ES2281558T3 - Procedimiento para la extraccion y el analisis de sustancias contenidas a partir de material organico. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el aislamiento de sustancias contenidas a partir de material orgánico, que comprende las etapas de procedimiento siguientes: a) liofilizar el material orgánico; b) extraer las sustancias contenidas con un disolvente o una mezcla de disolventes polar (A) y un disolvente o una mezcla de disolventes orgánico (B), pudiendo formar los extractos combinados a partir de extraer con (A) y (B), una fase y siendo el disolvente o la mezcla de disolventes (B) más apolar, que el disolvente o la mezcla de disolventes (A).; c) combinar los extractos a partir de extraer con (A) y (B) para dar una fase y separación posterior en una fase polar y una fase apolar; y d) realizar una esterificación/transesterificación en la fase apolar con un alcohol., realizándose la esterificación/transesterificación en presencia de un ácido volátil; siendo el procedimiento un procedimiento de alto rendimiento.

Description

Procedimiento para la extracción y el análisis de sustancias contenidas a partir de material orgánico.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el aislamiento de sustancias contenidas a partir de material orgánico, que comprende las etapas de procedimiento siguientes:

(a) liofilizar el material orgánico;

(b) extraer las sustancias contenidas con un disolvente o una mezcla de disolventes polar (A) y un disolvente o una mezcla de disolventes orgánico (B), pudiendo formar el extracto combinados a partir de extraer con (A) y (B), una fase y siendo el disolvente o mezcla de disolventes (B) más apolar que el disolvente o la mezcla de disolventes (A);

(c) combinar los extractos a partir de extraer con (A) y (B) para dar una fase y separación posterior en una fase polar y una apolar; y

(d) realizar una esterificación/transesterificación en la fase apolar con un alcohol, realizándose la esterificación/
transesterificación en presencia de un ácido volátil;

siendo el procedimiento un procedimiento de alto rendimiento.

El conocimiento de las rutas de síntesis bioquímicas en el metabolismo de células animales o vegetales, incluyendo los microorganismos, tales como bacterias, hongos, algas, o células de mamíferos, es aún muy rudimentario a pesar del conocimiento de las rutas de síntesis principales. La determinación de los estados fisiológicos durante el crecimiento, desarrollo o como reacción al estrés ambiental se limita hasta el momento esencialmente a la investigación de moléculas diana individuales, tales como por ejemplo ARN y proteínas. Las modificaciones del nivel de ARNm o de proteína o su actividad sin embargo con frecuencia no pueden correlacionarse con modificaciones en el metabolismo o incluso con funciones fenotípicas.

El análisis directo de metabolitos o sustancias contenidas celulares tiene lugar con frecuencia mediante reacciones enzimáticas específicas, ensayos inmunológicos o basándose en procedimientos cromatográficos, que identifican determinadas sustancias mediante los tiempos de retención o coeluciones con sustancias de referencia. Tal como se describe en Katona, J. Chromatography 1999, 847, 91-102, una gran parte del estado de la técnica sólo trata el análisis de pocos componentes específicos, por ejemplo ácidos o azúcares.

Sólo en sus inicios se muestra, que los productos metabólicos o metabolitos no sólo representan productos intermedios o finales, sino que actúan también como sensores y reguladores. Al análisis de perfiles metabólicos complejos o de sustancias contenidas en organismos le corresponde por tanto un gran significado en la asignación de funciones génicas, en la valoración de influencias por estrés y no en última instancia en la valoración de la seguridad y el valor de los organismos modificados genéticamente.

Sin embargo para poder estudiar estas relaciones, por regla general es necesario, estudiar sistemas orgánicos en diferentes condiciones de la manera más detallada y reproducible posible, de modo que pueden reconocerse por ejemplo variabilidades genéticas o diferentes influencias internas o externas. Esto requiere sin embargo inevitablemente un análisis de un gran número de muestras.

Lo más avanzado es la determinación de perfiles de metabolitos complejos (independientemente de si esta determinación se limita a diferentes clases de sustancias, fases de desarrollo o tipos de material, es decir independientemente de si se trata de una huella metabólica, perfilado metabólico o metabolómica) en selecciones diagnósticas, sin embargo recientemente se han descrito también los primeros perfiles de plantas (para una visión general véase Trethewey, Curr. Opin. Plant. Biol. 1999, 2, 83-85). Igualmente muestra Sauter (ACS Symposium Series 1991, 443 (Synth. Chem. Agrochem. 2), American Chemical Society, Washington, DC, 288-299) la modificación de sustancias contenidas en la cebada tras el tratamiento con diferentes herbicidas. Pudieron detectarse entre 100 y 200 señales e identificarse con ayuda de sustancias de referencia a través de sus coeficientes de retención en la cromatografía de gases (CG) o a través de análisis de cromatografía de gases y espectrometría de masas (CG/EM).

Fiehn, Nature Biotechnology 2000, 18, 1157-1161, describe la cuantificación de 326 sustancias en extractos de hoja de Arabidopsis thaliana. Para la comparación de cuatro genotipos diferentes se homogeneizaron en un procedimiento costoso muestras vegetales congeladas, se extrajeron en metanol al 97% en volumen y se obtuvieron tras la adición de cloroformo y agua en varias etapas, un fase polar y una apolar, que entonces se analizaron mediante CL/EM y CG/EM (véase también Fiehn, Anal. Chem. 2000, 72, 3573-3580; http://www.mpimp-golm.mpg.de/fiehn/
blatt-protokolle.html). Según un procedimiento muy similar Roessner, The Plant Journal 2000, 23, 131-142, extrajo sustancias contenidas vegetales en metanol y comparó entre sí los perfiles de metabolitos polares con plantas de patata cultivadas in vitro y en tierra.

Gilmour, Plant Physiology 2000, 124, 1854-1865 extrajo azúcar a partir de hojas liofilizadas de cinco tipos diferentes de Arabidopsis en etanol al 80% tras la incubación durante 15 min a 80°C y la incubación durante la noche a 4°C. Igualmente a 80°C, durante 30 min y en etanol al 80% con Hepes, pH 7,5, Strand, Plant Physiology 1999, 119, 1387-1397, extrajo dos veces seguidas almidón y azúcar soluble. A estas altas temperaturas se extrae aún dos veces más, para mejorar el resultado de la extracción, y concretamente una vez con etanol-Hepes al 50%, pH 7,5 y una vez con Hepes, pH 7,5.

Los procedimientos descritos en el estado de la técnica sólo permiten una automatización limitada, que además sólo puede efectuarse con un esfuerzo técnico elevado. Especialmente el registro de números de muestras grandes, la determinación de la influencia de diversos factores de estrés sobre el metabolismo de los organismos o la observación de procesos dinámicos, que requiere un análisis continuo de muestras en ventanas de tiempo con frecuencia muy pequeñas, requieren procedimientos,

(a) que sean rápidos, es decir por ejemplo, que la fijación y el análisis de las muestras tenga lugar en el transcurso de un periodo de tiempo corto tras la obtención de las muestras,

(b) que sean altamente reproducibles, es decir por ejemplo, que un análisis proporcione a través de muchas muestras distintas resultados dentro de un intervalo de error reducido,

(c) que sean fáciles de manipular, es decir por ejemplo, que el procedimiento pueda automatizarse y que pueda accionarse sin un esfuerzo técnico o personal alto,

(d) que sean abiertos, es decir por ejemplo, que pueda analizarse un gran número de sustancias, y/o

(e) que sean sensibles, es decir por ejemplo, que el análisis detecte también modificaciones reducidas en las concentraciones de sustancias y cantidades de sustancias reducidas.

En el caso de un mayor número de muestras es especialmente necesario, que se garantice la estabilidad de las muestras y por consiguiente la reproducibilidad de los resultados. Un análisis continuo amplio de material biológico, por ejemplo muestras animales o muestras vegetales, o por ejemplo la interacción entre sustancia(s) y organismos en sistemas complejos y su transcurso temporal no es posible por consiguiente con los procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

El problema técnico, en el que se basa la presente invención era, por tanto, encontrar un procedimiento, que permita superar los inconvenientes mencionados anteriormente de los procedimientos conocidos en el estado de la técnica y que posibilite analizar de manera rápida y sencilla especialmente un mayor número de muestras con una reproducibilidad y sensibilidad alta.

La solución del problema se pone a disposición mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones de la presente invención.

En consecuencia la solicitud se refiere a un procedimiento para el aislamiento de sustancias contenidas a partir de material orgánico, que comprende las etapas de procedimiento siguientes:

(a) liofilizar el material orgánico;

(b) extraer las sustancias contenidas con un disolvente o una mezcla de disolventes polar (A) y un disolvente o una mezcla de disolventes orgánico (B), pudiendo formar el extracto combinados a partir de extraer con (A) y (B), una fase y siendo el disolvente o mezcla de disolventes (B) más apolar que el disolvente o la mezcla de disolventes (A);

(c) combinar los extractos a partir de extraer con (A) y (B) para dar una fase y separación posterior en una fase polar y una apolar; y

(d) realizar una esterificación/transesterificación en la fase apolar con un alcohol, realizándose la esterificación/
transesterificación en presencia de un ácido volátil;

siendo el procedimiento un procedimiento de alto rendimiento.

Por el término "material orgánico" se entiende cualquier material orgánico o biológico, tales como material de plantas, animales, microorganismos por ejemplo de protistas, hongos, bacterias, algas, virus etc., por ejemplo a partir de organismos separados de material de cultivo, fluidos corporales tales como sangre, linfa, secreciones o alimentos, alimentos para animales y otros productos animales o vegetales. Igualmente se entiende por esto material de cultivo en el que viven organismos, es decir por ejemplo también tras la separación de los organismos, por ejemplo medios para el cultivo de microorganismos, tales como protistas, por ejemplo cinetoplastos, plasmodios, o bacterias, por ejemplo bacterias gram positivas o gram negativas, o algas, hongos, por ejemplo levaduras, o células animales o
vegetales.

Por el término "extracción" o "extraer" se entiende según la invención que a partir de una muestra sólida o líquida con disolventes o mezclas de disolventes de apolares a polares se traspasan las sustancias contenidas en la misma, por ejemplo sustancias contenidas a partir de material orgánico, al disolvente o mezcla de disolventes correspondiente. En un disolvente polar tal como por ejemplo agua, se disuelven las sustancias contenidas hidrófilas, por ejemplo también metabolitos, en un disolvente lipófilo se disuelven las sustancias contenidas hidrófobas, por ejemplo también metabolitos, del material.

Por "disolventes o mezclas de disolventes polares" se entiende un disolvente o una mezcla de disolventes con un índice de polaridad de desde 4 hasta 10,2, preferiblemente de desde 5 hasta 7, más preferiblemente de desde 5,5 hasta 6,5 según Kellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, pág. 195. Disolventes polares son por ejemplo agua, incluyendo soluciones acuosas, o disolventes orgánicos polares, apróticos o próticos, por ejemplo alcoholes alquílicos con un resto alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol o por ejemplo acetona, acetonitrilo, éster etílico del ácido acético, dimetilsulfóxido o N,N-dimetilformamida, u otros disolventes con una polaridad superior o igual a 0,50, tal como se indica por ejemplo en Küster/Thiel, Rechentafeln für die Chemische Analytik, Walter de Gruyter, Berlín/Nueva York 1993, pág. 359, o son mezclas de los mismos. Una mezcla de disolventes utilizada según la invención del 80% de metanol/20% de agua tiene así por ejemplo el índice de polaridad de 6,1 según Kellner, 1998.

Por un "disolvente apolar" o una "mezcla de disolventes apolar" se entiende un disolvente o una mezcla de disolventes, que presenta una menor polaridad o un menor índice de polaridad que el disolvente o la mezcla de disolventes (A) y en el que pueden extraerse mejor sustancias de polaridad media a apolares, especialmente un disolvente o una mezcla de disolventes con un índice de polaridad según Kellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, pág. 195, que es 0,3 o superior y menor que el del medio de extracción de la fase polar. Más preferiblemente el índice de polaridad según Kellner, 1998 es 0,5, aún más preferiblemente 1, lo más preferiblemente alrededor de mayor que 2 y menor que el del medio de extracción de la fase polar. En consecuencia el índice de polaridad del disolvente apolar tiene de manera especialmente preferible en valor de desde 5,5 hasta 1, más preferiblemente de 5 a 2, lo más preferiblemente de 4,5 a 3,5 según Kellner, 1998. Una mezcla de disolventes utilizada según la invención del 40% de metanol/60% de diclorometano tiene entonces por ejemplo un índice de polaridad de 3,9 según Kellner, 1998. "Disolventes apolares" son por ejemplo disolventes orgánicos, por ejemplo disolventes que contienen halógeno tales como cloroformo, diclorometano, tetraclorocarbono o disolventes alifáticos tales como hexano, ciclohexano, pentano, heptano etc. o disolventes aromáticos, tales como por ejemplo tolueno o benceno, o éteres, tales como por ejemplo terc-butilmetil éter, dietil éter o tetrahidrofurano u otros disolventes con una polaridad inferior a 0,50, tal como se indica por ejemplo en Küster/Thiel 1993, o mezclas de los mismos.

Por una "fase polar" o un "extracto polar" se entiende una fase o un extracto, que se obtiene a partir de una extracción con un disolvente o una mezcla de disolventes con un índice de polaridad de desde 4 hasta 10,2, preferiblemente de desde 5 hasta 7, más preferiblemente de desde 5,5 hasta 6,5 según Kellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, pág. 195, o que se obtiene a partir de una extracción con un disolvente o una mezcla de disolventes polar tal como se mencionó anteriormente.

Por una "fase apolar" o un "extracto apolar" se entiende una fase o un extracto, que presenta una menor polaridad o un menor índice de polaridad con respecto a la fase polar y en la/el que pueden extraerse mejor sustancias de polaridad media a apolares, tal como por ejemplo en una extracción con disolventes o mezclas de disolventes apolares tal como se mencionó anteriormente. Según la invención se obtiene una "fase apolar" o un "extracto apolar" mediante la extracción con un disolvente o una mezcla de disolventes con un índice de polaridad según Kellner, Analytical Chemistry, Weinheim, 1998, página 195, que es 0,3 o superior y menor que el del medio de extracción de la fase polar/del extracto polar. Más preferiblemente el índice de polaridad según Kellner, 1998 es 0,5, aún más preferiblemente 1, lo más preferiblemente alrededor de mayor que 2 y menor que el del medio de extracción de la fase polar.

Por el término "sustancias contenidas" se entiende compuestos polares y apolares, por ejemplo "metabolitos", que se generan en las reacciones de degradación y de síntesis (reacciones catabólicas o anabólicas) del metabolismo o que absorben los organismos de su entorno. Esto se refiere a compuestos, que se encuentran en la célula o en organismos más complejos también extracelularmente, por ejemplo fluidos corporales. En el cultivo de microorganismos u otros organismos se comprenden también las sustancias contenidas de estos cultivos, por ejemplo del medio de crecimiento. La concentración de una sustancia contenida se ve influida por influencias externas (condiciones ambientales, condiciones nutritivas, situación de estrés) o por condiciones internas (desarrollo, regulaciones, modificaciones condicionadas genéticamente), a las que están sometidos los organismos. El término comprende tanto los denominados metabolitos primarios como los metabolitos secundarios. Por "metabolitos primarios" se entienden por regla general aquellos metabolitos, que son productos de rutas de degradación y de síntesis, que son de significado fundamental para la célula y con ello son más o menos iguales para todas las células. Por "metabolitos secundarios" se entienden por regla general compuestos, que en la mayoría de los casos se forman en rutas auxiliares, por ejemplo en situaciones de estrés, tales como condiciones de hambre o de carencia o tras finalizar la fase activa de crecimiento de la célula y para las que en muchos casos no se conoce ninguna función reconocible para la célula (véase también Römpp Lexikon Biotechnologie, Nueva York, 1992). Por sustancias contenidas se entienden por tanto por ejemplo sustancias polares o apolares, tales como hidratos de carbono, aminas (especialmente aminoácidos), tetrapirroles, lípidos, esteroides, nucleótidos, nucleósidos, cofactores, coenzimas, vitaminas, antibióticos, hormonas, péptidos, terpenos, alcaloides, carotenoides, xantofilas, flavoides, etc. y las sustancias de las rutas metabólicas respectivas, sin que debe considerarse la enumeración anterior o posterior como limitativa de ninguna manera.

Los hidratos de carbono comprende por ejemplo los hidratos de carbono del metabolismo de los hidratos de carbono, por ejemplo de la glicólisis, de la gluconeogénesis, por ejemplo triosas, tetrosas, pentosas, por ejemplo furanosas o hexosas, por ejemplo piranosas o heptosas, del metabolismo de los polisacáridos, o del metabolismo del piruvato, del metabolismo de la acetilcoenzima A, di u oligosacáridos, glicósidos, derivados de la hexosa, desoxihexosas, hidratos de carbono del metabolismo de las pentosas, del metabolismos de los aminoazúcares, del ciclo del citrato de metabolismo del glioxilato, etc. u otras sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Los aminoácidos comprenden por ejemplo los aminoácidos del metabolismo de los aminoácidos, tales como por ejemplo en el metabolismo del amoniaco, o del metabolismo del azufre, del ciclo de la urea, o de sus derivados, por ejemplo aminoácidos aromáticos o no aromáticos, aminoácidos polares sin carga, no polares, alifáticos, aromáticos, cargados positivamente, cargados negativamente, aminoácidos de cadena ramificada o de cadena lineal, esenciales o no esenciales u otras sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Los tetrapirroles comprenden por ejemplo sustancias del metabolismo de la protoporfirina, del metabolismo de la hemoglobina, del metabolismo de la mioglobina, del diferente metabolismo del citocromo, del metabolismo de la fotosíntesis, etc. u otras sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Los lípidos comprenden por ejemplo ácidos grasos saturados o insaturados, esenciales o no esenciales, compuestos de acil-CoA, triacilglicéridos, lípidos de la lipogénesis o de la lipólisis, fosfolípidos, por ejemplo glicerofosfolípidos, éter lípidos, esfingofosfolípidos, glicolípidos o las sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Las hormonas comprenden hormonas esteroideas o no esteroideas, por ejemplo hormonas peptídicas o por ejemplo eicosanoides.

Los esteroides comprenden por ejemplo las sustancias del metabolismo del colesterol, hopanoides, esteroides vegetales, tales como fito y micosteroles, hormonas de insectos, isoprenoides, hormonas esteroideas, gestágenos, andrógenos, estrógenos, corticoesteroides o las sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Los nucleótidos y nucleósidos comprenden por ejemplo desoxi y ribonucleótidos/nucleósidos, sus derivados de 5'-fosfato, purinas, pirimidinas o sus derivados, por ejemplo derivados de nucleósido o de nucleótido ciclados, metilados y/o acetilados, etc. u otras sustancias de las rutas metabólicas respectivas.

Se comprenden igualmente sustancias, que desempeñan un papel en estas rutas metabólicas. Por "otras sustancias de las rutas metabólicas respectivas" se entienden los productos intermedios respectivos en la biosíntesis, en la conversión, transporte o degradación de las sustancias mencionadas. Una visión general sobre muchos metabolitos se encuentra por ejemplo en Michal, Biochemical Pathways, Berlín, 1999 o en KEGG, Kyoto Enzyclopedia of Genes and Genomes, Institute of Chemical Research at Kyoto University, Japón (por ejemplo http://www.genome.ad.jp/dbget/ligand.
html), que se incorporan de manera expresa.

Por el término "agua" se entiende cualquier tipo de una solución acuosa, también por ejemplo agua desionizada, desmineralizada, destilada o bidestilada. También pueden estar disueltas en agua una o más sustancias o mezcladas con ella, que preferiblemente mejoran la extracción, estabilidad o solubilidad de las sustancias contenidas del material orgánico, o que conducen a propiedades preferidas, por ejemplo valor de pH, conductividad, concentración de sal, etc., tales como por ejemplo soluciones de sal o tampón.

Por "ácido volátil" se entiende un ácido, que puede eliminarse mediante evaporación esencialmente, es decir hasta al menos el 80%, preferiblemente hasta el 90%, más preferiblemente hasta el 95% o más, lo más preferiblemente, de manera preferible completamente.

El procedimiento según la invención es especialmente adecuado como procedimiento de alto rendimiento para la extracción de material orgánico y la derivatización y análisis de los extractos de un gran número de muestras, especialmente en muestras vegetales.

Los procedimientos descritos en el estado de la técnica requieren la congelación y la pulverización mecánica de las muestras ultracongeladas, la separación de la fase orgánica de la fase acuosa en la preparación de los extractos totales, que comprende tanto los metabolitos lipófilos como los polares y etapas de lavado variadas de una fase orgánica con una solución acuosa para la eliminación del ácido con una costosa eliminación posterior del agua del disolvente orgánico así como dado el caso la filtración del material de muestra; etapas, que suponen mucho tiempo y sólo pueden automatizarse con un elevado esfuerzo técnico, en el caso de que sea posible (Fiehn, Anal. Chem. 2000 y Nature Biotechnology 2000). Por primera vez el procedimiento según la invención da a conocer las etapas de procedimiento esenciales, que permiten una automatización eficaz y amplia, unida con una aceleración del procedimiento.

Ventajosamente en el procedimiento según la invención se evita, que se produzcan procesos enzimáticos en las muestras hasta la extracción, que modifican el espectro de las sustancias contenidas y que así se vean afectas la reproducibilidad y la precisión de los resultados de medición. Por tanto es especialmente ventajoso, que en una etapa de procedimiento se liofilice el material. Mediante la liofilización se succiona el material del agua, de modo que se inhiben los procesos enzimáticos. La utilización de la liofilización es además económica y ecológicamente ventajosa, dado que las muestras así tratadas pueden almacenarse a temperatura ambiente y tratarse posteriormente. Esto permite no sólo un tratamiento y análisis automático de la muestra de manera técnicamente más sencilla y abaratada sino que ahorra costes de energía, dado que puede prescindirse de una circulación refrigerante.

Además es ventajoso, que en el procedimiento según la invención los extractos combinados forman una fase. La ventaja del mezclado en una fase repetido de los dos extractos antes de la separación de fases es que los restos de sustancias polares de la extracción polar se transforman en la fase polar y viceversa los restos de compuestos apolares de la fase polar se transforman en la fase apolar correspondiente. Mediante esto se aumenta la sensibilidad, exactitud, precisión, variabilidad y reproducibilidad de un procedimiento de alto rendimiento.

Las extracciones con (mezcla de) disolventes (A) y (B) conducen tras la extracción a una fase polar así como a una fase apolar, y pueden realizarse en paralelo, por ejemplo cuando la muestra se divide en primer lugar y luego se producen extractos respectivamente, o una detrás de otra, por ejemplo cuando las mismas muestras se tratan tras la separación del 1^{er} medio de extracción con un 2º medio de extracción, siendo igualmente posible la secuencia (A)(B) como la secuencia (B)(A), y siendo también posibles etapas intermedias. También es posible, combinar las etapas con otras etapas. La más preferida es la secuencia (A)(B).

Las dos fases pueden separarse tras la combinación de las dos fases para dar una fase según procedimientos conocidos por el experto de nuevo en una fase polar y una apolar, véase por ejemplo Bligh y Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911-917, por ejemplo mediante la adición de un disolvente o una mezcla de disolventes apolar, especialmente uno orgánico apolar tal como se describió anteriormente (por ejemplo diclorometano) o uno polar tal como se describió anteriormente, especialmente una solución acuosa por ejemplo un tampón, o mediante la adición tanto de un disolvente o una mezcla de disolventes apolar como de uno/una polar. Preferiblemente se consigue la separación de fases mediante la adición de un disolvente usado para la extracción, especialmente mediante metanol, diclorometano y/o agua.

El uso de un ácido volátil, de manera preferible ligeramente volátil para la esterificación/transesterificación en la fase polar, tal como por ejemplo HCl, es otra etapa esencial del procedimiento según la invención. Según la invención, el ácido usado tiene una menor presión de vapor que el disolvente usado o los componentes de la mezcla de disolventes o un azeótropo posible de todos o una parte de los componentes inclusive el propio ácido. Al contrario que los procedimientos descritos en el estado de la técnica, el uso de ácidos volátiles posibilita que puedan eliminarse los restos de ácido de manera rápida y que puede automatizarse mediante evaporación, mientras que en el estado de la técnica los restos de ácido han de eliminarse mediante etapas de lavado con un secado posterior, por ejemplo con un medio de secado tal como sulfato de sodio, y filtración. Como disolvente puede utilizarse para la esterificación/transesterificación un alcohol alquílico con un resto alquilo con de 1 a 8 átomos de carbono, tal como se describió anteriormente, opcionalmente con un porcentaje de un disolvente o una mezcla de disolventes inerte, por ejemplo cloroformo, diclorometano, benceno y/o tolueno. Se prefiere especialmente una mezcla de cloroformo, metanol, tolueno y ácido clorhídrico.

La esterificación/conversión puede realizarse en el procedimiento según la invención en la fase polar y/o en la apolar de la extracción. Preferiblemente la esterificación/transesterificación se realiza sólo en la fase apolar. Preferiblemente la esterificación/transesterificación según la invención de las sustancias contenidas o una parte de las sustancias contenidas, que se extrajeron, con un alcohol alquílico insaturado o saturado, lineal, ramificado o en forma de anillo con de 1 a 8 átomos de carbono, por ejemplo metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol, etc. Se prefiere metanol o etanol, lo más preferiblemente metanol. La temperatura de reacción está preferiblemente entre 70 y 150°C, más preferiblemente entre 90 y 120°C, lo más preferiblemente es de 100°C. El tiempo de reacción se encuentra preferiblemente entre 0,5 h y 4 h, más preferiblemente entre 1 h y 3 h. Pueden estar presentes otros disolventes, que son inertes en la reacción, por ejemplo tolueno, diclorometano, benceno y/o cloroformo. También pueden usarse mezclas de los alcoholes y/o disolventes inertes. La solución puede contener también del 0% en volumen al 20% en volumen de agua, preferiblemente menos del 10% en volumen, más preferiblemente es inferior al 5% en volumen. Preferiblemente el porcentaje de otros disolventes además de los alcoholes mencionados es del 0% en volumen al 20% en volumen, preferiblemente inferior al 10% en volumen, lo más preferiblemente el 0% en volumen.

