ES2277129T3 - Procedimiento para la hidrolisis de esteres de carotinoides. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la hidrólisis enzimática de ésteres de cetocarotinoides, en el que se incuba un reactivo, que contenga ésteres de cetocarotinoides, derivado de un organismo natural o genéticamente modificado, con un enzima disociador de los ésteres, elegido entre lipasas (E.C. 3.1.1.3), hasta una disociación de los ésteres por hidrólisis del 85 hasta el 100%.

Description

Procedimiento para la hidrólisis de ésteres de carotinoides.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la hidrólisis enzimática de ésteres de carotinoides, así como al empleo de los carotinoides, preparados de este modo, como artículos alimenticios y de pienso.
Los carotinoides se sintetizan, de novo, en bacterias, algas, hongos y plantas. Los cetocarotinoides, es decir los carotinoides que contienen al menos un grupo ceto, tales como por ejemplo la astaxantina, la cantaxantina, la equinenona, la 3-hidroxiequinenona, la 3'-hidroxiequinenona, la adonirubina y la adonixantina, son antioxidantes y pigmentos naturales, que son producidos por algunas algas y microorganismos como metabolitos secundarios.
De este modo se sintetizará, por ejemplo, la astaxantina por bacterias y por levaduras. Éstas acumulan astaxantina libre, no esterificada. Las microalgas de origen marino sintetizan astaxantina y la acumulan por regla general como ésteres de astaxantina, sin embargo pueden detectarse también pequeñas cantidades de astaxantina libre. El ejemplo más conocido consiste en la Haematococcus pluvialis, un alga que acumula hasta un 5% del peso seco como éster de astaxantina (70 a 80% como monoéster) bajo estrés producido por la luz y por los minerales, en el transcurso de pocos días. Esta protección de las algas bajo condiciones de estrés es aprovechada a escala industrial y económica.
Los ésteres de astaxantina, fundamentalmente los diésteres, son producidos en el reino vegetal de manera natural únicamente por una planta, la Adonis. Los ésteres de astaxantina se enriquecen en los pétalos de las flores, la astaxantina libre únicamente puede detectarse en trazas extraordinariamente pequeñas.
Se ha sintetizado astaxantina en los néctares de las flores en tabaco genéticamente modificado (Mann, Harker, Pecker y Hirschberg; Nature Biotechnology 18(8), 888-892, 2000). La cantidad preponderante de astaxantina se almacena en estado de éster.
Debido a sus propiedades coloreantes se emplean los cetocarotinoides y, especialmente, la astaxantina, como productos auxiliares para pigmentos en el pienso para los animales, ante todo para la cría de truchas, de salmones y de camarones.
Para la liberación de los carotinoides a partir de sus ésteres se transfieren éstos, de manera tradicional, a un disolvente orgánico y a continuación se saponifican de manera alcalina. Sin embargo en este caso son muy sensibles a la oxidación especialmente los cetocarotinoides, tales como la astaxantina, la hidroxiequinenona, la adonirubina y la adonixantina, con lo cual se reduce en gran medida el rendimiento en producto valorizable.
Se conoce por el estado de la técnica, también, la disociación enzimática de los ésteres, especialmente de los ésteres de carotinoides con empleo de lipasas o de esterasas.
De este modo Liu et al describen, por ejemplo, en la publicación J. Nutritional Biochemistry 9, 178-183 (1998) la hidrólisis, sintetizada por medio de lipasas, de xantófilos en presencia de ácidos biliares. Sin embargo no han sido analizados cetocarotinoides.
El autor Breithaupt describe en la publicación Z. Naturforsch., 55c, 971-975 (2000) la hidrólisis enzimática de los ésteres de los carotinoides a partir de pimiento rojo con lipasa procedente de Candida rugosa. No se han descrito ensayos experimentales con los ésteres de los cetocarotinoides anteriormente descritos. Se han descrito proporciones de hidrólisis del 21 hasta el 59% para los ésteres de carotinoides ensayados.
Los autores Zom et al. describen en la publicación Enzyme and Microbial Technology, 32, 623 - 628 (2003) la hidrólisis de ésteres de carotinoides procedentes de Tagetes erecta y Capsicum annuum. Se han descrito proporciones de hidrólisis del 18 hasta el 44% para Tagetes erecta y del 30 hasta el 69% para Capsicum annuum. No se ha ensayado la hidrólisis de los ésteres de los cetocarotinoides anteriormente descritos.
Los autores Aakermann et al. describen en la publicación Biocatalysis and Biotransformation, 13, 157-163 (1996) los ensayos, prácticamente fracasados, para la hidrólisis de dipalmitato de astaxantina sintético con lipasas procedentes de Candida rugosa. Se han detectado únicamente un 5% de astaxantina libre y un 6% de monopalmitato. Tampoco se han conseguido resultados significativamente mejores con el diacetato de astaxantina.
Se han descrito por Jacobs et al. disociaciones de ésteres de carotinoides, catalizadas por medio de esterasa, en la publicación Comp. Biochem. Physiol. 72B, 157-160 (1982). Los diésteres de astaxantina procedentes de Procambarus acutus (cangrejo de río) se transforman en un 31% en el monoéster y en un 13% en la astaxantina libre. Se ha supuesto posible una hidrólisis de hasta un 85% mediante el aumento de la concentración en colesterina-esterasa, sin que se hayan adquirido pruebas experimentales de cualquier tipo que soporten esta suposición. Los autores indican, además, que la hidrólisis puede ser influenciada por el tipo de los ácidos grasos en el éster, sin que hayan dado mayores detalles.
Los métodos enzimáticos para la hidrólisis de los carotinoides según el estado de la técnica conducen, por lo tanto, en su conjunto a resultados completamente insatisfactorios puesto que las proporciones de hidrólisis, realmente alcanzadas, son muy pequeñas. Las hidrólisis enzimáticas de los ésteres de los cetocarotinoides, según el estado de la técnica, transcurren, en tanto en cuanto han sido ensayadas, igualmente de una manera insatisfactoria. Por lo tanto el técnico en la materia no puede hacer previsiones fiables sobre el posible desarrollo de la reacción de hidrólisis cuando se utilicen otras fuentes de ésteres de carotinoides, tales como, especialmente, algas y plantas.
Breve descripción de la invención
La tarea de la presente invención consiste, por lo tanto, en la puesta a disposición de un procedimiento mejorado para la hidrólisis enzimática de ésteres de carotinoides y, especialmente, de ésteres de cetocarotinoides.
La tarea anteriormente citada se resolvió mediante la puesta a disposición de un procedimiento para la hidrólisis enzimática de ésteres de carotinoides, según el cual se incuba un reactivo, que contiene ésteres de carotinoides, derivado de un organismo natural o genéticamente modificado, con un enzima disociador de ésteres, elegido entre las hidrolasas disociadoras de los ésteres de los ácidos carboxílicos (E.C.3.1.1.), hasta una disociación de los ésteres hidrolítica esencialmente cuantitativa y aislamiento a partir de la carga de la reacción del o de los carotinoides formados.
Descripción detallada de la invención a) Definiciones generales
En el ámbito de la presente invención los "carotinoides" se eligen entre los carotinoides esterificables tales como la zeaxantina, la alfa-criptoxantina, la beta-criptoxantina, la capsorubina, la capsantina, la violaxantina, la neoxantina, la luteína, la astaxantina, la adonixantina, la adonirubina, la 3'-hidroxiequinenona, la 3-hidroxiequinenona, sin que quede limitada a las mismas.
Un grupo preferente de carotinoides son los cetocarotinoides.
En el ámbito de la presente invención, los "cetocarotinoides" se eligen entre los compuestos que contienen grupos ceto, esterificables, tales como la astaxantina, la 3-hidroxiequinenona, la 3'-hidroxiequinenona, la adonirubina y la adonixantina así como las mezclas de estos compuestos.
