeostase de magnésio, S. cerevisiae MRVI1 226047 at HS00180652 ml Homólogo do local 1 de integração do retrovírus de murino MSRB3 225782 at HS00827017 ml NM 198080 Sulfóxido de Metionina-reductase B3 MST1R 205455 at HS00234013 ml NM 002447 Receptor 1 de estimulação de macrófagos (tirosina-cinase conotada com c-met) MTHFD2 201761 at HS00759197 sl NM 006636 Metileno-tetra-hidrofolato-desidrogenase NAD+ dependente de meteniltetra-hidrofolato de ciclo-hidrolase MUC7 HS00379529 ml NM 152291 Mucina 7 salivar MYADM 225673 at Hs00414763 ml NM 138373 Marcador de diferenciação associado a mielóide MYBPC1 214087 s at Hs00159451 ml Proteína C de ligação a miosina, tipo lento MYC HS00153408 ml NM 002467 Homólogo oncogénico virai de mielocitomatose V-myc de aves NEK2 204641 at Hs00601227 mH NM 002497 NIMA (nunca na mitose do gene a) conotado com a cinase 2) NEXN 1552309 a at Hs00332124 ml NM 144573 Nexilina, proteína de ligação a actina NFIA 226806 s at Hs00325656 ml NM 005595 FIG. 8M 31/43 NFIB 213029 at Hs00232149 ml NM 005596 Factor nuclear I/B NFIL3 203574 at HS00356605 gl NM 005384 Factor nuclear de interleucina 3 regulado FLJ22595 220468 at HS00540047 gl NM 025047 Proteína FL322595 hipotética NMES1 223484 at Hs00260902 ml Mucosa normal de esófagos específicos 1. Núcleo NNMT 202237 at Hs00196287 ml NM 006169 Nicotinamida-N-metil-transferase NOPE 227870 at Hg00326335 ml NM 020962 Possível ortólogo da vizinhança de Pune Eli de murganho NQOl 201468 g at Hg00168547 ml NM 000903 NADPH desidrogenase-quinona 1 NR2F1 209505 at Hs00818842 ml NM 005654 Membro 1 do grupo F da subfamília 2 dos receptores nucleares NR4A1 202340 x at Hs00172437 ml NM 173157 Membro 1 do grupo A da subfamília 4 dos receptores nucleares NR4A2 204621 s at Hs00426691 ml 4 RefSeqs Membro 2 do grupo A da subfamília 4 dos receptores nucleares NR4A3 209959 at Hs00175077 ml Membro 3 do grupo A da subfamília 4 dos receptores nucleares NTNG2 Hs00287286 ml NM 032536 Netrina G2 NOSAP1 218039 at Hg00153533 ml NM 016359 Proteína 1 associada a nucleolar e a fuso OAS1 202869 at Hg00242943 ml 2 RefSeqg 2',5'-oligoadenilato-sintetase 1, 40/46 kDa OLFML3 218162 at Hg00220180 ml NM 020190 Olfactomedina tipo 3 OSR2 PDGFC 213568 at Hs00369588 ml Hs00211916 ml NM 053001 NM 016205 Proteína 2A conotada com interrupções ímpares PDGFRA 203131 at Hg00183486 ml NM 006206 Receptor do factor de crescimento associado às plaquetas, polipeptido Oí Domínio 3 de PDZ e LIM PDLIM3 209621 s at Hs00205533 ml NM 014476 PDZRN3 212915 at Hg00392900 ml Domínio de PDZ que contém o dedo 3 RING FIG. 8N 32/43 PEG10 212094 at Ha00248288 sl NM 015068 Paternalmente expresso 10 PFKFB3 202464 s at Ha00190079 ml NM 004566 6-fosfofructo-2-cinase/fructose-2,6- Pfs2 221521 s at H300211479 ml NM 016095 bifosfatase 3 Proteína PSF2 do compelxo