ES2282105T3 - Uso de un tejido estromal tridimensional para el tratamiento de tejidos isquemiso. - Google Patents
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Abstract
Uso de un tejido estromal tridimensional para la preparación de un medicamento para promover la angiogénesis en el tejido cardíaco isquémico, en el que dicho tejido cardíaco isquémico es puesto en contacto con un tejido estromal tridimensional que comprende células estromales y proteínas de tejido conectivo que son secretadas de manera natural por las células estromales, estando dichas células unidas y envolviendo en sustancia a un armazón que se compone de un material biocompatible no viviente que forma una estructura tridimensional que tiene los espacios intersticiales llenados por las células estromales.
Description
Uso de un tejido estromal tridimensional para el
tratamiento de tejidos isquémicos.
La presente invención se refiere al uso de un
tejido estromal tridimensional para promover la angiogénesis en el
tejido cardíaco isquémico. La presente invención también se refiere
al uso de un tejido estromal tridimensional para la promoción de la
vascularización en los tejidos isquémicos.
La enfermedad cardíaca coronaria es la primera
causa individual de muerte en América en la actualidad ("1999
Heart and Stroke Statistical Update" de la American Heart
Association). Esta enfermedad, como sucede en el caso de otros
varios trastornos cardiovasculares, está caracterizada por el
estrechamiento de las arterias y por un inadecuado flujo sanguíneo
a tejidos críticos.
Los métodos clínicos que se usan en la
actualidad para mejorar el flujo sanguíneo en un corazón enfermo o
dañado de otro modo suponen la utilización de técnicas quirúrgicas
invasivas tales como la cirugía de bypass coronario, la
angioplastia y la endarterectomía. Tales procedimientos naturalmente
conllevan altos grados de riesgo inherente durante la cirugía y
después de la misma, y a menudo tan sólo proporcionan un remedio
temporal para la isquemia cardíaca.
En un esfuerzo para mejorar la prognosis de los
procedimientos quirúrgicos en el corazón, los médicos e
investigadores han intentado usar bombas para dar asistencia al
flujo sanguíneo durante la cirugía. Sin embargo, tales bombas tan
sólo actúan como dispositivos de asistencia temporales durante la
cirugía, y no pueden ser usadas como forma de tratamiento para la
afección cardíaca.
Una alternativa, o al menos un complemento, al
bypass coronario y a otros procedimientos quirúrgicos para mejorar
el flujo sanguíneo en el corazón es la de inducir a los tejidos del
corazón a formar nuevos vasos sanguíneos. A ese respecto, se han
usado compuestos angiogénicos tales como el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) en un esfuerzo para facilitar la
formación de nuevos vasos sanguíneos. Un enfoque para el uso del
VEGF para promover la formación de vasos sanguíneos en el tejido
cardíaco ha sido el consistente en inyectar la proteína
directamente al interior del cuerpo del paciente. Sin embargo, tales
intentos han sido en gran medida fallidos.
Últimamente se ha usado un enfoque que se sirve
de la terapia genética para suministrar VEGF mediante inyección de
vectores retrovirales que se dirigían al tejido cardíaco y
redundaban en una producción de VEGF (Losordo et al., 1998,
Circulation 98:2800-2804). Este método in
situ mejoraba el flujo sanguíneo y los síntomas subjetivos en
los pacientes, sugiriendo que el suministro local de un factor de
crecimiento tal como el VEGF para promover la angiogénesis en los
tejidos cardíacos puede ser de valor terapéutico en el tratamiento
de ciertas afecciones cardíacas. Sin embargo, tales técnicas de
terapia genética en las que se utilizan vectores retrovirales
presentan ciertos riesgos inherentes y plantean problemas de
seguridad. Por añadidura, los enfoques del tipo de los que hacen
uso de la terapia genética presentan una serie de problemáticos
obstáculos técnicos no resueltos tales como los bajos niveles de
transfección para las células receptoras, la inestabilidad de los
constructos y la expresión a largo plazo del deseado producto
génico por parte de las células transfectadas.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se aporta el uso de un tejido estromal tridimensional
para la preparación de un medicamento para promover la angiogénesis
en el tejido cardíaco isquémico, en el que dicho tejido cardíaco
isquémico es puesto en contacto con un tejido estromal
tridimensional que comprende células estromales y proteínas de
tejido conectivo que son secretadas de manera natural por las
células estromales, estando dichas células unidas y envolviendo en
sustancia a un armazón que se compone de un material biocompatible
no viviente que forma una estructura tridimensional que tiene los
espacios intersticiales llenados por las células estromales.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se aporta el uso de un tejido estromal tridimensional
para la preparación de un medicamento para la promoción de la
vascularización en tejido isquémico, en el que dicho tejido
isquémico es puesto en contacto con dicho tejido estromal
tridimensional, comprendiendo dicho tejido estromal células
estromales y proteínas de tejido conectivo secretadas de manera
natural por las células estromales, estando dichas células unidas y
envolviendo a un armazón que se compone de un material biocompatible
no viviente que forma una estructura tridimensional que tiene los
espacios intersticiales llenados por las células
estromales.
estromales.
En particular, la presente invención se refiere
a la implantación o unión de un tejido estromal tridimensional para
promover la endotelialización y la angiogénesis en los tejidos
cardíacos y afines.
\newpage
La invención tiene una variedad de aplicaciones
entre las que se incluyen, aunque sin carácter limitativo, las de
promover la reparación y la regeneración del músculo cardíaco
dañado, promover la vascularización y la curación durante la
cirugía cardíaca (como p. ej. la cirugía de bypass o la sustitución
de válvulas cardíacas), promover la formación de vasos sanguíneos
en los sitios de anastomosis, y promover la vascularización y la
reparación del músculo esquelético, del músculo liso o del tejido
conectivo dañado.
La invención se basa en parte en el
descubrimiento de que los constructos de tejido estromal
tridimensional, cuando son implantados en el lecho de la herida de
los pacientes con úlceras de pie diabético, son capaces de inducir
una rápida endotelialización y vascularización, redundando en una
formación de nuevos capilares y en una reducción de la inflamación
en el tejido herido.
Los implantes de tejido estromal tridimensional
secretan una variedad de factores de crecimiento de los que se sabe
que son decisivos para la regeneración tisular y la angiogénesis,
siendo el más destacable el factor de crecimiento endotelial
vascular, o VEGF (Tabla II). La aplicación de estos productos a
otros tejidos dañados, tales como el músculo cardíaco dañado,
debería inducir un nuevo suministro local de sangre a la zona y
soportar una rápida remodelación tisular.
Un implante de tejido estromal tridimensional
puede también ser usado para promover la formación de un bypass
carotídeo "natural" para dar asistencia a u obviar la necesidad
de cirugía en forma de endarterectomía carotídea (que puede a
menudo redundar en un ataque debido al flujo corriente abajo de las
partículas desalojadas durante el procedimiento).
Figs. 1A-1D Fotomicrógrafos que
muestran la angiogénesis estimulada por tejido estromal artificial
en una membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM). Las
Figs. 1A y 1B muestran vistas macroscópicas, mientras que las Figs.
1C y 1D muestran vistas histológicas. La Fig. 1A muestra el andamio
en solitario, la Fig. 1C muestra la membrana no viable, y las Figs.
1B y 1D muestran la membrana tratada con tejido estromal
tridimensional.
Fig. 2 Gráfico de barras que ilustra el efecto
del tejido estromal artificial en la formación de vasos sanguíneos
capilares en una membrana corioalantoidea de embrión de pollo. Las
barras representan intervalos de confianza del 95%.
Fig. 3 Gráfico de barras que ilustra la
formación de vasos sanguíneos estimulada por tejido estromal
artificial en un ensayo en anillos aórticos de rata.
Fig. 4 Gráfico de barras que ilustra la
proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana
(HUVEC) in vitro a continuación de la estimulación con medio
acondicionado con tejido estromal artificial.
Fig. 5 Gráfico de barras que ilustra la
estimulación de la motilidad de las células endoteliales por parte
del tejido estromal artificial.
Fig. 6 Gráficos que ilustran la estimulación de
la quimiotaxis de las células endoteliales por parte del tejido
estromal artificial (a la izquierda se muestra la curva estándar
usando VEGF purificado a las concentraciones indicadas).
Fig. 7 Resultado de citometría de flujo que
ilustra la inducción de la expresión de integrina
\alpha_{v}\beta_{3} en células endoteliales por parte de
tejido estromal artificial.
Figs. 8A y 8B Fotomicrógrafos que ilustran la
inhibición de la apoptosis de células endoteliales cultivadas en
"MATRIGEL" en presencia de tejido estromal artificial. Las
células fueron coloreadas con lipoproteína de baja densidad y
sytox, con lo cual quedaron coloreados los núcleos de las células
apoptóticas.
Figs. 9A-9D Fotomicrógrafos de
una úlcera diabética humana que muestran la vascularización del
lecho de la herida, la remodelación del tejido y la reducción de la
inflamación estimuladas por el tejido estromal artificial. Las
Figs. 9A y 9C muestran el lecho de la herida antes del tratamiento,
mientras que las Figs. 9B y 9D muestran el lecho de la herida tras
el tratamiento.
Fig. 10 Ecocardiogramas representativos de
corazones porcinos tomados antes de (a y c) y 30 días después de (b
y d) la oclusión de la arteria coronaria ascendente inferior.
Controles de tratamiento simulado no tratados (Figs. 10a y 10b);
animales tratados con tejido estromal tridimensional (Figs. 10c y
10d).
La presente invención se refiere al uso de un
tejido estromal tridimensional para promover la formación de vasos
sanguíneos en los tejidos y órganos de un sujeto, y en particular de
un sujeto humano. En particular, la presente invención se refiere a
la implantación o unión de un tejido estromal tridimensional
artificial para promover la endotelialización y la angiogénesis en
los tejidos cardíacos y afines.
La invención tiene una variedad de aplicaciones
entre las que se incluyen, aunque sin carácter limitativo, las de
promover la reparación y la regeneración del músculo cardíaco
dañado, promover la vascularización y la curación durante la
cirugía cardíaca (como p. ej. la cirugía de bypass o la sustitución
de válvulas cardíacas), promover la formación de vasos sanguíneos
en los sitios de anastomosis, y promover la vascularización y la
reparación del músculo esquelético dañado, de tejido conectivo o de
otros tejidos.