Según la invención la esterificación/transesterificación se realiza con un ácido volátil.

Los procedimientos descritos en el estado de la técnica no son adecuados o sólo de manera limitada para una extracción de alto rendimiento de metabolitos a partir de material orgánico. Las extracciones diagnósticas conocidas hacen referencia en primera línea a estudios de líquidos, por ejemplo orina, de modo que estos procedimientos no son adecuados para el tratamiento de muestras sólidas, especialmente de muestras de células vegetales.

El procedimiento según la invención está optimizado para el alto rendimiento y la utilización de robótica, el porcentaje de trabajos manuales está reducido con respecto al estado de la técnica, especialmente con respecto a los procedimientos, que no presentan las etapas (a) hasta (d) parcial o completamente en esta forma, en al menos el 10%, preferiblemente el 20%, más preferiblemente en más del 30%, lo más preferiblemente en al menos el 50%.

Ventajosamente se reduce mediante el procedimiento según la invención y la posibilidad condicionada por esto para la automatización y la robótica, la tasa de confusión de las muestras en más del 10%, más preferiblemente en más del 20%, aún más preferiblemente en más del 30%, lo más preferiblemente en más del 50% con respecto al estado de la técnica, especialmente con respecto a los procedimientos que no presentan las etapas (a) hasta (d) parcial o completamente en esta forma. Igualmente se consigue mediante las etapas de procedimiento según la invención en un análisis de alto rendimiento, una reproducibilidad esencialmente elevada. La reproducibilidad elevada del procedimiento según la invención se caracteriza por la variabilidad analítica más reducida en al menos el 10%, preferiblemente el 20%, más preferiblemente al menos el 30% lo más preferiblemente al menos el 50% con respecto al estado de la técnica, especialmente con respecto a los procedimientos que no presentan las etapas (a) hasta (d) parcial o completamente en esta forma. Además es ventajoso, que mediante las formas de realización descritas en el presente documento del procedimiento según la invención se detecta un espectro de sustancias contenidas aumentado en más del 5%, preferiblemente el 10%, más preferiblemente el 20%, aún más preferiblemente el 50% con respecto al estado de la técnica, especialmente con respecto a los procedimientos, que no presentan las etapas (a) hasta (d) parcial o completamente en esta forma.

Preferiblemente la mezcla (A) es una mezcla de alcohol/agua con el 10% en volumen o menos, preferiblemente el 0% en volumen de otros disolventes u otras mezclas de disolventes.

Las sustancias polares se extraen en el estado de la técnica por regla general en alcoholes alquílicos puros o mezclados con agua o soluciones tampón, tales como etanol (Sauter, 1991, Strand, 1999, Gilmour, 2000) o metanol (Fiehn, Anal. Chem. 2000 y Nature Biotechnology 2000, Roessner, 2000) o en agua o soluciones tampón.

El agua tiene propiedades de extracción muy buenas para las sustancias polares. Sin embargo es desventajoso, que en soluciones acuosas vuelvan a activarse procesos celulares que por regla general se detuvieron previamente mediante congelación o liofilización. Esto puede provocar por ejemplo una degradación o conversión de diferentes metabolitos y conduce a una modificación y por consiguiente a una alteración de las concentraciones o condiciones dentro de estos extractos. Por regla general se intenta impedir estas reacciones secundarias indeseadas trabajando sobre hielo. Esto tiene sin embargo desventajas considerables tanto para la eficacia de la extracción como para el tratamiento de grandes cantidades de muestras. Son inevitables una pérdida de la sensibilidad y desviación del estado celular verdadero de la cosecha.

Se usan etanol o metanol, porque por un lado tiene propiedades polares, y por consiguiente se extraen suficientemente las sustancias hidrófilas, y por otro lado porque tras la adición a un extracto celular debido al efecto desnaturalizante, tóxico, del alcohol, se inhiben los extractos celulares en su actividad. Por consiguiente no puede tener lugar ninguna conversión adición de los metabolitos y las células se "congelan" en su estadio metabólico momentáneo. Sin embargo es desventajoso, que algunas clases de metabolitos sólo se disuelven difícilmente en metanol o etanol. Esto conduce a una pérdida de sensibilidad y puede influir también en la reproducibilidad de los resultados.

Se prefiere el uso de metanol o etanol como alcohol alquílico, más preferiblemente el uso de metanol. Preferiblemente, la mezcla tiene un índice de polaridad de desde 4 hasta 10,2, especialmente preferible desde 5 hasta 7, lo más preferiblemente desde 5,5 hasta 6,5 según Kellner, 1998.

En una forma de realización especialmente preferida la mezcla de disolventes polar (A) está compuesta de un mezcla en una fase del 50 al 90% en volumen de alcohol alquílico C_{1} a C_{6}, por ejemplo metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol o hexanol y del 10 al 50% en volumen de agua.

En una forma de realización especialmente preferida la mezcla en una fase según la invención está compuesta de al menos el 50% en volumen de metanol, del 10% en volumen al 50% en volumen de agua, preferiblemente sólo de metanol y/o agua, no conteniendo la mezcla más del 50% en volumen de agua. Esta etapa del procedimiento según la invención conduce a un rendimiento mayor que en el caso de una extracción en metanol o etanol puro. Además la estabilidad del extracto está aumentada con respecto a una extracción pura en agua y por consiguiente se mejora esencialmente la reproducibilidad del procedimiento. Al contrario que la extracción con mezclas de etanol/agua el rendimiento es tan alto, que es suficiente una etapa de extracción individual; para aislar una gran cantidad de sustancias contenidas. En procedimientos, que se basan en la etapa de extracción según la invención para el aislamiento de sustancias polares de células vegetales, se limitó la cantidad de sustancias analizadas sólo por el procedimiento de análisis. Pudo conseguirse una reproducibilidad muy alta.

Preferiblemente la mezcla tiene un porcentaje de al menos el 70% en volumen al 90% en volumen de metanol, más preferiblemente del 75% en volumen al 85% en volumen, lo más preferiblemente del 80% en volumen de metanol. Igualmente se prefiere del 10% en volumen al 50% en volumen de agua. Se prefiere más menos del 40% en volumen de agua, aún más preferiblemente menos del 30% en volumen de agua. Lo más preferido es del 15% en volumen al 25% en volumen de agua. En consecuencia, el procedimiento según la invención se realiza preferiblemente con una mezcla del 80% en volumen de metanol y el 20% en volumen de agua. Dado el caso la mezcla puede contener también cantidades escasas de otro disolvente u otra mezcla de disolventes, por ejemplo diclorometano, sin embargo se prefiere menos del 10% en volumen, más preferiblemente menos del 5% en volumen, lo más preferiblemente ningún otro disolvente en la mezcla. El disolvente o la mezcla de disolventes (B) es según la invención un disolvente orgánico o una mezcla de uno o varios disolventes polares, por ejemplo alcoholes alquílicos con un resto alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol o por ejemplo acetona, acetonitrilo, éster etílico del ácido acético, dimetilsulfóxido o N,N-dimetilformamida, u otros disolventes con una polaridad superior o igual a 0,50, tal como se indica por ejemplo en Küster/Thiel 1993, y uno o varios disolventes orgánicos apolares descritos anteriormente, por ejemplo disolventes que contienen halógeno tales como cloroformo, diclorometano, tetraclorocarbono o disolventes alifáticos tales como hexano, ciclohexano, pentano, heptano etc. o disolventes aromáticos, tales como por ejemplo tolueno o benceno, o éteres, tales como por ejemplo terc-butilmetil éter, dietil éter o tetrahidrofurano u otros disolventes con una polaridad inferior a 0,50, tal como se indica por ejemplo en Küster/Thiel 1993.

