PT1446210E - Processo para a extracção e para a analise de componentes de material orgânico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A EXTRACÇÃO E PARA A ANÁLISE DE COMPONENTES DE MATERIAL ORGÂNICO" A presente invenção é relativa a um processo para o isolamento de componentes de material orgânico, processo esse que abrange as seguintes etapas processuais: a) liofilização do material orgânico; b) extracção dos componentes com um solvente polar ou com uma mistura de solventes polar (A), e com um solvente orgânico ou com uma mistura de solventes orgânica (B), podendo os extractos juntados da extracção com (A) e (B) formar uma fase e sendo o solvente ou a mistura de solventes (B) mais apoiar do que o solvente ou a mistura de solventes (A) ; c) junção dos extractos da extracção com (A) e (B) numa fase e posterior separação numa fase polar e numa fase apoiar; e d) realização de uma esterificação/transesterificação na fase apoiar com um álcool, sendo a esterificação/transesterificação realizada na presença de um ácido volátil; e sendo o processo um processo de elevado rendimento. A compreensão das vias de síntese bioquímicas no metabolismo de células animais ou vegetais, inclusive de microorganismos como bactérias, fungos, algas ou células de 2 mamíferos, é ainda muito rudimentar apesar do conhecimento acerca das vias de síntese principais. A determinação de estados fisiológicos durante o crescimento, o desenvolvimento, ou como reacção ao stress ambiental está até aos dias de hoje essencialmente restringida ao estudo de moléculas alvo individuais, tais como, por exemplo, ARN e proteínas. Contudo, é com frequência que as alterações do nível proteico ou de ARNm ou da respectiva actividade não podem ser correlacionadas com alterações no metabolismo ou de todo com funções fenotípicas. A análise directa de componentes celulares ou de metabólitos ocorre frequentemente ou por reacções enzimáticas específicas, por imunoensaios ou com base em processos cromatográficos, que identificam determinadas substâncias com base em tempos de reacção ou de coeluições com substâncias de referência. Como descrito in Ratona, "J. Chromatography" 1999, 847, 91 - 102, uma grande parte do estado da técnica trata apenas da análise de poucos componentes específicos, como, por exemplo, ácidos ou açúcares.

Apenas nos inícios é mostrado que os produtos metabólicos ou os metabólitos não representam apenas produtos intermediários e produtos finais, actuando em vez também como sensores e reguladores. A análise de perfis metabólicos complexos ou de componentes em organismos ganha assim um grande significado na atribuição de funções dos genes, na avaliação de influências de stress e, não por último, na avaliação da segurança e do valor de organismos geneticamente modificados.

No entanto, de modo a ser possível estudar estas relações, 3 é normalmente necessário estudar com o maior grau possível de detalhe e de forma reproduzível os sistemas orgânicos sob as mais variadas condições, de modo a, por exemplo, se conseguir reconhecer níveis de variabilidade genética ou diversas influências internas ou externas. No entanto, isto requer forçosamente uma análise dum grande número de amostras. A maior progressão ocorreu na determinação de perfis complexos de metabólitos (independentemente de se esta determinação se restringe a diversas classes de substâncias, etapas de desenvolvimento ou tipos de material, ou seja, independentemente de se se trata de impressões digitais metabólicas, profiling metabólico ou metabolomics (análise de todos os metabólitos do organismo) em exames de diagnóstico, tendo-se contudo também apenas descrito perfis de plantas (para um panorama geral ver Trethewey, "Curr. Opin. Plant. Biol." 1999, 2_, 83 - 85). Assim, Sauter [ACS Symposium Series 1991, 443 ("Synth. Chem. Agrochem." 2), American Chemical Society, Washington, DC, 288 - 299] mostra a alteração de componentes na cevada, depois do tratamento com diversos herbicidas. Foi possível detectar entre 100 e 200 sinais e identificá-los recorrendo a substâncias de referência, através dos respectivos coeficientes de retenção na cromatografia gasosa (GC) ou através de análise de espectrometria de massa-cromatografia gasosa (GC/ms).

Fiehn, "Nature Biotechnology" 2000, 1_8, 1157 - 1161, descreve a quantificação de 326 substâncias em extractos de folha de Arabidopsis thaliana. Para a comparação de quatro genótipos diferentes, homogeneizou-se, num processo dispendioso, amostras de plantas congeladas, extraiu-se em 4 97% de vol. de metanol e obteve-se, depois da adição de clorofórmio e de água em várias etapas, uma fase polar e uma fase apoiar, que foram depois analisadas por LC/MS e GC/MS (ver Fiehn, "Anal. Chem." 2000, 72, 3573 - 3580; http://www.mpimp-golm.mpg.de/fiehn/blatt-protokolle.htrnl). De acordo com um processo muito semelhante, Roessner, "The Plant Journal" 2000, 23, 131 - 142, extrai componentes vegetais em metanol e compara os perfis de metabólitos polares de plantas da batata criadas in vitro e na terra.

Gilmour, "Plant Physiology" 2000, 124, 1854 - 1865, extrai açúcares de folhas liofilizadas de cinco variedades diferentes de Arabidopsis em 80% de etanol, depois da incubação durante 15 min nos 80°C e depois da incubação durante a noite nos 4°C. Igualmente nos 80°C durante 30 min e em 80% de etanol com Hepes, pH de 7,5, Strand, "Plant

Physiology" 1999, 119, 1387 - 1397, extrai duas vezes consecutivas amido e açúcares solúveis. A esta temperatura elevada, extrai-se ainda duas vezes, de modo a melhorar o resultado de extracção, e uma vez com 50% de etanol-Hepes, pH de 7,5, e uma vez com Hepes, pH de 7,5.

Os processos descritos no estado da técnica permitem apenas uma automatização limitada, a qual além disso apenas pode ser concretizada com elevados custos técnicos. Em particular a tomada de grandes números de amostras, a determinação da influência de inúmeros factores de stress sobre o metabolismo dos organismos ou a observação de processos dinâmicos, que requer uma análise continua de amostras em janelas de tempo com frequência muito pequenas, pedem processos: (a) que sejam rápidos, ou seja e por exemplo, que a 5 fixação de amostras e a análise de amostras ocorra dentro de um curto intervalo de tempo depois da obtenção das amostras, (b) que sejam de elevada reproducibilidade, ou seja e por exemplo, que uma análise de muitas amostras diferentes forneça resultados dentro de um reduzido espectro de erro, (c) que sejam de manuseamento simples, ou seja e por exemplo, que o processo seja passivel de automatização e possa ser levado a cabo sem elevados custos técnicos e de pessoal, (d) que sejam abertos, ou seja e por exemplo, que seja possivel analisar um grande número de substâncias, e/ou (e) que sejam sensíveis, ou seja e por exemplo, que a análise também recolha pequenas alterações nas concentrações das substâncias e pequenas quantidades de substâncias.

No caso de um maior número de amostras, é particularmente necessário que a estabilidade das amostras e, com isso, a reproducibilidade dos resultados, sejam garantidas. Uma análise abrangente continua de material biológico, por exemplo, de amostras animais ou de amostras vegetais, ou, por exemplo, a interacção entre a substância ou as substâncias e os organismos em sistemas complexos e a respectiva evolução no tempo, não é assim possivel com os processos conhecidos do estado da técnica. 0 problema técnico na base da presente invenção foi, por conseguinte, o de arranjar um processo que permitisse ultrapassar as desvantagens acima mencionadas dos processos conhecidos do estado da técnica, e que permitisse analisar 6 de forma rápida e simples sobretudo um maior número de amostras com uma elevada sensibilidade e reproducibilidade. A resolução do problema é dada pelas formas de execução caracterizadas nas reivindicações da presente invenção.

