ES2290274T3 - Procedimiento para la produccion de un tejido biologico usando un soporte de colageno y estructura de tejido correspondiente. - Google Patents

Procedimiento para la produccion de un tejido biologico usando un soporte de colageno y estructura de tejido correspondiente. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la producción de un tejido biológico, en el que se cultivan células musculares sobre un soporte, caracterizado porque se dispone como soporte un tejido afieltrado producido industrialmente de fibrillas de colágeno, que puede obtenerse comercialmente como parche de colágeno para la hemostasia o tratamiento de una herida, porque se aplican células de músculo cardiaco sobre el soporte o se introducen en éste, porque se realiza el cultivo en un medio de cultivo y porque se cultivan las células de músculo cardiaco sobre el soporte hasta que las fibras de colágeno se han degradado en la mayor parte y se ha formado un fragmento de tejido de músculo cardiaco que se contrae de manera sincrónica.

Description

Procedimiento para la producción de un tejido biológico usando un soporte de colágeno y estructura de tejido correspondiente.
La invención se refiere a un procedimiento para la producción de un tejido biológico, en el que se cultivan células musculares sobre un soporte, al uso de un soporte determinado para este fin así como a una estructura de tejido adecuada para la implantación, que puede obtenerse con el procedimiento.
Hoy en día se intenta cultivar para diferentes fines, tejidos, órganos o partes de los mismos, para poder reemplazar tejidos y órganos dañados o incluso destruidos por enfermedad o accidente. Ensayos de este tipo existen entre otros para la piel, tejido hepático y tejido de músculo cardiaco.
Para soportar el tejido (especialmente en la fase inicial del cultivo) y para la distribución inicial de las células a menudo se usan colágenos líquidos, por ejemplo un colágeno que puede obtenerse bajo el nombre comercial "Matrigel®", o sustancias sólidas biodegradables. Sin embargo, los resultados obtenidos hasta ahora son todavía insuficientes con respecto a la calidad del tejido. Crean especialmente problemas la consolidación de la matriz, la distribución celular irregular en esta matriz y unido a esto, una formación de tejido no semejante a la natural, irregular.
A partir del documento DE 198 28 726 A1 se conoce un transplante bioartificial, que se obtiene a base de una matriz de colágeno prácticamente libre de células, no desnaturalizada con estructura esponjosa. Para esta matriz se libera previamente de células foráneas de manera enzimática o química un tejido alogénico o xenogénico.
El documento WO 99/47188 da a conocer el uso de una lámina de biopolímero para una reparación de tejido o construcción de tejido. La lámina puede contener células o macromoléculas para el crecimiento celular, morfogénesis, diferenciación o formación de tejido.
En el caso de cultivo de tejidos cardiacos se añade que una distribución de las células cardiacas no correspondiente de manera suficiente a las razones naturales, irregular conduce a un comportamiento de contracción asincrónico e irregular.
Existe una gran necesidad de proporcionar tejido cardiaco cultivado. Una gran parte de la mortalidad y morbilidad total de la población se basa en causas cardiovasculares. Por tanto la investigación médica busca nuevos procedimientos para reemplazar tejidos y órganos, para controlar las consecuencias de la destrucción de tejido y de la pérdida de la función orgánica (por ejemplo infarto de miocardio) en el campo cardiovascular. Por tanto, la producción de tejido de músculo cardiaco en el biorreactor es el objetivo de actividades de investigación intensas.
El objetivo de la invención consiste en proporcionar una estructura de tejido tridimensional formada lo más semejante posible a la natural, que es adecuada para reemplazar o reemplazar parcialmente tejidos u órganos, especialmente tejido muscular y de músculo cardiaco. Especialmente debe conseguirse una estructura tal que puede servir como base para una transferencia de células o de tejido a un órgano enfermo o destruido mediante implantación en el organismo animal o humano. Además se expone un procedimiento para la producción de una estructura de este tipo.
Para resolver este objetivo, en el caso de un procedimiento del tipo mencionado anteriormente, se prevé disponer como soporte un tejido afieltrado producido industrialmente de fibrillas de colágeno, que puede obtenerse comercialmente como parche de colágeno para la hemostasia o tratamiento de una herida, aplicar células de músculo cardiaco sobre el soporte o introducirlas en éste, realizar el cultivo en un medio de cultivo y cultivar las células de músculo cardiaco sobre el soporte hasta que las fibras de colágeno se han degradado en la mayor parte y se ha formado un fragmento de tejido de músculo cardiaco que se contrae de manera sincrónica.
Un aspecto determinante de la invención consiste en que se pudo encontrar un soporte para el cultivo de células o de tejido, que tal como se ha comprobado, es adecuado idealmente para la formación regular de una unión de tejido. Este soporte está compuesto por un tejido afieltrado o reticulado producido industrialmente de fibras de colágeno o también "fibrillas de colágeno", tal como se usa para la hemostasia y tratamiento de heridas, especialmente en el campo quirúrgico desde hace muchos años. Pueden obtenerse comercialmente parches de colágeno de este tipo adecuados como soporte para la producción de la estructura de tejido según la invención según el procedimiento según la invención, por ejemplo son adecuados los parches de colágeno conocidos bajo el nombre comercial "Collatamb®" y "Tissufleece®".
El soporte de colágeno forma una estructura esponjosa o afieltrada que puede empaparse con líquidos o impregnarse con éstos. Por tanto es fácilmente posible inocular el tejido de colágeno con células, que pueden encontrarse por ejemplo en una solución nutritiva.
Dado que el soporte esponjoso o afieltrado se disuelve lentamente en el medio de cultivo de igual manera que en el organismo, durante el cultivo se produce una distribución regular y una expansión progresiva de las células en el soporte o matriz. En el transcurso del cultivo se forma de este modo un tejido sólido de manera regular, mecánicamente estable.
El cultivo se continúa hasta que las fibras de colágeno se han degradado en la mayor parte y se ha formado un tejido de músculo cardiaco formado de manera uniforme. Resulta un fragmento de tejido de músculo cardiaco que se contrae de manera sincrónica, mecánicamente estable, sólido y regular.
Un fragmento de tejido de músculo cardiaco de este tipo es adecuado para la implantación. También puede usarse de manera ventajosa para fines de investigación, dado que puede reproducirse fácilmente y cumple sus propiedades físicas y mecánicas de manera eficaz. Por tanto, el tejido de músculo cardiaco producido de esta manera también es adecuado para las investigaciones científicas de tejidos cardiacos y es de gran utilidad para los laboratorios de investigación, por ejemplo también en la investigación farmacéutica.
El cultivo de las células sobre la sujeción de colágeno degradable según el procedimiento según la invención se realiza en un medio de cultivo, preferiblemente en medio de eagle modificado por Dulbecco (DMEM). A este respecto puede procederse de modo que el soporte de colágeno se coloca en una placa y que las células se añaden suspendidas en medio de cultivo. Las células también pueden disponerse en el medio de cultivo, tras lo cual se coloca dentro el soporte de colágeno. Las células también pueden inyectarse en el soporte, dado el caso múltiples veces y/o en diferentes puntos del soporte. De igual manera, los procedimientos indicados anteriormente para aplicar e introducir las células sobre o en el soporte pueden combinarse de manera adecuada.
En un perfeccionamiento de la invención se realiza el procedimiento de modo que el cultivo se realiza de forma tridimensional en un molde negativo adecuado. En el caso más sencillo, el molde puede ser un cuadrado o un disco. A modo de ejemplo, el soporte de tejido de colágeno podría cortarse a la medida de una placa Petri pequeña adecuada para el molde y colocarse en ésta. Las células pueden disponerse en el medio de cultivo y/o añadirse tras colocar el soporte.
Las células también pueden añadirse en mezcla con aditivos adiciones tales como por ejemplo antibióticos y/o introducirse en el soporte.
