ES2282149T3

ES2282149T3 - Metodos y composiciones para la deteccion y tratamiento de cancer de pecho, basados en polipeptidos asociados al cancer de pecho.

Info

Publication number: ES2282149T3
Application number: ES00979182T
Authority: ES
Inventors: Brynmor Watkins; Robert P. Szaro
Original assignee: Matritech Inc
Current assignee: Matritech Inc
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: CA2391212A1; US20060160154A1; WO2001036977A8; ATE354588T1; WO2001036977A3; JP2004500056A; JP2003528296A; EP1232177A2; EP1232177B1; CA2390607A1; WO2001036977A2; DE60033555T2; EP1240521A2; AU1615201A; US6936424B1; WO2001036470A2; WO2001036470A3; DE60033555D1; AU1658901A

Abstract

1. Un método in vitro que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra aislada de un mamífero; y (b) detectar en la muestra la presencia de una proteína que se caracteriza por comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, que si se encuentra presente es indicativa de la presencia de cáncer de pecho en el mamífero.

Description

Métodos y composiciones para la detección y tratamiento de cáncer de pecho, basados en polipéptidos asociados al cáncer de pecho.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la detección y/o el tratamiento del cáncer de pecho. Más específicamente, la presente invención se refiere a proteínas asociadas al cáncer de pecho y a ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas que representan marcadores celulares para la detección del cáncer de pecho, y dianas moleculares para la terapia del cáncer de pecho.

Antecedentes de la invención

El cáncer de pecho es la principal causa de muerte en las mujeres. Aunque la patogénesis del cáncer de pecho sigue sin estar clara, la transformación del epitelio de pecho normal en un fenotipo maligno puede ser el resultado de factores genéticos, especialmente en mujeres por debajo de los 30 años (Miki y col. (1994) Science 266: 66-71). Sin embargo, es probable que otros factores no genéticos también tengan un efecto significativo en la etiología de la enfermedad. Independientemente de su origen, la mortalidad por cáncer de pecho aumenta significativamente si no se detecta tempranamente en su progresión. Por tanto, se ha realizado un importante esfuerzo en la elucidación de los eventos celulares tempranos que rodean a la transformación en tejido del pecho. Dicho esfuerzo ha conducido a la identificación de varios marcadores de cáncer de pecho potenciales. Por ejemplo, los alelos de los genes BRCA1 y BRCA2 han sido relacionados con el cáncer de pecho de inicio temprano y hereditario (Wooster y col. (1994) Science 265: 2088-2090). El alelo natural de BRCA1 codifica una proteína supresora de tumor. Las eliminaciones y/u otras alteraciones en dicho alelo han sido relacionadas con la transformación del epitelio del pecho. Por consiguiente, se ha propuesto la detección de alelos de BRCA1 mutados o de sus productos génicos como medio de detección de cánceres de pecho y de ovario (Miki y col., ver anterior). Sin embargo, el BRCA1 está limitado como marcador de cáncer debido a que las mutaciones de BRCA1 no se producen en la mayoría de los cánceres de pecho (Ford y col. (1995) British J. Cancer 72: 805-812). De forma similar, el gen BRCA2, que se ha asociado a formas hereditarias del cáncer de pecho, participa únicamente en una pequeña proporción del total de casos de cáncer de pecho (Ford y col., ver anterior).

Se ha asociado otra serie de genes al cáncer de pecho, y pueden servir como marcadores de la enfermedad, tanto directamente como a través de sus productos génicos. Dichos marcadores potenciales incluyen el gen TP53 y su producto génico, la proteína supresora de tumores p53 (Malkin y col. (1990) Science 250: 1233-1238). La pérdida de heterozigosidad en genes como el gen de la ataxia telangiectasia también se ha asociado a un riesgo elevado de desarrollo de cáncer de pecho (Swift y col. (1991) N. Engl. J. Med. 325: 1831-1836). Un problema asociado a los múltiples marcadores propuestos hasta la fecha es que a menudo el fenotipo oncogénico es el resultado de una eliminación génica, requiriendo por tanto la detección de la

\hbox{ausencia de la forma natural
 como predictor de la transformación.}

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de obtener marcadores específicos fiables que se expresen diferencialmente en tejido de pecho normal y transformado y que puedan ser útiles en la diagnosis del cáncer de pecho, en la predicción de su inicio o el tratamiento del cáncer de pecho. En la presente memoria se proporcionan dichos marcadores y métodos para su uso.

Resumen de la invención

La invención proporciona una variedad de métodos y composiciones para la detección de la presencia de cáncer de pecho en un mamífero, por ejemplo, un humano, y para el tratamiento del cáncer de pecho en un mamífero al que se le ha diagnosticado la enfermedad. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas cuyos miembros son todos detectables en concentraciones más elevadas en suero procedente de un mamífero, por ejemplo un humano, con cáncer de pecho en relación con suero de un mamífero normal, es decir, un mamífero sin cáncer de pecho. Consecuentemente, estas proteínas, así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas, o las secuencias complementarias a las mismas, pueden usarse como marcadores de cáncer de pecho útiles en la diagnosis del cáncer de pecho, en la monitorización de la eficacia de una terapia para el cáncer de pecho y/o como dianas de dicha terapia.

En un aspecto, la invención proporciona marcadores proteicos asociados al cáncer de pecho aislados. Los marcadores proteicos se caracterizan por ser detectables en una concentración más elevada en el suero procedente de un mamífero, específicamente un humano, con cáncer de pecho, que en el suero de un mamífero sin cáncer de pecho.

Dichos marcadores proteicos corresponden a la SEQ ID NO: 1 descrita más adelante.

Además, las proteínas asociadas al cáncer de pecho mencionadas se caracterizan también por ser proteínas no inmunoglobulínicas y/o no albumínicas. Además, las proteínas asociadas al cáncer de pecho pueden definir una región antigénica o epítopo que puede unirse específicamente a un resto de unión, por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, un fragmento de anticuerpo del mismo, o una posición de unión de anticuerpo biosintético dirigido contra la región antigénica o epítopo. Adicionalmente, la invención permite al especialista en la técnica aislar ácidos nucleicos que codifican las anteriores proteínas asociadas al cáncer de pecho, o ácidos nucleicos capaces de hibridarse en condiciones de hibridación específicas con un ácido nucleico que codifica las proteínas asociadas al cáncer de pecho. Además, el especialista en la técnica puede producir secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína marcadora aislada completa, o fragmentos de la misma, usando métodos disponibles actualmente en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y col., eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, la proteína asociada al cáncer de pecho de la invención, cuando se encuentra aislada, se puede secuenciar usando los protocolos convencionales de secuenciamiento de péptidos. En base a la secuencia de péptidos, es posible producir sondas de hibridación de oligonucleótidos útiles en el escrutinio de librerías de cADN. A continuación se puede escrutar la librería de cADN con el oligonucleótido resultante para aislar las secuencias de cADN de longitud parcial o total que codifican la proteína aislada.

En otro aspecto, la invención proporciona una serie de métodos, por ejemplo, métodos basados en proteínas o en ácidos nucleicos, para la detección de la presencia de cáncer de pecho en un mamífero. Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo sobre cualquier muestra relevante de tejido o de fluido corporal. Por ejemplo, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo sobre tejido de pecho, más preferiblemente sobre tejido de biopsia de pecho. De forma alternativa, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo sobre una muestra de fluido corporal humano seleccionada del grupo que consiste en: sangre; suero; plasma; materia fecal; orina; secreción vaginal; fluido espinal; saliva; fluido ascítico; fluido peritoneal; esputo y exudación de pecho. Se contempla, sin embargo, que los métodos de la invención también pueden ser útiles en la detección de células de cáncer de pecho metastatizadas en otras muestras de tejido o de fluido corporal. La detección de cáncer de pecho se puede realizar usando uno cualquiera de la serie de métodos de ensayo conocidos y usados en la técnica.

En un aspecto, el método de diagnosis del cáncer en un individuo comprende poner en contacto una muestra procedente del individuo con un primer resto de unión que se une específicamente a una proteína asociada al cáncer de pecho para producir un primer complejo resto de unión-proteína asociada al cáncer. El primer resto de unión es capaz de unirse específicamente a al menos una de las proteínas marcadoras asociadas al cáncer de pecho identificadas anteriormente para producir un complejo. A continuación se puede detectar la presencia y/o la cantidad de proteína marcadora en el complejo, por ejemplo, a través del primer resto de unión si está marcado con un resto detectable, por ejemplo, un marca radioactiva o fluorescente, o a través de un segundo resto de unión marcado con un resto detectable que se une específicamente al primer resto de unión usando metodologías convencionales conocidas en la técnica. De este modo, la presencia o la cantidad de la proteína marcadora puede ser indicativa de la presencia de cáncer de pecho en el individuo. Por ejemplo, la cantidad de proteína marcadora en la muestra se puede comparar con un valor medio calibrado previamente para indicar la presencia o la ausencia de cáncer de pecho, en donde la cantidad del complejo en la muestra, referida al valor medio, puede ser indicativo de la presencia o de la ausencia de cáncer en el individuo. Aunque dicho método se puede llevar a cabo sobre un tejido, por ejemplo tejido de pecho, o sobre un fluido corporal, por ejemplo suero, actualmente la muestra de ensayo preferida es el fluido corporal. Los restos de unión que se usan a lo largo de la presente solicitud se seleccionan entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y posiciones de unión de anticuerpos.

La detección de las anteriormente mencionadas moléculas de ácido nucleico también puede servir a modo de indicador de la presencia de cáncer de pecho y/o de cáncer de pecho metastatizado en un individuo. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona otro método para la detección de cáncer de pecho en un humano. El método comprende la etapa de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra de tejido o de fluido corporal, que indica la presencia de un cáncer de pecho en un individuo. La molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia capaz de reconocer y unirse específicamente a una proteína asociada al cáncer de pecho, y (ii) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica al menos una porción de una o más de las proteínas asociadas al cáncer de pecho identificadas en la presente memoria.

