CN102507766B - 测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 - Google Patents
测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102507766B CN102507766B CN201110319951.1A CN201110319951A CN102507766B CN 102507766 B CN102507766 B CN 102507766B CN 201110319951 A CN201110319951 A CN 201110319951A CN 102507766 B CN102507766 B CN 102507766B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nnk
- cell
- contamination
- add
- nutrient solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。该方法特点是通过毒理学与生物化学相结合，利用建立的液质联用方法，分析NNK在细胞中的代谢，具有前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及毒理学及生物化学分析领域，具体为一种分析4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的细胞毒性的中性红法及测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法。
背景技术
烟草特有亚硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNAs)是一类仅存在于烟草及烟气中的氮亚硝胺类化合物。TSNAs属于器官特异性致癌物质，其作用的主要靶器官是肺部组织。TSNAs可诱导实验动物产生多种癌症，其中NNK和NNN的致癌性最为强烈（施应选．烟叶和烟气中TSNAs的含量分析及其与前体物的关系[D]．云南：云南师范大学，2006：15．），国际癌症研究组织（IARC）将NNK定为一类致癌物（Smokeless tobacco and tobacco-specific nitrosamines. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 89. Lyon (FR): IARC, 2007.）。生物实验表明NNK是大鼠肺癌的强烈致癌剂（Brunnemann K, Hoffmann D. Analytical studies on tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco and tobacco smoke[J]. Critical reviews in toxicology, 1991, 21(4): 235-240.）。NNK和它的主要代谢物NNAL是烟气中唯一已知的胰腺癌致癌物（Hecht S S, Chen C B, Ohmori T, Hoffmann D. Comparative carcinogenicity in F344 rats of the tobacco specific nitrosamines, N'-nitrosonornicotine and 4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone [J]. Cancer Res, 1980, 40: 298-302；Hecht S S, Hoffmann D. The relevance of tobacco-specific nitrosamines to human cancer[J]. Cancer Surv.1989, 8: 273-294.）。NNK需要通过代谢活化才能表现其致癌性，对NNK进行体内体外代谢研究可以进一步阐明烟草引发癌症的机制，并为后续癌症预防研究提供技术支持。
在有机体一切代谢活动与执行功能的过程中，细胞呈现为一个独立、有序、自动控制性很强的代谢体系（翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学[M]．北京：高等教育出版社，2000．），是代谢与功能的基本单位。用细胞进行体外毒理试验具有耗时短并且成本低的特点，测定体外细胞毒性可以大大减少活体动物毒理学测定时的动物数量，并可为确定后续染毒及分离分析试验的剂量提供依据。细胞毒性试验的多种方法中，中性红法检测结果与体内LD50的相关性好，结果稳定可靠，灵敏性也较高（王征，张天宝，朱玉平，等．急性毒性体外筛选方法的比较[J]．卫生研究，2006，35(3)：286-288；隋海霞，高芃，张立实，等．保健食品快速筛选试验-细胞毒性方法的确定[J]．中国食品卫生杂志，2004，16(6)：485-488．）。
对于细胞中NNK代谢物的检测，文献报道多采用[5-3H]NNK标记，HPLC法分析（Hecht S S. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone by Cultured Monkey Lung Explants[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(1): 5-9.；Berhard Schrader, Hirsch-Ernst, Ekkehard scholz, et al. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in primary cultures of rat alveolar type Ⅱ cells[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(2): 180-185.；Mullett W M, Levsen K, Borlak J, et al. Automated in-tube solid-phase microextraction coupled with HPLC for the determination of N-nitrosamines in cell cultures[J]. Analytical Chemistry, 2002, 74(7): 1695-1701）。同位素放射性标记试验需具备相应的安全防护措施和条件，每次试验或阶段性试验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，要面临去污染处理和放射性废物处理等问题，近年来应用日益受限。且建立的HPLC法分析时间长，分离效果不佳，峰形质量不高。因此建立一种对所有NNK代谢物都适用且前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的液质联用方法，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而专门研究的一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，该方法特点是通过毒理学与生物化学相结合，利用建立的液质联用方法，分析NNK在细胞中的代谢，具有前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的优点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。
具体包括以下步骤：
