ES2287928T3 - Levaduras kluyveromyces modificadas, preparacion y utilizacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LEVADURAS DEL TIPO KLUVEROMYCES QUE PRESENTAN UNA O VARIAS MODIFICACIONES GENETICAS DE AL MENOS UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEASA, QUE REDUCE O MODIFICA LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE DICHAS LEVADURAS, ASI COMO SU UTILIZACION COMO CELULA HUESPED PARA LA SECRECION DE PROTEINAS RECOMBINANTES.

Description

Levaduras Kluyveromyces modificadas, preparación y utilización.

La presente invención se refiere a nuevas levaduras pertenecientes al género Kluyveromyces, genéticamente modificadas y su utilización para producir ventajosamente proteínas recombinantes.

El progreso realizado en el campo de la biología molecular ha permitido modificar los microorganismos para hacerles producir proteínas de interés y por ejemplo proteínas heterólogas (proteínas de mamíferos, proteínas artificiales, proteínas quiméricas, etc). En particular, numerosos estudios genéticos se han referido a la bacteria Escherichia coli y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Más recientemente, se han desarrollado herramientas genéticas con el fin de utilizar la levadura Kluyveromyces como célula huésped para la producción de proteínas recombinantes. Poner de manifiesto el plásmido pKD1 procedente de K. drosophilarum (patente europea EP 241 435) ha permitido desarrollar un sistema huésped - vector particularmente ventajoso para la secreción de proteínas recombinantes (patentes europeas EP 361 991, EP 413 622).

Sin embargo, la aplicación de este sistema de producción está aún limitada, en particular por los problemas de eficacia de expresión de los genes en estos microorganismos recombinados, por los problemas de estabilidad de los plásmidos e igualmente por los problemas de degradación de los productos recombinantes por las células en las que se sintetizan. Se puede manifestar en efecto un fenómeno de proteolisis durante el tránsito de la proteína de interés en el medio secretorio de la levadura recombinada o por la existencia de proteasas secretadas o presentes en el medio de cultivo a continuación de una lisis celular que no se desea que intervenga durante la fermentación.

La solicitante ha demostrado ahora que es posible mejorar los niveles de producción de dichas proteínas recombinantes, es decir en su forma integral, en las levaduras Kluyveromyces, modificando al menos un gen codificador de una proteasa celular y especialmente una proteasa que transita por el medio secretorio. De manera sorprendente, la solicitante ha demostrado más que dichas modificaciones son particularmente ventajosas puesto que permiten aumentar las tasas de producción de proteínas recombinantes y ésto es tanto más ventajoso cuanto menos efecto aparente tenga dicha modificación sobre la velocidad de crecimiento y la viabilidad de las células modificadas en las condiciones industriales de fermentación. Siempre de manera sorprendente, la solicitante ha demostrado igualmente que dichas modificaciones no afectan a la estabilidad de las levaduras transformadas, lo que permite utilizar dichas levaduras de manera particularmente ventajosa para producir proteínas recombinantes.

La presente invención tiene pues por objeto las levaduras del género Kluyveromyces que presenten una o varias modificaciones genéticas de al menos un gen codificador de una proteasa, modificando la actividad proteolítica de dichas levaduras. Preferentemente, la o las modificaciones genéticas vuelven a dicho gen parcial o totalmente incapaz de codificar la proteasa natural. En otro modo preferido de la invención, el o los genes así modificados genéticamente codifican una proteasa no funcional o un mutante con un espectro de actividad proteolítica modificada. En otro modo preferido de la invención, el gen o los genes que codifican dichas proteasas se pone(n) bajo el control de un promotor regulado.

Las levaduras del género Kluyveromyces según la invención comprenden las levaduras tal como se definen por van der Walt [en : The Yeasts (1.987) NJ.W. Kreger-van Rij (ed); Elsevier; pág. 224] y preferentemente las levaduras K. marxianus var. lactis (K. lactis), K. marxianus var. marxianus (K. fragilis), K. marxianus var. drosophilarum (K. drosophilarum). K. waltii, etc...

Por modificación genética, se debe entender más particularmente toda supresión, sustitución, deleción o adición de una o varias bases en el gen o en los genes considerados. Se pueden obtener dichas modificaciones in vitro (en el ADN aíslado) o in situ, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética y exponiendo dichas levaduras a un tratamiento mediante agentes mutágenos. Por agentes mutágenos, se pueden citar, por ejemplo, agentes físicos tales como radiaciones energéticas (rayos X, g, ultravioleta, etc..) o agentes químicos capaces de hacer reaccionar con diferentes grupos funcionales bases de ADN y por ejemplo agentes alquilantes [etilmetanosulfonato (EMS), N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, N-nitroquinolein-1-óxido (NQO)], agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc... Por deleción se entiende toda supresión del gen considerado. Se puede tratar especialmente por una parte de la región codificadora de dichas proteasas y/o toda o parte de la región promotora de la transcripción.

Las modificaciones genéticas se pueden obtener igualmente por disrupción génica, por ejemplo según el protocolo inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1.983) 202]. En este caso, la totalidad de la secuencia codificadora se perturbará preferentemente para permitir la sustitución, por recombinación homóloga, de la secuencia genómica salvaje por una secuencia no funcional o mutante.

Dicha o dichas modificaciones genéticas pueden estar localizadas en el gen codificador de dichas proteasas o fuera de la región codificadora de dichas proteasas y por ejemplo en las regiones responsables de la expresión y/o de la regulación transcripcional de dichos genes. La incapacidad de dichos genes para codificar las proteasas naturales se puede manifestar bien por la producción de una proteína inactiva debido a modificaciones estructurales o conformacionales, bien por la ausencia de producción, bien por la producción de una proteasa que tenga alterada una actividad enzimática y por la producción de la proteasa natural a un nivel atenuado o según un modo de regulación deseado.

Por otro lado, algunas alteraciones tales como las mutaciones puntuales por naturaleza se pueden corregir o atenuar por mecanismos celulares, por ejemplo durante la replicación del ADN que precede a la división celular. Dichas alteraciones genéticas tienen entonces un interés limitado al nivel industrial puesto que las propiedades fenotípicas que resultan no son perfectamente estables. La solicitante ha puesto ahora a punto un procedimiento que permite preparar las levaduras Kluyveromyces que presentan una o varias modificaciones genéticas de al menos un gen codificador de una proteasa, siendo dicha o dichas modificaciones estables segregacionalmente y/o no reversibles. Las levaduras que presentan dichas modificaciones son particularmente ventajosas como huésped celular para la producción de proteínas recombinantes. La invención permite igualmente la realización de las levaduras en las que la o las modificaciones aportadas hacen que el gen o los genes considerados sean total o solamente parcialmente incapaces de producir una proteasa funcional.

Preferentemente, las levaduras según la invención presentan una o varias modificaciones genéticas estables segregacionalmente. Siempre según un modo preferido, la modificación o las modificaciones genéticas son no reversibles. Según otro modo preferido de la invención, la modificación o las modificaciones genéticas no dejan ninguna actividad residual al gen considerado.

Preferentemente, el gen o los genes codificadores de una o más proteasas se elige(n) entre los genes codificadores de proteasas que transitan por el medio secretorio de Kluyveromyces. Dichas proteasas se pueden localizar en el retículo endoplasmático, compartimento del aparato de Golgi, compartimento posGolgi y por ejemplo vacuolas celulares, vesículas del endosoma, vesículas de secreción o el medio extracelular.

Como ejemplo de dichos genes, se pueden citar los genes de Kluyveromyces que codifican una proteasa elegida entre las familias de la proteasa A, de la proteasa B o de una carboxipeptidasa (y por ejemplo la carboxipeptidasa Y o la carboxipeptidasa S) y la endopeptidasa KEX1 de K. lactis o una proteasa de actividad similar y por ejemplo la proteasa YAP3 [Egel-Mitani et al., Yeast 6 (1.990) 127] o más generalmente toda nueva proteasa que intervenga en la maduración de algunas proteínas secretadas.

En un modo preferido de la invención, el gen o los genes considerados codifican proteasas que no intervienen en la división del péptido señal de las proteínas recombinantes expresadas en forma de preproteínas. Se pueden citar como ejemplos de genes particularmente interesantes los genes de las proteasas A, de la proteasa B y de la carboxipeptidasa Y de Kluyveromyces, cuya clonación se describe en los ejemplos.

