ES2274573T3 - Inmunogenos quimericos tipo exotoxina a de pseudomonas para provocar una respuesta inmunitaria mediada por iga secretora. - Google Patents
Inmunogenos quimericos tipo exotoxina a de pseudomonas para provocar una respuesta inmunitaria mediada por iga secretora. Download PDFInfo
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Abstract
El uso un inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad provocada por un patógeno que penetra en un mamífero a través de una membrana mucosa, en el que el medicamento es para aplicar a una superficie mucosa del mamífero para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra el patógeno, en el que además el inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de mucosa; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio Ib de PE y codifica un epítopo del patógeno; y (4) una secuenciade aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE y en el que el dominio de retención en el RE carece de actividad de ADP-ribosilación.
Description
Inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de
Pseudomonas para provocar una respuesta inmunitaria mediada
por IGA secretora.
Esta invención se refiere a los campos de las
proteínas quiméricas y la inmunología.
La inmunización contra las enfermedades
infecciosas ha sido uno de los grandes logros de la medicina
moderna. Las vacunas pueden ser útiles sólo si la vacuna en sí, no
es significativamente patógena. Muchas vacunas se producen
inactivando el patógeno. Por ejemplo, pueden prepararse vacunas de
hepatitis calentando el virus y tratándolo con formaldehído. Otras
vacunas, por ejemplo ciertas vacunas contra la polio, se producen
atenuando un patógeno vivo. Sin embargo, existe preocupación sobre
la producción de vacunas atenuadas para ciertos agentes infecciosos
cuya patología no se comprende totalmente, tal como VIH.
La biología molecular ha permitido la producción
de vacunas con subunidades; vacunas en las que el inmunógeno es un
fragmento o subunidad de una proteína parental o complejo. Se están
evaluando proteínas de la cubierta de VIH-1, tal
como gp120, para vacunas con subunidades. Varios estudios han
sugerido que los anticuerpos contra la región del bucle V3 de gp120
proporcionan protección a través de la neutralización del virus.
(Emini, E.A., y cols., 1992, Nature 355,
728-30: Javaherian. K., y cols., 1989, Proc Natl
Acad Sci USA 86, 6768-72; Steimer. K.S. y
cols., 1991, Science 254, 105-8; Wang, C.Y.,
y cols., 1991, Science 254, 285-8).
Sin embargo, las vacunas con subunidades pueden
no ser lo suficientemente complejas para generar una respuesta
inmunitaria apropiada. También, cuando el patógeno es muy mutable,
tal como VIH, las vacunas con subunidades que provocan una
inmunidad específica de cepa pueden no ser eficaces para
proporcionar una protección global. Además, la inyección de virus
inactivos o incluso de la proteína de la cubierta misma tiene
potencial de producir una mezcla de anticuerpos neutralizadores y
los denominados "potenciadores". (Toth, F.D., y cols., 1994,
Clin Exp Immunol 96, 389-94; Eaton. A.M., y
cols., 1994, Aids Res Hum Retroviruses 10,
13-8; Mitchell, W.M. y cols., 1995, Aids 9,
27-34; Montefiori, D.C., y cols., 1996, J Infect
Dis 173, 60-7).
La capacidad inmunógena de las vacunas con
subunidades algunas veces se aumenta acoplando la subunidad a una
proteína transportadora creando una vacuna conjugada. Una de tales
proteínas transportadoras la exotoxina A de Pseudomonas
("PE"). Los investigadores ligaron covalentemente un
O-polisacárido no inmunógeno derivado de
lipopolisacárido ("LPS") a PE. La vacuna conjugada resultante
provocó una respuesta inmunitaria contra LPS y PE. (S.J. Cryz, Jr.
y cols. (1987) J. Clin. Invest., 80: 51-56 y
S. J. Cryz, Jr. y cols. (1990) J. Infectious Diseases, 163:
1040-1045). En otro estudio, los investigadores
fueron capaces de evocar una respuesta inmunitaria contra un
antígeno de Plasmodium falciparum acoplándolo mediante un
espaciador a PE. (J. U. Que y cols. (1988) Infection and
Immunity, 56: 2645-49). En un tercer estudio,
los investigadores inactivaron PE y la entrecruzaron químicamente
con péptidos del dominio neutralizante principal ("PND") de
VIH-1. La vacuna conjugada provocó la producción de
anticuerpos que reconocían el péptido PND y neutralizaban la cepa
homóloga, VIH-1_{MN}. (S.J. Cryz, Jr. y cols.
(1995) Vaccine, 13: 66-71).
Se han construido proteínas quiméricas que
contienen componentes de VIH-1 y se han evaluado sus
propiedades inmunógenas. Éstas incluyen: un antígeno de poliovirus
que contiene un epítopo de la glucoproteína transmembrana gp41 de
VIH-1 (Evans, D.J., y cols., 1989, Nature
339, 385-8), una proteína mucina que contiene copias
múltiples del bucle V3 (Fontenot, J.D., y cols.; 1995, Proc Natl
Acad Sci USA, 92, 315-9) una cadena B de cólera
genéticamente modificada con secuencias del bucle V3 (Backstrom, M.,
y cols., 1994. Gene 149, 211-7) y un
conjugado peptídico de PE inactivado químicamente y bucle V3 (Cryz,
S., Jr., y cols., 1995, Vaccine 13,
67-71).