En una realización, el método comprende exponer una muestra procedente de un individuo en condiciones específicas de hibridación a una sonda de ácido nucleico, por ejemplo, con una longitud superior a aproximadamente 10 nucleótidos y más preferiblemente superior a 15 nucleótidos, capaz de hibridarse con un ácido nucleico diana que codifica una de las proteínas asociadas al cáncer de pecho identificadas en la presente memoria para producir un duplete. Después, se puede detectar la presencia del duplete usando una serie de métodos de detección conocidos y usados en la técnica. Se contempla que el ácido nucleico objetivo pueda ser amplificado, por ejemplo, mediante metodologías de reacción en cadena de polimerasa (PCR) convencional o de reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR), antes de la hibridación con la sonda de ácido nucleico.

En una realización, el ácido nucleico diana (por ejemplo, una molécula de ARN mensajero (mARN)) tiene una longitud de más de 15 nucleótidos, más preferiblemente de más de 50 nucleótidos, y aún más preferiblemente de más de 100 nucleótidos, y codifica una secuencia de aminoácidos presente en una de las proteínas asociadas al cáncer de pecho identificadas en la presente memoria. A continuación, dicho mARN diana puede ser detectado, por ejemplo, mediante análisis de Northern blot haciendo reaccionar la muestra con una sonda de hibridación marcada, por ejemplo una sonda de oligonucleótido marcado con ^{32}P, capaz de hibridarse específicamente con al menos una porción de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína marcadora. La detección de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína asociada al cáncer de pecho o que es capaz de unirse específicamente con una proteína asociada al cáncer de pecho, puede por tanto servir a modo de indicador de la presencia de un cáncer de pecho en el individuo que está siendo evaluado.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para la detección de la presencia de cáncer de pecho o para la evaluación de la eficacia de un tratamiento terapéutico de un cáncer de pecho. Dichos kits pueden comprender, combinados, (i) un receptáculo para recibir una muestra de tejido humano o de fluido corporal procedente del individuo que está siendo evaluado, (ii) una pareja de unión que se une específicamente a un epítopo de una proteína marcadora asociada al cáncer de pecho o a una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína asociada al cáncer de pecho o la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína asociada al cáncer de pecho, y (iii) una muestra de referencia. En una realización, la muestra de referencia puede comprender un control negativo y/o positivo. En dicha realización, el control negativo sería indicativo de un tipo celular de pecho normal y el control positivo sería indicativo de cáncer de pecho.

Por tanto, la invención proporciona un amplio abanico de métodos y composiciones para detectar cáncer de pecho en un individuo. Específicamente, la invención proporciona proteínas asociadas a cáncer de pecho, que permiten una detección específica y temprana, preferiblemente antes de que se produzca la metástasis, del cáncer de pecho en un individuo. Además, la invención proporciona kits útiles en la detección de cáncer de pecho en un individuo. Adicionalmente, la invención proporciona métodos in vitro que utilizan las proteínas asociadas al cáncer de pecho como dianas e indicadores. Éstos y otros muchos aspectos y ventajas adicionales de la invención serán evidentes tras considerar las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La invención puede comprenderse de una forma más completa haciendo referencia a las siguientes figuras, en las cuales:

Las Figuras 1A - 1C son espectros resultantes de la caracterización vía espectrometría de masas de proteínas de 28 kD sometidas a digestión con tripsina y eluidas en gel de poliacrilamida. La Figura 1A es un espectro de la proteína más pesada de 28 kD aislada del gel, la Figura 1B es un espectro de la proteína media de 28 kD aislada del gel y la Figura 1C es un espectro de la proteína más ligera de 28 kD aislada del gel.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos y composiciones para la detección y el tratamiento de cáncer de pecho. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de proteínas asociadas al cáncer de pecho que generalmente se encuentran presentes en niveles detectables más altos en suero de humanos con cáncer de pecho en relación a suero de humanos sin cáncer de pecho.

Las proteínas asociadas a cáncer de pecho o los ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas pueden actuar como marcadores útiles en la detección de cáncer de pecho o como dianas para la terapia del cáncer de pecho. Por ejemplo, se contempla que las proteínas marcadoras y los restos de unión, por ejemplo, anticuerpos que se unen a las proteínas marcadoras o sondas de ácido nucleico que se hibridan con las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas marcadoras, se puedan usar para detectar la presencia de cáncer de pecho en un individuo. Además, se contempla que el especialista pueda producir nuevos métodos terapéuticos para tratar el cáncer de pecho que incluyen, por ejemplo: anticuerpos que se pueden administrar a un individuo que se unen a la proteína diana in vivo y reducen o eliminan su actividad biológica; secuencias de ácido nucleico o de ácido peptidilnucleico que se hibridan con genes o transcritos genéticos que codifican las proteínas diana, para reducir con ello la expresión de las proteínas diana in vivo; o moléculas pequeñas, por ejemplo, moléculas orgánicas que interaccionan con las proteínas diana o con otros restos celulares, por ejemplo, los receptores de las proteínas diana, reduciendo o eliminando con ello la actividad biológica de las proteínas diana.

A continuación se presentan métodos para aislar proteínas asociadas al cáncer de pecho, métodos para detectar el cáncer de pecho usando como marcadores proteínas asociadas al cáncer de pecho, y métodos para tratar individuos que padecen cáncer de pecho usando proteínas asociadas al cáncer de pecho como dianas para la terapia contra el cáncer.

1. Métodos para Detectar Proteínas Marcadoras Asociadas al Cáncer de Pecho

Las proteínas marcadoras de la invención, tal como se describen en la presente memoria, se identifican comparando la composición proteica del suero de un humano al que se le ha diagnosticado cáncer de pecho con la composición proteica del suero de un humano libre de cáncer de pecho. Tal como se usa en la presente memoria, el término "proteína asociada al cáncer de pecho" pretende indicar cualquier proteína que es detectable en un tejido o fluido corporal de un individuo al que se le ha diagnosticado cáncer de pecho en un nivel mayor que el correspondiente tejido o fluido corporal de un individuo libre de cáncer de pecho, e incluye sus especies y variantes alélicas, y los fragmentos correspondientes. Tal como se usa en la presente memoria, el término "cáncer de pecho" pretende indicar cualquier cáncer o lesión cancerosa asociada a tejido de pecho o a células de tejido de pecho, y puede incluir precursores de cáncer de pecho, por ejemplo, hiperplasia ductal atípica o hiperplasia no atípica. No es necesario que la proteína marcadora o la molécula objetivo sean únicas de una célula de cáncer de pecho o de un fluido corporal de un individuo que padece cáncer de pecho; sino que la proteína marcadora o la molécula diana deberían presentar una relación señal ruido suficientemente alta para discriminar entre muestras que proceden de un tejido o fluido corporal con cáncer de pecho y muestras que proceden de un tejido o fluido corporal normales.

Tal como se usa en la presente memoria, una "porción" o un "fragmento" de una proteína o de una secuencia de aminoácidos denota un péptido contiguo que comprende, secuencialmente, al menos diez aminoácidos de la proteína o de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, los aminoácidos 1-10, 34-43 ó 127-136 de la proteína o secuencia). Preferiblemente, el péptido comprende, secuencialmente, al menos veinte aminoácidos de la proteína o secuencia de aminoácidos. Más preferiblemente, el péptido comprende, secuencialmente, al menos cuarenta aminoácidos de la proteína o secuencia de aminoácidos.

Las proteínas marcadoras asociadas al cáncer de pecho de la invención se identificaron comparando las proteínas presentes en el suero de individuos con cáncer de pecho con las proteínas presentes en el suero de individuos sin cáncer de pecho. Se eliminaron las proteínas albúmina e inmunoglobulina del suero, y se separó las proteínas en doce fracciones mediante cromatografía de intercambio aniónico. Brevemente, se cargaron las proteínas en una columna de intercambio aniónico fuerte en presencia de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, y se eluyeron con un gradiente por etapas de cloruro de sodio en fosfato sódico 50 mM, pH 7,0. Las doce fracciones resultantes incluyen una fracción de flujo, una fracción que eluye en cloruro sódico 25 mM, una fracción 50 mM, una fracción 75 mM, una fracción 100 mM, una fracción 125 mM, una fracción 150 mM, una fracción 200 mM, una fracción 250 mM, una fracción 300 mM, una fracción 400 mM y una fracción 2 M.

Se analizaron todas las fracciones mediante espectrometría de masas SELDI (surface-enhanced laser desorption and ionization). Las muestras de cada una de las doce fracciones fueron aplicadas a una de las cuatro superficies diferentes del chip SELDI. Se puede generar una superficie SELDI de cobre o de níquel añadiendo una disolución de sal de cobre o de níquel a un chip que comprende ácido etilendiamintetraacético. Otras superficies de chip SELDI incluyen: WCX-2 que comprende restos carboxilato, y SAX-2 que comprende restos de amonio cuaternario. Por tanto, las proteínas asociadas a cáncer de pecho de la invención se caracterizan por el aumento de su presencia en el suero de individuos que tienen cáncer de pecho referido a individuos sin cáncer de pecho, por su peso molecular, por sus características de unión y elución en una resina de intercambio aniónico, y por su afinidad por un chip SELDI en particular. Por ejemplo, tal como se usa en la presente memoria, el término "afinidad" por un chip SELDI en particular pretende indicar que las proteínas asociadas al cáncer de pecho de la invención se unen preferentemente a un tipo de chip SELDI (por ejemplo, un chip SELDI de cobre) respecto a uno o más chips SELDI distintos (por ejemplo, los chips de níquel, SAX-2 y WCX-2) descritos en la presente memoria. Tal como se discute en detalle en el Ejemplo 1, la comparación de los sueros procedentes de individuos enfermos y sanos reveló una serie de proteínas que se encuentran presentes con frecuencia y en niveles detectables en los sueros de los individuos enfermos, pero que raramente se encuentran presentes en niveles comparables en los sueros de individuos sanos.