En otro modo de la invención, dicha o dichas proteasas poseen una actividad de señal de peptidasas y dicha o dichas modificaciones genéticas permiten su sobreexpresión, lo que es particularmente ventajoso en el caso en que esta etapa sea una etapa limitante del medio secretorio.

La invención tiene igualmente por objeto toda levadura Kluyveromyces, tal como se definió anteriormente, en la que se ha introducido una secuencia de ADN exógeno que comprende uno o varios genes que codifican una proteína de interés que se desea expresar y/o secretar en dicha levadura.

En el sentido de la presente invención, se entiende por secuencia de ADN exógeno toda secuencia de ADN introducida artificialmente en la levadura y que codifica una o varias proteínas de interés. En particular se puede tratar de secuencias de ADN complementario (ADNc), secuencias artificiales o híbridos y secuencias sintéticas o semisintéticas, incluso en una casete de expresión que permita la síntesis en dichas levaduras de dicha o dichas proteínas de interés. Por ejemplo, esta secuencia de ADN exógeno puede incluir una región de arranque de la transcripción, regulada o no en Kluyveromyces, con el fin de dirigir, cuando sea deseable, la expresión de dichas proteínas de interés.

Preferentemente, la secuencia de ADN exógeno está incluso en un vector, que puede ser o una replicación autónoma en la levadura considerada o de tipo integrador. Más particularmente, los vectores de replicación autónoma se pueden preparar a partir de secuencias de replicación autónoma en Kluyveromyces y por ejemplo se puede tratar del plásmido pKD1 [Falcone et al., Plasmids 15 (1.986) 248; Chen et al., Nucl. Acids Res. 14 (1.986) 4.471] caracterizado por una alta estabilidad segregacional, especialmente en las diferentes variedades de K. marxianus o del plásmido pKW1 aíslado en K. waltii [Chen et al., J. General Microbiol. 138 (1.992) 337]. Los vectores de replicación autónoma se pueden preparar igualmente a partir de secuencias cromosómicas (ARS). Cuando se trata de vectores de tipo integrador, éstos se pueden preparar a partir de secuencias cromosómicas homólogas en dicha levadura huésped, de manera que se dirija la secuencia genética codificadora de dichas proteínas de interés y un marcador de selección genética, de manera que se oriente la integración del conjunto por recombinación homóloga. En un modo de realización particular dichas secuencias homólogas corresponden a las secuencias genéticas que proceden de la región codificadora de dicha proteasa, lo que permite reemplazar por recombinación homóloga la secuencia original de dicha proteasa por el marcador de selección y la secuencia de ADN exógeno, permitiendo la disrupción génica de dicha proteasa. En otro modo de realización, la casete de expresión está integrada en un locus codificador del ARN ribosomal (rDNA), que permite la amplificación génica de dicha casete de expresión [Bergkamp et al., Curr. Genet. 21 (1.992) 365]. En otro modo más de realización, la secuencia de ADN exógeno está integrada en el cromosoma de dichas levaduras huésped por recombinación no homóloga.

La secuencia de ADN exógeno se puede introducir en la levadura por las técnicas del experto en la materia y por ejemplo las técnicas del ADN recombinante, cruces genéticos, fusión de protoplastos, etc. En un modo de realización particular, la secuencia de ADN exógeno se introduce en las levaduras Kluyveromyces por: transformación, electroporación, conjugación u otra técnica más descrita en la bibliografía. Cuando se trata de la transformación de las levaduras Kluyveromyces, se puede utilizar la técnica descrita por Ito et al. [J. Bacteriol. 153 (1.983) 163]. La técnica de transformación descrita por Durrens et al. [Curr. Genet. 18 (1.990) 7] que utiliza etilenglicol y dimetilsulfóxido es igualmente eficaz. También es posible transformar las levaduras por electroporación, según el método descrito por Karube et al. [FEBS Letters 182 (1.985) 90]. Se describe igualmente un protocolo alternativo en la solicitud de patente europea EP 361991.

Dichas levaduras Kluyveromyces modificadas por su contenido en proteasas por las técnicas descritas anteriormente, se utilizan ventajosamente como células huésped para producir proteínas recombinantes y por ejemplo proteínas heterólogas de interés farmacéutico o agroalimentario. Dichas levaduras huésped son particularmente ventajosas puesto que permiten aumentar la calidad y la cantidad de las proteínas recombinantes que se desea producir y/o secretar y que dichas modificaciones genéticas de dichas células no afectan a la estabilidad genética y mitótica de los vectores de expresión de dichas proteínas recombinantes. Otro objeto de la invención reside pues en un procedimiento de producción de proteínas recombinantes según el que se cultiva una levadura tal como se definió anteriormente en las condiciones de expresión de la o de las proteínas codificadas por la secuencia de ADN exógeno y que se recupera la o las proteínas de interés. En un modo preferido, dichas proteínas de interés se secretan en el medio de cultivo. Como ejemplo se pueden citar las proteínas existentes de manera natural en la naturaleza o las proteínas artificiales y por ejemplo las proteínas híbridas. En este caso, la utilización de células de levaduras con un contenido modificado en proteasas es particularmente ventajoso por el hecho de la exposición de la región bisagra entre los diferentes campos proteicos de la quimera. En un modo de realización particular, dicha proteína artificial comporta un péptido fusionado a uno de los extremos de la quimera y es particularmente sensible, por ejemplo durante el tránsito en el medio secretorio, a una degradación proteolítica por una exoproteasa, N- o C-terminal y por ejemplo una carboxipeptidasa. Se entiende que la degradación proteolítica de la proteína de interés puede resultar igualmente de toda proteasa celular y por ejemplo citoplasmática, liberada en el medio exterior del hecho de una lisis celular no deseada durante el procedimiento de la fermentación de dichas levaduras recombinadas. La alteración genética de la secuencia nucleotídica codificadora de dichas proteasas puede resultar igualmente pues en un procedimiento particularmente ventajoso para producir dichas proteínas de interés y se reivindica igualmente.

Preferentemente, el procedimiento según la invención permite la producción de proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario. Como ejemplo, se pueden citar las enzimas (tales como especialmente: superóxido dismutasa, catalasa, amilasas, lipasas, amidasas, quimosina, etc, o todo fragmento o derivado de las mismas), derivados sanguíneos (tales como seroalbúmina, alfa o betaglobina, factores de la coagulación y por ejemplo el factor VIII, factor IX, factor de von Willebrand, fibronectina, alfa-1 antitripsina, etc, o todo fragmento o derivado de los mismos), insulina y sus variantes, linfocinas [tales como: interleucinas, interferones, factores de estimulación de colonias (G-CSF, GM-CSF, M-CSF etc...), TNF, etc, o todo fragmento o derivado de los mismos], factores de crecimiento (tales como la hormona de crecimiento, eritropoyetina,FGF, EGF, PDGF, TGF, etc, o todo fragmento o derivado de los mismos), apolipoproteínas y sus variantes moleculares, polipéptidos antigénicos para la realización de vacunas (hepatitis, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus del herpes, etc) y fusiones de polipéptidos tales como especialmente las fusiones que comportan una parte biológicamente activa fusionada a una parte estabilizadora.

Otro objeto de la presente invención consiste en un fragmento de ADN de Kluyveromyces que codifica una proteasa. La solicitante ha puesto en efecto de manifiesto, ha aíslado y caracterizado algunas proteasas de Kluyveromyces y especialmente las proteasas que transitan por el medio secretorio. Más preferentemente, uno de los objetos de la invención se refiere a una proteasa de Kluyveromyces elegida especialmente entre las proteasas A, B, la carboxipeptidasa Y, así como la familia de las serina proteasas de tipo subtilisina y cuyo representante es la proteasa KEX1 de K. lactis [Wésolowski-Louvel et al., Yeast 4 (1.988) 71]. Como ejemplo, se han determinado las secuencias nucleotídicas de los genes de K. lactis que codifican las proteasas A, B y la carboxipeptidasa Y, por la solicitante y se presentan en las SEC ID nº 3, 1 y 2, respectivamente. Un mapa de restricción de un fragmento cromosómico codificador de la proteasa A de K. lactis se indica igualmente en la Figura 10. Se entiende que toda variante genética de estos genes de proteasas y su utilización ventajosa para producir las proteínas de interés, forman parte igualmente de la invención. Dichas variaciones pueden ser de origen natural pero también se pueden obtener in situ o in vitro por las técnicas de ingeniería genética o después de tratamiento de las células por un agente mutágeno e incluyen especialmente mutaciones puntuales o múltiples, deleciones, adiciones, inserciones, proteasas híbridas, etc. En un modo de realización aún más particular, en las variaciones genéticas pueden igualmente interesar las regiones de control de la expresión de dichas proteasas, por ejemplo con vistas a alterar sus niveles de expresión o su modo de regulación.