Preferiblemente pueden añadirse a las células además factores y/o co-factores, por ejemplo factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroplastos (FGF), factor-b de crecimiento de trombocitos (TGF-b).
La estructura de tejido según la invención se forma preferiblemente de modo que las células son parte de un tejido celular relacionado cultivado sobre y/o en el soporte, es decir el cultivo se condujo in vitro hasta que se consiguió un tejido celular relacionado.
A continuación se aclara en más detalle la invención mediante un ejemplo representado en el dibujo. En el dibujo muestran:
la figura 1: una vista en corte de una placa de cultivo que contiene una suspensión celular para colocar el soporte de colágeno;
la figura 2: una estructura de tejido obtenida tras el cultivo según la figura 1.
La figura 1 muestra una placa 1 Petri, que está rellena de silicona 2. De la silicona se cortó un fragmento de forma cuadrada como molde 3 negativo para el fragmento de tejido que ha de cultivarse, que está dimensionado precisamente de tal manera que puede colocarse un soporte 5 de tejido de colágeno cortado a la medida adecuada de TissuFleece®. En lugar de un corte en forma cuadrada, también puede elegirse otro molde adecuado que se ajuste al fin de utilización deseado del tejido cultivado acabado.
En el corte o en el molde 3 negativo se encuentra ya en esta representación una mezcla de células cardiacas (cardiomiocitos) y un medio, como el medio de eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FCS), penicilina/estreptomicina (P/E). Al colocar el soporte 5 la mezcla 7 penetra en el soporte y lo empapa. Además pueden añadirse, si se desea, tras colocar el soporte 5 células adicionales desde arriba.
El cultivo adicional se lleva a cabo en condiciones habituales y que pueden ajustarse según criterios conocidos por el experto. En el presente caso las condiciones de cultivo fueron tal como sigue:
Calentamiento en la incubadora a 37ºC, medio de cultivo: medio de eagle modificado por Dulbecco (DMEM)
Aditivos: suero bovino fetal (FCS), penicilina/estreptomicina (P/E), CO_{2} al 5%.
El cultivo durante 84 días dio como resultado un fragmento de tejido cardiaco mecánicamente estable, tal como se representa en la figura 2 con 5a. El soporte 5 original se ha disuelto ya ampliamente y se ha producido un fragmento de tejido cardiaco sólido, relacionado, que puede extraerse sin dificultad del molde y puede conducirse al uso adicional (implantación o investigación científica).
\newpage
El tejido cultivado recién extraído muestra una estructura celular regular y se autocontrae. Es elástico y plástico similar al corazón nativo. El tejido es lo suficientemente estable mecánicamente para el manejo y diversas manipulaciones. Muestra una cinética de degradación lenta (días). Además el tejido puede estimularse eléctricamente y contraerse rítmicamente.

Claims (7)

1. Procedimiento para la producción de un tejido biológico, en el que se cultivan células musculares sobre un soporte, caracterizado porque se dispone como soporte un tejido afieltrado producido industrialmente de fibrillas de colágeno, que puede obtenerse comercialmente como parche de colágeno para la hemostasia o tratamiento de una herida, porque se aplican células de músculo cardiaco sobre el soporte o se introducen en éste, porque se realiza el cultivo en un medio de cultivo y porque se cultivan las células de músculo cardiaco sobre el soporte hasta que las fibras de colágeno se han degradado en la mayor parte y se ha formado un fragmento de tejido de músculo cardiaco que se contrae de manera sincrónica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza el cultivo en medio de eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células se añaden suspendidas en el medio de cultivo y/o se inyectan en el soporte.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realiza el cultivo de forma tridimensional en un molde negativo adecuado.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se añaden a las células sustancias, preferiblemente factores y co-factores.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque los factores son factores promotores del crecimiento de los vasos.
7. Estructura de tejido de células de músculo cardiaco, que puede obtenerse mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6.
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