GINS de PGM5 226303 at H300222671 ml NM 021965 replicação de ADN. Replicação de ADN Fosfoqlucomutase 5. Junção de PLA2G2A 203649 s at Hg00179898 ml NM 000300 aderência célula-célula Fosfolipase A2, qrupo IA, plaquetas, PLAGL1 209318 x at Hg00243030 ml NM 002656 fluido sinovial. Carabolimso de lípidos Gene de adenoma pleiomórfico, tipo 1 PLCB4 203895 at Hg00168656 ml Fososfolipase C β4 PLEKHC1 209209 s at Hs00235033 ml NM 006832 Membro 1 da família C, contendo o PLN 204939 g at HS00160179 ml NM 002667 domínio de homoloqia Pleckstrina (com domínio FERM) Fosfolambano PLSCR4 218901 at Hg00220482 ml NM 020353 Scramblase 4 de fosfolípidos PMP22 210139 g at HS00165556 ml Proteína 22 de mileina periférica POLQ 219510 at Hs00198196 ml 2 RefSeqs Polimerase ADN diriqiqida a Θ POSTN 1555778 a at HS00170815 ml NM 006475 Factor específico de osteoblastos de P001F1 HS00230821 ml NM 000306 periostina Domínio POO, classe 1, factor 1 de PPIA o CYC PPP1R12B 201957 at Hs99999904 ml HS00364078 ml 3 RefSeqs transcrição (Pitl, factor 1 do crescimento hormonal) Proteína fosfatase 1 reguladora do PPP1R14D 220082 at HS00214613 ml NM 017726 inibidor da subunidade 12B Proteína fosfatase 1 reguladora do PRC1 218009 a at HS00187740 ml inibidor da subunidade 14D Regulador proteico de citocinese 1 PRKAR2B 203680 at Hs00176966 ml NM 002738 Proteína cinase reguladora PAL Hs00168730 ml NM 000948 dependente de cAMP, tipo II β Prolactina FIG. 80 33/43 PS ATI 223062 s at Hs00795278 mH 2 RefSeqs Fosfoserina-aminotransferase 1 PTCH Hg00181117 ml NM 000264 Homóloqo reparado de Drosophila PTEN Ha00829813 al NM 000314 Homóloqo de fosfatase e tensina PTGS2 1554997 a at Ha00153133 ml NM 000963 mutado em múltiplos cancros 1 avançados Prostaqlandina-endoperóxido-sintase PTN 211737 x at Ha00383235 ml NM 002825 2 (prostaqlandina G/H sintase e ciclooxiqenase) Pleiotrofina (factor 8 de PTPRC PTRF 1557938 s at Hs00236304 ml Ha00396859 ml 3 RefSeqs NM 012232 crescimento de liqação a heparina, factor 1 promotor do crescimento de neurite) Polimerase I e factor de libertação RAB23 229504 at Hs00212407 ml da transcrição, abans AL545542 RAB23, membro RAS da família de RACGAP1 222077 g at Hs00374747 ml NM 013277 oncoqenes Proteína 1 de activação de GTPase RÃI2 219440 at Ha00253960 al NM 021785 Rac Ácido retinóico induzido 2 RAMP 218585 s at Hs00212788 ml NM 016448 Proteína associada à matriz nuclear RASL12 219167 at Hs00275429 ml NM 016563 regulada por RA Família 12 de tipo RAS RB1 Hs00153108 ml NM 000321 Retinoblastoma 1 incluindo RBM24 235004 at Hs00290607 ml NM 153020 osteosarcoma Proteína 24 com motivo de ligação a RECK 205407 at HS00221638 ml NM 021111 ARN Proteína rica em cisteína indutora RFC3 204127 at HS00161357 ml 2 RefSeqs de reversão com motivos kazal Factor C de replicaçâo (activador 