ES2277347T3 - Formulaciones de oxidos de 1,2,4-benzotriazinas. - Google Patents

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Abstract

SE DESCRIBEN FORMULADOS ACUOSOS PARENTERALES PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES CANCEROSOS QUE INCLUYEN 1,4 - DIOXIDOS DE 1,2,4 - BENZOTRIAZIN - 3 - AMINA EN UN TAMPON CITRATO; Y UN PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES CANCEROSOS.

Description

Formulaciones de óxidos de 1,2,4-benzotriazinas.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere al tratamiento de los tumores cancerosos con óxidos de 1,2,4-benzotriazinas contenidos en un vehículo tamponado de citrato, a pH 3,0-5,0.
Desarrollos descritos
Los óxidos de 1,2,4-benzotriazinas son compuestos conocidos. El documento de patente de los Estados Unidos Nº3.980.779 describe composiciones de 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina- que tienen la fórmula
1
en donde
uno de R y R^{1} es un grupo hidrógeno, halógeno, alquilo de cadena corta, halogenuro de alquilo de cadena corta, alcoxi de cadena corta, carbamoilo, sulfonamido, alcoxilo de cadena corta de carboxi o carbono y el otro de R y R^{1} es halógeno, alquilo de cadena corta, halogenuro de alquilo de cadena corta, alcoxilo de cadena corta, carbamoilo, sulfonamido, alcoxilo de cadena corta de carboxilo o carbono, como composiciones antimicrobianas usadas para promover el crecimiento del ganado.
El documento de patente de los Estados Unidos Nº5.175.287 concedido el 29 de diciembre de 1992, describe el uso de los óxidos de 1,2,4-benzotriazinas junto con la radiación en el tratamiento de los tumores. Los óxidos de 1,2,4-benzotriazinas sensibilizan a las células tumorales a la radiación y las hacen más vulnerables a esta modalidad de tratamiento.
Holden et al (1992) "Enhacement of Alkylating Agent Activity by SR-4233 in the FSaIIC Murine Fibrosarcoma" JNCI 84: 187-193 describe el uso de SR-4233, llamado 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina, también conocido como y algunas veces de aquí en adelante referido como tirapazamina, en combinación con un agente alquilante antitumoral. Los cuatro agentes alquilantes antitumorales, cisplatino, ciclofosfamida, carmustina y melfalán, fueron cada uno probados para examinar la habilidad de la tirapazamina a superar la resistencia de las células tumorales hipóxicas a los agentes alquilantes antitumorales. La tirapazamina se usó sola y en combinación con cantidades variables de cada uno de los agentes alquilantes antitumorales. Cuando SR-4233 se administró justo antes del tratamiento de dosis única con ciclofosfamida, carmustina o mefalán se observó una marcada intensificación de los efectos de la dosis que condujo a efectos sinérgicos citotóxicos sobre las células tumorales.
El documento de patente internacional WO 8908647 describe los óxidos de 1,2,4-benzotriazina como agentes radiosensibilizadores y agentes citotóxicos selectivos. Otras patentes relacionadas incluyen: las patentes de los Estados Unidos Nºs 3.868.372 y 4.001.410 que describen la preparación de los óxidos de 1,2,4-benzotriazinas y los documentos de patente de los Estados Unidos Nºs 3.991.189 y 3.957.799 que describen los derivados de óxidos de 1,2,4-benzotriazinas.
Riley et al. [Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, 1993, 11(2): 131-138] describen la solubilidad y estabilidad de las formulaciones de tirapazamina en diferentes tampones. La tirapazamina muestra aquí que es estable en el tampón de fosfatos a pH 7,4.
Tocher et al. [Biochemical Pharmacology, 1990, 40(6): 1405-1410] muestran los efectos dañinos para el DNA y los estudios voltamétricos de SR4233 en función del pH.
Se han encontrado miembros de óxidos de 1,2,4-benzotriazinas que son eficaces en el tratamiento de los tumores cancerosos cuando se usan conjuntamente con la terapia de radiación y la quimioterapia.
La terapia de radiación y la quimioterapia, conjuntamente con la cirugía, continúan siendo las tres primeras formas de tratamiento del cáncer. La terapia de radiación y la quimioterapia funcionan como alternativas a la cirugía en el control primario de una variedad de neoplasmas, cuando la cirugía está limitada por consideraciones anatómicas. El conocimiento actual demuestra que índices de curación más altos y mayor calidad de vida serían posibles para los pacientes de cáncer si la eficacia de la terapia de radiación y la quimioterapia se mejorasen.
Una forma de mejorar la efectividad de la radioterapia o la quimioterapia es usar ventajosamente la hipoxia que existe en los tumores, una de las pocas diferencias explotables entre los tejidos tumorales y los normales. El desarrollo anormal de los vasos sanguíneos es característico de un gran número de tumores sólidos. Este sistema capilar anormal a menudo produce áreas hipóxicas, transitorias o permanentes. En general, la hipoxia aumenta la resistencia de una célula, normal o cancerosa, a la terapia. Un método que aumente la muerte de las células tumorales hipóxicas (o limite el daño de la radiación para los tejidos normales) mejoraría el índice terapéutico de la radiación o de la
quimioterapia.
Se han desarrollado compuestos de benzotriazina para usar ventajosamente esta hipoxia relativa dentro del tumor. La tirapazamina, el miembro más prometedor de las series de benzotriazinas hasta la fecha, se bioreduce en las condiciones de hipoxia a un compuesto intermedio activo. Este compuesto intermedio activo puede inducir daño al ADN, lo que aumenta los efectos de la terapia de radiación o de la quimioterapia y es citotóxico por si mismo. Debido a que los tejidos normales adyacentes no son hipóxicos, esta bioreducción permite efectos citotóxicos selectivos sobre las células tumorales hipóxicas.
La investigación ha indicado una superioridad sustancial de las benzotriazinas sobre los sensibilizadores de la radiación tipo nitroimidazol y otros agentes bioreducibles in vitro como se muestra en la Tabla I.
TABLA I Relación de citotoxicidad hipóxica para varios fármacos bioreducibles in vitro
2
La tirapazamina, sin embargo, tiene los inconvenientes de solubilidad insuficiente en los vehículos farmacéuticos adecuados para la administración parenteral así como que es inestable en dichos vehículos. Se ha encontrado que la solubilidad de la tirapazamina en agua es de alrededor de 0,81 mg/ml, lo que requeriría un gran volumen de la solución, aproximadamente, 1 litro, para ser administrada a un paciente para proporcionarle la dosis correcta. Los intentos para aumentar la solubilidad usando tensioactivos tales como Tween 80, y polímeros tales como Pluronic F68, povidona y albúmina no tuvieron éxito, con aumentos mínimos de la solubilidad. El aumento de solubilidad con codisolventes fue más exitoso, sin embargo, la proporción de codisolventes necesaria para solubilizar la dosis mínima tolerada esperada de tirapazamina significaría cantidades significativas de infusión de codisolventes, por ejemplo, hasta 120 ml de propilenglicol como una solución al 50% v/v propilenglicol/agua. Este gran volumen de un codisolvente no es deseable en una formulación inyectable y pone en riesgo de efectos clínicos indeseables al paciente.
La tirapazamina carece también de estabilidad durante su almacenaje: la degradación completa ocurre en menos de 4 horas a reflujo en hidróxido sódico 0,1N.
La presente invención tiene como su principal objetivo proporcionar una formulación acuosa de infusión/inyectable que contiene cantidades suficientes del agente anticanceroso tumoral y es estable durante el almacenaje. Durante nuestros extensos estudios clínicos de la tirapazamina se puso de manifiesto que sin suficiente solubilidad y estabilidad este muy prometedor fármaco no ayudaría a incontables pacientes que sufren de tumores cancerosos.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una formulación acuosa parenteral para el tratamiento de tumores cancerosos que comprende:
una cantidad eficaz para tratar tumores cancerosos de un compuesto de la fórmula (I)
3 
\vskip1.000000\baselineskip
en donde
X es H; hidrocarbilo (1-4C); hidrocarbilo (1-4C) sustituido con OH, NH_{2}, NHR o NRR; halógeno; OH; alcoxi (1-4C); NH_{2}; NHR o NRR, en donde cada R está independientemente seleccionada de alquilo inferior (1-4C) y acilo inferior (1-4C) y alquilo inferior (1-4C) y acilo inferior (1-4C) sustituidos por OH, NH_{2}, grupos de amina secundaria de alquilo (1-4C) y grupos de amina terciaria de dialquilo (1-4C), alcoxi (1-4C) o halógeno; y cuando X es NRR, ambos Rs están unidos directamente o a través de un puente de oxígeno para formar un anillo de morfolina, pirrolidina o piperidina;
n es 0 o 1; y
Y^{1} y Y^{2} son cada uno independientemente H; nitro; halógeno; hidrocarbilo (1-14C) que incluye hidrocarbilo cíclico y hidrocarbilo insaturado, opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, epoxi, alcoxi (1-4C), alquiltio (1-4C), amina primaria (NH_{2}), amina secundaria de alquilo (1-4C), amina terciaria de dialquilo (1-4C), amina terciaria de dialquilo (1-4C) en donde los dos alquilos están unidos para producir un análogo de morfolina, pirrolidina o piperidina, aciloxi (1-4C) acilamido (1-4C) y tio de los mismos, acetilaminoalquilo (1-4C), carboxi, alcoxicarbonilo (1-4C), carbamilo, alquilcarbamilo (1-4C), alquilsulfonilo (1-4C) o alquilfosfonilo (1-4C), en donde el hidrocarbilo puede opcionalmente interrumpirse por una unión sencilla éter(-O-); o en donde Y^{1} y Y^{2} son independientemente un grupo morfolino, pirrolidino, piperidino, NH_{2}, NHR', NR'R'O(CO)R', NH(CO)R', O(SO)R', o O(POR')R' en el que R' es un hidrocarbilo (1-4C) que puede estar sustituido con sustituyentes OH, NH_{2}, amina secundaria de alquilo (1-4C), amina terciaria de dialquilo (1-4C), morfolino, pirrolidino, piperidino, alcoxi (1-4C), o halógeno, o sales farmacológicamente aceptables de dicho compuesto en un tampón de citrato que tienen una concentración de desde alrededor de 0,005M a alrededor de
0,05M.
La formulación parenteral para el tratamiento de los tumores cancerosos de la presente invención comprende:
de 0,500 a 0,810 g de un compuesto de la fórmula (I);
de 0,100 a 9,000 g de cloruro sódico;
de 0,9000 a 10,00 g de ácido cítrico;
de 0,200 a 3,000 g de hidróxido sódico; y cantidad suficiente de agua para 1000 ml, pH 3,0-5,0.
El compuesto anticanceroso tumoral preferido de la presente invención es la tirapazamida, 1,4 dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina, que tiene la fórmula estructural
4
con peso molecular de 178,16 y punto de fusión con descomposición de 220ºC.
En la formulación más preferida intravenosa cada mililitro de solución contiene de 0,500 a 0,810 mg/ml tirapazamina,
de 5,000 a 9,000 g de cloruro sódico,
de 0,9000 a 10,00 g de ácido cítrico,
de 0,200 a 3,000 g de hidróxido sódico,
que tiene un pH de alrededor de 3,7 a 4,3.
La presente invención está también dirigida a un método de tratamiento del tumor canceroso de un paciente con necesidad de dicho tratamiento que comprende administrar una cantidad eficaz de una formulación de tratamiento del tumor canceroso a dicho paciente.
Descripción detallada de la invención Agentes antitumorales
La presente invención proporciona una composición y un método para tratar tumores cancerosos en los mamíferos, incluyendo tumores cancerosos humanos, particularmente tumores sólidos. En este aspecto de la invención, una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, como se define aquí, contenido en una solución de tampón de citrato, se administra a un mamífero que tiene un tumor canceroso y que necesita dicho tratamiento desde alrededor de media hora a alrededor de veinticuatro horas antes de la administración al mamífero de una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico al que el tumor es susceptible. La fórmula I y las pruebas del compuesto se describen en el documento de patente de Estados Unidos US 5484612.
En la preparación de la formulación de la presente invención, se realizaron amplios estudios para proporcionar suficiente solubilidad al compuesto para el tumor canceroso y hacer la formulación estable durante el almacenaje como quedará claro en la descripción a continuación.
La presente invención se describirá con referencia específica a las formulaciones de tirapazamina, sin embargo, debe entenderse que el intento es que los otros compuestos comprendidos por la fórmula I estén cubiertos por las reivindicaciones de la invención.
Propiedades de solubilidad de tirazapamina
La solubilidad de tirazapamina en agua y varios otros vehículos se muestra en la Tabla II
TABLA II Solubilidad de tirazapamina en medio acuoso
100
101
La limitada solubilidad de 0,81 mg/ml requeriría la infusión de hasta un litro de fluido, de manera que para minimizar el volumen de fluido, la solubilidad tiene que ser aumentada. Los intentos de aumentar la solubilidad con el uso de tensioactivos (Tween 80) y polímeros (Pluronic F68, povidona, albúmina) no tuvieron éxito con solo un mínimo aumento de la solubilidad.
Se obtuvieron aumentos de solubilidad con codisolventes, sin embargo, la proporción de codisolvente necesaria para solubilizar la dosis máxima tolerada esperada de tirapazamina (\sim 700 mg) significaría infundir cantidades significativas del codisolvente (por ejemplo hasta 120 ml de propilenglicol (PG) como una solución PG/solución acuosa al 50% v/v).
\newpage
Las propiedades fisicoquímicas de la tirapazamina demuestran que la molécula no es ni muy polar ni de carácter altamente lipófilo. Esto se ilustra por (i) el coeficiente de partición (octanol/agua) de 0,15 (logP 0,82) y (ii) la descomposición que se observa durante la fusión a 200ºC lo que sugiere que la estructura cristalina de la tirapazamina está fuertemente unida por fuerzas intermoleculares. La naturaleza plana de la molécula facilitaría una intercalación ordenada con el cristal con las atracciones intermoleculares (interacciones de transferencia de carga) entre cada plano vía el nitrógeno y oxígeno de las funciones N-óxido. Puede existir una forma hidratada de la tirapazamina en donde las moléculas de agua están unidas a los componentes de oxígeno por enlaces de hidrógeno.
Se han hecho varios intentos para clasificar los disolventes orgánicos usando parámetros tales como constante dieléctrica, parámetro de solubilidad, tensión superficial, tensión interfacial, densidades de los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno, y coeficiente de partición octanol-agua a fin de predecir la solubilidad de los compuestos en mezclas de agua-disolventes. Los valores para los disolventes seleccionados usados en los estudios de solubilidad de la tirapazamina se dan en la Tabla III. Estos parámetros se han usado matemáticamente para predecir la solubilidad de solutos no polares por medio de la correlación de estos parámetros con la pendiente de las gráficas de solubilidad construidas con los datos experimentales. Aquellos parámetros que reflejan las propiedades de cohesión de los disolventes, tales como los parámetros de solubilidad y la tensión interfacial, producen la correlación más alta con la pendiente, así como la habilidad del codisolvente puro de formar enlaces de hidrógeno expresada como la densidad de los grupos donantes de protones o la densidad de los grupos aceptores.
TABLA III Índices de polaridad de los disolventes
[Rubino, J.T. y Yalkowsky, S.H., Cosolvency and Cosolvent Polarity, Pharmaceutical Research, 4 (1987) 220-230]
102 
\vskip1.000000\baselineskip
Los disolventes apróticos, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y dimetilacetamida (DMA), presentes en fracciones grandes del volumen total alteran la estructura del agua a través de efectos bipolares e hidrófobos. Los disolventes anfipróticos, por ejemplo, glicerol, PEG400 y propilenglicol pueden hacer ambas cosas, autoasociarse y formar enlaces de hidrógeno con el agua, por lo tanto, dichos disolventes no son idealmente adecuados para solutos que no pueden participar en enlaces de hidrógeno. El coeficiente de partición del soluto es un indicador para predecir si los codisolventes serán eficaces. La siguiente ecuación se ha usado para predecir con éxito la solubilidad en varios sistemas de disolventes:
logC_{s} = logC_{o} = f(logR + 0,89logP + 0,03)
\newpage
en donde C_{s} y C_{o} son las solubilidades en la mezcla de disolventes y agua respectivamente, f es la fracción de codisolvente, R es el poder relativo del disolvente (valores típicos son DMF = 4, glicerol = 0,5) y P es el coeficiente de partición. A medida que P tiende a la unidad (logP \rightarrow 0) un aumento en la solubilidad no es posible puesto que,
logC_{s} = logC_{o}
Puesto que el logP de la tirapazamina es -0,8, esta ecuación predeciría que los codisolventes probablemente no tengan un efecto significativo en la solubilidad acuosa. Experimentos realizados con estos codisolventes produjeron como resultado el que la solubilidad de la tirapazamina no aumentó significativamente con estos codisolventes.
Estabilidad
Se hicieron estudios de estabilidad en condiciones límites usando múltiples ciclos de autoclave de 21 minutos a 121ºC. Estos estudios demostraron que la tirapazamina era más estable en soluciones ácidas de solución salina normal o soluciones tamponadas a pH 4 usando tampones de citrato 0.05 M o lactato 0,1 M. La tirapazamina fue inestable en presencia de tampón de fosfato a pH 5,9 y en tampón de citrato a pH 6. Un cambio en el pH de la formulación de la solución salina normal ocurrió después de ocho ciclos de autoclavado de 4,5 a 4,9, por lo tanto las formulaciones requieren un cierto grado de tamponación.
Se sometieron también las formulaciones a condiciones límites almacenándolas a altas temperaturas de 50ºC y 70ºC después de un único ciclo de autoclavado de 21 minutos a 121ºC. Se descubrió que la tirapazamina es inestable en presencia del tampón de lactato después del almacenaje a 70ºC. Esta inestabilidad no fue aparente después de la condición límite de múltiples autoclavados. La formulación que resultó más estable fue citrato 0,05 M a pH 4.
La formulación de tirapazamina se continuó por lo tanto usando tampón de citrato. La solubilidad de la tirapazamina a 15ºC requirió que la concentración se redujera de 1 a 0,5 mg/ml. Se realizaron pruebas en condiciones límites adicionales en tampón de citrato a pH 3,5, 4,0 y 4,5 para determinar los límites del pH. Basado en los datos de este estudio se establecieron los límites como pH 4,0 \pm 0,3.
Basado en los datos de estabilidad establecidos, la formulación más estable de tirapazamina fue en tampón de citrato a pH 4. La solubilidad de la tirapazamina en tampón de citrato fue 0,81 mg/ml a 15ºC. Por lo tanto para limitar el volumen de líquido de infusión se usó una concentración máxima de 0,7 mg/ml en el desarrollo posterior de la formulación.
Se evaluaron los efectos de la concentración del tampón (0,05 o 0,005 M) en la estabilidad sometiendo a condiciones límites lotes de estabilidad de tirapazamina de 2 x 10 l (0,7 mg/ml) en tampón de citrato a pH 4,0.
La tirapazamina fue estable después de 2 meses en ambos, tampón de citrato 0,005 M y tampón de citrato 0,05 M a 50ºC. A 70ºC, hubo evidencia de inestabilidad en la formulación de citrato 0,05 M, por lo tanto se escogió la concentración de citrato más baja (0,005 M) para desarrollo como formulación clínica. La formulación clínica usada en los estudios químicos descritos más tarde fue como sigue:
Tirapazamina 0,700 g
Cloruro sódico 8,700 g
Ácido cítrico 0,9605 g
Hidróxido sódico cs hasta pH 4 en agua hasta 1.000 ml 0,2500 g
La tirapazamina se almacena en ampollas de vidrio transparente de 20 ml que contienen 0,7 mg/ml (14 mg) de tirapazamina en el tampón de citrato isotónico. Se almacenan las ampollas de 15ºC a 30ºC en empaquetamiento a prueba de la luz.
Dosificación
Se realizó un estudio de toxicidad aguda en el ratón, estudios de dosis única y múltiple en ratas y perros y un estudio de mielosupresión in vitro. con la formulación de la presente invención.
En un estudio de toxicidad aguda en ratones, se encontró que la DL_{10} y la DL_{50} de la tirapazamina eran 98 y 101 mg/kg, respectivamente.
Se realizaron estudios de dosis única y de dosis múltiples de 2 semanas y 2 meses en ratas y perros. Las observaciones clínicas y síntomas observados en ambas especies y en cada régimen incluyeron salivación, disminución del número de glóbulos blancos en sangre (incluyendo linfocitos en los perros), y disminución del número de glóbulos rojos en sangre.
Farmacología
Para medir la selectividad de la citotoxicidad de la tirapazamina se ha investigado el efecto de la tirapazamina en una variedad de células aeróbicas e hipóxicas en cultivos celulares. La tirapazamina (20 \muM) produjo muerte celular potente y selectiva de células hipóxicas in vitro, con relaciones de citotoxicidad hipóxica de 150, 119 y 52 en las líneas celulares del hamster, ratón y humanas, respectivamente (1-2 órdenes de magnitud mayores que los sensibilizadores de radiación tales como los nitroimidazoles, mitomicina C y porfiromicina). Esta citotoxicidad se observó también en un intervalo de tensión del oxígeno (1%-20% de O_{2}; principalmente a 1%-4% de O_{2}).
La tirapazamina fue igualmente eficaz in vivo en modelos de tumores del ratón en dosis única de 0,30 mmol/kg (160 mg/m^{2}) o dosis múltiples de 0,08 mmol/kg (43 mg/m^{2}), cuando se usó con radiación fraccionada (2,5 Gy x 8). La tirapazamina fue también eficaz como una dosis única de 0,30 mmol/kg (160 mg/m^{2}) con una dosis única grande (20 Gy) de radiación. La tirapazamina pareció ser más eficaz, produciendo varias curas en tumores SCCVII de ratones, como dosis múltiples de 0,08 mmol/kg (43 mg/m^{2}) administradas antes de cada fracción de radiación (2,5 Gy x 8); y la tirapazamina pareció ser lo menos eficaz, produciendo típicamente menos de 1 log de muerte celular, cuando se administró sin radiación. Cuando se usó con la radiación fraccionada, la tirapazamina produjo un efecto igual al efecto predicho si la tirapazamina estuviera actuando en una población celular distinta (células hipóxicas) de la de la radiación (células aeróbicas).
El mecanismo de acción de la tirapazamina se ha estudiado en detalle y está íntimamente unido al metabolismo del fármaco. La ilustración a continuación representa el mecanismo de acción propuesto para la producción por la tirapazamina de un radical libre, durante la reducción del mono N-óxido, lo que origina rupturas de cadena sencilla y doble del ADN. En condiciones hipóxicas, la tirapazamina se metaboliza al producto de reducción de 2 electrones WIN 64102 (mono N-óxido; SR 4317) y a continuación al producto de reducción de 4 electrones WIN 60109 (cero N-óxido; SR 4330). Varios estudios que han investigado la reparación del daño al ADN después del tratamiento con tirapazamina han mostrado que la inhibición de la reparación del ADN está relacionada con la dosis y es similar a la producida por rayos X.
5
Se estudió extensivamente el di-N-óxido de benzotriazina, tirapazamina, in vitro e in vivo para determinar y cuantificar su eficacia y para elucidar su mecanismo de acción.
In vitro
Se han investigado los efectos de la tirapazamina en una variedad de células aeróbicas e hipóxicas en cultivo para medir la selectividad de la citotoxicidad de la tirapazamina. Se usaron células de ovario del hamster chino (CHO-HA-I), células de ratón (C3H 10T1/2, RIF-I, y SCCVII), y líneas celulares humanas (HCT-8, AG 1522, A549 y HT 1080). La tirapazamina (20 \muM) produjo muerte celular potente y selectiva de células hipóxicas in vitro como se muestra en la Tabla 4.
TABLA 4 Citoxicidad de la tirapazamina in vitro para ocho líneas celulares incubadas en condiciones aeróbicas o hipóxicas
6
In vivo Solamente tirapazamina
Cuando se administra sola in vivo a los ratones, se esperaría que la tirapazamina en dosis única produjera una muerte celular relativamente pequeña correspondiente al porcentaje de células tumorales que son hipóxicas. Un número de experimentos han mostrado que este es el caso, con la muerte celular típicamente menos de un log (fracción superviviente \geq 1 x 10^{-1}). Por ejemplo, la máxima mortalidad celular observada después de una dosis única fue en el tumor SCCVII (fracción de supervivencia = 5 x 10^{-1}), y solo se produjo un pequeño retraso en el crecimiento del tumor de 3 días en el fibrosarcoma FSaIIC.
Puede esperarse que dosis múltiples de tirapazamina administradas sin radiación, produzcan ligeramente más muerte celular que una dosis única, incluso con dosis más bajas de tirapazamina. Sin embargo, la fracción de supervivencia más baja vista en cuatro tumores de ratón diferentes fue 5 x 10^{-1}, y menor, hasta 5 x 10^{-2} en un quinto tumor de ratón (tumor RIF-1).
Tirapazamina con radiación
En un número de sistemas modelo descritos a continuación, la tirapazamina aumenta la actividad antitumoral de la radiación, estimada por la muerte celular o el retraso del crecimiento del tumor. Los tumores examinados incluyeron FSaIIC, SCCVII, RIF-1, EMT6, y KHT. La tirapazamina aumenta la muerte celular cuando se administra en regimenes de dosis única o dosis múltiple, y cuando el fármaco se combina con radiación de dosis única o fraccionada.
\newpage
En un estudio, los efectos antitumorales de la tirapazamina más la radiación exceden el efecto aditivo de estos dos tratamientos. El aumento de la actividad con la tirapazamina sucede cuando se administra el fármaco 2,5 a 0,5 horas antes de la radiación o hasta 6 horas después. Además de la actividad contra las células hipóxicas, la tirapazamina sensibiliza a la radiación a las células aeróbicas in vitro si se exponen las células al fármaco en condiciones hipóxicas antes o después de la radiación.
En un estudio, el tratamiento con tirapazamina aumentó la actividad antitumoral de la radiación en mayor grado que el sensibilizador de células hipóxicas etanidazol.
La curva concentración de oxígeno/citotoxicidad de la tirapazamina parece particularmente bien adecuada para la combinación con la radioterapia. Por debajo de aproximadamente 30 torr (mm de Hg) las células se hacen cada vez más resistentes a los efectos dañinos de la radiación. Los sensibilizadores de radiación nitroaromáticos y de antibióticos de quinonas, sin embargo, son más eficaces sólo a niveles de oxígeno mucho más bajos. De esta forma, no son tóxicos para las células moderadamente hipóxicas, resistentes a la radiación presentes en los tumores. Por contraste, la citotoxicidad de la tirapazamina permanece relativamente constante sobre el intervalo total de concentraciones de oxígeno que confieren resistencia a la radiación.
Diferente a otros sensibilizadores a la radiación estudiados hasta la fecha, la toxicidad de la tirapazamina disminuye a altas concentraciones de oxígeno (por ejemplo, las que se encuentran en los tejidos normales). En un sistema in vitro, la toxicidad de la tirapazamina fue al menos 50 a >2.000 veces mayor en condiciones hipóxicas que en condiciones de 100% de vapor de oxígeno. Puesto que es activa contra un amplio espectro de células tumorales resistentes a la radiación pero no es tóxica para las células normales con concentraciones de oxígeno altas, la tirapazamina es selectivamente citotóxica para las células tumorales hipóxicas.
Tirapazamina con quimioterapia
Cuando se administró tirapazamina (25 a 75 mg/kg IP = 83,3 a 250 mg/m^{2}) a ratones con FSaIIC fibrosarcoma, se observó alguna muerte celular en el tumor directamente. La adición de la tirapazamina (50 mg/kg IP = 167 mg/m^{2}) a la ciclofosfamida (150 mg/kg IP = 500 mg/m^{2}), melfalán (10 mg/kg IP = 33 mg/m^{2}), o cisplatino (10 mg/kg IP = 33 mg/m^{2}) en este modelo produjo aumentos en el retraso del crecimiento del tumor de 1,6 a 5,3 veces.
Efectos sobre tejidos normales
Se usaron ratones hembras C3H/Km en dos ensayos para determinar el potencial de la tirapazamina para afectar la sensibilidad del tejido normal a la radiación ionizante. Se realizaron ambos ensayos, de reacción de la piel normal y de contracción de la pierna (muslo) con radiación fraccionada. La tirapazamina no afectó a los tejidos en ninguno de los dos ensayos.
Para determinar si la tirapazamina puede afectar al tejido normal, se irradiaron las patas derechas traseras de ratones hembras C3H/Km con ocho fracciones (3, 4, 5 o 6 Gy) durante 4 días (una vez cada 12 horas). Los ratones fueron inyectados con solución salina o tirapazamina (0,08 mmol/kg = 43 mg/m^{2}) 30 minutos antes, o inmediatamente después de cada fracción. Las reacciones de la piel sobre los muslos irradiados se marcaron tres veces a la semana, del día 10 al día 32 después de la primera dosis de radiación. Los ratones se marcaron "a ciegas" sin conocimiento de su grupo de tratamiento según una escala similar a la desarrollada previamente [Brown JM, Goffinet DR, Cleaver JE, Kallman RF, "Preferential radiosensitization of mouse sarcoma relative to normal mouse skin by chronic intra-arterial infusion of halogenated pyrimidine analogs", JNCI (1971) 47, 77-89]. No se produjo sensibilización a la radiación o toxicidad aditiva por la adición de la tirapazamina al tratamiento de radiación según la determinación de la reacción de la piel.
Habiéndose descrito la invención con referencia a sus realizaciones preferidas, debe entenderse que las modificaciones dentro del alcance de la invención serán aparentes a aquellos versados en la técnica.

Claims (6)

1. Una formulación parenteral acuosa para el tratamiento de un tumor canceroso sensible a un compuesto a continuación que comprende:
de 0,500 a 0,810 g de un compuesto de la fórmula (I)
7
en donde
X es H; hidrocarbilo que tiene 1-4C; hidrocarbilo que tiene 1-4C sustituido con OH, NH_{2}, NHR o NRR; halógeno; OH; alcoxi que tiene 1-4C; NH_{2}; NHR o NRR; en donde cada R está independientemente seleccionado de alquilo inferior que tiene 1-4C y acilo inferior que tiene 1-4C y alquilo inferior que tiene 1-4C y acilo inferior que tiene 1-4C sustituido con OH, NH_{2}, grupos de amina secundaria de alquilo que tienen 1-4C y grupos de amina terciaria de dialquilo que tienen 1-4C, alcoxi que tiene 1-4C o halógeno; y cuando X es NRR, ambos Rs unidos directamente o a través de un puente de oxígeno forman un anillo de morfolina, pirrolidina o piperidina;
n es 0 o 1; y
Y^{1} y Y^{2} son cada uno independientemente H; nitro; halógeno; hidrocarbilo que tiene 1-4C que incluye hidrocarbilo cíclico y hidrocarbilo insaturado, opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, epoxi, alcoxi que tiene 1-4C, alquiltio que tiene 1-4C, amina primaria (NH_{2}), amina secundaria de alquilo que tiene 1-4C, amina terciaria de dialquilo que tiene 1-4C, amina terciaria de dialquilo que tiene 1-4C en donde los dos alquilo están unidos para producir un análogo de morfolina, pirrolidina o piperidina, aciloxi que tiene 1-4C, acilamido que tiene 1-4C y tio de los mismos, acetilaminoalquilo que tiene1-4C, carboxi, alcoxicarbonilo que tiene 1-4C, carbamilo, alquilcarbamilo que tiene 1-4C, alquilsulfonilo que tiene 1-4C o alquilfosfonilo que tiene 1-4C, en donde el hidrocarbilo puede opcionalmente interrumpirse por una unión sencilla éter(-O-); o en donde Y^{1} y Y^{2} son independientemente un grupo morfolino, pirrolidino, piperidino, NH_{2}, NHR', NR'R'O(CO)R', NH(CO)R', O(SO)R', o O(POR')R' en el que R' es un hidrocarbilo que tiene 1-4C que puede estar sustituido con un sustituyente OH, NH_{2}, amina secundaria de alquilo que tiene 1-4C, amina terciaria de dialquilo que tiene 1-4C, morfolino, pirrolidino, piperidino, alcoxi que tiene 1-4C, o halógeno, o sales farmacológicamente aceptables de dicho compuesto en un tampón de citrato que tienen una concentración de 0,005M a 0,05M;
de 0,100 a 9,000 g de cloruro sódico;
de 0,9000 a 10,00 g de ácido cítrico;
de 0,200 a 3,000 g de hidróxido sódico; y cantidad suficiente de agua para 1000 ml, pH 3,0-5,0.
2. El uso de una formulación de la reivindicación 1, en la producción de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso.
3. Una formulación acuosa parenteral para el tratamiento de un tumor canceroso sensible al compuesto anterior que comprende:
de 0,500 a 0,810 g de 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina;
de 5,000 a 9,000 g de cloruro sódico;
de 0,9000 a 10,00 g de ácido cítrico;
de 0,200 a 3,000 g de hidróxido sódico; y cantidad suficiente de agua para 1000 ml, pH 3,7-4,3.
4. Uso de una formulación de la reivindicación 3 en la producción de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso.
5. Una formulación acuosa parenteral para el tratamiento de un tumor canceroso sensible al compuesto anterior que comprende:
0,700 g de 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina;
8,700 g de cloruro sódico;
0,9605 g de ácido cítrico;
0,2500 g de hidróxido sódico; y cantidad suficiente de agua para 1000 ml, pH 4.
6. Uso de una formulación de la reivindicación 5 en la producción de un medicamento para el tratamiento de un tumor canceroso.
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