La invención tiene igualmente por objeto toda proteína que resulte de la expresión de un fragmento de ADN exógeno tal como se definió anteriormente.

La invención tiene por objeto igualmente un procedimiento de preparación de una levadura Kluyveromyces genéticamente modificada y su utilización ventajosa para producir las proteínas de interés. Preferentemente, el procedimiento de la invención consiste en reemplazar el gen o los genes cromosómicos considerados por una versión modificada in vitro.

La presente invención se describirá más completamente con ayuda de los ejemplos que siguen, que se deben considerar como ilustrativos y no limitantes.

Leyenda de las figuras

Las representaciones de los plásmidos indicadas en las Figuras siguientes se trazan en una escala aproximada y sólo se indican los sitios de restricción importantes para la comprensión de las clonaciones realizadas.

Figura 1: Mapa de restricción del inserto genómico del plásmido pFP8. Se indica la posición de los sitios de corte de las endonucleasas siguientes: B=BamHI; G=BglII; C=ClaI; E=EcoRI; H=HindIII; K=KpnI; N=NcoI; P=PstI; Pv=PvuII; T=SstI; X=XhoI. Se representa el fragmento obtenido después de amplificación PCR así como el ARNm del gen PRB1 de S. cerevisiae.

Figura 2: Hibridación de la sonda PRB1 de S. cerevisiae con los fragmentos de restricción del ADN genómico de K. lactis. Cuadro superior: foto de gel de agarosa (1%) teñido con bromuro de etidio y antes de la transferencia por el filtro de nailon; cuadro inferior: representación esquemática de las señales obtenidas después de hibridación del filtro con la sonda radiactiva. La numeración corresponde a las siguientes digestiones: 1=EcoRI; 2=BglII; 3=BglII+EcoRI; 4=HindIII; 5=HindIII+EcoRI; 6=PstI; 7=PstI+EcoRI; 8=SalI; 9=SalI+EcoRI; 10=BamHI; 11=BamHI+EcoRI.

Figura 3: Hibridación de la sonda PRB1 de S. cerevisiae con las 34 minipreparaciones de ADN (mezcla de 10 clones cada una) después de restricción doble por las enzimas EcoRI y BglII. Cuadro A: foto de gel de agarosa (1%) teñido con bromuro de etidio y antes de la transferencia por el filtro de nailon; cuadro B: autoradiografía del filtro de nailon después de hibridación con la sonda PRB1 de S. cerevisiae; se indican las subfracciones "d", "e" y "f" que corresponden a una alíquota de los fragmentos de ADN genómico de K. lactis después de digestión total por EcoRI+BglII y fraccionamiento en tamaño por electroelución.

Figura 4: La hibridación controla los clones positivos 18-3 y 31-I. Cuadro A: Foto después de migración en gel de agarosa al 1% de las digestiones EcoRI+BglII del ADN de los clones 31-I (pozo nº 1), 18-3 (pozo nº 2) y 31-K (testigo negativo, pozo nº 3). Cuadro B: Autoradiografía del filtro de nailon que corresponde al gel precedente después de hibridación con la sonda PRB1 de S. cerevisiae. P corresponde a la localización del plásmido (pYG1224) no digerido; se indica la posición del fragmento de restricción BglII-EcoRI de aproximadamente 0,7 kb que se hibrida con la sonda radiactiva.

Figura 5: Comparación de la secuencia proteica del fragmento BglII-EcoRI de ADN genómico de K. lactis (restos Arg^{308} a Phe^{531} de la secuencia peptídica SEC ID nº 1) con la parte correspondiente del gen PRB1 de S. cerevisiae (restos Arg^{105} a Leu^{328}). Los asteriscos indican los aminoácidos conservados entre las dos secuencias.

Figura 6: Mapas de restricción de los insertos genómicos de los plásmidos: pYG1224, pYG1226 y pYG1227 (cuadro A); pYG1231 (cuadro B); pYG1237, pYG1238, pYG1239, pYG1240, pYG1241 y pYG1242 (cuadro C). Se indica la posición de los sitios de corte de las endonucleasas siguientes: G=BglII; C=ClaI; S=SalI; E=EcoRI; H=HindIII; K=KpnI; P=PstI; V=EcoRV. Cuadro D: localización de la fase codificadora del gen PRB1 de K. lactis; la flecha vertical indica la posición aproximada del extremo N-terminal de la proteína madura. La posición del supuesto codón de iniciación de la traducción y la posición del codón especificando el final de la traducción se indican por un asterisco.

SEC ID nº 1: Secuencia del gen PRB1 de K. lactis. Las flechas negras indican la posición aproximada del final de las regiones "pre" y "pro" de la proteasa B. Se subrayan los sitios de restricción BglII, SalI, EcoRI y HindIII, así como la secuencia que corresponde al oligodesoxinucleótido Sq2101.

Figura 8: Mapa de restricción del inserto del plásmido pC34. La caja corresponde al inserto genómico de K. lactis y la línea corresponde a las secuencias del vector KEp6. La flecha indica la posición del gen PRC1 de K. lactis. La parte detallada comprendida entre los sitios EcoRI y SalI corresponde a la región secuenciada presentada en la Figura 9. Lista de abreviaturas: C=ClaI; H=HindIII; B=BamHI; E=EcoRI; P=PstI; S=SalI; Sp=SphI; Sau=Sau3A.

SEC ID nº 2 : Secuencia nucleotídica del fragmento EcoRI-SalI que incluye el gen PRC1 de K. lactis.

Figura 10: Mapa de restricción del inserto del plásmido pA25/1. La caja corresponde al inserto genómico de K. lactis y la línea corresponde a las secuencias del vector KEp6. La flecha indica la posición aproximada del gen PRA1 tal como se indica por una hibridación en el método de hibridación Southern mediante las sondas 3' y 5' especificadas. Lista de abreviaturas: C=ClaI; H=HindIII; B=BamHI; Sau=Sau3A; S=SalI; P=PstI; G=BglII; Xb=XbaI; Sn=SnaBI; E=EcoRI;

Figura 11: Cuadro A: Mapa de restricción del fragmento de restricción HindIII-EcoRI del plásmido pYG1232. Se indica la posición de los sitios de corte de las endonucleasas siguientes: G=BglII; S=SalI; E=EcoRI; H=HindIII; K=KpnI; X=XhoI. El sitio de clonación HindIII procede del vector y se subraya. Cuadro B: Disrupción del gen PRB1 de K. lactis por el marcador de selección URA3 de S. cerevisiae. Este método de hibridación Southern corresponde al del ADN genómico de K. lactis CBS 294.91 (uraA) después de la transformación por el fragmento BglII-EcoRI del cuadro A y la selección en ausencia de uracilo. Pozos 1 a 3: ADN genómico de tres transformados después de restricción doble BglII + EcoRI; la cepa del pozo 3 es K. lactis Y750; pozo 4: ADN genómico de la cepa CBS 294.91 después de restricción doble BglII + EcoRI. La sonda radiactiva utilizada corresponde al fragmento BglII-EcoRI del plásmido pYG1224 (Fig. 6A).