1) RGS1 216834 at HS00175260 ml NM 002922 3, 338 kDa. Replicaçâo de ADN Regulador da proteína G de RNASE4 213397 x at HS00377763 ml sinalização 1. Resposta imune Família 4 de ribonuclease RNase RODH 205700 at Hs00366258 ml NM 003725 3-hidroxiesteróide-epimerase FIG. 8P 34/43 RPESP 235210 s at Ha00541931 ml NM 153225 RPE-eapondina RRM2 209773 s at Ha00357247 gl NM 001034 Polipepticlo M2 ribonucleótido- reductase S100A10 236909 at H300741221 ml NM 002966 Proteína A10 de ligação a cálcio S100 (ligando anexina de II, calpactina I, polipeptido leve (pll) ) SBLF 213413 at Hg00538997 ml Factor tipo B dopado SCN7A 228504 at Hg00161546 ml NM 002976 Canal de gódio dependente de voltagem de tipo VII a SELL 204563 at Hg00174151 ml NM 000655 Molécula 1 de adeaão a linfócitos L de gelectina SELM 226051 at Hs00369741 ml NM 080430 Selenoproteína M SERPINB3 209719 x at Hg00199468 ml NM 006919 Inibidor de gerina- ou cisteína-proteinase, classe B (ovalbumina), membro 3 SETBP1 205933 at Hg00210209 ml NM 015559 Proteína 1 de ligação a SET SFRP1 202037 g at H300610060 ml NM 003012 Proteína 1 enrugada segregada SLC1A6 1554593 s at Hs00192604 ml NM 005071 Família 1 de veículo soluto com elevada afinidade para 0 membro 6 de transporte de aspartato/glutamato SLIT2 209897 g at Hs00191193 ml NM 004787 Homólogo 2 slit (Drosophila) SMAD6 Hs00178579 ml NM 005585 mães SMAD contra homólogo 6 DPP, Drosophila SMOC2 223235 s at Hs00405777 ml NM 022138 Proteína 2 de ligação a cálcio modular conotada com SPARC SNX10 218404 at Hs00203362 ml NM 013322 Nexina 10 seleccionada SOCS3 227697 at H300269575 3l NM 003955 Supressor de sinalização 3 de citoguina SOX4 213668 a at Hg00268388 gl NM 003107 SRY (região Ύ de determinação do sexo)-caixa 4 SOX9 202935 a at Hg00165814 ml NM 000346 SRY (região Y de determinação do sexo)-caixa 9 (displasia campomélica, inversão de sexo autossómica) SPARCL1 200795 at Hg00190740 ml NM 004684 Mast9 hevina SPARC, tipo 1 SPON1 209436 at Hs00323883 ml Proteína da matriz extracelular de espondina 1 FIG. 8Q 35/43 SPPl 209875 s at Hs00167093 ml NM 000582 Fosfoprote'na 1 segregada (osteopontina, sialoproteína 1 óssea, activação 1 precoce de linfócitos T) SPRR3 218990 s at Hs00271304 ml NM 005418 Proteína 3 rica em prolina pequena. Actividade molecular estrutural SRPX 204955 at Hs00196867 ml NM 006307 Repetição de Sushi que contém proteína ligada a X STC1 230746 s at Hs00174970 ml NM 003155 Estaniocalcina 1 STK6 208079 g at HS00269212 ml NM 003600 Serina/treonina-cinase 6 STN2 235852 at Hs00263833 ml NM 033104 Estonina 2 S0LF1 212354 at HS00290918 ml NM 015170 Sulfatase 1 SOLT1E1 219934 s at Hs00193690 ml NM 005420 Membro 1 de prefereência por estrogénio da família 1E de sulfotransferase TCF21 204931 at HS00162646 ml Factor 21 de transcrição TCF8 212764 at Hs00611018 ml NM 030751 Factor 8 de transcrição que reprime a expressão de interleucina 2 TCN1 205513 at Hs00189055 ml NM 001062 Transcobalamina I (proteína de ligação à vitamina B12família de ligaçaó R) TEAD2 TEGT 226408 at Hs00368217 ml Hs00162661 ml NM 003598 NM 003217 Membro 2 da família do domínio TEA TERT HS00162669 ml 2 RefSeqs Telomerase-transcriptase inversa TGFB1I1 209651 at Hs00210887 ml NM 015927 Transcrição 1 induzida pelo factor βΐ de transformação do crescimento TIMP2 224560 at Hs00234278 ml NM 003255 Inibidor tecidual de metaloproteinase 2 TK1 1554408 a at HS00177406 ml NM 003258 Timidina-cinase 1 solúvel TMPO 203432 at HS00162842 ml NM 003276 Timopoietina. Ligação ao ADN TNA 205200 at Hs00162844 ml NM 003278 Tetraneotina TNC 201645 at HS00233648 ml NM 002160 Tenascina C FIG. 8R 36/43 TNRC9 216623 x at Hs00300355 ml Repetição trinucleotídica que contém 9 Topoisomerase de ADN II a, 170 kDa T0P2A 201291 s at HS00172214 ml NM 001067 TOPK 219148 at Hs00218544 ml NM 018492 Proteína-cinase com origem em células T-LAK TP53 Hs00153349 ml NM 000546 Proteína tumoral p53, síndrome Li-Fraumeni TPX2 210052 s at Hs00201616 ml NM 012112 Homólogo proteico conutado com microtúbolos TPX2 (Xenopus laevis) TRIP13 204033 at HS00188500 ml NM 004237 Interactuadir 13 do receptor da hormona da tiróide TSPAN-2 227236 at Hs00194836 ml NM 005725 Tetraspano 2. Motilidade celular TTK 204822 at HS00177412 ml NM 003318 Proteína TTK-cinase T03A 209074 s at Hs00200376 ml NM 007177 Proteína TD3A TYMS 202589 at HS00426591 ml NM 001071 Timidilato-sintetase OBD 205890 s at Hs00197374 ml NM 006398 Obiquitina D OBE2C 202954 at HS00738962 ml NM 181711 Enzima 22 C de conjugação de ubiquitina OHRF1 225655 at HS00273589 ml NM 013282 Domínios 1 contendo PHD e dedo RING de tipo ubiquitina ORB 225242 s at HS00736722 ml Gene 1 sensível a esteróides FIG. 8S 37/43 WFDCl WISP1 ZAK ZBTB16 ZFP36 ZNF217 ZWINT ZYX 18S 219478 at Hs00221849 ml NM 021197 Domínio 1 nuclear com quatro 229802 at Hs00365573 ml 2 RefSeqs dissulfureto WAP Proteína 1 do circuito de 225665 at Hs00370447 ml 2 RefSeqs sinalização indutível WNT1 Motivo α estéril e entrelaçadop 228854 at Hs00232313 ml NM 006006 de leucina que contêm cinase AZK Domínios dedo de zinco e BTB 201531 at Hs00185658 ml NM 003407 contendo 16 Proteína 36 de dedo de zinco, tipo 204026 s at Hs00232417 ml HS00199952 ml HS00170299 ml HS99999901 sl NM 006526 NM 003461 C3H, homólogo, murganho Proteína 217 de dedo de zinco Interactuador ZW10 zixina. Adesão celular ARNr eucariótico 18S FIG. 8T 38/43 Ensaio de exnressão « m simhoio rio G*nt> mÊmmÈm ensa,° ae expi essao Ιϋ simooio ao eene génica TaqMan’ «s AMLN HS00218B03 mt AMXÃ1Ú Hs002Ô0484 m1 APQBEG3B HsOG358SS1 m1 ASAM HSÕ0293345 ml ASPM HsOÔ4115G5 m1 BUB1B H$00176169 m1 CÍÕOTÚ H$0021S888 m1 G14orf?$ HsÒG?4683S $1 CCNA2 Hs0G153138 m1 comi Hs0G259126 ml CÚC2 HsOQ3S4H3Jtíl ÇDC2Ú Hs(30415S51 a1 GÚCA1 HsíX)230O9? m1 CQCAS Hs0022flaQS m1 CDKN3 HsOQ193192 ml CENPÂ HsO01S64S5 ml OENPF tismmxLad GFH H&00184830 m1 ChGn Hsaaai.8.Q54._m.1 COL1Â2 H$00184099 m1 CRN H$O0174941 mi CTSE Hs00157213 ml CYP24AÍ Hs00167399 m1 FIG. 9A 39/43 DLG7 HS0G2Q7323 m1 EBP Hs00395513 m1 F3 Hs00175225 m1 FABP6 Ns00155029 mi FGFR3 Hs00179829 ml FU11029 Hs00383634 m1 FU21986 HSÓ0227735 m1 FLJ31052 Hs00708284 s1 FN1 Hs00365058 m1 F0XM1 Hs00153543 m1 GJB2 HS00269615 st GJB6 HS00272726 s1 GUSB Hs99999908 m1 HPRT Hs99999909 m1 IGF2 Hs0017i254 m1 INA NsOQ19Q771 m1 ÍQGAP3 HS00603642 m1 KÍAA0101 NS00207134 ml KIAÁ0186 HSÔ0221421 m1 KfAA0992 H$00363101 ml KÍF11 Hs00189698 ml KÍF20A Hs00194882 m1 KIF2G Hs00199232 mi KIF4A Hs00602211 q1 40/43 40/43 ^Sm:ti6KvâS _

génica 'TaqMan' Símbolo do Gene R Ensaio de expressão |gf ** ----------- kàl JSijp kissí KLFB mm KRT20 KRT7 MAGBA3 MAGEA9 MAN 101 MCM1Õ MELK HsoBmmjtíi Ns00230918 m1 HS0026S033 m1 Hs00300643 ml HgQ681&825 ml Hs00366532 m1 &QQ2tíâlâ-£l HsP022Q59S mt Hs0C2ie580fflt HsQÕ207eat ml HsO06G6931 m1

MMP12 NEK2 NQ01 NR2F1 PDÚFC pomm PLAGL1 pisem POLO POSTN HsD0tS9178 m1 HsQ0SQ1227 mH usaaifiBSiLm H$Q0392900 m1 Hs0024SQ30 ml HsQO220482 m1 Hsooiaaise mi Hs0017Q81S. ml FIG. 9C 41/43 PPÍA o CYC Hs99999904 ml PPP1R12B Ns003640T8 ml PPP1R14D HsQ0214613 ni1 PRC1 Hs00187740 ml PRKAR2B HsOO176966 m1 PTPRC HsQ0236304 m1 RÃMP BsOQ212788 m1 RNASE4 HS00377763 m1 SBLP HsOÕ538M7jt!.1 SERP!NB3 HsOOl99468 m1 SLC1Â6 HSQ0192604 mi SP0N1 Hs00323883 m1 SPP1 HsOQI87093 mi STN2 Hs00263833 m1 TERT Hs00162669 m1 TNRC9 HS00300355 ml T0P2A HsOQI72214 ml TOPK HSÕ0218544 m1 TPX2 Hs00201616 ml TRÍP13 HsOQI88500 ml TTK HsO0177412 m1 UHRF1 Hs00273589 ml ZBTB16 Hs00232313 ml ZWÍNT HsOOl 99952 m1 18S Hs99999901 si 42/43

ANLN ANXA10 ASAM A$PM CUoffTB CCNA2 Hs00218803 m1 BS0O2OO464 m1 HsQ0283345 m1 NsÓÓ4Í1505 m1 Hs00746838 st Hs00,153138 m1 CDC2 CDC2Q CDCA1 Hs0Q364.293 m1HlMSELâl Hs0Q23Q097 mi ÚFH Hs001932P1 mi Ha00164830 m1 CRH CISE CYP24AÍ EBF FGFRS F0XM1 HsOQ174941 mt Hs001S7213 m1 HsQO167999 m1 GUSB IQGAP3 KÍF20Â K1F2C KIF4A KLF9 HsOQ3S5513 m1 HsQO179829 m1 HsQ0153543 ml HsOQ2S9815 si Hs99999908 mi Η800171254 ml HsQ0603642 mi HsOOi94882 ml HsQO199232 m1 HS00230918 m1 43/43 KRT14 HS00265033 m1 KRT2Q H$00300643 ml MAGRAS H$00366532 m1 MAGEA9 Hs00245619 $1 MCMW H$00218560 m1 MELK H$00207681 ml MMP1 Hs0Q233958 m1 MMP12 Hs00159178 mi NEK2 Hs00601227 mH NR2F1 Hs00818842 mi PDZRN3 HsG03S2900 m1 POLO Hs00198196 mi POSTN Hs0017G815 mi PPM HS99999904 ml PPPiRUO Hs00214613 mi PTPRC H$00236304 ml -.........rrr------rr-----rr11 ---1-1-11 ---γιιμγγγγγι n*rr SLC1AS H$00192604 ml TERT HsOO162669 ml T0P2A HsQ0172214 ml TPX2 Hs00201616 m1 TRÍP13 NsOQI88500 m1 18S H$99999901 $1