Em seguida, o pedido é relativo a um processo para o isolamento de componentes de material orgânico, o qual abrange as seguintes etapas processuais: a) liofilização do material orgânico; b) extracção dos componentes com um solvente polar ou com uma mistura de solventes polar (A), e com um solvente orgânico ou com uma mistura de solventes orgânica (B), podendo os extractos juntos da extracção com (A) e (B) formar uma fase, e sendo o solvente ou a mistura de solventes (B) mais apoiar do que o solvente ou a mistura de solventes (A) ; c) junção dos extractos da extracção com (A) e (B) numa fase e posterior separação numa fase polar e numa fase apoiar; e d) realização de uma esterificação/transesterificação na fase apoiar com um álcool, sendo a esterificação/transesterificação realizada na presença de um ácido volátil; e sendo o processo um processo de elevado rendimento. 0 conceito "material orgânico" trata-se de todo o material orgânico ou biológico, como o material de plantas, animais, 7 microorganismos, por exemplo, de protistas, fungos, bactérias, algas, vírus, etc., por exemplo, de organismos separados de material de cultura, líquidos corporais como sangue, linfa, secreções ou nutrientes, forragens e outros produtos animais ou vegetais. Do mesmo modo, trata-se de material de cultura em que vivem organismos, ou seja e por exemplo, também depois da separação dos organismos, por exemplo, os meios para a cultura de microorganismos, tais como protistas, por exemplo, cinetoplastos, plasmódios ou bactérias, por exemplo, bactérias gram-positivas ou gram-negativas, ou algas, fungos, por exemplo, leveduras, ou células animais ou vegetais. 0 conceito "extracção" ou "extrair" trata-se, segundo a invenção, de passar - a partir de uma amostra sólida ou líquida com solventes ou misturas de solventes apoiares a polares - as substâncias aí contidas, por exemplo, componentes de material orgânico, para o respectivo solvente ou para a respectiva mistura de solventes. Num solvente polar, como, por exemplo, a água, dissolvem-se os componentes hidrófilos, por exemplo, também os metabólitos; num solvente lipófilo dissolvem-se os componentes hidrófobos, por exemplo, também os metabólitos, do material. "Solventes ou misturas de solventes polares" trata-se de um solvente ou de uma mistura de solventes com um índice de polaridade de 4 a 10,2, de preferência de 5 a 7, com maior preferência de 5,5 a 6,5 de acordo com Kellner, "Analytical Chemistry", Weinheim, 1998, pág. 195. Os solventes polares são, por exemplo, água, inclusive soluções aquosas ou solventes orgânicos próticos ou apróticos polares, por exemplo, álcoois alquílicos com um radical alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, como, por exemplo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol, ou, por exemplo, acetona, acetonitrilo, éster de etilo do ácido acético, sulfóxido de dimetilo ou Ν,Ν-dimetilformamida, ou outros solventes com uma polaridade superior ou igual a 0,50, como, por exemplo, indicado in Kuster/Thiel, "Rechentafeln fur die Chemische Analytik", Walter de

Gruyter, Berlim/Nova Iorque 1993, pág. 359, ou são misturas destes . Uma mistura de solventes empregue segundo a invenção de 80% de metanol/20% de água tem assim, por exemplo, o indice de polaridade de 6,1 de acordo com Kellner, 1998 .

Um "solvente apoiar" ou uma "mistura de solventes apoiar" trata-se de um solvente ou de uma mistura de solventes que apresenta uma polaridade mais baixa ou um índice de polaridade mais baixo do que o solvente ou a mistura de solventes (A), e em que podem ser melhor extraídas as substâncias semipolares a apoiares, em particular o solvente ou a mistura de solventes com um índice de polaridade de acordo com Kellner, "Analytical Chemistry", Weinheim, 1998, pág. 195, que é inferior em 0,3 ou menos ao do meio de extracção da fase polar. É dada maior preferência ao índice de polaridade de acordo com Kellner, 1998, de 0,5, com ainda maior preferência de 1, com total preferência em mais de 2 inferior ao do meio de extracção da fase polar. Em seguida, o índice de polaridade do solvente apoiar tem com particular preferência um valor de 5,5 a 1, com maior preferência de 5 a 2, com total preferência de 4,5 a 3,5 de acordo com Kellner, 1998. Uma mistura de solventes, empregue segundo a invenção, de 40% de metanol/60% de diclorometano tem assim, por exemplo, um índice de polaridade de 3,9 de acordo com Kellner, 1998. 9 "Solventes apoiares" são, por exemplo, solventes orgânicos, ou solventes contendo halogéneo como clorofórmio, diclorometano, tetracloreto de carbono ou solventes alifáticos tais como hexano, ciclo-hexano, pentano, heptano, etc., ou solventes aromáticos, como, por exemplo, tolueno ou benzeno, ou éteres, como, por exemplo, éter terc.-butilmetílico, éter dietílico ou tetra-hidrofurano, ou outros solventes com uma polaridade inferior a 0,50, como, por exemplo, indicado em Kuster/Thiel 1993, ou misturas destes.

Uma "fase polar" ou um "extracto polar" trata-se de uma fase ou de um extracto que se obtém a partir de uma extracção com um solvente ou com uma mistura de solventes com um índice de polaridade de 4 a 10,2, de preferência de 5 a 7, com maior preferência de 5,5 a 6,5 de acordo com Kellner, "Analytical Chemistry", Weinheim, 1998, pág. 195, ou a partir de uma extracção com um solvente polar ou com uma mistura de solvente polar como acima mencionado.

Uma "fase apoiar" ou um "extracto apoiar" trata-se de uma fase ou de um extracto que apresenta uma polaridade mais baixa ou um índice de polaridade mais baixo em relação à fase polar, e no qual ou na qual se podem extrair melhor substâncias semipolares a apoiares, como, por exemplo, no caso duma extracção com solventes apoiares ou misturas de solventes apoiares como acima referido. Em conformidade com a invenção, obtém-se uma "fase apoiar" ou um "extracto apoiar" por meio da extracção com um solvente ou com uma mistura de solventes com um índice de polaridade de acordo com Kellner, "Analytical Chemistry", Weinheim, 1998, pág. 195, que é inferior em 0,3 ou mais ao do meio de extracção da fase polar/do extracto polar. Maior preferência é dada 10 ao índice de polaridade de acordo com Kellner, 1998, de 0,5, com ainda maior preferência de 1, com total preferência inferior em mais de 2 ao do meio de extracção da fase polar. O conceito "componentes" trata de compostos polares e apoiares, como, por exemplo, "metabólitos", originados nas reacções de degradação e de síntese (reacções catabólicas ou reacções anabólicas) do metabolismo ou que são tomados pelos organismos a partir do respectivo ambiente. Isto diz respeito a compostos que se encontram a nível celular ou também a nível extracelular em organismos mais complexos, por exemplo, em líquidos corporais. Na cultura de microorganismos ou de outros organismos estão também englobados os componentes destas culturas, como, por exemplo, o meio de crescimento. A concentração de um componente é influenciada por agentes externos (condições ambientais, condições nutricionais, situações de stress) ou por condições internas (desenvolvimento, regulações, alterações do foro genético), subjacentes aos organismos. O conceito abrange tanto os denominados metabólitos primários como também os metabólitos secundários. Os "metabólitos primários" tratam-se, normalmente, daqueles metabólitos que são produtos de vias de degradação e de síntese, que têm um significado fundamental para a célula e que, com isso, são mais ou menos iguais para todas as células. Os "metabólitos secundários" tratam-se normalmente de compostos que são em geral formados por vias secundárias, como, por exemplo, no caso de situações de stress, tais como condições de fome e de carência ou depois de acabada a fase de crescimento activa da célula, e para os quais em muitos casos não se conhece uma função reconhecível para a célula (ver "Rõmpp Lexikon Biotechnologie", Nova Iorque, 1992). Por 11 conseguinte, os componentes tratam-se, por exemplo, de substâncias polares ou apoiares, tais como hidratos de carbono, aminas (em particular aminoácidos), tetrapirróis, lipidos, esteróides, nucleótidos, nucleósidos, cofactores, coenzimas, vitaminas, antibióticos, hormonas, péptidos, terpenos, alcaloides, carotenóides, xantófilas, flavonóis, etc. e as substâncias das respectivas vias metabólicas, sem se dever considerar a enumeração anterior ou seguinte de forma alguma como restritiva.

Os hidratos de carbono incluem, por exemplo, os hidratos de carbono do metabolismo dos hidratos de carbono, como, por exemplo, glicólise, gluconeogénese, por exemplo, trioses, tetroses, pentoses, por exemplo, furanoses ou hexoses, por exemplo, piranoses ou heptoses, do metabolismo dos polissacáridos ou do metabolismo do piruvato, do metabolismo de acetil-coenzima A, dissacáridos ou oligossacáridos, glicósidos, derivados de hexose, desoxi-hexoses, hidratos de carbono do metabolismo da pentose, do metabolismo dos aminoaçúcares, do ciclo citrato do metabolismo do glioxilato, etc., ou outras substâncias das respectivas vias metabólicas.

Os aminoácidos incluem, por exemplo, os aminoácidos do metabolismo de aminoácidos, como, por exemplo, no metabolismo do amoníaco, ou do metabolismo do enxofre, do ciclo da ureia ou dos respectivos derivados, por exemplo, aminoácidos aromáticos ou não aromáticos, aminoácidos sem carga polares, não polares, alifáticos, aromáticos, de carga positiva, de carga negativa, aminoácidos essenciais ou não essenciais de cadeia ramificada ou não ramificada ou outras substâncias das respectivas vias metabólicas. 12

Os tetrapirróis abrangem, por exemplo, substâncias do metabolismo da protoporfirina, do metabolismo da hemoglobina, do metabolismo da mioglobina, dos diferentes metabolismos do citocrómio, dos metabolismos da fotossintese, etc., ou outras substâncias das respectivas vias metabólicas.

