ES2282989T3 - Polipeptidos que tienen actividad de quinasa, su preparacion y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS POLIPEPTIDOS QUE PRESENTAN UNA ACTIVIDAD SOBRE LA KINASA O, DE MANERA MAS ESPECIFICA, QUE MUESTRAN UNA ACTIVIDAD SOBRE LA 3-KINASA DE FOSFOINOSITIDOS (PI). TALES POLIPEPTIDOS ACTUAN EN LAS VIAS RESPONSABLES DEL CRECIMIENTO Y LA DIFERENCIACION CELULAR. SE PRESENTA UN POLIPEPTIDO AISLADO QUE POSEE UNA ACTIVIDAD SOBRE LA PI3-KINASA CUANDO SE PRODUCE MEDIANTE UNA PRODUCCION RECOMBINANTE EN CELULAS DE INSECTOS.
Description
Polipéptidos que tienen actividad de quinasa, su
preparación y su utilización.
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos que muestran actividad de quinasa. Más específicamente,
la presente invención se refiere a polipéptidos que muestran
actividad de fosfoinositido (de aquí en adelante "PI")
3-quinasa, particularmente moléculas implicadas en
mecanismos responsables del crecimiento y la diferenciación
celular.
La mayoría de los avances han tenido lugar en
nuestro conocimiento de la estructura y la función de las moléculas
de transducción de señal y sistemas de segundos mensajeros acoplados
a los receptores de la superficie celular. De este modo, un
subgrupo de receptores de factores de crecimiento de polipéptidos
pertenecen a la familia de proteína-tirosina
quinasas (de aquí en adelante, "PTK") y la activación de estos
receptores después de la unión del ligando implica la
autofosforilación del receptor así como la fosforilación de un
conjunto de proteínas sustrato intracelulares (revisado en Ullrich,
A. y otros, 1990). La importancia de la autofosforilación del
receptor no estaba clara hasta hace poco, cuando la evidencia de
diversos laboratorios ha sugerido que este hecho puede mediar la
formación de complejos entre proteínas receptoras y proteínas
putativas reguladoras del crecimiento, tales como fosfolipasa
C\gamma (PLC\gamma) (Meisenhelder y otros, 1989),
fosfatidilinositol PI3-quinasa (Coughlin, S R y
otros, 1989), proteína activadora de GTPasa (GAP) (Kaplan y otros,
1990), la quinasa de serina/treonina Raf (Morrison y otros, 1989) y
miembros de la familia src de proteína-tirosina
quinasas (Kypta, R M y otros, 1990) (revisada en Cantley, L C y
otros, 1991).
La asociación de la actividad de PI quinasa con
receptores activados es de particular interés dado que el aumento
del número de recambio de PI y sus derivados fosforilados está
implicado en la acción de las hormonas, factores de crecimiento y
la transformación de células por virus de ADN y ARN (revisado en
Whitman, M y otros, 1988; Cantley y otros, 1991). Se sabe que
existen varias especies de PI quinasa, pero hasta ahora ninguno de
estos enzimas se han caracterizado mediante clonación y expresión y
la demostración de la actividad de PI quinasa. Los fibroblastos
contienen por lo menos dos actividades de PI quinasa que son
distinguibles en base a su sensibilidad al detergente y propiedades
cinéticas (Whitman, M y otros, 1987). Estas dos actividades se
clasificaron como Tipo I (inhibida por detergentes no iónicos) y
Tipo II (estimulada por detergentes no iónicos e inhibida por
adenosina). Se ha identificado una tercera especie diferente (Tipo
III) en cerebro bovino pero aún está poco caracterizada (enferman,
G. y otros, 1987). Una especie de actividad de
PI-quinasa en particular se ha convertido en el
principal interés en la búsqueda de sistemas de segundos mensajeros
unidos a proteínas-tirosina quinasa, ya que se
observó que esta actividad co-inmunoprecipitaba con
receptores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas
activado (PDGF) (Kaplan, D R y otros, 1987; Coughlin, S R y otros,
1989) y con el complejo antígeno T
medio/pp60^{c-src}
(mT:pp60^{c-src}) de polioma (Whitman, M y otros,
1985). Se ha observado que esta actividad es debida a una PI quinasa
de Tipo I que produce nuevos lípidos de inositol fosforilados en la
posición D-3 del anillo de inositol (Whitman, M y
otros, 1988). Más recientemente, también se ha observado que este
enzima se asocia con el kit (Lev y otros, 1991) del receptor
CSF-1 (Varticovski, L y otros, 1989), el receptor
del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Bjorge y otros, 1990),
el \alpha-receptor de PDGF (Yu y otros, 1991), el
receptor de insulina (Ruderman y otros, 1990), el receptor del
factor de crecimiento de hepatocito, Met (Graziani y otros, 1991) y
con proteínas-tirosina quinasa no receptoras
activadas (Fukui y Hanafusa, 1989; Chan y otros, 1990; Varticovski y
otros, 1991).
La actividad de PI3 quinasa se ha relacionado
estrechamente con la presencia de proteínas de 81/85 kD en estos
inmunoprecipitados que se pueden fosforilar en residuos de tirosina
por la proteína-tirosina quinasa asociada tanto
in vitro como in vivo (Kaplan, D R y otros, 1987;
Courtneidge, S A y otros, 1987; Cohen y otros, 1990). Recientemente
se describió una purificación de 650 veces de PI3 quinasa de cerebro
bovino que, entre otras proteínas presentes en la preparación más
pura, contenía una proteína de 85 kD que se observó que era un
sustrato in vitro para los receptores de PDGF y EGF (Morgan,
S J y otros, 1990). Utilizando la información de la secuencia de
péptidos trípticos derivados de esta proteína, se han clonado
recientemente dos proteínas p85 bovinas homólogas, p85\alpha y
p85\beta (Otsu, M y otros, 1991). Otros dos grupos han clonado
independientemente homólogos p85\alpha murino y humano utilizando
diferentes estrategias (Escobedo, J A y otros, 1991b; Skolnik, E Y
y otros, 1991). Se puede demostrar que ambas proteínas p85 se unen
directamente a receptor de PDGF fosforilado in vitro (Otsu,
M y otros, 1991; Escobedo, J A y otros, 1991b). Estas proteínas
pueden actuar como subunidades de unión del receptor de la PI3
quinasa dado que no se puede demostrar que alguna de ellas codifique
la actividad de PI3-quinasa intrínseca cuando se
expresa en una variedad de sistemas celulares (Otsu, M y otros,
1991; Escobedo, J A y otros, 1991b). Sin embargo, la
inmunoprecipitación de PI3-quinasa de cerebro bovino
marcada con ^{125}I con anticuerpos desarrollados contra
proteínas p85 precipita una proteína de 85 kD junto con una segunda
proteína de peso molecular 110 kD (Otsu, M y otros, 1991).
La PI3-quinasa es una del
creciente número de proteínas de señalización potenciales que se
asocian con proteína-tirosina quinasas activadas
mediante estimulación de ligando o como consecuencia de la
transformación celular. Una característica común de todas estas
proteínas (aparte de Raf) es que contienen uno o más dominio s SH2
(homología src) (Koch, C A y otros, 1991). Tanto las
proteínas p85\alpha como las proteínas p85\beta contienen dos
dominios SH2. Los experimentos de un grupo de laboratorios han
sugerido que estos dominios pueden actuar mediante la unión a
secuencias de péptidos habitualmente fosforilados en residuos de
tirosina y, de este modo, mediar en la formación del complejo que
sigue a la activación de proteína-tirosina quinasas
(Anderson y otros, 1990; Meyer y Hanafusa, 1990; Moran y otros,
1990; Matsuda y otros, 1991; Meyer y otros, 1991; revisado en Koch,
C A y otros, 1991). En apoyo a esto, varios estudios han sugerido
que la fosforilación de tirosina del receptor de PDGF o mT de
polioma es esencial para su asociación con proteínas, tales como la
PI3-quinasa (Kazlauskas, A y otros, 1989; Talmage,
D A y otros, 1989), GAP (Kaplan y otros, 1990; Kazlauskas, A y
otros, 1990) y PLC\gamma (Anderson y otros, 1990; Margolis y
otros, 1990). El residuo de tirosina exacto para la unión de la
actividad de PI3-quinasa (y una fosfoproteína de 85
kD) al receptor de PDGF humano se ha mapeado a la tirosina 751 que
se encuentra en la región de inserción de quinasa del dominio de
proteína-tirosina quinasa (Kazlauskas y Cooper,
1989, 1990; Kazlauskas y otros, 1991). Los sitios de unión de otras
proteínas a este receptor (por ejemplo, PLC\gamma, GAP y quinasas
de la familia de src) aún deben mapearse, pero estas proteínas
pueden asociarse a través de otros residuos de tirosina
fosforilados.
La presente invención se ha facilitado mediante
el hallazgo de que ciertos péptidos sintetizados del
\beta-receptor de PDGF humano, concretamente
péptidos derivados de la secuencia alrededor de la tirosina 751 del
receptor de PDGF, se pueden utilizar para unirse y aislar
PI3-quinasa de cerebro bovino, posibilitando la
purificación adicional PI3-quinasa de cerebro bovino
parcialmente purificada (tal y como se ha descrito por Morgan y
otros, 1990) hasta una homogeneidad clara y para obtener proteína
p110 razonablemente pura. Tal y como se describirá a continuación
en la presente invención, la PI3-quinasa requiere
una columna de fosfopéptidos que contiene un motivo YXXM para su
aislamiento mediante dicha técnica, estando la tirosina fosforilada.
Sólo si se utiliza una columna de este tipo se fijan las proteínas
de 85 kD y 110 kD, mientras que la subunidad de 85 kD se une a
todas las columnas de afinidad de fosfopéptidos ensayadas y sólo no
consigue unirse a los péptidos no fosforilados. Además, el tamaño
relativamente pequeño de los fosfopéptidos utilizados para dichas
columnas produce una buena especificidad y una densidad elevada de
grupos de afinidad por unidad de volumen de columna.
Esta purificación ha permitido que se disponga
de información de las secuencias de aminoácidos y que se realice la
clonación de ADNc. Dicha clonación ha revelado algunos hechos
interesantes. De este modo, la p110 es una proteína de 1068
aminoácidos que tiene un peso molecular calculado inesperadamente
elevado (en comparación con las figuras de
SDS-PAGE) de aproximadamente 124 kD (124247).
La proteína está relacionada con Vps34p, una
proteína de Saccharomyces cerevisiae implicada en el tráfico
de proteínas a la vacuola. Sorprendentemente, la p110 cuando se
expresaba en células COS-1 estaba inactiva y sólo
se observaba actividad cuando formaba complejos con p85. Sin
embargo, cuando se expresaba en células de insectos, se podía
observar que la p110 poseía una actividad quinasa intrínseca. El
polipéptido p110 nuevo se puede asociar con p85\alpha en un
complejo p85\alpha/p110 que se une al receptor del
factor-1 estimulante de colonias activado. La
presente invención también se basa en estos descubrimientos y
hallazgos impredecibles.
De este modo, en un aspecto, la presente
invención proporciona un polipéptido aislado de peso molecular
calculado de aproximadamente 124 kD que posee actividad de
PI3-quinasa cuando se produce mediante producción
recombinante en células de insectos o un polipéptido derivable del
mismo que tiene actividad de PI3-quinasa y se une,
cuando se asocia con una subunidad p85 de PI3 quinasa de mamífero, a
un fosfopéptido que incluye el motivo YXXM, estando la tirosina
fosforilada. Dichos polipéptidos son preferiblemente aquellos
capaces de asociarse con subunidades p85 de PI3 quinasas de
mamífero para producir complejos p85/p110 activos. Preferiblemente,
los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácidos de la figura 9
de la presente invención o muestran una homología importante de
secuencia con la misma. Se prefieren los polipéptidos que tiene por
lo menos los aminoácidos 272 a 1068 de la secuencia de la figura 9
de la presente invención.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
el término "actividad de PI3-quinasa" significa
actividad de fosfoinositido-3 quinasa.
La presente invención comprende polipéptidos tal
y como se han definido y que muestran una homología de secuencia de
PI3 quinasa con cualquier especie de mamífero elegido. En la figura
16 de la presente invención se proporciona una secuencia humana.
Los aminoácidos 37(tyr)-834 (codón de
finalización) (ver figura 16) se conservan en más de un 99% con
respecto a la secuencia de ADNc de p110 bovina y corresponde a los
aminoácidos 272-1069 (codón de finalización) de la
secuencia de la figura 9. No existe similitud de secuencia entre las
secuencias de ADNc de p110 de las dos especies en la cadena arriba
del aminoácido 37 (secuencia humana).
La presente invención incluye anticuerpos,
monoclonales, o en cualquier caso, contra los polipéptidos de la
presente invención.
En otro aspecto, la invención incluye una
secuencia de ADN que comprende, o: (a) una secuencia indicada en la
figura 9 de la presente invención; (b) cualquiera de las
subsecuencias A a N de la figura 9 de la presente invención; (c) la
secuencia representada por las bases 816 a 3204 de la figura 9 de la
presente invención; (d) una secuencia indicada en la figura 16 de
la presente invención; o (e) una secuencia de ADN hibridable a (a),
(b), (c) o (d); cuyas secuencias (a), (b), (c), (d) o (e) codifican
un polipéptido que tiene actividad de PI3-quinasa
si se expresa en células de insectos o pueden formar complejos con
una subunidad p85 de PI3-quinasa de mamífero para
producir dicha actividad. Las subsecuencias A a N, a las que se ha
hecho referencia anteriormente, son en sí mismas parte de la
presente invención.
Entre las condiciones de hibridación que se
pueden utilizar para encontrar secuencias activas se incluyen, pero
no se limitan a, 1 M NaCl/10 x solución de Denhardt/50 mM
Tri-HCl (pH 7,4)/10 mM EDTA/0,1% SDS/100 \mug/ml
de ADN de esperma de arenque desnaturalizado (Sigma) a 65ºC durante
16 horas, con las siguientes condiciones de lavado, es decir, 2 -x
SSC/0,1% SDS, 42ºC - - -> 0,5 x SSC/0,1% SDS, 50ºC
- - -> 0,1 x SSC/0,1% SDS, 65ºC
- - -> 0,1 x SSC/0,1% SDS, 68ºC.
La presente invención proporciona además una
construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN, tal y como
se ha definido anteriormente, bajo el control de una secuencia de
control y en un marco de lectura adecuado en un vector de
expresión.
La secuencia de control puede incluir un
promotor regulable (por ejemplo, Trp). Las células huésped
seleccionadas que se han alterado genéticamente para permitir la
expresión del polipéptido codificado mediante la incorporación de
dicha construcción son otro aspecto de la presente invención, y ésta
también incluye un procedimiento de fabricación de dicho
polipéptido mediante el cultivo de dichas células huésped y,
naturalmente, los polipéptidos resultantes.
En general, los polipéptidos nuevos de la
presente invención se pueden utilizar para proporcionar actividad
de PI3-quinasa, directamente o después de formar
complejos con una subunidad p85 de mamíferos. Los complejos
enzimáticamente activos que implican los polipéptidos definidos
anteriormente son parte de la invención.