La invención está basada en parte en el
descubrimiento de que los tejidos estromales tridimensionales,
cuando son implantados en el lecho de la herida de pacientes con
úlceras de pie diabético, son capaces de inducir la
endotelialización y la vascularización, redundando en una formación
de nuevos capilares y una reducción de la inflamación en el tejido
herido.
El tejido estromal tridimensional comprende
células estromales cultivadas en un sustrato o armazón
tridimensional. Las células estromales preferiblemente comprenden
fibroblastos con o sin células y/o elementos adicionales que serán
descritos más ampliamente a continuación. En particular, las células
adicionales pueden comprender células de músculo liso, células de
músculo cardíaco o células de músculo esquelético. Los fibroblastos
y/o las otras células pueden ser de origen fetal o adulto, y pueden
sacarse de fuentes convenientes tales como la piel, el músculo
cardíaco, el músculo liso, el músculo esquelético, el hígado, el
páncreas, etc. Tales tejidos y/u órganos pueden ser obtenidos
mediante una apropiada biopsia o bien al hacer una autopsia. De
hecho, pueden usarse órganos de cadáveres como generosa fuente de
suministro de elementos y células estromales.
Debe entenderse que un experto en la materia
puede controlar la actividad angiogénica de un cultivo de tejido
estromal incorporando células que liberen distintos niveles de
factores angiogénicos. Por ejemplo, se sabe de las células de
músculo liso vascular, y preferiblemente de las células de músculo
liso aórtico, que producen bastante más VEGF que los fibroblastos
dérmicos humanos. Por consiguiente, utilizando células de músculo
liso aórtico en lugar de fibroblastos o además de los mismos,
pueden cultivarse tejidos estromales tridimensionales con una
acrecentada actividad angiogénica.
En una realización alternativa de la invención,
un implante de tejido estromal tridimensional que esté manipulado
genéticamente para presentar unas mejoradas propiedades para inducir
la angiogénesis puede ser usado para promover la formación de
nuevos vasos sanguíneos en los tejidos cardíacos o de otro tipo.
Para la puesta en práctica de la presente
invención, se inoculan células estromales en un armazón
tridimensional, y dichas células son ahí cultivadas para así
desarrollar un tejido estromal. El armazón de soporte tridimensional
puede ser de cualquier material y/o forma que: (a) permita que las
células se unan al mismo (o pueda ser modificado para permitir que
las células se unan al mismo); y (b) permita que las células crezcan
en más de una capa.
Para formar el armazón pueden usarse los de una
serie de distintos materiales entre los que se incluyen, aunque sin
carácter limitativo, los siguientes: nilón (poliamidas), dacron
(poliésteres), poliestireno, polipropileno, poliacrilatos,
compuestos polivinílicos (como p. ej. el cloruro de polivinilo;
PVC), policarbonato, politetrafluoroetileno (PTFE; TEFLON),
thermanox (TPX), la nitrocelulosa, el algodón, el ácido
poliglicólico (PGA), las suturas de catgut, la celulosa, la
gelatina, el dextrano, etc. Cualesquiera de estos materiales pueden
ser tejidos en forma de malla para así formar el armazón
tridimensional. Ciertos materiales tales como el nilón, el
poliestireno, etc. son malos sustratos para la fijación celular.
Cuando se usan estos materiales en calidad del armazón de soporte
tridimensional, es recomendable pretratar al armazón antes de la
inoculación de las células estromales a fin de acrecentar la
fijación de las células estromales al armazón. Por ejemplo, antes de
la inoculación con células estromales, las rejillas de nilón
podrían ser tratadas con ácido acético 0,1M e incubadas en
polilisina, suero bovino fetal y/o colágeno para recubrir el nilón.
El poliestireno podría ser tratado de manera análoga usando ácido
sulfúrico.
Cuando el tejido estromal tridimensional deba
ser implantado directamente in vivo, puede ser preferible
usar materiales biodegrables tales como PGA, material de sutura de
catgut, colágeno, ácido poliláctico o ácido hialurónico. Por
ejemplo, estos materiales pueden ser tejidos para así formar con los
mismos un armazón tridimensional tal como una esponja de colágeno o
un gel de colágeno. En los casos en los que los cultivos deban ser
conservados por espacio de largos periodos de tiempo o
criopreservados, pueden ser preferibles materiales no degradables
tales como el nilón, el dacron, el poliestireno, los poliacrilatos,
los polivinilos, los teflones, el algodón, etc. Una conveniente
malla de nilón que podría ser usada según la invención es la Nitex,
que es una malla de filtración de nilón que tiene un tamaño medio
de poro de 140 \mum y un diámetro medio de la fibra de nilón de
90 \mum (\alm{1}3-210/36, Tetko, Inc.,
N.Y.).
Se inoculan al armazón células estromales que
comprenden fibroblastos, con o sin otros elementos y células que se
describen a continuación. Estas células estromales pueden sacarse de
tejidos u órganos tales como la piel, el corazón, los vasos
sanguíneos, el músculo esquelético, el hígado, el páncreas, etc.,
los cuales pueden ser obtenidos mediante biopsia (en los casos en
los que ello sea lo apropiado) o al efectuar una autopsia. De
hecho, los fibroblastos y otras células estromales pueden ser
obtenidos en cantidad y con bastante comodidad de cualquier órgano
apropiado de un cadáver. Como se ha explicado anteriormente, los
fibroblastos fetales pueden ser usados para formar un tejido
estromal tridimensional "genérico" que servirá de soporte para
el crecimiento de una variedad de distintos tejidos y/o células que
entren en contacto con el mismo. Sin embargo, puede prepararse un
tejido estromal "específico" inoculando en el armazón
tridimensional células estromales sacadas del corazón y/o de un
determinado individuo que deba recibir más tarde las células y/o los
tejidos cultivados según el cultivo tridimensional de la
invención.
Las células estromales pueden ser fácilmente
aisladas desagregando el apropiado órgano o tejido. Esto puede
llevarse a cabo fácilmente usando técnicas que son conocidas para
los expertos en la materia. Por ejemplo, el tejido u órgano puede
ser desagregado mecánicamente y/o tratado con enzimas digestivas y/o
agentes quelantes que debiliten las uniones entre las células
contiguas, haciendo que sea así posible dispersar el tejido para
dejarlo en forma de una suspensión de células individuales sin una
apreciable rotura de células. La disociación enzimática puede ser
llevada a cabo desmenuzando el tejido y tratando el tejido
desmenuzado con cualesquiera de las de una serie de enzimas
digestivas ya sea en solitario o bien en combinación. Éstas
incluyen, aunque sin carácter limitativo, la tripsina, la
quimotripsina, la colagenasa, la elastasa y/o la hialuronidasa, la
DNasa, la pronasa, la dispasa, etc. La disrupción mecánica puede
también ser llevada a cabo por una serie de métodos entre los que
se incluyen, aunque sin carácter limitativo, el uso de trituradores,
mezcladores, tamices, homogeneizadores, células de presión o
sonicadores, para mencionar tan sólo unos pocos de los aparatos que
pueden ser usados. Para una reseña de las técnicas de desagregación
de tejidos, véase Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of
Basic Technique, 2ª Ed., A.R. Liss, Inc., Nueva York, 1987, Cap. 9,
pp. 107-126.
Una vez que el tejido ha sido reducido a una
suspensión de células individuales, la suspensión puede ser
fraccionada en subpoblaciones de las cuales pueden obtenerse los
fibroblastos y/o los otros elementos y/o células estromales. Esto
puede también llevarse a cabo usando técnicas estándar para la
separación celular entre las que se incluyen, aunque sin carácter
limitativo, las de clonación y selección de específicos tipos de
células, la destrucción selectiva de las células no deseadas
(selección negativa), la separación basada en la aglutinabilidad
celular diferencial en la población mixta, los procedimientos de
congelación-descongelación, el uso de las diferentes
propiedades de adherencia de las células en la población mixta, la
filtración, la centrifugación convencional y zonal, la elutriación
centrífuga (centrifugación en contracorriente), la separación por
gravedad unitaria, la distribución en contracorriente, la
electroforesis y la clasificación celular activada por
fluorescencia. Para una reseña de las técnicas de selección clonal
y separación celular, véase Freshney, Culture of Animal Cells. A
Manual of Basic Techniques, 2ª Ed., A.R. Liss, Inc., Nueva York,
1987, Caps. 11 y 12, pp. 137-168.
El aislamiento de células estromales puede por
ejemplo efectuarse de la manera siguiente: Las muestras de tejido
recién obtenidas son lavadas a fondo y desmenuzadas en solución
salina equilibrada de Hanks (HBSS) a fin de retirar el suero. El
tejido desmenuzado es incubado durante 1-12 horas en
una solución recién preparada de una enzima disociadora tal como la
tripsina. Tras haber sido efectuada tal incubación, las células
disociadas son puestas en suspensión, pelletizadas por
centrifugación y puestas en placas de cultivo. Todas las células
estromales se fijarán antes que las otras células, y por
consiguiente pueden ser aisladas y cultivadas selectivamente las
apropiadas células estromales. Las células estromales aisladas
pueden ser entonces cultivadas hasta la confluencia, separadas del
cultivo confluente e inoculadas en el armazón tridimensional
(Patente Estadounidense Nº 4.963.489; Naughton et al., 1987,
J. Med. 18(3&4):219-250). La inoculación
del armazón tridimensional con una alta concentración de células
estromales, p. ej. de aproximadamente 10^{6} a 5 x 10^{7}
células/ml, redundará en el establecimiento del tejido estromal
tridimensional en periodos de tiempo más cortos.
Además de los fibroblastos, pueden ser añadidas
otras células para formar el tejido estromal tridimensional que es
necesario para soportar el crecimiento a largo plazo en cultivo. Por
ejemplo, otras células que se encuentran en el tejido conectivo
suelto pueden ser inoculadas en el armazón tridimensional junto con
los fibroblastos o en lugar de los mismos. Tales células incluyen,
aunque sin carácter limitativo, células endoteliales, pericitos,
macrófagos, monocitos, adipocitos, células de músculo liso, células
de músculo cardíaco, etc. Tales células pueden ser inoculadas en el
armazón tridimensional en ausencia de fibroblastos. Estas células
estromales pueden sacarse fácilmente de los tejidos u órganos
apropiados tales como la piel, el corazón, los vasos sanguíneos,
etc., usando métodos conocidos en la técnica tales como los
señalados anteriormente. En una realización específica de la
invención, se inoculan fibroblastos en el armazón.
Debe entenderse que un experto en la materia
puede controlar la actividad angiogénica de un cultivo de tejido
estromal incorporando células que liberen distintos niveles de
factores angiogénicos. Por ejemplo, se sabe de las células de
músculo liso vascular, y preferiblemente de las células de músculo
liso aórtico, que producen bastante más VEGF que los fibroblastos
dérmicos humanos. Por consiguiente, utilizando células de músculo
liso aórtico en lugar de fibroblastos o además de los mismos,
pueden cultivarse tejidos estromales tridimensionales con una
acrecentada actividad angiogénica.
De nuevo, cuando las células cultivadas deban
ser usadas para trasplantación o implantación in vivo, es
preferible obtener las células estromales de los propios tejidos
del paciente. El crecimiento de células en presencia del armazón de
soporte estromal tridimensional puede ser adicionalmente acrecentado
añadiendo al armazón o recubriéndolo con proteínas (como p.
ej. colágenos, fibras de elastina, fibras reticulares),
glicoproteínas, glicosaminoglicanos (como p. ej.
heparansulfato,
condroitin-4-sulfato,
condroitin-6-sulfato, dermatán
sulfato, queratán sulfato, etc.), una matriz celular y/u otros
materiales.
Tras la inoculación de las células estromales,
el armazón tridimensional deberá ser incubado en un medio nutriente
apropiado. Pueden ser adecuados para tal uso muchos medios de los
que están disponibles comercialmente, tales como el RPMI 1640 y los
de Fisher, Iscove y McCoy y medios similares. Es importante que el
tejido estromal tridimensional esté en suspensión en el medio
durante el periodo de incubación a fin de maximizar la actividad
proliferativa. Además, el cultivo deberá ser "alimentado"
periódicamente para retirar el medio gastado, despoblar las células
liberadas y añadir medio nuevo. Durante el periodo de incubación,
las células estromales crecerán linealmente a lo largo de los
filamentos del armazón tridimensional y los envolverán antes de
empezar a crecer pasando al interior de las aberturas del
armazón.
Las aberturas del armazón deberán ser de un
tamaño apropiado para permitir que las células estromales se
extiendan a través de las aberturas. El mantener a las células
estromales en crecimiento activo y extendiéndose a través del
armazón acrecienta la producción de los factores de crecimiento que
son elaborados por las células estromales y por consiguiente
servirán de soporte para los cultivos a largo plazo. Por ejemplo, si
las aberturas son demasiado pequeñas, las células estromales pueden
alcanzar rápidamente la confluencia pero pueden ser incapaces de
salir fácilmente de la malla, y las células atrapadas pueden
presentar inhibición por contacto y suspender la producción de los
apropiados factores que son necesarios para soportar la
proliferación y mantener los cultivos a largo plazo. Si las
aberturas son demasiado grandes, las células estromales pueden ser
incapaces de extenderse a través de la abertura, y esto también
hará que disminuya la producción por parte de las células
estromales de los apropiados factores que son necesarios para
soportar la proliferación y mantener los cultivos a largo plazo.
Cuando se usa un armazón del tipo de una malla, tal como el aquí
ejemplificado, se ha comprobado que funcionarán satisfactoriamente
unas aberturas de aproximadamente 140 \mum a aproximadamente 220
\mum. Sin embargo, otros tamaños pueden funcionar igual de bien,
en dependencia de la estructura tridimensional y de la intricación
del armazón. De hecho, funcionará según la invención cualquier forma
o estructura que permita que las células estromales se extiendan y
continúen replicándose y creciendo por espacio de prolongados
periodos de tiempo.
Las distintas proporciones de los varios tipos
de colágeno depositados en el armazón pueden afectar al crecimiento
de las células que entran en contacto con el tejido estromal
tridimensional. Las proporciones de proteínas de matriz
extracelular (ECM) depositadas pueden ser manipuladas o acrecentadas
seleccionando fibroblastos que elaboren el apropiado tipo de
colágeno. Esto puede llevarse a cabo usando anticuerpos monoclonales
de un apropiado isotipo o subclase que sea capaz de activar el
complemento, y que definan particulares tipos de colágeno. Estos
anticuerpos y complemento pueden ser usados para seleccionar
negativamente los fibroblastos que expresen el deseado tipo de
colágeno. Como alternativa, el estroma que se use para inocular el
armazón puede ser una mezcla de células que sinteticen los
apropiados tipos de colágeno deseados. Se indican en la Tabla I la
distribución y los orígenes de los distintos tipos de colágeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Así, puesto que el sistema de cultivo
tridimensional que aquí se describe es adecuado para el crecimiento
de diversos tipos de células y tejidos, y en dependencia del tejido
a cultivar y de los tipos de colágeno que se deseen,
puede(n) seleccionarse la(s) célula(s)
estromal(es) apropiada(s) para inocular el armazón
tridimensional.
Durante la incubación del soporte estromal
tridimensional pueden desprenderse del armazón células
proliferantes. Estas células desprendidas pueden adherirse a las
paredes del recipiente de cultivo, donde pueden seguir proliferando
y formar una monocapa confluente. Esto debería impedirse o
minimizarse por ejemplo retirando las células desprendidas durante
la alimentación, o transfiriendo el tejido estromal tridimensional a
un nuevo recipiente de cultivo. La presencia de una monocapa
confluente en el recipiente puede "parar" el crecimiento de las
células en el cultivo tridimensional. La remoción de la monocapa
confluente o la transferencia del tejido estromal a un medio sin
usar en un nuevo recipiente restablecerá la actividad proliferativa
del sistema de cultivo tridimensional. Tal remoción o transferencia
deberá hacerse en todo recipiente de cultivo que tenga una monocapa
estromal que tenga una confluencia de más de un 25%. Como
alternativa, el sistema de cultivo podría ser agitado para impedir
que se peguen las células desprendidas, o bien en lugar de alimentar
periódicamente los cultivos, el sistema de cultivo podría
disponerse de forma tal que fluya continuamente a través del sistema
medio sin usar. El caudal podría ser ajustado tanto para maximizar
la proliferación dentro del cultivo tridimensional como para
separar y retirar las células que se hayan desprendido del cultivo,
para que las mismas no se adhieran a las paredes del recipiente y
no crezcan hasta la confluencia. En todo caso, las células
estromales desprendidas pueden ser recogidas y criopreservadas para
un uso futuro.
Puede prepararse tejido estromal tridimensional
manipulado genéticamente como se describe en la Patente U.S. Nº
5.785.964. Un tejido estromal manipulado genéticamente puede servir
de vehículo de suministro de genes para una liberación sostenida de
factores angiogénicos in vivo.
Las células estromales pueden ser manipuladas
para expresar un producto génico exógeno. Las células estromales
que pueden ser manipuladas genéticamente incluyen, aunque sin
carácter limitativo, fibroblastos, células de músculo liso, células
de músculo cardíaco, células troncales mesenquimáticas y otras
células que se encuentran en el tejido conectivo suelto, tales como
células endoteliales, macrófagos, monocitos, adipocitos, pericitos,
células reticulares que se encuentran en la médula ósea, etc.
Las células y los tejidos pueden ser manipulados
para expresar un producto génico objetivo que puede impartir una
amplia variedad de funciones entre las que se incluyen, aunque sin
carácter limitativo, la acrecentada función de las células y los
tejidos manipulados genéticamente de promover la angiogénesis al
estar implantados in vivo. El producto génico objetivo puede
ser un péptido o proteína, tal como una enzima, una hormona, una
citoquina, una proteína reguladora, tal como un factor de
transcripción o una proteína de fijación del DNA (DNA = ácido
desoxirribonucleico), o una proteína estructural, tal como una
proteína de superficie celular, o bien el producto génico objetivo
puede ser un ácido nucleico tal como un ribosoma o una molécula
antisentido.
En una realización preferida, los productos
génicos objetivo que imparten propiedades acrecentadas a las células
manipuladas genéticamente incluyen, aunque sin carácter limitativo,
productos génicos que acrecientan el crecimiento celular, como p.
ej. el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor
de crecimiento de los hepatocitos (HGF), los factores de
crecimiento de los fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico
(EGF) y el factor de crecimiento transformante (TGF). En otra
realización preferida, las células y los tejidos son manipulados
genéticamente para expresar productos génicos objetivo que redundan
en inmortalización celular, como p. ej. oncogenes o telomeresa. En
otra realización adicional, las células pueden ser manipuladas para
expresar un producto génico de suicidio programado, como p. ej. la
timidina
cinasa.
cinasa.
En otra realización preferida, las células y los
tejidos son manipulados genéticamente para expresar productos
génicos que aportan funciones protectoras in vitro, tales
como propiedades de criopreservación y antidesecación, como p.
ej. la trehalosa (Patentes U.S. Núms. 4.891.319, 5.290.765 y
5.693.788). Las células y los tejidos de la presente invención
pueden ser también manipulados para expresar productos génicos que
aporten una función protectora in vivo, tales como aquéllos
que protegerían a las células contra una respuesta inflamatoria y
darían protección contra el rechazo por parte del sistema inmune del
huésped, tales como los epítopes HLA, los epítopes de
histocompatibilidad mayor, los epítopes de inmunoglubolina y
receptores, los epítopes de moléculas de adherencia celular, las
citoquinas y las quemoquinas.
Hay una serie de maneras para hacer que mediante
una manipulación los productos génicos objetivo sean expresados por
las células y los tejidos de la presente invención. Puede hacerse
mediante una manipulación que los productos génicos objetivo sean
expresados constitutivamente o de manera histoespecífica o
estímulo-específica. Según este aspecto de la
invención, las secuencias de nucleótidos que codifican los productos
génicos objetivo pueden ser ligadas operativamente a elementos
promotores que sean constitutivamente activos, histoespecíficos o
inducidos en presencia de estímulos específicos.