Una vez identificadas las proteínas asociadas al cáncer de pecho mediante espectroscopía de masas, las proteínas identificadas se pueden aislar empleando metodologías estándar de aislamiento de proteínas, y se pueden secuenciar usando tecnologías de secuenciamiento de proteínas conocidas y usadas en la técnica. Véase, por ejemplo, los Ejemplos 5 y 6. Una vez identificadas las secuencias de aminoácidos, se pueden identificar los ácidos nucleicos que codifican las proteínas marcadoras o las porciones de las mismas usando metodologías de ADN recombinante convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press. Por ejemplo, se puede secuenciar una proteína asociada al cáncer de pecho aislada usando protocolos convencionales de secuenciamiento de péptidos, y las sondas de hibridación de oligonucleótidos diseñadas para secuenciar una librería de cADN. A continuación, la librería de cADN puede someterse a escrutinio con las sondas de hibridación resultantes para aislar secuencias de cADN de longitud completa o parcial que codifiquen las proteínas marcadoras aisladas.

Las proteínas marcadoras útiles en la presente invención abarcan no sólo las secuencias concretas identificadas en la presente memoria sino también las variantes alélicas de las mismas, y proteínas relacionadas que funcionen también como proteínas marcadoras. De este modo, por ejemplo, las secuencias que resultan de formas alternativas de montaje, de modificación post-translacional o de duplicación génica, quedan abarcadas por la presente invención. Las variantes de especies también están contempladas en esta invención, cuando el paciente sea un mamífero no humano. También se contemplan otras proteínas homólogas que pueden funcionar como proteínas marcadoras.

Preferiblemente, las secuencias variantes son similares en al menos un 80% o idénticas en al menos un 70%, más preferiblemente similares en al menos un 90% o idénticas en al menos un 80%, y aún más preferiblemente similares en al menos un 95% o idénticas en al menos un 90%, a al menos una porción de una de las secuencias descritas en la presente memoria.

Para determinar si una región de péptidos candidata presenta el requisito de porcentaje de similitud o identidad con un polipéptido de referencia o con un oligómero peptídico, en primer lugar la secuencia de aminoácidos candidata y la secuencia de aminoácidos de referencia se alinean usando el algoritmo de programación dinámica descrito por Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147: 195-197, en combinación con la matriz de sustitución BLOSUM62 descrita en la Figura 2 de Henikoff y Henikoff (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", PNAS (Nov 1992), 89: 10915-10919. Para la presente invención, un valor apropiado para la penalización de inserción de hueco es -12, y un valor apropiado para la penalización de extensión de hueco es -4. Los programas de ordenador que realizan las alineaciones usando el algoritmo de Smith-Waterman y la matriz BLOSUM62, tal como el programa GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Inglaterra), se encuentran disponibles comercialmente y son ampliamente empleados por los especialistas en la técnica.

Una vez realizada la alineación entre la secuencia candidata y la referencia, se puede calcular un valor de porcentaje de similitud. Se comparan secuencialmente los aminoácidos individuales de cada secuencia según la similitud entre ellos. Si el valor de la matriz BLOSUM62 correspondiente a los dos aminoácidos alineados es cero o un número negativo, el valor de similitud del par es cero; en caso contrario el valor de similitud del par es 1,0. El valor de similitud bruto es la suma de las puntuaciones de similitud entre pares de los aminoácidos alineados. Entonces, el valor bruto se normaliza dividiéndolo por el número de aminoácidos en la más pequeña de las secuencias candidatas o de referencia. El valor bruto normalizado es la similitud porcentual. De forma alternativa, para calcular una identidad porcentual, los aminoácidos alineados de cada secuencia se vuelven a comparar secuencialmente. Si los aminoácidos no son idénticos, el valor de identidad entre pares es cero; en caso contrario el valor de identidad entre pares es 1,0. El valor bruto de identidad es la suma de los aminoácidos alineados idénticos. A continuación, el valor bruto se normaliza dividiéndolo entre el número de aminoácidos en la más pequeña de las secuencias candidatas o de referencia. El valor bruto normalizado es la identidad porcentual. Para el propósito del cálculo del porcentaje de similitud y de identidad se ignoran las inserciones y las eliminaciones. Consecuentemente, las penalizaciones por huecos no se usan en este cálculo, aunque se usan en el alineamiento inicial.

En todos los casos, las variantes de las secuencias que existen de forma natural, tal como se ha descrito anteriormente, deben evaluarse para determinar su función como proteínas marcadoras. Específicamente, su presencia o ausencia en una forma concreta o en un compartimento biológico concreto debe ser indicativo de la presencia o ausencia de cáncer en un individuo. Esta experimentación de rutina se puede llevar a cabo empleando los métodos descritos más adelante o empleando otros métodos conocidos en la técnica.

Las proteínas marcadoras de una muestra de tejido o fluido corporal se pueden detectar mediante ensayos de unión, en donde se introduce un compañero de unión para la proteína marcadora en una muestra que se sospecha contiene la proteína marcadora. En dicho ensayo, el compañero de unión se puede marcar de forma detectable con, por ejemplo, un marcador radioisotópico o fluorescente. Los anticuerpos marcados se pueden usar de un modo similar con el fin de aislar las proteínas marcadoras seleccionadas. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas marcadoras se pueden detectar usando sondas de ácido nucleico que presentan una complementariedad de secuencia con al menos una porción de la secuencia que codifica la proteína marcadora. Técnicas tales como la PCR y, en concreto, la PCR de transcriptasa inversa, son medios útiles para aislar ácidos nucleicos que codifican una proteína marcadora. Los ejemplos siguientes proporcionan detalles del aislamiento y caracterización de proteínas asociadas al cáncer de pecho, y de métodos para su uso en la detección y el tratamiento del cáncer de pecho.

2. Detección de Cáncer de Pecho

Una vez que se han identificado las proteínas asociadas al cáncer de pecho, las proteínas o los ácidos nucleicos que codifican las proteínas se pueden usar como marcadores para determinar si un individuo tiene cáncer de pecho y, de ser así, para determinar los métodos de detección adecuados que se pueden usar para monitorizar el estatus de la enfermedad.

Usando las proteínas marcadoras o los ácidos nucleicos que codifican las proteínas, el especialista puede producir una serie de métodos de detección para detectar el cáncer de pecho en un humano. Los métodos comprenden normalmente las etapas de detectar, empleando determinados medios, la presencia de una o más proteínas asociadas al cáncer de pecho o ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas en una muestra de un tejido o de un fluido corporal de un humano. La precisión y/o fiabilidad del método para la detección del cáncer de pecho en un humano puede mejorarse detectando la presencia de una serie de proteínas asociadas al cáncer de pecho y/o de ácidos nucleicos en una muestra preseleccionada de tejido o de fluido corporal. Los ensayos de detección pueden comprender uno o más de los protocolos descritos más adelante.

2.A. Ensayos Basados en Proteínas

Se puede detectar la proteína marcadora de una muestra, por ejemplo, combinando la proteína marcadora con un resto de unión capaz de unirse específicamente a la proteína marcadora. El resto de unión puede comprender, por ejemplo, un miembro de un par ligando-receptor, es decir, un par de moléculas capaces de presentar una interacción de unión específica. El resto de unión puede comprender, por ejemplo, un miembro de un par de unión específico, tal como anticuerpo-antígeno, enzima-sustrato, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-ácido nucleico, u otro par de unión específico conocido en la técnica. Se pueden diseñar proteínas de unión con una afinidad potenciada hacia una proteína diana. Opcionalmente, el resto de unión puede ligarse con una marca detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, radioactiva, fosforescente o de partícula coloreada. El complejo marcado puede detectarse, por ejemplo, visualmente o con la ayuda de un espectrofotómetro u otro detector.

Las proteínas marcadoras también se pueden detectar usando las técnicas de electroforesis de gel disponibles en la técnica. En la electroforesis de gel bidimensional, las proteínas se separan primero en un gel de gradiente de pH según sus respectivos puntos isoeléctricos. A continuación, el gel resultante se coloca en un segundo gel de poliacrilamida, y las proteínas se separan según su peso molecular (véase, por ejemplo, O’Farrel (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021).

Se pueden detectar una o más proteínas marcadoras aislando en primer lugar las proteínas de una muestra obtenida de un individuo del que se sospecha tenga cáncer de pecho, y a continuación separando las proteínas mediante electroforesis de gel bidimensional para producir un modelo de electroforesis de gel bidimensional característico. A continuación el modelo se compara con un modelo de gel estándar producido separando, en las mismas o en similares condiciones, las proteínas aisladas de células normales o cancerosas. El modelo de gel estándar se puede almacenar, y recuperar, de una base de datos electrónica de modelos de electroforesis. La presencia de una proteína asociada a cáncer de pecho en el gel bidimensional proporciona una indicación de que la muestra que está siendo evaluada fue tomada de una persona con cáncer de pecho. Como con los demás ensayos de detección descritos en la presente memoria, la detección de dos o más proteínas, por ejemplo, en el modelo de electroforesis de gel bidimensional potencia aún más la precisión del ensayo. La presencia de una serie, por ejemplo de dos a cinco, proteínas asociadas al cáncer de pecho en el gel bidimensional proporciona un indicio aún más fuerte de la presencia de un cáncer de pecho en el individuo. Por tanto, el ensayo permite la detección y tratamiento tempranos del cáncer de
pecho.

También se puede detectar una proteína marcadora asociada al cáncer de pecho usando cualquiera de una amplia variedad de técnicas de inmunoensayo disponibles en la técnica. Por ejemplo, el especialista puede emplear el formato de inmunoensayo sándwich para detectar el cáncer de pecho en una muestra de fluido corporal. De forma alternativa, el especialista puede usar procedimientos inmuno-histoquímicos convencionales para detectar la presencia de la proteína asociada al cáncer de pecho en una muestra de tejido usando una o más proteínas de unión
marcadas.