Figura 12: Mapa de restricción de los insertos de los plásmidos pC34 [vector KEp6; cuadro a)], pYG154 [vector pIC-20R; cuadro b)] y pYG155 [vector pIC-20R; cuadro c)]. Cuadro d): Fragmento utilizado para la disrupción. Los sitios de restricción entre paréntesis han sido destruidos por la enzima Klenow o por la ADN polimerasa de T4, como se indica en el texto. La caja corresponde al inserto genómico de K. lactis y la línea corresponde a las secuencias de los vectores. Lista de abreviaturas: C=ClaI; H=HindIII; B=BamHI; E=EcoRI; P=PstI; S=SalI, Sp=SphI; Sau=Sau3A; Sm=SmaI; N=NcoI.

Figura 13: Mapa de restricción del plásmido pYG105 y estrategia de construcción del plásmido pYG1212. Abreviaturas utilizadas: P, promotor LAC4 de K. lactis; T, terminador transcripcional; IR, secuencias repetidas invertidas del plásmido pKD1; LP, región prepro de la SAH; Ap^{r} y Km^{r} designan respectivamente los genes de resistencia a la ampicilina (E. coli) y al G418 (Kluyveromyces).

Figura 14: Comparación de las capacidades de secreción de una variante truncada de la albúmina humana en las cepas K. lactis CBS 293.91 (pozos 2, 4, 6, 8 y 10) o su mutante de disrupción para el gen de la proteasa B (cepa Y750; pozos 1, 3, 5, 7 y 9), después de transformación por el plásmido pYG1212. Las células transformadas se cultivan en erlenmeyers en presencia de G418 (200 mg/l) durante 2 días (pozos 1, 2, 7 y 8), 4 días (pozos 3, 4, 9 y 10) o 7 días (pozos 5 y 6); los pozos 1 a 6 corresponden a un crecimiento en medio YPD y los pozos 7 a 10 corresponden a un crecimiento en medio YPL. Los sedimentos son equivalentes a 50 ml de sobrenadante de cultivo.

SEC ID nº 3: Secuencia nucleotídica del fragmento ClaI-EcoRI que incluye el gen PRA1 de K. lactis.

Técnicas generales de clonación

Los métodos utilizados clásicamente en biología molecular tales como: extracciones preparativas de ADN plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, purificación de fragmentos de ADN por electroelución, extracciones de proteínas en fenol o en fenol-cloroformo, precipitación de ADN en medio salino por etanol o isopropanol, transformación en Escherichia coli, etc..., son bien conocidos por el experto en la materia y se describen extensamente en la bibliografía [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1.982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1.987].

Las enzimas de restricción han sido suministradas por New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) o Amersham y se utilizan según las recomendaciones de los proveedores.

Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories). Los plásmidos de tipo pIC se han descrito por Marsh et al. [Gene 32 (1.984) 481].

Para las ligaduras, los fragmentos de ADN se separan según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, se extraen en fenol o en una mezcla fenol/cloroformo, se precipitan en etanol después se incuban en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor.

El llenado de los extremos 5' prominentes se realiza por el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I de E. coli (Biolabs), según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia de la ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se realiza por un tratamiento moderado por la nucleasa S1. La exonucleasa Ba131 se utiliza según las recomendaciones del proveedor (Biolabs).

Los oligodesoxinucleótidos se sintetizan químicamente según el método de las fosforamiditas utilizando las agrupaciones protectoras \beta-cianoetilos [Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12 (1.984) 4.539]. Después de la síntesis, las agrupaciones protectoras se eliminan por tratamiento con amoniaco y dos precipitaciones en butanol permiten purificar y concentrar los oligodesoxinucleótidos [Sawadogo y Van Dyke, Nucleic Acids Res. 19 (1.991) 674]. La concentración en ADN se determina por medición de la densidad óptica a 260 nm.

La mutagénesis dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1.985) 8.749] utilizando el estuche distribuido por Amersham.

El fragmento de ADN utilizado para servir de sonda molecular en el ADN genómico de K. lactis se amplifica in vitro por la técnica PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1.985) 1.350; Mullis K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1.987) 335] en el ADN de S. cerevisiae. La amplificación está automatizada (40 ciclos de amplificación) y se realiza en un aparato Perkin Elmer Cetus (secuenciador térmico de ADN) utilizando la Taq polimerasa (aíslada de la arqueobacteria Thermophilus aquaticus) suministrada por la compañía Perkin Elmer. Cada ciclo de amplificación consta de tres etapas:

1)

Una etapa de desnaturalización del ADN a 91ºC;

2)

Una etapa de hibridación de los cebos de oligodesoxinucleótidos en el ADN matriz. La temperatura de hibridación se elige cinco a diez grados por debajo de la temperatura de fusión de los oligodesoxinucleótidos (T_{1/2}). Para los oligodesoxinucleótidos de un tamaño de aproximadamente 20 mer, T_{1/2} = 2x(A+T)+4x(C+G) [Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53 (1.984) 323].

3)

Una etapa de síntesis del ADN complementario por la Taq polimerasa a 72ºC.

La preparación de sondas nucleotídicas radiactivas se hace por incorporación de adCTP radiactivo (fósforo 32) a lo largo de la molécula neosintetizada a partir de 20 ng de ADN utilizando el estuche "Marcado de ADN por Cebado al Azar" comercializado por la firma Boehringer.

Las transferencias de ADN en la membrana de nailon (Biodyne, Pall, St Germain en Laye) o de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel) se realizan según el método desarrollado inicialmente por Southern [J. Mol. Biol. 98 (1.979) 503]. Las condiciones de hibridación y de lavado utilizadas dependen de la naturaleza de la sonda utilizada: en condiciones heterólogas (ADN genómico de K. lactis hibridado con una sonda procedente de S. cerevisiae por ejemplo), la hibridación y los lavados se realizan en condiciones poco estringentes (hibridación durante 15 horas, a 40ºC, sin formamida en SSC 5X /Denhart 5X, el filtro se lava después 3 veces en SSC 5X /SDS al 1% a 40ºC, durante 15 minutos, después 1 vez en SSC 0,25X /SDS al 1%, durante 10 minutos); en condiciones homólogas (ADN genómico de K. lactis hibridado con una sonda procedente de K. lactis por ejemplo), la hibridación y los lavados se realizan en condiciones más estringentes (hibridación durante 15 horas, a 40ºC, en SSC 5X /Denhart 5X /formamida al 50%, el filtro se lava después 3 veces en SSC 5X /SDS al 1%, a 40ºC, durante 15 minutos, después 1 vez en SSC 0,2X /SDS al 1%, durante 10 minutos).

La verificación de las secuencias nucleotídicas se realiza en ADN plasmídico con el estuche "Sequenase version 2.0" de la compañía United States Biochemical Corporation, según el método de Tabor y Richardson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1.987) 4.767]. Esta técnica es una modificación del método inicialmente descrito por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1.977) 5.463].

Los transformados de K. lactis con el ADN de los plásmidos de expresión de las proteínas de la presente invención se realizan por toda técnica conocida por el experto en la materia y de las que se da un ejemplo en el texto.

Salvo indicación de lo contrario, las cepas bacterianas utilizadas son: E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strA^{r}), E. coli TG1 (lac, proA, B, supE, thi, hsdD5 / FtraD36, proA^{+}B^{+}, lacI^{q}, lacZ, M15) o E. coli JM101 [Messing et al., Nucl. Acids Res. 9 (1.981) 309].

Las cepas de levaduras utilizadas pertenecen a las levaduras de gemación y más concretamente a las levaduras del género Kluyveromyces. Las cepas K. lactis MW98.8C (a, uraA, arg, lys, K^{+}, pKD1º), K. lactis CBS 293.91, K. lactis CBS 294.91 (uraA) y K. lactis CBS 2359/152 [a, metA, (k1, k2); Wésolowski et al., Yeast 4 (1.988) 71] se han utilizado particularmente; se ha patentado una muestra de la cepa MW98-8C el 16 de Septiembre de 1.988 en Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) en Baarn (Paises Bajos) donde se ha registrado con el número CBS 579.88.

La preparación de ADN genómico de levadura procede esencialmente de la técnica de Hoffman y Winston [Gene 57 (1.987) 267] y se describe con detalle en el texto.

Las cepas de levaduras transformadas por los plásmidos de expresión que codifican las proteínas de la presente invención se cultivan en erlenmeyers o en fermentadores piloto de 21 (SETRIC, Francia) a 28ºC, en medio rico (YPD: extracto de levadura al 1%, Bactopeptona al 2%, glucosa al 2% o YPL: extracto de levadura al 1%, Bactopeptona al 2%, lactosa al 2%) con agitación constante.

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Ejemplos Ejemplo 1 Clonación del gen de la proteasa B de K. Lactis E.1.1. Realización de una sonda por amplificación enzimática in vitro de una secuencia de ADN

Se realiza una amplificación enzimática por PCR a partir del plásmido pFP8 [Moehle et al., Genetics 115 (1.987) 255; Fig. 1], vector transportador E. coli/S. cerevisiae derivado de YEp13 y que lleva el gen PRB1 de S. cerevisiae y los oligodesoxinucleótidos 5'-TGACACTCAAAATAGCG-3' (se subraya el codón que corresponde al resto Asp^{3}) y 5'-AATATCTCTCACTTGAT-3' (se subraya el codón de la cadena complementaria que corresponde al resto Ile^{348}). La temperatura de hibridación de los oligodesoxinucleótidos es de 45ºC y el volumen de reacción de 100 ml comprende: 10 ng del plásmido pFP8, oligodesoxinucleótidos cebo, 10 ml de tampón PCR 10X [Tris-HCl pH=8,5 (100 mM); MgCl2 (20 mM); KCl (100 mM); gelatina (0,01%)], 10 ml de dNTP (dATP + dCTP + dGTP + dTTP, cada uno en una concentración de 10 mM)] y 2,5 unidades de Taq polimerasa. La adición de una gota de aceite de parafina permite evitar la evaporación durante las elevaciones de temperatura durante los ciclos de amplificación. Se obtiene un fragmento de ADN de 1.039 pares de bases, del que se verifica la identidad por análisis de las posiciones de algunos sitios de restricción y que corresponde a la casi totalidad de la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la proteasa B (Asp^{3} a Ile^{348}). Este fragmento se purifica después por electroelución después de migración en gel de agarosa al 0,8% y se utiliza para preparar la sonda radiactiva según el método de "Cebado al Azar".

E.1.2. Preparación de ADN genómico de levadura

Se centrifugan las levaduras (cepa K. lactis MW98-8C) en fase estacionaria de crecimiento. Después de lavado del residuo en agua estéril, éste se recoge en una disolución que contiene: Tritón X100 al 2% (v/v); SDS al 1% (p/v); NaCl 100 mM; Tris-HCl (pH=8) 10 mM; EDTA 1 mM. Se muelen las levaduras entonces en presencia de fenol-cloroformo por la acción mecánica de bolas de vidrio añadidas a la mezcla que se agita con vórtice durante 2 minutos. La fase acuosa se recupera a continuación después de centrifugación y se precipita por adición de 2,5 volúmenes de etanol. El ADN se recoge en TE para experimentar una purificación en un gradiente de cesio. A partir de 1 litro de cultivo se obtiene aproximadamente 1 mg de ADN genómico de alto peso molecular (>> 20 kb).

E.1.3. Investigación del gen por hibridación en condiciones de estringencia débil

La preparación de ADN genómico se somete a una digestión total por las enzimas de restricción de las que están presentes los sitios en el sitio múltiple de clonación del vector pIC-20H. Un resultado preliminar muestra que sólo las condiciones poco estringentes (hibridación durante 15 horas a 40ºC, sin formamida en SSC 5X /Denhart 5X, después de 3 lavados en SSC 5X /SDS al 1%, a 40ºC, durante 15 minutos, después de 1 lavado en SSC 0,25X /SDS al 1%, durante 10 minutos) permiten visualizar un fragmento EcoRI de 1,8 kb que se hibrida con la sonda PRB1 de S. cerevisiae. Se realiza un segundo método de hibridación Southern, en el que cada pozo consta de 12 mg de ADN genómico dividido durante 15 horas por 20 unidades de EcoRI y 20 unidades de una segunda enzima de restricción (Fig. 2). En las condiciones de hibridación y de lavado anteriormente definidas, un fragmento genómico de aproximadamente 700 pb y procedente de la doble digestión EcoRI+BglII se hibrida con la sonda PRB1 de S. cerevisiae (Fig. 2, pozo nº 3). Del mismo modo, un fragmento de restricción BglII de mayor tamaño (aproximadamente 1,3 kb) se hibrida con esta sonda (Fig. 2, pozo nº 2). El fragmento de aproximadamente 700 pb detectado después de digestión del ADN genómico por EcoRI + BglII es pues un fragmento de restricción BglII-EcoRI. Las otras restricciones parecen menos interesantes ya que generan o fragmentos de menor tamaño que el del obtenido por la doble digestión EcoRI + BglII o un fragmento de idéntico tamaño (1,8 kb) al del generado después de digestión por EcoRI únicamente (Fig. 2, pozo nº 1).

La clonación de este fragmento asimétrico BglII-EcoRI de 700 pb permite obtener una fracción del gen PRB1 de K. lactis que podrá servir a continuación de sonda homóloga para clonar la o las partes marcadoras del gen. Para clonar este fragmento, se tratan 100 mg de ADN genómico durante 15 horas por 100 unidades de endonucleasas EcoRI y BglII, después se hacen migrar en gel de agarosa preparativa (1%). La fracción del gel que comprende los fragmentos en los que el tamaño está comprendido entre 500 y 1.000 pb se corta a continuación en tres subfracciones (subfracción "f": 500/700 pb; subfracción "e": 700/800 pb; subfracción "d": 800/1.000 pb; Fig. 3). Un método de hibridación Southern realizado después de migración de una alíquota de estas subfracciones e hibridación con la sonda PRB1 de S. cerevisiae muestra una señal de hibridación del tamaño esperado (700 pb) y particularmente intensa con la subfracción "e" (700/800 pb). Un banco genómico limitado a los fragmentos BglII-EcoRI de esta subfracción (minibanco genómico) está pues construido por clonación de los fragmentos de restricción BglII-EcoRI en los sitios que corresponden al vector pIC-20H. La transformación de la ligación en E. coli da 90% de clones blancos en cajas LB enriquecidos en ampicilina y X-gal. 340 clones (de los que aproximadamente 30 clones son azules) son trasplantados entonces en el mismo medio para aíslarlos. Los 340 clones del banco limitado se reparten a continuación en 34 mezclas que corresponden cada una a 10 clones diferentes y su ADN es digerido por EcoRI+BglII, migran en gel de agarosa, se transfieren en membrana para hibridarse a continuación con la sonda PRB1 de S. cerevisiae en condiciones poco estringentes de hibridación y de lavado. La Figura 3 muestra este método de hibridación Southern donde dos mezclas (nº 18 y nº 31) presentan una señal de hibridación del tamaño esperado (aproximadamente 700 pb). Se hace la misma operación para analizar separadamente los 10 clones de las mezclas nº 18 y nº 31: el clon nº 3 es el único clon de la mezcla nº 18 que presenta una señal de hibridación del tamaño esperado (clon 18-3); de manera análoga, sólo el clon I de la mezcla 31 (clon 31-I) da una señal de hibridación del tamaño esperado. Un último método de hibridación Southern se realiza a partir del ADN de los clones 18-3 y 31-I (señal positiva) y de un clon negativo (clon K de la mezcla nº 31). En las condiciones de hibridación y de lavado definidas anteriormente, sólo los clones 18-3 y 31-I confirman la presencia de una señal positiva después de digestión doble EcoRI+BglII y en la que el tamaño parece taxativamente equivalente (Fig. 4).

E.1.4. Identificación del gen

La secuencia nucleotídica del fragmento BglII-EcoRI del clon 18-3 se realiza para demostrar que este fragmento corresponde bien a una fracción del gen PRB1 de K. lactis.