En una realización específica, las secuencias de
nucleótidos que codifican los productos génicos objetivo son
ligadas operativamente a elementos promotores reguladores que
responden al esfuerzo de cizallamiento o radial. En este caso, el
elemento promotor sería activado por el flujo sanguíneo al pasar
(cizallamiento), así como por el esfuerzo radial que es inducido
como resultado del flujo pulsátil de sangre a través del corazón o
del vaso.
Los ejemplos de otros elementos promotores
reguladores incluyen a elementos de respuesta a la tetraciclina,
elementos de respuesta a la nicotina, elementos de respuesta a la
insulina, elementos de respuesta a la glucosa, elementos de
respuesta al interferón, elementos de respuesta a los
glucocorticoides, elementos de respuesta al estrógeno/progesterona,
elementos de respuesta al ácido retinoide, transactivadores virales,
al promotor temprano o tardío del adenovirus SV40, al sistema lac,
al sistema trp, al sistema TAC, al sistema TRC, al promotor para
3-fosfoglicerato y a los promotores de ácido
fosfatasa. Además podrían construirse elementos de respuesta
artificiales, compuestos de multímeros de sitios de fijación de
factor de transcripción y elementos de respuesta hormonal de manera
similar a la arquitectura molecular de los promotores y
potenciadores que se dan de manera natural (véase, p. ej.,
Herr, W y Clarke, J Cell (1986) 45(3):
461-70). Tales regiones reguladoras compuestas
artificiales podrían ser diseñadas para responder a cualquier señal
deseable y ser expresadas en determinados tipos de células en
dependencia de los sitios de fijación de promotores/potenciadores
seleccionados.
El tejido estromal tridimensional de la presente
invención puede ser usado en una variedad de aplicaciones entre las
que se incluyen, aunque sin carácter limitativo, las de promover la
reparación y la regeneración del músculo cardíaco dañado, promover
la vascularización y la curación durante la cirugía cardíaca (como
p. ej. la cirugía de bypass o la sustitución de válvulas
cardíacas), promover la formación de vasos sanguíneos en los sitios
de anastomosis, y promover la vascularización y reparación del
músculo esquelético, del músculo liso o del tejido conectivo
dañado. A ese respecto, el tejido estromal puede ser usado en forma
de tejido recién cultivado, de tejido criopreservado, o incluso de
tejido privado de vida.
El tejido estromal tridimensional de la presente
invención puede ser unido a varios sitios en el corazón, entre los
que se incluyen el epicardio, el miocardio y el endocardio, para
promover la angiogénesis en la región de unión. Los medios para
lograr la unión incluyen, aunque sin carácter limitativo, la
adherencia directa entre el tejido estromal y el tejido cardíaco,
la cola biológica, la cola sintética, los colorantes láser o el
hidrogel. Los de una serie de selladores y agentes hemostáticos que
están disponibles comercialmente incluyen los llamados
"SURGICAL" (celulosa oxidada), "ACTIFOAM" (colágeno),
"FIBRX" (sellador de fibrina fotoactivado), "BOHEAL"
(sellador de fibrina) y "FIBROCAPS" (sellador de fibrina en
forma de polvo seco), los polímeros polisacáridos
p-G1cNAc ("SYVEC" patch; Marine Polymer
Technologies) y el Polímero 27CK (Protein Polymer Tech.). Son
también conocidos aparatos y dispositivos médicos para preparar
selladores de fibrina autóloga a partir de 120 ml de la sangre del
paciente en el quirófano en una hora y media (como p. ej. el Sistema
Vivostat).
En una realización de la invención en la que se
utiliza la adherencia directa, el tejido estromal tridimensional es
colocado directamente sobre el corazón o un vaso contiguo, y el
producto se adhiere por medio de la adherencia celular natural.
Este método ha sido demostrado en estudios de curación de heridas en
pacientes con úlceras de pie diabético.
En una realización preferida, un tejido estromal
tridimensional es unido al corazón o al vaso contiguo usando cola
quirúrgica, y preferiblemente una cola biológica tal como una cola
de fibrina. Es perfectamente conocido el uso de cola de fibrina
como adhesivo quirúrgico. Son conocidas las composiciones de la cola
de fibrina (véanse, p. ej. las Patentes U.S. Núms. 4.414.971,
4.627.879 y 5.290.552), y la fibrina obtenida puede ser autóloga
(véase, p. ej. la Patente U.S. Nº 5.643.192). Las composiciones de
la cola pueden también incluir componentes adicionales tales como
liposomas que contengan uno o varios agentes o fármacos (véanse, p.
ej. las Patentes U.S. Núms. 4.359.049 y 5.605.541), y las mismas
pueden ser aplicadas mediante inyección (véase, p. ej., la Patente
U.S. Nº 4.874.368) o pulverización (véanse, p. ej., las Patentes
U.S. Núms. 5.368.563 y 5.759.171). Están también disponibles
conjuntos de utensilios y materiales para aplicar las composiciones
de cola de fibrina (véase, p. ej., la Patente U.S. Nº
5.318.524).
En otra realización, un colorante láser es
aplicado a la pared cardíaca y/o vascular, al tejido estromal
tridimensional o a ambos, y es activado usando un láser de la
apropiada longitud de onda para lograr la adherencia a los tejidos.
En realizaciones preferidas, el colorante láser tiene una frecuencia
de activación que está situada dentro de una gama de valores que no
altera la función ni la integridad del tejido. Por ejemplo, la luz
de 800 nm atraviesa los tejidos y las células sanguíneas rojas.
Usando verde de indociano (ICG) como colorante láser, pueden usarse
longitudes de onda láser que atraviesan el tejido. Se aplica a
pincel una solución de 5 mg/ml de ICG a la superficie del tejido
estromal tridimensional (o del sitio objetivo), y el ICG se fija al
colágeno del tejido. Se usa para activar el colorante láser un
impulso de 5 mseg. de una luz de emisión láser con una intensidad
punta cercana a los 800 nm, lo cual redunda en la desnaturalización
del colágeno, que fusiona la elastina del tejido adyacente con la
superficie modificada.
En otra realización, el tejido estromal
tridimensional es unido al corazón o al vaso usando un hidrogel. Los
de una serie de materiales poliméricos naturales y sintéticos son
suficientes para formar adecuadas composiciones de hidrogel. Por
ejemplo, polisacáridos como p. ej. alginato pueden ser reticulados
con cationes divalentes, y los polifosfacenos y poliacrilatos son
reticulados iónicamente o mediante polimerización ultravioleta (Pat.
U.S. Nº 5.709.854). Como alternativa, puede usarse para unir el
tejido estromal tridimensional una cola quirúrgica sintética tal
como el cianoacrilato de 2-octilo ("DERMABOND",
Ethicon, Inc., de Somerville, NJ).
En una realización alternativa de la presente
invención, el tejido estromal tridimensional es fijado al corazón o
a un vaso sanguíneo usando una o varias suturas, incluyendo, aunque
sin carácter limitativo, suturas de prolina 5-O,
6-O y 7-O (Núms. de Cat. Ethicon
8713H, 8714H y 8701H) u otro adecuado material de sutura
biodegradable o no biodegradable tal como una poliglecaprona,
polidioxanona o poliglactina. Al suturar se usan típica aunque no
necesariamente agujas de dos brazos.
En otra realización, el tejido estromal
tridimensional es cultivado en un sistema biorreactor (como p. ej.
en las Patentes U.S. Núms. 5.763.267 y 5.843.766) en el cual el
armazón es ligeramente mayor que el producto final de tejido
artificial. El producto final contiene una cenefa, un orillo, una
aleta o una lengüeta del material que constituye el andamio, siendo
dicho apéndice usado en calidad del sitio para la aplicación de la
cola sintética/biológica, del colorante láser o del hidrogel. En
realizaciones alternativas, el tejido que constituye el andamio
puede ser usado como enganche para suturar o microsuturar.
El tejido estromal tridimensional puede ser
implantado para promover la vascularización, reparación y
regeneración de músculo cardíaco dañado. En una realización
preferida, los tejidos estromales tridimensionales serán aplicados
a un vaso para hacer que surjan nuevos vasos sanguíneos para
establecer un bypass en torno a las arterias obstruidas o
bloqueadas y restituir el flujo de sangre al corazón. En otra
realización, el tejido estromal tridimensional será aplicado
directamente al corazón usando un procedimiento mínimamente
invasivo. El tejido puede ser aplicado para promover la
vascularización y el flujo sanguíneo para minimizar la necrosis del
tejido cardíaco a continuación de un infarto de miocardio. Al unir
un tejido estromal tridimensional al epicardio o miocardio del
corazón, será necesario abrir el pericardio (es decir, el saco
cardíaco) antes de la aplicación. Sin embargo, la unión de un
parche de tejido estromal tridimensional al endocardio puede ser
llevada a cabo introduciendo un catéter o un dispositivo similar en
un ventrículo del corazón y adhiriendo o uniendo el parche estromal
a la pared del ventrículo. Se prefiere que el sitio de unión tenga
un razonablemente buen flujo sanguíneo para soportar la
angiogénesis.
La actividad angiogénica del tejido estromal
tridimensional puede también ser usada para tratar las anastomosis.
Una anastomosis está definida como una unión operatoria entre dos
estructuras huecas o tubulares o como una abertura creada por
cirugía, trauma o enfermedad entre dos o más espacios u órganos
separados (véase, p. ej., el Stedmans's Medical Dictionary, 26ª
Ed., Williams & Wilkins, Baltimore, MD). Por ejemplo, pueden
surgir sitios anastomóticos debido a la introducción de un injerto
vascular durante un procedimiento de injerto de bypass de arteria
coronaria (CABG), durante una resección intestinal o durante el
transplante de un órgano. En los procedimientos de CABG, se coloca
un tejido tridimensional en el sitio de unión corriente abajo del
injerto de bypass para promover la angiogénesis y el
restablecimiento del flujo sanguíneo a ese sitio, es decir, para
formar arterias adicionales que surjan de los sitios de conexión
además de promover la curación del sitio. Los ejemplos en el campo
vascular incluyen, aunque sin carácter limitativo, los precapilares
(entre arteriolas), los de Riolan (arteria marginal de colon que
conecta las arterias cólicas media e izquierda), los
portal-sistémicos (venas rectales
superior-media/inferior; vena
portal-vena cava inferior), los
término-terminales (de arteria a vena) y los
cavo-pulmonares (el tratamiento de la enfermedad
cardíaca cianótica estableciendo una anastomosis de la arteria
pulmonar derecha a la vena cava superior).