En un inmunoensayo sándwich, generalmente se usan dos anticuerpos capaces de unirse a la proteína marcadora, por ejemplo, uno inmovilizado sobre un soporte sólido, y uno libre en disolución y marcado con el compuesto químico detectable. Los ejemplos de marcas químicas que se pueden usar para el segundo anticuerpo incluyen radioisótopos, compuestos fluorescentes y enzimas u otras moléculas que generan productos coloreados o electroquímicamente activos cuando son expuestos a un reactivo o sustrato de enzima. Cuando una muestra que contiene la proteína marcadora se coloca en este sistema, la proteína marcadora se une al anticuerpo inmovilizado y al anticuerpo marcado, para formar un complejo inmune "sándwich" sobre la superficie del soporte. La proteína acomplejada se detecta eliminando por lavado los compuestos no ligados de la muestra y el exceso de anticuerpo marcado, y midiendo la cantidad de anticuerpo marcado acomplejado con la proteína sobre la superficie del soporte. De forma alternativa, se puede detectar el anticuerpo libre en disolución, que puede estar marcado con un resto químico, por ejemplo, un hapteno, mediante un tercer anticuerpo marcado con un resto detectable que se une al anticuerpo libre o, por ejemplo, o que se acopla al hapteno.

Tanto el procedimiento de inmunoensayo sándwich como el inmunohistoquímico de tejido son altamente específicos y muy sensibles, siempre que se empleen marcas con buenos límites de detección. Se puede encontrar una revisión detallada del diseño, teoría y protocolos del ensayo inmunológico en numerosos textos de la técnica, incluyendo "Practical Immunology", Butt, W.R., ed., (1984) Marcel Dekker, Nueva York, y "Antibodies, A Laboratory Approach", Harlow y col. eds. (1988), Cold Spring Harbor Laboratory.

En general, las consideraciones del diseño de inmunoensayos incluyen la preparación de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales) que tengan una especificidad de unión suficientemente elevada por la proteína diana para formar un complejo que se pueda distinguir con fiabilidad de los productos de interacciones no específicas. Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" pretende indicar proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos u otras proteínas que comprenden un dominio de unión tipo región variable de inmunoglobulina, que tienen las afinidades de unión y las especificidades adecuadas por la proteína diana.

Cuanto mayor es la especificidad de unión del anticuerpo, menor es la concentración de proteína diana que se puede detectar. Tal como se usa en la presente memoria, los términos "unión específica" o "unirse específicamente" pretenden indicar que el resto de unión, por ejemplo, una proteína de unión tiene una afinidad de unión por la proteína diana superior a aproximadamente 10^{5} M^{-1}, más preferiblemente superior a aproximadamente 10^{7} M^{-1}.

Los anticuerpos de una proteína diana asociada al cáncer de pecho aislada que son útiles en los ensayos de detección de cáncer de pecho en un individuo pueden generarse usando procedimientos inmunológicos estándar bien conocidos y descritos en la técnica. Véase, por ejemplo, Practical Immunology, Butt, N.R., ed., Marcel Dekker, NY, 1984. En resumen, se usa una proteína diana aislada para activar los anticuerpos de un hospedante xenogeneico, tal como un ratón, una cabra u otro mamífero adecuado. La proteína marcadora se combina con un adyuvante apropiado capaz de potenciar la producción de anticuerpos en el hospedante, y se inyecta al hospedante, por ejemplo, mediante administración intraperitoneal. Se puede usar cualquier adyuvante adecuado para estimular la respuesta inmune del hospedante. Un adyuvante usado habitualmente es el adyuvante completo de Freund (una emulsión que comprende células microbianas muertes y secadas disponible en, por ejemplo, Calbiochem Corp., San Diego, o Gibco, Grand Island, NY). Cuando se requieren múltiples inyecciones de antígeno, las inyecciones consecutivas pueden comprender el antígeno en combinación con un adyuvante incompleto (por ejemplo, una emulsión libre de células). Los anticuerpos policlonales se pueden aislar del hospedante productor de anticuerpos mediante extracción de suero que contenga los anticuerpos de la proteína de interés. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir aislando células hospedantes que producen el anticuerpo deseado, fusionando dichas células con células de mieloma usando procedimientos estándar conocidos en la técnica inmunológica, y realizando un escrutinio en busca de células híbridas (hibridomas) que reaccionen específicamente con la proteína diana y que tengan la afinidad de unión
deseada.

Los dominios de unión de anticuerpos también pueden producirse biosintéticamente y la secuencia de aminoácidos del dominio de unión puede manipularse para potenciar la afinidad de unión con el epítopo preferido de la proteína diana. Las metodologías de anticuerpos específicos son bien conocidas y están descritas en la bibliografía. Por ejemplo, en "Practical Immunology" (1984) (ver anterior) puede encontrarse una descripción más detallada para su preparación.

Adicionalmente, en la práctica de la presente invención se pueden usar posiciones de unión de anticuerpos biosintéticas modificadas genéticamente, también conocidas en la técnica como BABS ó sFv’s. Los métodos para fabricar y usar BABS que comprenden (i) dímeros V_{H} y V_{L} sintéticos asociados no covalentemente o unidos por puentes de disulfuro, (ii) posiciones de unión de cadena sencilla V_{H}-V_{L} ligadas covalentemente, (iii) dominios V_{H} ó V_{L} individuales, o (iv) posiciones de unión de anticuerpo de cadena sencilla, se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº: 5.091.513; 5.132.405; 4.704.692 y 4.946.778. Además, las BABS que presentan la especificidad requerida por las proteínas asociadas al cáncer de pecho se pueden derivar mediante clonación de anticuerpo fago a partir de librerías genéticas combinatorias (véase, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628). En resumen, fagos que expresan sobre sus superficies de recubrimiento BABS que tienen regiones variables de inmunoglobulina codificadas por secuencias génicas de región variable derivadas de ratones pre-inmunizados con proteínas asociadas al cáncer de pecho aisladas, o fragmentos de los mismos, son sometidos a escrutinio en busca de actividad de unión frente a proteína asociada a cáncer de pecho inmovilizada. Los fagos que se unen a las proteínas asociadas al cáncer de pecho inmovilizadas son recolectados y se secuencia el gen que codifica la BABS. Las secuencias de ácido nucleico resultantes que codifican la BABS de interés pueden ser expresadas a continuación en sistemas de expresión convencionales para producir la proteína BABS.

La proteína asociada al cáncer de pecho aislada también puede usarse para el desarrollo de kits y ensayos de diagnosis y de evaluación de tejidos para monitorizar el nivel de las proteínas en una muestra de tejido o de fluido. Por ejemplo, el kit puede incluir anticuerpos u otras proteínas de unión específica que se unan específicamente a las proteínas asociadas al cáncer de pecho y que permitan que la presencia y/o la concentración de las proteínas asociadas al cáncer de pecho pueda ser detectada y/o cuantificada en una muestra de tejido o de fluido.

Se contempla que los kits adecuados para detectar proteínas asociadas al cáncer de pecho incluyan, por ejemplo, un receptáculo u otro medio para capturar una muestra que vaya a ser evaluada, y un medio de detección de la presencia y/o cantidad en la muestra de una o más de las proteínas asociadas al cáncer de pecho descritas en la presente memoria. Tal como se usa en el presente documento, "medio de detección" en una realización incluye uno o más anticuerpos específicos de dichas proteínas, y medios para detectar la unión de los anticuerpos a dichas proteínas mediante, por ejemplo, un inmunoensayo sándwich estándar tal como se ha descrito en la presente memoria. Cuando se pretende detectar la presencia de una proteína dentro de una célula, por ejemplo procedente de una muestra de tejido, el kit también puede comprender los medios para romper la estructura celular de tal modo que las proteínas intracelulares queden expuestas.

2.B. Ensayos Basados en Ácidos Nucleicos

La presencia de un cáncer de pecho en un individuo también puede determinarse detectando, en una muestra de tejido o de fluido corporal, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína asociada al cáncer de pecho. Usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, se pueden secuenciar las proteínas asociadas al cáncer de la invención, y a continuación, en base a la secuencia determinada, se pueden diseñar sondas de oligonucleótidos para escrutar una librería de cADN (véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989), ver anterior).

Se puede detectar una molécula de ácido nucleico diana que codifica una proteína marcadora asociada al cáncer de pecho usando un resto de unión marcado capaz de unirse específicamente al ácido nucleico diana. El resto de unión puede comprender, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico o un ácido nucleico peptídico. Adicionalmente, se puede detectar un ácido nucleico diana, tal como un mARN que codifica una proteína asociada al cáncer de pecho, llevando a cabo, por ejemplo, un análisis Northern blot usando oligonucleótidos marcados, por ejemplo, fragmentos de ácido nucleico complementarios a al menos una porción de un ácido nucleico diana, y capaces de hibridarse específicamente con la misma.

Más específicamente, usando técnicas recombinantes establecidas o síntesis de olignonucleótidos se pueden producir sondas genéticas que comprenden ARN complementario o, preferiblemente, ADN complementario a las secuencias de nucleótidos asociadas al cáncer de pecho, o secuencias de mARN que codifican proteínas asociadas al cáncer de pecho. Las sondas se hibridan con secuencias de ácido nucleico complementarias presentes en el espécimen evaluado, y pueden proporcionar una especificidad exquisita. Una sonda corta y bien definida, que codifica una secuencia única sencilla, es más precisa y preferida. Las sondas más grandes generalmente son menos específicas. Aunque un oligonucleótido de cualquier longitud se puede hibridar con un tránscrito de mARN, los oligonucleótidos contemplados como más útiles en los ensayos de hibridación estándar se encuentran en el intervalo de 8-100 nucleótidos, preferiblemente en el intervalo de 15-50 nucleótidos. La selección de la longitud de la sonda y de la secuencia le permite a uno elegir el grado de especificidad deseado. La hibridación se lleva a cabo a una temperatura de entre 50º y 65ºC en una disolución tampón altamente salina, en formamida o en otros agentes para fijar el grado de complementariedad requerido. Además, el estado del arte permite que se puedan fabricar sondas que reconozcan esencialmente cualquier secuencia de ADN o de ARN. Para más detalles véase, por ejemplo, Guide to Molecular Techniques, Berger y col., Methods of Enzymology, Vol. 152, 1987.

En los ensayos se puede emplear una amplia variedad de marcadores diferentes acoplados a las sondas y anticuerpos. Los reactivos marcados pueden proporcionarse en disolución o acoplados a un soporte insoluble, dependiendo del diseño del ensayo. Los diversos conjugados se pueden unir covalentemente o no covalentemente, directa o indirectamente. Cuando se unen covalentemente, el grupo de unión concreto dependerá de la naturaleza de los dos restos que van a unirse. En la bibliografía se muestra un gran número de grupos de unión y de métodos de unión. En general, los marcadores se pueden dividir en las siguientes categorías: cromógenos; reacciones catalizadas; quimioluminiscencia; marcas radioactivas y partículas coloreadas de tamaño coloidal. Los cromógenos incluyen compuestos que absorben luz en un intervalo definido de tal modo que se observa un color, o que emiten luz cuando son irradiados con luz de una longitud de onda concreta o de un intervalo de longitudes de onda concreto, por ejemplo, fluorósceros. Se pueden emplear catalizadores enzimáticos y no enzimáticos. Al elegir una enzima, habrá que tener en cuenta muchas consideraciones, que incluyen la estabilidad de la enzima, si se encuentra presente normalmente en muestras del tipo para el que se ha diseñado el ensayo, la naturaleza del sustrato y el efecto, si hay alguno, de la conjugación de las propiedades de la enzima. Las marcas enzimáticas particularmente útiles incluyen oxiodorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas o sintetasas. También se pueden usar sistemas enzimáticos interrelacionados. Una marca quimioluminiscente implica un compuesto que se excita electrónicamente mediante una reacción química, y que entonces puede emitir luz que sirve como señal detectable, o dona energía a un aceptor fluorescente. Las marcas radioactivas incluyen varios radioisótopos que son de uso común, tal como las formas inestables del hidrógeno, del yodo, del fósforo, y otros similares. Las partículas coloreadas de tamaño coloidal implican materias tales como el oro coloidal que, al agregarse, forma un punto distintivo detectable visualmente que corresponde a la posición de una sustancia que se quiere detectar. Se puede encontrar información adicional sobre la tecnología de marcado en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.366.241.

Un método común de marcado in vitro de sondas de nucleótidos implica la traducción mellada, en donde la sonda de ADN no marcada recibe una mella realizada con una endonucleasa para producir extremos 3’ hidroxilo libres en cualquier cadena del fragmento de doble cadena. Simultáneamente, una exonucleasa elimina el residuo de nucleótido del lado 5’ fosforilo de la mella. La secuencia de sustitución de nucleótidos se determina mediante la secuencia de la cadena opuesta del dúplex. De este modo, si se suministran los nucleótidos marcados, la polimerasa de ADN rellenará la mella con los nucleótidos marcados. Usando está conocida técnica, se puede marcar hasta el 50% de la molécula. Para sondas más pequeñas, se pueden usar métodos conocidos que implican el marcado del extremo 3’. Además, actualmente existen métodos comerciales disponibles de marcado de ADN con moléculas fluorescentes, catalizadores, enzimas o materiales quimioluminiscentes. Existen kits de marcado con biotina comercialmente disponibles (Enzo Biochem Inc.) bajo la marca comercial Bio-Probe. Este tipo de sistema permite que la sonda se acople a avidina, que a su vez es marcada con, por ejemplo, una molécula fluorescente, una enzima, un anticuerpo, etc. Para más detalles referentes a la construcción y a la tecnología de sondas véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

El oligonucleótido seleccionado para hibridarse con el ácido nucleico diana, tanto si ha sido sintetizado químicamente o mediante metodologías de ADN recombinante, se aisla y se purifica usando técnicas estándar, y a continuación es preferiblemente marcado (por ejemplo, con ^{35}S o con ^{32}P) usando protocolos de marcados estándar.

A continuación, se lleva una muestra que contiene el ácido nucleico a un gel de electroforesis, los ácidos nucleicos son transferidos a un filtro de nitrocelulosa y el oligonucleótido marcado es expuesto al filtro en condiciones de hibridación severas, por ejemplo, 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X disolución de Denhardt, 0,1% de SDS a 42ºC, tal como se describe en Sambrook y col. (1989), ver anterior. A continuación, el filtro se puede lavar usando 2 X SSPE, 0,1% de SDS a 68ºC, y más preferiblemente usando 0,1 X SSPE, 0,1% de SDS a 68ºC. Otros procedimientos útiles conocidos en la técnica incluyen hibridación en disolución e hibridación de ARN de punto y ranura. Opcionalmente, la cantidad del ácido nucleico presente en una muestra se cuantifica entonces midiendo la radioactividad de los fragmentos hibridados, usando procedimientos estándar conocidos en la técnica.

Adicionalmente, también se pueden usar oligonucleótidos para identificar otras secuencias que codifican miembros de las familias de proteínas diana. También se puede usar la metodología para identificar secuencias genéticas asociadas a las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas descritas en la presente memoria, por ejemplo, para identificar secuencias no codificadoras que quedan por encima o por debajo en la cadena de la secuencia que codifica la proteína, y que pueden desempeñar un papel funcional en la expresión de dichos genes. Adicionalmente, se pueden llevar a cabo ensayos de unión para identificar y detectar proteínas capaces de una interacción de unión específica con un ácido nucleico que codifica una proteína asociada al cáncer de pecho, que puede estar implicada, por ejemplo, en la regulación génica o en la expresión génica de la proteína. En una realización adicional, los ensayos descritos en la presente memoria se pueden usar para identificar y detectar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia capaz de reconocer una proteína asociada al cáncer de pecho y de unirse específicamente a la misma.

Adicionalmente, se anticipa que usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos apropiados, es decir, más de un cebador, el especialista puede determinar el nivel de expresión de un gen diana in vivo mediante procedimientos estándar de reacción en cadena de polimerasa (PCR), por ejemplo, mediante PCR cuantitativa. Los ensayos convencionales basados en PCR se discuten, por ejemplo, en Innes y col. (1990) "PCR Protocols; A guide to methods and Applications", Academic Press, y en Innes y col. (1995) "PCR Strategies", Academic Press, San Diego, CA.

3. Identificación de Proteínas que Interaccionan In Vivo con Proteínas Asociadas al Cáncer de Pecho

Adicionalmente, se contempla que el especialista, usando procedimientos como los descritos más adelante, pueda identificar otras moléculas que interaccionan in vivo con las proteínas asociadas al cáncer de pecho descritas en la presente memoria. Dichas moléculas también proporciona posibles dianas para la quimioterapia.

A modo de ejemplo, el cADN que codifica las proteínas o los péptidos capaces de interactuar con las proteínas asociadas al cáncer de pecho se puede determinar usando un ensayo de dos híbridos, tal como publicaron Durfee y col. (1993) Genes & Develop. 7: 555-559. El principio del sistema de dos híbridos consiste en que la interacción no covalente de dos proteínas dispara un proceso (transcripción) en el que dichas proteínas normalmente no desempeñan un papel directo, debido a su enlace covalente con los dominios que funcionan en dicho proceso. Por ejemplo, en el ensayo de dos híbridos, la expresión detectable de un gen informador se produce cuando interactúan dos proteínas de fusión, una que comprende un dominio de unión de ADN y otra que comprende un dominio de inicio de
transcripción.

El especialista puede usar una célula hospedante que contiene uno o más genes informadores, tal como la cepa de levadura Y153, presentada en Durfee y col. (1993), ver anterior. Dicha cepa porta dos genes informadores localizados cromosomalmente, cuya expresión es regulada por Gal4. Un primer gen informador, es el gen lacZ de E. coli bajo el control del promotor Gal4. Un segundo gen informador es el gen HIS3 seleccionable. Otros genes informadores útiles pueden incluir, por ejemplo, el gen de luciferasa, el gen LEU2 y el gen GFP (Proteína Fluorescente
Verde).

Se usan dos conjuntos de plásmidos en el sistema de dos híbridos. Un conjunto de plásmidos contiene ADN que codifica un dominio de unión de ADN de Gal4 fusionado estructuralmente a ADN que codifica una proteína asociada al cáncer de pecho. El otro conjunto de plásmidos contiene ADN que codifica un dominio de activación Gal4 fusionado a porciones de una librería de cADN humana construida a partir de linfocitos humanos. La expresión del primer conjunto de plásmidos da como resultado una proteína de fusión que comprende un dominio de unión de ADN de Gal4 y una proteína asociada a cáncer de pecho. La expresión del segundo conjunto de plásmidos produce una proteína de activación de la transcripción fusionada a un producto de expresión de la librería de cADN de linfocitos. Cuando los dos plásmidos son transformados en una célula hospedante deficiente en Gal4, tal como las células Y153 de levadura descritas anteriormente, la interacción del dominio de unión de ADN de Gal4 y del dominio de activación de la transcripción se produce únicamente si la proteína asociada al cáncer de pecho fusionada al dominio de unión de ADN se une a una proteína expresada por la librería de cADN de linfocitos fusionada al dominio de activación de la transcripción. Como resultado de la interacción proteína-proteína entre la proteína asociada al cáncer de pecho y su pareja de unión in vivo, se producen niveles detectables de expresión de gen informador.

Además de identificar moléculas que interaccionan in vivo con las proteínas asociadas al cáncer de pecho, el especialista también puede realizar un escrutinio para encontrar moléculas, por ejemplo, moléculas pequeñas que alteran o inhiben la interacción específica entre una proteína asociada al cáncer de pecho y su pareja de unión
in vivo.

Por ejemplo, se puede transfectar una célula hospedante con ADN que codifica un híbrido "dominio de unión de ADN/proteína asociada al cáncer de pecho" y una pareja de unión "dominio de activación de la traducción/proteína putativa asociada al cáncer de pecho", tal como se ha descrito anteriormente. La célula hospedante también contiene un gen informador apropiado en asociación operativa con un elemento de activación de la transcripción que actúa en cis, que es reconocido por el dominio de unión de ADN de factor de transcripción. Se evalúa el nivel de gen informador expresado en el sistema. A continuación, se expone la célula hospedante a una molécula candidata y se detecta el nivel de expresión de gen informador. Una reducción en la expresión del gen informador es indicativa de la capacidad del candidato para interferir en la formación o en la estabilidad del complejo con respecto a la proteína asociada al cáncer de pecho y su pareja de unión in vivo. A modo de control, también se evalúa la capacidad de la molécula candidata para interferir con otros complejos proteína-proteína no relacionados. Las moléculas capaces de interferir específicamente con una interacción "proteína asociada a cáncer de pecho/pareja de unión", pero no con otras interacciones proteína-proteína, se identifican como candidatos para la producción y análisis detallado. Una vez que se ha identificado un candidato potencial, se puede evaluar su eficacia en la modulación del ciclo celular y en la replicación celular en un sistema de modelo de ciclo celular estándar.

Las moléculas candidatas se pueden producir como se describe más adelante. Por ejemplo, se puede insertar ADN que codifica las moléculas candidatas, usando técnicas convencionales bien descritas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook (1989) ver anterior), en cualquiera de una serie de vectores de expresión, y transfectarse en una célula hospedante apropiada para producir proteínas recombinantes, incluyendo tanto las formas de longitud completa como las truncadas. Las células hospedantes útiles incluyen E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, el sistema celular insecto/baculovirus, células de mieloma y varias células de mamífero. Las formas de longitud completa de dichas proteínas se expresan preferiblemente en células de mamíferos, tal como se describe en la presente memoria. Las secuencias de nucleótidos también incluyen preferiblemente una secuencia para dirigir la secuencia traducida al núcleo, usando, por ejemplo, una secuencia que codifica la secuencia dirigida de ocho núcleos de aminoácido del antígeno grande T, que está bien caracterizado en la técnica. El vector puede incluir adicionalmente varias secuencias para promover la expresión correcta de la proteína recombinante, incluyendo las secuencias del promotor de transcripción y de terminación, las secuencias potenciadotas, las secuencias de posición de unión de ribosoma preferidas, las secuencias líder de mARN preferidas, las secuencias de procesado de proteínas preferidas, las secuencias señal preferidas para la secreción proteica, y otras similares. La secuencia de ADN que codifica el gen de interés también puede manipularse para eliminar potencialmente las secuencias de inhibición o para minimizar la formación de estructuras secundarias no deseadas. Como apreciará el especialista en la técnica, la proteína recombinante también puede expresarse como una proteína de fusión.

Después de la traducción, la proteína se puede purificar a partir de las propias células o puede recuperarse del medio de cultivo. El ADN también puede incluir secuencias que ayudan en la expresión y/o purificación de la proteína recombinante. El ADN se puede expresar directamente o se puede expresar como parte de una proteína de fusión que tiene un punto de unión de fusión lábil.

El ADN también puede expresarse en un hospedante mamífero adecuado. Los hospedantes útiles incluyen células 3T3 de fibroblasto (por ejemplo, NIH 3T3, de CRL 1658), COS (riñón de simio, ATCC CRL-1650) ó CHO (ovario de hámster chino) (por ejemplo, CHO-DXB11, de Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4222), células epiteliales de pulmón de visón (MV1Lu), células de fibroblasto de prepucio humano, células de glioblastoma humano y células de teratocarcinoma. Otros sistemas celulares eucarióticos útiles incluyen células de levadura, el sistema insecto/baculovirus o células de mieloma.

Con el fin de expresar una molécula candidata, el ADN se subclona en una posición de inserción de un vector comercial adecuado junto con las secuencias adecuadas promotor/potenciador y con secuencias de terminación 3’. Las combinaciones promotor/secuencia potenciadota útiles incluyen el promotor CMV (promotor de citomegalovirus (MIE) humano) presente, por ejemplo, en pCDM8, así como el promotor de virus tumoral mamario (MMTV) activado por la secuencia potenciadota LTR de virus de sarcoma de Rous (por ejemplo, de Clontech, Inc., Palo Alto). Un promotor inducible útil incluye, por ejemplo, un promotor inducible por Zn^{2+}, tal como el promotor de metalotioneína de Zn^{2+} (Wrana y col. (1992) Cell 71: 1003-1014). En la técnica se conocen otros promotores inducibles y se pueden usar con resultados similares. También se puede potenciar aún más la expresión usando secuencias potenciadotas de activación trans. Preferiblemente, el plásmido también contiene un marcador ampliable, tal como el DHFR, bajo el control adecuado de un promotor, por ejemplo, de promotor temprano SV40 (ATCC Nº 37148). Las condiciones de transfección, del cultivo celular, de la amplificación génica y de la expresión génica son las condiciones estándar, bien conocidas en la técnica, tal como se describen, por ejemplo, en Ausubel y col., ed., (1989) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. En resumen, las células transfectadas se cultivan en un medio que contiene un 5-10% de suero de ternero fetal dializado (dFCS), y se obtienen líneas celulares de expresión elevada transfectadas de forma estable mediante amplificación y subclonación, y se evalúan empleando análisis estándar Western y Northern blot. También se puede usar el Southern blot para determinar el estado de las secuencias integradas y la extensión de su amplificación de número de copias.

La proteína candidata expresada se purifica a continuación usando procedimientos estándar. Actualmente, la metodología preferida emplea una columna de afinidad, tal como una columna de afinidad de ligandos o una columna de afinidad de anticuerpos. A continuación se lava la columna, y las moléculas candidatas son eluidas selectivamente en un gradiente de fuerza iónica creciente, de cambio de pH o de adición de detergente suave. Cabe destacar que además de las moléculas candidatas que se unan a las proteínas asociadas al cáncer de pecho, las propias proteínas asociadas al cáncer de pecho también pueden producirse usando dichas tecnologías de ADN recombinante.

Ejemplo 1

Identificación de Marcadores de Cáncer de Pecho

Para identificar marcadores de cáncer de pecho, se compararon los sueros de individuos con cáncer de pecho con sueros de individuos normales empleando espectrometría de masas de desorción e ionización superficial por láser (SELDI). En resumen, se congelaron alícuotas de 0,5 mL de sueros extraídos de los individuos. A continuación, a cada alícuota se añadió 1 \muL de una disolución de 1 mg/mL de inhibidor de tripsina de semilla de soja (SBTI) y 1 \muL de una disolución de 1 mg/mL de leupeptina. Para eliminar los lípidos, se añadieron a cada muestra 350 \muL de 1,1,2-trifluorotricloroetano. Entonces las muestras fueron sometidas a vórtice durante cinco minutos y fueron centrifugadas en una microcentrífuga durante cinco minutos a 4ºC. Los sobrenadantes resultantes se aplicaron a una columna de 1 mL de agarosa acoplada a proteína G (columna Hitrap Protein G, Pharmacia y Upjohn, Peapack, NJ) para eliminar las proteínas de inmunoglobulina. A continuación se aclaró la columna con 3 mL de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, con SBTI y leupeptina ("tampón de unión"), y el flujo resultante fue aplicado directamente a una columna de 5 mL de Sefarosa al 6% acoplada a azul de Cibacron (columna Hitrap blue, Pharmacia y Upjohn, Peapack, NJ) para eliminar las proteínas de albúmina. La columna Hitrap blue fue aclarada con 20 mL de tampón de unión. El flujo resultante se concentró usando cuatro concentradores basados en centrifugación con un corte de 10 kD (Centricon 10, Millipore Corporation, Bedford, MA) hasta un volumen final de aproximadamente
0,7 mL.

El suero resultante (sustancialmente libre de inmunoglobulina y de albúmina) se subdividió en doce fracciones que contenían cantidades aproximadamente iguales de proteína mediante cromatografía de intercambio iónico. Específicamente, el suero se aplicó a una columna de intercambio iónico Mono Q (Pharmacia y Upjohn, Peapack, NJ) (un intercambiador aniónico fuerte con grupos de amonio cuaternario) en tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, y las proteínas fueron eluidas de la columna aumentando la concentración de cloruro sódico paso a paso. De este modo, el suero se dividió en doce fracciones en base a la concentración de cloruro sódico usado para la elución. Consecuentemente, dichas fracciones se designaron flujo a través de cloruro sódico 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM y 2 M. Después de cada elución, cada fracción se concentró hasta aproximadamente 100 \mug/mL y se intercambió en tampón empleando tampón de
unión.

A continuación se aplican de 4 a 10 \muL de cada una de las doce fracciones y se permitió que se unieran a cada una de las cuatro superficies de chip SELDI, abarcando cada superficie hasta ocho muestras. La localización pretendida para cada muestra en el chip se marcó con un círculo dibujado usando un marcador hidrofóbico como los usados en manchas de Pap. Los chips SELDI usados en la presente memoria se compraron a Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, California, y se usaron como se describe más adelante.

Para las superficies de cobre o de níquel, se pretrató un chip que contenía restos de ácido etilendiamintriacético (IMAC, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA) con dos aplicaciones de cinco minutos de cinco \muL de una disolución de sal de cobre o de sal de níquel, y se lavó con agua desionizada. Después de un tratamiento de cinco minutos con cinco \muL de tampón de unión, se aplicaron de dos a tres microlitros de muestra a la superficie durante de treinta a sesenta minutos. Entonces se aplicaron otros de dos a tres microlitros de muestra durante otros treinta-sesenta minutos. A continuación se lavaron los chips dos veces con tampón de unión para eliminar las proteínas no ligadas. Se añadieron dos veces 0,5 \muL de ácido sinapínico (12,5 mg/mL) y se dejó secar en cada una de las veces. La presencia de ácido sinapínico potencia la vaporización y la ionización de las proteínas ligadas durante la espectrometría de
masas.

Para las superficies de chip que contenían restos carboxílicos (WCX-2, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA), antes del uso del bolígrafo hidrófobo, la superficie se lavó con HCl 10 mM durante treinta minutos, y se aclaró cinco veces con agua desionizada. Después de usar el bolígrafo, la superficie se lavó cinco veces con cinco \muL de tampón de unión y una vez con agua desionizada. Se aplicaron de dos a tres \muL de muestra en dos aplicaciones de treinta a sesenta minutos cada una. Se lavó la superficie dos veces con 5 \muL de tampón de unión, y se aplicaron 0,5 \muL de ácido sinapínico dos veces.

Para las superficies de chip que contenían restos de amonio cuaternarios (SAX-2, Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA), después de usar el bolígrafo, la superficie se lavó cinco veces con cinco \muL de tampón de unión y una vez con agua desionizada. La aplicación de la muestra, el lavado y la aplicación del ácido sinapínico se llevaron a cabo como se ha descrito antes.

A continuación los chips se sometieron a espectrometría de masas utilizando un Ciphergen SELDI PBS One (Ciphergen Biosystems, Inc., Palo Alto, CA) que funcionaba con el programa "SELDI v. 2.0". Para todos los chips, se fijó una "masa elevada" en 200.000 Daltons. Se fijo la "sensibilidad inicial del detector" en 9 (en un intervalo de 1-10, siendo 10 la mayor sensibilidad). Se fijó el NDF (filtro de densidad neutra) en "OUT". El método de adquisición de datos se fijó en "Cuantificación SEADI". Los parámetros de adquisición SELDI se fijaron en 20, con incrementos de 5, y se incluyó un calentamiento con dos disparos a una intensidad de 50 (sobre 100). Para los chips IMAC, se optimizó la masa entre 3.000 Daltons y 3.001 Daltons, la intensidad inicial del láser se fijó en 80 (sobre 100), y los temporales se fijaron en 5 (es decir, 5 disparos de láser por posición). El ordenador identificó automáticamente los picos. Para los chips WCX-2, se optimizó la masa entre 3.000 Daltons y 50.000 Daltons, la intensidad inicial del láser se fijó en 80, y los temporales en 8. El ordenador identificó automáticamente los picos. Para los chips SAX-2, se optimizó la masa entre 3.000 Daltons y 50.000 Daltons, se fijó la intensidad inicial del láser en 85, y los temporales en 8. El ordenador realizó la identificación automática de los picos.

Se analizaron diez muestras de suero (cinco procedentes de individuos normales y cinco procedentes de individuos con cáncer de pecho) mediante espectrometría de masas para identificar las proteínas presentes en las sesenta fracciones descritas anteriormente. Los picos resultantes en la espectrometría de masas se compararon para identificar los picos presentes en las muestras de suero de individuos con cáncer de pecho pero que no estaban presentes en las muestras normales. Si los picos de muestras diferentes presentaban una diferencia de masas de no más de un uno por ciento, se asumía que los picos eran el mismo. Se identificaron en las cinco muestras de suero procedentes de individuos con cáncer de pecho once picos de espectrometría de masas que variaban en tamaño entre justo por encima de 11.000 Da y aproximadamente 103.000 Da, y no estaban presentes en las muestras procedentes de individuos normales. Entonces se determinó la presencia o la ausencia de dichos picos en otras treinta muestras adicionales de suero (quince de individuos normales y quince de individuos con cáncer de pecho). También se analizaron otros siete picos que estaban presentes en cuatro de las muestras de suero de cáncer de pecho originales, pero que no estaban en ninguna de las muestras normales, debido a que estaban en la misma fracción y en la misma superficie SELDI que los uno o más picos de los once que ya estaban siendo evaluados. De los dieciocho picos estudiados, quince estaban presentes en quince o más de las veinte muestras de suero de cáncer de pecho, pero estaban ausentes en 15 o más de las muestras de suero normales.

Los resultados de los anteriores análisis se resumen en la Tabla 1. Se estima que las masas enumeradas en la tabla presentan un error inferior al uno por ciento.

TABLA 1

1

Ejemplo 2

Secuenciamiento de Proteínas Marcadoras de Cáncer de Pecho

Las proteínas asociadas al cáncer de pecho, en base a los datos bioquímicos y de espectrometría de masas proporcionados antes, se pueden caracterizar con mayor profundidad usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las muestras de suero se pueden fraccionar usando, por ejemplo, cromatografía en columna y/o electroforesis, para producir muestras de proteínas purificadas correspondientes a cada una de las proteínas identificadas en la Tabla 1. Las secuencias de las proteínas aisladas se pueden determinar a continuación usando metodologías convencionales de secuenciamiento de péptidos (véanse los Ejemplos 5 y 6). Cabe destacar que el especialista en la técnica, en vista de la descripción precedente, sería capaz de producir un anticuerpo dirigido contra cualquier proteína asociada al cáncer de pecho identificada mediante los métodos descritos en la presente memoria. Además, el especialista, en vista de la descripción precedente, sería capaz de producir secuencias de ácidos nucleicos que codifican los fragmentos descritos anteriormente, así como secuencias de ácidos nucleicos complementarias a los mismos. Adicionalmente, el especialista, usando metodologías convencionales de ADN recombinante, por ejemplo, mediante el escrutinio de una librería de cADN con dicha secuencia de ácidos nucleicos, sería capaz de aislar secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa que codifican proteínas diana asociadas al cáncer de pecho. Dichas secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa, o fragmentos de las mismas, se pueden usar para generar sistemas o terapias de detección basadas en ácidos nucleicos.

Ejemplo 3

Producción de Anticuerpos que se Unen Específicamente a Proteínas Asociadas al Cáncer de Pecho

Una vez identificada, una proteína asociada al cáncer de pecho se puede detectar en una muestra de tejido o de fluido corporal usando múltiples ensayos de unión bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, tal como se ha discutido anteriormente, se puede detectar una proteína asociada al cáncer de pecho en una muestra de tejido o de fluido corporal usando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que se une específicamente a un epítopo dispuesto por la proteína asociada al cáncer de pecho. En dichos sistemas de detección, el anticuerpo se marca preferiblemente con un resto detectable.

A continuación se proporciona un ejemplo de protocolo para la producción de un anticuerpo monoclonal anti-proteína asociada a cáncer de pecho. También se contemplan otros protocolos. Por consiguiente, el método concreto de producción de anticuerpos de proteínas diana no queda abarcado como aspecto de la invención.

Se inyectan ratones Balb/c J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) intraperitonealmente con la proteína diana cada 2 semanas hasta que los ratones inmunizados obtienen el título de suero apropiado. Después de eso, los ratones son inyectados con 3 pinchazos intravenosos consecutivos. En la primera inyección se usa adyuvante completo de Freund (Gibco, Grand Island), en la segunda inyección se usa adyuvante incompleto de Freund; y en las posteriores inyecciones intravenosas se usa disolución salina. A continuación se sacrifica al animal y se extrae el bazo. A continuación se fusionan células de bazo (o células de nodos linfáticos) con una línea celular de mieloma, por ejemplo, usando el método de Kohler y col. (1975) Nature 256: 495. Los hibridomas que producen anticuerpos que reaccionan con las proteínas diana son clonadas a continuación y se cultivan como ascites. Se escrutan hibridomas en función de su reactividad frente al inmunógeno en cualquier ensayo deseado. Las descripciones detalladas de los protocolos de escrutinio, de producción de ascites y de inmunoensayos también se describen en el documento PCT/US92/09220, publicado el 13 de mayo de 1993.

Ejemplo 4

Ensayo Basado en Anticuerpos para Detectar Cáncer de Pecho en un Individuo

El siguiente ensayo ha sido desarrollado para muestras de tejido; sin embargo, se contempla que puedan desarrollarse ensayos similares para evaluar muestras fluidas sin una experimentación excesiva. Un ensayo típico puede emplear un kit de inmunodetección comercial, por ejemplo, el kit ABC Elite de Vector Laboratorios, Inc.

Se extrae una muestra de biopsia del paciente en investigación según las guías médicas apropiadas. A continuación la muestra se aplica a un porta de vidrio de microscopio y se fija en acetona fría durante 10 minutos. Entonces, el porta es aclarado con agua destilada y pretratado con una disolución que contiene peróxido de hidrógeno (2 mL de H_{2}O_{2} al 30% y 30 mL de metanol frío). A continuación se aclara el porta con un Tampón A que contiene disolución salina tamponada Tris (TBS) con un 0,1% de Tween y un 0,1% de Brij. Se añade al porta un anticuerpo monoclonal de ratón anti-proteína asociada al cáncer de pecho en Tampón A, y a continuación se incuba el porta durante una hora a temperatura ambiente. Entonces se lava el porta con Tampón A, y se añade al porta un anticuerpo secundario (kit ABC Elite, Vector Labs, Inc.) en Tampón A. A continuación se incuba el porta durante 15 minutos a 37ºC en una cámara de humedad. Se vuelve a lavar los portas con Tampón A, y a continuación se añade el reactivo ABC (kit ABC Elite, Vector Labs, Inc.) al porta para amplificar la señal. Entonces se incuba el porta durante otros 15 minutos a 37ºC en la cámara de humedad.

Entonces se lava el porta con agua destilada, y se añade al porta sustrato de diaminobencedina (DAB) durante 4-5 minutos. A continuación se aclara el porta con agua destilada, se tiñe con hematoxilina, se aclara con etanol al 95%, se aclara con etanol al 100%, y a continuación se aclara con xileno. Entonces se aplica un cubre sobre el porta y el resultado se observa en el microscopio.

Ejemplo 5

Purificación y Caracterización de Proteína de Cáncer de Pecho de 28,3 kD

La proteína de cáncer de pecho de 28,3 kD identificada en el Ejemplo 1 se aisló y se caracterizó con mayor profundidad como se indica a continuación.