El "éster" de un carotinoide/cetocarotinoide puede ser tanto un monoéster como también un poliéster, especialmente diésteres o una mezcla de diversos ésteres. Los diésteres o los poliésteres pueden derivarse de ácidos carboxílicos iguales o diferentes.
Los ésteres son especialmente los ésteres de los ácidos grasos. Los ésteres de los ácidos grasos adecuados están constituidos a partir de ácidos monocarboxílicos con 8 a 30 átomos de carbono de cadena lineal o de cadena ramificada, monoinsaturados o poliinsaturados, en caso dado substituidos. Ejemplos de ácidos grasos saturados, no ramificados, son el ácido caprónico, el ácido enantoico, el ácido caprínico, el ácido pelargónico, el ácido caprínico, el ácido undecanoico, el ácido láurico, el ácido tridecanoico, el ácido mirístico, el ácido pentadecanoico, el ácido palmítico, el ácido margarínico, el ácido esteárico, el ácido nonadecanoico, el ácido araquínico, el ácido behénico, el ácido lignocerínico, el ácido cerotínico y el ácido melisínico. Ejemplos de ácidos grasos monoinsaturados son el ácido palmitoleico, el ácido oleico y el ácido erúcico. Ejemplos de ácidos grasos diinsaturados son el ácido sórbico y el ácido linoleico. Ejemplos de ácidos grasos triinsaturados son el ácido linolénico y el ácido elaeoesteárico. Ejemplos de ácidos grasos tetrainsaturados y poliinsaturados son el ácido araquidónico, el ácido clupanodónico y el ácido docosahexanoico. Son preferentes los ácidos grasos no ramificados, saturados. Además son preferentes los ácidos grasos con 10 hasta 24 átomos de carbono, preferentemente con 12 hasta 20 átomos de carbono o con 14 hasta 20 átomos de carbono monovalentes, saturados o mono-, di- o triinsaturados.
Los carotinoides o bien los ésteres según la definición precedente abarcan estos compuestos tanto en forma isomerizada como también en forma de mezclas de estereoisómeros.
"El conjunto de carotinoides" significa la suma de todos los carotinoides y de los ésteres de carotinoides según la definición precedente.
Una "disociación de los ésteres hidrolítica esencialmente cuantitativa" significa que se ha hidrolizado mediante la actividad enzimática al menos uno de los ésteres de los carotinoides presentes, especialmente al menos uno de los ésteres de los cetocarotinoides presentes, al menos en una proporción del 85% aproximadamente, especialmente al menos del 88% aproximadamente de tal manera, que ya no esté contenido ningún grupo éster en la molécula. De manera especialmente preferente se obtienen proporciones de hidrólisis, según la invención, del 100% o por debajo de este valor, tal como, por ejemplo, desde el 88 hasta el 99% o desde el 95 hasta el 99%.
La "proporción de hidrólisis" se define, según la invención, mediante la parte en porcentaje en que disminuye la cantidad de ésteres de carotinoides (por ejemplo extractable) en un reactivo, mediante catálisis enzimático. Especialmente puede determinarse la proporción de hidrólisis mediante la determinación del contenido en ésteres de carotinoides en el reactivo antes y después del tratamiento enzimático según la invención, por ejemplo mediante cromatografía tal como se ha descrito en los ejemplos y calculándose a partir del mismo la proporción de los ésteres hidrolizados.
El "reactivo" que contiene ésteres, empleado en el procedimiento, puede derivarse de organismos recombinantes naturales o genéticamente modificados. El reactivo puede proceder en este caso del conjunto del organismo o de una parte (por ejemplo los pétalos de las flores) o de una fracción de los mismos (por ejemplo obtenida tras homogeneización o digestión celular y subsiguiente fraccionamiento).
El "contenido en carotinoide" de un reactivo se define como la cantidad del conjunto de carotinoides, determinada por medida fotométrica según el método de Lichtenthaler (Methods Enzymology 148, 350-382, 1987).
El "contenido en ésteres de carotinoides" se define como la cantidad de carotinoides, que puede ser esterificada con un ácido monocarboxílico con 10 hasta 24 átomos de carbono, preferentemente con 12 hasta 20 átomos de carbono o con 14 hasta 20 átomos de carbono saturado o mono-, di- o triinsaturado. El contenido en ésteres de carotinoides puede determinarse, entre otras formas, por cromatografía puesto que los ésteres de carotinoides presentan, por regla general, tiempos de retención mayores que los carotinoides circundantes con materiales de soporte adecuados de "fase inversa", tales como por ejemplo fases C30 de cadena larga, enlazadas mediante polímeros. Un material de soporte C30 adecuado y las condiciones de separación adecuadas se han indicado a modo de ejemplo, en el ejemplo 3.
Una unidad enzimática (U) de lipasa significa aquella cantidad de enzima que libera 1,0 microequivalentes de ácidos grasos a partir de un triglicérido (por ejemplo tripalmitato de glicerina) en una hora a 37ºC y a pH 7,7.
Una unidad enzimática (U) de esterasa significa aquella cantidad de enzima, que disocie por completo hidrolíticamente, en el transcurso de un minuto, 1,0 micromol de substrato de éster a pH 7,0 y a 37ºC. 1 U de colesterol-esterasa significa por lo tanto, por ejemplo, aquella cantidad de enzima que transforme, bajo las condiciones indicadas, 1 micromol de oleato de colesterilo, en presencia de taurocolato, para dar colesterina y ácido oleínico, en el transcurso de un minuto.
Los "organismos" abarcan, según la invención, microorganismos o plantas procariotas o eucariotas.
Los "microorganismos" se eligen en este caso entre las bacterias, las levaduras, las algas o los hongos.
Los microorganismos preferentes se eligen entre Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Paracoccus, Nostoc, cianobacterias del género Synechocystis, Candida, Saccharomyces, Hansenula, Halobacterium, Phaffia, Pichia, Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Blakeslea, Phycomyces, Fusarium, Haematococcus, Phaedactylum tricomatum, Volvox, Chlamydomonas, Ankistrodesmus, Chlorella, Chlorococcum, Coelastrum, Crucigenia, Dictyococcus, Hydrodicty on, Ermosphera, Coelastrella, Botryococcus, Scenedesmus, Scotiellopsis, Protosiphon, Euglena, Nannochloropsis, Glenodinium, Aphanocapsa, Parmotrema, Cantharellus, Brevibacterium, Eremosphera, Pavlova, Gordonia, Isochryis, Brydyrhizobium, Myrmecia, Neochloris, Mycobacterium o Dunaliella.
Las plantas, adecuadas según la invención, se eligen entre las familias de las Ranunculaceae, Berberidaceae, Begoniaceae, Papaveraceae, Cannabaceae, Chenopodiaceae, Cruciferae, Rosaceae, Fabaceae, Linaceae, Vitaceae, Brassiceae, Cucurbitaceae, Primulaceae, Caryophyllaceae, Amaranthaceae, Apocynaceae, Balsaminaceae, Gentianaceae, Geraniaceae, Graminae, Euphorbiaceae, Labiatae, Leguminosae, Caprifoliaceae, Oleaceae, Tropaeolaceae, Solanaceae, Lobeliaceae, Scrophulariaceae, Compositae, Asteraceae, Plumbaginaceae, Liliaceae, Amaryllidaceae, Rubiaceae, Poaceae, Polemoniaceae, Orchidaceae, Umbelliferae, Verbenaceae, Violaceae, Malvaceae, Illiaceae o Lamiaceae.
Son especialmente adecuados los géneros de plantas tales como Marigold, Tagetes erecta, Tagetes patula, Acacia, Aconitum, Adonis, Amica, Aquilegia, Aster, Astragalus, Bignonia, Calendula, Caltha, Campanula, Canna, Centaurea, Cheiranthus, Chrysanthemum, Citrus, Crepis, Crocus, Curcurbita, Cytisus, Delonia, Delphinium, Dianthus, Dimorphotheca, Doronicum, Eschscholtzia, Forsythia, Fremontia, Gazania, Gelsemium, Genista, Gentiana, Geranium, Gerbera, Geum, Grevillea, Helenium, Helianthus, Hepatica, Heracleum, Hibiscus, Heliopsis, Hypericum, Hypochoeris, Impatiens, Iris, Jacaranda, Kenia, Laburnum, Lathyrus, Leontodon, Lilium, Linum, Lotus, Lycopersicon, Lysimachia, Maratia, Medicago, Mimulus, Narcissus, Oenothera, Osmanthus, Petunia, Photinia, Physalis, Phyteuma, Potentilla, Pyracantha, Ranunculus, Rhododendron, Rosa, Rudbeckia, Senecio, Silene, Silphium, Sinapsis, Sorbus, Spartium, Tecoma, Torenia, Tragopogon, Trollius, Tropaeolum, Tulipa, Tussilago, Ulex, Viola y Zinnia.
b) Descripción de las formas preferentes de realización
Un primer objeto de la invención se refiere a un procedimiento para la hidrólisis enzimática de ésteres de cetocarotinoides según la definición en las reivindicaciones 1 ó 2.
En una variante del procedimiento, el tiempo de reacción está comprendido en el intervalo mayor que 1 hora, tal como por ejemplo 1 hasta 48, 5 hasta 45, 10 hasta 40, 15 hasta 35 ó 20 hasta 30 horas. El tiempo necesario para la reacción hasta que se alcance la hidrólisis deseada, esencialmente cuantitativa, puede ser determinado fácilmente por el técnico en la materia mediante la toma de muestras y análisis, por ejemplo de la cantidad consumida de éster.
Las hidrolasas, empleadas preferentemente según la invención, pueden elegirse entre las lipasas (E.C. 3.1.1.3) y las esterasas (E.C. 3.1.1.13), así como mezclas de las mismas. Los enzimas preferente son, por ejemplo, las lipasas procedentes de Candida sp., tal como por ejemplo la lipasa de tipo 7 procedente de Candida rugosa o una colesterinaesterasa procedente de Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas spec., páncreas de ternera y páncreas de cerdo. Otras lipasas preferentes son conocidas procedentes de Candida antarctica, Candida cylindrica, Candida cylindracea, Candida lipolytica, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas spec., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas alcaligenes, Schweinepankreas, Schweineleber, Humicola spec., Rhizomucor miehei, Rhizomucor javanicus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, Alcaligenes spec., Penicillium roqueforti, Penicillium cyclopium, Carica papaya L., Mucor miehei, Aspergillus niger, Chromobacter viscosum, Thermomyces lanuginosa. Los enzimas, según la invención, pueden presentarse en este caso en forma libre (por ejemplo disueltas) o inmovilizada, enlazada con un soporte. Los métodos para la inmovilización enzimática son conocidos por el técnico en la materia y se han descrito, por ejemplo, en la publicación Biotechnology, Rehm et al Hrsg., Vol.3 VCH Verlagsgesellschaft, 2ª edición, capítulo 17.
Es especialmente preferente añadir el enzima a la carga de la reacción en una cantidad total tal, que la actividad total del enzima añadido, referido respectivamente al contenido en el conjunto de carotinoides (en \mug o bien mg) se encuentre en el intervalo siguiente:
\bullet
lipasa: por encima de 10, especialmente por encima de 20, o por encima de 30, tal como especialmente desde 50 hasta 5.000 o desde 50 hasta 4.000 o desde 50 hasta 3.000 o desde 500 hasta 3.000 U/\mug de conjunto de carotinoides.
\bullet
esterasa: por encima de 1, especialmente por encima de 5, tal como por ejemplo desde 10 hasta 500 o desde 50 hasta 300 o desde 100 hasta 200 U/mg de conjunto de carotinoides.
Las actividades enzimáticas totales indicadas corresponden a la actividad enzimática presente al inicio de la reacción o, cuando deba llevarse a cabo la adición en varias porciones a intervalos diferentes de la reacción, la suma numérica de las actividades enzimáticas iniciales de las porciones individuales añadidas.
En una variante preferente del procedimiento se incubará el reactivo que contiene los ésteres de carotinoides en un medio de reacción acuoso con el enzima correspondiente, presentándose el éster de carotinoides en caso dado en forma emulsionada en el medio y añadiéndose al medio de la reacción en caso dado al menos un emulsionante en una cantidad tal, que la proporción cuantitativa entre el emulsionante (por ejemplo en mg) y el carotinoide (por ejemplo en mg) se encuentre en el intervalo desde 100:1 hasta 2.000:1, tal como por ejemplo en el intervalo desde 500:1 hasta 1.000:1.
Preferentemente, el emulsionante abarca al menos un compuesto elegido entre el ácido colánico y sus derivados así como mezclas de estos compuestos. Especialmente el emulsionante es una mezcla (de manera preferente aproximadamente equimolar) de ácido cólico y de ácido desoxicólico.
Además de, o en lugar del sistema emulsionante, anteriormente citado, pueden estar contenidos en los reactivos acuosos, según la invención, otros aditivos mejoradores de la solubilidad de los ésteres de carotinoides hidrófobos. Ejemplos a este respecto son detergentes, tales como, por ejemplo, la digitonina, el octilglucósido, Brij 35 (dodecilpoli(oxietilenglicoléter)), Genapol X-080 (isotridecil(etilenglicoléter)), Nonidet P-40 (etilfenolpoli(etilenglicoléter)), Synperonic P/F 68 (copolímero de polietilenglicol-polipropilenglicol), Synperonic P/F 127 (copolímero de polietilenglicol-polipropilenglicol), Thesit (dodecilpoli(etilenglicoléter), Triton X-100 y Triton X-114 (octilfenolpoli(etilenglicoléter), Tween 20 y Tween 80 (monooleato de poli(oxietileno)sorbitán), decanoil-N-metilglucamida (MEGA 10; N-(D-gluco-2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)-N-metildecanoamida), Deoxy-BigCHAP (N,N-bis-(3-D-gluconamidopropil)-deoxicolamida), n-dodecilglucósido (1-O-n-dodecil-\beta-D-glucopiranósido), n-dodecilmaltósido (1-O-n-dodecil-\beta-D-glucopiranosilo (1\rightarrow4) \alpha-D-glucopiranósido), HECAMEG (6-O-(N-heptil-carbamoil)-metil-\alpha-D-glucopiranósido), octanoil-N-metilglucamida (MEGA 8; N-(D-gluco-2,3,4,5,6-pentahidroxihexil)-N-metiloctanoamida), monolaurato de sucrosa, ácido taurocólico, ácido taurodeoxicólico, dodecilsulfato de litio, dodecilsulfato de sodio, CHAPS (3-(sulfonato de (3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propano), CHAPSO (3-(sulfonato de (3-colamidopropil)dimetilamonio-2-hidroxi-1-propano), sulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano (sulfobetaína SB12), sulfonato de N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano (sulfobetaína SB14) o solubilizantes.
Especialmente el medio de la reacción puede ser un medio acuoso-orgánico, que contenga un disolvente orgánico en una proporción en volumen desde aproximadamente un 5 hasta un 95% en volumen, tal como por ejemplo desde un 5 hasta un 50 o desde un 5 hasta un 30 o desde un 5 hasta un 15% en volumen, referido al volumen total de la carga de la reacción. El disolvente orgánico se elige en este caso entre las cetonas alifáticas inferiores (tal como la acetona), los alcanos con 4 hasta 10 átomos de carbono (tal como el n-butano, el n-pentano, el n-hexano, el n-heptano, el n-octano y sus análogos mono- o polirramificados), los alcanoles con 1 a 10 átomos de carbono (especialmente el metanol, el etanol, el n- o el iso-propanol, el n- o el terc.-butanol), los éteres (tales como los di-alquiléteres con 2 hasta 6 átomos de carbono como por ejemplo el isopropiléter), o el DMSO y la DMF y solubilizantes aromáticos (tales como el benceno, el xileno o el tolueno) y mezclas de los mismos. Cuando se utiliza acetona es preferente una proporción en volumen de la acetona en el intervalo desde aproximadamente 5 hasta 15% en volumen, especialmente del 10% en volumen aproximadamente.
Especialmente se llevará a cabo el procedimiento según la invención de tal manera, que la carga de la reacción presente un valor del pH comprendido en el intervalo desde aproximadamente 6 hasta 8, especialmente desde 6,5 hasta 7,5. Para el ajuste del valor del pH pueden emplearse tampones usuales, tales como por ejemplo tampón de fosfato alcalino, tampón Tris, tampón PIPES o tampón HEPES. El técnico en la materia conoce otros tampones adecuados. La elección del tipo, de la concentración y del intervalo de tamponamiento queda a criterio del técnico en la materia y puede adaptarse de manera óptima a la respectiva carga de la reacción empleada mediante un reducido número de ensayos previos.
En otra forma preferente de realización del procedimiento, según la invención, se incuban los reactantes que contienen ésteres de carotinoides en un medio de reacción esencialmente no acuoso con el enzima correspondiente. El medio de reacción no acuoso contiene en este caso, al menos, un disolvente orgánico, elegido entre los alcanos con 4 hasta 10 átomos de carbono, los alcanoles con 1 hasta 10 átomos de carbono, los disolventes de di-alquiléteres con 2 hasta 6 átomos de carbono y aromáticos, especialmente aquellos según la definición precedente.
El procedimiento, según la invención, es adecuado especialmente para la hidrólisis de un reactivo, que comprenda al menos un monoéster de carotinoides o diéster de carotinoides de un ácido monocarboxílico con 10 hasta 24 átomos de carbono, preferentemente con 14 hasta 20 átomos de carbono según la definición precedente.
Según otra forma preferente de realización del procedimiento, según la invención, el reactivo se deriva de microorganismos naturales o recombinantes, procariotas o eucariotas o de plantas o de partes de las mismas. El reactivo se obtendrá preferentemente mediante extracción con ayuda de un disolvente orgánico (especialmente según la definición precedente) o mezclas de tales disolventes orgánicos.
Según otra forma preferente de realización del procedimiento, según la invención, se lleva a cabo la reacción con varias etapas y mediante adición repetida de enzima. Usualmente es suficiente para una disociación de los ésteres esencialmente cuantitativa que se añada a la medio de la reacción, en una segunda etapa, otra porción de enzima. El instante y la cantidad pueden determinarse de manera sencilla por parte del técnico en la materia.
Si éste observa por ejemplo mediante la toma de muestras que no se lleva a cabo una hidrólisis adicional de los ésteres, aún cuando estén contenidos en el medio todavía ésteres sin reaccionar, éste podrá dosificar ulteriormente una cantidad suficiente de enzima. En caso necesario puede repetirse la redosificación.
Según otra configuración preferente del procedimiento, según la invención, se empleará el enzima en forma enlazada sobre un soporte. Ejemplos de soportes adecuados son, por ejemplo, los que se han descrito en la publicación Biotechnology, Vol. 3, (citada anteriormente).
La temperatura de la reacción se encuentra, según la invención, preferentemente en el intervalo desde aproximadamente 20 hasta 70ºC, según el óptimo de temperatura del biocatalizador empleado. De manera ejemplificativa, la temperatura de la reacción puede encontrarse en el intervalo desde 25 hasta 45 o desde 30 hasta 40ºC.
En otra variante, el reactivo que contiene los ésteres de carotinoides abarca, al menos, un éster de carotinoides diferente del éster de cetocarotinoides, al menos un éster de cetocarotinoides o mezcla de tales ésteres de carotinoides y éster de cetocarotinoides.
Especialmente, el éster de carotinoides se deriva de la astaxantina.
Preferentemente, se aislarán del medio de la reacción los carotinoides y/o los cetocarotinoides disociados, de manera en sí conocida.
El procedimiento, según la invención, puede llevarse a cabo por tandas, de manera semicontinua o de manera continua. La realización del procedimiento puede llevarse a cabo ventajosamente también en bioreactores, tales como los que se han descrito por ejemplo en la publicación Biotechnology, Vol. 3, (citada anteriormente).
Otro objeto de la invención se refiere, finalmente, al empleo de los carotinoides, preparados de la manera anterior, para la fabricación de aditivos para artículos comestibles y para piensos.
c) Obtención de plantas de Tagetes transgénicas productoras de ésteres de cetocarotinoides
Se prepara una planta de Tagetes recombinante, expresante de la actividad de la cetolasa. Con ayuda de esta cetolasa es posible introducir un grupo ceto en el anillo de \beta-ionona de los carotinoides. Las secuencias codificantes de la cetolasa, adecuadas, son conocidas por el estado de la técnica, tal como se han descrito por ejemplo en la publicación Haematococcus pluvialis Accession No.: D45881. Otros genes adecuados y la obtención de constructor más adecuados se han descrito en la publicación DE 10258971, a la que se hace referencia expresa por la presente.
La obtención de las plantas transgénicas puede llevarse a cabo, por ejemplo, de la manera siguiente
Se esterilizan semillas de Tagetes y se siembran en medio de germinación (medio Ms; Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15(1962), 473-497; pH 5,8. 2% de sacarosa). La germinación se produce en un intervalo de temperatura/luz/tiempo de 18 hasta 28ºC/20-200 \muE/3 hasta 16 semanas, preferentemente sin embargo a 21ºC, 20 hasta 70 \muE, durante 4 hasta 8 semanas.
Todas las hojas de las plantas desarrolladas in vitro hasta ese momento se recolectan y se cortan transversalmente al nervio central. Los explantes de hojas formados de este modo, con un tamaño de 10 hasta 60 mm^{2}, se conservan en el transcurso de la preparación en medio líquido MS a temperatura ambiente durante 2 horas como máximo.
Se cultiva durante la noche cualquier cepa de Agrobakterium tumifaciens, preferentemente sin embargo una cepa supervirulenta, tal como por ejemplo la EHA105 con un plásmido binario correspondiente (preparado de manera en sí conocida), que porte un gen marcador de selección (preferentemente bar o pat) así como un gen de cetolasa y se emplea para el cocultivo con el material de las hojas. El cultivo de la cepa bacteriana puede llevarse a cabo de la manera siguiente: se inocula una colonia individual de la cepa correspondiente en YEB (0,1% de extracto de lavadura, 0,5% de extracto de carne de vaca, 0,5% de peptona, 0,5% de sacarosa, 0,5% de sulfato de magnesio x 7 H_{2}0) con 25 mg/l de canamicina y se cultiva durante 16 hasta 20 horas a 28ºC. A continuación se separa la suspensión bacteriana mediante centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos y se vuelve a suspender el medio líquido MS de tal manera, que se establezca un OD_{600} de aproximadamente 0,1 hasta 0,8. Esta suspensión se emplea para el cocultivo con el material de las hojas.
Inmediatamente antes del cocultivo se substituye el medio MS, en el que se han conservado las hojas, por la suspensión bacteriana. La incubación de las hojitas en la suspensión de agrobacterios se lleva a cabo durante 30 minutos bajo ligera aplicación de sacudidas a temperatura ambiente. A continuación se aplican los explantes infectados sobre un medio MH fijado con agar (por ejemplo 0,8% de Plant Agar (Duchefa, NL)) con reguladores del crecimiento, tal como por ejemplo 3 mg/l de bencilaminopurina (BAP) así como 1 mg/l de ácido indolilacético (IAA). La orientación de las hojas sobre el medio no tiene importancia. El cultivo de los explantes tiene lugar durante 1 hasta 8 días, preferentemente sin embargo durante 6 días, pudiéndose emplear en este caso las condiciones siguientes: intensidad luminosa: 30 hasta 80 \muMol/m^{2} x sec, temperatura: 22 hasta 24ºC, alternancia de iluminación/obscuridad de 16/8 horas. A continuación se transfieren los explantes cocultivados sobre medio MS fresco, preferentemente con los mismos reguladores del crecimiento, contenido este segundo medio, además, un antibiótico para reprimir el crecimiento bacteriano. Para esta finalidad es muy adecuada la timentina en una concentración desde 200 hasta 500 mg/l. Como segundo componente selectivo se seleccionará una fosfonotricina, empleada para la selección del éxito de la transformación, que es muy eficiente en una concentración desde 1 hasta 5 mg/l, sin embargo pueden imaginarse también otros componentes selectivos según el procedimiento a ser empleado.
Respectivamente al cabo de una hasta tres semanas se lleva a cabo la transferencia de los explantes sobre medio fresco hasta que se desarrollen brotes y pequeños vástagos, que se transfieren para el enraizamiento a continuación sobre el mismo medio basal con inclusión de timentina y de PPT o de componentes alternativos con reguladores del crecimiento, concretamente por ejemplo 0,5 mg/l de ácido indolilbutírico (IBA) y 0,5 mg/l de ácido giberilínico GA_{3}. Los vástagos enraizados pueden transferirse al invernadero.
Además del método descrito, son posibles las siguientes modificaciones ventajosas:
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como paso previo a que sean infectados los explantes con las bacterias, pueden preincubarse durante 1 hasta 12 días, preferentemente durante 3 hasta 4, en el medio anteriormente descrito para el cocultivo. A continuación se lleva a cabo la invención, el cocultivo y la regeneración selectiva como se ha descrito más arriba.
\bullet
El valor del pH para la regeneración (normalmente 5,8) puede hacerse descender hasta pH 5,2. De este modo se mejora el control del crecimiento de los agrobacterios.
\bullet
La adición de AgNO_{3} (3 a 10 mg/l) al medio para la regeneración mejora el estado del cultivo con inclusión de la propia regeneración.
\bullet
Los componentes, que reducen la formación de fenol y que son conocidos por el técnico en la materia tales como, por ejemplo, el ácido cítrico, el ácido ascórbico, la PVP, tienen una acción positiva sobre el cultivo.
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Puede encontrar aplicación para todo el procedimiento también un medio de cultivo líquido. El cultivo puede incubarse también sobre soportes usuales en el mercado, que se colocan sobre el medio líquido.
A partir de las plantas, transformadas de esta manera, se seleccionarán aquellas con actividad de cetolasa acrecentada, se multiplican y se utilizan como material de partida para la hidrólisis de los ésteres de carotinoides según la invención.
d) Métodos de extracción de los ésteres de carotinoides
Los carotinoides y sus ésteres, tal como la astaxantina y sus monoésteres y diésteres, pueden extraerse mediante disolventes orgánicos a partir de los microorganismos que contienen carotinoide, de las plantas o de las partes de las plantas, que previamente se han secado y/o se han desmenuzado, tal como por ejemplo mediante acetona, hexano, cloruro de metileno, terc.-butilmetiléter o mediante mezclas de disolventes tales como etanol/hexano o acetona/hexano. Mediante proporciones variables de la mezcla de los disolventes puede variarse el efecto de la extracción debido a la diversa polaridad. Mediante una extracción de este tipo pueden enriquecerse los carotinoides y sus ésteres en concentración mayor.
A continuación puede aumentarse todavía más su pureza mediante separación por agitación de los carotinoides y sus ésteres y separación cromatográfica de la mezcla.
Los extractos, preparados de este modo, son especialmente adecuados como reactivos para la realización de la reacción según la invención.
e) Realización general de la hidrólisis de los ésteres catalizada con lipasas
El material de partida desmenuzado (por ejemplo material de los pétalos machacado en el mortero) se extrae con un disolvente orgánico, por ejemplo acetona al 100%, en caso dado varias veces durante un período de tiempo adecuado bajo aplicación de sacudidas (por ejemplo tres veces, respectivamente durante 15 minutos aproximadamente). El disolvente se evapora. Los carotinoides se recogen a continuación en un volumen pequeño de disolvente orgánico, por ejemplo acetona, se diluyen con tampón adecuado, por ejemplo tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH 7,4), por ejemplo en la proporción de 10:1 (tampón respecto al disolvente) y se mezclan perfectamente. A continuación se lleva a cabo, en caso dado, la adición de un emulsionante o dispersante adecuado, tal como por ejemplo sales de bilis (por ejemplo en cantidades desde 1 mg por \mug de carotinoide). Además, es ventajosa la adición de sales estabilizantes, tal como por ejemplo una solución de NaCl/CaCl_{2}. La suspensión se incuba a continuación suficientemente, por ejemplo durante 30 minutos a 37ºC. Para la hidrólisis enzimática de los ésteres de carotinoides se añade entonces una solución de lipasa (por ejemplo lipasa tipo 7 de Candida rugosa (Sigma)) y se incuba bajo aplicación de sacudidas, a 37ºC. Al cabo de una primera fase de incubación, tal como por ejemplo durante 21 horas aproximadamente, se lleva a cabo de nuevo una adición de lipasa con una nueva incubación a 37ºC, por ejemplo durante un período de tiempo de, al menos, aproximadamente 5 horas hasta una hidrólisis de los ésteres esencialmente cuantitativa. La cantidad total empleada de lipasa está comprendida, por ejemplo, desde aproximadamente 500 hasta 3.000 U/\mug de carotinoide. A continuación se extraen los carotinoides por medio de una mezcla vigorosa (tras adición de Na_{2}SO_{4} (anhidro)) en un disolvente orgánico esencialmente no miscible con agua, tal como por ejemplo éter de petróleo. Esta aplicación de sacudidas se repite hasta que la fase orgánica permanezca incolora. Las fracciones orgánicas se reúnen y el disolvente se evapora. Los carotinoides libres se analizan a continuación.
f) Realización general de una hidrólisis de los ésteres catalizada por medio de esterasa
El material de partida desmenuzado, por ejemplo material de los pétalos machacado en el mortero, se extrae con un disolvente orgánico, por ejemplo acetona al 100%, en caso dado varias veces durante un período de tiempo adecuado con aplicación de sacudidas (por ejemplo tres veces, respectivamente durante aproximadamente 15 minutos). El disolvente se evapora. Los carotinoides se recogen a continuación en un volumen adecuado de un disolvente orgánico, tal como por ejemplo la acetona (absorción a 475 nm por ejemplo comprendida entre 0,75 y 1,25) y se suspende, por ejemplo mediante un tratamiento durante 5 minutos en el baño de ultrasonidos. El extracto de los carotinoides se mezcla con un tampón adecuado (por ejemplo tampón Tris-HCl, 50 mM; pH 7,0) y se incuba (por ejemplo durante 5 a 10 minutos a 37ºC). A continuación se lleva a cabo la adición de la esterasa (por ejemplo una colesterol-esterasa procedente de Pseudomonas spec. o de una colesterol-esterasa de Pseudomonas fluorescens). Al cabo de una primera fase de incubación (por ejemplo al cabo de 8 a 12 horas) se añade nuevamente enzima. La hidrólisis de los ésteres, esencialmente cuantitativa, se lleva a cabo en el transcurso de aproximadamente 24 horas con incubación a 37ºC. La cantidad total empleada de esterasa está comprendida por ejemplo desde aproximadamente 10 hasta 500 U/mg de carotinoide. Tras adición de sal, por ejemplo Na_{2}SO_{4} (anhidro) se mezcla perfectamente con un disolvente orgánico esencialmente no miscible con agua, tal como éter de petróleo y se centrifuga (por ejemplo durante 3 minutos; 4.500 g). Este proceso se repite varias veces en caso dado. Las fases orgánicas se reúnen y se evaporan. Los carotinoides formados se analizan a continuación.
g) Hidrólisis de los ésteres en disolventes orgánicos en lugar de un medio acuoso
Pueden ser ventajosas las hidrólisis de los ésteres en disolventes orgánicos puesto que
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el disolvente orgánico puede desplazar el equilibrio termodinámico,
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algunas lipasas exponen su centro catalítico únicamente en presencia de una fase lípida o, probablemente, en disolvente orgánico,
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el empleo de sales de bilis en medio acuoso es costoso,
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las lipasas permanecen activas en disolventes orgánicos durante prolongados períodos de tiempo (semanas hasta meses) incluso a temperaturas elevada de, por ejemplo, 60ºC.
La hidrólisis de los ésteres, según la invención, puede llevarse a cabo por ejemplo con una lipasa B, inmovilizada, de Candida antarctica, NOVO 435 de Novo Nordisk, en n-heptano al 100% para la hidrólisis de los ésteres de carotinoides incluso a temperaturas elevadas de hasta 60ºC.
Se observan proporciones de hidrólisis esencialmente cuantitativas.
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Como otros medios de reacción orgánicos empleables pueden imaginarse el n-butanol, el hexano, el isooctano, el tolueno, el butiléter y el isopropiléter.
h) Elaboración de los productos de la reacción
El producto, preparado según el procedimiento de acuerdo con la invención, tal como por ejemplo la astaxantina, puede obtenerse ventajosamente a partir de la solución acuosa de la reacción mediante extracción.
La extracción puede repetirse varias veces para aumentar el rendimiento. Ejemplos de agentes adecuados para la extracción son disolventes tales como el tolueno, el cloruro de metileno, el acetato de butilo, el diisopropiléter, el benceno, el MTBE, el éter de petróleo o el ácido acético, sin que éstos sean limitativos.
Cuando la reacción se lleve a cabo en medio orgánico, será suficiente una primera etapa de separación del enzima de la fase orgánica. Tras concentración de la fase orgánica, obtenida de este modo, pueden obtenerse los productos, por regla general, con una buena pureza química.
Tras la extracción puede concentrarse por evaporación la fase orgánica con el producto así como también únicamente de manera parcial y el producto se separa por cristalización. Para ello se enfriará la solución ventajosamente a una temperatura de 0ºC hasta 10ºC. La cristalización puede llevarse a cabo también directamente a partir de la solución orgánica. El producto separado por cristalización puede recogerse de nuevo en el mismo disolvente o en otro disolvente para una nueva cristalización y separarse nuevamente por cristalización.
No obstante, es posible, también, purificar todavía más el producto preparado según la invención. Para ello se someterá al medio, que contiene el producto, en caso dado tras la separación del enzima, a una cromatografía con una resina adecuada, reteniéndose total o parcialmente sobre la resina cromatográfica el producto deseado o las impurezas. Estas etapas cromatográficas pueden repetirse en caso necesario, empleándose resinas cromatográficas iguales o diferentes. El técnico en la materia está especializado en la selección de las resinas cromatográficas adecuadas y en su empleo más eficaz.
La identidad y la pureza del o de los compuestos aislados puede determinarse mediante técnicas conocidas. Éstas abarcan la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), los procedimientos espectroscópicos, los procedimientos colorimétricos, la cromatografía de capa delgada, los ensayos enzimáticos o los ensayos microbiológicos. Estos procedimientos de análisis están reunidos en las publicaciones: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; y de Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) tomo A27, VCH: Weinheim, páginas 89-90, páginas 521-540, páginas 540-547, páginas 559-566, 575-581 y páginas 581-587; Michal, Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tomo
17.
i) Aplicaciones de los productos preparados según la invención
Los productos de hidrólisis, según la invención, son adecuados especialmente como aditivos para artículos comestibles y para piensos. Éstos favorecen, ante todo, la pigmentación tras administración, preferentemente oral.
Se entenderá por "pigmentación" según la invención, preferentemente, la intensificación o bien la provocación de un color al menos de una parte de un animal o de productos animales del animal pigmentado en comparación con el animal no pigmentado. De este modo los pigmentos que contienen astaxantina provocan, especialmente, la generación o la intensificación de una tonalidad de color rosa hasta rosa-roja.
Los animales preferentes, que pueden ser pigmentados mediante la administración oral, según la invención, son animales elegidos entre peces, crustáceos o aves, especialmente gallináceas y ánades. Los peces preferentes son salmónidos, especialmente salmones o truchas. Los crustáceos preferentes son camarones o cangrejos. Las gallináceas preferentes son gallinas, pavos o gansos. El ánade preferente es el flamenco.
De acuerdo con el animal pigmentado se entenderán por productos animales pigmentados, de forma especialmente preferente la carne de salmón o de trucha, la piel de gallinas, de pavos o de gansos, las plumas de gallinas, de pavos, de gansos o de flamencos y los huevos o bien yema del huevo de gallinas, de pavos o de gansos.
La administración oral de los carotinoides a los animales puede llevarse a cabo directamente o, preferentemente, a través de una administración oral de preparaciones de pienso, a las cuales se haya mezclado el carotinoide. Los carotinoides pueden estar presentes en este caso en forma sólida o líquida. Los carotinoides pueden añadirse directamente a la preparación para el pienso, en tanto en cuanto sean fisiológicamente aceptables para los animales correspondientes los disolventes aún contenidos o pueden emplearse tras eliminación por evaporación de los disolventes aún contenidos en forma de polvo que contenga el carotinoide o de aceites. No es obligatoriamente necesaria una purificación previa del producto de hidrólisis obtenido.
El polvo o los aceites que contienen el carotinoide, obtenidos, puede incorporarse por ejemplo en aceite de pescado, pueden aplicarse sobre materiales pulverulentos de soporte, tal como por ejemplo harina de trigo o pueden ocluirse en alginatos, gelatinas o lípidos.
La invención se refiere, por lo tanto, también a preparaciones de pienso, que contengan, además de los componentes usuales del pienso, al menos un hidrolizado de carotinoides según la invención.
De este modo una preparación de pienso de pescado puede contener, por ejemplo, otros componentes usuales para los piensos de pescado, tales como por ejemplo harina de pescado y/o otras proteínas, aceites, tales como por ejemplo aceite de pescado, cereales, vitaminas, minerales, agentes para la conservación y, en caso dado, medicamentos, en cantidades usuales.
Una receta típica de pienso para pescado para truchas se compone por ejemplo por los componentes siguientes:
1 
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Una receta típica de pienso para pescado para salmones se compone por ejemplo por los componentes siguientes:
2
Pueden mezclarse con las preparaciones para piensos de animales los hidrolizados según la invención en forma de polvo o en forma líquida, tal como por ejemplo en forma de aceite. Las preparaciones para pienso de animales, obtenidas de este modo, pueden pelletizarse en forma en sí conocida o, de forma especialmente preferente puede extrudirse.
En una forma preferente de realización se mezclarán los preparados que contienen carotinoide con las preparaciones para el pienso de los animales preferentemente en forma líquida. Esto es especialmente ventajoso en el caso de la fabricación de preparaciones extrudidas para pienso. El procedimiento de extrusión conduce a tensiones por extrusión sobre los productos sensibles, tal como por ejemplo la astaxantina, que pueden conducir a una pérdida de astaxantina. El estrés provocado por la extrusión está constituido, inicialmente, por la acción de las fuerzas mecánicas (amasado, cizallado, compresión, etc.) sin embargo puede estar constituido también por estrés hidrotérmico provocado por la adición de agua y de vapor de agua, observándose también estrés por oxidación.
Para evitar las pérdidas de producto que se producen debido al procedimiento de extrusión anteriormente descrito, pueden aplicarse los extractos líquidos que contengan carotinoides mediante la tecnología denominada PPA tras la extrusión - y el procedimiento de secado, bajo vacío (aplicación post pelletizado -post pelleting application-).
Los hidrolizados, que contienen carotinoides pueden administrarse también directamente por vía oral a los animales en tanto en cuanto sean fisiológicamente aceptables para los animales correspondientes los disolventes contenidos todavía.
Los hidrolizados que contienen carotinoides pueden elaborarse sin embargo también después de la eliminación por evaporación del disolvente todavía presente, en forma de polvo o de aceites.
Los polvos o aceites que contienen carotinoides, obtenidos, pueden incorporarse por ejemplo en aceite de pescado, aplicarse sobre materiales de soporte pulverulentos, tal como por ejemplo harina de trigo o pueden ocluirse en alginatos, e gelatinas o en lípidos.
Así pues, la invención se refiere también a agentes pigmentantes, que contienen hidrolizados que contienen carotinoides, pudiéndose procesar éstos en caso dado como se ha descrito precedentemente.
Parte experimental Ejemplo 1 Hidrólisis enzimática, catalizada por medio de colesterol-esterasa, de ésteres de carotinoides procedentes de material procedente de plantas e identificación de los carotinoides Rutina general de trabajo
Se extrae material procedente de plantas, machacado en el mortero (por ejemplo material de pétalos) (peso fresco 50 hasta 100 mg) con acetona al 100% (tres veces 500 \mul; aplicación de sacudidas respectivamente durante 15 minutos aproximadamente). El disolvente se evapora. A continuación se recogen los carotinoides con 400 \mul de acetona (absorción a 475 nm entre 0,75 y 1,25) y tratamiento durante 5 minutos en el baño de ultrasonidos. El extracto de los carotinoides se mezcla con 300 \mul de tampón 50 mM Tris-HCl (pH 7,0) y se incuba durante 5 hasta 10 minutos a 37ºC. A continuación se lleva a cabo la adición de 100 hasta 200 \mul de colesterol-esterasa (solución madre: 6,8 U/ml de una colesterol-esterasa de Pseudomonas spec.). Al cabo de 8 hasta 12 horas se añaden de nuevo de 100 hasta 200 \mul de enzima; la hidrólisis de los ésteres se lleva a cabo en el transcurso de 24 horas mediante incubación a 37ºC. Tras adición de 0,35 g de Na_{2}SO_{4}x10H_{2}0 y 500 \mul de éter de petróleo se mezcla perfectamente y se centrifuga (3 minutos; 4.500 g). La fase del éter de petróleo se retira y se mezcla de nuevo con 0,35 g de Na_{2}SO_{4} (anhidro). Centrifugación durante 1 minuto a 10.000 g. El éter de petróleo se evapora y los carotinoides libres se recogen en 100 hasta 120 \mul de acetona. Los carotinoides libres pueden identificarse mediante el tiempo de retención y los espectros de UV-VIS mediante HPLC y columna en fase inversa C30.
Ejemplo 2 Hidrólisis enzimática, catalizada con lipasa de ésteres de carotinoides, procedentes de material procedente de plantas e identificación de los carotinoides Rutina general de trabajo
a) Se extrae material procedente de plantas, machacado en el mortero (por ejemplo material de pétalos) (peso fresco 30-100 mg) con acetona al 100% (tres veces 500 \mul; aplicación de sacudidas respectivamente durante 15 minutos aproximadamente). El disolvente se evapora. Los carotinoides se recogen a continuación en 495 \mul de acetona. Se añaden 4,95 ml de tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH 7,4) y se mezclan perfectamente. A continuación se lleva a cabo la adición de aproximadamente 17 mg de sales de bilis (Sigma) y 149 \mul de una solución de NaCl/CaCl_{2} (3M NaCl y 75 mM de CaCl_{2}). La suspensión se incuba durante 30 minutos a 37ºC. Para la hidrólisis enzimática de los ésteres de carotinoides se añaden 595 \mul de una solución de lipasa (50 mg/ml de lipasa tipo 7 de Candida rugosa (Sigma)) y se incuban a 37ºC, con aplicación de sacudidas. Aproximadamente al cabo de 21 horas se lleva a cabo de nuevo una adición de 595 \mul de lipasa y una nueva incubación durante al menos 5 horas a 37ºC. A continuación se disuelven aproximadamente 700 mg de Na_{2}SO_{4} (anhidro) en la solución. Tras adición de 1.800 \mul de éter de petróleo se extraen los carotinoides mediante mezcla vigorosa, en la fase orgánica. Esta aplicación de sacudidas se repite hasta que la fase orgánica permanezca incolora. Las fracciones de éter de petróleo se combinan y el éter de petróleo se evapora. Los carotinoides libres se recogen en 100 hasta 120 \mul de acetona. Los carotinoides libres pueden identificarse debido al tiempo de retención y a los espectros UV-VIS por medio de HPLC y de columna en fase inversa C30. Las sales de bilis empleadas o las sales de los ácidos biliares son mezclas 1:1 de colato y de desoxicolato.
b) Rutina de trabajo para la elaboración, cuando estén presentes únicamente pequeñas cantidades de ésteres de carotinoides en el material procedente de plantas
Alternativamente puede conseguirse la hidrólisis de los ésteres de carotinoides mediante lipasas de Candida rugosa tras separación mediante cromatografía de capa delgada. Para ello se extraen de 50 hasta 100 mg de material procedente de plantas tres veces con aproximadamente 750 \mul de acetona. El extracto del disolvente se concentra por vacío en el evaporador rotativo (son tolerables temperaturas elevadas de 40 hasta 50ºC). A continuación se lleva a cabo la adición de 300 \mul de éter de petróleo:acetona (proporción 5:1) y buen removido. Los productos sobrenadantes se sedimentan mediante centrifugación (1 a 2 minutos). La fase superior se transfiere a un nuevo recipiente de reacción. El resto remanente se extrae de nuevo con 200 \mul de éter de petróleo:acetona (proporción 5:1) y los productos sobrenadantes se eliminan mediante centrifugación. Los dos extractos se combinan (volumen 500 \mul) y el disolvente se evapora. El residuo se suspende de nuevo en 30 \mul de éter de petróleo:acetona (proporción 5:1) y se aplica sobre una placa de capa delgada (gel de sílice 60, Merck). En el caso en que se requiera más de una aplicación con fines de análisis preparativo, deberán elaborarse varias alícuotas con, respectivamente, 50 hasta 100 mg de peso fresco en la forma descrita para la separación mediante cromatografía en capa delgada.
La placa de capa delgada se revela en éter de petróleo:acetona (proporción 5:1). Las bandas de los carotinoides pueden identificarse a simple vista debido a su color. Las bandas individuales de los carotinoides se desprenden por raspado y pueden reunirse con fines de análisis preparativo. Los carotinoides se eluyen con acetona del material de sílice; el disolvente se evapora en vacío. Para la hidrólisis de los ésteres de los carotinoides se disuelve el residuo en 495 \mul de acetona, 17 mg de sales de bilis (Sigma), 4,95 ml de tampón 0,1M de fosfato de potasio (pH 7,4) y se añaden 149 \mul de NaCl 3M, 75 mM de CaCl_{2}. Tras un buen removido se equilibra durante 30 minutos a 37ºC. A continuación se lleva a cabo la adición de 595 \mul de lipasa de Candida rugosa (Sigma, solución madre de 50 mg/ml en CaCl_{2} 6mM). Durante la noche se produce la incubación con lipasa mediante aplicación de sacudidas, a 37ºC. Aproximadamente al cabo de 21 horas se añade de nuevo la misma cantidad de lipasa; se incuba al menos durante 5 horas M/44120-PCT de nuevo a 37ºC con aplicación de sacudidas. A continuación se lleva a cabo la adición de 700 mg de Na_{2}SO_{4} (anhidro); se aplican sacudidas durante aproximadamente 1 minuto con 1.800 \mul de éter de petróleo y la mezcla se centrifuga a 3.500 revoluciones/minuto durante 5 minutos. La fase superior se transfiere a un nuevo recipiente de reacción y se repite la aplicación de sacudidas hasta que la fase superior sea incolora. Las fases de éter de petróleo, reunidas, se concentran por evaporación en vacío (son posibles temperaturas desde 40 hasta 50ºC). El residuo se disuelve en 120 \mul de acetona, eventualmente mediante ultrasonidos. Los carotinoides disueltos pueden separarse mediante HPLC con empleo de una columna C30 y cuantificarse mediante sustancias de referencia.
Los datos precedentes en los ejemplos 1 y 2 son transferibles, de manera correspondiente, a material procedente de algas.
Ejemplo 3 Análisis mediante HPLC de los carotinoides libres
El análisis de las muestras obtenidas según las rutinas de trabajo de los ejemplos 1 y 2 se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:
Se establecieron las condiciones HPLG siguientes:
Columna de separación:
Columna Prontosil C30, 250 x 4,6 mm, (Bischoff, Leonberg, Alemania)
Flujo:
1,0 ml/min
Eluyentes:
Eluyente A - metanol al 100%
Eluyente B - metanol al 80%, acetato de amonio al 0,2%
Eluyente C - t-butil-metiléter al 100%
Detección:
300-530 nm
Perfil de los gradientes
3
Algunos tiempos de retención típicos para los carotinoides formados según la invención son, por ejemplo: violaxantina 11,7 minutos, astaxantina 17,7 minutos, adonixantina 19 minutos, adonirubina 19,9 minutos, zeaxantina 21 minutos.
Algunos intervalos típicos de tiempos de retención para los ésteres de los carotinoides, formados según la invención:
En el caso de Haematococcus están esterificados los carotinoides, en el caso más frecuente, con palmitato, oleato, linolato y linoleato. Los tiempos típicos de retención están comprendidos entre 28 y 40 minutos.
En caso de Tagetes, los representantes de los ésteres de carotinoides más frecuentes son el dipalmitato, el miristato-palmitato, el palmitato-estearato y el dimiristato; los monoésteres son claramente más raros. Los tiempos típicos de retención se encuentran comprendidos entre 28 y 38 minutos.
Los ésteres de los carotinoides en pimiento portan ácidos grasos con una longitud con 12 hasta 16 átomos de carbono tal como por ejemplo el ácido láurico, el ácido mirístico y el ácido palmítico. En el caso más frecuente se presentan en el pimiento rojo carotinoides esterificados con ácido linoleico, con ácido palmitínico y con ácido linolénico. Los tiempos de retención típicos se encuentran comprendidos entre 28 y 40 minutos.
En el caso de Adonis, los carotinoides están esterificados, en el caso más frecuente, con oleato, palmitato, miristato, linoleato y laurato. Los tiempos típicos de retención están comprendidos entre 28 y 38 minutos.
Ejemplo 4 Hidrólisis de ésteres catalizada con lipasa con diversas fuentes de ésteres de carotinoides
Siguiéndose las enseñanzas generales del ejemplo 2a se preparan y se hidrolizan los extractos de ésteres de carotinoides a partir de las fuentes vegetales o bien algas siguientes:
Pimiento (Capsicum annuum I.)
Adonis (Adonis aestivalis)
Tagetes (Tagetes erecta)
BioAstin (Haematococcus pluvialis)
Además se varió el contenido en emulsionante (contenido en sales de bilis) en los diversos experimentos.
Las proporciones de hidrólisis determinadas se han reunido en la tabla siguiente.
Proporciones de hidrólisis para diversas fuentes de ésteres
5
Las proporciones de hidrólisis están referidas a la cantidad total de ésteres. Éstas son, en el caso de Adonis y de Haematococcus casi exclusivamente ésteres de cetocarotinoides, en el caso de Tagetes y de pimiento son exclusivamente ésteres de carotinoides.

Claims (25)

1. Procedimiento para la hidrólisis enzimática de ésteres de cetocarotinoides, en el que se incuba un reactivo, que contenga ésteres de cetocarotinoides, derivado de un organismo natural o genéticamente modificado, con un enzima disociador de los ésteres, elegido entre lipasas (E.C. 3.1.1.3), hasta una disociación de los ésteres por hidrólisis del 85 hasta el 100%.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el o los cetocarotinoide(s) formados se aíslan de la carga de la reacción.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el tiempo de retención se encuentra en el intervalo desde 1 hasta 48 horas.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se añade a la carga de la reacción enzima en una cantidad total tal, que la concentración total en lipasa añadida, con relación al contenido total en carotinoides, se encuentre en el intervalo desde 50 hasta 3.000 U/\mug.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se incuba un reactivo, que contiene ésteres de cetocarotinoides, en un medio acuoso de reacción con el enzima disociador de los ésteres.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que los ésteres de cetocarotinoides están presentes en forma emulsionada en el medio.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se añade al medio de la reacción al menos un emulsionante en una cantidad tal, que la proporción cuantitativa entre el emulsionante y el conjunto de carotinoides se encuentre en el intervalo desde 500:1 hasta 1.000:1.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 y 7, en el que el emulsionante comprende al menos un compuesto elegido entre el ácido cólico y sus derivados así como mezclas de estos compuestos.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el emulsionante es una mezcla de ácido cólico y de ácido desoxicólico
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la carga de la reacción presenta un valor del pH en el intervalo desde aproximadamente 6 hasta 8.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de la reacción es un medio acuoso-orgánico, que contiene un disolvente orgánico en una proporción en volumen desde un 5 hasta un 95% en volumen, referido al volumen total de la carga de la reacción.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el disolvente orgánico se elige entre las acetona, los alcanos con 4 hasta 10 átomos de carbono, los alcanoles con 4 hasta 10 átomos de carbono, los di-alquiléteres con 2 hasta 6 átomos de carbono y los disolventes aromáticos y sus mezclas.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el reactivo, que contiene los ésteres de los cetocarotinoides se incuba con el enzima disociador de los ésteres en un medio de reacción no acuoso, que contenga disolventes orgánicos en una proporción mayor que el 95% en volumen.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el medio de la reacción no acuoso contiene al menos un disolvente orgánico, elegido entre los alcanos con 4 hasta 10 átomos de carbono, los alcanoles con 4 hasta 10 átomos de carbono, los di-alquiléteres con 2 hasta 6 átomos de carbono y los disolventes aromáticos.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el enzima es una lipasa de Candida sp.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo comprende al menos un monoéster o diéster de cetocarotinoides de un ácido monocarboxílico con 10 hasta 24 átomos de carbono, preferentemente con 12 hasta 20 átomos de carbono
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo se deriva de microorganismos naturales o recombinantes, procariotas o eucariotas o de plantas o de partes de las mismas.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el reactivo se obtiene mediante extracción con ayuda de un disolvente orgánico o mezclas de disolventes orgánicos.
19. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se lleva a cabo a través de varias etapas con adición repetida de enzima.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el enzima se emplea en forma enlazada sobre un soporte.
21. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura de la reacción se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 20 hasta 70ºC.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo, que contiene los ésteres de los cetocarotinoides, abarca al menos un éster de cetocarotinoides o mezcla de ésteres de carotinoides y de ésteres de cetocarotinoides.
23. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se aíslan del medio de la reacción los cetocarotinoides disociados.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el éster de cetocarotinoides se deriva de astaxantina.
25. Empleo de los cetocarotinoides, preparados según una de las reivindicaciones precedentes, para la fabricación de aditivos para artículos comestibles y para piensos.
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