Os lipidos incluem, por exemplo, ácidos gordos essenciais ou não essenciais, saturados ou insaturados, compostos de acil-CoA, glicéridos de triacilo, lipidos da lipogénese ou da lipólise, fosfolipidos, por exemplo glicerofosfolipidos, lipidos de éteres, esfingofosfolipidos, glicolipidos ou as substâncias das respectivas vias metabólicas.

As hormonas incluem hormonas esteróides ou não esteróides, por exemplo hormonas peptidicas ou, por exemplo, eicosanóides.

Os esteróides incluem, por exemplo, as substâncias do metabolismo da colesterina, hopanóides, esteróides vegetais, como fitosterinas e micosterinas, hormonas de insectos, isoprenóides, hormonas esteróides, gestagénios, androgénios, estrogénios, corticoesteróides ou as substâncias das respectivas vias metabólicas.

Os nucleótidos e os nucleósidos incluem, por exemplo, desoxinucleótidos/ desoxinucleósidos e ribonucleótidos/ ribonucleósidos, os respectivos derivados de 5'-fosfato, purinas, pirimidinas ou os respectivos derivados, como, por exemplo, derivados de nucleósidos ou de nucleótidos ciclizados, metilados e/ou acetilados, etc., ou outras substâncias das respectivas vias metabólicas. 13

Também estão incluídas as substâncias que desempenham um papel nestas vias metabólicas. "Outras substâncias das respectivas vias metabólicas" tratam-se dos respectivos produtos intermediários na biossíntese, na transformação, transporte ou degradação das substâncias referidas. Um panorama geral de muitos metabólitos encontra-se, por exemplo, in Michal, "Biochemical Pathways", Berlim, 1999 ou in KEGG, "Kyoto Enzyclopedia of Genes and Genomes", Institute of Chemical Research at Kyoto University, Japão (por exemplo, http: / /www. genome. ac;. jp/dbget. /liqand. html), que são aqui expressamente incluídos. 0 conceito "água" trata-se de todo o tipo de solução aquosa, também, por exemplo, água desionizada, desmineralizada, destilada ou bidestilada. É igualmente possível que uma ou mais substâncias esteja ou estejam dissolvidas na água e assim misturadas, as quais melhorem preferencialmente a extracção, a estabilidade ou a solubilidade dos componentes do material orgânico, ou que levem a propriedades preferidas, por exemplo, valor de pH, condutibilidade, concentração salina, etc., como, por exemplo em soluções salinas ou em soluções tampão. "Ácido volátil" trata-se de um ácido que pode ser preferencialmente removido de forma substancial - ou seja, até pelo menos 80%, de preferência até 90%, com maior preferência até 95% ou mais, com total preferência na totalidade, por concentração por evaporação. O processo de acordo com a invenção adequa-se em particular como processo de elevado rendimento à extracção de material orgânico e às derivação e análise dos extractos de um grande número de amostras, em particular de amostras 14 vegetais .

Os processos descritos no estado da técnica requerem o congelamento e a pulverização mecânica das amostras ultracongeladas, a separação da fase orgânica da fase aquosa na produção de extractos totais, que abrangem tanto os metabólitos lipófilos como os metabólitos polares, e etapas de lavagem abrangentes de uma fase orgânica com uma solução aquosa para a remoção do ácido, com posterior remoção dispendiosa de água do solvente orgânico e, eventualmente, filtração do material de amostra; etapas que podem ser passíveis de automatização com dispêndio de tempo e apenas com elevados custos técnicos, isto se de todo (Fiehn, "Anal. Chem." 2000 e "Nature Biotechnology" 2000). Apenas o processo segundo a invenção revela as etapas processuais fundamentais que permitem uma automatização eficiente e abrangente, em ligação com uma aceleração do processo.

Com vantagem impede-se, no processo segundo a invenção, que decorram processos enzimáticos nas amostras até à extracção, os quais alterem o espectro de componentes, afectando assim a reproducibilidade e a precisão dos resultados de medição. Por conseguinte, constitui uma vantagem particular que, numa etapa processual, o material seja liofilizado. Através da liofilização, retira-se a água do material, inibindo-se os processos enzimáticos. A utilização da liofilização constitui ainda uma vantagem económica e ecológica, dado que as amostras assim trabalhadas podem ser conservadas à temperatura ambiente e continuar a ser processadas. Isto não permite apenas um processamento automático e uma análise da amostra de forma mais simples e barata a nível técnico, mas poupa também 15 custos energéticos, visto que se pode prescindir de um circuito de refrigeração constante.

Além disso, constitui uma vantagem que, no processo segundo a invenção, os extractos juntados formem uma fase. A vantagem da boa remistura de fase única dos dois extractos antes da separação de fase, é a de que os restos de substâncias polares passem da extracção apoiar à fase polar e o contrário, os restos de compostos apoiares da fase polar passem à respectiva fase apoiar. Deste modo, aumenta-se a sensibilidade, exactidão, a precisão, a variabilidade e a reproducibilidade de um processo de elevado rendimento.

As extracções com solvente ou com mistura de solventes (A) e (B) levam, após a extracção, a uma fase polar e a uma fase apoiar, e podem ser levadas a cabo em paralelo - por exemplo, se a amostra for primeiro dividida e depois os extractos forem por sua vez produzidos - ; ou consecutivamente - por exemplo, se as mesmas amostras forem tratadas depois da separação do primeiro meio de extracção com um segundo meio de extracção, sendo tanto possível a sequência (A) (B) como a sequência (B)(A), e sendo igualmente possíveis etapas intermédias. Também é possível combinar as etapas com outras etapas. É dada total preferência à sequência (A)(B).

Depois da junção das duas fases numa fase, as mesmas podem voltar a ser separadas pelo processo conhecido do especialista, numa fase polar e numa fase apoiar; ver, por exemplo, Bligh und Dyer, "Can. J. Biochem. Physiol." 1959, 37, 911 - 917, através, por exemplo, da adição de um solvente apoiar, em particular de um solvente orgânico apoiar (por exemplo, diclorometano) como acima descrito, ou 16 de um solvente ou de uma mistura de solventes polar como acima descrito, em particular de uma solução aquosa, por exemplo, de um tampão, ou através da adição tanto de um solvente ou de uma mistura de solventes apoiar, como dum solvente ou duma mistura de solventes polar. Preferencialmente, consegue-se a separação de fase através da adição de um solvente utilizado na extracção, em particular metanol, diclorometano e/ou água. A utilização de um ácido volátil, de preferência muito volátil, na esterificação/transesterificação na fase polar, como, por exemplo, HC1, trata-se de outra etapa essencial do processo segundo a invenção. Em conformidade com a invenção, o ácido utilizado tem uma pressão de vapor mais baixa do que o solvente utilizado ou os componentes da mistura de solventes ou um azeótropo possivel de todos os componentes ou de uma parte dos componentes, incluindo o próprio ácido. Ao contrário do processo descrito no estado da técnica, a utilização de ácidos voláteis permite que, através da concentração por evaporação, os restos de ácidos possam ser removidos de forma rápida e automatizável, enquanto que, no estado da técnica, os restos de ácido têm de ser removidos por etapas de lavagem com posterior secagem, por exemplo, com um sicativo como o sulfato de sódio, e filtração. Como solvente, é possível empregar na esterificação/transesterificação um álcool alquílico com um radical alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, como acima descrito, opcionalmente com um teor dum solvente inerte ou de uma mistura de solventes inerte, como, por exemplo, clorofórmio, diclorometano, benzeno e/ou tolueno. É dada particular preferência a uma mistura de clorofórmio, metanol, tolueno e ácido clorídrico. 17 A esterificação/transformação pode ser realizada no processo segundo a invenção, na fase polar e/ou apoiar da extracção. Em termos preferenciais, a esterificação/transesterificação é apenas realizada na fase apoiar. Preferencialmente, a esterificação/transesterificação de acordo com a invenção dos componentes ou de uma partes dos componentes que foram extraídos, é realizada com um álcool alquilico saturado ou insaturado, de cadeia linear, de cadeia ramificada ou em anel, com 1 a 8 átomos de carbono, como, por exemplo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol, etc.. Prefere-se metanol ou etanol, sobretudo o metanol. A temperatura de reacção encontra-se preferencialmente compreendida entre 70 e 150°C, com maior preferência entre 90 e 120°C, com total preferência nos 100°C. Preferencialmente, o tempo de reacção encontra-se entre 0,5 h e 4 h, com maior preferência entre 1 h e 3 h. É possível adicionar outros solventes que são inertes na reacção, como, por exemplo, tolueno, diclorometano, benzeno e/ou clorofórmio. Também é possível utilizar misturas dos álcoois e/ou solventes inertes. A solução também pode conter 0% de vol. a 20% de vol. de água, de preferência menos de 10% de vol., com maior preferência menos de 5% de vol.. Em termos preferenciais, o teor de outros solventes, além dos álcoois mencionados, é de 0% de vol. a 20% de vol., de preferência menos de 10% de vol., com total preferência 0% de vol..

Em conformidade com a invenção, a esterificação/transesterificação é realizada com um ácido volátil.

Os processos descritos no estado da técnica não se adequam 18 ou adequam-se apenas de forma limitada a uma extracção de alto rendimento de metabólitos de material orgânico. As extracções de diagnóstico conhecidas são em primeira linha relativas a exames de líquidos, como, por exemplo, da urina, pelo que estes processos não são adequados à preparação de amostras sólidas, em particular de amostras de células de plantas. 0 processo de acordo com a invenção está optimizado para o alto rendimento e para a utilização de robótica, a proporção de trabalhos manuais está reduzida em pelo menos 10%, de preferência 20%, com maior preferência em mais de 30%, com total preferência em pelo menos 50%, em comparação com o estado da técnica, em particular em comparação com os processos que têm em parte ou não têm de todo as etapas (a) a (d) nesta forma.

Com vantagem, reduz-se com o processo segundo a invenção e com a possibilidade daí resultante de automatização e de robótica, a taxa de troca indevida de amostras em mais de 10%, com maior preferência em mais de 20%, com ainda maior preferência em mais de 30%, com total preferência em mais de 50% em comparação com o estado da técnica, em particular em comparação com os processos que têm parcialmente ou não têm de todo as etapas (a) a (d) nesta forma. Do mesmo modo, atinge-se com as etapas processuais segundo a invenção numa análise de alto rendimento, uma reproducibilidade claramente maior. A reproducibilidade aumentada do processo segundo a invenção é caracterizada pela variabilidade analítica reduzida em pelo menos 10%, de preferência 20%, com maior preferência pelo menos 30%, com total preferência pelo menos 50%, em comparação com o estado da técnica, em particular em comparação com os processos que têm 19 parcialmente ou não têm de todo as etapas (a) a (d) nesta forma. Constitui ainda uma vantagem que, através das formas de execução aqui descritas do processo conforme a invenção, se regista um espectro maior em mais de 5%, de preferência em 10%, com maior preferência em 20%, com ainda maior preferência em 50%, de componentes do que com o estado da técnica, em particular em comparação com os processos que têm parcialmente ou não têm de todo as etapas (a) a (d) nesta forma.

Em termos preferenciais, a mistura (A) é uma mistura de álcool/água com 10% de vol. ou menos, de preferência 0% de vol. de outros solventes ou misturas de solventes.

As substâncias polares são normalmente extraídas no estado da técnica em álcoois alquílicos puros ou misturados com água ou soluções tampão, como etanol (Sauter, 1991, Strand, 1999, Gilmour, 2000) ou metanol (Fiehn, "Anal. Chem." 2000 e "Nature Biotechnology" 2000, Roessner, 2000) ou em água ou soluções tampão. A água tem propriedades de extracção muito boas para as substâncias polares. No entanto, há aqui a desvantagem de, nas soluções aquosas, voltarem a ser activados os processos celulares que normalmente foram antes interrompidos por congelamento ou liofilização. Isto pode provocar, por exemplo, uma degradação ou uma restruturação enzimática de diferentes metabólitos e leva a uma alteração e, com isso, a uma incorrecção das concentrações ou das relações dentro destes extractos. Tenta-se normalmente impedir estas reacções secundárias indesejadas pelo trabalho em gelo. Contudo, isto tem desvantagens consideráveis tanto para a eficiência de extracção, como também para o processamento 20 final de maiores números de amostras. A perda de sensibilidade e o desvio do estado celular real até o momento da colheita são inevitáveis.

Utiliza-se o etanol ou o metanol devido a, por um lado, terem propriedades polares, extraindo-se assim em suficiente grau componentes hidrófilos, e, por outro, devido a, depois da adição a um extracto celular, os extractos celulares serem inibidos na respectiva actividade devido ao efeito tóxico e desnaturante do álcool. Deste modo, não pode haver mais transformação dos metabólitos e as células são "congeladas" no seu estádio metabólico momentâneo. No entanto, constitui uma desvantagem que algumas classes de metabólitos polares sejam apenas de má dissolução em metanol ou etanol. Isto leva a uma perda de sensibilidade e também pode influenciar a reproducibilidade dos resultados. É dada preferência à utilização de metanol ou de etanol como álcool alquilico, com maior preferência à utilização de metanol. Em termos preferenciais, a mistura tem um índice de polaridade de 4 a 10,2, com especial preferência de 5 a 7, com total preferência de 5,5 a 6,5, de acordo com Kellner, 1998.

Numa forma particularmente preferida de execução, a mistura de solventes polar (A) consiste numa mistura de fase única de 50 a 90% de vol. de álcool alquilico Ci a C6, como, por exemplo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol ou hexanol, e 10 a 50% de vol. de água.

Numa forma particularmente preferida de execução, a mistura de fase única de acordo com a invenção consiste em pelo 21 menos 50% de vol. de metanol, 10% de vol. a 50% de vol. de água, de preferência somente em metanol e/ou água, não contendo a mistura mais de 50% de vol. de água. Esta etapa do processo segundo a invenção leva a uma maior rendimento do que numa extracção em etanol ou metanol puro. Além disso, aumenta-se a estabilidade do extracto em comparação com uma extracção pura em água, melhorando-se com isso de forma essencial a reproducibilidade do processo. Ao contrário da extracção com misturas de etanol/água, o rendimento é tão elevado, que uma única etapa de extracção é quanto basta para isolar um grande número de componentes. Nos processos que se baseiam na etapa de extracção de acordo com a invenção para o isolamento de substâncias polares de células de plantas, o número de substâncias analisadas foi apenas limitado pelo processo de análise. Foi possível atingir um nível de reproducibilidade muito elevado.

Em termos preferenciais, a mistura tem um teor de pelo menos 70% de vol. a 90 % de vol. de metanol, com maior preferência de 75% de vol. a 85% de vol., com total preferência 80% de vol. de metanol. Igualmente preferidos são 10% de vol . a 50% de vol. de água. É dada maior preferência a menos de 40% de vol. de água, com ainda maior preferência menos de 30% de vol. de água. É dada total preferência a 15% de vol. a 25% de vol. de água. Em seguida, o processo segundo a invenção é preferencialmente levado a cabo com uma mistura de 80% de vol. de metanol e 20% de vol. de água. Eventualmente, a mistura também pode conter baixas quantidades de outro solvente ou de outra mistura de solventes, como, por exemplo, diclorometano, mas, em termos preferenciais, menos de 10% de vol., com maior preferência menos de 5% de vol., e, com total 22 preferência, não há outro solvente na mistura. Em conformidade com a invenção, o solvente ou a mistura de solventes (B) trata-se de um solvente orgânico ou de uma mistura de um ou mais solventes polares, por exemplo álcoois alquilicos com um radical alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, como, por exemplo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, pentanol, hexanol ou, por exemplo, acetona, acetonitrilo, éster de etilo do ácido acético, sulfóxido de dimetilo ou N,N-dimetilformamida, ou de outros solventes com uma polaridade superior ou igual a 0,50, como, por exemplo, indicado em Kuster/Thiel 1993, e um ou mais dos solventes orgânicos apoiares acima descritos, como, por exemplo, solventes contendo halogéneo como clorofórmio, diclorometano, tetracloreto de carbono, ou solventes alifáticos como hexano, ciclo-hexano, pentano, heptano, etc., ou solventes aromáticos, tais como, por exemplo, tolueno ou benzeno, ou éteres como, por exemplo, éter terc.-butilmetilico, éter dietilico ou tetra-hidrofurano, ou outros solventes com uma polaridade inferior a 0,50, como, por exemplo, indicado em Kuster/Thiel 1993. O solvente ou a mistura de solventes (B) é mais apoiar do que o solvente ou a mistura de solventes (A) . Em conformidade com a invenção, o índice de polaridade (de acordo com Kellner, 1998) de (B) é inferior em 0,3 ou mais ao do meio de extracção da fase polar. Maior preferência é dada ao índice de polaridade de acordo com Kellner, 1998, de 0,5, com maior preferência de 1, com total preferência inferior em mais de 2 ao do meio de extracção da fase polar. De preferência, o índice de polaridade do solvente apoiar tem um valor de 1 a 5,5, com maior preferência de 5, com total preferência inferior a 4,5 de acordo com Kellner, 23 1998. Uma mistura de solventes, empregue segundo a invenção, de 40% de metanol/60% de diclorometano tem assim, por exemplo, um índice de polaridade de 3,9 de acordo com Kellner, 1998.

Em termos preferenciais, a mistura mencionada abrange um componente solvente que se mistura com a água, podendo com isso, numa seguinte junção de fases, a separação de fase levar depois a uma fase apoiar e a uma fase polar. Preferencialmente, o componente mistura-se com um álcool Ci a C6, em particular etanol ou metanol. Os solventes halogenados são particularmente preferidos. Um ponto de ebulição mais baixo, por exemplo inferior a 100°C, com maior preferência inferior a 80°C, com ainda maior preferência inferior a 60°C e, com total preferência, inferior a 40°C à pressão normal é ainda vantajoso, pois nesse caso a remoção do solvente ou da mistura de solventes pode ser levada a cabo de forma mais rápida e a temperaturas mais baixas de forma mais suave para os componentes. É dada preferência a uma mistura de metanol ou de etanol e clorofórmio, pentano, hexano, heptano, ciclo-hexano, tetracloreto de carbono, acetato de etilo ou diclorometano. É dada maior preferência a uma mistura de metanol ou de etanol com clorofórmio ou diclorometano.

Com particular preferência, a mistura de solventes (B) consiste numa mistura de fase única de 30% de vol. a 60% de vol. de álcool alquílico Ci a Cg, como acima mencionado, 40% de vol. a 70% de vol. de clorofórmio ou de diclorometano, e 0% de vol. a 30% de vol. de outro solvente ou de outra mistura de solventes, de preferência metanol e/ou clorofórmio e/ou diclorometano, não se ultrapassando nem não se ficando abaixo dos teores mencionados de álcool 24 alquílico e/ou de diclorometano e/ou de clorofórmio. Em termos preferenciais, o álcool alquílico é metanol ou etanol, com especial preferência metanol.

Preferencialmente, o solvente apoiar é diclorometano ou clorofórmio, sendo dada preferência à utilização de diclorometano.

Os 0% de vol. a 30% de vol. do outro solvente ou mistura de solventes consistem noutro ou noutros solventes, que formam uma fase com a mistura acima mencionada. Eventualmente, a mistura (B) também pode conter baixas quantidades de água, de preferência menos de 20% de vol., com maior preferência menos de 10% de vol., com ainda maior preferência menos de 5% de vol., com total preferência não existe água ou outro solvente na mistura.

De forma surpreendente, descobriu-se que é possível uma extracção particularmente boa com uma determinada relação de metanol e de diclorometano. Por conseguinte, é dada total preferência a que o processo segundo a invenção seja realizado na etapa b) com uma mistura de 30 a 40% de vol. de metanol e 60 a 70% de vol. de diclorometano. Prefere-se sobretudo 40% de vol. de metanol e 60% de vol. de diclorometano.

Uma mistura de fase única segundo a invenção dos extractos (A) e (B) é conseguida, por exemplo, se a mistura de solventes (A) for composta por 80% de vol. de metanol e 20% de vol. de água, e a mistura de solventes (B) por 40% de vol. de metanol e 60% de vol. de diclorometano, e se depois os dois extractos forem combinados. Com vantagem, todos os componentes e, opcionalmente e por exemplo, os padrões 25 encontram-se assim numa fase.

Eventualmente, é possível repetir uma ou mais vezes a extracção com (A) ou (B). No entanto, é dada preferência a uma realização única de cada etapa de extracção.

Em vez de uma separação de fases ou após uma separação de fases, também é possível realizar, no processo segundo a invenção, um fraccionamento em duas ou mais fracções por meio de uma extracção de fase sólida. Um fraccionamento em várias fracções tem a vantagem de os processo de derivação e de análise poderem ser melhor ajustados aos respectivos grupos de substâncias. Assim, é feita a transesterificação sobretudo de fracções que contêm principalmente triglicéridos, antes da análise, passando, a por exemplo, ésteres de metilo. A extracção de fase sólida adequa-se especialmente bem à automatização.

Eventualmente, é possível interromper o processamento final dos extractos em qualquer momento do processo aqui descrito entre as etapas mencionadas, desde que os extractos sejam conservados ou armazenados de forma estável, por exemplo, ao ultracongelar os extractos e/ou ao liofilizá-los. No entanto, prefere-se evitar uma interrupção do processamento final antes da análise.

Numa forma de execução da invenção, a extracção, por exemplo, a das amostras liofilizadas ou congeladas, é sustentada por outras etapas, através, por exemplo, de técnicas de homogeneização e de dispersão (ver acima, por exemplo, Fiehn, "Anal. Chem." 2000 e "Nature Biotechnology" 2000, Sauter, 1991, Roessner, 2000, Bligh und Dyer, 1959, Strand, 1999, etc .). 26

Assim, o material pode ser quebrado por, por exemplo, calor, moinho de agitação ou outros processos de moagem, pressão e alterações rápidas e consecutivas de pressão, etapas de extracção por ultra-sons, de ondas de choque, de microondas e/ou com Ultraturrax; e os componentes podem ser melhor extraídos. Estes processos podem ser realizados mediante arrefecimento, por exemplo nos 0°C. No caso do material liofilizado, também é contudo possível um processamento final à temperatura ambiente, ou seja, nos 15 - 25°C. É vantajoso um método de extracção que permita a automatização do processo. Assim, é possível realizar uma ASE (Accelerated Solvent Extraction), PSE (Pressurised Solvent Extraction), PFE (Pressurised Fluid Extraction) ou PLE (Pressurised Liquid Extraction), em que o solvente ou a mistura de solventes é passado/a através do material sob pressão e, eventualmente, a uma temperatura mais elevada (ver Bjõrklund, "Trends in Analytical Chemistry" 2000, 1_9(7), 434 - 445, Richter, "American Laboratory" 1995, 27, 24 - 28, Ezzell, "LC-GC", 1995, 13(5), 390 - 398).

Em conformidade com a invenção, a extracção é realizada por forma a que a temperatura e a pressão sejam ajustadas de modo a não ocorrer uma degradação dos componentes e a que a eficiência de extracção seja suficiente, como, por exemplo, a uma temperatura de 0°C ou mais, favoravelmente a 20°C, com maior preferência a 40 - 200°C, sendo favorável os 150°C ou menos, com maior preferência 120°C ou menos. A um nível preferencial, o processo é realizado nos 40 bar ou mais, com maior preferência nos 70 bar, com ainda maior preferência nos 100 bar a 200 bar, com total preferência nos 110 bar a 150 bar. As condições especialmente preferidas são assim uma temperatura de 60 - 80°C, em 27 particular de 70°C, e uma pressão de 110 bar a 170 bar, em particular de 140 bar. O tempo de extracção pode encontrar-se entre 30 s e 20 min, preferindo-se menos de 10 min, preferindo-se ainda mais os 5 min. É dada particular preferência à utilização de uma temperatura de 60 - 80°C e a uma pressão de 110 - 170 bar com um tempo de extracção inferior a 5 min. As condições de extracção são, em conformidade com a invenção, mais suaves do que as descritas no estado da técnica, e levam a maiores níveis de rendimento e a uma maior estabilidade dos componentes isolados.

Numa forma de execução preferida, a esterificação/transesterificação é realizada na fase polar e/ou apoiar com um ácido volátil como catalisador, de preferência com HF, Hl, HC1, BF3, BCI3, HBr, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético ou ácido tricloroacético, sendo dada maior preferência a BF3, BC13 ou HC1, e total preferência ao HC1 como ácido volátil na função de catalisador.

Depois da extracção, as fases podem ser repartidas em diversos alíquotas e podem ser eventualmente concentradas por evaporação, de modo a, por exemplo, remover os ácidos voláteis e a água e/ou a preparar as amostras para as seguintes etapas processuais, por exemplo, com um bailarino de IV (equipamento agitador aquecido com radiação de infravermelhos a baixa pressão), com uma centrifugadora de vácuo ou por liofilização. A concentração por evaporação deverá ocorrer de forma suave, de preferência abaixo dos 80°C, com maior preferência abaixo dos 40°C, de preferência a baixa pressão, consoante o solvente ou a mistura de solventes, por exemplo a 10 mbar. No caso da utilização de 28 diclorometano/metanol e/ou de misturas de metanol/água, é dada particular preferência à redução da pressão em etapas até aos 10 mbar.