a. 中性红试验：取生长状态良好的细胞，消化计数，按适宜密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养；24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与十二烷基磺酸钠（SDS）作为阴性与阳性对照，继续培养；24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的提前24 h温育的中性红培养液培养3 h；弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液(乙醇+水+冰醋酸，体积比50：49：1)，置于振荡器上震荡混匀20 min，用酶标仪于540 nm处测定吸光度值；
b. NNK的染毒及细胞培养液样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液。取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入内标溶液（内标为三种氘代内标：NNK-d4、HPB-d4、NNAL-d3的混合内标溶液），加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，取200μL滤液于色谱瓶，用流动相混合液（是指15%的流动相A与85%的流动相B的混合液，其中A指水（含10 mM甲酸铵），B指乙腈）定容至1 mL，混匀，进行LC-MS/MS分析测定；
c. NNK的染毒及细胞提取物样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液。用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测；加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至离心管，再向原管中加入生理盐水润洗，洗液一起并入离心管；向管中加入10-15粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm，4 ℃离心30 min，取上清液即得细胞提取物；取细胞提取物20 μL，加入60 μL乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min，取上清液；过MEPS针（指填充吸附微量萃取针）萃取后，进行LC-MS/MS分析测定；
d. 样品分析：
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX HILIC Plus柱(2.1×100 mm, 3.5 μm, 美国Agilent 公司)；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：200 μL/min；洗脱方式：等度 15% A+85% B；进样量：2 μL；柱温：26 ℃；
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage, IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N2）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N2）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N2）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N2）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。
多反应监测(MRM)条件下各分析物及内标化合物的母离子、子离子以及优化的去簇电压DP和碰撞能量CE值如下表1所示。
表1 分析物及内标物的MRM参数
Table 1 MRM parameters of the analytes and internal standards
注：各分析物上面一行数据为定量时采用的MRM参数,下面一行数据为辅助定性所用参数
NNK：4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；NNAL：4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇；NNK-N-Oxide：4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁酮；HPB：4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮；PBD：1-(3-吡啶基)-1,4-二醇；酮酸：1-(3-吡啶基)-1-丁酮-4-羧酸；羟基酸：1-(3-吡啶基)-1-丁醇-4-羧酸；NNK-d4：4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基-d4)-1-丁酮；HPB-d4：4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮-（3,3,4,4-D4）；NNAL-d3：4-(甲基-d3-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇。
本发明相比现有技术的所具备的优点在于：前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高。
附图说明
附图1为NNK及其代谢物的标准品在Agilent ZORBAX HILIC Plus柱上的谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明：
实施例1
1. 仪器与试剂：
A549细胞购自中科院上海细胞库。
HERA cell 240 CO2培养箱（美国Thermo SCIENTIFIC公司）；超净工作台（中国苏州安泰空气技术有限公司）；OLYMPUS IX71 荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；-80℃低温冰箱（美国Thermo SCIENTIFIC公司）；SIGMA 3-18K 低温高速离心机（德国Sartorius公司）；Bio RAD Model 680 酶标仪（美国Bio RAD公司）；KA-1000 台式离心机（中国上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q Biocel型超纯水仪（美国Millipore公司）；Kylin-Bell TS-2 轨道振荡器（中国海门其林贝尔仪器制造公司）；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器（中国上海申安医疗器械厂）。
培养皿（60mm×15mm, 35 mm×10mm）（美国Corning公司）；96孔细胞培养板（美国Corning公司）；冻存管（2.0mL）（美国Corning公司）；多道移液器加样槽（美国Corning公司）；Eppendorf 移液器（2.5，20，200，1000μL）(德国Eppendorf公司）；程序降温盒（Mr. Frosty）(美国NALGENE公司）；M300 八道移液器(芬兰BioHit公司）；一次性针头滤器（0.22μm）(美国Millipore公司）；胎牛血清(美国Gibco公司）；RPMI-1640培养基(中国Solarbio公司）；胰酶(中国Solarbio公司）；二甲亚砜（DMSO）(美国Amresco公司）；中性红(中国Solarbio公司）；十二烷基磺酸钠（SDS）(中国Solarbio公司）。
