PT672150E - Leveduras kluyveromyces modificadas, preparação e utilização. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "LEVEDURAS KLUYVEROMYCES MODIFICADAS, PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO" A presente invenção refere-se a novas leveduras geneticamente modificadas pertencentes ao género Kluyveromyces e a sua utilização para produzir vantajosamente proteínas recombinantes.

Os progressos realizados no domínio da biologia molecular permitiram modificar microrganismos para os fazer produzir proteínas de interesse e, por exemplo, proteínas heterólogas (proteínas de mamíferos, proteínas artificiais, proteínas quiméricas, etc.). Em particular, foram realizados numerosos estudos genéticos na bactéria Escherichia coli e na levedura Saccharomyces cerevisiae. Mais recentemente, as ferramentas genéticas foram desenvolvidas de forma a utilizarem a levedura Kluyveromyces como célula hospedeira para a produção de proteínas recombinantes. A descoberta do plasmídeo pKDl originário de K. drosophilarum (documento EP 241435) permitiu desenvolver um sistema hospedeiro vector, particularmente, vantajoso para a secreção de proteínas recombinantes (documentos EP 361991, EP 413622).

Contudo, a aplicação deste sistema de produção está ainda limitada, em particular pelos problemas de eficácia de expressão de genes nestes microrganismos recombinantes, pelos problemas de estabilidade dos plasmídeos e igualmente pelos problemas da degradação dos produtos recombinantes pelas células nas quais estes são sintetizados. Um fenómeno de proteólise pode, de facto, manifestar-se durante o trânsito da proteína de interesse 1 na via de secreção da levedura recombinante ou pela existência de proteases segregadas ou presentes no meio de cultura depois de uma lise celular indesejável interveniente durante a fermentação. A requerente mostrou agora que é possivel melhorar os níveis de produção das referidas proteínas recombinantes, isto é, na sua forma integral, nas leveduras Kluyveromyces, através da modificação de, pelo menos, um gene que codifica uma protease celular e especialmente uma protease que transita pela via de secreção. De modo surpreendente, a requerente mostrou ainda que tais modificações são particularmente vantajosas uma vez que permitem aumentar as taxas de produção de proteínas recombinantes, e esta é mais vantajosa uma vez que a referida modificação não tem efeito aparente na velocidade de crescimento e na viabilidade das células modificadas nas condições industriais de fermentação. Ainda de modo surpreendente, a requerente mostrou, igualmente, que as referidas modificações não afectam a estabilidade das leveduras transformadas, o que permite utilizar as referidas leveduras de modo particularmente vantajoso para produzir proteínas recombinantes. A presente invenção tem assim por objecto leveduras do género Kluyveromyces que apresentam uma ou mais modificações genéticas de, pelo menos, um gene que codifica uma protease, modificando a actividade proteolítica das referidas leveduras. De um modo preferido, a ou as modificações genéticas tornam o referido gene parcialmente ou totalmente incapaz de codificar a protease natural. Numa outra forma de realização preferida da invenção, o ou os genes assim modificados geneticamente codificam uma protease não funcional, ou um mutante que tem um espectro de actividade proteolítica modificado. Numa outra forma de realização preferida da invenção, o ou os genes que codificam 2 as referidas proteases são colocados sob controlo de um promotor regulado.

De acordo com a invenção, as leveduras do género Kluyveromyces compreendem as leveduras como definidas por van der Walt [em: The Yeasts (1987) NJ. W. Kreger- van Rij (ed) : Elsevier: p.224], e de um modo preferido as leveduras K. marxianus var. lactis (K. lactis) , K. marxianus var. marxianus (K. fragilis) , K. marxianus var. drosophilarum {K. drosophilarum), K. waltii, etc.

Por modificação genética entende-se mais particularmente qualquer supressão, substituição, delecção ou adição de uma ou mais bases no ou nos genes considerados. Tais modificações podem ser obtidas in vitro (no ADN isolado) ou in situ, por exemplo, por meio de técnicas de engenharia genética ou também por exposição das referidas leveduras a um tratamento por meio de agentes mutagénicos. Como agentes mutagénicos podem-se citar, por exemplo, os agentes fisicos, tais como as radiações energéticas (X, g, raios ultra-violeta, etc.) ou os agentes químicos capazes de reagir com diferentes grupos funcionais das bases do ADN e, por exemplo, os agentes de alquilação [etilmetanossulfonato (EMS), N-metil-N'-nitro-N-nitroso- guanidina, N-nitroquinolina-l-óxido (NQO)], os agentes de bialquilação, agentes intercalantes, etc. Por delecção entende-se qualquer supressão do gene considerado. Pode-se actuar particularmente numa parte da região que codifica as referidas proteases e/ou toda ou parte da região promotora da transcrição.

As modificações genéticas podem ser igualmente obtidas por interrupção génica, por exemplo, de acordo com o processo inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202] . Neste caso, a integralidade da sequência codificante será de um modo preferido perturbada para permitir a substituição, 3 por recombinação homóloga da sequência genómica de tipo selvagem por uma sequência não funcional ou mutante. A ou as referidas modificações genéticas podem ser localizadas no gene que codifica as referidas proteases ou exteriormente à região que codifica os referidas proteases e, por exemplo, nas regiões responsáveis pela expressão e/ou regulação transcripcional dos referidos genes. A incapacidade dos referidos genes em codificar as proteases naturais pode-se manifestar quer seja pela produção de uma proteína inactiva devido a modificações estruturais ou conformacionais, seja pela ausência de produção, seja pela produção de uma protease que tem uma actividade enzimática modificada ou ainda pela produção da protease natural num nível atenuado ou de acordo com um modo de regulação desejado.

Além disso, determinadas modificações, tais como as mutações pontuais são, por natureza, capazes de serem corrigidas ou atenuadas através de mecanismos celulares, por exemplo durante a replicação do ADN que precede a divisão celular. Tais modificações genéticas têm assim um interesse limitado ao nível industrial uma vez que as propriedades fenotípicas que daí resultam não são perfeitamente estáveis. A requerente desenvolveu agora um processo que permite preparar leveduras de Kluyveromyces que apresentam uma ou mais modificações genéticas de pelo menos um gene que codifica uma protease, sendo a ou as referidas modificações segregacionalmente estáveis e/ou não reversíveis. As leveduras que apresentam essas modificações são particularmente vantajosas como hospedeiro celular para a produção de proteínas recombinantes. A invenção permite igualmente produzir leveduras nas quais a ou as modificações contidas tornam o ou os genes considerados totalmente ou parcialmente incapazes de produzir uma protease funcional. 4

De um modo preferido, as leveduras de acordo com a invenção apresentam uma ou mais modificações genéticas segregacionalmente estáveis. Ainda de acordo com uma forma de realização preferida, a ou as modificações genéticas são não reversíveis. Também de acordo com uma forma de realização preferida da invenção, a ou as modificações genéticas não deixam qualquer actividade residual do gene considerado.

De um modo preferido, o ou os genes que codificam uma ou mais proteases são escolhidos a partir de genes que codificam proteases que transitam pela via de secreção de Kluyveromyces. Tais proteases podem estar localizadas no retículo endoplasmático, no compartimento do aparelho de Golgi, no compartimento pós-Golgi e, por exemplo, nos vacúolos celulares, nas vesículas do endossoma, nas vesículas de secreção ou no meio extracelular. A título de exemplo desses genes, pode-se citar os genes de Kluyveromyces que codificam uma protease escolhida a partir das famílias da protease A, protease B ou de uma carboxipeptidase (e, por exemplo, carboxipeptidase Y ou carboxipeptidase S) ou ainda endopeptidase KEX1 de K. lactis ou uma protease com actividade semelhante e, por exemplo, a protease YAP3 [Egel-Mitani et al., Yeast _6 (1990) 127] ou mais genericamente qualquer outra protease interveniente na maturação de determinadas proteínas segregadas.

Numa forma de realização preferida da invenção, o ou os genes considerados, codificam proteases que não intervêm na clivagem do péptido sinal das proteínas recombinantes expressas sob a forma de pré-proteínas. Pode-se citar a título de exemplos de genes particularmente interessantes, os genes da protease A, da protease B e da carboxipeptidase Y de Kluyveromyces, cuja clonagem é descrita nos exemplos. 5

Numa outra forma de realização da invenção, a ou as referidas proteases possuem uma actividade de sinal de peptidase e a ou as referidas modificações genéticas permitem a sua sobre-expressão que é particularmente vantajosa no caso em que esta etapa é uma etapa limitante da via de secreção. A invenção têm igualmente por objecto qualquer levedura Kluyveromyces tal como definida anteriormente na qual foi introduzida uma sequência de ADN exógeno compreendendo um ou mais genes que codificam uma proteína de interesse que seja desejada expressar e/ou segregar na referida levedura.

Do ponto de vista da presente invenção, entende-se por sequência de ADN exógeno qualquer sequência de ADN introduzida artificialmente na levedura e que codifica uma ou mais proteínas de interesse. Em particular, podem-se tratar de sequências de ADN complementar (ADNc), de sequências artificiais ou híbridas, ou ainda de sequências sintéticas ou semi-sintéticas contidas numa cassete de expressão que permitem a síntese nas referidas leveduras da ou das referidas proteínas de interesse. Por exemplo, esta sequência de ADN exógeno pode incluir uma região de iniciação da transcrição, regulada ou não em Kluyveromyces, de forma a dirigir expressão, quando a mesma é desejável, das referidas proteínas de interesse.

De um modo preferido, a sequência de ADN exógeno é incluída num vector quer seja de replicação autónoma na levedura considerada ou do tipo integrativo. Mais particularmente, os vectores de replicação autónoma podem ser preparados a partir de sequências de replicação autónoma em Kluyveromyces e, por exemplo, pode-se tratar do plasmídeo pKDl [Falcone et al., Plasmids L5 (1986) 248; Chen et al., Nucl. Acids Res. 14_ (1986) 4471] caracterizado por uma elevada estabilidade segregacional, 6 especialmente nas várias variedades de K. marxianus ou do plasmideo pEWl isolado em K. waltii [Chen et al.r J. General Microbiol. 138 (1992) 337]. Os vectores de replicação autónoma podem ser igualmente preparados a partir de sequências cromossómicas (ARS). Tratando-se de vectores do tipo integrativo, estes podem ser preparados a partir de sequências cromossómicas homólogas à referida levedura hospedeira, de modo a flanquear a sequência genética que codificam as referidas proteínas de interesse, e um marcador de selecção genética, de modo a orientar a integração do conjunto através de recombinação homóloga. Numa forma de realização particular, as referidas sequências homólogas correspondem às sequências genéticas provenientes da região codificante da referida protease, permitindo substituir através de recombinação homóloga a sequência original da referida protease pelo marcador de selecção e da sequência de ADN exógeno, permitindo a interrupção génica da referida protease. Numa outra forma de realização, a cassete de expressão é integrada no locus que codifica o ARN ribossomal (ADNr) permitindo a amplificação génica da referida cassete de expressão [Bergkamp et al., Curr. Genet. 21_ (1992) 365]. Ainda noutra forma de realização, a sequência de ADN exógeno é integrada no cromossoma das referidas leveduras hospedeiras através de recombinação homóloga. A sequência de ADN exógeno pode ser introduzida na levedura através de métodos dos especialistas na técnica, por exemplo, técnicas do ADN recombinante, cruzamentos genéticos, fusão de protoplastos, etc. Numa forma de realização particular, a sequência de ADN exógeno pode ser introduzida na levedura Kluyveromyces através de transformação, electroporação, conjugação ou qualquer outra técnica descrita na literatura. Tratando-se da transformação de leveduras Kluyveromyces, pode-se utilizar a técnica descrita por Ito et al. [J. Bacteriol. 153 7 (1983) 163] . A técnica de transformação descrita por Durrens et al. [Curr. Genet. 1_8_ (1990) 7] utilizando o etilenoglicol e o dimetilsulfóxido é também eficaz. É também possível transformar as leveduras através de electroporação de acordo com o método descrito por Karube et al. [FEBS Letters 182 (1985) 90]. Um protocolo alternativo é também descrito no pedido de patente EP 361991.