El tercer bucle variable (V3) de la proteína de
la cubierta, gp120, contiene el dominio neutralizante principal de
VIH-1. (Emini, E.A., y cols., 1992, Nature
355, 728-30; Javaherian, K., y cols., 1989, Proc
Natl Acad Sci USA 86, 6768-72: Rusche. J.R., y
cols., [aparecen erratas publicadas en Proc Natl Acad Sci
USA 22, 8697 1988, y Proc Natl Acad Sci USA 51 1667
1989]; Proc Natl Acad Sci USA 85, 3198-202
1988). Aunque los bucles V3 varían considerablemente entre las
diversas cepas de VIH -1 (Berman. P. W . y cols., 1990,
Nature 345, 622-5) se ha demostrado que los
anticuerpos específicos contra esta región neutralizan la capacidad
infecciosa del virus y evitan la fusión del virus y la célula in
vitro (Kovacs, J .A. y cols. 1993, J. Clin Invest 92,
919-28). Además, la inmunización sistémica con una
forma recombinante de gp120 parece ser suficiente para proteger a
los chimpancés de la infección por exposición sistémica a
VIH-1. White-Scharf, M.E., y cols.,
1993, Virology 192, 197-206.
VIH con frecuencia penetra en el cuerpo por las
superficies mucosas. Sin embargo, se desconoce que los inmunógenos
contra VIH conocidos actualmente provoquen una respuesta inmunitaria
secretora, que inhibiría el acceso de los virus a través de las
mucosas.
Sería deseable el desarrollo de una vacuna
estable que podría provocar respuestas tanto humorales como
celulares, incluyendo la inmunidad mucosa y que fuera lo
suficientemente flexible para incorporar secuencias de muchas cepas
de un agente infeccioso, tal como VIH-1.
Los inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de
Pseudomonas ("tipoPE") en los que se ha insertado un
epítopo exógeno en el dominio Ib son útiles para provocar
respuestas inmunitarias humorales, mediadas por células y
secretoras contra el epítopo exógeno. En particular, el epítopo
exógeno puede ser el bucle V3 de la proteína gp120 de VIH. Tales
quimeras son útiles en vacunas contra la infección por VIH.
Los inmunógenos quiméricos PE ofrecen diversas
ventajas. Primero, pueden prepararse completamente por medios
recombinantes. Esto elimina la necesidad de unir el epítopo a PE
mediante entrecruzamiento químico y de inactivar químicamente la
exotoxina. La tecnología recombinante también permite preparar un
"casete" quimérico que tenga un sitio de inserción para el
epítopo exógeno elegido en la localización del dominio Ib. Esto
permite insertar rápidamente variantes existentes de un epítopo, o
variantes nuevas de epítopos que evolucionan rápidamente. Esto
permite la producción de vacunas que incluyen un cóctel de
inmunógenos diferentes.
Segundo, la exotoxina de Pseudomonas
puede diseñarse alterando la función de sus dominios, proporcionando
así una variedad de actividades. Por ejemplo, al sustituir el
dominio natural de unión de células de exotoxina A de
Pseudomonas (dominio Ia) por un ligando para un receptor
celular particular, puede dirigirse a la quimera para que se una al
tipo celular particular.
Tercero, debido a que el dominio Ib incluye un
bucle de cisteína a cisteína, los epítopos que son de naturaleza
muy constreñida pueden presentarse en una conformación casi natural.
Esto ayuda a provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno
natural. Por ejemplo, es evidente un motivo
giro-giro-hélice con los péptidos
circulares (restringidos por un enlace disulfuro) pero no con los
lineales. (Ogata, M., y cols., 1990, Biol Chem 265,
20678-85). También los péptidos circulares son
reconocidos más fácilmente por los anticuerpos monoclonales contra
el bucle V3 que los lineales. (Catasti, P., y cols., 1995, J Biol
Chem 270, 2224-32).
Cuarto, las quimeras descritas actualmente
pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria humoral, una
mediada por células o una secretora. Se ha reseñado que la exotoxina
de Pseudomonas actúa como un "superantígeno", al unirse
directamente a las moléculas de CHM Clase II sin procesamiento
previo en la célula presentadora de antígeno. P.K. Legaard y cols.
(1991) Cellular Inmunology 135: 372-382. Esto
promueve una respuesta inmunitaria mediada por CHM Clase II contra
células que portan proteínas que contienen el epítopo exógeno.
También, al unirse al receptor de la superficie celular, las
exotoxinas quiméricas de Pseudomonas se translocan al
citosol. Esto posibilita una respuesta inmunitaria dependiente de
CHM Clase I contra las células que portan el epítopo exógeno en su
superficie. Este aspecto es particularmente ventajoso porque
normalmente el sistema inmunitario monta una respuesta inmunitaria
dependiente de CHM Clase I solamente contra proteínas producidas
por la célula. También, al dirigir la quimera a una superficie
mucosa, se puede provocar una respuesta inmunitaria secretora que
involucre a las IgA.
Moore y cols., 1995, Vaccine, Vol 13. n.º 18,
174171-1741749 describe que la inmunización con una
proteína recombinante de la cubierta de VIH atrapada en
micropartículas biodegradables indujo respuestas consistentes de
linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de VIH en ratones. Se
describe que la inmunización con tales micropartículas por vía
intranasal indujo niveles modestos de IgA secretora.
Hinkula y cols., 1997, Vaccine. Vol 15, n.º 8,
874-878 describe que puede inducirse la inmunidad
contra proteínas reguladoras de VIH-1 mediante
vacunación con genes. Se describe que una combinación de cinco genes
proporcionó una reactividad potente contra todos ellos, y que la
inmunización intranasal produjo una buena actividad en la mucosa
induciendo respuestas de proliferación de IgG, IgA y linfocitos
T.
Rubinstein y cols., 1995, AIDS, Vol 9, n.º 3,
243-251 se refiere a un conjugado que comprende un
péptido del dominio neutralizante principal de
VIH-1. El conjugado se administró por vía
intradérmica y, después de la segunda inmunización, se detectaron
anticuerpos en 10 de los 11 voluntarios; tras la cuarta
inmunización, se detectaron anticuerpos de afinidad alta. Se
detectaron valoraciones altas de IgG e IgA en el suero y la saliva
de todos los sujetos analizados.