超纯水（电阻率≥18.2MΩ.cm）；甲醇（色谱纯，美国J&T Baker 公司）；乙腈（色谱纯，美国J&T Baker 公司）；甲酸（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸铵（纯度≥99%,Alfa Aesar公司）；乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）；0.22 μm有机相针式滤器（美国Agilent公司）；Glass beads-acid washed 玻璃珠（425-600 μm，德国Sigma 公司）；MEPS针（澳大利亚SGE公司）。
4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL）；4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基-N-氧化)-1-丁酮（NNK-N-Oxide）；4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（HPB）；1-(3-吡啶基)-1,4-二醇（PBD, 羟基醇或二醇）；1-(3-吡啶基)-1-丁酮-4-羧酸（酮酸）；1-(3-吡啶基)-1-丁醇-4-羧酸（羟基酸，铵盐）；4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基-d4)-1-丁酮（NNK-d4）；4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮-（3,3,4,4-D4）（HPB-d4）；4-(甲基-d3-亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL-d3）（纯度>98%，加拿大TRC公司）。
Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；API5500质谱仪（美国AB公司）；Milli-Q超纯水仪(美国MILLIPORE公司)；CP2245分析天平(感量0.0001g ,德国Sartorius公司)； SIGMA 3-15高速离心机(德国Sartorius公司)；SIGMA 3-18K 低温高速离心机（德国Sartorius公司）；涡旋震荡器（德国IKA公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。
2. 试验方法：
选择A549细胞株，取生长状态良好的细胞，消化计数，按1×104个/ 皿密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养。24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与200 μg/mL的SDS作为阴性与阳性对照，继续培养。24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的中性红培养液（提前24 h温育）培养3 h。弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液（乙醇+水+冰醋酸，体积比50：49：1），置于振荡器上震荡混匀20 min，用酶标仪于540 nm处测定吸光度值。根据中性红试验的结果，选取2 μg/mL以下浓度进行NNK染毒试验（依据本中性红实验的结果，在此浓度以下进行实验，细胞的存活率和正常细胞无显著性差异，可认为细胞正常存活）。
选择A549细胞株，接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液。取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入50 μL混合内标溶液（1 μg/mL，乙腈作溶剂），加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，取200μL滤液于色谱瓶，用流动相混合液定容至1 mL，混匀，进行LC-MS/MS分析测定。
选择A549细胞株，接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液。用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测，加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入80 μL生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至1.5 mL离心管，再向原管中加入20 μL生理盐水润洗，洗液一起并入1.5 mL离心管。向管中加入10-15粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm，4 ℃离心30 min，取上清液即得细胞提取物。取细胞提取物20 μL，加入60 μL乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min，取上清液。过MEPS萃取后，进LC-MS/MS分析测定。
3.液质联用分析：
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX HILIC Plus柱(2.1×100 mm, 3.5 μm, 美国Agilent 公司)；流动相：A：水（含10 mM甲酸铵），B：乙腈；流速：200 μL/min；洗脱方式：等度 15% A+85% B；进样量：2 μL；柱温：26 ℃。
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（Ion Spray Voltage, IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：600 ℃；雾化气（GS1, N2）：65 psi；辅助加热气（GS2 , N2）：60 psi；气帘气（Curtain gas, CUR, N2）：35 psi；碰撞气（Collision gas, CAD, N2）：8 psi；驻留时间（Dwell Time）：50 ms；入口电压EP（Entrance Potential）：10 V；出口电压CXP（Collision Cell Exit Potential）：12 V。
Claims (1)
1.一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于：首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析；具体包括以下步骤：
a. 中性红试验：取生长状态良好的细胞，消化计数，按适宜密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养；24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与十二烷基磺酸钠（SDS）作为阴性与阳性对照，继续培养；24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的提前24 h温育的中性红培养液培养3 h；弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液，置于振荡器上震荡混匀20 min，用酶标仪于540 nm处测定吸光度值；所述酸乙醇洗脱液为乙醇+水+冰醋酸，体积比50：49：1；
b. NNK的染毒及细胞培养液样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液；
取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入内标溶液，加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，取200μL滤液于色谱瓶，用流动相混合液定容至1 mL，混匀，进行LC-MS/MS分析测定；