Noutra forma de execução, o processo em conformidade com a invenção abrange ainda uma ou mais etapas para derivar, sujeitar a cromatografia e/ou analisar os componentes, por exemplo das fases ou dos extractos obtidos. Prefere-se derivar, sujeitar a cromatografia e analisar os extractos ou as fases nas etapas seguintes do processo segundo a invenção. De modo a continuar a analisar os extractos, é necessário derivar determinados componentes em função do método de separação e de análise utilizado . Assim, no caso de uma separação cromatográfica gasosa (GC), é dada preferência à derivação, enquanto que, no caso de uma separação por cromatografia liquida (LC), não é normalmente necessária uma derivação. Eventualmente, também é possível um processo de análise sem separação cromatográfica, como, por exemplo, espectrometria de massa (MS), espectrometria por absorção atómica (AAS) ou espectrometria de ressonância nuclear (NMR).

Noutra forma de execução preferida, o processo segundo a invenção contém ainda para a extracção pelo menos uma das seguintes demais etapas: i) congelamento do material, de preferência congelamento rápido do material obtido, por exemplo, colhido; ii) homogeneização e/ou dispersão do material, de preferência homogeneização e dispersão; 29 iii) concentração por evaporação dos extractos, de preferência após separação de fase e/ou esterificação/transesterificação até ao estado seco; iv) realização de uma formação de oxima na fase apoiar; v) realização de uma formação de oxima na fase polar; vi) realização de uma sililação de trialquilo na fase apoiar; ou vii) realização de uma sililação de trialquilo na fase polar.

Em termos vantajosos, o processo conforme a invenção contém as etapas mencionadas individualmente, com maior preferência várias e, com total preferência, todas, sendo dada particular preferência à sequência aqui mencionada.

Em termos vantajosos, o material orgânico é logo arrefecido depois da colheita, é melhor congelado, de modo a impedir assim toda a actividade enzimática na amostra ou no material, impedindo, com isso, uma alteração da distribuição dos componentes. Preferencialmente, o congelamento do material é realizado depois da obtenção ou da colheita em menos de 60 s, com maior preferência em 30 s, com total preferência em 15 s ou menos. Se o material for vegetal, a tirada de amostra pode ser directamente realizada na câmara climatizada (fitotron) . É favoravelmente que o material é com rapidez pesado depois de obtido e depois rapidamente ultracongelado, por exemplo, em nitrogénio liquido, e armazenado, por exemplo, nos -80°C ou em nitrogénio liquido. 30

Depois da esterificação/transesterificação, pode concentrar-se a solução para a remoção do ácido por evaporação até preferencialmente ao estado seco, de modo a, por exemplo, remover ácidos voláteis e água e a preparar as amostras para as etapas processuais seguintes, por exemplo, com bailarino de infravermelhos, centrifugadora de vácuo ou por liofilização. A concentração por evaporação deverá ocorrer de forma suave, de preferência entre os 5°C e os 80°C, com maior preferência entre os 20°C e os 40°C. É dada ainda preferência à realização do processo a baixa pressão, em função do solvente ou da mistura de solventes, por exemplo nos 100 mbar a 10 mbar. No caso da utilização de diclorometano/metanol e/ou de misturas de metanol/água, prefere-se em especial a redução da pressão em etapas para, por exemplo, 10 mbar. Os solventes empregues podem sustentar a etapa de secagem ao, por exemplo, serem particularmente muito voláteis, ou podem como veículos sustentar a evaporação de água, como, por exemplo, o tolueno.

Noutra forma de execução preferida é realizada uma formação de oxima no processo segundo a invenção, na fase apoiar e/ou polar. Em conformidade com a invenção, a oxima trata-se de um composto com a estrutura (I) R-ONR', (D # em que R pode ser H ou um radical alquilo, de preferência um radical alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, em particular um radical metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo ou hexilo, ou um radical arilalquilo substituído ou não substituído, de preferência com 5 a 7 átomos de carbono no radical arilalquilo e com 0 a 2 heteroátomos no anel ou 31 na cadeia do radical arilalquilo, como, por exemplo, um radical benzilo substituído ou não substituído, em particular um radical benzilo halogenado com 1 a 7 radicais de halogéneo, de preferência um radical pentafluorobenzilo, e podendo R' ser um radical de duas ligações opcional.

Em conformidade com a invenção, é possível utilizar como parceiros de reacção para a formação de oxima, os compostos com a estrutura (Ib) R-ONH2, sendo R como acima definido, de preferência hidroxilamina ou hidroxilaminas 0-substituídas ou, por sua vez, o respectivo sal com um ácido volátil, por exemplo, hidrocloretos, como o hidrocloreto de O-alquil-hidroxilamina ou hidrocloreto de 0-pentafluorobenzil-hidroxilamina, pelo processo conhecido do especialista (ver Fiehn, "Anal. Chem." 2000), por exemplo dissolvido numa mistura de solventes apropriada ou num solvente apropriado, como, por exemplo, piridina. Prefere-se um processo segundo a invenção, em que se emprega na formação de oxima o hidrocloreto de O-metil-hidroxilamina (II) , hidrocloreto de 0-pentafluorobenzil-hidroxilamina (III) ou o hidrocloreto de O-etil-hidroxilamina (IV), sendo dada total preferência ao hidrocloreto de O-metil-hidroxilamina (II).

(XV) 32

A reacção pode ser realizada durante 30 min a 6 h, de preferência durante 1 h a 2 h, de preferência pelo menos nos 20 - 80°C, com maior preferência nos 50 - 60°C. É dada particular preferência à realização durante 1 h a 2 h nos 50 - 60°C.

Noutra forma de execução de acordo com a invenção, é realizada uma sililação de trialquilo na fase polar e/ou apoiar. Em conformidade com a invenção, a sililação de alquilo pode ser realizada com um composto com a fórmula Si(R1_4)4, sendo R4 de preferência uma N-Ci_4-alquil-2,2,2-trifluoroacetamida, com especial preferência uma N-metil-2,2,2-trif luoroacetamida, tal como na fórmula (V). Com especial preferência, realiza-se assim a sililação de trialquilo com um composto com a fórmula (V) 9

F CHg em que R1, R2 e/ou R3 podem ser, independentemente uns dos outros, radicais alquilo com respectivamente 1 a 6 átomos de carbono, em particular CH3, C2H5, C3H7 ou C4H9 com as seguintes fórmulas estruturais para C3H7 e C4H9:

33 . η2

HjCr^V®3 «vi) 4- »ι

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C tj íUv t* %**£** 4

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em que, preferencialmente, R1 ou R2 é um radical metilo, com especial preferência R1 e R2 são radicais metilo. Preferencialmente, R3 é um radical alquilo de cadeia linear ou ramificado com 1 a 4 átomos de carbono, como acima descrito, com particular preferência um radical metilo ou um radical terc.-butilo, com maior preferência R3 é um radical metilo. Em termos preferenciais, realiza-se uma sililação de trimetilo com MSTFA (N-metil)-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluroacetamida. A reacção pode ter 34 lugar durante 10 min a 120 min, de preferência durante 20 min a 60 min, nos 20°C - 90°C, de preferência entre 40 e 70°C.

Antes da sililação de trialquilo, é preferencialmente possível adicionar um ou mais padrões internos e/ou um ou mais padrões de cromatografia. Numa forma de execução, utiliza-se no processo de acordo com a invenção na extracção, solventes ou misturas de solventes, que contêm ainda adicionalmente até 5% em peso, com maior preferência até 3% em peso, ainda com maior preferência até 1% em peso, de sais tampão, ácidos e/ou bases. É dada preferência aos sistemas tampão voláteis. Assim, é possível empregar, por exemplo, em conformidade com a invenção, solução de formiato de amónio, de carbonato de amónio, de cloreto de amónio, de acetato de amónio ou de hidrogenocarbonato de amónio, e/ou um ácido, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropânico, ácido heptafluorobutânico, ácido nonafluoropentânico, ácido undecafluoro-hexânico, ácido tridecafluoro-heptânico ou ácido pentadecafluorooctânico e/ou uma base como, por exemplo, trietilamina, piridina ou amoníaco.

Constitui uma vantagem misturar a mistura concentrada da etapa (c) com um ou mais padrões de análise, por exemplo, padrões internos e/ou padrões de cromatografia. Estes padrões podem ser, por exemplo, compostos não existentes nas amostras naturais mas semelhantes às substâncias analisadas, incluindo substâncias marcadas com isótopos, radiactividade ou fluorescência, como para os açúcares, por exemplo, ribitol ou alfa-metilglucopiranósido, para aminoácidos, por exemplo, L-glicina-2,2-d2 ou L-alanina- 35 2,3,3,3-cU, para ácidos gordos ou os respectivos derivados, em particular ácidos gordos impares ou os respectivos ésteres de metilo, como, por exemplo, éster de metilo do ácido undecânico, do ácido tridecânico ou do ácido nonacosânico. Os padrões também podem ser adicionados individualmente ao respectivo extracto da etapa (b). 0 processo de acordo com a invenção também abrange as etapas para a separação e para a análise, podendo os extractos ser com vantagem separados por LC, GC ou CE (electroforese capilar).

Depois da concentração por evaporação acima mencionada, os extractos produzidos segundo a invenção podem ser deitados em meios de solução de HPLC ou misturas de solventes, e depois ser analisados na LC. Os agentes de controlo de fluidez tratam-se de misturas de, por exemplo, metanol, acetonitrilo ou etanol e/ou éter terc.-butilmetilico (éter metilterc.-butilico), tetra-hidrofurano, isopropanol ou acetona e/ou água e/ou um sal, como, por exemplo, solução de formiato de amónio, carbonato de amónio, cloreto de amónio, acetato de amónio ou hidrogenocarbonato de amónio e/ou de um ácido, como, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido pentafluoropropânico, ácido heptafluorobutânico, ácido nonafluoropentânico, ácido undecafluoro-hexânico, ácido tridecafluoro-heptânico ou ácido pentadecafluorooctânico, e/ou uma base como, por exemplo, trietilamina, piridina ou amoníaco, consoante se deva separar extractos polares ou apoiares. Em regra, é realizada uma eluição de gradientes, a que se segue preferencialmente uma detecção por espectrometria de massa, por exemplo, uma detecção MS ou MS/MS (detecção simples de espectrometria de massa ou de 36 espectrometria de massa tandem).

Por GC, pode ocorrer uma detecção dos componentes, através, por exemplo, de EI-MS (ionização por jacto de electrões e análise por espectrometria de massa) ou CI-MS (ionização química e análise por espectrómetro de massa), espectrometria de massa de campo, quadripolar, time-of-flight, Ion-Trap ou Fourier-Transform-Ion-Cyclotron-Resonance, FID (determinação de ionização de chama) ou espectrometria de infravermelhos Fourier-Transform, por LC, por exemplo, por meio de espectrometria de massa de campo, quadripolar, time-of-flight, Ion-Trap ou Fourier-Transform-Ion-Cyclotron-Resonance, detecção por absorção de UV/Vis, detecção por fluorescência, NMR ou espectroscopia de infravermelhos. Preferencialmente, o processo de acordo com a invenção engloba uma MS (espectrometria de massa), análise LC/MS (cromatografia líquida ligada a uma detecção por espectrometria de massa opcional), análise GC/MS (cromatografia gasosa ligada a uma detecção por espectrometria de massa opcional) e/ou análise LC/MS/MS (cromatografia líquida ligada a uma detecção por espectrometria de massa tandem opcional), com total preferência uma análise LC/MS, GC/MS e/ou LC/MS/MS.

Em seguida, é possível fraccionar e/ou separar os extractos pelo processo segundo a invenção, depois da secagem e de nova dissolução num solvente apropriado ou numa mistura de solventes apropriada, através, por exemplo, de LC e/ou de GC, e analisar, detectar e quantificar depois os componentes através, por exemplo, de MS.

Para a realização da análise GC, é possível realizar com a fase apoiar e/ou com a fase polar, uma 37 esterificação/transesterificação, em particular com metanol ou etanol e, depois, uma formação de oxima, de preferência uma metoximização, como acima descrito. Preferencialmente, é possivel adicionar substâncias padrão, por exemplo padrões de cromatografia e/ou padrões internos, a cada amostra ou ao respectivo extracto, por exemplo, uma solução de ácidos gordos de cadeia linear ímpares ou hidrocarbonetos. Em seguida, ocorre uma sililação de trialquilo dos extractos, sendo opcional a oximização e/ou a sililação de trialquilo da fase apoiar.

Estas etapas podem ser realizadas tal como aqui descrito, mas também podem ser individualmente combinadas com outras etapas, por exemplo, com outros métodos de separação e de análise, e ser ajustadas de forma correspondente.

Numa forma de execução especialmente preferida, o material consiste em material vegetal. A parte fundamental do estado da técnica descreve apenas a análise a partir de líquidos e não de material sólido. A preparação de células de plantas distingue-se dos tecidos ou das células animais, na medida em que as células animais têm apenas uma membrana celular, sendo contudo as células de plantas envoltas por uma parede celular. A titulo de exemplo, é possivel extrair populações ou espécies de plantas, como, por exemplo, plantas geneticamente modificadas ou estressadas. Do mesmo modo, é possível produzir homogenados a partir dum grande número de organismos. Para comprovar a sensibilidade, a exactidão, a precisão, a variabilidade e a reproducibilidade, é possivel testar soluções padrão ou o material misturado com soluções padrão no processo. Nesse intuito, é possivel sobrepor o material orgânico com, por exemplo, quantidades definidas de substâncias padrão. 38

Como preferência, as informações e os dados obtidos pelo processo segundo a invenção são analisados automaticamente e armazenados num banco de dados. No caso dum grande número de amostras, emprega-se preferencialmente um reconhecimento de pico automático e uma integração de pico dos dados dos resultados.

Numa forma de execução preferida, o processo de acordo com a invenção é optimizado para um grande rendimento, uma baixa variabilidade e uma elevada reproducibilidade e contém, preferencialmente, as seguintes etapas: (i) obtenção do material orgânico e arrefecimento ou congelamento em 60 s depois da obtenção; (ii) liofilização do material; (iii) extracção com a mistura de solventes (A) de 80% de vol. de metanol e 20% de vol. de água e a mistura de solventes (B) de 40% de vol. de metanol e 60% de vol. de diclorometano, e junção dos extractos; (iv) adição de padrões ao(s) extracto(s); (v) concentração por evaporação dos extractos após separação de fase e esterificação/transesterificação até ao estado seco; (vi) realização de uma esterificação/transesterificação na fase apoiar com HC1; e 39 (vii) análise dos extractos por análise MS, LC/MS, LC/MS/MS e/ou GC/MS. É dada especial preferência a um processo, em que o material orgânico é extraído por uma ASE. Eventualmente, os extractos podem ser mais fraccionados por meio de uma extracção de fase sólida. Noutra forma de execução, o processo é parte dum processo destinado à análise de um perfil metabólico. Com vantagem, a invenção é assim relativa a um processo para a produção de um perfil metabólico com grande rendimento, o qual abrange as etapas processuais segundo a invenção acima mencionadas e a seguinte outra etapa: (viii) análise dos dados dos resultados por meio de reconhecimento automático de pico e integração de pico. A determinação de um perfil metabólico complexo dos metabólitos existentes numa amostra orgânica e componentes no caso dum grande número de amostras, permite o estudo directo de influenciadores directos do crescimento, do desenvolvimento ou do stress sobre todo o organismo ou partes deste, e constitui assim uma parte essencial da análise funcional do genoma aquando da determinação de funções dos genes. Os processos para a análise de perfis de metabólitos complexos, em particular se forem adequados à análise de maiores números de amostras, permitem estudar a complexidade de interacções de regulação a todos os níveis e em todos os estádios, assim como a acção de factores endogénicos e exogénicos.

Assim sendo, é possível utilizar o processo segundo a 40 invenção no intuito de estudar, por exemplo: a) os efeitos de diferenças genéticas no perfil metabólico, b) a influência de, por exemplo, condições ambientais, stress, substâncias químicas, etc., c) a interacção entre a) e b) ou d) a evolução no tempo de a), b) ou c), como, por exemplo, em estudos sobre a influência de uma ou mais substâncias (por exemplo, também as bibliotecas de substâncias), ou factores de stress, como, por exemplo, secura, calor, frio, geada, deficiência, sal, privação de luz, etc. sobre o perfil metabólico de, por exemplo, organismos o mais idênticos a nível genético possível, organismos geneticamente aparentados até aos organismos o mais geneticamente díspares possível. A presente invenção é explicada com base nos exemplos que se seguem, sem que isto seja de alguma forma restritivo.

Exemplo 1

Tiragem de amostras e armazenamento das amostras A tiragem de amostras ocorreu directamente na câmara climatizada. As plantas foram cortadas com uma pequena tesoura de laboratório, foram rapidamente pesadas numa balança de laboratório, foram passadas para um cartucho de extracção previamente arrefecido e postas numa grade de 41 alumínio arrefecida por nitrogénio líquido. Se necessário, os cartuchos de extracção podem ser armazenadas nos -80°C no congelador. 0 tempo de corte das plantas até ao congelamento em nitrogénio líquido não ultrapassou 10 a 20 s.

Exemplo 2 Liofilização

Teve-se em atenção que, durante a experiência, as plantas permanecessem, até ao primeiro contacto com solventes, no estado ultracongelado (temperatura < -40°C) ou que fossem libertadas da água por liofilização. A grade de alumínio com as amostras de plantas nos cartuchos de extracção foi colocada no equipamento de liofilização pré-arrefecido (-40°C). A temperatura inicial durante a secagem principal era de -35°C, a pressão era de 0,120 mbar. Durante a secagem, os parâmetros foram alterados em conformidade com um programa de pressão e de temperatura. A temperatura final passadas 12 horas era de +30°C, e a pressão final era de 0,001 - 0,004 mbar. Depois de desligadas a bomba de vácuo e a máquina de arrefecimento, o sistema foi ventilado com ar (seco por meio de um tubo de secagem) ou árgon.

Exemplo 3

Extracção

Os cartuchos de extracção com o material vegetal liofilizado foram directamente passados depois da ventilação do equipamento de liofilização para os cartuchos de extracção de 5 ml da ASE. 42

As 24 posições de amostra de um equipamento de ASE (Accelerated Solvent Extractor ASE 200 com Solvent Controller e AutoASE-software (empresa DIONEX) são enchidas com amostras vegetais.

As substâncias polares foram extraídas com cerca de 10 ml de metanol/água (80/20, v/v) a uma T = 70°C e com uma p = 140 bar, com 5 min de fase de aquecimento, 1 min de extracção estática. As substâncias lipófilas foram extraídas com cerca de 10 ml de metanol/diclorometano (40/60, v/v), a uma T = 70°C e com uma p = 140 bar, com 5 min de fase de aquecimento, 1 min de extracção estática. As duas misturas de solventes foram extraídas na mesma proveta de amostra (provetas de centrifugação, 50 ml com tampa de enroscar e septo de enfiar para a ASE (DIONEX)). A solução foi misturada com padrões internos: ribitol, L-glicina-2,2-d2, L-alanina-2,3,3,3-d4 e a-metil-glicopiranósido e éster de metilo do ácido nonadecânico, éster de metilo do ácido undecânico, éster de metilo do ácido tridecânico, éster de metilo do ácido nonacosânico. O extracto total foi misturado com 7 ml de água. O resíduo sólido da amostra vegetal e o cartucho de extracção foram deitados fora. 0 extracto foi agitado e depois centrifugado nos pelo menos 1 400 g durante 5 a 10 min, de modo a acelerar a separação de fase. 1 ml da fase superior de metanol/água ("fase polar", incolor) foi tirado para a outra análise GC, 1 ml foi tirado para a análise LC. O resto da fase de metanol/água foi deitado fora. A fase orgânica foi de novo 43 lavada com o mesmo volume de água (7 ml) e centrifugada. 0,5 ml da fase orgânica ("fase lipídica", verde escuro) foram tirados para a outra análise GC, 0,5 ml foram tirados para a análise LC. Todos os aliquotas tirados foram concentrados por evaporação com o bailarino de IV, evaporador de vácuo de infravermelhos (Bettich) até ao estado seco. A temperatura máxima durante a operação de concentração por evaporação não excedeu neste caso os 40°C. A pressão no equipamento não era inferior a 10 mbar.

Exemplo 4

Continuação do processamento da fase lipídica para a análise LC/MS ou LC/MS/MS O extracto lipídico concentrado por evaporação até ao estado seco, foi deitado em agente de controlo da fluidez. O decorrer da HPLC foi conseguido com uma eluição de gradientes.

Exemplo 5

Continuação do processamento da fase polar para a análise LC/MS ou LC/MS/MS O extracto polar, concentrado por evaporação até ao estado seco, foi deitado em agente de controlo da fluidez. O decorrer da HPLC foi conseguido com uma eluição de gradientes.

Exemplo 6

Derivação da fase lipídica para a análise GC/MS 44

Para a transmetanólise, juntou-se uma mistura de 140 μΐ de clorofórmio, 37 μΐ de ácido clorídrico (37% em peso de HC1 em água), 320 μΐ de metanol e 20 μΐ de tolueno ao extracto concentrado por evaporação. O recipiente foi fechado de forma vedante e aquecido sob agitação durante 2 h nos 100°C. Em seguida, a solução foi concentrada por evaporação até ao estado seco. O resíduo foi completamente seco. A metoximização dos grupos carbonilo ocorreu por reacção com hidrocloreto de metoxiamina (5 mg/ml em piridina, 100 μΐ) durante 1,5 h nos 60°C no recipiente fechado de forma vedante. 20 μΐ de uma solução de ácidos gordos ímpares de cadeia linear foram adicionados como padrões temporais. Por fim, procedeu-se a derivação com 100 μΐ de N-metil-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamida (MSTFA) durante 30 min nos 60°C no recipiente de novo fechado de forma vedante. O volume final antes da injecção de GC era de 200 μΐ.

Exemplo 7

Derivação da fase polar para a análise GC/MS A metoximização e a sililação de trimetilo com MSTFA ocorreram como descrito para a fase lipídica.

Lisboa, 30 de Março de 2007

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o isolamento de componentes de material orgânico, o qual inclui as seguintes etapas processuais: a) liofilização do material orgânico; b) extracção dos componentes com um solvente polar ou com uma mistura de solventes polar (A), e com um solvente orgânico ou com uma mistura de solventes orgânica (B), podendo os extractos juntados formar uma fase a partir da extracção com (A) e (B), sendo o solvente ou a mistura de solventes (B) mais apoiar do que o solvente ou a mistura de solventes (A); c) junção dos extractos a partir da extracção com (A) e (B) numa fase e posterior separação numa fase polar e numa fase apoiar; e d) realização de uma esterificação/transesterificação na fase apoiar com um álcool, sendo a esterificação/transesterificação realizada na presença de um ácido volátil; e sendo o processo um processo de elevado rendimento.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o solvente polar ou a mistura de solventes polar (A) consiste numa mistura de fase única de 50 a 90% de vol. de álcool alquilico Ci a C6, 10 a 50% de vol. de água e 40 a 0% de vol. de outro solvente ou de outra mistura de solventes.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o solvente orgânico ou a mistura de solventes orgânica (B) consiste numa mistura de fase única de 30% de vol. a 60% de vol. de álcool alquilico Ci a C6, 40% de vol. a 70% de vol. 2 de clorofórmio ou de diclorometano, e 0% de vol. a 30% de vol. doutro solvente ou de outra mistura de solventes.

4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que a extracção é levada a cabo por meio de Accelerated Solvent Extraction, Pressurised Liquid Extraction, Pressurised Fluid Extraction, extracção por ultra-sons, por ondas de choque ou por microondas, ou por meio de moinho de agitação ou Ultraturrax.

5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que a extracção é realizada a uma temperatura de 0°C a 200°C e/ou a uma pressão de 40 bar a 200 bar.

6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o ácido volátil empregue na esterificação/transesterificação se trata de HC1, HBr, BF3, BC13, ácido trifluoroacético, ácido tricloroacético ou Hl.

7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que o componente de álcool empregue na esterificação/transesterificação se trata de um álcool alquilico saturado ou insaturado, de cadeia linear, de cadeia ramificada ou em anel, com 1 a 8 átomos de carbono.

8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, em que os componentes são derivados, sujeitos a cromatografia e/ou analisados em outra ou noutras etapas.

9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, indo esse processo englobar pelo menos uma das demais etapas: 3 3 i) ϋ) iii) IV) V) vi) vii) congelamento do material; homogeneização e/ou dispersão do material; concentração por evaporação dos extractos após separação de fase e/ou após esterificação/transesterificação até ao estado seco; realização de uma formação de oxima na fase apoiar; realização de uma formação de oxima na fase polar; realização de uma sililação de trialquilo na fase apoiar; ou realização de uma sililação de trialquilo na fase polar.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a sililação de trialquilo é uma sililação de trimetilo.

11. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, em que os extractos ou os extractos juntados são misturados com um ou mais padrões de análise.

12. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, em que as fases são respectivamente analisadas por meio de uma análise de LC, MS, GC, LC/MS, GC/MS e/ou LC/MS/MS.

13. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, em que os solventes ou as misturas de solventes empregues na extracção contêm ainda adicionalmente 5% em peso de sais tampão, ácidos e/ou bases.

14. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, em que o material consiste em material vegetal.

15. Processo para gerar um perfil metabólico de grande 4 rendimento, incluindo as etapas processuais de acordo com uma das reivindicações 1 a 14 e a seguinte demais etapa: (viii) análise dos dados dos resultados por meio de reconhecimento automático de pico e integração de pico. Lisboa, 30 de Março de 2007