El disolvente o la mezcla de disolventes (B) son más apolares que el disolvente o la mezcla de disolventes (A). Según la invención el índice de polaridad (según Kellner, 1998) de (B) es 0,3 o superior y menor que el del medio de extracción de la fase polar. Más preferiblemente el índice de polaridad según Kellner, 1998, es 0,5, aún más preferiblemente 1, lo más preferiblemente más de 2 y menor que el del medio de extracción de la fase polar. Preferiblemente el índice de polaridad del disolvente apolar tiene un valor de desde 1 hasta 5,5, más preferiblemente 5, lo más preferiblemente inferior a 4,5 según Kellner, 1998. Una mezcla de disolventes utilizada según la invención del 40% de metanol/60% de diclorometano tiene entonces por ejemplo un índice de polaridad de 3,9 según Kellner, 1998.

Preferiblemente, la mezcla mencionada comprende un componente de disolvente que no se mezcla con agua, para que en el caso de una purificación de fases posterior pueda promoverse a continuación la separación de fases en una fase apolar y una polar. Preferiblemente se mezcla el componente con un alcohol C_{1} a C_{6}, especialmente etanol o metanol. Los disolventes halogenados se prefieren especialmente. Un punto de ebullición bajo, por ejemplo inferior a 100°C, más preferiblemente inferior a 80°C, aún más preferiblemente inferior a 60°C y lo más preferiblemente inferior a 40°C a presión normal es además ventajoso, porque la eliminación del disolvente o de la mezcla de disolventes puede realizarse más rápidamente y a temperaturas más bajas de una manera más moderada para las sustancias contenidas. Se prefiere una mezcla de metanol o etanol y cloroformo, pentano, hexano, heptano, ciclohexano, tetraclorocarbono, acetato de etilo o diclorometano. Se prefiere más una mezcla de metanol o etanol con cloroformo o diclorometano.

De manera especialmente preferible la mezcla de disolventes (B) está compuesta de una mezcla en una fase del 30% en volumen al 60% en volumen de alcohol alquílico C_{1} a C_{6}, tal como se mencionó anteriormente, del 40% en volumen al 70% en volumen de cloroformo o diclorometano y del 0% en volumen al 30% en volumen de otro disolvente u otra mezcla de disolventes, preferiblemente metanol y/o cloroformo y/o diclorometano, no superándose o quedándose por debajo los porcentajes de alcohol alquílico y/o diclorometano y/o cloroformo. Preferiblemente el alcohol alquílico es metanol o etanol, especialmente preferible metanol.

Preferiblemente el disolvente apolar es diclorometano o cloroformo, se prefiere el uso de diclorometano.

El del 0% en volumen al 30% en volumen del disolvente o de la mezcla de disolventes adicional está compuesto de uno o varios disolventes adicionales, que forman una fase con la mezcla mencionada anteriormente. Dado el caso la mezcla (B) puede contener también cantidades reducidas de agua, preferiblemente inferiores al 20% en volumen, más preferiblemente inferiores al 10% en volumen, aún más preferiblemente inferiores al 5% en volumen, lo más preferiblemente no hay agua ni ningún otro disolvente en la mezcla.

Sorprendentemente se encontró que es posible una extracción especialmente buena con una razón determinada de metanol con respecto a diclorometano. Lo más preferiblemente se realiza el procedimiento según la invención en la etapa (b) por tanto con una mezcla del 30 al 40% en volumen de metanol y del 60 al 70% en volumen de diclorometano. Lo más preferido es el 40% en volumen de metanol y el 60% en volumen de diclorometano.

Una mezcla en una fase según la invención de los extractos (A) y (B) se consigue por ejemplo, cuando la mezcla de disolventes (A) está compuesta del 80% en volumen de metanol y el 20% en volumen de agua y la mezcla de disolventes (B) del 40% en volumen de metanol y el 60% en volumen de diclorometano y se combinan entonces ambos extractos. Ventajosamente se encuentran por consiguiente todas las sustancias contenidas y opcionalmente por ejemplo los patrones en una fase.

Dado el caso puede repetirse la extracción con (A) o (B) una o varias veces. Se prefiere sin embargo una realización única de cada etapa de extracción.

En lugar de o tras una separación de fases puede realizarse en el procedimiento según la invención un fraccionamiento en dos o más fracciones también por medio de una extracción en fase sólida. Un fraccionamiento en varias fracciones tiene la ventaja de que los procedimientos de derivatización y de análisis pueden adaptarse mejor a los respectivos grupos de sustancias. De este modo se transesterifican especialmente fracciones, que contienen principalmente triglicéridos, antes del análisis por ejemplo para dar ésteres metílicos. La extracción en fase sólida es especialmente adecuada para la automatización.

Dado el caso puede interrumpirse el tratamiento de los extractos en algún punto del procedimiento descrito en el presente documento entre las etapas mencionadas, siempre que los extractos se almacenen o conserven de manera estable, por ejemplo ultracongelando y/o liofilizando los extractos. Sin embargo se prefiere evitar una interrupción del tratamiento antes del análisis.

En una forma de realización de la invención se favorece la extracción, por ejemplo la de las muestras liofilizadas o congeladas, mediante etapas adicionales, por ejemplo mediante técnicas de homogeneización y de dispersión (véase anteriormente, por ejemplo en Fiehn, Anal. Chem. 2000. y Nature Biotechnology 2000, Sauter, 1991, Roessner, 2000, Bligh y Dyer, 1959, Strand, 1999 etc.).

Así puede quebrarse el material por ejemplo mediante calor, molino agitador u otros procedimientos de molienda, presión o modificaciones de la presión rápidas, sucesivas, etapas de extracción de ultrasonidos, onda de choque, microondas y/o ultraturrax y extraerse mejor las sustancias contenidas. Estos procedimientos pueden realizarse con refrigeración, por ejemplo a 0°C. En el caso de material liofilizado es posible un tratamiento a temperatura ambiente, es decir a de 15 a 25°C. Es ventajoso un método de extracción que permite la automatización del procedimiento. Así puede por ejemplo realizarse una ASE (Accelerated Solvent Extraction, extracción con disolventes acelerada), PSE (Pressurised Solvent Extraction, extracción con disolventes presurizados), PFE (Pressurised Fluid Extraction, extracción con fluidos presurizados) o PLE (Pressurised Liquid Extraction, extracción con líquidos presurizados), en las que se hace pasar el disolvente o mezcla de disolventes a través del material a presión y dado el caso a temperaturas más altas (véase Björklund, Trends in Analytical Chemistry 2000, 19 (7), 434-445, Richter, American Laboratory 1995, 27, 24-28, Ezzell, LC-GC 1995, 13 (5), 390-398).

Según la invención, la extracción se realiza de tal modo que se ajustan la temperatura y la presión de tal modo que no se descomponen las sustancias contenidas y la eficacia de la extracción es suficiente, por ejemplo a una temperatura de 0ºC o superior, ventajosamente de 20ºC, más preferiblemente de 40ºC a 200ºC, ventajosamente 150ºC o inferior, más preferiblemente de 120ºC o inferior. Preferiblemente se realiza el procedimiento a 40 bar o superior, más preferiblemente a 70 bar, aún más preferiblemente a de 100 bar a 200 bar, lo más preferiblemente a de 110 bar a 150 bar. Por consiguiente, las condiciones especialmente preferidas son una temperatura de desde 60ºC hasta 80ºC, especialmente de 70ºC y de 110 bar a 170 bar, especialmente de 140 bar. El tiempo de extracción puede encontrarse entre 30 s y 20 min., preferiblemente inferior a 10 min., más preferiblemente 5 min. Es especialmente preferible el uso de una temperatura de desde 60ºC hasta 80ºC y una presión de desde 110 hasta 170 bar en un tiempo de extracción inferior a 5 min. Por consiguiente, las condiciones de extracción son según la invención más moderadas que las descritas en el estado de la técnica y conducen a rendimientos más altos y a una estabilidad más alta de las sustancias contenidas aisladas.

En una forma de realización preferida se realiza la esterificación/transesterificación en la fase polar y/o apolar con un ácido volátil como catalizador, preferiblemente con HF, HI, BF_{3}, BCl_{3}, HBr, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o ácido tricloroacético, más preferiblemente BF_{3}, BCl_{3} o HCl, lo más preferiblemente HCl como ácido volátil como catalizador.

Tras la extracción, las fases pueden dividirse en distintas alícuotas y dado el caso evaporarse, por ejemplo para separar los ácidos volátiles y el agua y/o preparar las muestras para las siguientes etapas de procedimiento, por ejemplo con un IR-dancer (dispositivo de agitación calentado con radiación infrarroja a presión reducida), una centrífuga a vacío o mediante liofilización. La evaporación debe producirse de manera moderada, preferiblemente por debajo de 80ºC, más preferiblemente por debajo de 40ºC, preferiblemente a presión reducida, según cada disolvente o mezcla de disolventes por ejemplo a 10 mbar. Especialmente preferible, con el uso de mezclas de metanol/agua y/o diclorometano/metanol, es la reducción de la presión en etapas hasta 10 mbar.

En una forma de realización adicional, el procedimiento según la invención comprende además una o varias etapas para derivatizar, cromatografiar y/o analizar las sustancias contenidas, por ejemplo a partir de los extractos obtenidos o de las fases. Preferiblemente se derivatizan, se cromatografían y se analizan los extractos o las fases en las siguientes etapas del procedimiento según la invención. Para analizar adicionalmente los extractos, deben derivatizarse sustancias contenidas determinadas según cada método de separación y de análisis usado. Así se derivativa preferiblemente para dar una separación mediante cromatografía de gases (CG), mientras que por regla general no es necesario ninguna derivatización para dar una separación mediante cromatografía líquida (CL). Dado el caso también es posible un procedimiento de análisis sin separación mediante cromatografía, por ejemplo espectrometría de masas (EM), espectrometría de absorción atómica (EAA) o espectrometría por resonancia magnética nuclear (RMN).

En otra forma de realización preferida, el procedimiento según la invención contiene para la extracción aún al menos una de las siguientes etapas adicionales:

i)

congelar el material, preferiblemente congelación rápida del material obtenido, por ejemplo recogido;

ii)

homogeneizar y/o dispersar el material, preferiblemente homogeneización y dispersión;

iii)

evaporar hasta sequedad los extractos, preferiblemente tras la separación de fases y/o esterificación/transes- terificación;

iv)

realizar una formación de oximas en la fase apolar

v)

realizar una formación oximas en la fase polar;

vi)

realizar una trialquilsililación en la fase apolar; o

vii)

realizar una trialquilsililación en la fase polar;

El procedimiento según la invención contiene ventajosamente las etapas mencionadas de manera única, más preferiblemente varias y lo más preferiblemente todas, es especialmente preferible la secuencia mencionada en el presente documento.

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Ventajosamente se enfría el material orgánico inmediatamente tras la cosecha, mejor se congela, para impedir de ese modo cualquier actividad enzimática en la muestra o en el material y por consiguiente evitar una modificación en la distribución de las sustancias contenidas. Preferiblemente se realiza la congelación del material tras la obtención o cosecha en menos de 60 s, más preferiblemente 30 s, lo más preferiblemente 15 s o menos. Si el material es vegetal, la toma de muestras puede tener lugar directamente en la cámara de fitotrón. Ventajosamente se pesa rápidamente el material tras la obtención y después se congela profunda y rápidamente, por ejemplo en nitrógeno líquido, y se almacena por ejemplo a -80ºC o en nitrógeno líquido.

Tras la esterificación/transesterificación puede evaporarse la solución para eliminar el ácido, preferiblemente hasta sequedad, por ejemplo para eliminar ácidos volátiles y agua y preparar las muestras para las etapas de procedimiento posteriores, por ejemplo con un IR-Dancer, centrífuga a vacío o mediante liofilización. La evaporación debe producirse de manera moderada, preferiblemente a entre 5ºC y 80ºC, más preferiblemente entre 20ºC y 40ºC. Además se prefiere la realización del procedimiento a presión reducida, según cada disolvente o mezcla de disolventes por ejemplo a de 100 mbar a 10 mbar. Con el uso de mezclas de metanol/agua y/o diclorometano/metanol, se prefiere especialmente la reducción de la presión en etapas hasta por ejemplo 10 mbar. Los disolventes utilizados pueden favorecer la etapa de secado, por ejemplo siendo de manera especial fácilmente volátiles o favoreciendo la evaporación de agua como agente de arrastre, tal como por ejemplo tolueno.

En otra forma de realización se realiza una formación oximas en la fase polar y/o apolar en el procedimiento según la invención. Según la invención se entiende por oxima un compuesto de estructura (I) R-ONR',

1

pudiendo R ser H o un resto alquilo, preferiblemente un resto alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono, especialmente un resto metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo o un resto arilalquilo sustituido o no sustituido, preferiblemente con de 5 a 7 átomos de carbono en el resto arilalquilo y con de 0 a 2 heteroátomos en el anillo o en la cadena del resto arilalquilo, por ejemplo un resto bencilo sustituido o no sustituido, especialmente un resto bencilo halogenado con de 1 a 7 restos halógeno, preferiblemente un resto pentafluorobencilo y pudiendo R' ser cualquier resto de doble enlace.

Según la invención pueden usarse como reactivos para la formación de oximas, compuestos de estructura (Ib) R-ONH_{2}, definiéndose R tal como anteriormente, preferiblemente hidroxilamina o hidroxilamina O-sustituida o respectivamente su sal con un ácido volátil, por ejemplo clorhidrato, tal como clorhidrato de O-alquilhidroxilamina o clorhidrato de O-pentafluorobencilhidroxilamina, según el procedimiento conocido por el experto (véase Fiehn, Anal. Chem. 2000), por ejemplo disuelto en un disolvente o mezcla de disolventes adecuado, tal como por ejemplo piridina. Se prefiere un procedimiento según la invención, utilizándose para la formación de oximas, clorhidrato de O-metilhidroxilamina (II), clorhidrato de O-pentafluorobencilhidroxilamina (III) o clorhidrato de O-etilhidroxilamina (IV), siendo lo más preferido clorhidrato de O-metilhidroxilamina (II).

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4

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5

La reacción puede realizarse durante de 30 min. a 6 h, preferiblemente durante de 1 h a 2 h, preferiblemente al menos a de 20ºC a 80ºC, más preferiblemente de 50ºC a 60ºC. Se prefiere especialmente la realización durante de 1 h a 2 h a de 50ºC a 60ºC.

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En otra forma de realización según la invención se realiza una trialquilsililación en la fase polar y/o apolar. La trialquilsililación puede realizarse según la invención con un compuesto de fórmula Si(R^{1-4})_{4}, siendo R^{4} preferiblemente una N-alquil-C_{1-4}-2,2,2-trifluoroacetamida, especialmente preferible una N-metil-2,2,2-trifluoroacetamida, tales como en la fórmula (V). Por consiguiente se prefiere especialmente la trialquilsililación con un compuesto de fórmula (V),

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pudiendo R^{1}, R^{2} y/o R^{3} ser independientemente entre sí restos alquilo con de 1 a 6 átomos de carbono respectivamente, especialmente CH_{3}, C_{2}H_{5}, C_{3}H_{7} o C_{4}H_{9} con las siguientes fórmulas estructurales para C_{3}H_{7} y C_{4}H_{9}:

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siendo preferiblemente R^{1} o R^{2} restos metilo, siendo especialmente preferible R^{1} y R^{2} restos metilo. R^{3} es preferiblemente un resto alquilo lineal o ramificado con de 1 a 4 átomos de carbono tal como se describió anteriormente, especialmente preferible un resto metilo o resto terc-butilo, más preferiblemente R^{3} es un resto metilo. Preferiblemente se realiza una trimetilsililación con MSTFA (N-metil-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamida. La reacción puede tener lugar durante de 10 min. a 120 min., preferiblemente durante de 20 min. a 60 min. a de 20°C a 90°C, preferiblemente entre 40°C y 70°C.

Antes de la trialquilsililación pueden añadirse preferiblemente uno o varios patrón/patrones interno(s) y/o patrón/patrones de cromatografía. En una forma de realización, se usan en el procedimiento según la invención para la extracción disolventes o mezclas de disolventes, que contienen adicionalmente además hasta el 5% en peso, más preferiblemente hasta el 3% en peso, aún más preferiblemente hasta el 1% en peso de sales tampón, ácidos y/o bases. Se prefieren sistemas tampón volátiles. Así pueden utilizarse por ejemplo según la invención solución de formiato de amonio, de carbonato de amonio, de cloruro de amonio, de acetato de amonio o de hidrogenocarbonato de amonio y/o un ácido, por ejemplo ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropanoico, ácido heptafluorobutanoico, ácido nonafluoropentanoico, ácido undecafluorohexanoico, ácido tridecafluoroheptanoico o ácido pentadecafluorooctanoico y/o una base tales como por ejemplo trietilamina, piridina o amoniaco.

Es ventajoso mezclar la mezcla combinada de la etapa (c) con uno o varios patrones de análisis, por ejemplo patrones internos y/o patrones de cromatografía. Tales patrones pueden ser por ejemplo compuestos que no se originan en las muestras naturales, pero similares a las sustancias analizadas, incluyendo sustancias marcadas con isótopos, radiactivas o marcadas con fluorescencia, tales como para azúcar por ejemplo ribitol o alfa-metilglucopiranósido, para aminoácidos por ejemplo L-glicina-2,2-d_{2} o L-alanina-2,3,3,3,-d_{4}, para ácidos grasos o sus derivados especialmente ácidos grasos de número impar o sus ésteres metílicos, por ejemplo éster metílico del ácido undecanoico, del ácido tridecanoico, o del ácido nonacosanoico. Los patrones pueden añadirse también por separado a cada extracto de la etapa (b).

El procedimiento según la invención comprende también etapas para la separación y el análisis, pudiéndose separar los extractos ventajosamente a través de CL, CG o EC (electroforesis capilar).

Tras la evaporación mencionada anteriormente, los extractos producidos según la invención pueden absorberse en disolventes o mezcla de disolventes de HPLC y entonces se analizan en la CL. Como eluyentes se tienen en consideración mezclas de por ejemplo metanol, acetonitrilo o etanol y/o terc-butilmetil éter (metilterc-butil éter), tetrahidrofurano, isopropanol o acetona y/o agua y/o una sal, tal como por ejemplo solución de formiato de amonio, de carbonato de amonio, de cloruro de amonio, de acetato de amonio o de hidrogenocarbonato de amonio y/o un ácido, por ejemplo ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropanoico, ácido heptafluorobutanoico, ácido nonafluoropentanoico, ácido undecafluorohexanoico, ácido tridecafluoroheptanoico o ácido pentadecafluorooctanoico y/o una base, tal como por ejemplo trietilamina, piridina o amoniaco, según el caso de si deben separase extractos polares o apolares. Por regla general se realiza una elución por gradiente, preferiblemente se incorpora una detección mediante espectrometría de masas, por ejemplo una detección mediante EM o EM/EM (detección de espectrometría de masas simple o espectrometría de masas en tándem).

Tras la CG puede tener lugar una detección de las sustancias contenidas por ejemplo por medio de IE-EM (ionización por impacto electrónico y análisis por medio de un espectrómetro de masas) o IQ-EM (ionización química y análisis por medio de un espectrómetro de masas), espectrometría de masas de sector magnético, de tipo quadrupolo, por tiempo de vuelo, de trampa iónica o por resonancia de ión-ciclotrón con transformada de Fourier, FID (Flammenionisationsdetektor, “detector de ionización de llamas”) o espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier, tras CL por ejemplo por medio de espectrometría de masas de sector magnético, de tipo quadrupolo, por tiempo de vuelo, de trampa iónica o por resonancia de ión-ciclotrón con transformada de Fourier, detección por absorción UV/visible, detección por fluorescencia, espectroscopia de infrarrojos o RMN. Preferiblemente, el procedimiento según la invención comprende una EM (espectrometría de masas), análisis de CL/EM (cromatografía líquida acoplada a una detección por espectrometría de masas en tándem cualquiera), de CG/EM (cromatografía de gases acoplada a una detección por espectrometría de masas cualquiera) y/o de CL/EM/EM (cromatografía de líquidos acoplada a una detección por espectrometría de masas en tándem cualquiera), lo más preferido un análisis de CL/EM, CG/EM y/o CL/EM/EM.

En consecuencia, los extractos según el procedimiento según la invención, pueden fraccionarse y/o separarse tras el secado y la disolución de nuevo en un disolvente o una mezcla de disolventes adecuado, por ejemplo se separan por medio de CL y/o CG y después se analizan, se detectan y se cuantifican las sustancias contenidas, por ejemplo por EM.

Para la realización del análisis de CG, puede realizarse una transesterificación/esterificación con la fase apolar y/o la fase polar, especialmente con metanol o etanol y después una formación de oxima, preferiblemente una metoximación, tal como se describió anteriormente. Preferiblemente pueden añadirse sustancias de patrón, por ejemplo patrones internos y/o de cromatografía, a cada muestra o al extracto respectivo, por ejemplo una solución de hidrocarburos o ácidos grasos lineales, de número impar. Posteriormente tiene lugar una trialquilsililación de los extractos, siendo opcional la oximación y/o la trialquilsililación de la fase apolar.

Estas etapas pueden realizarse tal como se describe en el presente documento, pero también pueden combinarse individualmente con otras etapas, por ejemplo métodos de separación y de análisis, y pueden adaptarse correspondientemente.

En una forma de realización especialmente preferida, el material consiste en material vegetal. La parte esencial del estado de la técnica describe sólo el análisis de líquidos, pero no de material sólido. La preparación de células vegetales se diferencia en este respecto de la de los tejidos o células animales, en que las células animales sólo tienen una membrana celular, sin embargo las células vegetales están rodeadas de una pared celular. Por ejemplo, pueden extraerse especies o poblaciones de plantas, por ejemplo plantas estresadas o modificadas genéticamente. También pueden producirse homogeneizados a partir de una gran cantidad de organismos. Para la comprobación de la sensibilidad, exactitud, precisión, variabilidad y reproducibilidad pueden someterse a prueba soluciones patrón o material mezclado con soluciones patrón en el procedimiento. Para esto pueden añadirse al material orgánico por ejemplo cantidades definidas de sustancias patrón.

Preferiblemente se evalúan automáticamente las informaciones y datos obtenidos mediante el procedimiento según la invención y se guardan en un banco de datos. En el caso de una gran cantidad de muestras se utiliza preferiblemente una identificación de pico y una integración de pico automática de los datos de resultado.

En una forma de realización preferida, el procedimiento según la invención se optimiza hasta alto rendimiento, variabilidad reducida y alta reproducibilidad y contiene preferiblemente las etapas siguientes:

(i)

obtener el material orgánico y refrigerar o congelar en el plazo de 60 s tras la obtención;

(ii)

liofilizar el material;

(iii)

extraer con mezcla de disolventes (A) del 80% en volumen de metanol y del 20% en volumen de agua y mezcla de disolventes (B) del 40% en volumen de metanol y del 60% en volumen de diclorometano y combinar el extracto;

(iv)

añadir los patrones al/a los extracto(s);

(v)

evaporar hasta sequedad los extractos tras la separación de fases y esterificación/transesterificación;

(vi)

realizar una esterificación/transesterificación en las fase apolares con HCl; y

(vii)

analizar los extractos por análisis de EM, CL/EM, CL/EM/EM y/o CG/EM.

Se prefiere especialmente un procedimiento, extrayéndose el material orgánico mediante un ASE. Dado el caso pueden fraccionarse adicionalmente los extractos a través de una extracción en fase sólida.

En otra forma de realización, el procedimiento es parte de un procedimiento para el análisis de un perfil metabólico.

Por consiguiente, la invención se refiere ventajosamente a un procedimiento para la preparación de un perfil metabólico en alto rendimiento, que comprende las etapas de procedimiento según la invención mencionadas anteriormente y la siguiente etapa adicional:

(viii)

analizar los datos de resultado por medio de una identificación de pico y una integración de pico automática.

La determinación de un perfil metabólico complejo de los metabolitos y sustancias contenidas que existen en una muestra orgánica en el caso de una gran cantidad de muestras, posibilita el estudio directo de la influencia directa del estrés, del desarrollo o del crecimiento sobre todo el organismo o partes del mismo y por consiguiente es una parte esencial de los análisis de genoma funcionales en la determinación de funciones génicas. Los procedimientos para el análisis de perfiles de metabolitos complejos, especialmente cuando son adecuados para el análisis de mayores cantidades de muestras, permiten estudiar la complejidad de las interacciones reguladoras a todos los niveles y en todos los estadios así como el efecto de factores tanto exógenos como endógenos.

Así, el procedimiento según la invención puede usarse por ejemplo para estudiar:

a) los efectos de diferencias genéticas en el perfil metabólico,

b) la influencia de por ejemplo las condiciones ambientales, estrés, sustancias químicas, etc,

c) la interacción entre a) y b) o

d) el transcurso temporal de a), b) o c),

tal como por ejemplo en los estudios de la influencia de una o varias sustancias (por ejemplo también bibliotecas de sustancias), o factores de estrés, tales como por ejemplo sequedad, calor, frío, hielo, carencia, sal, ausencia de luz, etc., sobre el perfil metabólico de por ejemplo organismos lo más idénticos posibles genéticamente, relacionados genéticamente hasta lo más diferentes posibles genéticamente.

La presente invención se aclara mediante los ejemplos siguientes, sin que esto sirva como limitativo de alguna manera.

Ejemplo 1

Toma de muestras y almacenamiento de las muestras

La toma de muestras tiene lugar directamente en la cámara fitotrón. Se cortaron las plantas con una tijera de laboratorio pequeña, se pesaron rápidamente en una balanza de laboratorio, se traspasaron a un cartucho de extracción enfriado previamente y se insertaron en una rejilla de aluminio que se enfría con nitrógeno líquido. En caso necesario, pueden almacenarse los cartuchos de extracción en el frigorífico a -80º. El tiempo desde el corte de la planta hasta la congelación en nitrógeno líquido no supera los de 10 a 20 s.

Ejemplo 2

Liofilización

Se prestó atención a que durante el ensayo, las plantas permanecieron hasta el primer contacto con el disolvente o bien en estado a baja temperatura (temperaturas < -40ºC) o bien se liberaron del agua mediante liofilización.

Se colocó la rejilla de aluminio con las muestras de plantas en los cartuchos de extracción, en la instalación de liofilización enfriada previamente (-40ºC). La temperatura de partida durante el secado principal ascendió a -35ºC, la presión ascendió a 0,120 mbar. Durante el secado, se modificaron los parámetros correspondientes a un programa de presión y de temperatura. La temperatura final, tras 12 horas, ascendió a +30ºC, y la presión final se encontró a de 0,001 a 0,004 mbar. Tras desconectar la bomba de vacío y el refrigerador, se ventiló el sistema con aire (secado mediante un tubo secador) o argón.

Ejemplo 3

Extracción

Se traspasaron los cartuchos de extracción con el material de plantas liofilizado, inmediatamente después de la ventilación del aparato de liofilización, a los cartuchos de extracción de 5 ml del ASE.

Se rellenan las 24 posiciones de muestra de un aparato ASE (Accelerated Solvent Extractor ASE 200 ("extractor con disolvente acelerado") con controlador de disolvente y AutoASE-software (empresa DIONEX)) con las muestras de plantas.

Se extrajeron las sustancias polares con aproximadamente 10 ml de metanol/agua (80/20, v/v) a T = 70°C y p = 140 bar, fase de calentamiento durante 5 min., extracción estática durante 1 min. Se extrajeron las sustancias lipófilas con aproximadamente 10 ml de metanol/diclorometano (40/60, v/v) a T = 70°C y p = 140 bar, fase de calentamiento durante 5 min., extracción estática durante 1 min. Se extraen ambas mezclas de disolventes en el mismo tubo de muestras (tubos de centrifugación, 50 ml con tapa de rosca y septum que puede pasarse para el ASE (DIONEX)).

Se mezcló la solución con patrones internos: ribitol, L-glicina-2,2-d_{2}, L-alanina-2,3,3,3-d_{4} y a-metilglucopiranósido y éster metílico del ácido nonadecanoico, éster metílico del ácido undecanoico, éster metílico del ácido tridecanoico, éster metílico del ácido nonacosanoico.

Se mezcló el extracto total con 7 ml de agua. Se rechazaron el residuo sólido de las muestras de las plantas y el cartucho de extracción.

Se agitó el extracto y después se centrifugó a al menos 1400 g durante de 5 a 10 min., para acelerar la separación de las fases. Se tomó 1 ml de la fase metanol/agua superior ("fase polar", incolora) para el análisis de CG adicional, se tomó 1 ml para el análisis de CL. Se rechazó el resto de la fase metanol/agua. Se lavó la fase orgánica de nuevo con el mismo volumen de agua (7 ml) y se centrifugó. Se tomaron 0,5 ml de la fase orgánica ("fase lipídica", verde oscuro) para el análisis de CG adicional., se tomaron 0,5 ml para el análisis de CL. Se evaporaron todas las alícuotas separadas con el evaporador a vacío infrarrojo IR-Dancer (Bettich) hasta sequedad. A este respecto, la temperatura máxima durante el proceso de evaporación no sobrepasó 40ºC. La presión en el aparato ascendió a no menos que 10 mbar.

Ejemplo 4

Procesamiento adicional de la fase líquida para los análisis de CL/EM o CL/EM/EM

Se absorbió el extracto lipídico evaporado hasta sequedad en un eluyente. Se realizó la serie de HPLC con una elución por gradiente.

Ejemplo 5

Procesamiento adicional de la fase polar para los análisis de CL/EM o CL/EM/EM

Se absorbió el extracto polar evaporado hasta sequedad en un eluyente. Se realizó la serie de HPLC con una elución por gradiente.

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Ejemplo 6

Derivatización de la fase lipídica para el análisis de CG/EM

Para obtener la transmetanolisis, se añadió una mezcla de 140 \mul de cloroformo, 37 \mul de ácido clorhídrico (HCl al 37% en peso en agua), 320 \mul de metanol y 20 \mul de tolueno al extracto evaporado. Se cerró el depósito de manera impermeable y se calentó con agitación durante 2 h a 100ºC. Posteriormente se evaporó hasta sequedad la solución. Se secó el residuo completamente.

La metoximación de los grupos carbonilo tuvo lugar mediante la reacción con clorhidrato de metoxiamina (5 mg/ml en piridina, 100 \mul) durante 1,5 h a 600ºC en el depósito cerrado de manera impermeable. Se añadieron como patrones de tiempo 20 \mul de una solución de ácidos grasos de lineales, de número impar. Posteriormente se derivatizaron con 100 \mul de N-metil-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamida (MSTFA) durante 30 min. a 60ºC en el depósito cerrado de manera impermeable de nuevo. El volumen final antes de la inyección de CG fue de 200 \mul.

Ejemplo 7

Derivatización de la fase polar para el análisis de CG/EM

La metoximación y la trimetilsililación con MSTFA tuvieron lugar tal como para la fase lipídica descrita.

Claims (15)

1. Procedimiento para el aislamiento de sustancias contenidas a partir de material orgánico, que comprende las etapas de procedimiento siguientes:

a)

liofilizar el material orgánico;

b)

extraer las sustancias contenidas con un disolvente o una mezcla de disolventes polar (A) y un disolvente o una mezcla de disolventes orgánico (B), pudiendo formar los extractos combinados a partir de extraer con (A) y (B), una fase y siendo el disolvente o la mezcla de disolventes (B) más apolar, que el disolvente o la mezcla de disolventes (A).;

c)

combinar los extractos a partir de extraer con (A) y (B) para dar una fase y separación posterior en una fase polar y una fase apolar; y

d)

realizar una esterificación/transesterificación en la fase apolar con un alcohol.,

realizándose la esterificación/transesterificación en presencia de un ácido volátil; siendo el procedimiento un procedimiento de alto rendimiento.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, componiéndose el disolvente o mezcla de disolventes polar (A), de una mezcla de una única fase del 50 al 90% en volumen de alcohol alquílico de C_{1} a C_{6}, del 10 al 50% en volumen de agua y del 40 al 0% en volumen de un disolvente o una mezcla de disolventes adicional.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, componiéndose el disolvente o mezcla de disolventes orgánico (B), de una mezcla de una única fase del 30% en volumen al 60% en volumen de alcohol alquílico de C_{1} a C_{6}, del 40% en volumen al 70% en volumen de cloroformo o diclorometano y del 0% en volumen al 30% en volumen de un disolvente o una mezcla de disolventes adicional.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 3, realizándose la extracción por medio de extracción con disolventes acelerada, extracción con líquidos presurizados, extracción con fluidos presurizados, extracción ultrarrápida, por ondas de choque o por microondas, o por medio de un molino con agitación o ultraturrax.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, realizándose la extracción a una temperatura de 0ºC a 200ºC y/o a de 40 bar a 200 bar.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, usándose como ácido volátil para la esterificación/transes-
terificación HCl, HBr, BF_{3}, BCl_{3}, ácido trifluoroacético, ácido tricloroacético o HI.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, usándose como componente alcohólico para la esterificación/transesterificación un alcohol alquílico saturado o insaturado, lineal, ramificado o en forma de anillo con de 1 a 8 átomos de carbono.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, derivatizándose, cromatografiándose y/o analizándose las sustancias contenidas en una o varias etapas adicionales.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, conteniendo el procedimiento al menos una de las etapas adicionales:

i)

congelar el material;

ii)

homogeneizar y/o dispersar el material;

iii)

evaporar hasta sequedad los extractos tras la separación de fases y/o tras la esterificación/transesterificación;

iv)

realizar una formación de oxima en la fase apolar;

v)

realizar una formación de oxima en la fase polar;

vi)

realizar una trialquilsililación en la fase apolar; o

vii)

realizar una trialquilsililación en la fase polar.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, siendo la trialquilsililación una trimetilsililación.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, mezclándose los extractos o los extractos combinados con uno o varios patrones de análisis.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, analizándose las fases en cada caso a través de un análisis de CL, EM, CG, CL/EM, CG/EM y/o de CL/EM/EM.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, conteniendo los disolventes o las mezclas de disolventes usados para la extracción, adicionalmente además hasta el 5% en peso de sales tampón, ácidos y/o bases.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, consistiendo el material en material vegetal.

15. Procedimiento para la preparación de un perfil metabólico en alto rendimiento, que comprende las etapas de procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14 y la siguiente etapa adicional:

(viii)

analizar los datos de resultado por medio de una identificación de pico y una integración de pico automática.