Se realiza en primer lugar un mapa de restricción sumario del plásmido pYG1224 del clon 18-3 y revela la presencia de un sitio SalI al parecer único en el centro del fragmento BglII-EcoRI. Los fragmentos BglII-SalI (aproximadamente 350 pb) y SalI-EcoRI (aproximadamente 300 pb) del plásmido pYG1224 se clonan entonces en el vector pUC19, lo que genera los plásmidos pYG1226 y pYG1227, respectivamente (Fig. 6A). Los insertos de estos plásmidos se secuencian entonces en su totalidad utilizando los "cebos universales". Como se indica en la Figura 5, el fragmento BglII-EcoRI del plásmido pYG1224 consta de una fase abierta de lectura (225 restos) que presenta homologías de secuencias con un fragmento del gen PRB1 de S. cerevisiae (Arg^{105} a Leu^{328}). La presencia de dicha homología, del mismo modo que la estricta conservación de los aminoácidos encontrados invariablemente en las serina -proteasas de la familia de las subtilisinas demuestran que el fragmento de ADN genómico producido por el plásmido pYG1224 corresponde bien a un fragmento del gen PRB1 de K. lactis.

E.1.5. Clonación de la parte 3' del gen

El fragmento BglII-EcoRI del plásmido pYG1224 consta de un sitio de restricción KpnI único localizado más abajo del sitio BglII (Fig. 6A). El subfragmento de restricción KpnI-EcoRI de aproximadamente 665 nucleótidos se genera pues a partir de este fragmento, se aísla por electroelución después de migración en gel de agarosa al 1% y se marca radiactivamente por el método de "cebado al azar". Esta sonda radiactiva se utiliza entonces para determinar el tamaño de los fragmentos de restricción del ADN genómico de K. lactis que lo incluyen. Un fragmento KpnI-BglII de aproximadamente 1,2 kb se detecta así después de hibridación y lavado en condiciones estringentes (hibridación durante 15 horas, a 40ºC, en SSC 5X /Denhart 5X /formamida al 50%, después de 3 lavados en SSC 5X /SDS al 1%, a 40ºC, durante 15 minutos, después de 1 lavado en SSC 0,2X /SDS al 1%, durante 10 minutos). Se construye entonces un banco limitado de ADN genómico de K. lactis (fragmentos de restricción KpnI-BglII de tamaño comprendido entre 1 y 1,5 kb) según el ejemplo E.1.3. y el fragmento de restricción que se hibrida con la sonda se clona entre los sitios KpnI y BamHI del vector pIC-20H, lo que genera el plásmido pYG1231 (Fig. 6B). El inserto genómico de este plásmido se secuencia a continuación utilizando el oligodesoxinucleótido Sq2101 (5'-GACCTATGGGGTAAGG-ATTAC-3') como cebo. Este oligodesoxinucleótido corresponde a una secuencia nucleotídica presente en el fragmento BglII-EcoRI del plásmido pYG1224 y localizado a aproximadamente 30 nucleótidos del sitio EcoRI. Permite pues determinar la secuencia nucleotídica situada en 3' de este sitio de restricción y especialmente la secuencia localizada entre el sitio EcoRI y el codón que especifica la terminación de la traducción del ARN mensajero que corresponde al gen PRB1 de K. lactis.

E.1.6. Clonación de la parte 5' del gen

La secuencia nucleotídica realizada en E.1.5. demuestra la existencia de un sitio de restricción HindIII localizado entre el sitio EcoRI y el codón de final de traducción. La utilización del fragmento de restricción KpnI-EcoRI que corresponde a la parte C-terminal del gen PRB1 de K. lactis como sonda radiactiva en el ADN genómico de K. lactis digerido por HindIII y una segunda enzima permite identificar por el método de hibridación Southern un fragmento HindIII-EcoRV de 1,7 kb aproximadamente que se hibrida con esta sonda. Este fragmento de restricción se clona en primer lugar entre los sitios EcoRV y HindIII del vector pIC-20R lo que genera el plásmido pYG1237. Se realiza un mapa de restricción del inserto de ADN genómico contenido en el plásmido pYG1237 (Fig. 6C) y se generan los siguientes plásmidos: pYG1238 (plásmido pYG1237 suprimido su fragmento PstI), pYG1239 (fragmento PstI de pYG1237 en el vector pUC19), pYG1240 (plásmido pYG1237 suprimido su fragmento KpnI), pYG1241 (plásmido pYG1237 suprimido su fragmento ClaI) y pYG1242 (plásmido pYG1237 suprimido su fragmento SalI; Fig. 6C). Los insertos genómicos de estos diferentes plásmidos se secuencian entonces con la ayuda de cebos universales y del oligodesoxinucleótido Sq2148 (5'-GCTTCGGCAACATATTCG-3') que permite secuenciar la región situada inmediatamente en 5' del sitio BglII. Esta estrategia permite obtener las secuencias superpuestas que demuestran la unicidad de los sitios de restricción BglII, ClaI y PstI y que permiten identificar el ATG probable de iniciación de la traducción del gen PRB1 de K. lactis.

E.1.7. Secuencia nucleotídica del gen PRB1 de K. lactis

La compilación de las secuencias determinadas en E.1.4., E.1.5. y E.1.6. cubre la totalidad de la fase codificadora del gen PRB1 de K. lactis (Fig. 6D). Esta secuencia se da en SEC ID nº 1 y codifica una proteína de 561 restos que corresponde a la proteasa B de K. lactis.

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Ejemplo 2 Clonación del gen de la carboxipeptidasa y de K. Lactis

Se repite la estrategia general descrita en el ejemplo 1 para la clonación del gen de la carboxipeptidasa Y de K. lactis CBS 2359/152.

E.2.1. Preparación de la sonda

Se realiza en primer lugar una preparación de ADN genómico de la cepa S. cerevisiae S288C [Mortimer y Johnston, Genetics 113 (1.986) 35] según el ejemplo E.1.2. Se realiza a continuación una amplificación por PCR de esta preparación de ADN genómico con los oligonucleótidos 5'-CTTCTTGGAGTTGTTCTTCG-3' y 5'-TGGCAAGA
CATCCGTCCACGCCTTATT-ACC-3' especificados del gen PRC1. Se obtiene así un fragmento amplificado del tamaño esperado (699 pb) que corresponde a las posiciones 696-1.395 (estando numerado el codón de iniciación ATG +1) de la fase abierta de lectura del gen PRC1 de S. cerevisiae [Valls et al., Cell 48 (1.987) 887]. Este fragmento se purifica a continuación por electroelución y es radiomarcado según la técnica de "Cebado al Azar".

E.2.2. Clonación del gen PRC1 de K. lactis

El gen PRC1 de K. lactis se obtiene por cribado del banco genómico de K. lactis construido por Wésolowski-Louvel [Yeast 4 (1.988) 71] a partir de la cepa 2.359/152 en el vector de clonación KEp6 [Chen et al., J. Basic. Microbiol. 28 (1.988) 211]. La cepa E. coli JM101 se transforma por el ADN del banco y los transformados son escalonados en medio LB enriquecido con ampicilina (50 mg/l). Se transfieren a continuación 15.000 clones sobre filtros de nitrocelulosa y se hibridan los filtros con la sonda descrita en el ejemplo E.2.1. Las condiciones de hibridación y de lavado son las del ejemplo E.1.3. Se aíslan así 12 clones positivos y uno de ellos, denominado pC34, es retenido después para la continuación del estudio. En un primer momento, se confirma la hibridación del plásmido pC34 con la sonda que corresponde al gen PRC1 de S. cerevisiae en el método de hibridación Southern. Se da un mapa de restricción del inserto genómico (aproximadamente 6,9 kb) del plásmido pC34 en la Figura 8. La secuencia del fragmento EcoRI-SalI de 2,5 kb que comprende el gen PRC1 de K. lactis se determina a continuación en las 2 cadenas. Esta secuencia se presenta en la SEC ID nº 2.

Ejemplo 3 Clonación del gen de la proteasa a de K. lactis

Se repite la estrategia general descrita en los ejemplos precedentes para la clonación del gen de la proteasa A de K. lactis CBS 2359/152.

E.3.1. Preparación de la sonda

Un fragmento interno de 449 pb del gen PRA1 (o gen PEP4) de S. cerevisiae se amplifica en primer lugar por la técnica PCR a partir del plásmido CBZ1B1 [Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1.986) 2.500] suministrado por el Dr E. Jones (Carnegie-Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA) y los oligodesoxinucleótidos 5'-CTGTT
GATAAGGTGGTCC-3' y 5'-CAAGCGTGTAATCGTATGGC-3'. El fragmento amplificado obtenido corresponde a las posiciones 617-1.066 de la fase abierta de lectura del gen PRA1 de S. cerevisiae, estando numerado el codón de iniciación ATG +1. Este fragmento se purifica a continuación por electroelución y es radiomarcado según la técnica de "Cebado al Azar".

E.3.2. Clonación del gen PRA1 de K. lactis

El gen PRA1 se obtiene por cribado del banco genómico de K. lactis construido por Wésolowski-Louvel [Yeast 4 (1.988) 71] a partir de la cepa 2359/152 en el vector de clonación KEp6 [Chen et al., J. Basic Microbiol. 28 (1.988) 211]. Después de la transformación del banco en E. coli JM101 y selección en presencia de ampicilina (50 mg/l), se transfieren a continuación 15.000 clones en filtros de nitrocelulosa y los filtros se hibridan con la sonda descrita en el ejemplo E.3.1. Las condiciones de hibridación y de lavado son las del ejemplo E.1.3. Se aísla así 1 solo clon positivo y se denomina pA25/1. En un primer momento, se confirma la hibridación del plásmido pA25/1 con la sonda que corresponde al gen PRA1 de S. cerevisiae en el método de hibridación Southern. Se presenta un mapa de restricción del inserto genómico (aproximadamente 7,5 kb) de este plásmido en la Figura 10. La secuencia del fragmento ClaI-EcoRI de 1,6 kb que comprende el gen PRA1 de K. lactis se determina a continuación en las 2 cadenas. Esta secuencia se presenta en la SEC ID nº 3.

Ejemplo 4 Transformación de las levaduras

La transformación de las levaduras pertenecientes al género Kluyveromyces y en particular las cepas K. lactis MW98-8C, CBS 293.91 y CBS 294.91 (uraA) se realiza por ejemplo por la técnica de tratamiento de las células enteras con acetato de litio [Ito H. et al., J. Bacteriol. 153 (1.983) 163-168], adaptado como sigue. El crecimiento de las células se hace a 28ºC en 50 ml de medio YPD, con agitación y hasta una densidad óptica a 600 nm (DO_{600}) comprendida entre 0,6 y 0,8; se recogen las células entonces por centrifugación a velocidad débil, se lavan en una disolución estéril de TE (Tris 10 mM HCl pH 7,4; EDTA 1 mM), se resuspenden en 3-4 ml de acetato de litio (0,1 M en TE) para obtener una densidad celular de aproximadamente 2 x 10^{8} células/ml, después se incuban a 30ºC, durante 1 hora, con agitación moderada. Se incuban alíquotas de 0,1 ml de la suspensión resultante de células competentes, a 30ºC, durante 1 hora, en presencia de ADN y en una concentración final de 35% de polietilenglicol (PEG_{4000}, Sigma). Después de un choque térmico de 5 minutos a 42ºC, se lavan las células 2 veces, después se resuspenden en 0,2 ml de agua estéril. En el caso en que el marcador de selección es el gen URA3 de S. cerevisiae, las células se escalonan directamente en YNB (Base Nitrogenada de Levadura, por sus siglas en inglés; Difco)/Glucosa (20 g/l)/agar. En el caso en que el marcador de selección es el gen aph del transposón Tn903, las células se incuban en primer lugar durante 16 horas, a 28ºC, en 2 ml de medio YPD para permitir la expresión fenotípica del gen de resistencia al G418 expresado bajo el control del promotor P_{k1} (cf. patente europea EP 361 991); se adicionan escalonadamente a continuación 200 \mul de la suspensión celular en cajas YPD selectivas (G418, 200 \mug/ml). Las cajas se ponen para incubación a 28ºC y los disruptores o los transformados aparecen después de 2 a 3 días de crecimiento celular.

Ejemplo 5 Disrupción de genes de proteasas en K. lactis E.5.1. Cepas de K. lactis disruptas por el gen PRB1

El plásmido pYG1229 se construye por clonación del fragmento HindIII-EcoRI (incluyendo el fragmento BglII-EcoRI de aproximadamente 700 bp y que corresponde a la parte C-terminal del gen PRB1 de K, lactis) del plásmido pYG1224 entre los sitios que corresponden al plásmido pUC9. El plásmido pYG1228 se construye por clonación del fragmento HindIII de 1,1 kb y que corresponde al gen URA3 de S. cerevisiae procedente del plásmido pCG3 [Gerbaud et al., Curr. Genetics 3 (1.981) 173] en el sitio HindIII del plásmido pIC-20R. El plásmido pYG1228 permite pues disponer de un fragmento de restricción SalI-XhoI de aproximadamente 1,1 kb y que contiene la totalidad del fragmento HindIII que contiene el gen URA3 de S. cerevisiae. Este fragmento de restricción se clona a continuación en el sitio SalI del plásmido pYG1229 lo que genera el plásmido pYG1232 (2 orientaciones posibles). La digestión de este plásmido por las enzimas BglII y EcoRI permite generar un fragmento de restricción de aproximadamente 1,8 kb que corresponde al gen URA3 de S. cerevisiae bordeado por las secuencias genómicas de K. lactis procedentes del gen PRB1 (Fig. 11A). La transformación de mutantes uraA de K. lactis por el fragmento BglII-EcoRI del plásmido pYG1232 genera los clones transformados (complementados por el gen URA3 de S. cerevisiae) que corresponde a la integración de este fragmento en el cromosoma. El cuadro B de la Figura 11 muestra la integración de este fragmento en el ADN genómico de la cepa K. lactis CBS 294.91 (uraA) después de recombinación no homóloga (pozo 1) o después de recombinación homóloga en el gen PRB1 (pozo 3, esta disrupción se indica Y750). La disrupción del alelo salvaje del gen PRB1 no modifica las características de crecimiento de la cepa.

E.5.2. Cepas de K. lactis disruptas para el gen PRC1

El fragmento SalI-SphI de 4,4 kb procedente del plásmido pC34 se subclona en primer lugar en los sitios que corresponden al vector pIC-20R, lo que genera el plásmido pYG154 (Fig. 12, cuadro b). Este plásmido se digiere a continuación por la enzima SphI, después se trata con la ADN polimerasa I del fago T4 en presencia de fosfatasa intestinal de ternero (CIP). El plásmido obtenido se liga a continuación con el fragmento EcoRI de 1,6 kb que lleva el gen URA3 de S. cerevisiae procedente del plásmido pKan707 (patente europea EP 361 991), tratado previamente con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. El plásmido obtenido se denomina pYG155 (Fig. 12, cuadro c). El fragmento SalI-BamHI de 4,5 kb del plásmido pYG155 se purifica a continuación por electroelución y se utiliza para transformar la cepa K. lactis CBS 294.91 (uraA). Los transformados se seleccionan para el fenotipo Ura^{+} y se analizan algunos clones a continuación en el método de hibridación Southern para verificar el lugar de integración del marcador URA3. Se identifica así el clon Y797 en el cual el gen PRC1 cromosómico se ha reemplazado por recombinación homóloga, por el alelo disrupto construido in vitro. La disrupción del alelo salvaje del gen PRC1 no modifica las características de crecimiento de la cepa.

Ejemplo 6 Plásmidos de expresión E.6.1. Plásmido pYG1212

Los genes de las proteínas de interés que se desea secretar y/o expresar se insertan en primer lugar, "en la orientación productiva" (definida como la orientación que pone la región N-terminal de la proteína de manera proximal con respecto al promotor de transcripción), bajo control de promotores funcionales, regulables o constitutivos tales como, por ejemplo, los presentes en los plásmidos pYG105 (promotor LAC4 de K, lactis), pYG106 (promotor PGK de S. cerevisiae), pYG536 (promotor PHO5 de S. cerevisiae) o los promotores híbridos tales como los descritos en la solicitud de patente europea EP 361 991. Los plásmidos pYG105 y pYG106 son particularmente útiles ya que permiten la expresión de genes incluso en los fragmentos de restricción HindIII a partir de promotores funcionales en K. lactis, regulables (pYG105) o constitutivos (pYG106).

El plásmido pYG105 corresponde al plásmido pKan707 descrito en la solicitud de patente europea EP 361 991 en la que el sitio de restricción HindIII único y localizado en el gen de resistencia a la geneticina (G418) se ha destruido por mutagénesis dirigida toda conservando una proteína igual (oligodesoxinucleótido 5'-GAAATGCATAAGCTCTTGC
CATTCTCACCG-3'). El fragmento SalI-SacI que codifica el gen URA3 del plásmido así mutado se ha reemplazado a continuación por un fragmento de restricción SalI-SacI que consta de una casete de expresión constituida de promotor LAC4 de K. lactis [en forma de fragmento SalI-HindIII procedente del plásmido pYG107; Fleer et al., Bio/Technology 9 (1.991) 968]) y del terminador del gen PGK de S. cerevisiae [en forma de fragmento HindIII-SacI; Fleer et al., Bio/Technology 9 (1.991) 968]. El plásmido pYG105 es mitóticamente muy estable en las levaduras Kluyveromyces y se da un mapa de restricción en la Figura 13. Los plásmidos pYG105 y pYG106 no difieren entre sí más que por la naturaleza del promotor de transcripción codificado por el fragmento SalI-HindIII.

La proteína codificada por el plásmido pYG1212 corresponde aproximadamente a los dos primeros campos de la seroalbúmina humana (SAH). Esta variante molecular, obtenida por digestión del extremo C-terminal de la SAH utilizando la exonucleasa Ba131 a partir del sitio MstII único localizado en 3 aminoácidos del extremo C-terminal de la SAH, es derivado del plásmido YP40 descrito en la solicitud de patente europea EP 413 622. Brevemente, el fragmento de restricción HindIII-MstII del plásmido YP40, que corresponde a los restos 1 a 403 de la SAH (se indica el ATG de iniciación de la traducción +1), se liga con el fragmento MstII-HindIII del plásmido pYG221 [Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1.992) 1.904], lo que genera un fragmento HindIII que incluye los 403 restos N-terminales de la SAH seguido de los tres últimos restos de la SAH (resto Leu-Gly-Leu) y de un codón de final de traducción [variante troncada indicada SAH_{(1-403)}]. Este fragmento-HindIII se clona a continuación en la orientación productora en el plásmido pYG105, lo que genera el plásmido pYG1212 (Fig.13).

Ejemplo 7 Potencial de secreción de los disruptores E.7.1. SAH_{(1-403)} en un disruptor para la proteasa B

En un primer momento, las levaduras K. lactis CBS 293.91 e Y750 se transforman por el plásmido pYG1212. Después de selección en medio rico enriquecido en G418 se ensaya en los clones recombinantes su capacidad para secretar la proteína SAH_{(1-403)}. Se ponen a incubar algunos clones en medio YPD o YPL, a 28ºC. Se recuperan los sobrenadantes de cultivo por centrifugación cuando las células alcanzan la fase estacionaria de crecimiento, se concentran 10 veces por precipitación durante 30 minutos, a -20ºC, con una concentración final de 60% de etanol, después se ensaya después de electroforesis en gel SDS-PAGE al 8,5% y coloración del gel por azul de coomassie. Los resultados presentados en la Figura 14 demuestran que el disruptor Y750 (prb1º) secreta cantidades de la proteína que son bien superiores a las cantidades secretadas por su homólogo no disruptado. Esto es válido después de 2, 4 ó 7 días de crecimiento, independientemente de la fuente de carbono utilizada (glucosa o lactosa).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.

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(B)

CALLE: 20, avenue Raymond ARON

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(C)

CIUDAD: ANTONY

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(E)

PAÍS: FRANCIA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 92165

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Levaduras Kluyveromyces modificadas, preparación y utilizaciones.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1.686 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

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(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi)

ORIGEN:

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(B)

CEPA: Kluyveromyces lactis

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(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

POSICIÓN: 1..1686

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(D)

OTROS DATOS: /producto= "Gen de la proteasa B" /gen= "K1.PRB1"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

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1

2

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2.503 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

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(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi)

ORIGEN:

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(B)

CEPA: Kluyveromyces lactis

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(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

POSICIÓN: 387..1862

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(D)

OTROS DATOS: /producto= "Gen de la proteasa C de K. lactis" /gen= "Kl.PRC1"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

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5

6

7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1.615 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi)

ORIGEN:

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(B)

CEPA: Kluyveromyces

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(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

POSICIÓN: 188..1417

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(D)

OTROS DATOS: /producto= "Gen de la proteasa A" /gen= "PRA1"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

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9

10

11

Claims (21)

1. Levadura del género Kluyveromyces que presenta una o varias modificaciones genéticas de al menos un gen codificador de una proteasa elegida entre: la proteasa A representada por la secuencia polipeptídica SEC ID Nº3, la proteasa B representada por la secuencia polipeptídica SEC ID Nº1 y la carboxipeptidasa Y, representada por la secuencia SEC ID Nº2, disminuyendo dichas modificaciones genéticas la actividad proteolítica de dichas levaduras.

2. Levadura según la reivindicación 1, caracterizada porque la o las modificaciones genéticas hacen que dicho gen sea parcial o totalmente incapaz de codificar la proteína natural.

3. Levadura según la reivindicación 1, caracterizada porque el o los genes así modificados genéticamente codifican una proteína no funcional o un mutante teniendo un espectro de actividad proteolítica modificada.

4. Levadura según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la o las modificaciones genéticas son segregacionalmente estables.

5. Levadura según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la o las modificaciones genéticas son no reversibles.

6. Levadura según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la o las modificaciones no dejan ninguna actividad residual al gen considerado.

7. Levadura según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la o las modificaciones se producen en la parte codificadora de la proteína que tiene una actividad de proteasa y/o en las regiones responsables de la expresión y/o de la regulación transcripcional de dichos genes.

8. Levadura según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la o las modificaciones genéticas son de mutaciones puntuales o múltiples y/o adiciones y/o deleciones y/o disrupciones.

9. Levadura según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque se trata de un gen de Kluyveromyces elegido entre los genes: PRB1 (SEC ID Nº1), PRC1 (SEC ID Nº2) y PRA1 (SEC ID Nº3).

10. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque se elige entre las levaduras pertenecientes a las especies: K. lactis, K. fragilis, K. drosophilarum y K. waltii.

11. Levadura del género Kluyveromyces caracterizada porque presenta una o varias modificaciones genéticas de al menos un gen codificador de una proteasa elegida entre: la proteasa A representada por la secuencia polipeptídica SEC ID Nº3, la proteasa B representada por la secuencia polipeptídica SEC ID Nº1 y la carboxipeptidasa Y, representada por la secuencia SEC ID Nº2, disminuyendo dichas modificaciones genéticas la actividad proteolítica de dichas levaduras y en que comprende más de una secuencia de ADN exógeno que codifica al menos una proteína de interés.

12. Levadura según la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia de ADN exógeno comprende una región de arranque de la transcripción y de la traducción unida al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína de interés.

13. Levadura según una las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada porque la secuencia que codifica la proteína de interés incluye una secuencia de exportación que dirige la proteína en el medio secretorio.

14. Levadura según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque la secuencia de ADN exógeno forma parte de un vector de replicación autónomo o está integrada en el cromosoma.

15. Levadura según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque la o las proteínas de interés son de uso farmacéutico o agroalimentario.

16. Levadura según la reivindicación 15, caracterizada porque la o las proteínas son proteínas artificiales y por ejemplo híbridas.

17. Utilización de una levadura según una de las reivindicaciones 1 a 16 para la producción de proteínas recombinantes.

18. Procedimiento de producción de proteínas recombinantes caracterizado porque se cultiva una levadura según una de las reivindicaciones 11 a 16 en las condiciones de expresión de la o de las proteínas codificadas por la secuencia de ADN exógeno y que se recupera la o las proteínas de interés.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, para la producción de proteínas de interés farmacéutico o agroalimentario.

20. Procedimiento según la reivindicación 19 para la producción de proteínas artificiales y especialmente híbridas.

21. Procedimiento de preparación de una levadura Kluyveromyces según la reivindicación 1, caracterizado porque se reemplazan todos o parte de los genes cromosómicos: PRB1 (SEC ID Nº1), PRC1 (SEC ID Nº2) o PRA1 (SEC ID Nº3) por una versión modificada in vitro.