En un aspecto, esta invención proporciona un
inmunógeno quimérico no tóxico tipo exotoxina A de
Pseudomonas ("tipo PE") para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una
enfermedad provocada por un patógeno que penetra en un mamífero a
través de una membrana mucosa, en el que el medicamento es para su
aplicación a una superficie mucosa del mamífero para provocar una
respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra el patógeno.
El inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento
celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor
superficial celular; (2) un dominio de translocación que comprende
una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una
secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la
translocación al citosol celular; (3) un dominio de un epítopo
exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y
1500 aminoácidos que comprende un epítopo exógeno; y, opcionalmente,
(4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de
retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende
una secuencia de retención en el RE. En una realización, el
inmunógeno quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de una
PE no tóxica en la que el dominio Ib además comprende el epítopo
exógeno entre dos restos de cisteína del dominio Ib.
En ciertas realizaciones, el dominio de
reconocimiento celular se une al receptor de macroglobulina
\alpha2 ("\alpha2-MR"), al receptor del
factor de crecimiento epidérmico ("EGF"), al receptor de
IL-2, al receptor de IL-6, al
receptor de transferrina humana o a gp120. En otra realización, el
dominio de reconocimiento celular comprende las secuencias de
aminoácidos de un factor de crecimiento. En otra realización, el
dominio de translocación comprende los aminoácidos 280 a 364 del
dominio II de PE. En otra realización, el dominio de epítopo exógeno
comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo
exógeno. En otra realización, el dominio de epítopo exógeno
comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del bucle
V3 de VIH -1. En otra realización, el dominio de retención en el RE
es el dominio III de PE que comprende una mutación que elimina la
actividad de ADP-ribosilación, tal como E553. El
dominio de retención en el RE puede comprender la secuencia de
retención en el RE REDLK (SEC. ID. N.º: 11), REDL (SEC. ID. N.º: 12)
o KDEL (SEC. ID. N.º: 13). En otra realización el epítopo exógeno
es un epítopo de un patógeno (por ejemplo, un epítopo de un virus,
una bacteria o un protozoo parasítico) o de un antígeno
canceroso.
En otro aspecto, esta invención proporciona una
composición que comprende un anticuerpo IgA secretor que reconoce
específicamente un epítopo de HIV-1, en la que el
anticuerpo es producido mediante la administración a al menos una
superficie mucosa de un sujeto, de un inmunógeno quimérico tipo
exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico que
comprende: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y
1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de la
superficie mucosa; (2) un dominio de translocación que comprende
una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una
secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la
translocación al citosol celular; (3) un dominio de un epítopo
exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y
1500 aminoácidos que codifica un epítopo de VIH-1; y
(4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de
retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende
una secuencia de retención en el RE.
Figuras 1A-1C. (A y B) A
representación esquemática de PE y de una quimera de
PE-bucle V3 que muestra la localización relativa de
los bucles Ib y V3 entre los dominios II y III. También se muestra
la localización aproximada de la eliminación de un aminoácido único
(\DeltaE553) para eliminar la toxicidad de PE. (C) Las secuencias
de aminoácidos, representadas por un código de una sola letra, que
sustituyen el bucle Ib de PE natural por una secuencia de bucle V3
de gp120 (negrita) de las cepas MN o Thai-E (TE) de
VIH-1 contenían dos residuos de cisteína diseñados
para producir una conformación de bucle tras la formación del enlace
disulfuro. La inserción de un único sitio de restricción PstI, que
se usa para la introducción de secuencias de bucle V3, produjo
diversas modificaciones de la secuencia de aminoácidos de PE natural
adyacente al bucle Ib (cursiva). Se preparó un inserto peptídico de
control irrelevante como control y se denomina
ntPE-fp16. Se muestran las masas moleculares
calculadas para las proteínas expresadas de longitud completa. PE
natural - SEC. ID. N.º: 5; ntPE-V3MN14 - SEC. ID.
N.º: 7; ntPE-V3MN26 - SEC. ID. N.º: 8;
ntPE-V3Th-E26 - SEC. ID. N.º: 9;
ntPE-fp16 - SEC. ID. N.º: 10.
Figuras 2A-2C. Caracterización
de las quimeras de ntPE-bucle V3 tras la separación
por SDS-PAGE (a) Tinción con azul Coomasie de las
quimeras de ntPE-bucle V3 tras la separación por
SDS-PAGE. Se cargó aproximadamente 1 \mug de
proteína en cada carril. (B) Análisis por transferencia Western de
las quimeras de ntPE-bucle V3. Después de la
transferencia a membranas Immobilon P, las proteínas se sondaron con
anticuerpos monoclonales generados contra gp120/MN (1F12) o
gp120/Thai-E (1B2) intactos. Se insertó una
secuencia irrelevante de 16 aminoácidos en la región del bucle Ib
de ntPE (ntPE-fp16) y se usó aquí como control
negativo. (C) Se usaron estudios de inmunocaptura, usando 1F12 o
1B2 inmovilizados sobre sepharose con proteína G, para caracterizar
la exposición de las secuencias del bucle V3 sobre la superficie de
diversas proteínas quiméricas. Las proteínas se visualizaron
tiñendo geles con azul Coomasie. Se usaron Gp120 y
ntPE-fp16 como controles positivos y negativos
respectivamente. La captura de las proteínas de
PE-bucle V3 se indica con una única punta de flecha
y la de gp120 con una doble punta de flecha. El panel de la
izquierda solamente muestra la presencia de la cadena pesada (hc)
de los anticuerpos dado que la cadena ligera (lc) se salió del gel.
El panel derecho muestra ambas cadenas.
Figuras 3A-3C. Las inserciones
de las secuencias de aminoácidos del bucle V3 no alteran
significativamente la estructura secundaria de PE natural. Los
espectros de DC en el UV cercano (A) y en el UV lejano (B) (media
de tres barridos después de la sustracción del espectro de ruido de
fondo) se refinaron digitalmente, se corrigieron para tomar en
cuenta la concentración, y se normalizaron con las unidades de
elipticidad de peso medio de los restos. (C) Los cálculos de las
estructuras secundarias se realizaron usando el programa de ajuste
SELCON. *El contenido en hélices \alpha calculado es acorde a los
valores determinados a partir de los cambios que se observan en la
elipticidad a 222 nm.
Figura 4. Las quimeras de
PE-bucle V3 tóxicas afectan a la supervivencia
celular. Se determinó el grado de síntesis de proteínas, evaluado
por la incorporación de ^{3}H-leucina, en células
A431 humanas tras 18 horas de exposición a diversas concentraciones
de PE natural o de una forma tóxica (con un resto de ácido glutámico
en la posición 553 y con capacidad de
ADP-ribosilación del factor de elongación 2) de
PE-V3MN26.
Figuras 5A-5B. Caracterización
del suero de conejo tras la inmunización o con
ntPE-V3MN26 o con
ntPE-V3Th-E26. (A) Se evaluó la
reactividad por transferencia Western de antisuero de conejo diluido
1:1000 contra gp120/MN recombinante y gp120/Th-E
después de SDS-PAGE y la transferencia de las
proteínas a membranas Immobilon P. El anticuerpo primario reactivo
se detectó mediante un anticuerpo secundario contra Ig de conejo
conjugado con peroxidasa de rábano. (B) El suero de conejo que se
obtuvo de animales a los que se había inyectado
ntPE-V3MN26 se incubó previamente con gp120/MN
soluble competitiva a concentraciones de hasta 50 \mug/ml. Se
detectó la reactividad residual mediante análisis por transferencia
Western de gp120/MN inmovilizada tal como se describe para
(A).
(A).
Figura 6. Una quimera de
ntPE-bucle V3 administrada a conejos produce una
respuesta de anticuerpos capaz de neutralizar la capacidad
infecciosa de VIH-1 in vitro. Se inmunizó a
los conejos por vía subcutánea con 200 \mug de
ntPE-V3MN26 y se les inyectaron refuerzos de forma
similar después de 2, 4 y 12 semanas. Se evaluaron los sueros
recogidos durante hasta 27 semanas después de la administración
inicial para determinar la capacidad para proteger una línea de
linfocitos T humana, MT4, de la destrucción por
VIH-1 MN mediante un ensayo de conversión de con
tinte MTT. Los valores representan lecturas por triplicado
normalizados con respecto a una incubación de MT4 de control no
expuestos a virus.
La Figura 7 es un diagrama de la estructura de
exotoxina A de Pseudomonas. Se indica la posición del
aminoácido basándose en la SEC. ID. N.º: 2. El dominio Ia abarca
los aminoácidos 1-252. El dominio II abarca los
aminoácidos 253-364. Incluye un bucle de cisteína a
cisteína formado por cisteínas en los aminoácidos
265-287. La furina provoca una escisión en el bucle
de cisteína a cisteína entre los aminoácidos 279 y 280. Un fragmento
de PE que empieza con el aminoácido 280 se transloca al citosol.
Las construcciones en las que se eliminan los aminoácidos
345-304 también se translocan. El dominio Ib abarca
los aminoácidos 365-399. Contiene un bucle de
cisteína a cisteína formado por cisteínas en los aminoácidos 372 y
379. El dominio puede eliminarse completamente. El dominio III
abarca los aminoácidos 400-613. La eliminación del
aminoácido 553 elimina la actividad de
ADP-ribosilación. La secuencia del retículo
endoplasmático, REDLK (SEC. ID. N.º: 11) está situada en el extremo
carboxi de la molécula, en los aminoácidos
609-613.
La Figura 8 demuestra que las quimeras de
PE-bucle V3 se mueven de forma similar a PE natural.
Monocapas confluentes de células Caco-2 se
expusieron apicalmente a exotoxina enzimáticamente activa
recombinante de Pseudomonas (rEA-PE). Se
comparó la destrucción de células producida por 24 h de exposición a
diversas concentraciones de PE natural (rEA-PE) con
la producida mediante un tratamiento similar con versiones
enzimáticamente activas de quimeras de PE que contenían 14 ó 26
aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de VIH-1.
La Figura 9 demuestra que las quimeras de
PE-bucle V3 inducen una respuesta de IgG en suero.
Se administró una quimera no tóxica (enzimáticamente inactiva) del
bucle V3 que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de
VIH-1 (PEMN26) a conejos mediante seis protocolos de
inoculación diferentes. Las muestras de suero extraídas en los
tiempos descritos se ensayaron mediante un ELISA para determinar la
IgG específica de MNgp120 usando un anticuerpo monoclonal (1F12)
que reconoce el bucle V3 de esta proteína para el calibrado del
ensayo.
La Figura 10 muestra que las quimeras de
PE-bucle V3 inducen una respuesta de IgA salivar. Se
administró una quimera no tóxica (enzimáticamente inactiva) del
bucle V3 que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de
VIH-1 (PEMN26) a conejos mediante seis protocolos de
inoculación diferentes. Las muestras de saliva obtenidas tras la
administración de pilocarpina en los momentos descritos se ensayaron
mediante ELISA para determinar IgA específica de MNgp120. No había
IgA específica de gp120 disponible para el calibrado del ensayo. Los
valores se expresan como valores normalizados con una muestra
positiva estandarizada.
La Figura 11 muestra los niveles relativos de
IgA salivar tras la inoculación a mucosas o sistémica de
ntPE-V3MN26. Se midieron los anticuerpos IgA
específicos de MN-gp120 mediante ELISA en muestras
de saliva, normalizadas con una muestra fuertemente positiva y se
expresaron en una escala arbitraria de una unidad de IgA específica
de antígeno.
La Figura 12 muestra los niveles en suero de IgG
tras la inoculación de mucosas o sistémica de
ntPE-V3MN26. Se midieron los anticuerpos IgG
específicos de MN-gp120 mediante ELISA en muestras
de suero, y se normalizaron con un anticuerpo monoclonal de ratón
que reconoce específicamente el bucle V3 de MNgp120.
La Figura 13 muestra los niveles en suero de IgG
tras la inyección subcutánea de ntPE-V3MN26. La
respuesta inmunitaria producida a partir de la inyección de
ntPE-V3MN26 (barras sombreadas) se comparó con la
inducida cuando se inyectaba conjuntamente con una pauta de
adyuvante completo e incompleto de Freund (barras negras). Se
inyectó PE no tóxica que no contenía los 26 aminoácidos del bucle V3
de MNgp120 con la misma pauta de adyuvante que el control. Los
anticuerpos IgG específicos de MN-gp120 se midieron
en muestras de suero mediante ELISA y se normalizaron con un
anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce específicamente el bucle
V3 de MNgp120.
Las Figuras 14A y 14B muestran la neutralización
de cepas aisladas clínicas de VIH con anticuerpos generados con los
inmunógenos quiméricos de esta invención. Los sueros posteriores a
la vacunación de conejos a los que se había inyectado
ntPE-V3MN26 se mezclaron con un subtipo de virus B
(Figura 14A) o E (Figura 14B). Tras una incubación de 1 hora a
37ºC, se determinó la capacidad infecciosa vírica añadiendo virus
tratado a PBMC durante otros 3 días. La inhibición del crecimiento
vírico se evaluó midiendo los niveles de p24. Cuadrado blanco:
antígeno p24 (sin infectar); círculo negro: antígeno p24 1 en suero
antes del desangramiento; círculo blanco: antígeno p24 1 suero
inmunitario (24 semanas).
A no ser que se definan de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria
tienen el significado que entiende comúnmente una persona de
experiencia en la técnica a la que pertenece esta invención. Las
siguientes referencias proporcionan a una persona de experiencia en
la técnica una definición general de muchos de los términos que se
usan en esta invención: Singleton y cols. DICTIONARY OF MICROBIOLOGY
AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF
SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker editor, 1988); THE GLOSSARY OF
GENETICS, 5ª Ed., R. Rieger y cols. (editores), Springer Verlag
(1991); y Hale & Marharn, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF
BIOLOGY (1991). Tal como se usa en la presente memoria, los
siguientes términos tienen los significados que se les adscriben a
no ser que se indique lo contrario.
"Polinucleótido" se refiere a un polímero
formado por unidades nucleotídicas. Los polinucleótidos incluyen
ácidos nucleicos naturales, tales como ácido desoxirribonucleico
("ADN") y ácido ribonucleico ("ARN") así como análogos de
los ácidos nucleicos. Los análogos de los ácidos nucleicos incluyen
los que incluyen bases no naturales, nucleótidos que se enlazan con
otros nucleótidos mediante enlaces distintos del enlace fosfodiéster
natural o que incluyen bases que se unen a través de enlaces
distintos de los enlaces fosfodiéster naturales. Así, los análogos
de nucleótidos incluyen, por ejemplo y sin limitación,
fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres,
fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonatos
metílicos quirales, ribonucleótidos
2-O-metílicos, ácidos
péptidonucleicos (PNA), y similares. Tales polinucleótidos pueden
sintetizarse por ejemplo, usando un sintetizador de ADN
automatizado. El término "ácido nucleico" habitualmente se
refiere a polinucleótidos grandes. El término
"oligonucleótido" habitualmente se refiere a polinucleótidos
cortos, generalmente de menos de aproximadamente 50 nucleótidos. Se
entenderá que cuando una secuencia nucleotídica está representada
por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), ésta también
incluye un secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que
"U" sustituye a "T".
"ADNc" se refiere a un ADN que es
complementario o idéntico a un ARNm, o bien en forma monocatenaria o
bicatenaria.
En la presente memoria se usa la notación
convencional para describir las secuencias de polinucleótidos: el
extremo de la izquierda de una secuencia de polinucleótidos
monocatenaria es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de
una secuencia de polinucleótidos bicatenaria se denomina dirección
5'. La adición de nucleótidos en dirección de 5' a 3' a transcritos
de ARN en formación se denomina dirección de transcripción. La
cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina
"cadena codificante"; las secuencias de la cadena de ADN que
tienen la misma secuencia que un ARNm tránscrito a partir de ese ADN
y que están situadas en posición relativa 5' del extremo 5' del
tránscrito de ARN se dice que son "secuencias aguas arriba";
las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia
que el ARN y que están situadas en posición relativa 3' del extremo
3' del tránscrito de ARN codificante se denominan "secuencias
aguas abajo".
"Complementario" se refiere a la
compatibilidad topológica o acoplamiento de superficies que
interactúan de dos polinucleótidos. Así, puede decirse que las dos
moléculas son complementarias, y además, las características de la
superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer
polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la
secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la
secuencia de nucleótidos de la cadena compañera que se une al
polinucleótido del segundo polinucleótido. Así, el polinucleótido
cuya secuencia es 5'-TATAC-3' es
complementario a un polinucleótido cuya secuencia es
5'-GTATA-3'.
Una secuencia de nucleótidos es
"sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos
de referencia si la secuencia complementaria a la secuencia de
nucleótidos sujeto es sustancialmente idéntica a la secuencia de
nucleótidos de referencia.
"Codificante" se refiere a la propiedad
inherente de secuencias específicas de nucleótidos de un
polinucleótido, tales como un gen, un ADNc, o un ARNm, de servir
como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas
en procesos biológicos que tienen o una secuencia de nucleótidos
definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de
aminoácidos definida y las propiedades biológicas que resultan de
ella. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y
traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una
célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya
secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y que
habitualmente se proporciona en los listados de secuencias, como la
cadena no codificante, que se usa como plantilla para la
transcripción, de un gen o ADNc puede decirse que codifican la
proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A no ser que se indique
lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una
secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de
nucleótidos que son versiones degeneradas las unas de las otras y
que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de
nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir
intrones.
"Polinucleótido recombinante" se refiere a
un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas de forma
natural. Un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado
puede estar incluido en un vector adecuado, y el vector puede
usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula
huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina
"célula huésped recombinante". El gen se expresa después en la
célula huésped recombinante produciendo, por ejemplo, un
"polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante
también puede realizar una función no codificante (por ejemplo,
promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosomas,
etc.).
"Secuencia de control de la expresión" se
refiere a una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que
regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia
de nucleótidos ligada operativamente a ella. "Ligada
operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos
partes en las que la actividad de una parte (por ejemplo, la
capacidad de regular la transcripción) produce una acción en la otra
parte (por ejemplo, transcripción de la secuencia). Las secuencias
de control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin
limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o
constitutivos), potenciadores, terminadores de la transcripción, un
codon de inicio (es decir, ATG), señales de procesamiento para
intrones, y codones de terminación.
"Vector de expresión" se refiere a un
vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende
secuencias de control de la expresión ligadas operativamente a una
secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión
comprende suficientes elementos que actúan en posición cis
para la expresión; la célula huésped o el sistema de expresión
in vitro pueden proporcionar otros elementos para la
expresión. Vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la
técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o
contenidos en liposomas) y virus que incorporan el the
polinucleótido recombinante.
"Amplificación" se refiere a cualquier
medio por el cual se copia una secuencia de polinucleótidos y así se
expande a un mayor número de moléculas de polinucleótido por
ejemplo, por transcripción inversa, reacción en cadena de la
polimerasa, y reacción en cadena de la ligasa.
"Cebador" se refiere a un polinucleótido
que es capaz de hibridarse de forma específica a una plantilla
polinucleotídica determinada y de proporcionar un punto de
iniciación para la síntesis de un polinucleótido complementario.
Tal síntesis se produce cuando el cebador polinucleotídico se
introduce en condiciones en las que se induce la síntesis, es
decir, en presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica
complementaria, y un agente para la polimerización tal como ADN
polimerasa. Un cebador es habitualmente monocatenario, pero puede
ser bicatenario. Los cebadores habitualmente son ácidos
desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores
sintéticos y naturales son útiles para muchas aplicaciones. Un
cebador es complementario a la plantilla a la que está diseñado
para hibridarse para servir de sitio de iniciación de la síntesis,
pero no tiene que reflejar la secuencia exacta de la plantilla. En
tal caso, la hibridación específica del cebador a la plantilla
depende de lo estricto de las condiciones de hibridación. Los
cebadores pueden marcarse, por ejemplo, con restos cromógenos,
radioactivos o fluorescentes y usarse como restos
detectables.
detectables.
"Sonda" cuando se usa refiriéndose a un
polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que es capaz de
hibridarse específicamente a una secuencia designada de otro
polinucleótido. Una sonda se hibrida específicamente a un
polinucleótido complementario diana, pero no tiene que reflejar la
secuencia complementaria exacta de la plantilla.
En tal caso, la hibridación específica de la
sonda a la diana depende de lo estricto de las condiciones de
hibridación. Las sondas pueden marcarse, por ejemplo, con restos
cromógenos, radioactivos o fluorescentes y usarse como restos
detectables.
Una primera secuencia es una "secuencia
antisentido" con respecto a una segunda secuencia si un
polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se hibrida
específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda
secuencia.
"Hibridarse de forma específica" o
"hibridación específica" o "hibridarse selectivamente a",
se refiere a la unión, emparejamiento o hibridación de una molécula
de ácido nucleico preferentemente a una secuencia de nucleótidos
particular en condiciones estrictas cuando esa secuencia está
presente en una mezcla compleja de ADN o ARN, (por ejemplo ADN o
ARN total de la célula).
El término "condiciones estrictas" se
refiere a las condiciones en las que una sonda se hibridará de forma
preferente a su subsecuencia diana, y en un grado menor, o nada, a
otras secuencias. "Hibridación estricta" y "condiciones de
lavado de hibridación estrictas" en el contexto de los
experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como
hibridizaciones de Southern y Northern dependen de las secuencias, y
son diferentes al cambiar los parámetros del entorno. En Tijssen
(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes
parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and
the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York,
se encuentra una extensa guía de la hibridación de ácidos
nucleicos. En general, las condiciones de hibridación y lavado
altamente estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente
5ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia
específica con una potencia iónica y pH definidos. La Tm es la
temperatura (con una potencia iónica y pH definidos) a la que el
50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente
complementaria. Las condiciones muy estrictas se seleccionan para
que sean iguales a la Tm de una sonda particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación
estrictas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios
que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una
transferencia de Southern o Northern son formalina al 50% con 1 mg
de heparina a 42ºC, realizando la hibridación toda la noche. Un
ejemplo de condiciones de lavado altamente estrictas son NaCl 0,15
M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de
condiciones de lavado estrictas es un lavado de 0,2 x SSC a 65ºC
durante 15 minutos (véase, Sambrook y cols. para una descripción
del tampón SSC). A menudo, un lavado muy estricto viene precedido
por un lavado poco estricto para eliminar la señal de la sonda de
ruido de fondo. Un ejemplo de lavado medianamente estricto para un
emparejamiento, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es 1 x SCC
a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado poco estricto para
un emparejamiento, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es
4-6x SSCa 40ºC durante 15 minutos. En general, una
relación entre la señal y el ruido de fondo de 2 veces (o más) que
la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de
hibridación particular indica la detección de una hibridación
específica.
"Polipéptido" se refiere a un polímero
compuesto por restos aminoacídicos, sus variantes estructurales
naturales relacionadas, y sus análogos sintéticos no naturales
ligados mediante enlaces peptídicos, sus variantes estructurales
naturales relacionadas, y sus análogos sintéticos no naturales. Los
polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un
sintetizador polipeptídico automatizado. El término "proteína"
habitualmente se refiere a polipéptidos grandes. El término
"péptido" habitualmente se refiere a polipéptidos cortos.
En la presente memoria se usa la notación
convencional para representar secuencias polipeptídicas: el extremo
izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino; el
extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo
carboxilo.
"Sustitución conservadora" se refiere a la
sustitución en un polipéptido de un aminoácido por un aminoácido
funcionalmente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada
uno aminoácidos que son substituciones conservadoras las unas de
las otras:
- 1)
- Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
- 2)
- Ácido aspártico(D), Ácido glutámico (E);
- 3)
- Asparragina (N), Glutamina (Q);
- 4)
- Arginina (R), Lisina (K);
- 5)
- Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
- 6)
- Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
"Variante alélica" se refiere a cualquiera
de dos o más formas polimorfas de un gen que ocupa el mismo locus
genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente a través de
mutaciones, y pueden producir polimorfismo fenotípico entre las
poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silentes (el
polipéptido codificado no cambia) o pueden codificar polipéptidos
que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. "Variantes
alélicas" también se refieren a ADNc derivados de tránscritos de
ARNm de variantes alélicas genéticas, así como a las proteínas
codificadas por ellos.
Los términos "idéntico" o "identidad"
porcentual, en el contexto de dos o más polinucleótidos o secuencias
polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias
que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de
nucleótidos o restos aminoacídicos que son iguales, cuando se
comparan y alinean buscando la máxima correspondencia, medida
usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias
o mediante inspección visual.
La frase "sustancialmente idéntico", en el
contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o
más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 60%, 80%, 90%,
95% o 98% de identidad entre los nucleótidos o restos
aminoacídicos, cuando se comparan y alinean buscando la máxima
correspondencia, medida usando uno de los siguientes algoritmos de
comparación de secuencias o mediante inspección visual.
Preferiblemente, la identidad sustancial, existe en una región de
las secuencias que tiene al menos aproximadamente de 50 restos de
longitud, más preferiblemente en una región de al menos
aproximadamente 100 restos, y lo más preferiblemente las secuencias
son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150
restos. En la realización más preferida, las secuencias son
sustancialmente idénticas en la longitud completa de las regiones
codificantes.
Para la comparación de las secuencias,
habitualmente una secuencia actúa de secuencia de referencia, con la
que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un
algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las
secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan
las coordenadas de las subsecuencias, si fuera necesario, y se
designan los parámetros del programa del algoritmo de las
secuencias. El algoritmo de comparación de las secuencias después
calcula la identidad porcentual de las secuencias para la(s)
secuencia(s) de ensayo comparando con la secuencia de
referencia, basándose en los parámetros del programa designados.
Puede realizarse un alineamiento óptimo de las
secuencias para compararlas, por ejemplo, mediante el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482
(1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de
Needleman & Wunsch. J. Mol. Biol. 48: 443(1970),
mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y
Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante
implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT,
FASTA, y TFASTA del Paquete de programas de Wisconsin Genetics,
Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante
inspección visual (véase de forma general Ausubel y cols.,
referencia anterior).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP.
PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a partir de un
grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas,
por parejas para mostrar la relación y la identidad porcentual de
las secuencias. También representa un árbol o dendograma que muestra
las relaciones entre los agrupamientos que se usaron para crear la
alineación. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de
alineación progresiva de Feng y Doolittle. J. Mol. Evol. 35:
351-360 (1987). El procedimiento que se usa es
similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS
5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta
300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos
o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple se inicia
con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares,
produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este
agrupamiento después se alinea con la siguiente secuencia o
agrupamiento de secuencias alineadas con una relación más próxima.
Dos agrupamientos de secuencias se alinean mediante una simple
extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales.
El alineamiento final se logra mediante una serie de alineamientos
por pares progresivos. El programa se corre designando las
secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o
nucleótidos para las regiones de comparación de las secuencias y
designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia
de referencia puede compararse con otras secuencias de ensayo para
determinar la relación entre la identidad porcentual de las
secuencias usando los siguientes parámetros: peso del hueco por
defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0.10), y
huecos finales ponderados.
Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para
determinar la identidad porcentual de las secuencias y la similitud
de las secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul
y cols., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).
El programa para realizar análisis por BLAST está disponible al
público a través del Nacional Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica
primero identificar pares de secuencias con puntuaciones elevadas
(HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia
problema, que o bien concuerdan o bien satisfacen alguna puntuación
umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la
misma longitud de una secuencia de la base de datos. T se denomina
umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y cols.,
referencia anterior). Estas coincidencias de palabras vecinas
iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar
HSP más largas que las contienen. Las coincidencias de palabras
después se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada
secuencia todo lo lejos que pueda aumentarse la puntuación de
alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan
usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M
(puntuación de recompensa por un par de restos coincidentes;
siempre > 0) y N (puntuación de sanción por los restos no
coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos,
se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación
acumulada. La extensión de las coincidencias de palabras en cada
dirección se detiene cuando: la puntuación de la alineación
acumulada decae una cantidad X de su valor máximo alcanzado; la
puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación
de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se
alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros
del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la
velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de
nucleótidos) usa como parámetros por defecto una longitud de palabra
(W) de 11, una expectación (E) de 10, M = 5, N = -4, y una
comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos,
el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de
palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de
puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 10915 (1989).