c. NNK的染毒及细胞提取物样品前处理：接种细胞24 h后进行NNK染毒处理，继续培养24 h后取出培养液；
用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测；加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至离心管，再向原管中加入生理盐水润洗，洗液一起并入离心管；向管中加入10-15粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm，4 ℃离心30 min，取上清液即得细胞提取物；取细胞提取物20 μL，加入60 μL乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min，取上清液；过MEPS针萃取后，进行LC-MS/MS分析测定；
d. 样品分析：
色谱条件：
色谱柱：美国Agilent 公司的Agilent ZORBAX HILIC Plus柱，型号为2.1×100 mm, 3.5 μm；流动相：A：含10 mM甲酸铵的水，B：乙腈；流速：200 μL/min；洗脱方式：等度 15% A+85% B；进样量：2 μL；柱温：26 ℃；
质谱条件：
电离模式：电喷雾电离；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压：5500 V；离子源温度：600 ℃；雾化气 N2：65 psi；辅助加热气 N2：60 psi；气帘气 N2：35 psi；碰撞气 N2：8 psi；驻留时间：50 ms；入口电压：10 V；出口电压：12 V。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110319951.1A CN102507766B (zh) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | 测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110319951.1A CN102507766B (zh) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | 测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102507766A CN102507766A (zh) | 2012-06-20 |
| CN102507766B true CN102507766B (zh) | 2014-04-09 |
Family
ID=46219872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110319951.1A Active CN102507766B (zh) | 2011-10-20 | 2011-10-20 | 测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102507766B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107917983B (zh) * | 2017-11-16 | 2020-05-05 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种快速检测烟气体内代谢标志物的分析方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102012407B (zh) * | 2010-10-11 | 2013-03-27 | 红塔烟草(集团)有限责任公司 | 一种烟草特有亚硝胺检测方法 |
-
2011
- 2011-10-20 CN CN201110319951.1A patent/CN102507766B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102507766A (zh) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106281310B (zh) | 一种线粒体靶向过氧化氢分子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN104245599B (zh) | 用于检测辅酶q10的方法和试剂盒 | |
| CN102445510B (zh) | 测定肝微粒体中nnk代谢物的液质联用方法 | |
| CN101701943A (zh) | 气相色谱-质谱联用测定产品中富马酸二甲酯的方法 | |
| CN107941980A (zh) | 水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法 | |
| CN103623433A (zh) | 一种改进的斑马鱼药物代谢模型建立方法 | |
| CN106165059A (zh) | 使用不混溶的提取溶剂分析所提取的样品 | |
| CN106442753B (zh) | 一种测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法 | |
| CN105486775A (zh) | 一种右归丸中多种成分含量的检测方法 | |
| CN103439444A (zh) | 检测鱼类血浆中肉碱含量的高效液相色谱法 | |
| CN102507766B (zh) | 测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法 | |
| CN110208392A (zh) | 基于uplc-qtof-ms对富硒烟叶的代谢组学研究的方法 | |
| CN103163225A (zh) | 一种高灵敏全血环孢素a定量检测试剂盒及其制备 | |
| CN103487539B (zh) | 利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物含量的方法 | |
| Lee et al. | Experimental design in metabolomics | |
| CN108693286A (zh) | 一种药物中基因毒性杂质硫酸二异丙酯的检测方法 | |
| CN103926368B (zh) | 从玉米浆中提取生物素的方法及其薄层层析扫描检测方法 | |
| CN106841451A (zh) | 基于超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱的小鼠血液中香豆素及其代谢物的测定方法 | |
| CN104897821A (zh) | 提取样品中肌醇的方法、试剂盒及其用途 | |
| Qu et al. | Quantification of 13C, 15N labelled compounds with 13C, 15N edited 1H Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy | |
| CN109942533B (zh) | 一类香豆素腙化合物、其制备方法及应用 | |
| CN102060883A (zh) | 克林霉素磷酸酯异构体,其分析制备方法和用途 | |
| CN104749310A (zh) | 一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法 | |
| CN108845051A (zh) | 一种基于UHPLC-QTrap MS检测斑马鱼脑组织中鞘脂的方法 | |
| CN103852549B (zh) | 一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |