ES2296317T3 - Dispositivos sensores biologicos que producen imagenes de difraccion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN DISPOSITIVO Y A UN PROCEDIMIENTO, BARATOS Y SENSIBLES, DE DETECCION Y DE CUANTIFICACION DE LOS ANALITOS PRESENTES EN UN MEDIO. EL APARATO TIENE UNA PELICULA METALIZADA EN LA CUAL SE IMPRIME UNA COMPOSICION ESPECIFICA Y PREVIA DE UN RECEPTOR ESPECIFICO DE ANALITOS. DESPUES DE LA FIJACION DE UN ANALITO OBJETIVO, SE PRODUCE LA DIFRACCION DE LA LUZ EMITIDA Y/O REFLEJADA A TRAVES DE LAS DIMENSIONES FISICAS Y LA POSICION DEFINIDA Y PRECISA DEL ANALITO, PARA SELECCIONAR ZONAS DE LA PELICULA PLASTICA EN LA CUAL SE IMPRIME EL RECEPTOR. SE PRODUCE UNA IMAGEN DE DIFRACCION, QUE SE PUEDE VISUALIZAR FACILMENTE A SIMPLE VISTA U OCASIONALMENTE, MEDIANTE UN APARATO DE DETECCION.

Description

Dispositivos sensores biológicos que producen imágenes de difracción.

Sector de la técnica

La presente invención está en general en el campo de la detección de analitos en un medio y, más particularmente, la presente invención se refiere a la impresión por microcontacto de receptores específicos de analitos sobre elementos laminares de plástico metalizado para el desarrollo de sensores desechables de un solo uso, para indicar la presencia del analito en un medio.

Antecedentes de la invención

Existen muchos sistemas y dispositivos disponibles para detectar una amplia variedad de analitos en diversos medios. La mayor parte de estos sistemas y dispositivos son relativamente costosos y requieren un técnico formado para realizar la prueba. Existen muchos casos en los que sería ventajoso poder determinar si un analito se encuentra presente en un gran número de muestras. Un buen ejemplo de este tipo de necesidad se encuentra en el envasado de productos alimenticios. Habitualmente, las muestras de alimentos son comprobadas al azar en busca de contaminación microbiana mediante técnicas de ensayo convencionales. Aunque este método de muestreo podrá indicar tendencias entre una población de muestras, no se analiza cada una de las muestras de una población. Lo que se necesita es un método económico y preciso para ensayar cada una de las muestras utilizadas.

Sandstrom y otros, en "24 Applied Optics" (Óptica aplicada) 472, 1985, describen la utilización de un substrato óptico de silicio con una capa de monóxido de silicio y una capa de silicio, formados como elementos laminares dieléctricos. Los autores indican que un cambio en el espesor del elemento laminar modifica las propiedades del substrato óptico produciendo colores diferentes relacionados con el espesor del elemento laminar. El espesor del elemento laminar está relacionado con el color observado, y un elemento laminar dispuesto en la parte superior de un substrato óptico puede producir un cambio de color visible. Los autores indican que puede utilizarse un modelo matemático para cuantificar el cambio de color, y que "[c]álculos realizados utilizando el modelo informático muestran que puede mejorarse muy poco en rendimiento óptico a partir de la utilización de una estructura multicapa... pero una biocapa en la superficie modifica muy poco la reflexión de dichas estructuras, dado que las propiedades ópticas están determinadas principalmente mediante las superficies de separación en el interior de la estructura multi-capa. El sistema más sensible para la detección de biocapas es un recubrimiento de capa única, aunque en la mayor parte de las demás aplicaciones puede conseguirse el rendimiento mediante capas dieléctricas adicionales".

Sandstrom y otros indican asimismo que las transparencias (o diapositivas) formadas a partir de óxidos metálicos sobre metal tienen determinados inconvenientes, y que asimismo la presencia de iones metálicos puede ser peligrosa en muchas aplicaciones bioquímicas. Indican que el elemento laminar dieléctrico ideal de la parte superior tiene un espesor de 2 a 3 nm de dióxido de silicio que se forma espontáneamente cuando se deposita una capa de monóxido de silicio en la atmósfera ambiente, y que puede utilizarse una capa de dióxido de silicio de 70 a 95 nm sobre una capa de 40 a 60 nm de monóxido de silicio en un substrato de cristal o de plástico. Describen asimismo la formación de una cuña de monóxido de silicio mediante un ataque químico selectivo de la superficie del monóxido de silicio, con tratamiento de la superficie de dióxido de silicio con diclorodimetilxilano y una aplicación de una biocapa de antígeno y anticuerpo. A partir de esta disposición en cuña, pudieron determinar el espesor del elemento laminar con un elipsómetro, y hacen notar que "el máximo contraste se halló en la zona aproximadamente de 65 nm, en la que el color de la interferencia cambió de púrpura a azul". Indican que la sensibilidad de un sistema de este tipo es suficientemente elevada para la detección de un antígeno de proteínas mediante anticuerpos inmovilizados. Concluyen que "los diseños aportados son suficientemente sensibles para una amplia gama de aplicaciones". Los materiales, es decir, cristal, silicio y óxidos de silicio son químicamente inertes y no afectan a la reacción bioquímica estudiada. Utilizando los cálculos anteriores es posible diseñar transparencias que están optimizadas para aplicaciones diferentes. Las transparencias pueden ser fabricadas y su calidad estar garantizada mediante métodos industriales y actualmente existen dos diseños disponibles comercialmente.

La patente USA Nº 5.482.830 de Bogart y otros, da a conocer un dispositivo que incluye un substrato que tiene una superficie ópticamente activa que exhibe un primer color como respuesta a la luz incidente en el mismo. Este primer color se define como una distribución espectral de la luz que emana del mismo. El substrato exhibe asimismo un segundo color que es diferente del primer color (al tener una combinación de longitudes de onda de la luz que difieren de la combinación presente en el primer color, o que tienen una distribución espectral diferente, o que tienen una intensidad de una o varias de dichas longitudes de onda, diferentes de las presentes en el primer color). El segundo color aparece como respuesta a la misma luz cuando el analito está presente en la superficie. El cambio de un color al otro puede ser medido, mediante la utilización de un instrumento o visualmente. Dicha detección sensitiva representa un avance con respecto a los dispositivos anteriores dados a conocer por Sandstrom y Nygren, y permiten la utilización de los dispositivos de una manera comercialmente viable y competitiva.

Sin embargo, el método y el dispositivo descrito en la patente de Bogart y otros, tiene diversos inconvenientes. Uno de los inconvenientes es el coste elevado del dispositivo. Otro problema del dispositivo es la dificultad de controlar las diversas capas que están colocadas sobre la oblea, de manera que se obtenga una lectura fiable. Lo que se necesita es un dispositivo sensor biológico que sea fácil y económico de fabricar y capaz de una detección fiable y sensible del analito a detectar.

El documento USA 5512131 da a conocer un método para la configuración de superficies planas y no planas con monocapas moleculares auto-instaladas (SAMS) sobre capas superficiales de metal (32), que utiliza un micro-sello (20) que tiene entrantes (24), así como artículos fabricados con el mismo para su utilización como sensores bioquímicos. Las moléculas de SAM tienen cada una de ellas en las zonas (28) grupos funcionales tales como un tiol que se une de manera selectiva a una superficie metálica (30) de la capa (32), interactuando el resto de la molécula con las moléculas vecinas en la monocapa para formar una disposición relativamente ordenada. Las configuraciones de SAM están formadas por unas especies moleculares al descubierto, que permiten la unión de especies biológicas (por ejemplo, anticuerpos) así como una funcionalidad para su unión a una superficie metálica, y una parte de separación entre ellas, en la forma R'-A-R'' en que R' se une a la superficie (30), A es un separador y R'' es un grupo que está al descubierto. Un elemento laminar metálico delgado (32) puede estar situado encima de un substrato (34) que por sí mismo puede tener forma de un elemento laminar de un material tal como un plástico u otro polímero orgánico. La detección de la finalización del ensayo se realiza, por ejemplo, utilizando un analito etiquetado con una especie reflectiva tal como oro, de tal forma que mediante irradiación con láser en las zonas (28), se realiza el análisis en base a la reflectancia. Como alternativa, una gran parte de las zonas (28) puede estar iluminada con una radiación electromagnética coherente y observarse una disposición de difracción, siendo utilizada la intensidad de la disposición de difracción para cuantificar la magnitud de la etiqueta inmovilizada.

Características de la invención

La presente invención da a conocer un dispositivo y un método sensibles y económicos para detectar y cuantificar analitos presentes en un medio, según las reivindicaciones independientes adjuntas 1, 30.

El dispositivo comprende un elemento laminar metalizado sobre el cual está impresa una disposición específica predeterminada de unos receptores específicos de analitos. Con la unión de un analito objetivo que puede dispersar la luz para seleccionar zonas del elemento laminar de plástico sobre el cual está impreso el receptor, se produce la difracción de la luz transmitida y/o reflejada a través de las dimensiones físicas y definida mediante una colocación exacta del analito. Se produce una imagen de difracción que puede apreciarse fácilmente de manera visual u, opcionalmente, con un dispositivo sensor.

La presente invención utiliza métodos de impresión por contacto de configuraciones de monocapas auto-instalables de alcano-tiolatos, ácidos carboxílicos, ácidos hidroxámicos y ácidos fosfónicos sobre elementos laminares termoplásticos metalizados, las composiciones producidas con los mismos y la utilización de estas composiciones. Las monocapas auto-instalables tienen materiales receptores unidos a las mismas. Los materiales receptores son específicos para un analito particular o para una clase de analitos, dependiendo del receptor utilizado. Los métodos para la impresión por contacto de monocapas auto-instalables configuradas se dan a conocer en detalle en las solicitudes de patentes USA Nºs 08/707.456 y 08/768.449.

Las monocapas auto-instalables configuradas permiten la colocación controlada de analitos en las mismas, a través de las configuraciones de los receptores específicos de los analitos. Los dispositivos de los sensores biológicos de la presente invención fabricados con ella son utilizados en primer lugar para exponer el dispositivo del sensor biológico a un medio que contiene el analito escogido y, a continuación, después de un periodo de incubación apropiado, transmitir una luz tal como un láser a través del elemento laminar. Si el analito está presente en el medio y está combinado con los receptores de la monocapa auto-instalable configurada, la luz se difracta de tal forma que produce una imagen visible. En otras palabras, las monocapas auto-instalables configuradas con el analito combinado con las mismas pueden producir configuraciones de difracción óptica, que difieren dependiendo de la reacción de los receptores en la monocapa auto-instalable con el analito de interés. La luz puede estar comprendida dentro del espectro visible, y puede ser tanto reflejada desde el elemento laminar, como transmitida a través del mismo, y el analito puede ser cualquier compuesto o partícula que reaccione con la monocapa auto-instalable. La luz puede ser una luz blanca o una radiación electromagnética monocromática en la región de la luz visible. La solicitud actual da a conocer asimismo un soporte flexible para una monocapa auto-instalable sobre oro u otro metal adecuado, o una aleación metálica.

La solicitud presente da a conocer un soporte para una monocapa auto-instalable en oro u otro material adecuado que no requiere un favorecedor de la adherencia para la formación de una monocapa auto-instalable bien ordenada. La solicitud presente da a conocer asimismo un soporte para una monocapa auto-instalable en oro u otro material que es adecuado para una impresión continua, en vez de una fabricación por lotes. Además, la presente invención da a conocer un sensor biológico de bajo coste, desechable, que puede ser fabricado en grandes cantidades. Los sensores biológicos de la presente invención pueden estar fabricados como una prueba única para detectar un analito, o pueden estar constituidos como dispositivo para una serie de pruebas. Los sensores biológicos de la presente invención pueden ser utilizados para detectar contaminación en prendas de ropa tales como pañales, y para detectar la contaminación por microorganismos.

En otra realización de la presente invención, los nutrientes para una clase específica de microorganismos pueden estar incorporados en la monocapa auto-instalable. De esta manera, pueden detectarse concentraciones muy reducidas de microorganismos, en primer lugar mediante el contacto del sensor biológico de la presente invención con los nutrientes incorporados en la misma e incubando a continuación el sensor biológico en condiciones apropiadas para el crecimiento del microorganismo unido. Se permite que el microorganismo crezca hasta que existan suficientes microorganismos para formar una configuración de difracción.

La presente invención puede ser utilizada asimismo en lentes de contacto, gafas, cristales de ventanas, ampollas de productos farmacéuticos, recipientes de disolventes, botellas de agua, vendajes o tiritas y similares, para detectar la contaminación.

Después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones dadas a conocer, serán evidentes estas y otras características y ventajas de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un sensor biológico capaz de medir simultáneamente varios analitos diferentes en un medio.

La figura 2 es un esquema de la impresión por contacto de monocapas auto-instalables. Un polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero de silicona 184; Dow Corning Corp., Midland, MI) está polimerizado en una placa de silicona que contiene una configuración predeterminada. Esta configuración tiene píxeles que se aproximan al tamaño de una micra y pueden representar la imagen de difracción de un holograma simple. Se despega el PDMS de la placa y se expone a una solución que contiene HS(CH_{2})_{15}CH_{3}. A continuación se estampa el sello recubierto de alcano-tiol sobre el substrato recubierto de oro. A continuación, se expone el substrato a una solución que contiene un alcano-tiol diferente, tal como HS(CH_{2})_{11}OH.

La figura 3 es una imagen microscópica de la fuerza atómica del oro evaporado sobre MYLAR®, adquirido en Courtaulds Performance Films (Canoga Park, CA). La rugosidad media de la capa de oro es de 3 a 4 nanómetros, con una rugosidad máxima de 9 nanómetros.

Las figuras 4a, 4b y 4c son imágenes microscópicas de la fuerza atómica de un círculo hidrófilo de monocapas auto-instalables de ácidos 16-mercaptohexadecanoicos, tal como se describe en el Ejemplo 1. La figura 4a es una imagen topográfica, la figura 4b es una imagen de la fuerza lateral, y la figura 4c es un gráfico tridimensional de una imagen topográfica.

La figura 5 es una imagen al microscopio electrónico de emisión secundaria de campo de círculos de 10 micras de diámetro de monocapas auto-instalables hidrófilas formadas mediante la impresión de ácido 16-mercaptohexadecanoico, tal como se describe más adelante en el Ejemplo 1.

La figura 6a es una micrografía óptica a 300 aumentos, de círculos de 10 micras de diámetro de monocapas auto-instalables hidrófilas formadas mediante la impresión de ácido 16-mercaptohexadecanoico, tal como se describe más adelante en el Ejemplo 1 y después de una exposición a un adhesivo óptico, endurecible, de elevada energía superficial. El adhesivo fue endurecido mediante exposición a luz ultravioleta (UV).

La figura 6b es una fotografía de la configuración de difracción formada mediante luz visible transmitida a través de la configuración de la monocapa auto-instalable descrita mediante la figura 5a.

La figura 7 es una imagen al microscopio electrónico de emisión secundaria de campo de círculos de 10 micras de diámetro formados mediante la impresión de polímeros foto-endurecibles auto-instalados sobre monocapas hidrófilas auto-instalables después de una exposición a un adhesivo de elevada energía superficial que puede endurecerse mediante UV.

La figura 8 es una imagen al microscopio electrónico de emisión secundaria de campo de una micrografía electrónica de círculos de 1,5 micras de diámetro de monocapas auto-instalables impresas sobre MYLAR® recubierto de oro, tal como se describe en el Ejemplo 1.

Las figuras 9a y 9b son sensores biológicos de difracción para el Saccharomyces cerevisae, basados en impresiones por contacto de monocapas auto-instalables.

Las figuras 10a muestran la adherencia de Candida tropicalis en función de la modificación de la superficie. En estas figuras, los círculos son HS-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, indicados como CH_{3} y la zona que los rodea es HS-(CH_{2})_{15}COOH, indicada como COOH. La figura 10b es una fotografía de la configuración de difracción de la configuración mostrada en la figura 10a.

Las figuras 11a y 11b muestran la adherencia de Candida tropicalis en función de la modificación de la superficie. En estas figuras, los círculos son HS-(CH_{2})_{15}COOH, indicados como COOH y la zona que los rodea es HS-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, indicada como CH_{3}. La figura 11a es un fotomicrografía. La figura 11b es una fotografía de la configuración de difracción a partir de la configuración generada en la figura 11a.

La figura 12 muestra una célula de Saccharomyces cerevisae sufriendo una mitosis.

La figura 13 muestra Saccharomyces cerevisae en círculos de 10 \mu con un grupo final de L-fucosa.

Las figuras 14a y 14b muestran la unión de partículas de amino polistireno modificado, a círculos recubiertos con ácido mercaptohexadecanoico. La figura 14b es una vista con una mayor ampliación de la muestra mostrada en la figura 14a.

Las figuras 15a y 15b muestran una imagen al microscopio electrónico de emisión secundaria de campo de una micrografía electrónica de Concanavalin A etiquetada con partículas de oro de 20 \mum, unidas a una monocapa auto-instalable modificada con azúcar. Los 20 \mum de oro en el Concanavalin A producen un contraste elevado para la reproducción de la imagen. La figura 15a es una vista con una mayor ampliación de las partículas de oro de la figura 15b.

Descripción detallada

La presente invención se caracteriza por dispositivos de sensores biológicos mejorados y por métodos para la utilización de dichos dispositivos de sensores biológicos, para la detección y la cuantificación de la presencia de un analito de interés dentro de un medio. Los analitos que pueden ser detectados mediante la presente invención incluyen microorganismos tales como bacterias, levaduras, hongos y virus, pero no están limitados a los mismos. En contraste con dispositivos anteriores, los de la presente invención permiten la detección de cantidades extremadamente reducidas de analito en un medio, en un ensayo rápido que dura solamente unos pocos minutos. Además, en los dispositivos de los sensores biológicos de la presente invención no se requiere señalización o componentes electrónicos asociados.

La presente invención comprende la impresión de receptores específicos de los analitos sobre elementos laminares de plástico metalizado que permiten el desarrollo de sensores biológicos desechables de un solo uso, basados en la difracción de la luz, para indicar la presencia del analito. Mediante la unión de un analito objetivo a zonas seleccionadas del elemento laminar de plástico que contienen el receptor, se produce la difracción de la luz transmitida y/o reflejada por medio de las dimensiones físicas y una colocación definida y precisa del analito. Por ejemplo, la levadura, los hongos o las bacterias son suficientemente grandes para actuar como elementos de difracción para la luz visible cuando están colocados en configuraciones organizadas sobre una superficie. Además, para producir una imagen de difracción simple, las configuraciones de analitos pueden ser tales que permitan el desarrollo de una imagen holográfica sensible y/o un cambio en el color visible. De este modo, la aparición de un holograma o un cambio en un holograma existente, indicará una respuesta positiva. La configuración realizada mediante la difracción de la luz transmitida puede ser de cualquier forma incluyendo la transformación de una configuración, de una configuración a otra mediante la unión del analito al material receptor, pero sin estar limitada a la misma. En realizaciones particularmente preferentes, la configuración de difracción puede ser percibida en menos de una hora después del contacto del analito con el dispositivo del sensor biológico de la presente invención.

La rejilla de difracción que produce la difracción de la luz con la interacción con el analito debe tener una periodicidad mínima de 1/2 de la longitud de onda y un índice de refracción distinto del medio que la rodea. Los analitos muy pequeños, tales como virus o moléculas, pueden ser detectados indirectamente mediante la utilización de una partícula mayor, que sea específica para el analito pequeño. En una realización en la cual puede detectarse un analito pequeño, comprende el recubrimiento de la partícula, tal como una perla de látex, con un material receptor que se combina específicamente con el analito de interés. Las partículas que pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen: cristal, celulosa, polímeros sintéticos o plásticos, látex, polistireno, policarbonato, proteínas, bacterias o células de hongos y similares, pero no están limitadas a las mismas. Las partículas son preferentemente de forma esférica, pero la configuración estructural y espacial de las partículas no es crítica para la presente invención. Por ejemplo, las partículas pueden ser astillas, elipsoides, cubos y similares. El tamaño deseable de las partículas varía desde un diámetro aproximadamente de 0,2 \mum a 50,0 \mum, deseablemente de forma aproximada entre 0,4 \mum a 1 \mum. La composición de la partícula no es crítica para la presente invención.

La monocapa auto-instalable en el elemento laminar metalizado contiene un material receptor tal como un anticuerpo, que se une específicamente a un epitope (parte de una molécula reconocida por el sistema inmunitario), en el analito que es diferente del epitope utilizado en la unión a la partícula. De este modo, para detectar un medio con un analito pequeño tal como partículas virales, se expone el medio en primer lugar a las partículas de látex a las cuales se unen las partículas virales. A continuación, de manera opcional, se lavan las partículas de látex y son expuestas al elemento laminar metalizado con las monocapas auto-instalables que contienen los anticuerpos específicos del virus. A continuación los anticuerpos se unen a las partículas virales en las perlas de látex, inmovilizando de este modo las perlas de látex en la misma configuración que las monocapas en el elemento laminar. Debido a que las perlas de látex unidas producen difracción de la luz visible, se forma una configuración de difracción que indica la presencia de la partícula viral en el líquido. Los expertos en la técnica conocen bien otras combinaciones que utilizan partículas.

Los analitos que se considera que son detectados utilizando la presente invención, incluyen pero no están limitados a: bacterias; levaduras; hongos; virus; factores reumatoides; anticuerpos; incluyendo pero no limitándose a anticuerpos IgG, IgM, IgA, e IgE; antígeno carcinoembrionario, antígeno de estreptococo del Grupo A, antígenos virales, antígenos asociados con la enfermedad autoinmunitaria, alérgenos, antígenos tumorales, antígeno de estreptococos del Grupo B, antígeno de HIV I o de HIV II; o respuestas de huéspedes (anticuerpos) a estos y a otros virus; antígenos específicos a RSV o de respuesta de huéspedes (anticuerpos) al virus; un anticuerpo; antígeno, enzima; hormona; polisacáridos; proteína; lípido; carbohidrato; droga o ácido nucleico; Salmonella species; Candida species, incluyendo pero no limitándose a Candida albicans y Candida tropicalis; Salmonella species; los grupos A, B, C, Y y W sub 135 de Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, E. coli K1, Haemophilus influenza tipo B; un antígeno derivado de microorganismos; un hapten o hapteno (antígeno incompleto), drogas de consumo; drogas terapéuticas; productos medioambientales y antígenos específicos de la Hepatitis.

En otra realización de la presente invención, pueden incorporarse en la monocapa auto-instalable nutrientes para una clase específica de microorganismos. De este modo pueden detectarse concentraciones muy bajas de microorganismos poniendo en contacto en primer lugar el sensor biológico de la presente invención con los nutrientes incorporados en el mismo y a continuación incubando el sensor biológico en condiciones apropiadas para el crecimiento del microorganismo combinado. Se permite que el microorganismo crezca hasta que haya suficientes microorganismos para formar una configuración de difracción. Por supuesto, en algunos casos, el microorganismo puede multiplicarse lo suficiente para formar una configuración de difracción sin la presencia de un nutriente en la monocapa
configurada.

Una parte de la presente invención es un material receptor que puede ser micro-impreso en el elemento laminar metalizado y que se unirá específicamente al analito de interés. De esta manera, el material receptor está definido como una parte de un par de combinación específico e incluye, pero no está limitado a, antígeno/anticuerpo, enzima/substrato, oligonucleótido/DNA, quelador/metal, enzima/inhibidor, bacteria/receptor, virus/receptor, hormona/receptor, DNA/RNA, o RNA/DNA, oligonucleótido/RNA, y la combinación de estas especies con cualesquiera otras especies, así como la interacción de estas especies con especies inorgánicas.

El material receptor que está unido a la capa de unión se caracteriza por una capacidad para unir específicamente el analito o analitos de interés. La variedad de materiales que pueden ser utilizados como material receptor está limitada únicamente por los tipos de material que combinan selectivamente (con respecto a cualquier muestra escogida) con un asociado secundario. Las subclases de materiales que pueden estar incluidas en la clase global de materiales receptores incluyen toxinas, anticuerpos, antígenos, receptores de hormonas, parásitos, células, haptenos, metabolizantes, alérgenos, ácidos nucleicos, materiales nucleares, auto-anticuerpos, proteínas de la sangre, desechos celulares, enzimas, proteínas de los tejidos, substratos de enzimas, coenzimas, transmisores neuronales, virus, partículas virales, microorganismos, proteínas, polisacáridos, queladores, drogas y cualquier otro elemento de un par de unión específico. Esta lista únicamente incluye algunos de los muchos materiales diferentes que pueden ser recubiertos en la capa de unión para producir un sistema de ensayo de un elemento laminar fino. Cualquiera que sea el analito de interés seleccionado, el material receptor está diseñado para combinarse específicamente con el analito de interés.

La matriz que contiene el analito de interés puede ser un líquido, un sólido, un gas, o un líquido corporal tal como mucosidades, saliva, orina, materias fecales, tejidos, médula, líquido cerebroespinal, suero, plasma, sangre entera, esputos, soluciones tampón, soluciones en extracto, semen, secreciones vaginales, del pericardio, gástricas, peritoneales, pleurales u otros lavados y similares. El analito de interés puede ser un antígeno, un anticuerpo, una enzima, un fragmento de DNA, un gen intacto, un fragmento de RNA, una molécula pequeña, un metal, una toxina, un producto medioambiental, un ácido nucleico, un componente del citoplasma, componentes de pelos o flagelos, proteínas, polisacáridos, drogas, o cualquier otro material tal como los anotados en la Tabla A. Por ejemplo, el material receptor para bacterias puede combinar específicamente un componente superficial de una membrana, proteínas o lípidos, un polisacárido, un ácido nucleico o una enzima. El analito que es específico para la bacteria, puede ser un polisacárido, una enzima, un ácido nucleico, un componente de una membrana o un anticuerpo producido por el huésped como respuesta a la bacteria. La presencia del analito puede indicar una enfermedad infecciosa (bacteriológica o viral), cáncer u otro trastorno o condición metabólicos. La presencia del analito puede ser una indicación de envenenamiento por un producto alimenticio o de otra exposición a productos tóxicos. El analito puede indicar consumo de drogas o puede controlar niveles de productos terapéuticos.

Uno de los protocolos de ensayo que se encuentran más frecuentemente en los que puede utilizarse esta tecnología, es un ensayo de inmunización. Sin embargo, las consideraciones generales son aplicables a sondas de ácido nucleico, enzima/substrato, y otros formatos de ensayo de ligantes/receptores. En el caso de ensayos de inmunización, el anticuerpo puede servir de material receptor o puede ser el analito de interés. El material receptor, por ejemplo, un anticuerpo o un antígeno, debe formar una capa densa, estable, reactiva en la capa de unión del dispositivo de prueba. Si debe detectarse un antígeno y el material receptor es un anticuerpo, el anticuerpo debe ser específico para el antígeno de interés; y el anticuerpo (material receptor) debe combinarse con el antígeno (analito) con suficiente avidez de modo que el antígeno quede retenido en la superficie de la prueba. En algunos casos, el analito puede no simplemente combinarse con el material receptor, sino que puede hacer que se produzca una modificación detectable del material receptor. Esta interacción puede ocasionar un incremento de la masa en la superficie de prueba o una disminución del material receptor en la superficie de prueba. Un ejemplo de lo último es la interacción de una enzima degradada o de un material con un substrato específico inmovilizado. En este caso, podría apreciarse una configuración de difracción antes de la interacción con el analito de interés, pero si el analito estuviera presente desaparecería la configuración de difracción. El mecanismo específico a través del cual se produce la combinación, la hibridización o la interacción del analito con el material receptor no es importante para esta invención, pero puede tener un cierto impacto en las condiciones de la reacción utilizada en el protocolo del ensayo final.

En general, el material receptor puede estar adherido de manera pasiva a la capa de unión. Si es preciso, los grupos funcionales libres introducidos en la superficie de prueba mediante la capa de unión pueden ser utilizados para la unión covalente del material receptor a la superficie de prueba. Los productos químicos disponibles para la unión de materiales receptores son bien conocidos de los expertos en la técnica.

Puede utilizarse una amplia gama de técnicas para adherir material receptor a la capa de unión. Las superficies de prueba pueden recubrirse con material receptor mediante una inmersión total en una solución durante un periodo de tiempo predeterminado; mediante la aplicación de una solución en series o disposiciones discontinuas; mediante pulverización, chorro de tinta u otros métodos de impresión; o mediante recubrimiento por centrifugado con un sistema de disolvente apropiado. La técnica seleccionada debería reducir al mínimo la cantidad de material receptor requerido para recubrir una gran cantidad de superficies de prueba y mantener la estabilidad/funcionalidad del material receptor durante la aplicación. La técnica debe aplicar o adherir asimismo el material receptor a la capa de unión de un modo muy uniforme y reproducible.

La capa receptora está formada a partir de un material escogido entre el grupo consistente en antígenos, anticuerpos, oligonucleótidos, queladores, enzimas, bacterias, pelos bacteriales, materiales de los flagelos bacteriales, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, proteínas, carbohidratos, metales, virus, hormonas y receptores para dichos materiales. En las realizaciones preferentes, el dispositivo del sensor biológico está configurado y dispuesto para proporcionar una disposición detectable visualmente como respuesta a la transmisión de luz policromática cuando el analito de interés está interpuesto entre el material receptor y un reactivo secundario de combinación.

El medio en el cual puede estar alojado el analito puede ser sólido, del tipo de gel, líquido o gaseoso. A efectos de detectar un analito en un líquido corporal, el líquido es seleccionado entre un grupo consistente en orina, suero, plasma, líquido espinal, esputos, sangre entera, saliva, secreciones urogenitales, extractos fecales, del pericardio, gástricos, peritoneales, lavados pleurales, secreciones vaginales y frotis de garganta; y el método incluye de manera opcional la utilización de un espectrofotómetro para medir el aspecto de la disposición refractiva. El gas más corriente que se contempla que puede utilizarse con el dispositivo de sensor biológico de la presente invención es el aire.

El dispositivo del sensor biológico de la presente invención utiliza métodos de impresión de monocapas auto-instalables configuradas de alcano-tiolatos, ácidos carboxílicos, ácidos hidroxámicos y ácidos fosfónicos en elementos laminares de polímero metalizado, deseablemente elementos laminares de polímeros termoplásticos, las composiciones producidas a partir de los mismos y la utilización de estas composiciones. Las monocapas auto-instalables configuradas permiten la colocación controlada de líquidos en las mismas, los cuales pueden contener un receptor de analitos. El término "monocapas auto-instalables configuradas en los mismos" tal como se utiliza en esta descripción, significa las monocapas auto-instalables de cualquier configuración sobre los elementos laminares de polímero metalizado que incluyen una configuración sólida.

Cuando el elemento laminar con las monocapas auto-instalables del mismo está expuesto a un analito que puede reaccionar con la monocapa auto-instalable, el elemento laminar producirá configuraciones de difracción óptica que difieren dependiendo de la reacción de la monocapa auto-instalable con el analito de interés. El líquido puede ser un líquido de una tensión superficial elevada tal como agua. La luz puede estar dentro del espectro visible y ser reflejada desde el elemento laminar como transmitida a través del mismo, y el analito puede ser cualquier compuesto que reaccione con la monocapa auto-instalable.

En realizaciones preferentes, el método implica poner el substrato en contacto con una muestra de prueba que pueda contener potencialmente el analito en condiciones en las que el substrato produce un cambio en el índice de refracción de la monocapa. Cuando se transmite luz a través del polímero metalizado de plástico con la monocapa auto-instalable, se forma una configuración visible que puede ser visualizada dirigiendo la luz a una superficie u observando directamente a través del substrato.

En una realización, se contempla la presente invención en forma de una varilla de inmersión en la cual el elemento laminar metalizado impreso de microcontacto, está montado en el extremo de la varilla de inmersión. En la práctica, se sumerge la varilla de inmersión en el líquido en el cual se sospecha que puede estar presente el analito y se deja que permanezca durante varios minutos. A continuación, se extrae la varilla de inmersión y, o bien se proyecta una luz a través del elemento laminar metalizado, o el elemento laminar es observado con una luz detrás del elemento laminar. Si se observa una configuración, es que el analito está presente en el líquido.

En otra realización de la presente invención, se dispone una prueba de analitos múltiples en el mismo soporte. Tal como se muestra en la figura 1, se dispone una banda o tira (10) con varios elementos laminares metalizados impresos por microcontacto (20), (25), (30) y (35) teniendo cada elemento laminar una configuración de una monocapa auto-instalada (40) impresa en los mismos. Cada uno de los elementos laminares metalizados impresos por microcontacto (15), (20), (25) y (30) tiene un material receptor diferente que es distinto para diferentes analitos. Puede apreciarse que la presente invención puede estar formateada en cualquier disposición con una diversidad de elementos laminares metalizados impresos por microcontacto, permitiendo de este modo que el usuario del dispositivo del sensor biológico de la presente invención detecte la presencia de una serie de analitos en un medio utilizando una prueba única.

Todavía en otra realización de la presente invención, el sensor biológico puede estar unido a una etiqueta adherida al dorso o a una calcomanía que puede ser colocada a continuación sobre una superficie dura o en la pared de un recipiente. El sensor biológico puede estar colocado en la superficie interior de un recipiente tal como el envase de un producto alimenticio o un ampolla de cristal. El sensor biológico puede entonces ser visualizado para determinar si existe contaminación microbiana.

Monocapas auto-instaladas en un elemento laminar metalizado

Las monocapas auto-instaladas de compuestos orgánicos en superficies inorgánicas o metálicas, constituyen un importante aspecto de la presente invención. Aunque existen muchos sistemas diferentes de monocapas auto-instaladas basadas en diferentes componentes orgánicos y soportes, los sistemas deseables son los de alcano-tiolatos, HS(CH_{2})_{n}R,
sobre elementos laminares de oro. Habitualmente, un elemento laminar de oro de 5 a 2.000 nm de espesor, está soportado en una oblea de Si/SiO_{2} estabilizada con titanio, o en una lámina de cristal. El titanio sirve para favorecer la adherencia entre el oro y el soporte. Los alcano-tioles están adsorbidos químicamente en la superficie de oro a partir de una solución en la cual se ha sumergido el oro, y forman alcano-tiolatos adsorbidos con pérdida de hidrógeno. La adsorción puede producirse asimismo a partir del vapor. Las monocapas auto-instalables formadas en el oro a partir de alcano-tiolatos de cadena larga de estructura X(CH_{2})_{n}Y-(CH_{2})_{m}S, están altamente ordenados y pueden ser considerados como disposiciones moleculares cristalinas o casi cristalinas. En la superficie o en el interior de la monocapa puede incorporarse una amplia variedad de grupos funcionales orgánicos (X,Y).

Por consiguiente, las monocapas auto-instalables pueden ser fabricadas a medida para proporcionar una amplia variedad de propiedades a los materiales: la humectabilidad y la protección contra la corrosión por ataque con productos químicos son especialmente importantes para la impresión por microcontacto.

La figura 2 explica el procedimiento utilizado para la impresión por microcontacto. Se utiliza un sello elastomérico para la transferencia de "tinta" de alcano-tiol a una superficie de oro mediante contacto; si el sello está configurado, se forma una monocapa auto-instalable configurada. El sello está fabricado moldeando polidimetilsiloxano (PDMS) en una placa que tenga la configuración deseada. Las placas se preparan utilizando técnicas fotolitográficas normales, o están fabricadas a partir de materiales existentes que tengan características superficiales de microescala.

En un procedimiento experimental típico, se coloca una placa producida por fotolitografía en un cristal o en un plato de Petri de plástico y se vierte sobre la misma una mezcla en una proporción de 10:1 (en peso o en volumen) de elastómero de silicona SYLGARD® 184 y un producto de fraguado de la silicona SYLGARD® 184 (Dow Corning Corporation). Se deja que el elastómero repose durante 30 minutos aproximadamente a temperatura ambiente y a presión reducida para desgasificarlo, y luego se deja endurecer durante 1 a 2 horas a 60ºC y se despega cuidadosamente de la placa. El "entintado" del sello de elastómero se realiza exponiendo el sello a una solución 0,1 a 1,0 mM de alcano-tiol en etanol anhidro, bien vertiendo la solución por encima de la superficie del sello o bien frotando el sello cuidadosamente con una punta en Q que ha sido saturada con la solución de entintado. Se deja que el sello se seque hasta que no se aprecie visualmente líquido en la superficie del sello (habitualmente unos 60 segundos) tanto en condiciones ambientales como mediante exposición a una corriente de gas nitrógeno. Después del entintado se aplica el sello (habitualmente a mano) a una superficie de oro. Se ejerce una presión muy suave con la mano para ayudar a completar el contacto entre el sello y la superficie. A continuación se despega cuidadosamente el sello de la superficie. Después de la eliminación del sello, se lava la superficie del exceso de tiol y la superficie configurada de oro puede ser sometida a productos químicos de grabado (ver más adelante) que eliminan de manera selectiva las zonas no derivadas de la superficie de oro y, si se desea, el soporte o soportes situados debajo. Como alternativa, puede realizarse la derivación adicional de zonas sin sellar, tanto utilizando un segundo sello como lavando toda la superficie con un alcano-tiol diferente.

El carácter elastomérico del sello es importante para el éxito del proceso. El polidimetilsiloxano (PDMS) una vez endurecido es lo suficientemente elastomérico para permitir una buena conformación de contacto del sello y la superficie, incluso en superficies con un resalte significativo; este contacto es esencial para una transferencia por contacto eficiente de la "tinta" de alcano-tiol al elemento laminar de oro. Las propiedades elastoméricas del PDMS son importantes asimismo cuando el sello es extraído de la placa. Si el sello fuera rígido (como lo es la placa) sería difícil separar el sello de la placa después del endurecimiento sin dañar uno de los dos substratos. El PDMS es asimismo suficientemente rígido para conservar su forma incluso en características con dimensiones por debajo de la micra. Los inventores han generado con éxito disposiciones con líneas muy pequeñas, del orden de 200 nm de ancho. La superficie del PDMS tiene una baja energía libre interfacial (y = 22,1 dinas/cm) y el sello no se adhiere al elemento laminar de oro. El sello es duradero dado que el mismo sello puede ser utilizado hasta 100 veces a lo largo de un periodo de varios meses sin un deterioro significativo en su comportamiento. La naturaleza polimérica del PDMS juega asimismo un papel crítico en el procedimiento de entintado, al permitir que el sello absorba la tinta de alcano-tiol mediante hinchado. La fabricación de un rodillo de impresión para el sello permite una operación de impresión continua.

La impresión por microcontacto en superficies de oro puede ser realizada con una diversidad de "tintas" de alcano-tiol. Para la conformación de características pequeñas con resolución elevada se precisan alcano-tioles que no sufran una difusión reactiva (después de la aplicación del elemento laminar de oro). Para la estampación al aire, pueden utilizarse alcano-tioles autófobos tales como el hexadecanotiol. La impresión por microcontacto de otros alcano-tioles no autófobos, por ejemplo, HS(CH_{2})_{15}COOH puede ser llevada a cabo mediante la estampación bajo un líquido tal como agua. Las monocapas auto-instalables configuradas de alcano-tioles en oro proporcionan un carácter resistente excelente con un cierto número de productos químicos de grabado en húmedo.

En una realización de la presente invención, la monocapa auto-instalable está formada por un alcano-tiol finalizado en un grupo carboxi, estampado con un sello elastomérico configurado en una superficie de un elemento laminar termoplástico tal como MYLAR®, recubierto de oro. El alcano-tiol está entintado con una solución de alcano-tiol en etanol, secado y puesto en contacto con una superficie de oro. El alcano-tiol es transferido a la superficie solamente en aquellas zonas en las que el sello entra en contacto con la superficie, produciendo una configuración de monocapa auto-instalable que está definida por la configuración del sello. De manera opcional, las zonas de la superficie de oro sin modificar próximas a las zonas estampadas pueden ser transformadas en hidrófobas mediante una reacción con alcano-tiol finalizado en un grupo metilo.

A continuación sigue una descripción más detallada de los métodos y composiciones de la presente invención.

Cualquier elemento laminar termoplástico sobre el cual pueda depositarse un substrato metálico es adecuado para la presente invención. Estos elementos incluyen, pero no están limitados a polímeros tales como: tereftalato de polietileno (MYLAR®), acrilo-nitrilo-butadieno-estireno, copolímero de metil acrilato-acrilonitrilo, celofán, polímeros celulósicos tales como etil celulosa, acetato de celulosa, acetato butirato de celulosa, propionato de celulosa, triacetato de celulosa, polietileno, copolímeros de polietileno y acetato de vinilo, ionómeros (polímeros de etileno), copolímeros de nylon-polietileno, polipropileno, polímeros de metil penteno, fluoruro de polivinilo, y polisulfonas aromáticas. Preferentemente, el elemento laminar plástico tiene una transparencia óptica superior al 80%. Pueden hallarse otros termoplásticos adecuados y otros suministradores, por ejemplo, en obras de referencia tales como "Modern Plastics Enciclopedia" (Enciclopedia de plásticos modernos) (McGraw-Hill Publishing Co., New York 1923 a 1996).

En una realización de la invención, el elemento laminar termoplástico con el recubrimiento de metal en el mismo, tiene una transparencia óptica comprendida aproximadamente entre 5% y 95%. Una transparencia óptica más deseable para el elemento laminar termoplástico utilizado en la presente invención está comprendida aproximadamente entre 20% y 80%. En una realización deseada de la presente invención, el elemento laminar termoplástico tiene, por lo menos, una transparencia óptica aproximadamente de 80%, y el espesor del recubrimiento metálico es tal que mantiene una transparencia óptica superior aproximadamente a 20%, de manera que pueden producirse configuraciones de difracción tanto mediante luz reflejada como transmitida. Esto corresponde a un recubrimiento metálico de un espesor aproximado de 20 nm. Sin embargo, en otras realizaciones de la invención, el espesor de oro puede estar comprendido aproximadamente entre 1 nm y 1.000 nm.

El metal preferente para la deposición en el elemento laminar es oro. No obstante, pueden utilizarse plata, aluminio, cromo, cobre, hierro, zirconio, platino y níquel así como óxidos de estos metales. El óxido de cromo y el óxido de oro pueden ser utilizados para fabricar monocapas auto-instalables.

En principio, cualesquiera superficies con ondulaciones de un tamaño apropiado pueden ser utilizadas como placas. El proceso de impresión por microcontacto se inicia con una estructura con unos resaltes apropiados, a partir de la cual se moldea un sello elastomérico. Esta plantilla de "placa" puede ser generada fotolitográficamente, o mediante otros procedimientos tales como las rejillas de difracción disponibles comercialmente. En una realización, el sello puede estar fabricado en polidimetilsiloxano.

En otra realización, la invención se caracteriza por un dispositivo óptico de ensayo que tiene una superficie receptora ópticamente activa, configurada y dispuesta para permitir el ensayo simultáneo de una serie de muestras en la superficie de un analito de interés y un aparato automatizado de manipulación de líquido (por ejemplo, un dispositivo de pipetas) configurado y dispuesto para distribuir muestras y soluciones de reactivo a la superficie.

Más adelante se da a conocer una indicación de la metodología mediante la cual pueden ser realizadas las superficies ópticas de prueba de esta invención con los materiales y métodos óptimos. Generalmente, la presente invención incluye nuevas superficies de prueba ópticamente activas para la detección directa de un analito. Estas superficies tienen un material receptor específico unido a la superficie de prueba mediante la utilización de una capa de unión. De este modo, la presente invención da a conocer un método de detección que incluye poner en contacto el dispositivo del sensor biológico según la reivindicación 1, con una muestra de un líquido que contiene el analito de interés y, a continuación, examinar el cambio en la difracción de la luz transmitida producido en la superficie recubierta mediante la observación de si se forma una configuración de difracción.

La presente invención tiene una amplia gama de aplicaciones y puede ser utilizada en una diversidad de métodos de ensayo específicos de combinación de pares. Por ejemplo, los dispositivos de esta invención pueden ser utilizados en métodos de ensayos inmunitarios, tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos. Los dispositivos pueden estar adaptados para su utilización en esquemas de detección directos, indirectos o competitivos, para la determinación de la actividad enzimática y para la detección de moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, consumo de drogas, drogas terapéuticas, productos ambientales), así como para la detección de ácidos nucleicos.

En una realización de la presente invención, la monocapa auto-instalable tiene la siguiente fórmula general:

X-R-Y

X puede reaccionar con un metal o con un óxido metálico. Por ejemplo, X puede ser disulfuro asimétrico o simétrico (-R'SSY', -RSSY), sulfuro (-R'SY', -RSY), diseleniuro (-R'Se-SeY'), seleniuro (-R'SeY', -RSeY), tiol (-SH), nitrilo (-CN), isonotrilo, nitro (-NO_{2}), selenol (-SeH), compuestos fosforosos trivalentes, isotiocianato, xantato, tiocarbamato, fosfina, tioácido o ditioácido, ácidos carboxílicos, ácidos hidroxílicos y ácidos hidroxámicos.

R y R' son cadenas de hidrocarburos que pueden estar interrumpidas opcionalmente mediante hetero-átomos y que preferentemente no están ramificadas con el objeto de un compactado denso óptimo. A temperatura ambiente, R tiene una longitud igual o mayor que siete átomos de carbono con el fin de vencer la tendencia natural de una disposición al azar de la monocapa auto-instalable. A temperaturas más bajas, R puede ser más corto. En una realización, R es -(CH_{2})_{n}- en que n está comprendido entre 10 y 12, inclusive. De manera opcional, la cadena de carbono puede estar perfluorada. Debe entenderse que la cadena de carbono puede ser de cualquier longitud.

Y e Y' pueden tener cualquier propiedad superficial de interés. Por ejemplo, Y e Y' pueden estar comprendidos dentro del gran número de grupos utilizados para la inmovilización en las técnicas de cromatografía de líquidos, tales como grupos hidroxi, carboxilo, amino, adhehido, hidracida, carbonilo, epoxy o vinilo. En "Configuración de monocapas auto-instaladas utilizando impresión por microcontacto; ¿Una nueva tecnología para los sensores biológicos?", por Milan Mrksich y George M. Whitesides, publicado en TIBTECH, Junio 1995 (Vol. 13) páginas 228 a 235, se exponen ejemplos de materiales de la capa de detección.

Las monocapas auto-instalables de ácidos alquil fosfónico, hodroxámico y carboxílico pueden ser útiles asimismo a efectos de los métodos y composiciones de la presente invención. Dado que los alcano-tioles no se adsorben a las superficies de muchos óxidos metálicos, los ácidos carboxílicos, los ácidos fosfónicos y los ácidos hidroxámicos, pueden ser preferentes para X en el caso de estos óxidos metálicos. Consultar J.P. Folkers, G.M. Whitesides y otros, Langmuir, 1995, volumen 11, páginas 813 a 824.

R puede adoptar también la forma (CH_{2})_{a}-Z-(CH_{2})_{b}, en que a \geq 0, B \geq 7, y Z es cualquier función química de interés, tal como sulfonas, urea, lactama, etc.

El sello puede ser aplicado al aire o bajo un líquido tal como agua, para impedir un exceso de difusión del alcano-tiol. En procesos a gran escala o para la impresión continua, es muy deseable imprimir al aire, dado que en estos procesos son deseables tiempos de contacto más cortos.

En una realización de la presente invención, la configuración se forma en el polímero de plástico metalizado con la monocapa auto-instalable. En otra realización de la presente invención, el resalte de la configuración se forma con la monocapa auto-instalable. Después del proceso de estampación, pueden pasivarse opcionalmente las zonas metalizadas en el plástico, por ejemplo con una monocapa auto-instalable que finaliza en un grupo metilo, tal como hexadecilmercaptano.

Esta invención está ilustrada además mediante los ejemplos siguientes que no deben ser interpretados en ningún caso como que impongan limitaciones en el ámbito de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que es posible recurrir a diversas otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de las mismas, las cuales, después de la lectura de la descripción de las mismas, pueden ser sugeridas por sí mismas a los expertos en la técnica sin apartarse de la presente invención.

Ejemplo 1 Impresión de MYLAR® (tereftalato de polietileno) recubierto de oro, con configuraciones de ácido 16-mercaptohexadecanoico y hexadecanotiol

Las configuraciones de MYLAR® (tereftalato de polietileno) recubierto de oro, se imprimen con configuraciones de ácido 16-mercaptohexadecanoico y hexadecanotiol, tal como se muestra en la figura 2 y se describe a continuación.

Puede obtenerse un elemento laminar de MYLAR® modificado con una capa superior de oro depositada con plasma, de Courtaulds Performance Films (Canoga Park, CA 91304). En la figura 3 se muestra una imagen microscópica de la fuerza atómica de este elemento laminar de MYLAR®. Se utiliza un elemento laminar de polímero de un espesor comprendido entre 2 y 7 milésimas, y unos recubrimientos de oro en la parte superior que producen una resistencia superficial de 65 ohmios por centímetro cuadrado con una transmitancia de la luz visible comprendida entre 20% y 65%.

En el elemento laminar recubierto de oro se estampan configuraciones de alcano-tioles hidrófilos finalizados con grupos carboxy, utilizando ácido 16-mercaptohexadecanoico mediante el método siguiente. Se utiliza como placa una configuración fotoresistente expuesta y revelada, de círculos de 10 micras de diámetro en una oblea de silicio. Las configuraciones tienen unas características que están definidas mediante la separación de las características, aproximadamente menos de 10 micras entre sí, y más deseablemente menos de 1 a 5 micras entre sí. Se polimeriza polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero de silicona 184; Dow Corning Corp., Midland, MI) en una placa, para producir un sello con círculos de diez micras de diámetro separados cinco micras entre sí. Se entinta el sello mediante su exposición a una solución (1 a 10 mM en etanol) de ácido 16-mercaptohexadecanoico y se deja secar al aire. El substrato es puesto en contacto con el sello durante 50 segundos y es lavado entre 2 y 4 segundos con una solución de hexadecanotiol (1 a 10 mM en etanol). El substrato es lavado finalmente durante 10 segundos en etanol y es secado en una corriente de nitrógeno. En las figuras 4a hasta c y en la figura 5, se muestran los resultados de esta impresión de círculos de 10 micras de diámetro de la monocapa auto-instalable finalizada en grupos de ácido carboxílico.

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Estos círculos hidrófilos de monocapas auto-instalables, permiten la colocación selectiva de líquidos de tensión superficial elevada tales como agua, trietilenglicol, o adhesivos acrílicos de uretano endurecibles por luz ultravioleta. Estos líquidos pueden contener reactivos disueltos y en suspensión que reaccionan químicamente o físicamente con analitos objetivo, haciendo de este modo que el elemento laminar de plástico recubierto constituya un grupo de microreactores de 10 micras, adecuados como sensores químicos desechables de bajo coste. En las figuras 6a y 6b, en la figura 7 y en las figuras 8a y 8b se muestra un ejemplo de un dispositivo de este tipo.

Se muestra la difracción de la luz con estas composiciones. Se observan configuraciones tanto reflejadas como transmitidas cuando se utiliza una iluminación láser de 5 mW, 670 nM. La figura 6b es una fotografía de la configuración de difracción formada mediante luz visible mostrada a través de la configuración de la monocapa auto-instalable de la figura 6a. Con luz blanca transmitida se observan los colores de difracción del arco iris.

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Ejemplo 2

Procedimiento experimental para la detección de Saccharomyces cerevisae utilizando una estructura de azúcar hexámero. Se lava el elemento laminar MYLAR® metalizado con solución de piraña durante 20 minutos. A continuación se enjuaga el elemento laminar con agua purificada con un filtro miliporo hasta que el agua de lavado sea neutra. A continuación se limpia la superficie utilizando una limpieza con ozono UV durante 30 minutos. Se aplica CH_{3}(CH_{2})_{15}-SH (1 mM en EtOH) en la superficie del sello con una punta Q. A continuación se comprime el sello sobre la superficie de oro del elemento laminar MYLAR® durante 20 segundos. La impresión forma una estructura de círculos inversos. Se aclara el elemento laminar impreso con EtOH y se seca en nitrógeno.

Se recubre la superficie sin estampar con el tiol de azúcar hexámero dejando gotear 40 \muL de una solución sacarosa 0,5 mM en la superficie. Después de 20 segundos se aclara el exceso de la solución de tiol sacarosa. Esta oblea se suspende boca abajo en una suspensión de levadura, de 5 g de levadura en 30 ml de solución isotónica de NaCl. Transcurridos 40 minutos, se lava la superficie con EtOH. La configuración de difracción se genera mediante la utilización de un haz láser de He/Ne (lambda = 832,8 nm).

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Ejemplo 3

Se producen configuraciones de monocapas auto-instalables hidrófilas con oligómeros, de un promedio de seis moléculas de glucosa unidas al extremo del alcano-tiol en MYLAR® metalizado. (Ver ejemplo 2). Los círculos de 10 micras de diámetro separados cinco micras entre sí, son utilizados para generar la placa a la cual se unirá el organismo objetivo. La zona no estampada se convierte en hidrófoba a través de una reacción con alcano-tiol finalizado con un grupo metilo. Esta muestra no es difractante cuando es producida. Se somete un fragmento de 1 cm cuadrado de esta muestra durante 40 minutos a una solución acuosa de 30 mL que contiene 1 gramo de levadura de panadero y 0,9% en peso de solución salina, seguido de un lavado con grandes cantidades de agua. En las figuras 9a y 9b se muestran respectivamente la fotomicrografía de la muestra y la imagen de difracción producida a partir de la muestra irradiada con un láser He-Ne. Una muestra de control que no contiene el azúcar no muestra difracción ni unión de partículas. Tal como se aprecia en la figura 9a, la levadura se ha unido a los círculos de 10 micras del tiol de azúcar, pero no se ha unido a las monocapas auto-instalables hidrófobas terminadas en grupos metilo. Es evidente una cierta coalescencia de los círculos con la levadura combinada, en una dirección preferente. La figura 9b revela que la difracción con la radiación de 632 nM tiene como resultado la unión de la levadura. La difracción sirve de base para la detección de la presencia de células de levadura.

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Ejemplo 4 Detección de Saccharomyces cerevisae

Durante 20 minutos se lava con solución de piraña el elemento laminar metalizado de MYLAR® que debe ser impreso. El elemento laminar se aclara con agua purificada con un filtro miliporo hasta neutralización y a continuación se limpia con ozono UV durante 30 minutos. Se aplica la impresión por microcontacto de la capa hidrófoba de CH_{3}(CH_{2})_{15}-SH (1 mM en EtOH) en la superficie del sello con una punta q. Se comprime el sello sobre la superficie de oro del elemento laminar MYLAR® durante 20 segundos. La impresión forma una estructura de círculos inversos. Se aclara el elemento laminar impreso con EtOH y se seca en nitrógeno.

Se recubre la superficie no estampada con el tiol de azúcar hexámero dejando gotear 40 \muL de una solución de sacarosa 0,5 mM en la superficie. Después de 20 segundos se aclara el exceso de la solución de tiol sacarosa. Esta oblea se suspende boca abajo en una suspensión de levadura de 5 g de levadura en 30 ml de solución isotónica de NaCl. Transcurridos 40 minutos, se lava la superficie con EtOH. La configuración de difracción se genera mediante la utilización de un haz láser de He/Ne (lambda = 832,8 nm).

Ejemplo 5 Sensores biológicos específicos para Candida tropicalis

Se inocularon placas de agar (medio universal para levadura) con un clónico de la Candida tropicalis original (DSM 1348). Después de 2 días a 25ºC, se recogen las células y se diluyen con el medio de la levadura. A continuación se trata la suspensión en baño de ultrasonidos para separar los agregados de células.

El procedimiento experimental de impresión por microcontacto es el mismo que en el Ejemplo 2. Los tioles utilizados en este experimento son HS-(CH_{2})_{15}-CH_{3} indicado como CH_{3}, y HS-(CH_{2})_{15}COOH, indicado como COOH.

El tiempo de incubación del agua-oro en la solución de células está comprendido entre 1 noche y 3 días. Las muestras no se aclaran después de la incubación. Las siguientes combinaciones están representadas en las figuras indicadas.

3)

el círculo es CH_{3}, la zona que lo rodea está incubada con COOH durante una noche (la figura 10a es la fotomicrografía de la superficie y la figura 10b es la configuración de difracción producida por la superficie configurada de la figura 10a)

2)

el círculo es COOH, la zona que lo rodea está incubada con CH3 durante una noche (la figura 11a es la fotomicrografía de la superficie y la figura 11b es la configuración de difracción producida por la superficie configurada de la figura 11a)

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Ejemplo 6

Se imprime por contacto un substrato oro/MYLAR utilizando un sello de círculos de 10 \mu recubierto con una solución etanólica de ácido mercaptohexadecanoico. Las zonas que rodean los círculos se llenan a continuación con una solución en etanol de hexadecano tiol. Los grupos ácido finales son esterificados con L-fucosa utilizando acoplamiento con carbodiimida. El procedimiento implica la colocación del oro/MYLAR® impreso por contacto en una solución 41 mM de diciclohexil carbodiimida (DCC) en piridina durante 5 a 6 minutos, y a continuación transferirla inmediatamente a una ampolla que contenga una solución 3,3 mM de piridina en L-fucosa. Después de 2 horas y media, la muestra de oro/MYLAR® es extraída, es aclarada a fondo con agua destilada, a continuación con etanol y
secada.

Esta muestra es expuesta a una suspensión de 0,5 g de levadura de panadero (Saccharomyces cerevisae) en 15 ml de suspensión acuosa al 0,9% de cloruro sódico. Después de 8 días se aclara brevemente la muestra con agua destilada y se seca en una corriente de nitrógeno. La luz difractada de la muestra irradiada con un haz láser He/Ne (lambda = 832,8) y exploración con microscopio electrónico (SEM) reveló la presencia de los organismos de levadura en los círculos de 10 micras. (Ver figura 13). La figura 12 muestra una célula de levadura sufriendo mitosis. La figura 13 demuestra que las células de levadura todavía son viables, incluso después de unirse a los círculos.

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Ejemplo 7

Se imprime por contacto un substrato de oro/MYLAR® utilizando un sello de círculos de 10 micras, recubierto con una solución etanólica de ácido mercaptohexadecanoico. Las zonas que rodean los círculos se llenan a continuación con una solución etanólica de hexadecanotiol.

Se expone a continuación esta muestra a una suspensión acuosa de aproximadamente 10^{10} partículas/ml de partículas de polistireno modificado con amino 131 nm (Catálogo #F103092 de Seradyn). Después de dos días, se extrae la muestra y se lava cuidadosamente con etanol para eliminar las partículas sin unir. Una parte de la muestra difractó luz de un láser, el análisis SEM mostró que las partículas tendían a agregarse alrededor de los círculos (Ver figuras 14a y 14b). La figura 14b es una vista con una mayor ampliación de la muestra mostrada en la figura 14a.

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Ejemplo 8

Se imprime por contacto un substrato de oro/silicio utilizando un sello de círculos de 10 micras recubierto con una solución etanólica de ácido mercaptohexadecanoico. Los grupos ácido finales están esterificados con D-manosa utilizando acoplamiento con carbodiimida. El procedimiento implicó colocar la impresión por contacto de oro/silicio en una solución acuosa 41 mM de 1-etilo-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida ("FDAC") durante 5 a 8 minutos, y transferirla a continuación a una ampolla que contiene una solución 9,9 mM de D-manosa. A las 3 horas y media se extrae la muestra oro/silicio, se lava a fondo con agua destilada, a continuación con etanol y luego se seca.

La muestra se cubre con unas pocas gotas de solución salina tampón de fosfato (fosfato 20 mM, cloruro sódico 80 nM, pH 7,4), se añaden a continuación 20 \muL de Concanavalin A etiquetada con 20 nm de coloide de oro (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) al vertido tampón. Después de 30 minutos, se lava a fondo la muestra en la solución tampón, seguido de más aclarados con agua destilada y a continuación un secado bajo un chorro de nitrógeno. El análisis SEM muestra la presencia de partículas de oro de un tamaño de 20 nm unidas a los círculos (ver figura 15). Debido a que el Concanavalin A es específico para combinarse con la manosa, esta prueba confirma la presencia de manosa en los círculos de 10 micras.

Los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse ciertas modificaciones en la invención dada a conocer en esta descripción con respecto a las realizaciones ilustradas sin apartarse de la invención. Y aunque la invención ha sido descrita anteriormente con respecto a las realizaciones preferentes, se comprenderá que la invención está adaptada a numerosas reorganizaciones, modificaciones y alteraciones, y que está previsto que dichas reorganizaciones, modificaciones y alteraciones estén comprendidas dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

1. Sensor biológico que comprende:

un elemento laminar de polímero recubierto con metal; y

una monocapa auto-instalable impresa en el elemento laminar de polímero metalizado, en el que la monocapa auto-instalable tiene un material receptor en la misma que es específico para un analito;

en el que la monocapa auto-instalable está impresa en una configuración no difractiva y que cuando el sensor biológico se combina con el analito, el sensor biológico difracta la luz transmitida para formar una configuración de difracción.

2. Sensor biológico, según la reivindicación 1, en el que la configuración de difracción es visible.

3. Sensor biológico, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el metal ha sido escogido entre el grupo consistente en oro, plata, cromo, níquel, platino, aluminio, hierro, cobre, óxido de oro, óxido de cromo o zirconio.

4. Sensor biológico, según la reivindicación 3, en el que el metal es oro.

5. Sensor biológico, según la reivindicación 4, en el que el recubrimiento de oro tiene aproximadamente entre 1 nanómetro y 100 nanómetros de espesor.

6. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho elemento laminar de polímero es un elemento laminar termoplástico.

7. Sensor biológico, según la reivindicación 6, en el que el elemento laminar de polímero es tereftalato de polietileno, acrilonitrilo-butadieno-estireno, copolímero de acrilonotrilo-acrilato de metilo, celofán, polímeros celulósicos tales como etil celulosa, acetato de celulosa, acetato butirato de celulosa, propionato de celulosa, triacetato de celulosa, polietileno, copolímeros de polietileno-acetato de vinilo, ionómeros (polímeros de etileno), copolímeros de polietileno-nylon, polipropileno, polímeros de metil penteno, fluoruro de polivinilo y polisulfonas aromáticas.

8. Sensor biológico, según la reivindicación 7, en el que el elemento laminar del polímero es tereftalato de polietileno.

9. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el elemento laminar termoplástico es ópticamente transparente.

10. Sensor biológico, según la reivindicación 9, en el que el elemento laminar termoplástico tiene una transparencia óptica comprendida entre 5% y 95%.

11. Sensor biológico, según la reivindicación 10, en el que el elemento laminar termoplástico tiene una transparencia óptica comprendida aproximadamente entre 20% y 80%.

12. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la monocapa auto-instalable está formada a partir de compuestos con la fórmula general siguiente:

X-R-Y

en que:

X puede reaccionar con el metal o el óxido de metal en el elemento laminar polimérico;

R es una cadena de hidrocarburos; e

Y es un compuesto con alguna propiedad de interés.

13. Sensor biológico, según la reivindicación 12, en el que:

X es un disulfuro asimétrico o simétrico (-R'SSY', -RSSY), sulfuro (-R'SY', -RSY), diseleniuro (-R'Se-SeY'), seleniuro (-R'SeY', -RSeY), tiol (-SH), nitrilo (-CN), isonitrilo, nitro (-NO_{2}), selenol (-SeH), compuestos fosforosos trivalentes, isotiocianato, xantato, tiocarbamato, fosfina, tioácido o ditioácido, ácidos carboxílicos, ácidos hidroxílicos y ácidos hidroxámicos;

R y R' son cadenas de hidrocarburos que pueden estar interrumpidas opcionalmente mediante hetero-átomos y que opcionalmente pueden estar perfluoradas, y que preferentemente no están ramificadas; y

Y e Y' son grupos hidroxilo, carboxilo, amino, aldehido, hidracida, carbonilo, epoxy o vinilo.

14. Sensor biológico, según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que R tiene una longitud mayor de 7 átomos de carbono.

15. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que R es un compuesto de la forma (CH_{2})_{a}-Z-(CH_{2})_{b}, en que a \geq 0, b \geq 7, y Z es cualquier función química de interés.

16. Sensor biológico, según la reivindicación 15, en el que Z está escogido entre el grupo compuesto de sulfonas, lactamas y urea.

17. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que existen dos o más monocapas auto-instalables con propiedades químicas diferentes.

18. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que una primera monocapa auto-instalable es hidrófoba y la segunda monocapa auto-instalable es hidrófila.

19. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el analito es bacterias, levadura, hongos, virus, factores reumatoideos, anticuerpos IgG, IgM, IgA e IgE, antígeno carcinoembrionario, antígeno del estreptococo Grupo A, antígenos virales, antígenos asociados con la enfermedad autoinmunitaria, alérgenos, antígenos tumorales, antígeno del estreptococo Grupo B, antígeno HIV I ó HIV II, virus de anticuerpos, antígenos específicos a RSV, un anticuerpo, antígeno, enzima, hormona, polisacárido, proteína, lípido, carbohidrato, droga o ácido nucleico, Neisseria meningitides grupos A, B, C, Y y W sub 135, Streptococcus pneumoniae, E. coli K1, Haemophilus influenza tipo B; un antígeno derivado de microorganismos; un hapteno, una droga de consumo; una droga terapéutica; unos productos medioambientales y antígenos específicos de la Hepatitis.

20. Sensor biológico, según la reivindicación 19, en el que el analito es bacterias, levadura, hongos o virus.

21. Sensor biológico, según la reivindicación 20, en el que el hongo es la especie Candida.

22. Sensores biológicos, según la reivindicación 20, en los que la bacteria es de la especie Salmonella.

23. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el material receptor ha sido escogido entre antígenos, anticuerpos, oligonucleótidos, queladores, enzimas, bacterias, levaduras, hongos, pelos bacteriales, materiales de los flagelos bacteriales, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, carbohidratos, metales, hormonas y receptores para dichos materiales.

24. Sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el material receptor está seleccionado entre toxinas, parásitos, células, alérgenos, materiales nucleares, auto-anticuerpos, proteínas de la sangre, desechos celulares, proteínas de los tejidos, substratos de enzimas, coenzimas, transmisores neuronales, partículas virales, microorganismos y drogas.

25. Recipiente en el que el sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, está unido a la pared interior del recipiente.

26. Recipiente, según la reivindicación 25, en el que el recipiente es una ampolla.

27. Recipiente, según la reivindicación 25, en el que el recipiente es un recipiente de productos alimenticios.

28. Prenda de vestir, en la que el sensor biológico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, está unido a la pared interior de la prenda.

29. Prenda, según la reivindicación 28, en la que la prenda es un pañal.

30. Método de fabricación de un sensor biológico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, comprendiendo dicho método la impresión de una configuración de monocapas auto-instalables con un material receptor que es específico para un analito en dicho elemento laminar de polímero metalizado;

en el que la monocapa auto-instalable está impresa en una configuración no difractante y que, cuando el sensor biológico se combina con un analito, el sensor biológico difracta la luz transmitida para formar una configuración de difracción.

31. Método para detectar un analito en un medio que comprende:

poner en contacto el medio que se sospecha que contiene el analito con un dispositivo de un sensor biológico, tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24;

transmitir una luz a través del elemento laminar de polímero; y

detectar la presencia del analito combinado con el material receptor mediante la detección de una configuración formada mediante difracción de la luz transmitida.

32. Método, según la reivindicación 31, en el que el analito es bacterias, levadura, hongos, virus, factores reumatoides, anticuerpos IgG, IgM, IgA, e IgE; antígeno carcinoembrionario, antígeno de estreptococo Grupo A, antígenos virales, antígenos asociados con la enfermedad autoinmunitaria, alérgenos, antígenos tumorales, antígeno del estreptococo Grupo B, antígeno de HIV I ó de HIV II; antígeno, virus de anticuerpos, antígenos específicos de RSV, un anticuerpo, antígeno, enzima, hormona, polisacárido, proteína, lípido, carbohidrato, droga o ácido nucleico, Neisseria meningitides grupos A, B, C, Y y W sub 135, Streptococcus pneumoniae, E. coli K1, Haemophilus influenza tipo B; un antígeno derivado de microorganismos; un hapteno, una droga de consumo; una droga terapéutica; productos medioambientales o antígenos específicos de la Hepatitis.

33. Método, según la reivindicación 32, en el que el analito es bacterias, levadura, hongos o virus.

34. Método, según la reivindicación 33, en el que el hongo es de la especie Candida.

35. Método, según la reivindicación 33, en el que la bacteria es de la especie Salmonella.