As referidas leveduras Kluyveromyces modificadas no seu conteúdo em proteases pelas técnicas descritas acima são vantajosamente utilizadas como células hospedeiras para produzir as proteínas recombinantes e, por exemplo, proteínas heterólogas de interesse farmacêutico ou agro-alimentar. As referidas leveduras hospedeiras são particularmente vantajosas uma vez que permitem aumentar a qualidade e a quantidade de proteínas recombinantes que é desejado produzir e/ou segregar, e que as referidas modificações genéticas das referidas células não afectam a estabilidade genética e mitótica dos vectores de expressão das referidas proteínas recombinantes. Um outro objecto da invenção reside assim num processo de produção de proteínas recombinantes de acordo com o qual se cultiva uma levedura tal como definida acima, nas condições de expressão da ou das proteínas codificadas pela sequência de ADN exógeno, e em que se recupera a ou as proteínas de interesse. Numa forma de realização preferida, as referidas proteínas de interesse são segregadas para o meio de cultura. A título de exemplo, podem-se citar as proteínas que existem naturalmente na natureza, ou as proteínas artificiais e, por exemplo, as proteínas híbridas. Neste caso, a utilização de células de levedura possuindo um conteúdo modificado em proteases é particularmente vantajosa devido à exposição da região de charneira entre os diferentes domínios proteicos da proteína quimera. Numa forma de realização particular, a referida proteína artificial contém um péptido fundido a uma das extremidades da quimera e é particularmente sensível, por exemplo, durante o trânsito na via de secreção, a uma degradação proteolítica por uma exoprotease N- ou C-terminal e, por exemplo, uma carboxipeptidase. É entendido que a degradação proteolítica da proteína de interesse pode igualmente resultar de qualquer protease celular, por exemplo citoplasmática, libertada no meio externo devido a uma lise celular indesejável durante o processo de fermentação das referidas leveduras recombinantes. A alteração genética da sequência nucleotídica que codifica essas proteases pode assim resultar igualmente num processo particularmente vantajoso para produzir as referidas proteínas de interesse e é também reivindicado.

De um modo preferido, o processo de acordo com a invenção permite a produção de proteínas de interesse farmacêutico ou agro-alimentar. A título de exemplo, pode-se citar as enzimas (tais como especialmente a superóxido dismutase, catalase, amilases, lipases, amidases, quimiosina etc. ou qualquer fragmento ou derivados das mesmas), os derivados sanguíneos (tais como a albumina sérica, alfa ou beta-globina, factores de coagulação e, por exemplo, factor VIII, factor IX, factor de von Willebrand, fibronectina, alfa-1 antitripsina, etc. ou qualquer fragmento ou derivado dos mesmos), insulina e suas variantes, linfocinas [tais como interleucinas, interferões, factores estimuladores de colónia (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, etc.), o TNF etc. ou qualquer fragmento ou derivado das mesmas], os factores de crescimento (tais como a hormona do crescimento, eritropoietina, FGF, EGF, PDGF, TGF, etc., ou qualquer fragmento ou derivado dos mesmos), apolipoproteínas e as suas variantes moleculares, polipéptidos antigénicos para a produção de vacinas (hepatites, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr, vírus do herpes etc.), ou ainda fusões de polipéptidos, tais como especialmente as fusões contendo uma parte biologicamente activa fundida a uma parte estabilizadora. 9

Um outro objecto da presente invenção reside num fragmento de ADN de Kluyveromyces que codifica uma protease. A requerente de facto detectou, isolou e caracterizou determinadas proteases de Kluyveromyces e especialmente proteases que transitam através da via de secreção. De um modo mais preferido, um dos objectos da invenção refere-se a uma protease de Kluyveromyces escolhida especialmente a partir de uma protease A, B, carboxipeptidase Y, assim como à família das proteases de serina do tipo subtilisina cujo um representante é a protease KEX1 de K. lactís [Wesolowski-Louvel et al.r Yeast _4 (1988) 71]. A titulo de exemplo, as sequências nucleotidicas dos genes de K. lactis que codificam as proteases A, B e a carboxipeptidase Y foram determinadas pela requerente e são apresentadas como SEQ ID N° 5, 1 e 2, respectivamente. Um mapa de restrição de um fragmento cromossómico que codifica a protease A de K. lactis é igualmente descrito na Figura 10. É compreendido que qualquer variante genética destes genes de proteases, e a sua utilização vantajosa para produzir proteínas de interesse, fazem igualmente parte da invenção. As referidas variações podem ser de origem natural, mas podem também ser obtidas in situ ou in vitro através de técnicas de engenharia genética, ou após tratamento das células com um agente mutagénico, e incluem especialmente as mutações pontuais ou múltiplas, delecções, adições, inserções, proteases híbridas, etc. Numa forma de realização ainda mais particular, as variações genéticas podem também relacionar-se com as regiões de controlo da expressão das referidas proteases, por exemplo, com vista a alterar os níveis de expressão ou o seu modo de regulação. A invenção tem igualmente por objecto qualquer proteína resultante da expressão de um fragmento de ADN exógeno, tal como definido acima. 10 A invenção tem igualmente por objecto um processo de preparação de uma levedura Kluyveromyces geneticamente modificada e a sua utilização vantajosa para produzir as proteínas de interesse. De um modo preferido, o processo da invenção consiste em substituir o ou os genes cromossómicos considerados como uma versão modificada in vitro. A presente invenção será descrita mais em pormenor com a ajuda dos seguintes exemplos que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.

LEGENDA DAS FIGURAS

As representações dos plasmídeos indicados nas seguintes Figuras são desenhadas a uma escala aproximada e são apenas indicados os sítios de restrição importantes para a compreensão das clonagens realizadas.

Figura 1: Mapa de restrição da inserção genómica do plasmídeo pFP8. A posição dos sítios de clivagem das seguintes endonucleases é indicada: B=BamHI; G=BglII; C=ClaI; E=EcoRI; R=HindIII; K=KpnI; N=NcoI; P=PstI; Pv=PvuII; T=SstI; X=XhoI. 0 fragmento obtido após amplificação por PCR é assim representado como o ARNm do gene PRB1 de S. cerevisiae.

Figura 2: Hibridação da sonda PRB1 de S. cerevisiae com os fragmentos de restrição do ADN genómico de K. lactis. Painel superior: foto do gel de agarose (1%) corado com brometo de etídio e antes da transferência no filtro de nylon; painel inferior: representação esquemática dos 11 sinais obtidos após hibridação do filtro com a sonda radioactiva. A numeração corresponde às seguintes digestões: l=EcoRI; 2=BglII; 3=BglII+EcoRI; 4=Hindlll; b=Hindlll+EcoRl; 6=PstI; !=PstI+EcoRl; 8=SâlI; 9=SalI+EcoRI; 10=BamHI; ll=BamHI+EcoRI.

Figura 3: Hibridação da sonda PRB1 de S. cerevisiae com as 34 mini-preparações de ADN (mistura de 10 clones cada uma) após restrição dupla com as enzimas EcoRI e BglII. Painel A: foto do gel de agarose (1%) corado com brometo de etidio e antes da transferência no filtro de nylon; Painel B: autorradiografia do filtro de nylon após hibridação com a sonda PRBl de S. cerevisiae; são indicadas as subfracções "d", "e" e "f" que correspondem a um fracção de fragmentos genómicos de ADN de K. lactis após digestão total com EcoRI+Bglll e fraccionamento em tamanho por eletroeluição.

Figura 4: Hibridação de controlo dos clones positivos 18-3 e 31-1. Painel A: foto após migração no gel de agarose a 1% das digestões EcoRI+Bglll do ADN dos clones 31-1 (poço N° 1) , 18-3 (poço N° 2) e 31-K (controlo negativo, poço N° 3) . Painel B: autorradiografia do filtro de nylon que corresponde ao gel anterior após hibridação com a sonda PRBl de S. cerevisiae. P corresponde à localização do plasmideo não digerido (pYG1224); é indicada a posição do fragmento de restrição Bglll-EcoRl de cerca de 0,7 kb que híbrida com a sonda radioactiva.

Figura 5: Comparação da sequência proteica do fragmento Bglll-EcoRl de ADN genómico de K. lactis (resíduos Arg308 a Phe531 da sequência peptídica SEQ ID N° 1) com a parte correspondente do gene PRBl de S. cerevisiae (SEQ ID N° 8) 12 (resíduos Arg105 a Leu328) . Os asteriscos indicam os aminoácidos conservados entre as duas sequências.

Figura 6: Mapas de restrição das inserções genómicas dos plasmídeos pYG1224, pYG1226 e pYG1227 (painel A); pYG1231 (painel B) ; pYG1237, pYG1238, pYG1239, pYG1240, pYG1241 e pYG1242 (painel C) . A posição dos sítios de clivagem das seguintes endonucleases é indicada: G=BglII; C=ClaI; S=SalI; E=EcoRl; E=HindIII; K=KpnI; P=PstI; V=EcoRV.

Painel D: localização da fase codificante do gene PRB1 de K. lactis; a seta vertical indica a posição aproximada da extremidade N-terminal da proteína madura. A posição do codão que se presume ser de iniciação da tradução e a posição do codão que especifica o fim da tradução são indicados através de um asterisco. SEQ ID N° 1: Sequência do gene PRB1 de K. lactis. As setas negras indicam a posição aproximada do fim das regiões "pré" e "pro" da protease B. Os sítios de restrição BglII, Sal I, EcoRl e HindIII estão sublinhados, assim como a sequência correspondente ao oligodesoxinucleótido Sq2101.

Figura 8: Mapa de restrição da inserção do plasmídeo pC34. A caixa corresponde à inserção genómica de K. lactis e a linha corresponde às sequências do vector ΚΕρβ. A seta indica a posição do gene PRC1 de K. lactis. A parte detalhada compreendida entre os sítios EcoRl e Sall corresponde à região sequenciada apresentada na Figura 9. Lista de abreviaturas: C=ClaI; R=HindIII; B=BamHI; E=EcoRI; P=PstI; S=SalI; Sp=SphI; Sau=Sau3A. SEQ ID N° 2: Sequência nucleotídica do fragmento EcoRI-SalI incluindo o gene PRC1 de K. lactis. 13

Figura 10: Mapa de restrição da inserção do plasmideo pA25/l. A caixa corresponde à inserção genómica de K. lactis e a linha corresponde às sequências do vector ΚΕρβ. A seta indica a posição aproximada do gene PRA1 tal como indicada por uma hibridação em transferência de Southern por meio de sondas 3' e 5' especificas. Lista de abreviaturas: C=Clal; R=HindIII; B=BamHl; Sau=Sau3A; S=SalI; P=PstI; G=5glII; Xb=XbaI; Sn=SnaBI; E=EcoRI.

Figura 11: Painel A: Mapa de restrição do fragmento de restrição HindIII-EcoRI do plasmideo pYG1232. A posição dos sítios de clivagem das seguintes endonucleases é indicada: G=BglII; S=SalI; E=EcoRI; E=HindIII; K=KpnI; X=XhoI; o sítio de clonagem HindiII provém do vector e está sublinhado. Painel B: Interrupção do gene do PRB1 de K. lactis pelo marcador de selecção URA3 de S. cerevisiae. Esta transferência de Southern corresponde ao ADN genómico de K. lactis CBS294.91 (uraA) após transformação pelo fragmento Bglll-EcoRl do painel A e selecção na ausência de uracilo. Poços 1 a 3: ADN genómico de três transformantes após restrição dupla Bglll+EcoRI; a estirpe do poço 3 é K. lactis Y750; poço 4: ADN genómico da estirpe CBS 294.91 após restrição dupla Bglll+EcoRI. A sonda radioactiva utilizada corresponde ao fragmento BglII-EcoRI do plasmideo pYG1224 (Figura 6A).

Figura 12: Mapa de restrição das inserções dos plasmídeos pC34 [vector ΚΕρβ; painel a)], pYG154 [vector pIC-20R; painel b)] e pYG155 [vector pIC-20R; painel c)] . Painel d): fragmento utilizado para a interrupção. Os sítios de restrição entre parêntesis foram destruídos pela enzima Klenow ou pela ADN polimerase de T4 como indicado no texto. 14 A caixa corresponde à inserção genómica de K. lactis e a linha corresponde às sequências dos vectores. Lista de abreviaturas: C=ClaI; H=HindIII; B=BamHI; E=EcoRI; P=PstI; S=SalI, Sp=SphI; Sau=Sau3A; Sm=SmaI; N=7/coI.

Figura 13: Mapa de restrição do plasmideo pYG105 e estratégia de construção do plasmideo pYG1212. Abreviaturas utilizadas: P, promotor LAC4 de K. lactis; T, terminador de transcrição; IR, Sequências repetidas invertidas do plasmideo pKDl; LP, região pré-pro de SAH; Apr e Kmr designam respectivamente os genes de resistência à ampicilina (E. coli) e a G418 (Kluyveromyces) .

Figura 14: Comparação das capacidades de secreção de uma variante truncada da albumina humana nas estirpes de K. lactis CBS 293.91 (poços 2, 4, 6, 8 e 10) ou o seu mutante interrompido no gene da protease B (estirpe Y750; poços 1, 3, 5, 7 e 9) , após transformação com o plasmideo pYG1212. As células transformadas são cultivadas em balões Erlenmeyer na presença de G418 (200 mg/mL) durante 2 dias (poços 1, 2, 7 e 8), 4 dias (poços 3, 4, 9 e 10), ou 7 dias (poços 5 e 6); os poços 1 a 6 correspondem ao crescimento no meio YPD, e os poços 7 a 10 correspondem ao crescimento no meio YPL. As manchas são equivalentes a 50 mL de sobrenadante de cultura. SEQ ID N° 3: Sequência nucleotidica do fragmento Clal-EcoRI incluindo o gene PRA1 de K. lactis. 15

TÉCNICAS GERAIS DE CLONAGEM

Os métodos classicamente utilizados na biologia molecular, tais como as extracções preparativas de ADN plasmidico, centrifugação de ADN plasmidico em gradiente de cloreto de césio, electroforese em gel de agarose ou acrilamida, purificação de fragmentos de ADN por eletroeluição, extracções de proteína em fenol ou fenol-clorofórmio, precipitação de ADN em meio salino pelo etanol ou isopropanol, transformação em Escherichia coli, etc., são bem conhecidos do especialista na técnica e estão amplamente descritas na literatura [Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1987].

As enzimas de restrição foram fornecidas pela New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham e são utilizadas de acordo com as recomendações dos fornecedores.

Os plasmídeos do tipo pBR322, pUC e os fagos da série M13 são de origem comercial (Bethesda Research Laboratories). Os plasmídeos do tipo plC foram descritos por Marsh et al. [Gene 32. (1984) 481] .

Para as ligações, os fragmentos de ADN são separados de acordo com o seu tamanho por electroforese em gel de agarose ou de acrilamida, extraídos em fenol ou por uma mistura de fenol/clorofórmio, precipitados em etanol e depois incubados na presença de ADN ligase do fago T4 (Biolabs) de acordo com as recomendações do fornecedor. 16 0 preenchimento das extremidades 5' proeminentes é efectuado pelo fragmento Klenow da ADN polimerase I de E. coli (Biolabs) de acordo com as especificações do fornecedor. A destruição das extremidades 3' proeminentes é efectuada na presença de ADN polimerase do fago T4 (Biolabs) utilizada de acordo com as recomendações do fabricante. A destruição das extremidades 5' proeminentes é realizada por um tratamento conduzido pela nuclease Sl. A exonuclease Bal31 é utilizada de acordo com as recomendações do fornecedor (Biolabs).

Os oligodesoxinucleótidos são sintetizados quimicamente de acordo com o método da fosforamidite utilizando os grupos protectores B-cianoetilos [Sinha et al., Nucleic Acids Res. 12_ (1984) 4539] . Após a síntese, os grupos protectores são eliminados por tratamento com amoniaco e duas precipitações com butanol que permitem purificar e concentrar os oligodesoxinucleótidos [Sawadogo e Van Dyke, Nucleic Acids Res. 19 (1991) 674] . A concentração de ADN é determinada por medição da densidade óptica a 260 nm. A mutagénese dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos é efectuada de acordo com o método desenvolvido por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13_ (1985) 8749-8764] utilizando o kit distribuído pela Amersham. O fragmento de ADN utilizado para servir de sonda molecular no ADN genómico de K. lactis é amplificado in vitro pela técnica de PCR [Reacção em Cadeia da Polimerase, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350; Mullis K. B. e Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335] no ADN de S. cerevísiae. A amplificação é automatizada (40 ciclos de amplificação) e é efectuada num aparelho Perkin Elmer Cetus (DNA thermal cycler) utilizando a Taq polimerase (isolada da arqueobactéria Thermophilus 17 aquaticus) fornecida pela firma Perkin Elmer. Cada ciclo de amplificação compreende três etapas: 1) uma etapa de desnaturação de ADN a 91 °C; 2) uma etapa de hibridação dos iniciadores oligodesoxinucleotidicos no ADN molde. A temperatura de hibridação é escolhida com cinco a dez graus abaixo da temperatura de fusão dos oligodesoxinucleótidos (Ti/2) . Para os oligodesoxinucleótidos de um tamanho aproximado de 20 monómeros, Ti/2 = 2x(A+T)+4x(C+G) [Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53 (1984) 323]. 3) uma etapa para a síntese de ADN complementar pela Taq polimerase a 72 °C. A preparação de sondas nucleotídicas radioactivas é realizada por incorporação de dCTP radioactivo (fósforo 32) ao longo da molécula neo-sintetizada a partir de 20 ng de ADN utilizando o kit "Random Primed DNA Labeling" comercializado pela firma Boehringer.

As transferências de ADN em membrana de nylon (Biodyne, Pall, St Germain en Laye) ou de nitrocelulose (Schleicher & Schuell, Dassel) são efectuadas de acordo com o método desenvolvido inicialmente por Southern [J. Mol. Biol. 98 (1979)

503] . As condições de hibridação e de lavagem utilizadas dependem da natureza da sonda utilizada: em condições heterólogas (ADN genómico de K. lactis hibridado com uma sonda proveniente de S. cerevisiae, por exemplo), a hibridação e as lavagens são efectuadas em condições pouco restringentes (hibridação durante 15 horas a 40 °C sem formamida em 5X SSC/5X Denhart, o filtro é depois lavado 3 vezes em 5X SSC/1% de SDS a 40 °C durante 15 minutos, depois uma vez em 0,25X SSC/1% de SDS 18 durante 10 minutos); em condições homólogas (ADN genómico de K. lactis hibridado com uma sonda proveniente de K. lactis, por exemplo), a hibridação e as lavagens são efectuadas em condições mais restringentes (hibridação durante 15 horas a 40 °C em 5X SSC/5X Denhart/50% de formamida, o filtro é depois lavado 3 vezes em 5X SSC/1% de SDS a 40 °C durante 15 minutos, depois uma vez em 0,2X SSC/1% de SDS durante 10 minutos). A verificação das sequências nucleotidicas é efectuada no ADN plasmídico com o kit "Sequenase version 2.0" da firma United States Biochemical Corporation, de acordo com o método de Tabor e Richardson [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_4 (1987) 4767]. Esta técnica é uma modificação do método inicialmente descrito por Sanger et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7£ (1977) 5463].

As transformações de K. lactis com ADN de plasmídeos de expressão de proteínas da presente invenção são realizadas por qualquer técnica conhecida do especialista na matéria, e da qual um exemplo é apresentado no texto.

Salvo indicação em contrário, as estirpes bacterianas utilizadas são E. coli MC1060 (lacIPOZYA, X74, galU, galK, strAT) , E. coli TG1 (iac, proA, B, supE, thi, hsdD5/FtraD36, proA+B+, laclq, lacZ, M15) ou E. coli JM101 [Messing et ai., Nucl. Acids Res. 9_ (1981) 309].

As estirpes de levedura utilizadas pertencem às leveduras gemulantes e mais particularmente às leveduras do género Kluyveromyces. As estirpes K. lactis MW98.8c (a, uraA, arg, lys, K+, pKDl0), K. lactis CBS 293.91, K. lactis CBS 294.91 (uraA) e K. lactis CBS 2359/152 [a, metA, (kl, k2); Wesolowski et ai., Yeast _4 (1988) 71] foram particularmente utilizadas; uma amostra da estirpe MW98-8C foi depositada em 16 de Setembro de 1988 no 19

Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) em Baarn (Países Baixos) onde foi registada sob o número CBS579.88. A preparação do ADN genómico de levedura é essencialmente derivada da técnica de Hoffman e Winston [Gene _57 (1987) 267] e é descrita em detalhe no texto.

As estirpes de levedura transformadas com os plasmídeos de expressão que codificam as proteínas da presente invenção são cultivadas em balões Erlenmeyer ou em fermentadores piloto de 21 (SETRIC, França) a 28 °C em meio rico (YPD: 1% de extracto de levedura, 2% de Bactopeptona, 2% de glucose; ou YPL: 1% de extracto de levedura, 2% de Bactopeptona, 2% de lactose) com agitação constante.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: CLONAGEM DO GENE DA PROTEASE B DE K. LACTIS E. 1.1. Produção de uma sonda para amplificação enzimática in vitro de uma sequência de ADN. É realizada uma amplificação enzimática por PCR a partir do plasmídeo pFP8 [Moehle et al., Genetics 115 (1987) 255; Fig. 1], vector shuttle E. coli/S. cerevisiae derivado de YEpl3 e contendo o gene PRB1 de S. cerevisiae, e os oligodesoxinucleótidos 5'-TGACACTCAAAATAGCG-3' (o codão correspondente ao resíduo Asp3 está sublinhado) e 5'-AATATCTCTCACTTGAT-3' (o codão da cadeia complementar correspondente ao resíduo Ile348 está sublinhado). A temperatura de hibridação dos oligodesoxinucleótidos é de 45 °C e o volume reaccional de 100 mL compreendendo: 10 ng de plasmídeo pFP8, os 20 iniciadores oligodesoxinucleotídicos, 10 mL de tampão 10X PCR [Tris-HCl pH=8,5 (100 mM); MgC12 (20 mM); KC1 (100 mM); gelatina (0,01%)], 10 mL de dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP, cada um a uma concentração de 10 mM)], e 2,5 unidades de Taq polimerase. A adição de uma gota de óleo de parafina permite evitar a evaporação no decurso de subidas de temperatura durante os ciclos de amplificação. É obtido um fragmento de ADN de 1039 pares de bases, cuja identidade é verificada por análise das posições de determinados sítios de restrição e que corresponde a quase totalidade da sequência de aminoácidos da forma madura da protease B (Asp3 a Ile348 ) . Este fragmento é depois purificado por eletroeluição após migração num gel de agarose a 0,8% e é utilizado para preparar a sonda radioactiva de acordo com o método de "Random Priming". E.1.2. Preparação de ADN genómico de levedura.

As leveduras (estirpe K. lactis MW98-8C) em fase estacionária do crescimento são centrifugadas. Após lavagem do sedimento em água estéril, este é recuperado numa solução contendo: 2% de Triton X100 (v/v) ; 1% de SDS (p/v) ; 100 mM de

NaCl; 10 mM de Tris-HCl (pH=8) ; 1 mM de EDTA. As leveduras são depois moídas na presença de fenol-clorofórmio por acção mecânica de esferas de vidro adicionadas à mistura que é agitada em Vortex durante 2 minutos. A fase aquosa é depois recuperada após centrifugação e precipitada por adição de 2,5 volumes de etanol. 0 ADN é recuperado em TE para ser submetido a purificação num gradiente de césio. A partir de 1 litro de cultura obteve-se 1 mg de ADN genómico de elevado peso molecular (» 20 kb) . 21 Ε. 1.3. Pesquisa do gene por hibridação em condições de fraca restringência. A preparação de ADN genómico é submetida a uma digestão total com enzimas de restrição cujos sítios estão presentes na região de múltiplos sítios de clonagem do vector pIC-20H. Um resultado preliminar mostra que apenas as condições pouco restringentes (hibridação durante 15 horas a 40 °C sem formamida em 5X SSC/5X Denhart, depois 3 lavagens em 5X SSC/1% de SDS a 40 °C durante 15 minutos, depois 1 lavagem em 0,25X SSC/1% de SDS durante 10 minutos) permitiu visualizar um fragmento EcoRI de 1,8 kb que híbrida com a sonda PRB1 de S. cerevisiae. Uma segunda transferência de Southern é realizada na qual cada poço contém 12 mg de ADN genómico clivado durante 15 horas com 20 unidades de EcoRI e 20 unidades de uma segunda enzima de restrição (Fig. 2) . Nas condições de hibridação e de lavagem previamente definidas, um fragmento genómico de cerca de 700 pb e proveniente da digestão dupla EcoRI+BglII híbrida com a sonda PRBl de S. cerevisiae (Fig. 2, poço N° 3). Do mesmo modo, um fragmento de restrição BglII de tamanho superior (cerca de 1,3 kb) híbrida com esta sonda (Fig. 2, poço N° 2). O fragmento de cerca de 700 pb detectado após digestão do ADN genómico com EcoRI+BglII é assim um fragmento de restrição BglII-EcoRI. As outras restrições parecem menos interessantes uma vez que geram quer fragmentos de tamanho inferior àquele obtido pela digestão dupla EcoRI+BglII, quer um fragmento de tamanho idêntico (1,8 kb) àquele gerado após digestão com unicamente EcoRI (Fig. 2, poço N° 1) . A clonagem deste fragmento assimétrico BglII-EcoRI de 700 pb permite obter uma fracção do gene PRBl de K. lactis que pode servir de seguida como sonda homóloga para clonar a ou as partes ausentes do gene. Para clonar este fragmento são tratados 22 100 mg de ADN genómico durante 15 horas com 100 unidades de endonucleases EcoRI e BglII, depois submetida a migração num gel de agarose preparativo (1%) . A fracção do gel compreendendo os fragmentos cujo tamanho está entre 500 e 1000 pb é depois dividida em três subfracções (subfracção "f": 500/700 pb; subfracção "e": 700/800 pb; subfracção "d": 800/1000 pb;

Fig. 3). Uma transferência de Southern realizada após migração de um fracção destes subfracções e hibridação com a sonda PRB1 de S. cerevisiae mostra um sinal de hibridação do tamanho previsto (700 pb) e particularmente intensa com a subfracção "e" (700/800 pb) . Uma biblioteca genómica restrita aos fragmentos BglII-EcoRI desta subfracção (mini-biblioteca genómica) é assim construída por clonagem dos fragmentos de restrição BglII-EcoRI nos sítios correspondentes do vector pIC-20H. A transformação da ligação em E. coli produz 90% de clones brancos nas placas LB suplementadas com ampicilina e X-gal. São depois repicados 340 clones (incluindo, aproximadamente, 30 clones azuis) no mesmo meio para os isolar. Os 340 clones da biblioteca restrita são depois divididos em 34 misturas correspondendo cada uma a 10 clones diferentes e o seu ADN é digerido com EcoRI+BglII, submetido a migração em gel de agarose, transferido em membrana para ser depois hibridado com a sonda PRB1 de S. cerevisiae em condições pouco restringentes de hibridação e de lavagem. A Figura 3 mostra esta transferência de Southern onde duas misturas (N° 18 e N° 31) apresentam um sinal de hibridação do tamanho previsto (cerca de 700 pb). A mesma operação é realizada para analisar separadamente os 10 clones das misturas N° 18 e N° 31: o clone N° 3 é o único clone da mistura N° 18 a apresentar um sinal de hibridação no tamanho previsto (clone 18-3); de modo análogo, apenas o clone I da mistura 31 (clone 31-1) dá um sinal de hibridação no tamanho previsto. Uma última transferência de Southern é realizada a partir de ADN dos clones 18-3 e 31-1 (sinal positivo) e de um clone negativo (clone K da 23 mistura N° 31). Nas condições de hibridação e de lavagem definidas previamente, apenas os clones 18-3 e 31-1 confirmam a presença de um sinal positivo após digestão dupla EcoRI+BglII, e cujo o tamanho parece ser estritamente equivalente (Fig. 4). E.1.4. Identificação do gene. A sequência nucleotidica do fragmento BglII-EcoRI do clone 18-3 é produzida para demonstrar que este fragmento corresponde de facto a uma fracção do gene PRB1 de K. lactis. É realizado um mapa de restrição sumário do plasmideo pYG1224 do clone 18-3 e é revelada a presença de um sitio Sall aparentemente único no centro do fragmento BglII-EcoRI. Os fragmentos BglII-SalI (cerca de 350 pb) e SalI-EcoRI (cerca de 300 pb) do plasmideo pYG1224 são depois clonados no vector pUC19, produzindo os plasmideos pYG1226 e pYG1227, respectivamente (Fig. 6A) . As inserções destes plasmideos são depois totalmente sequenciadas utilizando "iniciadores universais". Como indicado na Figura 5, o fragmento BglII-EcoRI do plasmideo pYG1224 contém uma fase de leitura aberta (225 resíduos) que apresenta homologias de sequência com um fragmento do gene PRB1 de S. cerevisiae (Arg105 a Leu328 ) . A presença de tal homologia, assim como a estrita conservação de aminoácidos invariavelmente encontrados nas proteases de serina da família da subtilisina demonstra que o fragmento de ADN genómico transportado pelo plasmideo pYG1224 corresponde de facto a um fragmento do gene PRBl de K. lactis. 24 Ε. 1.5 . Clonagem da parte 3' do gene. 0 fragmento BglII-EcoRI do plasmídeo pYG1224 contém um sítio de restrição Κρη I único localizado a jusante do sítio BglII (Fig. 6A) . Os subfragmentos de restrição Kpnl-EcoRI de aproximadamente 665 nucleótidos são assim produzidos a partir deste fragmento, isolados por eletroeluição após migração em gel de agarose a 1% e marcados radioactivamente pelo método do "random priming". Esta sonda radioactiva é depois utilizada para determinar o tamanho dos fragmentos de restrição do ADN genómico de K. lactis que o incluem. Um fragmento Kpnl-BglII de aproximadamente 1,2 kb é assim detectado após hibridação e lavagem em condições restringentes (hibridação durante 15 horas a 40 °C em 5X SSC/5X Denhart/50% de formamida, depois 3 lavagens em 5X SSC/1% de SDS a 40 °C durante 15 minutos, depois 1 lavagem em 0,2X SSC/1% de SDS durante 10 minutos). Uma biblioteca restrita de ADN genómico de K. lactis (fragmentos de restrição Kpnl-BglII de tamanho compreendido entre 1 e 1,5 kb) é depois construída de acordo com o Exemplo E.1.3. e o fragmento de restrição que híbrida com a sonda é clonado entre os sítios Kpnl e BamHI do vector pIC-20H, produzindo o plasmídeo pYG1231 (Fig. 6B) . A inserção genómica deste plasmídeo é depois sequenciada utilizando o oligodesoxinucleótido Sq2101 (5'-GACCTATGGGGTAAGGATTAC-3') como iniciador. Este oligodesoxinucleótido corresponde a uma sequência nucleotídica presente no fragmento BglII-EcoRI do plasmídeo pYG1224 e localizada a aproximadamente 30 nucleótidos do sítio EcoRI. Isto permite assim determinar a sequência nucleotídica situada a 3' deste sítio de restrição, e especialmente a sequência localizada entre o sítio EcoRI e o codão específico da terminação da tradução do ARN mensageiro correspondente ao gene PRB1 de K. lactis. 25 Ε.1.6. Clonagem da parte 5' do gene. A sequência nucleotídica produzida em E.1.5. demonstra a existência de um sitio de restrição Hindlll localizado entre o sitio EcoRI e o codão de terminação da tradução. A utilização do fragmento de restrição Kpnl-EcoRI correspondente à parte C-terminal do gene PRB1 de K. lactis como sonda radioactiva no ADN genómico de K. lactis digerido com HindiII e com uma segunda enzima permite identificar por transferência de Southern um fragmento HindiII-EcoRV de aproximadamente 1,7 kb que híbrida com esta sonda. Este fragmento de restrição é primeiro clonado entre os sítios EcoRV e Hindlll do vector pIC-20R produzindo assim o plasmídeo pYG1237. É realizado um mapa de restrição da inserção de ADN genómica contida no plasmídeo pYG1237 (Fig. 6C), e os seguintes plasmídeos são produzidos: pYG1238 (plasmídeo pYG1237 com o fragmento PstI removido), pYG1239 (fragmento PstI de pYG1237 no vector pUC19), pYG1240 (plasmídeo pYG1237 com o fragmento Kpnl removido), pYG1241 (plasmídeo pYG1237 com o fragmento Ciai removido) e pYG1242 (plasmídeo pYG1237 com o fragmento Sall removido; Fig. 6C) . As inserções genómicas destes diferentes plasmídeos são depois sequenciadas com ajuda de iniciadores universais e do oligodesoxinucleótido Sq2148 (5'-GCTTCGGCAACATATTCG-3') que permitem sequenciar a região situada imediatamente a 5' do sítio Bglll. Esta estratégia permite obter as sequências sobrepostas demonstrando a unicidade dos sítios de restrição Bglll, Ciai e PstI e permitindo identificar o ATG provável para iniciação da tradução do gene PRBl de K. lactis. 26 Ε.1.7. Sequência nucleotídica do gene PRB1 de K. lactis. A compilação das sequências determinadas em E.I.4., E.1.5 e E.1.6. recupera a integralidade da fase codificante do gene PRB1 de K. lactis (Fig. 6D). Esta sequência é denominada SEQ ID N° 1 e codifica uma proteína de 561 resíduos que correspondem à protease B de K. lactis. EXEMPLO 2: CLONAGEM DO GENE DA CARBOXIPEPTIDASE Y DE K. LACTIS. A estratégia geral descrita no Exemplo 1 é repetida para a clonagem do gene da carboxipeptidase y de K. lactis CBS 2359/152. E.2.1. Preparação da sonda. É primeiro realizada uma preparação de ADN genómico da estirpe S288C de S. cerevisiae [Mortimer e Johnston, Genetics 113 (1986) 35] de acordo com Exemplo E.1.2. É depois realizada uma amplificação por PCR desta preparação de ADN genómico com os oligonucleótidos 5' -CTTCTTGGAGTTGTTCTTCG-3' e 5' -TGGCAAGACATCCGTCCACGCCTTATT-ACC-3' , específicos do gene PRC1. Um fragmento amplificado do tamanho previsto (699 pb) é assim obtido que corresponde às posições 696-1395 (o codão de iniciação ATG que é numerado +1) da fase de leitura aberta do gene PRC1 de S. cerevisiae [Valls et al., Cell £8 (1987) 887]. Este fragmento é depois purificado por eletroeluição e marcado radioactivamente de acordo com a técnica de "Random Priming". 27 E.2.2. Clonagem do gene PRC1 de K. lactis. 0 gene PRC1 de K. lactis é obtido por rastreio da biblioteca genómica de K. lactis construída por Wesolowski-Louvel [Yeast 4_ (1988) 71] a partir da estirpe 2359/152 no vector de clonagem KEp6 [Chen et al., J. Basic. Microbiol. 28_ (1988) 211] . A estirpe JM101 de E. coli é transformada com o ADN da biblioteca e os transformantes são plaqueados em meio LB suplementado com ampicilina (50 mg/mL). Foram depois transferidos 15000 clones sobre filtros de nitrocelulose e os filtros são hibridados com a sonda descrita no Exemplo E.2.1. As condições de hibridação e de lavagem são aquelas do

Exemplo E.1.3. São assim isolados 12 clones positivos e um deles, designado pC34, é depois retido para continuação do estudo. Num primeiro exemplo, a hibridação do plasmídeo pC34 com a sonda correspondente ao gene PRC1 de S. cerevisiae é confirmada por transferência de Southern. Um mapa de restrição da inserção genómica (aproximadamente 6,9 kb) do plasmídeo pC34 é apresentado na Figura 8. A sequência do fragmento EcoRI-SalI de 2,5 kb compreendendo o gene PRC1 de K. lactis é depois determinada nas 2 cadeias. Essa sequência é apresentada em SEQ ID N° 2. EXEMPLO 3: CLONAGEM DO GENE DA PROTEASE A DE K. LACTIS. A estratégia geral descrita nos exemplos anteriores é repetida para a clonagem do gene da protease A de K. lactis CBS 2359/152. 28 Ε.3.1. Preparação da sonda.

Um fragmento interno de 44 9 pb do gene PRAl (ou gene PEP4) de S. cerevisiae é primeiro amplificado pela técnica de PCR a partir do plasmideo CBZIB1 [Woolford et al., Mol. Cell. Biol. _6 (1986) 2500] fornecido pelo Dr. E. Jones (Carnegie-Mellon University, Pittsburgh, Pensilvânia, EUA) e os oligodesoxinucleótidos 5'-CTGTTGATAAGGTGGTCC-3' e 5'-CAAGCGTGTAATCGTATGGC-3' . O fragmento amplificado obtido corresponde às posições 617-1066 da fase de leitura aberta do gene PRA1 de S. cerevisiae, o codão de iniciação ATG foi numerado +1. Este fragmento é depois purificado por eletroeluição e marcado radioactivamente de acordo com a técnica de "Random Priming". E.3.2. Clonagem do gene PRAl de K. lactis. O gene PRAl é obtido por rastreio da biblioteca genómica de K. lactis construída por Weselowski-Louvel [Yeast _4 (1988) 71] a partir da estirpe 2359/152 no vector de clonagem KEp6 [Chen et al., J. Basic Microbiol. _28_ (1988) 211]. Após transformação da biblioteca em E. coli JM101 e selecção na presença de ampicilina (50 mg/mL), 15000 clones são depois transferidos sobre filtros de nitrocelulose e os filtros são hibridados com a sonda descrita no Exemplo E.3.1. As condições de hibridação e de lavagem são aquelas do Exemplo E.1.3. 1 único clone positivo é assim isolado e designado pA25/l. Num primeiro exemplo, a hibridação do plasmideo pA25/l com a sonda correspondente ao gene PRAl de S. cerevisiae é confirmada por transferência de Southern. Um mapa de restrição da inserção genómica (aproximadamente 7,5 kb) deste plasmideo é representado na Figura 10. A sequência do fragmento Clal-EcoRI de 1,6 kb 29 compreendendo o gene PRA1 de K. lactis é depois determinada nas 2 cadeias. Esta sequência é apresentada na SEQ ID N° 3.

EXEMPLO 4: TRANSFORMAÇÃO DAS LEVEDURAS A transformação das leveduras pertencentes ao género Kluyveromyces, e em particular as estirpes MW98-8C, CBS 293.91 e CBS 294.91 (uraA) de K. lactis é realizada, por exemplo, através da técnica de tratamento de células inteiras com acetato de litio [Ito H. et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168], adaptado como se segue. 0 crescimento das células é realizado a 28 °C em 50 mL de meio YPD, com agitação e até uma densidade óptica a 600 nm (OD60o) compreendida entre 0,6 e 0,8; as células são então recolhidas por centrifugação a baixa velocidade, lavadas numa solução estéril de TE (10 mM de Tris HC1 pH 7,4; 1 mM de EDTA), ressuspensas em 3-4 mL de acetato de litio (0,1 M em TE) para obter uma densidade celular aproximada de 2xl08 células/mL, depois incubadas a 30 °C durante 1 hora com agitação moderada. Fracções de 0,1 mL da suspensão resultante de células competentes são incubadas a 30 °C durante 1 hora na presença de ADN e a uma concentração final de polietilenoglicol de 35% (PEG4ooor Sigma) . Após um choque térmico de 5 minutos a 42 °C, as células são lavadas duas vezes, depois ressuspensas em 0,2 mL de água estéril. No caso em que o marcador de selecção é o gene URA3 de S. cerevisiae, as células são directamente plaqueadas em YNB (Yeast Nitrogen Base; Difco)/glucose (20 g/L)/agar. No caso em que o marcador de selecção é o gene aph do transposão Tn903, as células são primeiro incubadas durante 16 horas a 28 °C em 2 mL de meio YPD para permitir a expressão fenotipica do gene de resistência a G418 expresso sob controlo do promotor Pki (ver documento EP 361991); 200 pL da suspensão celular são depois plaqueados em placas YPD selectivas 30 (G418, 200 pg/mL) . As placas são incubadas a 28 °C e os clones com interrupções ou os transformantes aparecem após 2 a 3 dias de crescimento celular. EXEMPLO 5: INTERRUPÇÃO DE GENES DE PROTEASES EM K. LACTIS. E.5.1. Estirpes de K. lactis com o gene PRB1 interrompido.

O plasmideo pYG1229 é construído por clonagem do fragmento HindIII-EcoRI (incluindo o fragmento BglII-EcoRI de aproximadamente 700 pb e correspondente à parte C-terminal do gene PRB1 de K. lactis) do plasmideo pYG1224 entre os sítios correspondentes do plasmideo pUC9. O plasmideo pYG1228 é construído por clonagem do fragmento HindiII de 1,1 kb e correspondente ao gene URA3 de S. cerevisiae proveniente do plasmideo pCG3 [Gerbaud et al., Curr. Genetics 3 (1981) 173] no sítio Hindlll do plasmideo plC-20R. O plasmideo pYG1228 permite assim dispor de um fragmento de restrição Sall-Xhol de aproximadamente 1,1 kb e contendo a integralidade do fragmento Hindlll contendo o gene URA3 de S. cerevisiae. Este fragmento de restrição é depois clonado no sítio Sall do plasmideo pYG1229 produzindo o plasmideo pYG1232 (2 orientações possíveis). A digestão deste plasmideo com as enzimas BglII e EcoRl permite produzir um fragmento de restrição de aproximadamente 1,8 kb correspondente ao gene URA3 de S. cerevisiae flanqueado pelas sequências genómicas de K. lactis provenientes do gene PRB1 (Fig. 11A) . A transformação dos mutantes uraA de K. lactis pelo fragmento Bglll-EcoRl do plasmideo pYG1232 produz os clones transformados (complementados pelo gene URA3 de S. cerevisiae) correspondentes à integração deste fragmento no cromossoma. O painel B da Figura 11 mostra a integração deste fragmento no ADN genómico da estirpe CBS 294.91 {uraA) de K. lactis após 31 recombinação não homóloga (poço 1) ou após recombinação homóloga no gene PRB1 (poço 3, esta interrupção é anotada Y750) . A interrupção do alelo selvagem do gene PRB1 não modifica as características do crescimento da estirpe. E.5.2. Estirpes de K. lactis interrompidas pelo gene PRC1. 0 fragmento Sall-Sphl de 4,4 kb proveniente do plasmídeo pC34 é primeiro subclonado nos sítios correspondentes do vector pIC-20R, produzindo o plasmídeo pYG154 (Fig. 12, painel b) . Este plasmídeo é depois digerido com a enzima Sphl, depois tratada com a ADN polimerase I do fago T4 na presença de fosfatase intestinal de vitela (CIP) . 0 plasmídeo obtido é ligado depois ao fragmento EcoRI de 1,6 kb contendo o gene URA3 de S. cerevisiae proveniente do plasmídeo pKan707 (documento EP 361 991), previamente tratado com o fragmento Klenow da ADN polimerase I de E. coli. 0 plasmídeo obtido é designado pYG155 (Fig. 12, painel c). 0 fragmento SalI-BamHI de 4,5 kb do plasmídeo pYG155 é depois purificado através de eletroeluição e utilizado para transformar a estirpe CBS 294.91 de K. lactis (uraA). Os transformantes são seleccionados para o fenótipo Ura+ e alguns clones são depois analisados por transferência de Southern para verificar o sítio de integração do marcador URA3. 0 clone Y797 é assim identificado no qual o gene PRC1 cromossómico foi substituído por recombinação homóloga pelo alelo interrompido construído in vítro. A interrupção do alelo selvagem do gene PRC1 não modifica as características do crescimento da estirpe. 32 EXEMPLO 6: PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO. E.6.1. Plasmídeo pYG1212.

Os genes das proteínas de interesse que é desejado segregar e/ou expressar são primeiro introduzidos, "na orientação produtiva" (definida como a orientação que coloca a região N-terminal da proteína de modo proximal relativamente ao promotor da transcrição), sob controlo de promotores funcionais reguláveis ou constitutivos tais como, por exemplo, aqueles presentes nos plasmídeos pYG105 (promotor LAC4 de K. lactis), pYG106 (promotor PGK de S. cerevisiae), pYG536 (promotor PH05 de S. cerevisiae), ou promotores híbridos tais como aqueles descritos no pedido de patente EP 361991. Os plasmídeos pYG105 e pYG106 são particularmente úteis porque permitem a expressão de genes incluídos nos fragmentos de restrição HindiII a partir de promotores funcionais em K. lactis, reguláveis (pYG105) ou constitutivos (pYG106). 0 plasmídeo pYG105 corresponde ao plasmídeo pKan707 descrito no pedido de patente EP 361991 no qual o sítio de restrição HíndIII único e localizado no gene de resistência à geneticina (G418) foi destruído por mutagénese dirigida, conservando uma proteína inalterada (oligodesoxinucleótido 5'-GAAATGCATAAGCTCTTGCCATTCTCACCG-3'). 0 fragmento SalI-SacI que codifica o gene URA3 do plasmídeo assim mutado foi depois substituído por um fragmento de restrição SalI-SacI contendo uma cassete de expressão constituída pelo promotor LAC4 de K. lactis [na forma de um fragmento SalI-HindIII proveniente do plasmídeo pYG1075; Fleer et al., Bio/Technology 9 (1991) 968]) e do terminador do gene PGK de S. cerevisiae [na forma de um fragmento HindIII-SacI; Fleer et al., Bio/Technology 2 (1991) 968]. 0 plasmídeo pYG105 é mitoticamente muito estável em 33 leveduras Kluyveromyces e um mapa de restrição é apresentado na Figura 13. Os plasmídeos pYG105 e pYG106 diferem apenas na natureza do promotor de transcrição codificado pelo fragmento SalI-HindlII. A proteina codificada pelo plasmideo pYG1212 corresponde aproximadamente aos dois primeiros domínios da albumina sérica humana (SAH). Esta variante molecular, obtida por digestão da extremidade C-terminal da SAH utilizando a exonuclease Bal31 a partir do sítio MstII único localizado a 3 aminoácidos da extremidade C-terminal da SAH, é derivada do plasmideo YP40 descrito no pedido de patente EP 413622. Resumidamente, o fragmento de restrição HindIII-MstII do plasmideo YP40, correspondendo aos resíduos 1 a 403 de SAH (o ATG de iniciação da tradução é anotado +1), é ligado com o fragmento MstII-HíndIII do plasmideo pYG221 [Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_9 (1992) 1904], produzindo um fragmento HindIII incluindo os 403 resíduos do N-terminal de SAH seguidos dos três últimos resíduos da SAH (resíduos leu-Gly-Leu) e de um codão de fim de tradução [variante truncada anotada SAH(i-403)]. O fragmento HindIII é depois clonado na orientação produtiva no plasmideo pYG105, produzindo o plasmideo pYG1212 (Fig. 13). EXEMPLO 7: POTENCIAL DE SECREÇÃO DOS INTERROMPIDOS. E.7.1. HSA(1-403) num interrompido para a protease B.

Numa primeira fase, as leveduras K. Lactis CBS 293.91 e Y750 são transformadas com o plasmideo pYG1212. Após selecção em meio rico suplementado com G418, os clones recombinantes são testados para a sua capacidade de segregar a proteína HSA(1_403) . Alguns clones são incubados em meio YPD ou YPL a 28 °C. Os 34 sobrenadantes de cultura são recuperados por centrifugação quando as células alcançam a fase estacionária do crescimento, concentrados 10 vezes por precipitação durante 30 minutos a -20 °C numa concentração final de etanol de 60%, depois testados após electroforese em gel de SDS-PAGE a 8,5% e coloração do gel por azul de coomassie. Os resultados apresentados na Figura 14 demonstram que o interrompido Y750 (prbl°) segrega quantidades de proteína que são bem superiores às quantidades segregadas pelo seu homólogo não interrompido. Isto é válido após 2, 4 ou 7 dias de crescimento, independentemente da fonte de carbono utilizada (glucose ou lactose).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (A) REQUERENTE: (A) NOME: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) RUA: 20, avenue Raymond ARON

(C) CIDADE: ANTONY © PAIS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Leveduras Kluyveromyces modificadas, preparação e utilizações. (iii) NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 3 (iv) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível 35

©SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D)PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1686 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico © TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Kluyveromyces lactis (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1...1686 © OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "Gene da protease B" /gene= "K1.PRB1" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: GAA AAT ACA Glu Asn Thr 5 TTG GTT ATC Leu Vai Xle 20 TTA TTG ACT ATA ACC GCA TTG TCT ACC GTG 48 Leu Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Thr Vai 10 15 CCT GAA GTT AAT AGG GAA AAC AAG CAT GGT 96 Pro Glu Vai Asn Arg Glu Asn Lys His Gly 25 30 ATG AAG TTC Met Lys Phe 1 GCT ACT GCT Ala Thr Ala 36 GAC AAG AGC GTT GCC ATC AAA GAT CAT GCT TCT TCT GAT TTG GAT AAG 144 Asp Lys Ser Vai Ala Ile Lys Asp His Ala Ser Ser Asp Leu Asp Lys 35 40 45 CCT CAA CAT CAT GCT AAT GGC AAG GCT CGT TCT AAG TCT CGT GGT CGC 192 Pro Gin Kis His Ala Asn Gly Lys Ala Arg Ser Lys Ser Arg Gly Arg 50 55 60 TGC GCA GAC TCC AAG AAA TTC GAC AAG CTA CGT CCA GTC GAC GAT GCT 240 Cys Ala Asp Ser Lys Lys Phe ASP Lys Leu Arg Pro Val Asp Asp Ala S5 70 75 80 TCA GCT ATT TTà GCT CCA CTT TCT ACA GTT AAT GAT ATT GCC AAC AAG 288 Ser Ala Ile Leu Ala Pro Leu Ser Thr Val Asn Asp lie Ala Asn Lys 85 90 95 ATT CCT AAT CGT TAC ATC ATT GTC TTT AAG AAA GAT GCC TCT GCA GAT 336 Ile Pro Asn Arg Tyr lie Ile Val Phe Lys Lys Asp Ala Ser Ala Asp 100 105 110 GAA GTG AAG TTC CAT CAA GAA CTA GTC TCT GTC GAA CAT GCC AAG GCA 384 Glu Vai Lys Phe His Gin Glu Leu Val Ser Val Glu His Ala Lys Ala 115 120 125 CTA GGT TCC TTA GCT GAC CAT GAC CCA TTC TTC ACA GCA ACT TCC GGT 432 Leu Gly Ser Leu Ala Asp His Asp Pro Phe Phe Thr Ala Thr Ser Gly 130 135 140 GAA CAT AGT GAA TTT GGT GTC AAA GCA CAC TCT TTG GAA GGT GGT ATT 480 Glu His Ser Glu Phe Gly Val Lys Ala His Ser Leu Glu Gly Gly Ile 145 150 155 160 CAA GAC TCT TTT GAT ATT GCC GGT TCC CTT TCT GGT TAT GTT GGC TAC 528 Gin Asp Ser Phe Asp lie Ala Gly Ser Leu Ser Gly Tyr Val Gly Tyr 165 170 175 TTC ACA AAA GAA GTT ATC GAT TTC ATC AGA AGA AGC CCA TTG GTT GAA 576 Phe Thr Lys Glu Val Ile Asp Phe Ile Arg Arg Ser Pro Leu Val Glu 160 185 190 TTT GTT GAA GAA GAT TCT ATG GTT TTC TCT AAT AGT TTC AAT ACC CAA 624 Phe Vai Glu Glu Asp Ser Met val Phe Ser Asn Ser Phe Asn Thr Gin 195 200 205 AAC AGT GCT CCT TGG GGT CTA GCT CGT ATT TCT CAT CGT GAA AAG TTG 672 Asn Ser Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Glu Lys Leu 210 215 220 AAT TTA GGA TCT TTC AAC AAG TAC TTG TAT GAT GAT GAC GCT GGT AAA 720 Asn Leu Gly Ser Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp Asp Ala Gly Lys 225 230 235 240 GGT GTT ACT GCT TAC GTT GTT GAC ACT GGT GTC AAT GTC AAC CAT AAG 768 Gly val Thr Ala Tyr Val Val Asp Thr Gly Val Asn Val Asn His Lys 245 250 255 GAC TTT GAT GGC AGA GCT GTT TGG GGT AAG ACT ATT CCA AAA GAT GAT 816 Asp Phe Asp Gly Arg Ala Val Trp Gly Lys Thr Ile Pro Lys Asp Asp 260 265 270 37 CCA GAT GTA GAT GGA AAT GGT CAC GGT ACC CAC TGT GCT GGT ACC ATC 864

Pro Asp Vai Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Ile 275 280 285 GGT TCG GTT CAT TAT GGT GTT GCT AAG AAT GCT GAT ATA GTT GCC GTT 912

Gly Ser Vai His Tyr Gly Vai Ala Lys Asn Ala Asp Ile Vai Ala Vai 290 295 300 AAG GTT TTG AGA TCT AAT GGT TCT GGT ACC ATG TCT GAT GTT GTT AAA 960

Lys Vai Leu Arg Ser Asn Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Vai Vai Lys 305 310 315 320 GGT GTC GAA TAT GTT GCC GAA GCA CAC AAG AAA GCT GTT GAA GAA CAA 1008

Gly Vai Glu Tyr Vai Ala Glu Ala His Lys Lys Ala Vai Glu Glu Gin 325 330 335 AAG AAA GGG TTC AAG GGT TCA ACT GCT AAC ATG TCT TTG GGT GGT GGT 1056

Lys Lys Gly Phe Lys Gly Ser Thr Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly 340 345 350 AAA TCT CCA GCC TTG GAT TTG GCC GTC AAC GCC GCT GTT AAG GCA GGT 1104

Lys Ser Pro Ala Leu Asp Leu Ala vai Asn Ala Ala Vai Lys Ala Gly 355 360 365 GTT CAT TTT GCT GTT GCT GCC GGT AAT GAG AAC CAA GAT GCT TGT AAC 1152

Vai His Phe Ala Vai Ala Ala Gly Asn Glu Asn Gin Asp Ala Cys Asn 370 375 380 ACT TCG CCT GCC GCG GCT GAG AAT GCT ATC ACG GTT GGT GCC TCC AÇA 1200

Thr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Asn Ala lie Thr Vai Gly Ala Ser Thr 385 390 395 400 ΊΤΑ AGT GAT GAA AGA GCT TAC TTT TCC AAT TGG GGT AAA TGT GTC GAC 1248

Leu Ser Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Trp Gly Lys Cys Vai Asp 405 410 415 ATC TTT GGT CCG GGT TTG AAT ATC TTA TCT ACC TAC ATT GGT TCT GAT 1296

Ile Phe Gly Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asp 420 425 430 ACT GCT ACT GCT ACC TTG TCT GGT ACT TCT ATG GCC ACT CCT CAT GTT 1344

Thr Ala Thr Ala Thr Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Vai 435 440 445 GTC GGT TTG CTA ACA TAT TTC TTG TCC TTG CAA CCA GAT GCT GAT AGT 1392

Vai Gly Leu Leu Thr Tyr Phe Leu Ser Leu Gin Pro Asp Ala Asp Ser 450 455 460 GAA TAT TTC CAT GCC GCT GGC GGT ATT ACT CCT TCC CAA CTC AAG AAG 1440

Glu Tyr Phe His Ala Ala Gly Gly Ile Thr Pro Ser Gin Leu Lys Lys 465 470 475 480 AAG TTA ATT GAT TTC TCT ACT AAG AAC GTA TTG TCC GAT CTA CCT GAA 1488

Lys Leu Ile Asp Phe Ser Thr Lys Asn Vai Leu Ser Asp Leu Pro Glu 465 490 495 GAT ACC GTG AAC TAC TTG ATT TAC AAC GGT GGT GGT CAA GAT TTG GAT 1536

Asp Thr Vai Asn Tyr Leu Ile Tyr Asn Gly Gly Gly Gin Asp Leu Asp 500 505 510 38 GAC CTA TGG GGT AAG GAT TAC TCT ATT GGA AAA GAA CCA TCT GCC AAC 1584 Asp Leu Trp Gly Lys Asp Tyr Ser Ile Gly Lys Glu Pro Ser Ala Asn 515 520 525 CCT GAA TTC AGC TTG GAA AGC TTG ATT AAC TCT TTG GAT TCA AAG ACT 1632 Pro Glu Phe Ser Leu Glu Ser Leu Ile Asn Ser Leu Asp Ser Lys Thr 530 535 540 GAT GCT ATC TTT GAC GAC GTT AGA CAG TTG TTG GAC CAA TTT AAT ATC 1680 Asp Ala Ile Phe Asp Asp Vai Arg Gin Leu Leu Asp Gin Phe Asn Ile 545 550 555 560 ATC ΤΑ 1686

Ile (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2503 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico © TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Kluyveromyces lactis (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 387...1862 © OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "Gene da protease C de K. lactis" /gene= "K1.PRC1" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2: 39 GAATTCTGTC AACTGGATAC GGAAGACAAT AGAATGGACA CATAATGGTC TCAATACGAC 60 AATTCAACGG CTCTTAGAAG GTGAGTTATT CTTGACATTT TCATGGCTCT TCGAGCATGC 120 TTTCTAAGAT GACGCGGAAG GTGAAAAAGA TTAGAAAACG GCCATTCACG TGAATATCAC 180 GTGAACTACA AATTCATGAT ATATTACCGC CAATAGTATT GGTGGTTACC CGATCGTATC 240 GAATGTACTG ACTTCGAAAA TATGAATAGT CCTCTTTAAA ACAAAGGGTT TTCAGTGACC 300 CTTACTCCAT CATCTCCTTA GTATTTGGTC TACAGACTCG CCATTGCCGT ATATTCAGGG 360 TAGTAGTCAG TACATCGGTG TCTGCC ATG Met 1 GTT TCG ATA AAG TTT CTT TTA TCT Vai Ser lie Lys Phe Leu Leu Ser 5 413 TTA TAC GGC TGG CTA TCT GTC ACT TTA GCC , ATC TCG TTG AAT GCC GTT 461 Leu Tvr Gly Trp Leu Ser Val Thr Leu Ala Ile Ser Leu Asn Ala Val 10 15 20 25 GTT GAT AGT TTA TTC TCG AAC AGT TTC GAC GGG AAT AAC AAC ATC GAG 509 val Asp Ser Leu Phe Ser Asn Ser Phe Asp Gly Asn Asn Asn Ile Glu 30 35 40 GAT CAT GAA ACT GCA AAT TAT AAC ACT CAG TTT AGT GTC TTC AGC TCA 557 Asp His Glu Thr Ala Asn Tyr Asn Thr Gin Phe Ser Val Phe Ser ser 45 50 55 AAT ATT GAC GAC GCT TAT TCA TTG AGA ATT AAA CCT TTG GAT CCC AAA 605 Asn Ile Asp Asp Ala Tyr Ser Leu Arg Ile Lys Pro Leu Asp Pro Lys 60 65 70 TCT CTT GGC GTT GAT ACC GTG AAA CAA TGG TCG GGA TAT TTA GAT TAC 653 Ser Leu Gly Val Asp Thr Val Lys Gin Trp Ser Gly Tyr Leu Asp Tyr 75 80 85 CAG GAC TCA AAA CAC TTC TTT TAT TGG TTT TTT GAG TCT AGA AAT GAC 701 Gin Asp Ser Lys Hls Phe Phe Tyr Trp Phe Phe GlU Ser Arg Asn Asp 90 95 100 105 CCA GAG AAT GAC CCA GTG ATA CTA TGG TTA AAC GGT GGT CCT GGC TGT 749 Pro Glu Asn Asp Pro Val Ile Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys 110 115 120 TCC TCT TTC GTC GGT CTT TTC TTT GAA TTG GGA CCT TCT TCT ATA GGA 797 Ser Ser Phe Val Gly Leu Phe Phe Glu Leu Gly Pro Ser Ser Ile Gly 125 130 135 GCT GAT TTG AAA CCC ATT TAT AAC CCC TAC TCT TGG AAT TCC AAC GCT 845 Ala Asp Leu Lys Pro Ile Tyr Asn Pro Tyr Ser Trp Asn Ser Asn Ala 140 145 150 TCT GTG ATA TTC CTA GAT CAG CCT GTT GGT GTT GGG TTC TCA TAC GGT 893 Ser Val Ile Phe Leu Asp Gin Pro Val Gly Val Gly Phe Ser Tyr Gly 155 160 165 GAC TCT AAA GTG TCT ACT ACA GAT GAC GCT GCC AAA GAC GTT TAC ATA 941 Asp Ser Lys Val Ser Thr Thr Asp Asp Ala Ala Lys Asp Val Tyr Ile 170 175 180 185 TTC TTA GAT TTG TTC TTT GAA AGA TTC CCT CAT TTG AGA AAT AAC GAT 989 Phe Leu Asp Leu Phe Phe Glu Arg Phe Pro His Leu Arg Asn Asn Asp 190 195 200 40 TTC CAT ATC TCC GGT GAA TCA TAC GCC GGT CAT TAT TTA CCC AAG ATT 1037 Phe His Ile Ser Gly Glu Ser Tyr Ala Gly His Tyr Leu Pro Lys Ile 205 210 215 GCT CAT GAG ATT GCT GTA GTG CAT GCT GAG GAT TCC TCC TTC AAT CTA 1085 Ala His Glu Ile Ala Vai Vai His Ala Glu Asp Ser Ser Phe Asn Leu 220 225 230 TCG TCA GTA TTA ATT GGA AAT GGA TTT ACT GAC CCA CTG ACT CAA TAC 1133 Ser Ser Vai Leu Ile Gly Asn Gly Phe Thr Asp Pro Leu Thr Gin Tyr 235 240 245 CAA TAT TAC GAG CCG ATG GCC TGT GGT GAA GGT GGT TAT CCA GCG GTG 1181 Gin Tyr Tyr Glu Pro Met Ala Cys Gly Glu Gly Gly Tyr Pro Ala Vai 250 255 260 265 TTG GAA CCG GAA GAT TGC TTA GAT ATG AAT AGG AAT CTA CCT CTA TGC 1229 Leu Glu Pro Glu Asp Cys Leu Asp Met Asn Arg Asn Leu Pro Leu Cys 270 275 280 CTA TCG CTT GTG GAC CGC TGT TAC AAG TCC CAT TCT GTT TTC TCT TGT 1277 Leu Ser Leu Vai Asp Arg Cys Tyr Lys Ser His Ser Vai Phe Ser Cys 285 290 295 GTG TTG GCT GAC CGT TAT TGT GAA CAA CAG ATT ACT GGG GTT TAT GAG 1325 Vai Leu Ala Asp Arg Tyr Cys Glu Gin Gin Ile Thr Gly Vai Tyr Glu 300 305 310 AAA TCA GGT AGG AAC CCT TAC GAT ATT AGA TCT AAG TGT GAA GCA GAG 1373 Lys Ser Gly Arg Asn Pro Tyr Asp Ile Arg Ser Lys Cys Glu Ala Glu 315 320 325 GAT GAT TCC GGT GCC TGT TAT CAG GAA GAA ATT TAT ATC TCT GAT TAC 1421 Asp Asp Ser Gly Ala Cys Tyr Gin Glu Glu Ile Tyr Ile Ser Asp Tyr 330 335 340 345 TTG AAT CAG GAG GAA GTT CAA AGA GCT TTA GGG ACT GAT GTG AGT TCT 1469 Leu Asn Gin Glu Glu Vai Gin Arg Ala Leu Gly Thr Asp Vai Ser Ser 350 355 360 TTC CAA GGT TGT AGC TCG GAT GTC GGT ATC GGT TTC GCA TTC ACT GGC 1517 Phe Gin Gly Cys Ser Ser Asp Vai Gly Ile Gly Phe Ala Phe Thr Gly 365 370 375 GAT GGA CCG AGC CCA TTC CAC CAG TAC GTC GCA GAA CTT CTT GAT CAA 1565 Asp Gly Pro Ser Pro Phe His Gin Tyr Vai Ala Glu Leu Leu Asp Gin 380 385 390 GAT ATC AAT GTC TTG ATA TAT GCA GGC GAT AAG GAT TAT ATT TGT AAT 1613 Asp Ile Asn Vai Leu Ile Tyr Ala Gly Asp Lys Asp Tyr Ile Cys Asn 395 400 405 TGG CTA GGA AAT CTC GCT TGG ACT GAA AAA TTG GAA TGG AGG TAT AAC 1661 Trp Leu Gly Asn Leu Ala Trp Thr Glu Lys Leu Glu Trp Arg Tyr Asn 410 415 420 425 GAA GAG TAT AAA AAA CAA GTT TTG AGA ACT TGG AAG AGT GAA GAA ACA 1709 Glu GlU Tyr Lys Lys Gin Vai Leu Arg Thr Trp Lys Ser Glu Glu Thr 430 435 440 GAT GAG ACC ATT GGC GAA ACC AAA TCT TAT GGC CCG CTA ACT TAC TTG 1757 Asp Glu Thr Ile Gly Glu Thr Lys Ser Tyr Gly Pro Leu Thr Tyr Leu 445 450 455 41 AGA ATC TAT GAT GCT GGA CAC ATG GTT CCT CAC GAC CAA CCT GAA AAT 1805

Arg Ile Tyr Asp Ala Gly His Met Vai Pro His Asp Gin Pro Glu Asn 460 465 470 TCA TTA CAA ATG GTG AAT TCA TGG ATT CAG AAT ATC GCA AAG AGA TCT 1853

Ser Leu Gin Met Vai Asn Ser Trp lie Gin Asn lie Ala Lys Arg Ser 475 480 485 AGA ATA TAAGCATATT TCTTTACAAT TAATTTTAAA TACAAGCACC CTGAGGTATA 1909

Arg Ile 490 TACTGTATGC AGTTTGTTGC ATATCTATCA TTTCTTTCGC AATTGTTCAC TTTTGATTCA 1969 TTCTGTACAC TCTAATAAGG TTTTGCAACC TAGTAATGAT TTCCACACAT TCTTCAGCCG 2029 ACACAGCTTC GAAATAATAT CTCCGTTCTC TATCAGGTCT GTGAACAAAA ATCTTGAAAT 2089 ATTCTGGAAC GCGCTTAGAC CTTTTCACCA GGGTAATTTG GCTTATATGG AACGATTTCG 2149 TCTTGACGTT TTCGTGTGTC CAATTGAAAT CACCATCAGG CCCACTTATA TAAACGTAGT 2209 CACCATCAAT GACCAACATC CTCTCGTGTT TATTGATGAA TGACATTTGT TGTCTTCTCC 2269 ATACCTTATA TTTATAGTAG GAACCAGCAA AGAGATCTTT GTAACTGTTA TTTCCAGAAA 2329 CGTTATTTGA TGGTTTGGAT AAACTCCCAA GTTTAGGAGA TTTCTGGCCA TTGTTGAGAG 2389 AAGATTTTGA GGAATTTTTG AGTTTAAAAA AGCCAGAGGT AGAGGAAGAT GTGTTATGCT 2449 GCTTGTTGAT ACTGAATAAA TTCTTTGAGC TTGTTCTGTT CGAGGTTGGT CGAC 2503 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1615 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico © TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Kluyveromyces 42 (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 188..1417 (C) OUTRAS INFORMAÇÕES: /produto = "Gene da protease A" /gene= "PRA1" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: ATCGATAATA GAAGTGTTGA CATAACTATA TTAAAGACAG GGTAGACGGT CAGATATATA 60 GTAGTGTCAG TATTTTGAAC GGAGAGGAAC TTGATTAAAT CTATTATACA GTTTCCCCCA 120 AAATTTTTCT GAAATTGTGC CGCTAACTGT TCATTAAACG GTGCTTTCTT ACAACAAAAA 180 AATAAGC ATG CAT TTG AAT TTC CAA TCT CTT TTG CCT CTA GCT TCA TTG 229 Met Hls Leu Asn Phe Gin Ser Leu Leu Pro Leu Ala Ser Leu 1 5 10 TTA TTG GCT TCT TTT GAT GTT GCT GAA GCC AAG ATT CAT AAG GCC AAA 277 Leu Leu Ala Ser Phe Asp Vai Ala Glu Ala Lys Ile His Lys Ala Lys 15 20 25 30 ATT CAA AAA CAT AAA TTG GAA GAC CAA TTG AAG GAT GTT CCA TTT GCC 325 Ile Gin Lys His Lys Leu Glu Asp Gin Leu Lys Asp Val Pro Phe Ala 35 40 45 GAA CAT GTG GCT CAA CTA GGT GAA AAG TAC TTA AAT AGC TTC CAA AGA 373 Glu Hls Vai Ala Gin Leu Gly Glu Lys Tyr Leu Asn Ser Phe Gin Arg 50 55 60 GCT TAC CCT CAA GAA TCT TTC TCT AAG GAT AAC GTT GAT GTT TTC GTT 421 Ala Tyr Pro Gin Glu Ser Phe Ser Lys Asp Asn Val Asp Val Phe Val 65 70 75 GCC CCA GAA GGG TCT CAC AGT GTC CCA TTG ACC AAT TAC TTG AAT GCT 469 Ala Pro Glu Gly Ser His Ser val Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asn Ala 80 85 90 CAG TAT TTC ACA GAA ATT ACT TTG GGT TCG CCA CCA CAG TCT TTT AAG 517 Gin Tyr Phe Thr Glu Ile Thr Leu Gly Ser Pro Pro Gin Ser Phe Lys 95 100 105 110 GTT ATC TTA GAC ACT GGT TCA TCA AAC TTG TGG GTT CCA AGT GCA GAA 565 Vai Ile Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ala Glu 115 120 125 TGT GGT TCT TTG GCA TGT TTC TTG CAC ACC AAA TAT GAC CAT GAG GCT 613 Cys Gly Ser Leu Ala Cys Phe Leu HIS Thr Lys Tyr Asp His Glu Ala 130 135 140 TCT AGC ACT TAC AAA GCT AAT GGT TCC GAG TTT GCT ATC CAA TAT GGT 661 Ser Ser Thr Tyr Lys Ala Asn Gly Ser Glu Phe Ala Ile Gin Tyr Gly 145 150 155 43 TCT GGT TCC CTT GAA GGA TAT GTG TCT CGT GAT TTG TTG ACC ATT GGG 709 Ser Gly Ser Leu Glu Gly Tyr Vai Ser Arg Asp Leu Leu Thr Ile Gly 160 165 170 GAT TTA GTG ATA CCT GAC CAG GAT TTC GCT GAA GCT ACC AGC GAA CCA 757 Asp Leu Vai Ile Pro Asp Gin Asp Phe Ala Glu Ala Thr Ser Gltí Pro 175 180 185 190 GGT TTG GCA TTT GCC TTT GGT AAA TTC GAT GGT ATT TTG GGG TTG GCT 805 Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Lys Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala 195 200 205 TAC GAC TCC ATC TCT GTT AAC AGA ATC GTT CCA CCA GTG TAC AAC GCT 853 Tyr Asp Ser Xle Ser Vai Asn Arg Ile Vai Pro Pro Vai Tyr Asn Ala 210 215 220 ATC AAA AAC AAA CTT TTG GAT GAC CCA GTG TTT GCC TTT TAC TTG GGT 901 Ile Lys Asn Lys Leu Leu Asp Asp Pro Vai Phe Ala Phe Tyr Leu Gly 225 230 235 GAT TCT GAC AAG TCT GAA GAT GGC GGT GAA GCT TCC TTC GGT GGT ATC 949 Asp Ser Asp Lys Ser Glu Asp Gly Gly Glu Ala Ser Phe Gly Gly Ile 240 245 250 GAT GAG GAG AAG TAC ACC GGT GAA ATC ACT TGG TTG CCT GTT CGT CGT 997 Asp Glu Glu Lys Tyr Thr Gly Glu Ile Thr Trp Leu Pro val Arg Arg 255 260 265 270 AAG GCT TAC TGG GAA GTC AAG rjwpíp GAA GGT ATC GGT TTG GGT GAA GAA 1045 Lys Ala Tyr Trp Glu Vai Lys Phe Glu Gly Ile Gly Leu Gly Glu Glu 275 280 285 TAT GCT ACT TTA GAA GGT CAT GGT GCT GCT ATC GAC ACC GGT ACC TCT 1093 Tyr Ala Thr Leu Glu Gly His Gly Ala Ala Ile Asp Thr Gly Thr Ser 290 295 300 TTG ATT GCT TTG CCA AGC GGT TTG GCT GAA ATT TTG AAC GCT GAA ATC 1141 Leu Ile Ala Leu Pro Ser Gly Leu Ala Glu Ile Leu Asn Ala Glu Ile 305 310 315 GGT GCA AAG AAG GGC TGG TCT GGT CAA TAC TCC GTT GAT TGT GAA TCT 1189 Gly Ala Lys Lys Gly Trp Ser Gly Gin Tyr Ser Vai Asp Cys Glu Ser 320 325 330 AGA GAT AGT CTA CCA GAC TTA ACT TTG AAT TTC AAC GGT TAC AAC TTC 1237 Arg Asp Ser Leu Pro Asp Leu Thr Leu Asn Phe Asn Gly Tyr Asn Phe 335 340 345 350 ACT ATT ACC GCA TAC GAT TAC ACT TTG GAA GTC TCT GGG TCT TGT ATC 1285 Thr ile Thr Ala Tyr Asp Tyr Thr Leu Glu Vai Ser Gly Ser Cys Ile 355 360 365 TCT GCA TTC ACT CCA ATG GAC TTC CCA GAA CCA GTT GGT CCC TTG GCC 1333 Ser Ala Phe Thr Pro Met Asp Phe Pro Glu Pro Vai Gly Pro Leu Ala 370 375 380 ATT ATT GGT GAT GCC TTC CTA CGT AAA TAC TAC TCC ATT TAT GAT ATT 1381 Ile Ile Gly Asp Ala Phe Leu Arg Lys Tyr Tyr Ser Ile Tyr Asp Ile 385 390 395 44 GGT CAT GAT GCA GTT GGT TTG GCC AAG GCT GCC TAATTGTTAA AAAAGCGATC 1434

Gly His Asp Ala Vai Gly Leu Ala Lys Ala Ala 400 405 410 GAATTGTAAC CTTTTGAATT GGAGTTCAGC TTCTATTAAC TCGACAACTC TAAAAAAATA 1494 ATTAAATAAG ACGGTTAACT TACTGCTATA TTAATTGAAT GTCAGTTTCA CAAATCGAAT 1554 TAGCTAACAA AGTATAACAA CACTTGGTGA CAAATAAACC TTAAAATACC TGGCAGAATT 1614 C 1615

Lisboa, 27 de Agosto de 2007

REIVINDICAÇÕES 45

Claims (18)

1. Levedura do género Kluyveromyces apresentando uma ou mais modificações genéticas de, pelo menos, um gene que codifica uma protease escolhida de entre a protease A representada pela sequência polipeptidica SEQ ID N° 3, a protease B representada pela sequência polipeptidica SEQ ID N° 1 e a carboxipeptidase Y, representada pela sequência SEQ ID N° 2, em que as referidas modificações genéticas diminuem a actividade proteolítica das referidas leveduras.

2. Levedura de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por a ou as modificações genéticas tornarem o referido gene parcialmente ou totalmente incapaz de codificar a proteína natural.

3. Levedura de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por o ou os genes assim modificados geneticamente codificarem uma proteína não funcional ou um mutante possuindo um espectro de actividade proteolítica modificado.

4. Levedura de acordo com as reivindicações 1 a 3 caracterizada por a ou as modificações genéticas serem segregacionalmente estáveis.

5. Levedura de acordo com as reivindicações 1 a 4 caracterizada por a ou as modificações genéticas serem não reversíveis.

6. Levedura de acordo com as reivindicações 1 a 5 caracterizada por a ou as modificações genéticas não deixarem nenhuma actividade residual ao gene considerado.

7. Levedura de acordo com as reivindicações 1 a 6 caracterizada por a ou as modificações estarem contidas na parte codificante para a proteína que possui uma actividade de protease e/ou nas regiões responsáveis da expressão e/ou da regulação transcripcional dos referidos genes. Levedura de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 caracterizada por a ou as modificações genéticas serem mutações pontuais ou múltiplas e/ou adições e/ou delecções e/ou interrupções. Levedura de acordo com umas das reivindicações 1 a 8 caracterizada por se tratar de um gene de Kluyveromyces escolhido de entre os genes PRB1 (SEQ ID N°l), PRC1 (SEQ ID N° 2) e PRAl (SEQ ID N° 3) .

10. Levedura de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9 caracterizada por ser escolhida de entre as leveduras pertencentes às espécies K. lactis, K. fragilis, K. drosophilarum e K. waltii.

11. Levedura do género Kluyveromyces caracterizada por apresentar uma ou mais modificações genéticas de, pelo menos, um gene que codifica uma protease escolhida de entre a protease A representada pela sequência polipeptídica SEQ ID N° 3, a protease B representada pela sequência polipeptídica SEQ ID N° 1 e a carboxipeptidase Y, representada pela sequência SEQ ID N° 2, em que as referidas modificações genéticas diminuem a actividade proteolítica das referidas leveduras, e por compreender ainda uma sequência de ADN exógeno que codifica pelo menos uma proteína de interesse.

12. Levedura de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por a sequência de ADN exógeno compreender uma região de início da transcrição e da tradução junto à extremidade 5' da sequência que codifica a proteína de interesse.

13. Levedura de acordo com umas das reivindicações 11 ou 12 caracterizada por a sequência que codifica para a proteina de interesse incluir uma sequência de exportação dirigindo a proteina na via de secreção.

14. Levedura de acordo com uma das reivindicações 11 a 13 caracterizada por a sequência de ADN exógeno fazer parte de um vector de replicação autónoma ou ser integrada no cromossoma.

15. Levedura de acordo com uma das reivindicações 11 a 14 caracterizada por a ou as proteínas serem de utilização farmacêutica ou agroalimentar.

16. Levedura de acordo com a reivindicação 15 caracterizada por a ou as proteínas serem proteínas artificiais e, por exemplo, híbridas.

17. Utilização de uma levedura de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a produção de proteínas recombinantes. 18. Processo de produção de proteínas recombinantes caracterizado por se cultivar uma levedura de acordo com uma das reivindicações 11 a 16 nas condições de expressão da ou das proteínas codificadas pela sequência de ADN exógeno e por se recuperar a ou as proteínas de interesse.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18 para a produção de proteínas de interesse farmacêutico ou agroalimentar.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19 para a produção de proteínas artificiais e especialmente híbridas.

21. Processo de preparação de uma levedura de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se substituir todos ou parte dos genes cromossómicos PRB1 (SEQ ID N°l), PRC1 (SEQ ID N° 2) e PRAl (SEQ ID N° 3) para uma versão modificada in vitro. Lisboa, 27 de Agosto de 2007