La presente invención prevé un procedimiento de
profilaxis o terapia que implica el estímulo o desestímulo de la
proliferación celular por la acción de un agonista o antagonista,
respectivamente, para la actividad de PI3-quinasa
de un polipéptido de la presente invención o complejo que lo
incluye, en el que dicha proliferación celular está mediada a
través de un receptor de la superficie celular interactivo con dicha
actividad. La presente invención establece por primera vez,
mediante la proporción de proteína activa pura secuenciada, la
oportunidad de cribar (utilizando técnicas estándar) dichos
agonistas o antagonistas.
Otro aspecto de la presente invención es una
formulación farmacéutica o veterinaria que comprende un agonista o
antagonista, tal y como se ha definido anteriormente, formulada para
un uso farmacéutico o veterinario, respectivamente, opcionalmente
junto con un diluyente, portador o excipiente aceptables y/o en un
forma de una unidad de dosificación. Se puede utilizar la práctica
farmacéutica o veterinaria convencional para proporcionar
formulaciones o composiciones adecuadas.
De este modo, las formulaciones de la presente
invención se pueden aplicar a administración parenteral, por
ejemplo, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular,
intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal,
intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal,
tópica, intranasal, por aerosol, escarificación, y también oral,
bucal, rectal o vaginal.
Las formulaciones parenterales pueden estar en
forma de soluciones líquidas o suspensiones; para administración
oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o
cápsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvo,
gotas nasales o aerosoles.
Los procedimientos conocidos en la técnica para
producir formulaciones se encuentran en, por ejemplo,
"Remington’s Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para
administración parenteral puede, por ejemplo, contener como
excipientes agua estéril o solución salina, polialquilen glicoles,
tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, o
naftalenos hidrogenados. Se pueden utilizar polímeros de láctido,
copolímeros de láctido/glicólido o copolímeros de polioxietileno -
polioxipropileno biodegradables y biocompatibles para controlar la
liberación de los presentes factores. Entre otros sistemas de
liberación parenterales potencialmente útiles para los factores se
incluyen partículas de copolímeros de
etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas,
sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones
para inhalación pueden contener como excipientes, por ejemplo,
lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo,
lactosa o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo,
polioxietilen-9-lauril éter,
glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para la
administración en forma de gotas nasales, o como un gel para aplicar
intranasalmente. Las formulaciones para administración parenteral
también pueden incluir glicoco-
lato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cítrico para administración vaginal.
lato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cítrico para administración vaginal.
La concentración de agonista o antagonista de
PI3-quinasa en las formulaciones de la presente
invención variará dependiendo del número de cuestiones, incluyendo
la dosis a administrar, y la ruta de administración.
En términos generales, dichos agonistas o
antagonistas se pueden disponer en una solución acuosa de tampón
fisiológico que contiene aproximadamente de 0,1 a 10% p/v de
compuesto para administración parenteral. Los intervalos de dosis
generales varían desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta
aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por día; un intervalo de
dosis preferida varía desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta 100
mg/kg de peso corporal por día. La dosis preferida a administrar es
probable que dependa del tipo y el grado de progresión de la
enfermedad a la que se dirige, la salud general del paciente, la
fabricación de la formulación, y la ruta de administración.
La presente invención también incluye la
utilización de un polipéptido de la presente invención, o complejo
activo que contiene al mismo, o un agonista o antagonista del mismo
en la acción sobre el nivel de estimulación de plaquetas o
neutrófilos o en la regulación de los niveles de glucosa en sangre
(la acción de la insulina puede estar mediada por actividad de
PI3-quinasa), y se prevé dicha utilización cuando se
utiliza con objetivos profilácticos o terapéuticos.
Los polipéptidos de la presente invención (o
complejos que los contienen) tienen una utilidad particular en la
producción enzimática in vitro de fosfoinositidos
3-fosforilados, por ejemplo, PI(3)P,
PI(3,4)P2, PI(3,4,5)P3. Dicho material
es de un interés bioquímico considerable y es frecuentemente muy
difícil de sintetizar mediante técnicas químicas convencionales. La
presente invención proporciona, por primera vez, cantidades
apreciables de actividad enzimática purificada y adecuada para
dicha síntesis in vitro.
En general, la primera etapa en la purificación
y la clonación en la que se basa la presente invención implicaba
una purificación parcial de PI3-quinasa de cerebro
bovino tal y como se ha descrito anteriormente (Morgan y otros,
1990) y, a continuación, una purificación adicional mediante
cromatografía de afinidad en un péptido con fosfotirosina de 17
aminoácidos inmovilizado cuya secuencia se basa en esa tirosina 751
de alrededor del receptor de PDGF-\beta. Tras
esta purificación final, se eluyeron p110 y p85 de la resina con
tampones que contenían SDS. La mezcla p85/p110 se digirió
directamente con lisilendopeptidasa, o la p110 se purificó
adicionalmente mediante electroforesis en gel de
SDS-agarosa (ver a continuación) y se digirió tras
la elución del gel. Los péptidos se separaron mediante HPLC de fase
inversa y se secuenciaron utilizando un secuenciador Applied
Biosystems 477A modificado. El análisis de la secuencia de
aminoácidos de 14 péptidos (A a N, figura 9) generó 235 residuos
que se pudieron designar con certeza (ver figura 9, adjunta).
Es importante indicar que la producción
satisfactoria de información de la secuencia de la presente
invención era dependiente de una técnica novedosa de electroforesis
en gel de SDS-agarosa. Aunque la
SDS-PAGE se utiliza ampliamente para las
separaciones de resolución elevada de proteínas y es un
procedimiento que permite obtener componentes de forma primaria por
sus diferencias en el peso molecular, dado que la matriz de
poliacrilamida no se rompe fácilmente, la recuperación de proteínas
después de la SDS-PAGE requiere generalmente
técnicas que implican la electroelución a partir de fracciones de
gel, electrotransferencia o difusión pasiva. La elución de
proteínas a partir de geles de poliacrilamida que se han teñido
previamente utilizando reactivos sensibles (tales como Azul de
Coomassie) es lenta y las recuperaciones son frecuentemente bajas.
Además, estos procedimientos pueden concentrar impurezas presentes
en la matriz de poliacrilamida y en los volúmenes de tampón
relativamente grandes requeridos para la elución.
También se han desarrollado sistemas
SDS-PAGE preparativos que utilizan conjuntos de
flujo continuo, pero frecuentemente muestran una menor resolución y
recuperaciones bajas.
El procedimiento nuevo utilizado en la presente
invención utiliza electroforesis en gel de
SDS-agarosa (SDS-AGE) y permite una
combinación de la capacidad de resolución elevada de la
electroforesis en gel slab y la detección de proteínas utilizando
manchas sensibles con una técnica de recuperación rápida que aísla
proteínas con un rendimiento elevado y en volúmenes pequeños. La
proteína recuperada se purifica muy bien y en una forma que se
puede precipitar fácilmente o diferir directamente en tampones que
contienen SDS. Los péptidos producidos mediante este procedimiento
se pueden fraccionar mediante HPLC y, a continuación, analizar
mediante secuenciación de aminoácidos automatizada. La recuperación
de péptidos hidrofóbicos largos es particularmente eficaz
utilizando estas condiciones de digestión. El siguiente protocolo
guía al lector experto.
Todas las sustancias químicas deberían ser de
grado analítico o el más puro. El clorhidrato de guanidinio era de
grado Aristar (BDH, UK). El Prosieve FMC se adquirió de Flowgen (GB)
y agarosa ultrapura de BRL (EEUU). Otros reactivos de
electroforesis eran de Biorad (GB, grado de electroforesis). Las
proteínas de peso molecular estándar eran de
Bio-Rad (GB) y Amersham International (GB). La
tripsina del grado de secuenciación (porcino, EC 3.4.21.4) era de
Boehringer Mannheim (GB) y lisilendopeptidasa (Achromobacter
lyticus, EC 3.4.21.50) era de Wako Chemicals GMBH (Alemania). Los
capilares de vidrio fueron los suministrados por Applied Biosystems
Inc (EEUU) para utilizar en el sistema 430A HPEC, pero se congelaron
mediante abrasión con una suspensión acuosa de carborundo (grado
C150) y una barra de acero. Las placas de gel slab congeladas se
obtuvieron de Hoefer (GB).
Los geles de resolución de Slab Prosieve de 0,75
ó 1,5 mm de grosor se vertieron esencialmente tal y como se ha
descrito por el fabricante utilizando parejas de placas de vidrio de
16 x 18 cm, una de las cuales se congeló con el fin de evitar que
el gel se saliera del montaje de la electroforesis. Es importante
asegurar que las placas de gel se hayan calentado perfectamente
hasta 60ºC antes de verter el gel de resolución. La incapacidad de
calentar las placas de gel antes de verter un gel de apilamiento de
agarosa, la inserción del peine en un gel de enfriamiento rápido y
la extracción del peine del gel de apilamiento de agarosa frágil
provocaba diversos problemas. Con el fin de eliminar estas
dificultades se utilizó un gel de apilamiento de poliacrilamida 5%
T, 2,6% C en lugar de agarosa en las preparaciones posteriores.
Las muestras se desnaturalizaron a 100ºC en un
tampón muestra (190 mM de Tris/HCl, pH 6,8, SDS 6% (p/v), glicerol
30% (v/v), 10 mM de DTT, azul de bromofenol 0,01% (p/v)) y se
desarrollan geles utilizando tampón de cátodo Laemmli (0,192 M de
glicina, 0,025 M de Tris, SDS al 0,1% (p/v)) con un tampón de ánodo
modificado (1M de Tris/HCl, pH 8,3) a 200 V (aproximadamente 50 mA
para geles de 1,5 mm y 25 mA para geles de 0,75 mm) durante
aproximadamente 4 horas utilizando un aparato de gel SE400 (Hoefer,
EEUU). Los geles se tiñeron utilizando Azul de Coomassie
G-250 (Bio-Rad, GB) con un rápido
desteñido o una solución de acetato de amonio 4 M. En el último
caso, las proteínas se identificaron en unos pocos minutos mediante
contraste óptico utilizando reflexión de luz incidente observada
contra un fondo oscuro. Las bandas de proteínas se separaron
inmediatamente y las fracciones de gel se guardaron a -20ºC.
Las fracciones de gel se congelaron y se lavaron
dos veces en 1 ml de 62,5 mM de Tris/HCl, pH 6,8 durante 5 minutos
cada una a 20ºC. Las fracciones contenían Azul de Coomassie se
prelavaron con 1 ml de metanol al 50% (v/v), ácido acético al 5%
(v/v) durante 5 minutos a 20ºC.
Se estimó el volumen de la fracción de gel, a
continuación se añadieron un 10% de SDS y un 20% de DTT hasta
concentraciones finales del 2% y 0,2% (p/v), respectivamente. La
fracción de gel se fundió y se homogenizó mediante inmersión en
agua hirviendo durante 5 minutos con agitación ocasional. A
continuación, se midió el volumen de muestra y se alcanzó la
cantidad requerida (ver Tabla 1 a continuación) con 62,5 mM de
Tris/HCl precalentado, pH 6,8. La muestra diluida se calentó
durante 5 minutos adicionales y se cargó en un capilar de HPEC de
vidrio precalentado. Era importante no superar el 90% del volumen
del capilar en esta etapa. El capilar se incubó a 4ºC durante por
lo menos 10 minutos para permitir que el gel de muestre
solidificara, antes de la adición lenta de agarosa al 0,8%, 1 M de
Tris/HCl, pH 8,8 para rellenar el capilar. Después de 10 minutos
adicionales a 4ºC, los extremos del gel se ajustaron al mismo nivel,
se sellaron con discos Zytex y se aplicaron a un sistema HPEC de
Applied Biosystems 230A. La electroelución se realizó utilizando una
presión del tampón de elución de 2,5 psi (generando un flujo de
aproximadamente 1 \mul/min), una presión del tampón de reserva
superior de 3,5 psi y una presión del tampón de reserva inferior de
0,9 psi. Estos parámetros se cambiaron con respecto a las
recomendaciones del fabricante con el fin de detener el gel si cae
hacia arriba durante la carrera. Los parámetros de corriente fueron
tal y como se describe en el texto y se recogieron fracciones cada
3 minutos a la vez que se monitorizaba el eluato a 280 nm. El
estante colector de fracciones se enfrió hasta 4ºC y el
compartimento de gel se enfrió hasta 10ºC.
Es estudió el contenido de proteínas y la pureza
de fracciones mediante la monitorización de la radioactividad o
mediante SDS-PAGE y tinción con plata. Las muestras
necesitaron una digestión con tripsina o lisilendopeptidasa y
posteriormente al análisis de secuencias se separaron del Azul de
Coomassie mediante precipitación secuencial sobre hielo utilizando
TCA al 10% (p/v) y a continuación TCA al 20% con centrifugación
durante 10 minutos a 4ºC. Los gránulos se lavaron con 1 ml de
acetona a -20ºC durante toda la noche y, a continuación, se lavaron
de nuevo brevemente con el fin de eliminar la contaminación por
trazas de TCA y SDS antes de secarse con aire y la adición del
tampón de digestión requerido. Las digestiones trípticas se
realizaron en 0,1 M de Tris/HCl, pH 8,0 a 37ºC y las digestiones
con lisilendopeptidasas en 20 mM de Tris/HCl, pH 8,8 que contenía
SDS al 0,1% (p/v) a 30ºC. Se añadió clorhidrato de guanidinio
sólido a los digestos trípticos (concentración final de 6 M) y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC. Los productos se aplicaron
directamente a columnas de HPLC utilizando un sistema de
Hewlett-Packard 1090M y el efluente se monitorizó
con un detector con un conjunto de diodos. Los digestos de tripsina
se fraccionaron utilizando una columna Applied Biosystems
RP-300 (2,1 x 100 mm) mientras que los productos de
la lisilendopeptidasa requería una columna Applied Biosystems
AX-300 (2,1 x 30 mm) y una columna
OD-300 (2,1 x 100 mm) conectadas en serie
esencialmente tal y como se describe por Kawasaki y Suzuki
(1990).
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención sin limitar a la misma. Los Ejemplos
se refieren a los dibujos adjuntos.
En los dibujos adjuntos:
Las figuras 1 a 9 se refieren al Ejemplo 1,
secciones A y B.
Panel A. Perfil HPLC para la separación del
péptido Y751 fosforilado del no fosforilado en una columna de fase
inversa C_{18}. El gráfico muestra el espectro monitorizado a 214
nm durante el transcurso de la elución. Los picos correspondientes
a los péptidos fosforilado y no fosforilado se indican mediante
flechas. Los picos pequeños observados se derivan de las membranas
A431.
Panel B. Análisis espectral de los péptidos Y751
fosforilados y no fosforilados purificados entre 240 y 300 nm
medido mediante el detector con un conjunto de diodos. Se observa
que el máximo de absorción para el péptido se desplaza a una
longitud de onda inferior tras la fosforilación de tirosina.
Panel C. Análisis de fosfoaminoácidos de péptido
Y751 fosforilado mediante receptor de EGF purificado (panel
izquierdo) o membranas de células A431 (panel derecho). Tras la
reacción de fosforilación, el fosfopéptido se purificó mediante
HPLC de fase inversa. El péptido se sometió a hidrólisis ácida y los
fosfoaminoácidos se separaron mediante electroforesis en capa fina
bidimensional. Los patrones internos se tiñeron con ninhidrina y
los fosfoaminoácidos marcados con ^{32}P se detectaron mediante
autorradiografía. Se indican las posiciones de fosfato inorgánico
(P_{i}) y patrones de fosfoserina (S), fosfotreonina (T) y
fosfotirosina (Y).
Panel A. El pico 1 (P1) y el pico 2 (P2) de
fracciones de PI3-quinasa de la segunda etapa de
MonoQ se analizaron en un gel de SDS-PAGE al 7,5%.
Las proteínas en estas dos fracciones de pico se visualizaron
mediante tinción con plata. Se indican las posiciones de migración
de marcadores del peso molecular.
Panel B. Purificación por afinidad del pico 1
(P1) y el pico 2 (P2) de PI3-quinasa utilizando la
columna de fosfopéptidos Y751. Tinción con plata de un gel de
SDS-PAGE al 7,5% que muestra las proteínas asociadas
a PI3-quinasa de P1 y P2 de MonoQ que se unían a, y
se eluían de, la columna de fosfopéptidos Y751 con tampón fosfato
que contenía SDS al 0,1% a 80ºC. Los carriles 1, 2 y 3 para material
tanto de P1 como P2 indica que las proteínas se eluyeron mediante
elusiones sucesivas de 50 \mul.
Se aplicó un microgramo de
PI3-quinasa de cerebro bovino del pico 1
parcialmente purificada a 10 \mul de las resinas de péptidos
derivados de Y751 en 100 \mul de tampón de unión. Se analizó la
actividad de PI3-quinasa de las proteínas unidas.
Carril 1, actividad de PI3-quinasa unida a columna
de Y751 no fosforilado. Carril 2, actividad de
PI3-quinasa unida a columna de Y751 fosforilado.
Carril 3, actividad de PI3-quinasa extraída del
sobrenadante de la columna en el carril 2 mediante la columna nueva
de Y751 fosforilado. Carril 4, actividad de
PI3-quinasa restante asociada con la columna del
carril 2 tras la extracción del material unido utilizando SDS al
0,1% a 80ºC. Carril 5, actividad de PI3-quinasa
unida a columna reciclada de Y751 fosforilado usada en el carril 2
tras la adición de una alícuota nueva de PI3-quinasa
de cerebro bovino en tampón de unión. Carril 6, cantidad
equivalente de actividad de PI3-quinasa de cerebro
bovino soluble del pico 1 según aplicada a columnas en el carril 2
o el carril 5.
Las muestras de proteína se separaron en geles
de SDS-PAGE al 7,5% y se transfirieron a
nitrocelulosa. A continuación se sondaron las manchas
("blots") con antisueros desarrollados contra las secuencias de
péptidos COOH-terminal de p85\alpha o
p85\beta.
Panel A. Transferencia Western sondada con
antisuero COOH-terminal
anti-p85\alpha.
Carril 1, PI3-quinasa de cerebro
bovino del pico 1; carril 2, PI3-quinasa de cerebro
bovino del pico 2; carril 3, lisado de células
Cos-1 de células transfectadas con el vector pMT2
solo; carril 4, lisado de células Cos-1 de células
transfectadas con el vector pMT2p85\alpha; carril 5, lisado de
células Cos-1 de células transfectadas con el
vector pMT2p85\beta; carril 6; lisado de células Sf9 que contienen
p85\alpha; carril 7, lisado de células Sf9 que contienen
p85\beta. Panel B. Transferencia Western sondada con antisuero
COOH-terminal anti-p85\beta.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los carriles son como los descritos para el
Panel A.
Panel C. Competición de péptidos con anticuerpos
en transferencias Western. Las muestras en los carriles 1 y 2 se
sondaron con antisuero específico de p85\alpha, mientras que las
muestras de los carriles 3 y 4 se sondaron con antisuero específico
de p85\beta. Carriles 1 y 2, lisado de células Sf9 que contenía
p85\alpha expresada en baculovirus. Carriles 3 y 4, lisado de
células Sf9 que contenía p85\beta expresada en baculovirus. En
los carriles de número impar, la nitrocelulosa se sondó con
antisuero específico solo. En los carriles de número par, el
antisuero se completó con 100 \mug/ml de péptidos
C-terminales específicos de p85\alpha (carril 2)
y p85\beta (carril 4), respectivamente.
Panel D. Transferencia western anti p85\alpha
de material PI3-quinasa unido y soluble después de
la cromatografía utilizando la columna de fosfopéptidos Y751.
El pico (P1) y el pico 2 (P2) de
PI3-quinasa de cerebro bovino se inmovilizaron en la
columna de fosfopéptidos Y751. El material que no se unió se
recogió y, a continuación, la resina se lavó extensamente. Las
proteínas unidas se eluyeron de la columna con tampón de muestra
SDS-PAGE. Las proteínas unidas y no unidas se
separaron mediante SDS-PAGE en un gel al 7,5% y, a
continuación, se transfirieron a nitrocelulosa. A continuación, el
filtro se sondó con antisuero COOH-terminal
anti-p85\alpha y se visualizó con Proteína
A-Sefarosa con ^{125}I. Carril 1, material unido;
Carril 2, material de pico 1 que no se unió a la columna; Carril 3,
material unido del pico 2; Carril 4, material de pico 2 que no se
unió a la columna.
Se dejaron que los lisados de células Sf9 que
contenían proteínas p85\alpha o un microgramo de
PI3-quinasa de cerebro bovino parcialmente
purificada (P1 y P2 MonoQ) se unieran a las columnas durante 4 horas
a 4ºC tal y como se ha descrito. A continuación, se lavaron las
columnas repetidamente con tampón de unión, las proteínas unidas se
eluyeron con tampones que contenían SDS y, a continuación, se
analizaron mediante electroforesis en geles de
SDS-PAGE al 7,5%. Las proteínas unidas se
visualizaron mediante tinción con plata. Panel A. Proteínas unidas
a columna de fosfopéptidos Y751. Panel B. Proteínas unidas a columna
de fosfopéptidos Y857. Se indica la posición de migración de los
marcadores de peso molecular.
Se analizó la capacidad de unión a las diversas
columnas de péptidos de proteínas p85 en lisados de células SF9.
Después de un lavado extenso, las proteínas unidas se eluyeron de
las columnas, se separaron en geles de SDS-PAGE al
7,5% y se visualizaron mediante tinción con Azul de Coomassie. Panel
A. P85\alpha unida. Panel B. P85\beta unida. CON, columna de
Y751 no fosforilados de 17 aminoácidos; Y751, fosfopéptido de 17
aminoácidos de la región de inserción de quinasa del
\beta-receptor de PDGF; Y751.S, versión del
fosfopéptido Y751 de 11 aminoácidos; Y857, fosfopéptido de 17
aminoácidos derivado de la secuencia alrededor del segundo sitio
principal de fosforilación de tirosina en el
\beta-receptor de PDGF; pGAT, fosfopéptido Prat,
poli Glu:Ala:Tyr; Y416 e Y527m fosfopéptidos de 13 y 16 aminoácidos
derivados, respectivamente, de los dos sitios principales de
fosforilación de tirosina de pp60^{c-src}.
Se dejó que un microgramo de
PI3-quinasa (P1 MonoQ) de cerebro bovino
parcialmente purificada se uniera a columnas de afinidad de
péptidos durante 4 horas a 4ºC tal y como se ha descrito. A
continuación, las columnas se lavaron repetidamente con tampón de
unión. A continuación, las proteínas unidas se eluyeron con tampones
que contenían SDS y, a continuación, se analizaron mediante
electroforesis en geles de SDS-PAGE al 7,5% o se
ensayó la actividad de PI3-quinasa unida a la
columna.
Panel A. Las proteínas unidas se visualizaron
mediante tinción con plata. Se indica la migración de marcadores
del peso molecular.
Panel B. La actividad de
PI3-quinasa se unió a varias columnas de
fosfopéptidos. Los productos lipídicos marcados con ^{32}P se
separaron mediante TLC y se visualizaron mediante autorradiografía.
PI3P indica la posición de migración de un patrón de Pi3P. Ori
indica el origen de la placa de TLC.
Panel A. Se unió un microgramo de
PI3-quinasa de cerebro bovino de pico 1 parcialmente
purificada a 10 \mul de las columnas de péptidos indicadas. Tras
un lavado extenso, se analizó la actividad de
PI3-quinasa unida de las columnas. Carril 1,
actividad de PI3-quinasa unida a columna de Y751 no
fosforiladas; Carril 2, actividad de PI3-quinasa
unida a columna de Y751 fosforiladas; Carril 3, actividad de
PI3-quinasa unida a columna de Y751.S fosforiladas;
Carril 4, actividad de PI3-quinasa unida a columna
de Y857 fosforiladas; Carril 5, actividad de
PI3-quinasa unida a columna de Y740
fosforiladas.
Carril 6, actividad de
PI3-quinasa unida a columna de Y1313 con Met
fosforilada. PIP indica la posición de migración de un patrón de
P14P. Ori indica el origen de la placa de TLC.
Panel B. Comparación de los sitios de unión
identificados de PI3-quinasa en los péptidos
analizados. La secuencia de unión de consenso propuesta también se
muestra para la comparación (Cantley y otros, 1991).
Las figuras 9 a 15 se refieren al Ejemplo 1,
secciones C y D, y las figuras 16 a 26 se refieren al Ejemplo
2.
(Panel superior). Se muestran la secuencia de
nucleótidos de la región codificante y la secuencia de aminoácidos
deducida con el código de una letra. Las secuencias de péptidos (con
letras de A a N) obtenidas mediante la secuenciación de proteínas
están destacadas.
(Panel inferior) Representación esquemática del
ADNc de p110. La línea en negrita indica la secuencia codificante.
(p2.1): extensión del clon p2.1, (Producto de Race); región
amplificada por PCR RACE, (a): sonda utilizada en un análisis de
transferencia Southern, (b): sonda utilizada en un análisis de
transferencia Northern, (S): sitio Sau3AI cambiado a sitio BamHI
para la expresión en células Sf9.
(A) Comparación de la representación de puntos
de Vps34p (875 aminoácidos; eje horizontal) y p110 (1068
aminoácidos: eje vertical) utilizando el programa Compare (paquete
UWGCG; Devereux y otros, 1984).
(B) La alineación óptima de p110 (secuencia
superior) y Vps34p (secuencia inferior) sobre la región de
homología, utilizando el programa Gap (paquete UWGCG: Devereux y
otros, 1984). Los residuos idénticos se indicaron mediante (I), los
residuos conservados se indicaron mediante (:). Los residuos
propuestos de estar implicados en la unión de ATP están marcados
con (*).
Los ADNs (3 \mug) de peso molecular elevado de
origen bovino (carriles 1, 2, 3), humano (carriles 4, 5, 6) y de
rata (carriles 7, 8, 9) se digirieron con EcoRI (carriles 1, 4, 7),
BamHI (carriles 2, 5, 8) y HindIII (carriles 3, 6, 9), se
fraccionaron a través de un gel agarosa al 0,5% y se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa tal y como se ha descrito en el
Ejemplo 1. El filtro se sondó con un fragmento
XbaI-PstI marcado con ^{32}P (sonda a en la
figura 9, panel inferior). El filtro se lavó en 0,5 x SSC, SDS al
0,1% a 50ºC y se expuso durante toda la noche (Panel A). A
continuación, el filtro se lavó en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 68ºC y
se expuso durante siete días (Panel B). El trazado de los marcadores
muestra las posiciones de los marcadores de lambda HindIII.
Se fraccionaron en un gel de agarosa al 0,9% 5
\mug de ARN poli(A)^{+} aislados del cerebro
bovino total (carril 1) o la línea de células
SGBAF-1 (carril 2) y se inmovilizaron en membranas
tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. El filtro se sondó con
una sonda de ARN antisentido marcado con ^{32}P (sonda b en la
figura 9, panel inferior). Después de lavarse en 0,1 x SSC, SDS al
0,1% a 60ºC, el filtro se trató con 1 \mugml^{-1} de ARNasa A y
se autorradiografió durante toda la noche.
Se aisló ARN poli(A)^{+} de
varias fuentes y se realizó una PCR tal y como se ha descrito en el
Ejemplo 1. Bandas de 218 pb y 212 pb indican la amplificación
específica de transcritos humanos y bovinos, respectivamente.
Carril 1; blastos de células T humanos, carril 2; células de
leucemia limfocítica aguda de sangre periférica humana, carril 3;
células A431 (Humana), carril 4; células COS-1
(Simian), carril 5; cerebro bovino, carril 6; células
SGBAF-1 (Bovino), carril 7; células ZNR
(Porcino).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN poli(A)^{+} de
varias fuentes y se realizó una PCR. La amplificación específica de
mensaje de p85\alpha produce una unión de 190 pb. Los carriles
son los mismos que los indicados para (B).
(A) Se infectaron células Sf9 con un baculovirus
natural (carriles 1 y 2) o con baculovirus que expresan p85\alpha
(carril 3), p110 (carril 4) o p85\alpha y p110 (carriles 5 y 6).
Los inmunoprecipitados se prepararon con antisueros
anti-p85\alpha (carriles 1, 3 y 5) o
anti-p110 (carriles 2, 4 y 6), las muestras se
fraccionaron en un gel de SDS-PAGE al 7,5% y se
visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie.
(B) los ensayos de PI3-quinasa
se realizaron en inmunoprecipitados de p85\alpha y p110 expresadas
en células Sf9. Carriles 1-6: los mismos que en el
Panel (A); carril 7: actividad de pI3-quinasa de 1
\mul de la preparación de PI3-quinasa de cerebro
bovino parcialmente purificada.
Se realizó un ensayo de
PI3-quinasa in vitro en inmunocomplejos de
receptor anti-CSF-1 preparados a
partir de células Sf9 infectadas con un baculovirus que expresaba el
receptor de CSF-1 y se trataron de la siguiente
manera; carril 1: inmunoprecipitados de receptor
anti-CSF-1, no tratados; carril 2;
inmunoprecipitado de receptor anti-CSF, pretratado
con ATP e incubado con un lisado de células Sf9 que contenía
p85\alpha/p110; carril 3: inmunoprecipitado de receptor
anti-CSF-1, tratado en ausencia de
ATP e incubado con un lisado de células Sf9 que contenían
p85\alpha/p110;
Carril 4; inmunoprecipitado de receptor
anti-CSF-1, pretratado con ATP e
incubado con un lisado de células Sf9 que contenían p85\alpha;
carril 5; inmunoprecipitado de receptor
anti-CSF-1, pretratado con ATP e
incubado con un lisado de células Sf9 que contenían p110.
Se transfectaron células COS-1
con 5 \mug de los ADNs respectivos y se recogieron 48 horas
después. Las células transfectadas se marcaron con 100 \muCi
ml^{-1} de ^{35}S-metionina durante las últimas
4 horas de este periodo. Las inmunoprecipitaciones se realizaron con
un antisuero policlonal de p85\alpha o un antisuero de péptido
C-terminal de p110. Después de lavarse, el gránulo
se dividió en dos y, a continuación, se analizó la mitad en un gel
de SDS-PAGE al 10% mientras que la otra mitad se
sometió a un ensayo de PI3-quinasa.