Se agotó en inmunoglobulina G y en albúmina en suero aproximadamente 30 mL de suero (de un combinado de múltiples pacientes de cáncer de pecho) usando cromatografía de Proteína G y cromatografía de agarosa Cibacron Blue, respectivamente, usando metodologías estándar tales como las descritas en el Ejemplo 1. El suero agotado en albúmina e inmunoglobulina se fraccionó a continuación mediante cromatografía de afinidad de intercambio iónico Mono Q. En resumen, las proteínas del suero fueron aplicadas a una columna Mono Q de 5 mL (Pharmacia y Upjohn, Peapack, NJ) en tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, y se recogió la fracción de flujo libre. Después de eso, se eluyeron de la columna las proteínas del suero paso a paso usando tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, que contenía concentraciones crecientes de cloruro sódico. De este modo se obtuvieron 12 fracciones de suero, cada una con una cantidad diferente de cloruro sódico. Las fracciones incluían flujo libre y los tampones de elución de tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, que contenían cloruro sódico 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM y 2 M.

La fracción de cloruro sódico 50 mM que contenía la proteína de interés fue cambiada posteriormente de nuevo a tampón de fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, y concentrada empleando un Centricon 10 (Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, la muestra resultante se sometió a fraccionamiento mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Sephacryl S-200 (Pharmacia) usando un tampón isocrático que contenía fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. Las fracciones que eluyeron de la columna fueron evaluadas para determinar la presencia de la proteína de 28,3 kD usando espectroscopía de masas Ciphergen SELDI, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las fracciones que contenían la proteína de 28,3 kD se mezclaron y se aplicaron a una columna IMAC (Sigma) que había sido precargada con Ni^{2+} mediante una incubación previa con NiCl_{2} 50 mM. A continuación se lavó la columna IMAC con 6 volúmenes de lecho de una disolución que contenía fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, y la fracción de proteína ligada se eluyó con la misma disolución que contenía imidazol 100 mM. A continuación la fracción eluida se concentró por medio de un Minicon 10 (Millipore) y entonces se sometió a fraccionamiento mediante electroforesis de gel de dodecilsulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre un gel SDS-PAGE de glicina Tris al 12%. Las muestras de la fracción de proteínas se aplicaron a dos calles separadas del gel. Después de la electroforesis, el gel resultante fue sometido a tinción con colorante Coomassie Azul Brillante y se destiñó para revelar la presencia de proteínas. De una de las 2 calles se escindieron tres bandas de aproximadamente 28,3 kD (caracterizadas como la proteína de mayor peso molecular, la proteína de peso molecular medio y la proteína de menor peso molecular) y se eluyeron de los portas de acrilamida.

Las proteínas se eluyeron del gel como se indica a continuación. En resumen, los portas de gel se lavaron cinco veces con agua de grado HPLC aplicando un vórtice vigoroso. Los portas lavados fueron cortados entonces en piezas pequeñas en 120 \muL de acetato sódico 100 mM, pH 8,5, SDS al 0,1%, y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se decantó el sobrenadante en un tubo nuevo y se secó en un speedvac. La partícula resultante se reconstituyó a continuación en 37 \muL de agua de grado HPLC. A continuación se añadieron aproximadamente 1480 \muL de etanol frío y la mezcla resultante se incubó durante una noche a -20ºC. La muestra se centrifugó a 4ºC durante 15 minutos a 11.000 rpm. El sobrenadante se eliminó y la partícula resultante se reconstituyó en 5 \muL de agua. Las disoluciones de proteína resultantes se aplicaron al SELDI y se identificó la proteína de 28,3 kD en una de las tres preparaciones (véase la Figura 1A, que corresponde a la proteína de 28 kD más pesada). La correspondiente banda fue escindida a continuación de la segunda de las 2 calles del gel. Tras proteolisis con tripsina, los fragmentos trípticos fueron eluidos del gel y sometidos a análisis de microsecuencia mediante espectrometría de masas.

Mediante espectrometría de masas se detectaron cuatro masas individuales. Cuando las cuatro masas se usaron para buscar en la Base de Datos Suiza de Proteínas, se observó que las cuatro coincidían con las secuencias de aminoácidos presentes en la proteína denominada en la técnica ribonucleoproteína B'' nuclear pequeña U2 (U2 snRNP B'') (Habets y col. (1987) ver anterior, Número de Acceso de la Base de Datos Suiza de Proteínas 4507123; y Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2421-2425 (1987)). Los resultados se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

2

La secuencia de aminoácidos, en una dirección de extremo N a extremo C, de la proteína U2 snRNP B'' en un código de aminoácidos sencillos es:

3

<110> Watkins, Brynmor

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<120> Materials and Methods for Detection and Treatment of Breast Cancer

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<130> MTP-024PC

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<140>

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<141>

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<150> US 60/165.173

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<151> 1999-11-16

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<150> US 60/172.170

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<151> 1999-12-17

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<150> US 60/178.860

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<151> 2000-01-27

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<150> US 60/201.721

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<151> 2000-05-03

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<160> 23

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<170> PatentIn Ver. 2.0.

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<210> 1

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido tríptico

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<400> 1

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\sa{Gln Leu Gln Gly Phe Pro Phe Tyr Gly Lys Pro Met Arg}

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<210> 2

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido tríptico

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<400> 2

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\sa{His Asp Ile Ala Phe Val Glu Phe Glu Asn Asp Gly Gln Ala Gly Ala Ala Arg}

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<210> 3

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido tríptico

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<400> 3

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\sa{Leu Val Pro Gly Arg His Asp Ile Ala Phe Val Glu Phe Glu Asn Asp Gly Gln}

\sac{Ala Gly Ala Ala Arg}

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<210> 4

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: péptido tríptico

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<400> 4

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\sa{Thr Val Glu Gln Thr Ala Thr Thr Thr Asn Lys}

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<210> 5

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<211> 225

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

4

5

Claims

1. Un método in vitro que comprende las etapas de:

(a): obtener una muestra aislada de un mamífero; y

(b): detectar en la muestra la presencia de una proteína que se caracteriza por comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, que si se encuentra presente es indicativa de la presencia de cáncer de pecho en el mamífero.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende tejido de pecho, o un fluido corporal.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el fluido corporal se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, sudor, lágrimas, orina, fluido peritoneal, linfa, secreciones vaginales, semen, fluido espinal, fluido ascítico, saliva, esputos y exudado de pecho.

4. Un método in vitro que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto una muestra derivada de un mamífero con un resto de unión que se une específicamente a una proteína asociada al cáncer para producir un complejo resto de unión-proteína asociada al cáncer, en donde dicho resto de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una posición de unión de anticuerpo biosintético, y se une específicamente a un proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; y

(b): detectar la presencia del complejo, que si se encuentra presente es indicativo de la presencia de cáncer de pecho en el mamífero.

5. El método de la reivindicación 4, en el que opcionalmente (i) el resto de unión está marcado con un resto detectable; (ii) el resto de unión es un anticuerpo, o (iii) el resto de unión es un anticuerpo monoclonal.

6. El método de la reivindicación 4 ó 5, en donde la ausencia de una cantidad detectable de la proteína es indicativa de la ausencia de cáncer.

7. El método de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, que además comprende las etapas adicionales de:

(a): medir una cantidad del complejo en la muestra; y

(b): comparar la cantidad del complejo de la muestra con un valor medio indicativo de cáncer de pecho en un mamífero, en donde una cantidad del complejo en la muestra superior o igual al valor medio es indicativa de la presencia de cáncer de pecho en el mamífero.

8. Un método in vitro que comprende: detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra de tejido o de fluido corporal procedente de un mamífero, para indicar con ello la presencia de cáncer de pecho en el mamífero, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la etapa de detección comprende combinar la muestra con una sonda de hibridación marcada capaz de hibridarse específicamente con la molécula de ácido nucleico.

10. Un método in vitro que comprende las etapas de:

(a): combinar una muestra procedente de un mamífero en unas condiciones de hibridación específicas con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; y

(b): detectar la presencia de un dúplex que comprenda la sonda de ácido nucleico, siendo la presencia del dúplex indicativa de la presencia de cáncer de pecho en el mamífero.

11. El método de la reivindicación 10, que además comprende la etapa de amplificar el ácido nucleico diana de la muestra antes de combinar la muestra con la sonda de ácido nucleico.

12. El método de la reivindicación 10 ó 11, en el que la sonda de ácido nucleico está marcada con un resto detectable, y opcionalmente en el que el resto detectable comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en una marca radioactiva, una marca de hapteno, una marcada fluorescente y una marca enzimática.

13. Un resto de unión seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una posición de unión de anticuerpo biosintético que se une específicamente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 para su uso diagnóstico en la detección in vitro de cáncer de pecho.

14. El uso de un resto de unión seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una posición de unión de anticuerpo biosintético que se une específicamente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 5 en la fabricación de un elemento diagnóstico para la detección de cáncer de pecho.

15. Una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente a un ácido nucleico diana que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; ó SEQ ID NO: 5 para su uso diagnóstico en la detección in vitro del cáncer de pecho.

16. El uso de una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana que codifica la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 5 en la fabricación de un elemento diagnóstico para la detección de cáncer de pecho.

17. Un kit para uso en un método in vitro de detección de la presencia de cáncer de pecho, o de evaluación de la eficacia de un tratamiento terapéutico de un cáncer de pecho, comprendiendo dicho kit en conjunto: un receptáculo para recibir una muestra de tejido o de fluido corporal de un mamífero; un resto de unión seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una posición de unión de anticuerpo biosintético que se une específicamente a una proteína asociada al cáncer de pecho, que se caracteriza por comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; y un medio para la detección del resto de unión ligado a la proteína asociada al cáncer de pecho.

18. El kit de la reivindicación 17, que además comprende una muestra de referencia, en el que opcionalmente la muestra de referencia es indicativa de una muestra de pecho normal.