En una realización, el tejido estromal
tridimensional es aplicado como envoltura en torno al tejido
anastomótico para promover la curación del sitio (es decir, la
endotelialización). El otra realización, las células del tejido
estromal tridimensional son privadas de vida (p. ej. mediante
congelación y descongelación), y el producto resultante es aplicado
al sitio (es decir, "TRANSCYTE").
Este apartado demuestra que un tejido estromal
tridimensional basado en fibroblastos ("tejido estromal") fue
capaz de inducir endotelialización y vascularización. Se ha
observado que la aplicación de un material biológicamente activo de
este tipo induce la formación de nuevos capilares y reduce la
inflamación en el lecho de la herida de los pacientes con úlceras
de pie diabético.
Las propiedades angiogénicas de los tejidos
estromales tridimensionales se describen a continuación usando una
amplia gama de técnicas entre las que se incluyen el ensayo en la
membrana corioalantoidea de embrión de pollo, el ensayo en los
anillos aórticos de rata, la estimulación de la proliferación de las
células endoteliales, la quimiocinesis, la quimiotaxis, la
inhibición de la apoptosis y la inducción in vivo de
angiogénesis en tejido cardíaco isquémico. Colectivamente, estos
ensayos cubren una amplia gama de eventos individuales de
angiogénesis, así como la totalidad del proceso.
Ha quedado asimismo de manifiesto que la
fibronectina que está presente en la matriz extracelular estimula
la proliferación de células endoteliales, mientras que se ha
demostrado que el colágeno desnaturalizado constituye un sustrato
favorable para la fijación de las células endoteliales humanas. Los
factores de crecimiento fijados en la matriz incluyen el TGF\beta
y el HGF, los cuales son importantes para estimular la formación de
nuevos capilares y la endotelialización. La matriz también contiene
laminina-1, la cual puede servir para inhibir la
hiperplasia inicial a través del péptido YIGSR. La combinación de
estas proteínas de matriz junto con los factores de crecimiento que
son secretados de manera natural ofrece una solución fisiológica a
la inducción in vivo de la angiogénesis.
Fueron llevados a cabo experimentos para
examinar la expresión de factores angiogénicos por parte de los
tejidos estromales. La expresión de los factores de crecimiento fue
examinada tanto mediante la estimación del mRNA (mRNA = ácido
ribonucleico mensajero) por métodos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) como mediante la estimación de la proteína libre
mediante inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA).
Los RNAs mensajeros específicos fueron estimados
mediante RT-PCR (RT-PCR =
transcripción inversa-reacción en cadena de la
polimerasa) cuantitativa usando el método ABI TaqMan
(Perkin-Elmer, Foster City, CA). El RNA fue
extraído de las células usando un Conjunto de Utensilios y
Materiales de Purificación Rápida del RNA (Amresco, Solon, OH). El
RNA fue sometido a transcripción inversa usando Superscript II (Life
Technologies, Grand Island, NY) con cebadores hexámeros aleatorios
(Sigma, St. Louis, MO). La amplificación de las muestras de cDNA
(cDNA = ácido desoxirribonucleico complementario) que contenían 200
ng de RNA total fue detectada en tiempo real y comparada con la
amplificación de patrones derivados de plásmido para específicas
secuencias de mRNA usando un número de copias situado dentro de una
gama de 5 órdenes de magnitud con
40-4.000.000/reacción. En purificación y en el
rendimiento de la transcripción inversa, secuencias de mRNA para
cadena de PDGF B, VEGF o TGF\beta1 fueron añadidas a aislamientos
de RNA, y su rendimiento fue medido por el procedimiento TaqMan. Las
secuencias de mRNA de control fueron obtenidas mediante
transcripción por la T7 RNA polimerasa de plásmidos que contenían
la secuencia correspondiente. Los valores fueron normalizados usando
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa como control.
Fueron obtenidos de la McIntyre Farms (Lake, CA)
embriones de pollo de diez días de edad, y los mismos fueron
incubados a 37ºC. Los huevos fueron mirados al trasluz para
localizar y marcar una zona objetivo exenta de grandes vasos. Se
hicieron con una aguja dos pequeños orificios directamente encima
del saco de aire y encima de la zona objetivo. Fue aplicada
aspiración al primer orificio, haciendo que la membrana
corioalantoidea se desprendiese de la zona marcada. Usando una
"DREMEL MOTO-TOOL", la cáscara del huevo fue
retirada de la zona objetivo para crear una "ventana". Una
muestra circular de 4 mm de diámetro (tejido estromal tridimensional
o control) fue entonces colocada sobre la membrana cerca de un gran
vaso sanguíneo, pero no sobre el mismo. El orificio fue cubierto
con un pedazo de cinta adhesiva transparente, y los huevos fueron
incubados por espacio de 72 horas a 37ºC para permitir que tuviese
lugar el crecimiento de vasos sanguíneos. La parte tratada de la
membrana fue entonces retirada, fotografiada y fijada en metanol.
Fue contado el número de puntos de bifurcación de vasos sanguíneos
en la región de la muestra. Muestras de biopsia fueron fijadas en
metanol y las secciones fueron coloreadas con Tricromo de
Masson.
En el ensayo de los anillos aórticos, la
capacidad del revestimiento endotelial de los vasos sanguíneos para
generar microvasos fue usada para demostrar la angiogénesis. Las
aortas torácicas retiradas de ratas macho de Sprague Dawley de 1 a
2 meses de edad fueron transferidas a MCDB131 exento de suero. El
tejido fibroadiposo periaórtico fue cuidadosamente retirado, y las
aortas fueron lavadas de 8 a 10 veces y cortadas en longitudes de 1
mm. Fueron practicadas cavidades en un gel de agarosa al 1,5%, y las
mismas fueron llenadas con solución de fibrinógeno coagulante (20
\mul de 50 unidades NIH/ml de trombina bovina en 1 ml de
fibrinógeno). Los anillos aórticos fueron colocados en los centros
de las cavidades. Tras la coagulación, las placas de cultivo fueron
inundadas con MCDB131 exento de suero. Los cultivos fueron incubados
a 37ºC con CO_{2} al 5%, con cambios del medio cada 3 días. Los
microvasos de nueva formación fueron contados los días 3, 7 y
14.
La proliferación de las células endoteliales es
un decisivo componente de la angiogénesis. La capacidad del tejido
estromal para estimular esta actividad fue determinada mediante
incorporación de [^{3}H]-timidina. Varios
factores de crecimiento y muestras de medio acondicionado
concentrado fueron valorados con respecto a su influencia en la
proliferación de las HUVEC (HUVEC = células endoteliales de vena
umbilical humana). Cultivos confluentes fueron desprendidos y
puestos nuevamente en suspensión en medio de cultivo de HUVEC hasta
una concentración final de 2,5 x 10^{4} células/ml. Placas de
cultivo de 24 cavidades fueron pretratadas con Solución de Factor
de Fijación (Cell Applications, Inc.), y fueron añadidas células a
razón de 1 ml de suspensión celular por cavidad. Se dejó que las
células se asentasen y se fijasen, y las mismas fueron entonces
pasadas a Medio Endotelial Sin Suero (Cell Applications, Inc.)
suplementado con medio de cultivo de fibroblastos o medio
acondicionado mediante cultivos monocapa o tridimensionales de
fibroblastos. En el día dos, las células recibieron medio recién
hecho exento de suero suplementado de la manera apropiada con 1
\muCurie/ml de [^{3}H]-timidina. En el día tres
fue retirado el medio, las células fueron lavadas tres veces con PBS
(PBS = salina tamponada con fosfato), y fueron añadidos 250 \mul
de dodecilsulfato sódico (SDS) al 2,3% para solubilizar las células.
Tras haber transcurrido 30 minutos, el extracto de SDS y un ml de
un líquido de lavado de PBS fueron transferidos a un vial de
centelleo. Fueron añadidos a los viales cinco ml de
"SCINTIVERSE" (Fair Lawn, NJ), y se determinó la radiactividad
usando un Contador de Centelleo Beckman LS6500 (Fullerton, CA).
La capacidad de nuestro tejido estromal
tridimensional para estimular la migración de las células
endoteliales fue puesta a prueba de dos maneras. La primera fue un
ensayo de quimiocinesis que determinó la estimulación del
movimiento celular sin definición direccional alguna. La segunda
midió la migración celular hacia una fuente de estimulación.
Fueron cultivadas células endoteliales sobre
perlas Cytodex-2. El ensayo estimó la disociación de
las células de las perlas y la reasociación con una placa de
cultivo. Las células sobre la placa fueron coloreadas y
contadas.
La migración celular fue analizada con un ensayo
de la quimiotaxis de las células endoteliales utilizando una cámara
de quimiotaxis Boyden de 48 cavidades de Neuro Probe (Neuro Probe,
Inc.). Filtros de membrana de policarbonato (Poretics Corporation,
25 x 80 mm) fueron impregnados en ácido acético 0,5M durante la
noche, lavados tres veces por espacio de 1 hora con agua, incubados
en una solución de gelatina de piel de ternero tipo III al 0,01%
(Sigma, St. Louis, MO) por espacio de 12-16 horas, y
secados al aire. Células endoteliales de vena umbilical humana
fueron separadas y puestas nuevamente en suspensión en medio de
cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana a una
concentración final de 1,0 x 10^{5} células/ml. La Cámara Boyden
fue montada de la manera siguiente: Fueron puestos en las cavidades
inferiores 30 \mul de muestra o patrón, la membrana recubierta
con gelatina fue colocada encima, y fueron puestos en las cavidades
superiores 50 \mul de suspensión celular. La cámara fue incubada
a 37ºC por espacio de 3 horas. Las membranas fueron entonces
retiradas con cuidado de la cámara, y el lado de las células fue
enjuagado en PBS, y se pasó a su través una cuchilla rascadora para
retirar las células que no habían migrado. Las membranas fueron
coloreadas con colorante Giemsa de Wright, y se contó el número de
células, o la densidad de coloración fue registrada frente una curva
estándar generada con 20, 10, 5,0 y 0 ng/ml de VEGF purificado.
Se ha demostrado que la integrina
\alphav\beta3 desempeña un importante papel en la angiogénesis,
y los anticuerpos neutralizantes dirigidos a ella son capaces de
bloquear la formación de vasos sanguíneos capilares. La misma es
inducida por el VEGF, y se piensa que desempeña un papal decisivo en
la migración de las células endoteliales.
La presencia de integrinas y receptores de
superficie celular fue determinada por citometría de flujo en un
citómetro FACStar por la Cytometry Research Services, de San Diego,
CA. Las células fueron preparadas para el análisis de la manera
siguiente: Células endoteliales de vena umbilical humana fueron
tripsinizadas, y las células fueron puestas nuevamente en
suspensión a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml. De 250
\mul a 500 \mul de las suspensiones celulares fueron lavados
tres veces con Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS, GibcoBRL,
Grand Island, Nueva York), y fueron finalmente puestos de nuevo en
suspensión en FBS (FBS = suero bovino fetal) al 10% en solución
salina equilibrada de Hank (HBSS). Las células fueron incubadas por
espacio de 30 minutos con anticuerpos primarios diluidos hasta una
concentración de 1 \mug/ml en FBS al 10% en HBSS, lavadas tres
veces con HBSS, incubadas por espacio de 30 minutos con anticuerpos
secundarios diluidos hasta una concentración de 1 \mug/ml en FBS
al 10% en HBSS, lavadas tres veces con HBSS, y fijadas en 200
\mul de formalina al 10% (Baxter, Deerfield, IL) con una densidad
de 10^{6} células/ml.
Ha sido descrito anteriormente que las células
endoteliales cultivadas en forma de una monocapa en "MATRIGEL",
que es un sustrato de cultivo de membrana basal (Collaborative
Research), coalescían en forma de tubos y experimentaban apoptosis.
La inclusión de un factor angiogénico, como p. ej. el VEGF, en el
sustrato "MATRIGEL", sin embargo, mantenía la proliferación y
la morfología de las células endoteliales, sugiriendo que la
actividad angiogénica del VEGF inhibía la apoptosis (véanse, p.
ej., Goto et al., 1993, Lab Invest.
69:508-517; y Haralbopoulos et al., 1994,
Lab Invest. 71:575-582).
Para poner adicionalmente de manifiesto la
actividad angiogénica de los tejidos estromales tridimensionales de
la presente invención, fue añadido a células endoteliales cultivadas
en "MATRIGEL" medio de cultivo acondicionado por un tejido
estromal tridimensional para demostrar la inhibición de la
apoptosis. El "MATRIGEL" fue descongelado y solidificado en
placas de cultivo tisular de 6 cavidades "TRANSWELL" (Costar,
Boston, MA) según las instrucciones del fabricante. Células
endoteliales microvasculares dérmicas (DMEC) fueron sembradas en el
"MATRIGEL" solidificado a razón de 2,5 x 10^{5}
células/cavidad, en presencia de medio de cultivo acondicionado por
un cultivo monocapa de fibroblastos o un cultivo tridimensional de
fibroblastos, y fueron incubadas a 37ºC en una atmósfera de
CO_{2} al 5% como se ha descrito anteriormente (véase, p. ej.,
Kuzuya et al., 1994, J. Cell Physiol.
161:267-276). Las células DMEC de cada cultivo
fueron coloreadas incubando el cultivo en una solución de 10
\mug/ml de
di-1-acetilo-lipoproteína
de baja densidad por espacio de 2-4 horas (véase, p.
ej., Voyta et al., 1984, J. Cell Biol.
99:2034-2040) y una solución de "SYTOX", que
coloreó los núcleos celulares (Molecular Probes, Eugene, OR).
El tejido estromal tridimensional cultivado
aporta muchos de los componentes de la piel sana que son esenciales
para la curación de las heridas, incluyendo importantes mediadores
de la angiogénesis tales como el VEFG y el factor de crecimiento
transformante \beta (TGF\beta). Se usó la adquisición de
imágenes con Laser Doppler para estudiar la perfusión microvascular
en la base de úlceras de pie tratadas con tejido estromal
tridimensional, para investigar si la curación de estas lesiones
iba asociada a un incremento del flujo sanguíneo, que a su vez
podría reflejar una angiogénesis.
Fueron valoradas en cinco pacientes con diabetes
mellitus del tipo 2 siete úlceras de pleno espesor. Todas las
lesiones habían estado presentes por espacio de al menos tres meses
sin signos clínicos de infección y sin variación del tamaño durante
las dos semanas anteriores, a pesar del tratamiento convencional. Se
aplicó semanalmente tejido estromal tridimensional a la base de
cada herida por espacio de un total de ocho semanas, después de lo
cual se reanudó el tratamiento convencional. La perfusión
microvascular fue valorada usando la adquisición de imágenes con
Laser Doppler (Moore Instruments, Axminster, RU) inmediatamente
antes del tratamiento y después de 2, 5 y 8 semanas de
tratamiento.
La vascularización estimulada por tejido
estromal tridimensional fue examinada in vivo usando un
modelo de implante epicardial en ratones con Inmunodeficiencia
Combinada Grave (SCID). Los ratones fueron divididos en tres
grupos: implante de tejido estromal tridimensional
criopreservado/viable ("parche estromal viable"), implante de
tejido estromal tridimensional no viable ("parche estromal no
viable"), y control/tratamiento simulado. Cada grupo tenía al
menos seis animales por grupo en dos distintos puntos en el tiempo
(a los 14 días y los 30 días). El estudio con animales fue llevado
a cabo según los aplicables reglamentos de la Administración de
Comestibles y Fármacos de los Estados Unidos.
Los ratones con SCID (Universidad de Arizona,
Tucson, AZ) fueron alojados a razón de 2 por jaula en jaulas
microaisladoras sobre virutas de madera y recibieron "DIETA DE
RATA/RATÓN TECH-LAD AL 4%" y agua corriente
ad libitum. Los ratones fueron albergados a temperaturas
controladas de 74ºF \pm 10ºF y con una humedad de un 50% \pm
20% según la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de
Laboratorio" de los NIH (NIH = Institutos Nacionales de
Salud).
Fue inducida y mantenida anestesia general
mediante una inyección intraperitoneal de Avertina al 2,5%. Fue
mantenida la esterilidad y fue usada una almohadilla calefactora a
lo largo de todo el procedimiento. Los ratones fueron pesados, y la
pared torácica fue afeitada y preparada. En posición supina se llevó
a cabo una traqueotomía, y los ratones fueron ventilados usando un
respirador para pequeños animales (volumen de ventilación pulmonar
= 0,5 ml, ritmo = 120-130 ciclos
respiratorios/min.). La correcta intubación fue confirmada mediante
la observación de la dilatación y contracción torácica durante los
ciclos respiratorios con ventilación.
Todos los procedimientos quirúrgicos fueron
realizados usando un microscopio operatorio. Fue efectuada una
toracotomía izquierda y los grupos de músculo pectoralis fueron
cortados transversalmente, dejando al descubierto la jaula
torácica. Se entró en el cuarto espacio intercostal usando tijeras y
disección roma. Se pusieron en torno a las costillas superior e
inferior dos suturas de seda 6-0 (Ethicon) para
retracción. El timo fue retraído hacia arriba, y el pulmón
izquierdo fue colapsado usando una bolita de algodón estéril.
Entonces se aplicó presión al tórax derecho para desplazar el
corazón en dirección hacia la izquierda.
Para inducir daño isquémico
miocárdico/epicárdico, fue efectuada una oclusión coronaria de la
arteria coronaria izquierda justo debajo del atrio izquierdo
mediante oclusión térmica usando métodos estándar que son conocidos
para los expertos en la materia. La oclusión redunda en una zona de
tejido isquémico no viable situado primariamente en el ventrículo
izquierdo cerca del apex. Un parche estromal viable o un parche
estromal no viable de 4 mm fue suturado a la superficie del tejido
miocárdico/epicárdico isquémico de los ratones supervivientes usando
una sutura individual. Para los ratones de control, tan sólo fue
introducida una sutura en el sitio del daño isquémico. A
continuación de la implantación, los pulmones fueron dilatados de
nuevo usando presión positiva en la espiración final. La cavidad
torácica fue cerrada en capas usando seda 6-0
(Ethicon, Inc.), y los animales fueron apartados gradualmente del
respirador. Una vez que se hubo reanudado la respiración espontánea,
fue retirado el tubo traqueal, y fue cerrado el cuello. Los
animales permanecieron en supervisión hasta estar totalmente
conscientes, y el estado general de salud postoperatorio de cada
animal fue determinado diariamente.
Antes del explante fue llevado a cabo un
ecocardiograma para medir el espesor de la pared ventricular y
compararlo con el de antes de la oclusión. A los 14 días o a los 30
días, los ratones fueron anestesiados de nuevo y fueron recogidos
los parches de tejido estromal tridimensional con el tejido
circundante y los tejidos cardíacos de los controles. Los ratones
fueron sometidos a eutanasia tras la recolección del material usando
una sobredosis (150 mg/kg) de pentobarbital IP.
La formación in vivo de nuevos vasos
sanguíneos en los animales tratados con parche estromal y en los
controles fue examinada usando tres análisis independientes:
morfología general, histología e histoquímica.
La morfología general de un corazón
representativo de cada grupo fue examinada para valorar la
viabilidad del tejido en la región isquémica. La morfología general
del corazón fue examinada inyectando en un corazón explantado de
cada grupo el colorante rojo de tetrazolio (cloruro de
2,3,5-trifeniltetrazolio) (Sigma/Aldrich Chemical
Co., St. Louis, MO). El rojo de tetrazolio reacciona con el tejido
cardíaco viable produciendo un color rojo subido. En contraste con
ello, el tejido no viable no reacciona con el rojo de tetrazolio,
con lo cual el tejido no viable queda con un color blanco pálido.
Los corazones explantados de los ratones de control y de los
ratones tratados con el parche estromal del día 14 y del día 30
presentaban una región de tejido cardíaco isquémico no viable
situado primariamente en el ventrículo izquierdo y debido a la
oclusión coronaria/infarto de miocardio inducido. Las imágenes
tomadas a baja y alta potencia revelaron una gran zona de tejido
cardíaco no viable, como queda puesto de manifiesto por el color
blanco pálido. En los controles, la zona isquémica está exenta de
vasos sanguíneos visibles.
La formación de nuevos vasos sanguíneos
dependiente del tejido estromal tridimensional fue confirmada
mediante el análisis histológico de secciones de tejidos
cardíacos tratados y de control. Para el análisis histológico, los
implantes de parche estromal y los tejidos adyacentes fueron
extirpados y puestos en fijador "HISTOCHOICE" (Amresco Inc.,
Solon, OH) y procesados para la microscopía de luz. Los parches de
tejido estromal y los tejidos circundantes fueron seccionados,
colocados sobre portaobjetos y coloreados usando hematoxilina y
eosina (H y E). La coloración histológica usando H y E es
perfectamente conocida para los expertos en la materia (p. ej.
en Histology: A Text and Atlas, 3ª ed. (Ross et al.,
ed), pp. 1-7; Williams and Wilkins, Baltimore, MD),
y los conjuntos de utensilios y materiales y los reactivos pueden
obtenerse fácilmente de los proveedores comerciales (como p. ej. la
Sigma/Aldrich Chemical Co., de St. Louis, MO.).
Adicionalmente, la formación de nuevos vasos
sanguíneos dependiente del tejido estromal tridimensional fue
verificada usando histoquímica para identificar
específicamente la presencia y localización de las células
endoteliales vasculares presentes en las secciones histológicas. Los
implantes de parche estromal y los tejidos circundantes fueron
seccionados, colocados sobre portaobjetos y coloreados
histoquímicamente usando GS-1. La
GS-1 es una lectina que está comercialmente
disponible y se fija primariamente a la superficie de las células
endoteliales (Sigma/Aldrich Chemical Co.).
La formación in vivo de nuevos vasos
sanguíneos y la valoración de la función ventricular en cerdos
tratados con parches estromales y en controles fueron examinadas
mediante análisis de morfología general, histología y
ecocardiogramas.
Fueron creadas oclusiones coronarias en cerdos
de granja adultos ligando el cuarto al quinto punto de bifurcación
de la arteria coronaria ascendente izquierda (véanse, p. ej.,
Staubli et al., J. Cardiovasc. Pharmacol
6:829-832 (1984); Galinanes et al., Eur.
Surg. Res. 19:246-253 (1987)). Inmediatamente
después de la oclusión, los cerdos tratados recibieron un única
pieza de 2 cm x 2 cm de implante de tejido estromal tridimensional
suturada directamente a la región isquémica del epicardio. El
tejido estromal tridimensional se adhirió fácilmente al epicardio
del corazón porcino. Los cerdos de control no tratados (tratamiento
simulado) recibieron una oclusión coronaria, pero no recibieron un
implante de tejido estromal tridimensional.
La inducción de infarto de miocardio fue
confirmada mediante electrocardiografía. Se tomaron registros de
electrocardiograma (ECG) de los animales tratados y de los animales
de control no tratados antes y después de la oclusión de la arteria
coronaria ascendente inferior, así como a los 30 días de la
oclusión. Son perfectamente conocidos para los expertos en la
materia los aparatos y métodos para la generación de registros de
electrocardiograma.
La función ventricular fue valorada mediante
ecocardiografía. Los ecocardiogramas fueron tomados antes de la
oclusión y a los 30 días después de la inducción del infarto de
miocardio usando métodos estándar (véase, p. ej., Braunwald's Heart
Disease: a textbook of cardiovascular medicine, 5ª ed. Vol. 1,
Capítulo 3, pp. 53-107). Las imágenes fueron
obtenidas usando un Sistema de Sonografía Computerizada Acuson 128XP
que tenía una sonda de 7 mHz.
Tras haber transcurrido 30 días, los cerdos
fueron sacrificados y valorados en cuanto al desarrollo de nuevos
vasos mediante visualización clínica y coloración histológica.
El tejido estromal tridimensional artificial
secretó una variedad de factores de crecimiento de algunos de los
cuales se sabe que desempeñan un papel importante en la regeneración
tisular y la angiogénesis. Se indican en la Tabla II los factores
de crecimiento angiogénico que fueron expresados por el tejido
estromal tridimensional basado en fibroblastos. Las concentraciones
celulares de mRNA fueron determinadas a las 24 h de haberse
recuperado las células de la descongelación.
\newpage
Factores de crecimiento
angiogénico expresados por el tejido estromal
tridimensional
\vskip1.000000\baselineskip
El FBET tridimensional indujo el desarrollo de
vasos en la CAM en mayor grado en comparación con el control
(Figura 1A-1D), incluyendo tanto el desarrollo de
finos capilares como la evidencia de una permeabilidad incrementada.
El desarrollo de vasos sanguíneos capilares en la CAM tratada con
FBET era también claramente visible mediante histología. Este tipo
de desarrollo de capilares es característico de la angiogénesis
inducida por VEGF. El mismo era distinto de lo que se veía con la
estimulación por FGF básico, donde los vasos presentaban un mayor
diámetro con poco o ningún incremento de la permeabilidad. Al ser
contado el número de vasos por muestra en la CAM, había una
diferencia estadísticamente significante entre los efectos del
andamio en solitario y del FBET tridimensional (Figura 2). La
actividad angiogénica del tejido tridimensional se vio reducida en
< 90% por la preincubación con anticuerpo neutralizante
anti-VEGF antes de la colocación sobre la CAM,
indicando que la producción de VEGF por parte del FBET era
importante en sus actividades angiogénicas. Cuando los anillos
aórticos de las aortas torácicas de rata fueron cocultivados con
FBET, hubo un significante incremento del número de microvasos
formados (Figura 3). Se cree que el FBET produce una combinación de
factores angiogénicos en proporciones de secreción natural que
pueden tener un efecto sinérgico.
El medio acondicionado con tejido estromal
tridimensional estimuló la proliferación de células endoteliales
humanas, según medición efectuada mediante la incorporación de
[^{3}H]-timidina como se describe en el anterior
aparato 6.1.4 (Figura 4). Las actividades estimulatorias del medio
eran dependientes de la dosis.
Como se muestra en la Figura 5, el cocultivo de
células endoteliales con tejido estromal tridimensional indujo un
marcado incremento de la transferencia de células de las perlas a la
placa de cultivo (p = 0,0003), lo cual fue usado como una
indicación de quimiocinesis. Esta actividad estimuladora del tejido
estromal tridimensional fue inhibida en aproximadamente un 60% por
el anticuerpo neutralizante anti-factor de
crecimiento de los hepatocitos (HGF), indicando que el HGF estaba
también implicado.
Medio acondicionado con tejido estromal
tridimensional también estimuló la migración celular de manera
dependiente de la dosis (Figura 6). De hecho, el tejido estromal
estimuló una mayor quimiotaxis en comparación con el VEGF, incluso
al nivel de 50 ng/l. El anticuerpo anti-VEGF inhibió
en un 50% la migración celular estimulada por el medio
acondicionado con tejido estromal.
La presencia de integrina \alphav\beta3 en
la superficie de las células endoteliales fue analizada por
citometría de flujo tras tratamiento con medio acondicionado por
tejido estromal tridimensional. Las HUVECs cultivadas presentaron
una considerable expresión superficial de integrina
\alphav\beta3 en condiciones de cultivo normal. Sin embargo, el
medio acondicionado por tejido estromal estimuló un significante
incremento de la expresión de esta integrina (Figura 7).
Las células microvasculares dérmicas humanas, al
estar puestas en determinadas condiciones específicas tal como en
una capa de gel de colágeno o sobre "MATRIGEL", forman túbulos.
Los túbulos son sin embargo inestables y degeneran por apoptosis de
las células en unos 3 días. Sin embargo, si se las ponía en
cocultivo con tejido estromal tridimensional, las células
endoteliales microvasculares sobre "MATRIGEL" continuaban
proliferando, y fue inhibida la apoptosis (Figura 8A y 8B).
El medio acondicionado obtenido de fibroblastos
dérmicos de cultivo monocapa no presentó inhibición de la
apoptosis, de tal manera que las células formaban túbulos y
experimentaban apoptosis (Figura 8A). En contraste con ello, el
medio acondicionado obtenido de cultivos de fibroblastos
tridimensionales mantenía una proliferación y una morfología
celular que eran similares a las observadas para factores
angiogénicos tales como el bFGF y el VEGF (Figura 8B). Los
resultados demuestran dos características: 1) el medio acondicionado
de cultivos tridimensionales era capaz de inhibir la apoptosis
celular en el ensayo con "MATRIGEL" de manera similar a la
adición de factores angiogénicos; el tejido estromal tridimensional
producía y secretaba VEGF y HGF; y por consiguiente se presume que
la inhibición de la apoptosis es el resultado de los factores
angiogénicos que son secretados al medio; y 2) los mismos
fibroblastos cultivados en monocapa no producían un efecto de este
tipo, demostrando que las condiciones de cultivo tridimensional eran
responsables de la actividad (es decir que la expresión/secreción
de factores angiogénicos era inexistente o estaba disminuida en gran
medida con una monocapa de fibroblastos).
El flujo sanguíneo en la base de las úlceras de
pie diabético tratadas con tejido estromal tridimensional se
incrementó significantemente a lo largo de las ocho semanas de
tratamiento, pasando de 325 + 184 (media + SD) (SD = desviación
estándar) a un máximo de 560 + 344 unidades de perfusión arbitrarias
(p < 0,001, ANOVA con medidas repetidas) (ANOVA = análisis de
varianza). Cinco de las lesiones se habían curado a las doce
semanas, y las otras dos habían visto marcadamente reducido su
tamaño. Estas variaciones del flujo sanguíneo indican angiogénesis
en el tejido de granulación de nueva formación, acrecentada por un
sostenido y apropiado suministro de factores de crecimiento
angiogénico aportados por el tejido estromal tridimensional.
Análogamente, los fotomicrógrafos tomados antes
y después del tratamiento con tejido estromal mostraron una rápida
vascularización del lecho de la herida, remodelación del tejido
herido y reducción de la inflamación a continuación del tratamiento
(Figuras 9A-9D).
La formación in vivo de nuevos vasos
sanguíneos en ratones tratados con parche estromal y en controles
fue examinada usando tres tipos de análisis (morfología general,
histología e histoquímica) como se describe en el anterior apartado
6.1.10.
Con respecto a los animales que recibieron
implantes, los datos obtenidos de los corazones con implante de
parche estromal el día 14 y el día 30 demostraron que los implantes
de parche estromal viables y no viables estaban perfectamente
incorporados en el tejido cardíaco nativo en el sitio de
implantación. Además, la aplicación de un parche estromal viable en
el sitio isquémico redundó en la formación visualmente observable de
una serie de nuevos vasos sanguíneos en la zona isquémica que no
era observada en los animales de control no tratados. Por ejemplo,
las imágenes tomadas con ampliación demuestran claramente la
presencia de numerosos vasos sanguíneos en la zona de implantación
usando un implante de parche estromal viable. También fue observada
formación de nuevos vasos sanguíneos en la zona de implantación en
los corazones con parche estromal no viable. El número de nuevos
vasos sanguíneos formados, sin embargo, parecía ser
considerablemente mayor en los ratones tratados con parche estromal
viable en comparación con los animales tratados con parche estromal
no viable.
Las observaciones morfológicas generales
demuestran que un tejido estromal tridimensional de la presente
invención es capaz de promover la angiogénesis en el tejido
cardíaco.
Los micrógrafos de luz de secciones obtenidas de
corazones de ratón con SCID (SCID = inmunodeficiencia combinada
grave) no tratado normal ilustran la organización del miocardio y de
la parte más externa de la superficie del corazón, o sea del
epicardio. La capa miocárdica contiene arteriolas, capilares y
vénulas. En comparación con los ratones SCID normales, la inducción
de infarto de miocardio mediante oclusión coronaria redundó en una
espectacular disminución del número de vénulas detectables presentes
en la capa epicardial.
En contraste con ello, los micrógrafos de luz de
las secciones obtenidas de corazones tratados con parche estromal
mostraban numerosos nuevos vasos formados en la capa epicardial y la
presencia de arteriolas situadas en el miocardio cerca de la zona
interfacial epicardial/miocárdica. Análogamente, en los animales
tratados con parche estromal no viable se observaba la presencia de
formación de nuevos vasos en la capa epicardial pero en mucho menor
grado en comparación con los corazones tratados con parche estromal
viable. Los resultados histológicos confirman las observaciones
morfológicas generales de que los tejidos estromales
tridimensionales de la presente invención promueven la formación de
nuevos vasos sanguíneos.
Los micrógrafos de luz de las secciones de los
corazones tratados con parche estromal pusieron de manifiesto la
presencia de células endoteliales vasculares revistiendo los vasos
en el epicardio así como de vénulas y arteriolas en el miocardio.
En los corazones tratados con parche estromal no viable fue
detectado un número reducido de microvascularización. En contraste
con ello, se observó poca coloración de los vasos tapizados con
células endoteliales en el epicardio de los corazones de control.
Estos resultados demuestran que los tejidos estromales
tridimensionales de la presente invención estimulan la angiogénesis
in vivo.
La presente invención no debe quedar limitada en
cuanto a su alcance por las realizaciones que se han indicado a
título de ejemplo, las cuales pretenden ser meras ilustraciones de
aspectos individuales de la invención. Ciertamente, a la luz de la
anterior descripción y de los dibujos acompañantes resultarán obvias
para los expertos en la materia varias modificaciones de la
invención además de las aquí ilustradas y descritas. Se pretende
que tales modificaciones queden comprendidas dentro del alcance de
las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones que aquí se citan quedan
incorporadas en su totalidad a la presente por referencia.
La formación in vivo de nuevos vasos
sanguíneos y la valoración de la función ventricular en cerdos
tratados con parche estromal y en controles fueron examinadas
mediante análisis de morfología general, histología y
ecocardiograma, como se ha descrito anteriormente en el apartado
6.1.11.
La oclusión de la arteria coronaria ascendente
izquierda redundó en una región de tejido cardíaco isquémico como
queda demostrado por la electrocardiografía. En un
electrocardiograma, un latido cardíaco promediado es analizado para
formar uno o varios parámetros. La magnitud del vector ST
(ST-VM) mide el desplazamiento del segmento ST y es
comúnmente aceptada como medida de la isquemia en el miocardio. Se
calcula también la variación de la magnitud ST en comparación con
el latido de referencia inicial (al iniciarse la monitorización)
(STC-VM). La diferencia del vector QRS
(QRS-VD) mide las variaciones del complejo QRS en
comparación con el ECG inicial y refleja la variación en la
morfología del complejo QRS en comparación con cuando se inició la
monitorización. El parámetro QRS-VD ha sido ligado
al curso del infarto de miocardio en varios estudios.
Las lecturas de electrocardiograma tomadas
inmediatamente después de la ligación arterial demostraron unos
elevados segmentos S-T, indicando la creación de un
infarto de miocardio. Las lecturas de ECG tomadas después de 30
días en controles no tratados presentaban un segmento
S-T similar, mientras que el segmento
S-T estaba tan sólo ligeramente elevado en los
animales tratados.
Los ecocardiogramas obtenidos de cerdos de
control no tratados presentaban una atenuada función ventricular
tras 30 días (Figs. 10a y 10b). En contraste con ello, los
ecocardiogramas obtenidos de cerdos tratados con un tejido estromal
tridimensional presentaban a los 30 días una función ventricular que
se parecía más a la de los ecocardiogramas obtenidos antes de la
oclusión coronaria (compárense la Fig. 10d y las Figs. 10a y 10c).
Estos resultados demuestran que los corazones porcinos tratados con
un tejido estromal tridimensional conservaban una mejor función
ventricular después de 30 días en comparación con los corazones no
tratados.
El análisis morfológico general de los corazones
resecados reveló que los corazones tratados presentaban menos
adherencias en el sitio de implantación en comparación con los
controles de tratamiento simulado no tratados. Además, el análisis
histológico de gruesas secciones de corazones resecados puso de
manifiesto un mayor número de nuevos vasos sanguíneos en los
animales tratados en comparación con los grupos de tratamiento
simulado de control, demostrando que la implantación del tejido
estromal tridimensional en el epicardio estimulaba la angiogénesis
en el tejido cardíaco isquémico.
Claims (30)
1. Uso de un tejido estromal tridimensional para
la preparación de un medicamento para promover la angiogénesis en
el tejido cardíaco isquémico, en el que dicho tejido cardíaco
isquémico es puesto en contacto con un tejido estromal
tridimensional que comprende células estromales y proteínas de
tejido conectivo que son secretadas de manera natural por las
células estromales, estando dichas células unidas y envolviendo en
sustancia a un armazón que se compone de un material biocompatible
no viviente que forma una estructura tridimensional que tiene los
espacios intersticiales llenados por las células estromales.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células estromales son fibroblastos.
3. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células estromales son células de músculo liso.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que las
células de músculo liso son células de músculo liso vascular.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que las
células de músculo liso vascular son células de músculo liso
aórtico.
6. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células estromales son células de músculo cardíaco.
7. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células estromales son una combinación de fibroblastos y células de
músculo liso, células de músculo cardíaco, células endoteliales,
pericitos, macrófagos, monocitos, leucocitos, células plasmáticas,
células mast o adipositos.
8. Uso según la reivindicación 1, en el que el
armazón se compone de un material biodegradable.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el
material biodegradable es algodón, ácido poliglicólico, suturas de
catgut, celulosa, gelatina, gel de colágeno o dextrano.
10. Uso según la reivindicación 1, en el que el
armazón se compone de un material no biodegradable.
11. Uso según la reivindicación 10, en el que el
material no biodegradable es una poliamida, un poliéster, un
poliestireno, un polipropileno, un poliacrilato, un polivinilo, un
policarbonato, un politetrafluoroetileno, un compuesto
nitrocelulósico o algodón.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, en el que el armazón es una malla.
13. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido estromal es obtenido directamente de un cultivo recién
hecho.
14. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido estromal ha sido criopreservado.
15. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido estromal es adherido al corazón mediante fijación celular
natural.
16. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido estromal es unido al tejido cardíaco isquémico por medio de
una sutura biodegradable o no biodegradable, una cola biológica, una
cola sintética, un colorante láser o un hidrogel.
17. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido isquémico es del epicardio cardíaco.
18. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tejido isquémico es del miocardio cardíaco.
19. Uso según la reivindicación 1, en el cual el
tejido isquémico es del endocardio cardíaco.
20. Uso según la reivindicación 1, en el que las
células estromales son células troncales mesenquimáticas.
21. Uso de un tejido estromal tridimensional
para la preparación de un medicamento para la promoción de la
vascularización en tejido isquémico, en el que dicho tejido
isquémico es puesto en contacto con dicho tejido estromal
tridimensional, comprendiendo dicho tejido estromal células
estromales y proteínas de tejido conectivo secretadas de manera
natural por las células estromales, estando dichas células unidas y
envolviendo a un armazón que se compone de un material
biocompatible no viviente que forma una estructura tridimensional
que tiene los espacios intersticiales llenados por las células
estromales.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que el
tejido isquémico es al menos uno de los miembros del grupo que
consta de músculo esquelético, músculo liso, tejido conectivo o
piel.
23. Uso según la reivindicación 21, en el que
las células estromales son fibroblastos.
24. Uso según la reivindicación 21, en el que
las células estromales son células de músculo liso.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que
las células de músculo liso son células de músculo liso
vascular.
26. Uso según la reivindicación 25, en el que
las células de músculo liso vascular son células de músculo liso
aórtico.
27. Uso según la reivindicación 21, en el que
las células estromales son células de músculo cardíaco.
28. Uso según la reivindicación 21, en el que
las células estromales son una combinación de fibroblastos y
células de músculo liso, células de músculo cardíaco, células
endoteliales, pericitos, macrófagos, monocitos, leucocitos, células
plasmáticas, células mast o adipositos.
29. Uso según la reivindicación 21, en el que el
tejido estromal es unido al tejido cardíaco isquémico por medio de
sutura biodegradable o no biodegradable, una cola biológica, una
cola sintética, colorante láser o un hidrogel.
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
21 o 22, en el que las células estromales son células troncales
mesenquimáticas.
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