(A) Proteínas marcadas con ^{35}S
inmunoprecipitadas con antisuero
anti-p85\alpha.
(B) Actividad de PI3-quinasa
inmunoprecipitada con antisuero
anti-p85\alpha.
(C) Proteínas marcadas con ^{35}S
inmunoprecipitadas con antisuero de péptido
C-terminal p110.
(D) Actividad de PI3-quinasa
inmunoprecipitada con antisuero de péptido
C-terminal p110.
Los carriles contienen los resultados de células
COS-1 transfectadas con los siguientes ADNs; carril
1: vector ADN, carril 2: pMT2-p85\alpha, carril 3:
pSG5-p110, carril 4:
pMT2-p85\alpha y pSG5-p110, carril
5 en los paneles B y D muestran la actividad de
PI3-quinasa inmunoprecipitada con los dos antisueros
de 1 \mul de la preparación de pI3-quinasa de
cerebro bovino parcialmente purificada. Los tiempos de exposición
para los paneles A y C, y B y D son idénticos.
La figura muestra la secuencia de ADNc de p110
humana, junto con la correspondiente secuencia de aminoácidos.
Comparación de la secuencia de p110 humana y la
secuencia de p110 bovina a nivel de ADN.
Comparación de la secuencia de p110 humana y la
secuencia de p110 bovina a nivel de proteína.
La secuencia de proteínas de p110 humana.
La secuencia de un ADNc relacionado con p110,
PITR-c.
La secuencia de un ADNc relacionado con p110,
PITR-f.
La alineación de p110, PITR-c,
PITR-f humanas y VPS34 de
PI3-quinasa de levadura.
Análisis por SDS-PAGE de
proteínas capaces de unirse a varios dominios de p110 humana.
Representación esquemática de los dominios de
p110 analizada por su capacidad de unirse a p85.
Varios mutantes por deleción y fragmentos de PCR
de fragmento de p110, p110-N.
La capacidad de varios mutantes por deleción y
fragmentos de PCR de p110-N de unirse a las
subunidades p85.
Se mantuvieron células A431 en medio de Eagle
modificado por Dulbecco que contenía suero de ternera fetal al 10%.
El mantenimiento del cultivo de células de insectos y la infección
de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) se llevó a cabo
tal y como se ha descrito en Summers y Smith (1987).
Esta preparación se modificó de la descrita por
TOM y otros (1977). La solución de recogida (0,05 M de ácido bórico
(pH 7,2), 0,15 M de NaCl), la solución de extracción (0,02 M de
ácido bórico (pH 10,2), 0,02 mM de EDTA) y solución de borato de
0,5 M de ácido bórico (pH 10,2) se prepararon todas como nuevas. Las
células se lavaron una vez con solución de recogida enfriada con
hielo y, a continuación, se descartaron en una solución de recogida
nueva. Las células se granularon mediante centrifugación a baja
velocidad a 200 g y, a continuación, se resuspendieron mediante
pipeteo en 2 volúmenes de gránulo de la solución de recogida. Ésta
se añadió lentamente, con agitación, a 100 volúmenes de gránulo de
solución de extracción. Después de 10 minutos, se añadieron 8
volúmenes de gránulo de solución de borato y se continuó agitando
durante 5 minutos más. Esta solución se filtró mediante una malla
de nylon (tamaño promedio de la malla de 900 \mum) y se giró a
500g durante 10 minutos a 2ºC para granular cualquier núcleo/célula
completa. Finalmente, el sobrenadante se centrifugó a 12.000 g en
un rotor de ultracentrífuga SW28 a 4ºC durante 30 minutos. El
gránulo de membrana se resuspendió en un volumen mínimo de 50 mM de
Hepes (pH 7,5) y se guardó a -70ºC.
Los péptidos descritos en la siguiente Tabla 2
se sintetizaron en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems
430A utilizando química FMOC y un programa de adición de aminoácidos
apropiado según las recomendaciones de ABI. A continuación, los
péptidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa preparativa.
La composición de los péptidos se comprobó mediante HPLC analítica,
análisis de aminoácidos y secuenciación de proteínas en un
secuenciador automático de pulso líquido 477A.
Los péptidos se liofilizaron hasta sequedad para
eliminar cualquier sustancia química contaminante restante de la
síntesis/purificación y, a continuación, se disolvieron en agua de
grado HPLC a una concentración de \sim4 mg/ml.
Para una fosforilación a pequeña escala: 20
\mug de péptido, 10 \mul 5 x tampón quinasa (250 mM de Hepes
(pH 7,4), 750 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,1%, 10
nM de MnCl_{2}, 60 mM de MgCl_{2}, glicerol al 50%, 500 mM de
ortovanadato sódico), 5 \mul de preparación de membrana de A431 y
ATP/[\gamma-^{32}P]ATP (cantidades
relativas dependiendo del objetivo de la fosforilación). Se añadió
agua para ajustar el volumen a 50 \mul.
Para la fosforilación preparativa, se
disolvieron 2-3 mg de péptido en 1,5 ml de agua y se
añadieron a 450 \mul de 5x tampón quinasa. El pH se ajustó a 7,0.
Se añadieron 250 \mul de 0,1 M de ATP y 500 \mul de membranas
de plasma de A431 (\sim2 mg/ml) y, a continuación, se dejó
proceder la reacción durante 18 horas a temperatura ambiente con
mezclado continuo.
Se añadió un mililitro de tampón A (Tampón A:
ácido trifluoroacético al 0,08%, acetonitrilo al 1% en agua; Tampón
B: ácido trifluoroacético al 0,08%, acetonitrilo al 90%) a la
reacción de quinasas y se mezclaron. A continuación, esta solución
se centrífugo durante 20 minutos a 10.000 g hasta agrupar las
membranas. A continuación, el sobrenadante que contenía el
fosfopéptido se cargó en una columna Sep-Pak
(C_{18}) equilibrada con tampón A. La columna se lavó con 20 ml
de tampón A para eluir el ATP y, a continuación, el péptido se eluyó
con 3 x 1 ml de tampón B al 40%. La DO de las fracciones se
monitorizó a 268 nm y las fracciones que contenían péptido se
agruparon y, a continuación, se liofilizaron a sequedad (indicar que
el péptido Y751 fosforilado no tiene esencialmente absorción a 280
nm). A continuación, se separó el fosfopéptido del péptido no
fosforilado utilizando un sistema de HPLC 1090. Para la separación
preparativa, se utilizó una columna C_{18} (Aquapore
OD-300, 250 x 7 mm) equilibrada con un 100% de
tampón A (214 nm (sin. 50 mV)/280 nm (sin. 200 mV) con una velocidad
de flujo de 2 ml/min. El péptido se disolvió en 200 \mul de agua
de grado HPLC y, a continuación, se cargó a través de un bucle de
500 \mul. A continuación, se lavó la columna durante 10 minutos
con un 100% de tampón A antes de eluir el péptido y el fosfopéptido
con un gradiente lineal de 30 minutos de un 0 a un 45% de tampón B
seguido de 5 minutos de un gradiente lineal hasta un 100% de tampón
B. Las fracciones pico se recogieron manualmente. Las fracciones
agrupadas se diluyeron con agua, se liofilizaron y, a continuación,
se guardaron a -20ºC.
Los péptidos fosforilados en presencia de
[\gamma-^{32}P]ATP utilizando o bien
receptor de EGF purificado o bien membranas de células A431, se
purificaron mediante una columna Sep-Pak C_{18} y
HPLC tal y como se ha descrito anteriormente. A continuación, este
material se hidrolizó a 110ºC durante 1 hora en 1 ml de 6 M de HCl.
Se añadió un mililitro de agua de grado HPLC y la muestra se
centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos para eliminar los
detritos. El sobrenadante restante se congeló y se liofilizó hasta
sequedad. El gránulo se resuspendió en 2 ml de agua, se congeló y,
a continuación, se liofilizó una vez más. Este material se analizó
mediante electroforesis de capa fina bidimensional (esencialmente
tal y como se ha descrito por Cooper y otros, 1983).
Los péptidos se acoplaron a la matriz
esencialmente tal y como se describió por los fabricantes.
Brevemente, Se lavaron cinco veces 500 \mul (volumen empaquetado)
de resina Actigel-ALD Superflow (Sterogene, CA,
EEUU) con 100 mM de tampón fosfato (pH 7,8) (tampón de
acoplamiento)El péptido fosforilado o no fosforilado (1 mg)
se disolvió en 200 \mul de tampón de acoplamiento y se añadió a la
resina. Se añadió NaCNBH_{3} (solución de acoplamiento) a la
concentración final de 100 mM y ésta se mezcló a continuación a 4ºC
durante 6 horas. La resina se lavó con 10 volúmenes de columna de
500 mM de NaCl y, a continuación, se incubó con 100 mM de
Tris-HCl (pH 8,0) durante 1 hora en presencia de
solución de acoplamiento para bloquear cualquier sitio no
reaccionado en la resina. La resina se lavó con 500 mM de NaCl y
finalmente con tampón de acoplamiento más 500 \muM de vanadato y
NaN_{3} al 0,02% y, a continuación, se guardó a 4ºC. Los
fosfopéptidos unidos a la matriz de Actigel eran estables durante
varios meses en estas condiciones.
Las proteínas se diluyeron en tampón de unión
(50 mM de tampón fosfato (pH 7,2), 150 mM de NaCl, Triton
X-100 al 0,02%, 2 mM de EDTA y 200 \muM de
ortovanadato sódico), se mezclaron con la resina de afinidad de
péptido adecuada y, a continuación, se dejaron unirse durante 2
horas a 4ºC con rotación. El material de la columna se lavó
repetidamente (más de 6 veces) con 50 volúmenes de columna del mismo
tampón y, a continuación, son varios tampones de elusión que
contenían NaCl, urea o detergentes. Se ensayó la actividad de
PI3-quinasa de las proteína unidas o bien éstas se
extrajeron de la columna mediante ebullición en tampón de muestra
SDS-PAGE y, a continuación, se analizaron mediante
SDS-PAGE.
Los ensayos de PI3-quinasa se
llevaron a cabo esencialmente tal y como se ha descrito en Whitman y
otros (1987) en 50 \mul que contenían Tris-HCl
(pH 7,5), 50 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 0,5 mM de EDTA, 5 mM de
MgCl_{2}, 100 \muM de ATP (más 0,5 \muCi
[\gamma-^{32}P]ATP/ensayo), 1 mM de PI
más PI3-quinasa de cerebro bovino soluble o
inmovilizado en la columna. La incubación fue durante 5 minutos a
temperatura ambiente. La reacción se terminó mediante la adición de
100 \mul de 0,1 N de HCl y 200 \mul de cloroformo:metanol
(1:1). La mezcla se agitó y, a continuación, se centrifugó para
separar las fases. La fase superior se descartó y la fase orgánico
inferior se lavó con 80 \mul de metanol: 1 N HCl (1:1). Después de
la centrifugación, la fase superior se descartó de nuevo y la fase
inferior se evaporó a sequedad. Los productos de reacción se
dispusieron sobre 60 placas en capa fina de gel de sílice
(pretratadas con ácido oxálico al 1%, 1 mM de EDTA en agua:metanol
(6:4)) y se desarrolló en cloroformo:metanol:4 N amoniaco
(9:7:4).
Los antisueros de péptidos
C-terminales se prepararon contra las secuencias
C-terminales bovinas determinadas mediante la
clonación de ADNc (Otsu y otros, 1991). Los péptidos TLAYPVYAQQRR
para p85\alpha y TLAHPV
RAPGPGPPAAR para p85\beta se sintetizaron mediante química FMOC y se purificaron mediante HPLC. Los péptidos se acoplaron a KLH utilizando glutaraldehído y, a continuación, se inyectaron en los nódulos linfáticos de conejos utilizando los procedimientos descritos en Kypta y otros (1988). Los antisueros positivos según se determina mediante inmunoensayo unido a enzima se purificaron por afinidad en columnas de afinidad específicas de Actigel-péptido.
RAPGPGPPAAR para p85\beta se sintetizaron mediante química FMOC y se purificaron mediante HPLC. Los péptidos se acoplaron a KLH utilizando glutaraldehído y, a continuación, se inyectaron en los nódulos linfáticos de conejos utilizando los procedimientos descritos en Kypta y otros (1988). Los antisueros positivos según se determina mediante inmunoensayo unido a enzima se purificaron por afinidad en columnas de afinidad específicas de Actigel-péptido.
Se eligió un péptido de 17 amino9ácidos que
contiene Y751 del \beta-receptor de PDGF humano
para la síntesis en un intento de incluir todos los determinantes
de secuencias necesarios tras una investigación de los sitios de
unión conocidos para la PI3-quinasa (ver Tabla 2
anterior; revisada en Cantley y otros, 1991). Además del contexto
peptídico de Y751 del \beta-receptor de PDGF,
también se consideraron las secuencias alrededor de Y315 de la
mediana T de polioma (Talmage y otros, 1989) y Y721 del receptor de
CSF-1 humano (Shurtleff y otros, 1990). Utilizando
el protocolo de fosforilación utilizado anteriormente, se consiguió
más del 50% de fosforilación del péptido Y751 utilizando receptor
de EGF humano purificado o bien membranas de A431 como fuente de
proteína tirosina quinasa. El péptido Y751 fosforilado se podía
identificar claramente durante el análisis por HPLC de fase
inversa, en el que se eluía aproximadamente un minuto antes que el
péptido no fosforilado, ya que producía una fuerte absorbancia a
214 nm, pero o poca señal o nula a 280 nm (Figura 1, panel A). El
análisis de las propiedades de absorción mostró que la fosforilación
del péptido Y751 conducía a un desplazamiento en el máximo de
absorción de 280 a 267 nm (figura 1, panel B). Para fosforilaciones
a gran escala, las membranas de A431 eran la fuente preferida de
actividad de proteína tirosina quinasa, ya que se podían generar más
fácilmente. Sin embargo, dado que el péptido Y751 contiene dos
serinas, así como un único residuo de tirosina, se pensó que era
importante demostrar que el péptido se fosforiló exclusivamente en
el residuo de tirosina. Esto se estableció mediante dos
metodologías separadas; análisis del fosfopéptido purificado por
HPLC mediante análisis de fosfoaminoácidos o mediante la
microsecuenciación de proteínas.
El análisis de fosfoaminoácidos del péptido
Y751, fosforilado mediante el receptor de EGF purificado o membranas
de A431, demostró que la fosforilación del péptido Y751 tenía lugar
exclusivamente en el residuo de tirosina (Figura 1, panel C). El
análisis de secuencias de los péptidos fosforilados y no
fosforilados también confirmó que ambos péptidos tenían 17
aminoácidos de longitud y que sus secuencias eran idénticas excepto
en el ciclo 10 en el que tal y como se esperaba, no se observó
derivado de feniltiohidantoína-Tyr para el péptido
fosforilado debido a su modificación.
Recientemente se ha descrito una purificación de
650 veces de PI3-quinasa de cerebro bovino (Morgan
y otros, 1990), y se utilizó este mismo procedimiento a excepción de
que el gradiente para la segunda columna MonoQ se extendió para
producir dos picos diferentes que contenían actividad de
PI3-quinasa (Figura 2, panel A). Ambos picos
(referidos en la presente como pico 1 (P1) y pico 2 (P2)) no
contenían otra actividad de PI3-quinasa diferente
de la PI3-quinasa determinada mediante HPLC de
productos lipídicos desacetilados (datos no mostrados). Sin
embargo, ambas fracciones aún contenían más de 20 péptidos
detectables después del análisis del gel SDS-PAGE
mediante tinción con plata (ver figura 2, panel A). La composición
exacta de la subunidad del complejo de PI3-quinasa
activa era aún un punto de controversia, así que se realizó un
intento de afrontar la cuestión mediante la purificación por
afinidad de la actividad de PI3-quinasa de estos dos
grupos de MonoQ. La preparación de PI3-quinasa de
cerebro bovino se diluyó 10 veces en tampón de unión y se dejó que
se uniera por lotes a la resina de afinidad de fosfopéptidos Y751
durante 4 horas a 4ºC. Después de lavar extensamente la columna con
tampón de unión, las proteínas que permanecían unidas se eluyeron
con tampones que contenían SDS y se examinaron mediante
SDS-PAGE. Las dos especies principales de
polipéptidos de pesos moleculares de aproximadamente 85 y 100 kD,
que se unían específicamente a la columna de fosfopéptidos, pero no
a una columna idéntica preparada con péptido Y751 no fosforilado,
se identificaron en ambos picos de MonoQ y se observó que estaban
agotadas cuantitativamente de la preparación de
PI3-quinasa de cerebro bovino (figura 2, panel B).
Mediante el ensayo de material unido, la presencia de estas dos
proteínas parecía ser suficiente para generar actividad de
PI3-quinasa completa (figura 3, carril 2). Con
preparaciones nuevas de PI3-quinasa de cerebro
bovino, esta columna extrajo rutinariamente más de un 90% de la
actividad de PI3-quinasa presente en los picos 1 ó 2
de MonoQ (c.f., figura 3, carriles 2 y 3) tras una única
incubación. Ni las proteínas de 85 y 100 kD, ni la actividad de
PI3-quinasa se unieron a una columna con una
concentración equivalente de péptido Y751 no fosforilado (figura 3,
carril 1) o a una columna preparada con fosfotiramina, un análogo
de fosfotirosina (datos no mostrados). Debería indicarse que la
unión del complejo de PI3-quinasa a la columna de
fosfopéptidos no dio lugar a ningún incremento aparente en la
actividad enzimática total presente (figura 3, c.f., carriles 2 y
6). De hecho, frecuentemente se observó un ligero descenso en la
actividad, pero esto se consideró que era debido a la naturaleza
inestable de la enzima altamente purificada que se halló que estaba
inhibida por trazas de iones metálicos e inhibida reversiblemente
por oxidación. Se estima que esta etapa de purificación de afinidad
da lugar a una purificación de 7-8.000 veces de
PI3-quinasa de cerebro bovino en comparación con la
carga de DEAE (la purificación total conseguida del tejido es de
hecho mucho mayor).
La elución del complejo de
PI3-quinasa anterior de la columna de fosfopéptidos
demostró ser difícil de conseguir debido a la afinidad elevada de
la interacción. Kazlauskas y Cooper (1990) habían observado
previamente que la unión de proteínas p85 celulares a receptor de
PDGF fosforilado era estable al tratamiento con soluciones que
contenían detergentes iónicos, 2 M de NaCl, 1 M de urea o SDS al
0,2%. También se observó que las subunidades p85 y el complejo de
PI3-quinasa se unían fuertemente a la matriz de
fosfopéptidos Y751, y asimismo, no se eluían bajo ninguna de las
condiciones anteriores. A 20ºC, las proteínas de 85 y 110 kD
permanecían unidas en presencia de 2 M de NaCl más Triton
X-100 al 0,5%, 5 M de NaCl, 6 M de urea, 50 mM de
fosfotirosina o hasta 1 mg/ml de fosfopéptido Y752 libre. Se
investigaron varios protocolos de elución alternativos sin éxito. Un
medio de elución suministrado con la resina de Actigel era capaz de
extraer ambas proteínas pero conducía a una pérdida completa de
actividad. De forma interesante, no se pudieron establecer
condiciones adecuadas por las que la subunidad de 110 kD, pero no
la de 85 kD, se liberaba de la columna sugiriendo que la interacción
entre las subunidades de 110 y 85 kD es de afinidad elevada. La
elución de proteínas unidas se llevó a cabo de forma rutinaria
mediante el calentamiento de la resina hasta 80ºC durante 3 minutos
en presencia de tampón fosfato (pH 7,0), SDS al 0,1%, 0,1 mM de
DTT, 10% de glicerol. La columna de fosfopéptidos se podía regenerar
simplemente después de la elución mediante el lavado extenso en
tampón de unión (figura 3, carriles 4 y 5) y se podía utilizar
satisfactoriamente como mínimo diez veces antes de observar
cualquier deterioro en la unión.
Se investigó la relación de las proteínas de 85
kD, que se observó que se unían a la columna de fosfopéptidos Y751,
con las proteínas p85\alpha y p85\beta clonadas recientemente
utilizando los antisueros policlonales generados contra los 12 y 18
aminoácidos C-terminales previstos de p85\alpha y
p85\beta, respectivamente. A pesar del grado elevado de similitud
global de las secuencias entre p85\alpha y p85\beta, la
secuencia de aminoácidos sobre este segmento es significativamente
diferente y, de este modo, se esperaba que se produjeran antisueros
específicos de p85\alpha o p85\beta. Además, la secuencia de
aminoácidos correspondiente a este péptido en p85\alpha está
completamente conservada entre ADNcs humanos, bovinos y murinos
sugiriendo que los anticuerpos generados contra esta secuencia
podría ser útil para estudiar la expresión de proteínas p85
diferentes en especies diferentes de la bovina (Escobedo y otros,
1991b; Otsu y otros, 1991; Skolnik y otros, 1991). La región
correspondiente de p85\beta en especies diferentes a la bovina es
actualmente una incógnita.
Los antisueros de p85 generados contra estos
péptidos podían inmunoprecipitar específicamente las especies
apropiadas de p85 recombinante expresada de células
COS-1 o Sf9, pero no eran muy eficaces en la
inmunoprecipitación de actividad de PI3-quinasa de
líneas celulares o de la preparación de PI3-quinasa
de cerebro bovino parcialmente purificada. Sin embargo, se observó
que estos antisueros funcionaban bien en transferencias Western. Los
datos presentados en la figura 4 muestran que estos dos antisueros
reconocían específicamente proteínas p85 expresadas presentes en
células COS o en células Sf9. Las exposiciones más largas también
revelaron la proteína o proteínas p85 de COS endógenas, pero dichas
proteínas no se detectaron en células sf9 con estos antisueros. No
se observó reactividad cruzada incluso a concentraciones elevadas
de las proteínas recombinantes sugiriendo que son específicas para
p85\alpha (figura 4, panel A) y p85\beta (figura 4, panel B),
respectivamente. Se demostró que la capacidad de estos antisueros
de interaccionar con la especie de p85 apropiada estaba
completamente bloqueada en presencia del péptido adecuado utilizado
en el desarrollo de los antisueros (figura 4, panel C). Se observó
que la especie de p85 en los dos picos de actividad de
PI3-quinasa de cerebro bovino que se unía a la
columna de fosfopéptidos Y751 reaccionaba exclusivamente con los
antisueros anti C-terminal desarrollados contra la
secuencia específica de p85\alpha (figura 4, panel A). Después de
la inmovilización del material de PI3-quinasa de
cerebro bovino en la columna de fosfopéptidos Y751, todo el material
inmunorreactivo de p85\alpha se unió a la columna sin detectar
nada en el sobrenadante mediante tinción con plata o análisis de
transferencia Western (figura 4, panel D).
Para el análisis de secuencias del complejo de
PI3-quinasa, las subunidades de 110 y 85 kD se
eluyeron de la columna, tras un lavado astringente extenso,
mediante la breve ebullición de la resina en tampón fosfato 5 M (pH
7,0), SDS al 0,1%, 0,1 mM de DTT, glicerol al 10%. La preparación de
ambas proteínas de 85 y 110 kD para la digestión con
lisilendopeptidasa y el posterior análisis de secuencias se llevaron
a cabo según el protocolo descrito anteriormente en la presente
invención. El análisis de la secuencia de aminoácidos de un digesto
con lisilendopeptidasa C de la proteína p85 unida a la columna de
fosfopéptidos Y751 confirmó que la proteína p85 presente en ambos
picos 1 y 2 de la columna monoQ era idéntica a la p85\alpha
previamente clonada (Otsu y otros, 1991). No se encontraron
péptidos correspondientes a en p85\beta ningún pico. La
secuenciación extensa de la proteína de 110 kD purificada por
afinidad del material del pico 1 y el pico 2 de monoQ permitió el
aislamiento de un ADNc nuevo (ver a continuación).
Con la finalidad de evaluar la especificidad de
la columna de fosfopéptidos Y751 para purificar la
PI3-quinasa, se prepararon otras columnas de
fosfopéptidos utilizando péptidos basados en las secuencias de
aminoácidos que rodeaban sitios de fosforilación conocidos de
proteína tirosina quinasa. La tirosina 857 es el sitio de
autofosforilación principal en el \beta-receptor
de PDGF humano y se ha observado que es necesario para la unión de
GAP, pero no para la asociación con la PI3-quinasa
(Kazlauskas y Cooper, 1989, 1990; Kazlauskas y otros, 1991). Para
una comparación directa con el péptido Y751, se sintetizó un péptido
de 17 aminoácidos centrado alrededor del residuo de tirosina 857
(ver Tabla 2 anterior). En la figura 5 se muestra una comparación
de las proteínas de lisados de células Sf9 con baculovirus que
expresan p85\alpha o de fracciones de PI3-quinasa
de cerebro bovino del pico 1 (P1) y el pico 2 (P2) de mono Q que se
unen a columnas de fosfopéptidos Y751 (panel A) o Y587 (panel B).
Mientras que se observa que el p85\alpha expresado en baculovirus
se une a ambas columnas en una cantidad similar, se ve que las
proteínas de 85 y 110 kD de ambos picos de actividad sólo se unen a
la columna de fosfopéptidos Y751. De forma similar, la actividad de
PI3-quinasa sólo se encuentra asociada con la
columna de fosfopéptidos Y751 (figura 7, panel B).
Para determinar si esta especificidad de unión
se podía extender, se sintetizaron otros péptidos basados en sitios
de autofosforilación de tirosina conocidos (ver Tabla 2 anterior).
Se sintetizó también una versión más corta de 11 aminoácidos del
péptido Y751, denominado Y751S, en un intento de refinar
adicionalmente el dominio de reconocimiento SH2 mínimo requerido.
Se prepararon dos otros péptidos que contenían el motivo YXXM, uno
basado en la secuencia alrededor de la tirosina 740 del
\beta-receptor de PDGF, un segundo residuo en la
inserción de quinasa del receptor de PDGF que puede jugar un papel
en la unión de PI3-quinasa (Escobedo y otros,
1991a), y el segundo basado en la secuencia alrededor de la tirosina
Y1313 de Met, el receptor del factor de crecimiento del hepatocito.
Para introducir una secuencia totalmente aleatoria el péptido
sintético poli Glu:Ala:Tyr (6:3:1) también se fosforiló y se acopló
a la matriz de Actigel.
Finalmente, los péptidos que rodeaban los dos
sitios de fosforilación principales de
pp60^{c-src}, Y416 e Y527, se adquirieron y se
sintetizaron, respectivamente. Todos los péptidos se fosforilaron de
manera eficaz específicamente en los residuos de tirosina
utilizando el receptor de EGF y, a continuación, se purificaron
mediante HPLC tal y como se ha descrito anteriormente para el
fosfopéptido Y751.
Se eligieron las p85\alpha y p85\beta
bovinas expresadas en baculovirus para probar estas columnas (Otsu
y otros, 1991). Los análisis de unión se llevaron a cabo en
condiciones idénticas a las establecidas previamente para la
columna de fosfopéptidos Y751. De manera algo inesperada, las
subunidades p85 expresadas en baculovirus se unieron a todas las
columnas de fosfopéptidos de prueba (ver figura 7, paneles A y B).
Sin embargo, no se unieron a columnas idénticas que contenían
péptidos no fosforilados (figura 6, paneles A y B, carril 1 y datos
no mostrados). Sin embargo, cuando se aplicó
PI3-quinasa de cerebro bovino parcialmente
purificada a estas columnas, se observó que se unía exclusivamente a
las columnas de fosfopéptidos que contenían un motivo YXXM (ver
figura 7 y figura 8, panel A).
Que la columna de fosfopéptidos Y751S parezca
ser tan eficaz en la unión del complejo de
PI3-quinasa activo como la columna de fosfopéptidos
Y751 más larga sugiere que la secuencia de consenso propuesta
recientemente por Cantley y otros, (1991) contiene de hecho todos
los datos de la secuencia necesarios para el reconocimiento
correcto por el dominio SH2 de la PI3-quinasa
(figura 8, panel B).
Las enzimas de restricción y las enzimas de
modificación de ADN se obtuvieron de fuentes comerciales estándar y
se utilizaron según las recomendaciones del fabricante. Los
oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied
Biosystems 380B y se utilizaron directamente en los procedimientos
posteriores.
La línea de células SGBAF-1 se
estableció mediante transfección de células de la zona fasciculata
del córtex adrenal bovinas con pSV3neo tal y como se ha descrito
anteriormente para otros tipos de células (Whitley y otros, 1987).
Las células SGBAF-1 y las células
COS-1 se mantuvieron en un medio Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de suero de ternera fetal
(FCS). El mantenimiento de las células de Spodoptera
frugiperda (Sf9) se llevó a cabo tal y como se ha descrito por
Summers y Smith, 1987.
La purificación de las proteínas p85\alpha y
p110 mediante cromatografía en un columna de afinidad de péptidos
correspondiente a los aminoácidos 742-758 de la
región de inserción de quinasa del \beta-receptor
de PDGF humano se ha descrito anteriormente. El procedimiento
utilizado para la purificación final de p110 para el análisis de la
secuencia de aminoácidos estaba de acuerdo con el Protocolo mostrado
anteriormente en la presente invención. Este procedimiento se llevó
a cabo en tres preparaciones de PI3-quinasa
separadas. Una cuarta preparación se eluyó de la matriz al igual
que antes y se puso a ebullición durante 5 minutos. Después de
enfriarse, la muestra se diluyó con 25 mM de
Tris-HCl, pH 8,8 y se digirió directamente con
lisilendopeptidasa durante 72 horas a 30ºC. Los péptidos se
separaron al igual que antes. Las secuencias de los péptidos se
determinaron utilizando un secuenciador automático de pulso líquido
477A de Applied Biosystems.
Se aisló el ARN total de SGBAF-1
mediante el procedimiento de Chirgwin y otros (1979) y se seleccionó
el ARNm poli(A)^{+} mediante cromatografía en
celulosa de oligo-dT (Maniatis y otros, 1982). Se
construyó una biblioteca de ADNc cebado con
oligo-dT de 5 x 10^{6} recombinantes primarios en
lambda Uni-Zap (Stratagene) a partir de 5 \mug de
este ARNm utilizando el sistema de clonación de ADNc de Stratagene
Uni-Zap. La construcción de la biblioteca de ADNc
de cerebro bovino en lambda Uni-Zap se ha descrito
previamente (Otus y otros, 1991).
La biblioteca de ADNc de SGBAF no amplificada
(10^{6} recombinantes) se colocó en placas de E. coli K12
PLK-F’ (Stratagene) en una densidad de 10^{5}
placas por 15 cm de plato y se realizaron estiramiento
("lifts") por duplicado en membranas de nitrocelulosa
(Millipore). Para el cribado, los filtros se prehibridaron durante
por lo menos 1 hora a 42ºC en 6 x SSPE, SDS al 0,5%, 10 x solución
de Denhardt, 100 \mug ml^{-1} de ADN de esperma de arenque
sonicado desnaturalizado (Sigma). La hibridación se llevó a cabo en
la misma solución que contenía 10 ng ml^{-1} de oligonucleótido
radiomarcado. Los oligonucleótidos utilizados fueron: Péptido N
(MDWIFHT)
5’-AA(G/A)ATGGA(T/C)TGGAT(C/T/A)TT
(T/C)CA(T/C)AC-3’); Péptido J
(D D G Q L F H I D F G H F)
5’-GATGATGGCCA(G/A)CTGTT(T/C)CA(T/C)AT(T/A)GA(T/C)TTTGGCCA
(T/C)TT. Los oligonucleótidos se marcaron con ^{32}P en el
extremo 5’ en una reacción de 20 \mul que contenía 100 ng de
nucleótido, 1 x tampón quinasa (Promega), 0’1 mM de espermidina, 5
mM de ditiotreitol, 100 \muCi[\gamma^{32}P]ATP
(5000 Ci mmol^{-1}, Amersham) y 2 \mul (20 U) polinucleótido
quinasa de T4 (Amersham). Los filtros se lavaron en 6 x SSC, SDS al
0,1% a temperatura ambiente y, a continuación, se sometieron a
autorradiografía utilizando una película Kodak XAR. Los clones de
hibridación se purificaron en placas y se rescataron como plásmidos
según las instrucciones del fabricante.
La secuenciación se llevó a cabo mediante el
procedimiento de terminación de cadena utilizando el sistema de
Sequenasa (United Status Biochemicals). Los clones para la
secuenciación se obtuvieron mediante la clonación dirigida de los
fragmentos de restricción en los vectores mp18 y mp19 de M13
(Yanisch-Perron y otros, 1985) y mediante la
producción de una serie de deleciones mediada por la exonucleasa III
(Henikoff, 1984; kit de deleción de Exonucleasa III Pharmacia). Las
secuencias de ADN se analizaron en un ordenador MicroVAX utilizando
el paquete de análisis de secuencias Wisconsin (UWGCG: Devereaux y
otros, 1984).
Se llevó a cabo una PCR RACE esencialmente tal y
como se ha publicado previamente (Forman y otros, 1988; Harvey y
Garlison, 1991). Brevemente, la primera cadena de ADNc cebada con
hexámeros aleatorios (Amersham) se sintetizó a partir de 1 \mug
de ARNm de células SGBAF-1 utilizando el kit de
síntesis de la primera cadena de ADNc de Stratagene. La primera
cadena de ADNc de aisló mediante precipitación con isopropanol y se
alargó con oligo-dA utilizando desoxinucleotidil
transferasa terminal (BRL). La PCR se realizó utilizando oligo 2224
(5’-AATTCACACACTGGCATGCCGAT) y adaptador-dT
(5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT) como cebadores utilizando
un kit para PCR de tap polimerasa Perkin Elmer/Cetus (condiciones:
94ºC, 1 minuto, 35ºC, 1 minuto, 72ºC, 2 minutos, 30 ciclos). Los
productos se fraccionaron en un gel de agarosa al 1,5 % de punto de
fusión bajo y se visualizaron mediante tinción con bromuro de
etidio. El gel se separó en 6 bandas (intervalo de tamaño de
150-2000 pb) y el ADN se aisló de cada fracción de
gel. Se realizó un ronda adicional de PCR en este ADN utilizando el
oligonucleótido 2280 (5’-TTTAAGCTTAGGCATTCTAAAGT CACTATCATCCC) y el
adaptador (5’-GACTCGAGTCGACATCGA) como cebadores (condiciones:
94ºC, 1 minuto, 56ºC, 1 minuto, 72ºC, 2 minutos, 35 ciclos). Los
productos se fraccionaron en un gel de agarosa y se visualizaron
mediante tinción con bromuro de etidio. Se esperó una banda de 250
pb más corta que el tamaño del ADN en la fracción del gel utilizada
para la PCR. Se separó una banda de teñido muy intenso de 350 pb
obtenida de la fracción de gel de 600 pb, se digirió con HindIII y
SalI y se ligó en HindIII y XhoI digeridos con Bluescript KS para
obtener el plásmido pBS/RACE. Se secuenciaron completamente dos
inserciones independientes.
Los ADNs de peso molecular elevado se aislaron
de líneas celulares mediante técnicas estándar (Maniatis y otros,
1982). Los ADNs se digirieron con endonucleasas de restricción, se
fraccionaron mediante geles de agarosa al 0,5% y se transfirieron a
nitrocelulosa (BA85, Schleicher y Schuell) tal y como se ha descrito
en Maniatis y otros (1982). La prehibridación se llevó a cabo en 1
M de NaCl, 10 x solución de Denhardt, 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM de EDTA, SDS al 0,1% y 100
\mug ml^{-1} de ADN de esperma de arenque sonicado
desnaturalizado a 65ºC. La hibridación se llevó a cabo durante toda
la noche en la misma solución que contenía 20 ng ml^{-1} de
fragmento de sonda radiomarcado (fragmento de 0,88 kb
XbaI-Psti: sonda a, figura 9, panel inferior) de
actividad específica superior a 10^{8} dpm \mug^{-1}). Los
fragmentos de la sonda se aislaron de los geles de agarosa para
electroelución (Maniatis y otros, 1982) y ser marcados mediante el
traslado de mellas (Rigby y otros, 1977) utilizando
[\alpha-^{32}] dATP (> 3000 Ci mmol^{-1},
Amersham). Las membranas se lavaron extensamente en 0,1 x SSC, SDS
al 0,1% a 68ºC o a 50ºC en 0,5 x SSC, SDS al 0,1% para detectar
secuencias relacionadas y se sometieron a una autorradiografía con
una película Kodak XAR.
El ARN poli(A)^{+} de cerebro
bovino total o la línea de células SGBAF-1
modificada con DMSO y glioxal y se fraccionaron en un gel de
agarosa al 0,9% arrastrado en 10 mM de tampón fosfato (pH 7,5)
(Maniatis y otros, 1982). El ácido nucleico se transfirió a
membranas de nylon (Hybond-N, Amersham) y los
filtros se cocieron en seco. La prehibridación se llevó a cabo a
60ºC en formamida al 50%, 5 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, SDS
al 0,2%, 200 \mug ml^{-1} de ADN de esperma de arenque sonicado
desnaturalizado y 200 \mug ml^{-1} de ARN de levadura. La
hibridación se llevó a cabo en la misma solución que contenía 1 x
10^{7} cpm ml^{-1} de sonda de ARN antisentido. La sonda se
preparó mediante transcripción in vitro de un fragmento de 2
kb (nucleótidos 598-2608; Sonda b, figura 9, panel
inferior) subclonado en pSPT19 (Boehringer), utilizando ARN
polimerasa SP6 (Amersham) y [\alpha-^{32}] UTP
(Amersham) según las condiciones del fabricante. Las membranas se
lavaron en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. Los filtros se trataron
con 1 \mug ml^{-1} de ARNasa A (Sigma) en 2 x SSC durante 15
minutos a temperatura ambiente y el filtro se enjuagó a 50ºC en 0,1
x SSC. A continuación, los filtros se sometieron a autorradiografía
contra una película Kodak XAR a -70ºC.
Para p85\alpha, se transcribieron de forma
inversa 125 ng de ARN poli(A)^{+} con 2,5 unidades
de ADN polimerasa rTth
(Perkin-Elmer-Cetus) a 70ºC durante
10 minutos en una reacción de 10 \mul que contenía 10 mM de
Tris-HCl (pH 8,3), 90 mM de KCl, 0,5 mM de mezcla de
DNTP y 1,2 \muM de cebador antisentido (5’-CAGGCCTGGCTTCCTGT).
Para la polimerización de ADN el volumen de reacción se ajustó a 50
\mul mediante la adición de una mezcla única produciendo las
siguientes concentraciones finales: 5% (v/) de glicerol, 10 mM de
Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM de KCl, 0,75 mM de EGTA,
0,05% (v/v) de Tween 20, 2 mM de MgCl_{2}, 0,24 \muM de cebador
de sentido (5’-AACCAGGCTCAACTGTT). A continuación, se realizó la
PCR bajo las siguientes condiciones de reacción: 92ºC 1 minuto,
72ºC 1 minuto durante 25 ciclos en ciclador térmico de ADN Perkin
Elmer-Cetus.
Las condiciones para la p100 fueron similares a
excepción de que la concentración del cebador antisentido
(5’-TGCTGTAAATTCTAATGCTG) se incrementó hasta 4,8 \muM durante la
etapa de transcripción inversa. Las condiciones de polimerización
de ADN fueron las mismas a excepción de que la concentración final
de MgCl_{2} se incrementó hasta 2,5 mM y ambos cebadores (cebador
de sentido = 5’-GTATTTCATGAAACAAATGA) estaban presentes en una
concentración final de 0,96 \muM. También se añadió Taq ADN
polimerasa (Promega) a 0,03 U \mul^{-1}. La PCR se realizó
según se indica a continuación: 92ºC 30 segundos, 54ºC 5 segundos,
72ºC 30 segundos durante 35 ciclos. Se desarrollaron 20 \mul de
cada reacción en un gel de agarosa al 3% (Maniatis y otros, 1982) y
se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.
Para la preparación del antisuero de p110 anti
C-terminal, se sintetizó el péptido CKMDWIFHTIKQHALN
mediante química FMOC y se purificó mediante HPLC. A continuación,
se acopló a KLH utilizando glutaraldehído y se inyectó en los
nódulos linfáticos de conejos utilizando procedimientos descritos en
Kypta, R M y otros (190), Cell 62, 481-492. Los
antisueros positivos determinados mediante inmunoensayo de unión a
enzimas se purificaron por afinidad en columnas de afinidad de
péptido-Actigel. Los antisueros
anti-p85\alpha (Otsu y otros, 1991) y anti
receptor de CSF-1 (Ashmun y otros, 1989) se han
descrito previamente. Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo
tal y como describieron en Otsu y otros, 1991.
El ensayo de la actividad de
PI3-quinasa se llevó a cabo tal y como describieron
Whitman y otros (1985).
Para clonar la región codificante de p100 en el
vector de transferencia de baculovirus p36C (Page, 1989), se cambió
un sitio Sau 3A1 (GGATCA) presente 10 nucleótidos en dirección 5’
desde el codón de iniciación (ver figura 9) a un sitio BamHI
(GGATCC) mediante mutagénesis mediada por PCR. Brevemente, se
utilizó un oligonucleótido de sentido sustituyendo C por A en la
posición 6 del sitio Sau 3AI en una reacción de PCR con un cebador
antisentido que comprendía los nucleótidos
(102-104) de la secuencia de p110 (ver figura 9)
utilizando Vent polimerasa (New England Biolabs). El ADN plantilla
era una primera cadena de ADNc cebada aleatoriamente preparada a
partir de ARNm de células SGBAF-1 tal y como se ha
descrito anteriormente; las condiciones de la PCR: 94ºC 1 minuto,
50ºC 1 minuto, 72ºC 2 minutos, 35 ciclos. El producto de la PCR se
digirió con BamHI-EcoNI y se aisló un fragmento de
118 pb de un gel de agarosa con un punto de fusión bajo. Este
fragmento de BamHI-EcoNI se clonó en p110/2.2, se
digirió con BamHI (presente en las secuencias del vector) y EcoNI
(nucleótido = 108) produciendo un plásmido p110/(BamHI). El
fragmento BamHI-EcoNI de p110/(BamHI) se secuenció y
se halló que estaba de acuerdo con el determinado previamente. Se
aisló un fragmento BamHI-KpnI de 3,4 kb (sitio KpnI
presente en el vector) de p110/(BamHI) y se ligó en el vector de
transferencia de baculovirus p36C (Page, 1989) digerido previamente
con los mismos enzimas. Los virus recombinantes se obtuvieron tal y
como describieron Summers y Smith (1987). Las células Sf9 se
infectaron en una multiplicidad de infección de 10 con virus
recombinantes en medio IPL-41 suplementado con FCS
al 10%. Las células se recogieron y se lisaron 2 días después de la
infección en tampón de lisis EB (20 mM Tris-HCl (pH
7,4), 50 mM de NaCl, 50 mM de NaF, NP40 al 1%, 1 mM de EDTA, 500
\muM de ortovanadato sódico, 2 mM de PMSF, 100 unidades de
Aprotinina, inhibidor de calicreína, por ml) (Kazlauskas y Cooper,
1989) y los lisados se analizaron mediante inmunoapreciación.
Este ensayo se realizó esencialmente tal y como
se describió por Kazlauskas y Cooper (1990). Las células Sf9 se
infectaron tal y como ya se ha descrito y se lisaron 48 horas
después de la infección en tampón de lisis EB. El receptor de
CSF-1 se inmunoprecipitó a partir de las células Sf9
y se recogió en bolas de Proteína A-Sefarosa. A
continuación, el inmunocomplejo se sometió a un lavado extenso (3
veces con tampón de lisis EB, dos veces con tampón quinasa; 50 mM
de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCL, Triton X-100 al
0,02%, 12 mM de MgCl_{2}, 2MM de MnCl_{2}, glicerol al 10%, 500
\muM de ortovanadato sódico) y el receptor se fosforiló durante
15 minutos a 20ºC con ATP. A continuación, los precipitados se
lavaron de nuevo para eliminar el ATP libre y se incubaron durante
2 horas a 4ºC con lisados de células preparados a partir de células
Sf9 infectadas con virus que expresan (i) p85\alpha, (ii) p110 o
(iii) o coinfectadas con virus que expresan p85\alpha y p110. Los
complejos inmunes se lavaron y se ensayó la actividad
PI3-quinasa asociada.
Para la expresión transitoria de p85\alpha en
células COS-1, se clonó la región codificante para
p85\alpha en el vector de expresión pMT2 basado en el promotor
tardío de adenovirus (Kaufman y otros, 1989) tal y como se ha
descrito previamente (Otsu y otros, 1991). Para la expresión del
ADNc de p110 se construyó el plásmido pSG5-p110 de
la siguiente manera. El fragmento BamHI-HindIII de
3,4 kb de ADNc p2.1 se ligó en pSG5 (Stratagene) cortado con BamHI
y BgIII, los salientes HindIII y BgIII de p2.1 y pSG5
respectivamente, rellenándose con polimerasa Klenow. Esto produjo
la construcción pSG5.2.
El plásmido pBS/RACE (anterior) se digirió con
EcoRI y HindIII, el gel de la banda de 350 pb se purificó mediante
electroelución (Maniatis y otros, 1982) y se digirió posteriormente
con Sau3AI y BsmI. A continuación, esta mezcla se añadió al
fragmento BsmI-BstMI purificado del gel de p2.1 y se
ligó en una ligación de tres fragmentos a pSG5.2 digerido con BamHI
y BstXI. Se transfectaron 5 \mug de cada ADN en plastos de 10 cm
de células COS-1 confluentes en un 80% utilizando
Lipofectina (BRL) en las condiciones sugeridas por los fabricantes.
Se analizaron los lisados mediante inmunoprecipitación con antisuero
policlonal anti-p85\alpha o con antisuero de
péptido C-terminal anti-p110. Los
inmunocomplejos recogidos en bolas de Proteína
A-Sefarosa se analizaron en geles de
SDS-PAGE al 10% seguido de una autorradiografía o se
sometieron a ensayos de PI3-quinasa in vitro
tal y como se ha descrito.
Inicialmente, se cribó una biblioteca ADNc de
cerebro bovino cebado con un oligo(dT) (Otsu y otros, 1991)
con sondas de oligonucleótidos fabricadas contra los péptidos J y N
(ver figura 9). No se detectaron clones de hibridación. Por lo
tanto, se construyó una nueva biblioteca de ADNc de 5 x 10^{6}
recombinantes primarios a partir de ARNm aislado de una línea de
células de la zona fasciculata del córtex adrenal bovino
transfectado con pSV3neo (SGBAF-1), que se sabía que
contenía actividad de PI3-quinasa (Otsu y otros,
1991). El cribado de 1 x 10^{6} recombinantes primarios de esta
biblioteca con los mismos oligonucleótidos condujo a la detección
de 66 clones positivos con ambas sondas. Se caracterizaron veinte
clones solapantes y se observó que poseían inserciones de
1-4 kb. El clon con la inserción más larga que
representa la secuencia codificante (clon p110/2.1) se secuenció
completamente. Esto reveló un marco de lectura abierto (ORF)
potencial de 1053 aminoácidos con un peso molecular previsto de 123
kD. El ORF contenía todos los péptidos secuenciados, pero no estaba
precedido de codones de finalización
"in-frame". Dado que el tamaño previsto de la
proteína p110 de geles SDS es 110 kD, era posible que la proteína
pudiera iniciarse a partir de una metionina interna en este
ORF.
Los estudios de expresión llevados a cabo en
células COS-1 utilizando las metioninas 16, 30, 123
y 130 como codones de iniciación potenciales (iniciación en la Met
123 daría lugar a una proteína de 110 kD) no condujeron a la
síntesis de una proteína correspondiente a p110 o al incremento de
actividad de PI3-quinasa en estas células. Esto
sugirió que p110/2.1 carece de la secuencia codificante 5’ y que, o
bien, la proteína p110 corre de forma anómala en geles de
SDS-PAGE, o bien, que se sintetiza como parte de un
precursor de molécula más grande. La caracterización de los 46
clones positivos restantes aislados inicialmente, mostró que todos
tenían inserciones más cortas que en el clon p110/2.1. Con el fin de
extender adicionalmente el ADNc de p110/2.1 en la dirección 5’ se
utilizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de tipo RACE
(amplificación rápida de los extremos de ADNc) (Forman y otros,
1988; Harvey y Garlison, 1991). Se caracterizaron dos productos
independientes que extendieron la secuencia de nucleótidos conocida
(ver figura 9, panel inferior). Las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos deducidos para la región codificante del ADNc compuesto
se presentan en la figura 9. El codón de iniciación putativo está
precedido por un codón de finalización
"in-frame" y tiene lugar en una secuencia de
consenso Kozak (Kozak, 1987) para la iniciación de la traducción
(datos no mostrados). La secuencia de aminoácidos deducida codifica
una proteína de 1068 aminoácidos con una masa molecular relativa
calculada de 124.247.
La región codificante del ADNc para p110 es
extremadamente rica en A+T (contenido de G+C = 39,3%) que se
refleja en la imposibilidad de utilizar codones TCG (serina) y GTC
(valina). Cuando la secuencia de aminoácidos de p110 se comparó con
las secuencias en las bases de datos de proteínas Swissprot y NBRF,
se observó una homología significativa a una sola proteína, Vps34p
(figura 10). Esta es una proteína rara de 100 kD de Saccharomyces
cerevisiae implicada en el tráfico de proteínas en la vacuola
de la levadura y en la morfogénesis de la vacuola durante la
gemación (Herman y Emr, 1990). Una búsqueda en la secuencia de p110
de aminoácidos conservados en los sitios activos de las quinasas,
revela G_{842}, K_{863}, D_{916}, N_{921} y el triplete DFG
en los residuos 933-935 (estos residuos están
marcados en la figura 2B) que podrían ser homólogos a G_{52},
K_{72}, D_{166}, N_{171} y el triplete DFG en los residuos
184-186 en la proteína quinasa dependiente de AMPc
(Knighton y otros, 1991 a,b). Los residuos equivalentes están
presentes en Vps34p y también están marcados en la figura X. El
bucle P rico en glicina (Saraste y otros, 1990), hallado en muchas
quinasas (Hanks y otros, 1988), no parece estar presente en p110 o
Vps34p.
Debido a la existencia de cómo mínimo dos formas
de p85 (Otsu y otros, 1991), se utilizó el análisis de
transferencia Southern para analizar el número de genes relacionados
con p110 que aparecen en ADN genómico aislado de fuentes bovinas,
humanas y ratas. El análisis proporciona claramente evidencias de un
segundo gen, estrechamente relacionado, en el ADN genómico de rata
y humano (por ejemplo, comparar la figura 11A, carriles 4 y 9, con
la figura 11B, carriles 4 y 9). Para el ADN bovino, no parece haber
señales de hibridación eliminadas por el lavado a una astringencia
más elevada (compara la figura 11A, carriles 1, 2 y 3, con la figura
11B, carriles 1, 2 y 3). Sin embargo, es posible que un gen
relacionado exista en el ADN bovino, pero, o no se híbrida de forma
cruzada en las condiciones utilizadas, o es demasiado similar en la
secuencia para detectarse mediante un lavado diferencial.
En la figura 12A se muestra un análisis de
transferencia northern llevado a cabo en ARNm aislado de una línea
de células de SGBAF-1 y cerebro bovino total. Ambas
muestras de ARNm contienen transcritos principales específicos de
p110 de 4,8 kb y 9 kb, aunque existe sustancialmente más mensaje de
p110 presente en ARNm aislado de células de SGBAF-1
(figura 12A, carril 2) que el aislada del cerebro bovino total
(figura 12A, carril 1). Se realizó un estudio basado en la PCR para
examinar la distribución y conservación de ARNm de p110 en líneas
celulares y tejido de varias especies. La amplificación de un
fragmento específico de p110 se observa para tres ARNms humanos
(210 pb; figura 12B, carriles 1, 2 y 3) y dos ARNms bovinos (212 pb;
figura 12B, carriles 5 y 6). Se amplifican fragmentos de tamaños
similares a partir de líneas celulares de origen simio o porcino
(figura 12B, carriles 4 y 7, respectivamente), indicando la
existencia de un homólogo de p110 en estas especies. Una banda
adicional de 300 pb se amplifica a partir de ARNm de cerebro bovino
(figura 12B, carril 5) y su identidad se está investigando
actualmente. Dado que la actividad de PI3-quinasa
puede residir en un complejo p85\alpha/p110 (Carpenter y otros,
1990; Otsu y otros, 1991; Shibasaki y otros, 1991), se examinaron
algunas de estas líneas celulares para observar si se coexpresan
los mensajes para p85\alpha y p110. Se observa la amplificación
de un fragmento de 190 pb específico de p85\alpha para tres líneas
celulares de omisión humanas (figura 12C, carriles 1, 2 y 3) y una
línea celular de simio (figura 12C, carril 4) analizadas. De este
modl, por lo menos en estas cuatro líneas celulares, se coexpresan
los mensajes para p85\alpha y p110.
Para demostrar que el ADNc de p110 codifica la
subunidad de 110 kD de PI3-quinasa, se expresó en el
sistema de expresión de baculovirus (Summers y Smith, 1987). La
inmunoprecipitación con antisuero anti-p110 de
células de Spodoptera fugiperda (Sf9) infectadas con el virus
p36C-p110 reveló una proteína nueva de peso
molecular aparente de 110 kD (figura 13A, carril 4) que comigró con
la subunidad de PI3-quinasa p110 purificada de
cerebro bovino. No se observó dicha proteína en inmunoprecipitados
con anti-p110 preparados a partir de células
infectadas con un virus natural de control (figura 13A, carril 2).
El p110 expresado en baculovirus se utilizó para examinar si el
p110 solo posee actividad catalítica o si se requiere un complejo
p85\alpha/p110. Cuando se realizó el ensayo, se observó que los
inmunoprecipitados que contienen p110 poseen niveles significativos
de actividad de PI3-quinasa (figura 13B, carril 4),
confirmándose la identidad del producto lipídico como
PI(3)P mediante análisis HPLC. No se detectó actividad
en inmunoprecipitados con anti-p110 preparados a
partir de células infectadas de control (figura 13B, carril 2).
Estos resultados demuestran claramente que la subunidad p110 de
PI3-quinasa es suficiente para la actividad
catalítica.
Dado que La PI3-quinasa
purificada de cerebro bovino es un complejo de p85\alpha y p110,
se examinó la capacidad de p85\alpha y p110 expresadas en células
de insectos de reconstituir un complejo p85\alpha/p110 activo.
Los baculovirus que expresan p85\alpha
(pAcC4-p85\alpha ; Otsu y otros, 1991) o p110
(p36C-p110) se infectaron por separado, o juntos,
en células Sf9 y expresaron proteínas analizadas tal y como se
describen en procedimientos experimentales. Los inmunoprecipitados
de p85\alpha sola (figura 13A, carril 3) fueron inactivos en un
ensayo de PI3-quinasa (figura 13B, carril 3) tal y
como se ha demostrado previamente (Otsu y otros, 1991). En
experimentos de doble infección, se detectaron tanto p85\alpha
como p110 en inmunoprecipitados con
anti-p85\alpha (figura 13A, carril 5) o
anti-p110 (figura 13A, carril 6). Dado que ninguno
de los antisueros específicos de subunidad reconoce la otra
subunidad (ver figura 15A, carril 3; figura 15C, carril 2), la
interpretación más sencilla de estos datos es que, cuando se
expresan en células Sf9, p110 y p85\alpha (figura 13B, carril 5)
o los antisueros anti-p110 (figura 13B, carril 6)
eran ambos activos. Ningún antisuero inmunoprecipitó actividad de
PI3-quinasa endógena de células Sf9 infectadas con
virus naturales (figura 13B, carriles 1 y 2).
Se ha observado que la actividad de
PI3-quinasa se asocia con muchos receptores de PTK
activados, pero particularmente se han estudiado bien aquellos
receptores PTKs que poseen una región de inserción de quinasa, por
ejemplo, \beta-receptor de PDGF (Coughlin, S R y
otros, (1989), Science 243, 1191-1193 y el receptor
de CSF-1 (Varticovski y otros, 1989; Shurtleff y
otros, 1990). Se utilizó un ensayo de asociación in vitro
(Kazlauskas y Cooper, 1990) para estudiar la asociación de la
actividad de PI3-quinasa expresada en células de
insectos con el receptor de CSF-1 activado. La
figura 14 muestra que la actividad de PI3-quinasa
expresada en baculovirus se puede asociar con el receptor de
CSF-1, pero sólo de un lisado de células Sf9 que
contiene tanto p85\alpha y p110 (figura 14, carril 2) y sólo
cuando el receptor se ha fosforilado previamente a la incubación
con un lisado de células Sf9 (comparar figura 14, carriles 2 (+ATP)
y 3 (-ATP)). No se asocia actividad de PI3-quinasa
con receptores de CSF-1 incubados con lisados de
células Sf9 que contienen p85\alpha y p110 (figura 14, carril 4)
o p110 solo (figura 14, carril 5). No es observa actividad asociada
con el receptor de CSF-1 inmunoprecipitado de
células Sf9 (figura 14, carril 1). De este modo, las subunidades de
PI3-quinasa expresadas en células de insectos se
pueden utilizar para reconstituir un complejo p85\alpha/p110
activo que se une a un receptor de PTK fosforilado.
Todos los resultados mostrados anteriormente se
obtuvieron de los estudios de expresión llevados a cabo en células
de insectos. Con el fin de estudiar p110 y su interacción con
p85\alpha en un sistema de células de mamífero, se realizaron
estudios de coexpresión transitoria en células
COS-1. El ADNc de p110 se clonó en el vector de
expresión basado en SV40, pSG5 (produciendo el plásmido
pSF5-p110) y se transfectó en células
COS-1, solo o junto con una construcción de
expresión de p85\alpha, pMT2-p85\alpha (Otsu y
otros, 1991). Para permitir una visualización más fácil de las
proteínas, las células COS-1 transfectadas se
marcaron metabólicamente con ^{35}S-metionina
durante 3-4 horas antes de la lisis. El radiomarcaje
en este punto da lugar al marcaje preferencial de proteínas
sintetizadas a partir de construcciones transfectadas. Los lisados
de células se inmunoprecipitaron con antisueros
anti-p85\alpha (figura 15, paneles A y B) o
anti-p110 (figura 15, paneles C y D). Las proteínas
inmunoprecipitadas se visualizaron mediante autorradiografía después
del fraccionamiento en geles SDS-PAGE (figura 15,
paneles A y C) o sometidas a un ensayo in vitro de
PI3-quinasa (figura 15, paneles B y D).
La transfección de
pMT2-p85\alpha dio lugar a un incremento
significativo de p85\alpha sobre el nivel base debido a
p85\alpha de simio endógeno - comparar la figura 15A, carriles 2 y
4 con la figura 15A, carril 1. En los cotransfectantes de
p85\alpha/p110, el antisuero anti-p85\alpha
coinmunoprecipita p85\alpha y p110 (figura 15A, carril 4),
demostrando la existencia de un complejo p85\alpha/p110. Cuando se
realizaron ensayos de actividad de PI3-quinasa en
los inmunoprecipitados de anti-p85\alpha, sólo se
detectó una mayor actividad (10 veces sobre la base debido a
PI3-quinasa endógena de simio) con
inmunoprecipitados que contenían tanto p85\alpha como p110
(comparar la figura 15B, carril 4 con la figura 15B, carriles 1, 2 y
3). Estos resultados demuestran que en células
COS-1, como en células Sf9, el ADNc de p110 dirige
la síntesis de una proteína de peso molecular 110 kD, que se asocia
con p85\alpha para producir un complejo p85\alpha/p110 que
posee actividad de PI3-quinasa.
Sin embargo, cuando las proteínas se
inmunoprecipitaron a partir de los mismos lisados con el antisuero
anti-p110 y se realizaron los ensayos de
PI3-quinasa, los resultados fueron sorprendentes.
Tal y como se esperaba, el antisuero anti-p110
inmunoprecipitó p110 de células transfectadas con
pSG5-p110 (figura 15C, carril 3). Sin embargo,
además, sólo inmunoprecipitaría p110 libre de lisados preparados a
partir de células cotransfectadas con p85\alpha y p110 (figura
15C, carril 4), incluso cuando el complejo p85\alpha/p110 estaba
presente en estos lisados (figura 15A, carril 4). Cuando se ensayó
la actividad de PI3-quinasa, en inmunoprecipitados
que contenían p110 preparados a partir de células transfectadas con
p110 (figura 15D, carril 3) o células cotrasnfectadas con
p85\alpha y p110 (figura 15D, carril 4) no se observó actividad
que estuviera por encima de la presente en inmunoprecipitados de
control (figura 15D, carriles 1 y 2). De este modo, el antisuero
anti-p110 es capaz de inmunoprecipitar p110 de
lisados de células de tanto células Sf9 infectadas (figura 13A,
carril 4) como de células COS-1 transfectadas
(figura 15C, carril 3), pero sólo los inmunoprecipitados preparados
a partir de lisados de células Sf9 poseen niveles elevados de
actividad de PI3-quinasa (comparar la figura 13B,
carril 4 y la figura 15D, carril 3). Además, el antisuero
anti-p110 inmunoprecipita el complejo
p85\alpha/p110 cuando se expresa en células Sf9, pero no cuando
se expresa en células COS-1.
Tal y como se ha indicado anteriormente, el
análisis del ADNc de p110 clonado muestra que codifica una proteína
de 1068 aminoácidos con un peso molecular calculado de 124 kD. La
razón de la diferencia en el tamaño entre el valor de peso
molecular calculado (124 kD) y el observado de 110 kD no está clara,
pero se sabe que muchas proteínas migran de manera anómala en geles
de SDS-PAGE. La expresión de la proteína codificada
por este ORF en lisados de células Sf9, células
COS-1, reticulocitos y E. coli dan lugar
todos a la producción de una proteína de peso molecular aparente de
110 kD.
La secuencia de aminoácidos deducida de p110
contiene todas las secuencias de péptidos determinadas por el
análisis de las secuencias de proteínas. Dado que los péptidos se
obtuvieron a partir de la digestión con lisilendopeptidasa, se
espera que todos deberían estar precedidos de un residuo de
arginina. Esto es cierto en todos los casos a excepción del péptido
A que está precedido de un residuo de arginina (Arg 162). Los datos
de la secuencia de nucleótidos obtenidos a partir de otro clon de
ADNc que cubre esta región confirma la presencia de un residuo de
arginina en esta posición. De este modo, parece probable que la
división en este sitio por lisilendopeptidasa resulte de un
polimorfismo de la secuencia.
Cuando se realizó una búsqueda en la base de
datos de la secuencia de p110, no se detectó una homología
significativa con ninguna proteína conocida que esté implicada en el
metabolismo del lípido inositol. Sin embargo, tal y como se ha
indicado, p110 mostró una homología significativa a lo largo de su
mitad C-terminal con la proteína Vps34p de
Saccharomyces cerevisiae. La posibilidad de que Vps34p sea
una PI-quinasa de levadura está actualmente
investigándose. Si p110 y Vps34p son proteínas homólogas entonces es
interesante especular que p110 podría estar también implicada con
el marcaje de proteínas y/o el transporte vesicular. La actividad
de PI3-quinasa se ha implicado previamente en
respuestas mediadas por vesículas en eucariotas superiores. Por lo
tanto, se observa que la actividad de PI3-quinasa
aumenta después de la estimulación de plaquetas con trombina
(Lucera y Rittenhouse, 1990) y neutrófilos con
f-Met-Leu-Phe
(Traynor-Kaplan y otros, 1988). En ambos casos, la
estimulación de ligando estimula la fusión de estructuras
vesiculares necesarias para la respuesta biológica. También se ha
sugerido un papel para la PI3-quinasa en vesículas
intracelulares después de la activación de PTKs (Cantley y otros,
1991; Kelly y otros, 1992).
Los datos de transferencia Southern sugieren que
puede haber dos genes para PI3-quinasa en ratas y
humanos. También se proporcionan evidencias de la existencia de un
segundo gen en ADN de rata por los resultados de Carpenter y otros
(1990), los cuales identificaron dos formas de p110 en su
preparación de PI3-quinasa purificada. La
hibridación in situ confirma la presencia de dos secuencias
estrechamente relacionadas en ADN humano, aunque una podía ser un
pseudogén. Se han caracterizado dos formas de p85 (p85\alpha y
p85\beta) (Otsu y otros, 1991), aunque sólo p85\alpha se
encuentra asociado con p110 en PI3-quinasa de
cerebro bovino. Es posible especular que p85\beta se asocia con
una segunda forma de p110.
Aunque actualmente la función de los
fosfoinositidos 3-fosforilados producidos por la
PI3-quinasa no está clara, la disponibilidad de
sistemas de expresión que permiten su generación ayudará en la
determinación de su función.
Utilizando la sonda de ADNc bovino constituida
por el fragmento XbaI-PstI de la secuencia de la
figura 9 (sonda a, panel inferior) y ADNs genómicos de varias
especies, los análisis de transferencia Southern fueron positivos
contra la sonda bovina en las siguientes especies: -bovina (timo de
ternera), humana (células HeLa), rata (hígado), simio (células
COS), porcina (células ZNR), pollo (de Promega) y Xenopus
(hígado).
El ADNc humano se aisló de una bibilioteca de
ADNc, fabricada a partir de ARNm aislado de la línea celular humana
KG1a utilizando técnicas estándar. La sonda era un ADNc parcial de
la segunda mitad del ADNc de p110 bovino. La sonda se marcó con
^{32}P y se hibridó durante toda la noche a los filtros de la
biblioteca a 65ºC en 1 M de NaPi, tampón de SDS al 7%. Los filtros
se lavaron en 2 x SSC a 50ºC y se expusieron a una película de
rayos X a -70ºC. La secuencia de nucleótidos se muestra en la figura
16 junto con la correspondiente secuencia de aminoácidos. La
secuencia de p110 humana tiene un 95% de homología con la secuencia
de p110 bovina a nivel de ADN y es idéntica en un 98% a nivel de
proteína (figuras 17 y 18). La secuencia de proteínas se muestra en
la figura 19. Los cebadores (357) AAG GAT CAG AAC AAT GCC T y (416)
AGG CTT TCT TTA GCC ATC A se utilizaron para amplificar, utilizando
RT-PCR (94ºC 30 segundos, 50ºC 30 segundos, 72ºC 60
segundos; durante 35 ciclos), la secuencia parcial de un gen de
p110 relativamente elevado (p110-11). El
p110-11 tiene un 96% de homología de nucleótidos
con p110 (secuencia no proporcionada).
Se clonaron dos ADNcs nuevos relacionados con
p110. Se diseñaron cebadores degenerados a secuencias conservadas
entre la p110 humana y el gen de levadura relacionado VPS34 (Sentido
(GDDLRQD) 5’ GGN GAT/C GAT/C T/C TA/G CGN CAA/G
GA-3’ antisentido (FHIDFGHF) 5’ A/GAA A/GTG ICC
A/GAA A/GTC A/G/TAT A/GTG A/GAA-3). Éstos se
utilizaron en reacciones RT-PCR utilizando ARNm de
las líneas celulares humanas MOLT4 y U937 (94ºC 30 segundos, 50ºC
30 segundos, 72ºC 30 segundos; durante 35 ciclos). Se aislaron dos
ADNcs nuevos, PITR-c y PITR-f,
relacionados con p110. La secuencia de nucleótidos de
PITR-c se muestra en la figura 20. Este gen está
altamente relacionado con el gen de la levadura, VPS34, la proteína
VPS34 está implicada en el tráfico de proteínas desde el aparato de
golgi a la vacuola y tiene una actividad de
PI3-quinasa intrínseca. La secuencia de nucleótidos
de PITR-f se muestra en la figura 21 y es más
similar a p110 que PITR-c y es probable que también
posea actividad de PI3-quinasa. La alineación de
p110 humana, los genes relacionados con la
PI3-quinasa humana, PITR-c y
PITR-f, y la VPS34 de PI3-quina de
la levadura se muestra en la figura 22. Los aminoácidos conservados
en 3 o más de las proteínas se muestran en mayúscula.
Se cree que la interacción de las subunidades
p85 y p110 de PI3-quinasa es necesaria para la
actividad de la quinasa en células de mamíferos. De este modo, la
inhibición de la interacción entre las subunidades podría
proporcionar un medio de inhibición de la actividad de este
mecanismo de transducción de señal. Con el fin de diseñar reactivos
a p110 que bloquearán la interacción, es útil definir la región de
p110 que se une a las subunidades p85. Para hacer esto, se
construyó una serie de mutantes que expresan varios dominios de la
proteína p110 (figura 23B). Estos fragmentos se expresaron como
proteínas de fusión GST en bacterias. A continuación, las proteínas
se unieron a una columna de glutatión sefarosa (Pharmicia) según las
instrucciones del fabricante (Panayotou G y otros (1992) EmboJ
11:4261-4272). La capacidad de estos fragmentos de
proteína de unirse a las subunidades p85 se evaluó mediante la
capacidad de la columna de retener específicamente las subunidades
p85 purificadas de baculovirus (Otsu y otros (1991) Cell
65:91-104). Tal y como se muestra la figura 23A,
sólo p110-N (\alpha\alpha1-128)
era capaz de unir las subunidades p85\alpha y p85\beta. Para
caracterizar adicionalmente el dominio de unión, se realizaron
mutantes de deleción y fragmentos de PCR a partir del fragmento de
p110-N, tal y como se muestra en la figura 24. Los
resultados de la figura 25 demuestran que un dominio que contiene
los aminoácidos 19-110 de p110 humana es suficiente
para asociarse con las subunidades p85. La eliminación de más de 20
aminoácidos de los extremos terminales amino o carboxilo condujo a
una pérdida de la actividad de unión. Ahora que se ha identificado
este dominio es posible el diseño de péptidos, anticuerpos o
pequeñas moléculas específicas que pueden inhibir la interacción
entre las subunidades.
La presente invención incluye una secuencia de
la subunidad p110 de PI3-quinasa humana que
comprende los aminoácidos 19 a 110 de p110 humana, o un derivado
del mismo con amino terminal truncado o con carboxi terminal
truncado del que se han eliminado menos de 20 aminoácidos del
extremo amino terminal o carboxi terminal, respectivamente, pero
que es capaz de unirse a una subunidad p85 de
PI3-quinasa; y también se incluye un procedimiento
de inhibición de la interacción de las subunidades p85 y p110 de
PI3-quinasa de mamífero, que comprende la
utilización de una molécula que bloquea el dominio de unión
localizado entre los aminoácidos 19 y 110 de la p110 humana.
La presente invención proporciona además la
utilización de una secuencia o derivado, tal y como se ha definido
anteriormente, en el cribado de un agente terapéutico o profiláctico
que actúa inhibiendo la interacción entre las subunidades p85 y
p110 de PI3-quinasa de mamífero.
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Claims (18)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Secuencia de ADN aislada que comprende la secuencia indicada en la figura 16, o una parte de la misma, el producto de expresión de la cual es obtenible mediante la expresión en células de insectos y tiene actividad de PI3-quinasa cuando se expresa de esta manera. - 2. Parte del ADN aislado de la reivindicación 1, la cual comprende una secuencia que codifica los residuos de aminoácidos 272-1068 de la figura 16.
- 3. Secuencia de ADN aislada que es hibridable a la secuencia de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en condiciones que comprenden 1 M de NaCl/10 x solución de Denhardt/50 mM de Tris-HCl (pH 7,4)/10 mM de EDTA/SDS al 0,1%/100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado a 65ºC durante 16 horas seguido del lavado en 2 x SSC/SDS al 0,1% a 42ºC; a continuación, 0,5 x SSC/SDS al 0,1% a 50ºC; a continuación, 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 65ºC; a continuación, 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 68ºC, el producto de expresión de la cual es obtenible mediante la expresión en células de insectos y tiene actividad de PI3-quinasa.
- 4. Construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, bajo el control de una secuencia de control y en un marco de lectura correcto en un vector de expresión, incluyendo la secuencia de control opcionalmente un promotor regulable.
- 5. Células huésped que han sido alteradas genéticamente mediante la incorporación en las mismas de una construcción tal y como se ha definido en la reivindicación 4, con el fin de permitir la expresión del polipéptido codificado.
- 6. Células huésped según la reivindicación 5, que son células de insectos.
- 7. Procedimiento para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de PI3-quinasa si se expresa en células de insectos o es capaz de formar complejos con una subunidad p85 de la PI3-quinasa de mamífero para producir dicha actividad, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de las células huésped de las reivindicaciones 5 ó 6.
- 8. Polipéptido aislado que comprende la secuencia indicada en la figura 16, o una parte de la misma, que tiene actividad de PI3-quinasa si se expresa en células de insectos.
- 9. Parte del polipéptido aislado según la reivindicación 8, que comprende los residuos de aminoácidos 272-1068.
- 10. Polipéptido aislado obtenible mediante la expresión de una secuencia de ADN según la reivindicación 3.
- 11. Quinasa enzimáticamente activa que consiste en el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 y 10, solo o después de formar complejos con una subunidad p85 de mamífero.
- 12. Procedimiento para identificar un agonista o antagonista para la actividad de PI3-quinasa de un polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10, o un complejo activo que incluye al mismo, que comprende cribar las moléculas candidatas para dicha actividad utilizando un polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10.
- 13. Procedimiento para identificar moléculas que se unen específicamente a un polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10, cuyo procedimiento comprende utilizar dicho polipéptido en un procedimiento de cribado para dicha unión.
- 14. Polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10, o un complejo activo que contiene dicho polipéptido para su uso como medicamento.
- 15. Utilización de un polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10, o de un complejo activo que contiene dicho polipéptido, en la producción enzimática in vitro de fosfoinositidos 3-fosforilados.
- 16. Secuencia de la subunidad p110 de PI3-quinasa humana que comprende los aminoácidos 19-110 del p110 humano de la reivindicación 8, o un derivado del mismo con amino terminal truncado o con carboxi terminal truncado del que se han eliminado menos de 20 aminoácidos del extremo amino terminal o carboxi terminal, respectivamente, pero que es capaz de unirse a una subunidad p85 de PI3-quinasa.
- 17. Utilización de una secuencia o derivado tal y como se han definido en la reivindicación 16, en el cribado de un agente terapéutico o profiláctico que actúa mediante la inhibición de la interacción entre las subunidades p85 y p110 de PI3-quinasa de mamífero.
- 18. Utilización de un polipéptido tal y como se ha definido en las reivindicaciones 8, 9 ó 10, o de un complejo activo que contiene dicho polipéptido, en la fabricación de un medicamento; donde dicho medicamento opcionalmente:(a) estimula o desestimula la proliferación celular mediada a través de un receptor de la superficie celular interactivo con dicha actividad de PI3-quinasa; o(b) afecta al nivel de estimulación de plaquetas o neutrófilos; o(c) regula los niveles de glucosa en sangre; o(d) bloquea el dominio de unión localizado entre los aminoácidos 19 y 119 del p110 humano.
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