Además de calcular la identidad porcentual de
las secuencias, el algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:
5873-5787 (1993)). Una medida de similitud que
proporciona el algoritmo BLAST es la probabilidad sumatoria menor
(P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de
que una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de
aminoácidos ocurriera por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico
se considera similar a una secuencia de referencia si la
probabilidad sumatoria menor en una comparación entre el ácido
nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia es inferior a
aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente
0,01, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.
Una indicación adicional de que dos secuencias
de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es
que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico sea
inmunológicamente reactivo con el polipéptido codificado por el
segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Así, un
polipéptido es habitualmente sustancialmente idéntico a un segundo
polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente
en substituciones conservadoras. Otra indicación de que dos
secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que
las dos moléculas se hibriden entre si en condiciones estrictas, tal
como se describe en la presente memoria.
Un "ligando" es un compuesto que se une
específicamente a una molécula diana.
Un "receptor" es un compuesto que se une
específicamente a un ligando.
"Anticuerpo" se refiere a un ligando
polipeptídico sustancialmente codificado por un gen de
inmunoglobulina o genes de inmunoglobulinas, o sus fragmentos, que
específicamente se une y reconoce un epítopo (por ejemplo, un
antígeno). Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los
genes de la región constante de las cadenas ligeras kappa y lambda,
los genes de la región constante de las cadenas pesadas alfa, gamma,
delta, epsilon y mu, y la miriada de genes de la región variable de
las inmunoglobulinas. Los anticuerpos existen, por ejemplo, en
forma de inmunoglobulinas intactas o en forma de un número de
fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con
diversas peptidasas. Estos incluyen, por ejemplo, los fragmentos
Fab' y F(ab)'_{2}. El término "anticuerpo" tal como
se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de
anticuerpos o bien producidos por la modificación de anticuerpos
enteros o los sintetizados de novo usando metodologías de
ADN recombinante. También incluye anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos
humanizados. La porción "Fc" de un anticuerpo se refiere a la
porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno o
más dominios de la región constante de la cadena pesada, CH_{1},
CH_{2} y CH_{3} pero no incluye la región variable de la cadena
pesada.
Un ligando o un receptor (por ejemplo, un
anticuerpo) "se une específicamente a" o es "específicamente
inmunorreactivo con" un compuesto analito cuando el ligando o
receptor funciona en una reacción de unión que determina la
presencia del analito en una muestra de compuestos heterogéneos.
Así, en las condiciones de ensayo (por ejemplo, inmunoensayo)
designadas, el ligando o receptor se une de forma preferente a un
analito particular y no se une en una cantidad significativa a
otros compuestos presentes en la muestra. Por ejemplo, un
polinucleótido se une específicamente en condiciones de hibridación
a un polinucleótido analito que comprende una secuencia
complementaria; un anticuerpo se une específicamente en condiciones
de inmunoensayo a un analito antígeno que porta un epítopo contra
el que se generó el anticuerpo; y un adsorbente se une
específicamente a un analito en condiciones de elución
adecuadas.
"Inmunoensayo" se refiere a un
procedimiento de detectar un analito en una muestra que implica
poner en contacto la muestra con un anticuerpo que específicamente
se une al analito y detectar la unión entre el anticuerpo y el
analito. Pueden usarse una variedad de formatos de inmunoensayos
para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con
una proteína particular. Por ejemplo, rutinariamente se usan
inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos
monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína.
Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción
de formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para
determinar la inmunorreactividad específica.
"Vacuna" se refiere a un agente o
composición que contiene un agente eficaz para conferir un grado
terapéutico de inmunidad a un organismo a la vez que provoca solo
niveles muy bajos de morbidez o mortandad. Los procedimientos para
preparar vacunas son, por supuesto, útiles en el estudio del sistema
inmunitario y en la prevención y tratamiento de la enfermedad
animal o humana.
Una "cantidad inmunógena" es una cantidad
eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.
"Sustancialmente puro" o "aislado"
quiere decir que una especie objeto es la especie presente
predominante (es decir, en términos molares, más abundante que
cualquier otra especie macromolecular individual de la composición),
y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la
que la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50% (en
términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura quiere decir que
aproximadamente del 80% al 90% o más de la especie macromolecular
presente en la composición es la especie purificada de interés. La
especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (la
especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante
procedimientos de detección convencionales) si la composición está
formada esencialmente por una única especie macromolecular. Las
especies de disolventes, moléculas pequeñas (<500 Daltons),
estabilizantes (por ejemplo, BSA), y especies iónicas elementales
no se consideran especies macromolecular para los fines de esta
definición.
"Natural" aplicado a un objeto se refiere
al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por
ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está
presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse
de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificada
intencionadamente por el hombre en el laboratorio es natural.
"Detectar" se refiere a determinar la
presencia, ausencia, o cantidad de un analito en una muestra, y
puede incluir cuantificar la cantidad del analito en una muestra o
por célula en una muestra.
"Resto detectable" o una "marcador" se
refieren a una composición que puede detectarse por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o
químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen ^{32}P,
^{35}S, tintes fluorescentes, reactivos con alta densidad
electrónica, enzimas (por ejemplo, tal como se usa comúnmente en un
ELISA), biotina-estreptavadina, dioxigenina,
haptenos y proteínas para los que hay disponibles antisueros o
anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una
secuencia complementaria a una diana. El resto detectable a menudo
genera una señal cuantificable, tal como una señal radioactiva,
cromógena o fluorescente, que puede usarse para cuantificar la
cantidad de resto detectable unido en una muestra. El resto
detectable puede estar incorporado o unido a un cebador o sonda
bien de forma covalente, o a través de enlaces iónicos, de van der
Waals o de hidrógeno, por ejemplo, la incorporación de nucleótidos
radioactivos, o de nucleótidos biotinilados que son reconocidos por
estreptavadina. El resto detectable puede detectarse directa o
indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de
un segundo resto detectable de forma directa o indirecta. Por
ejemplo, el resto detectable puede ser el ligando de una pareja de
unión, tal como la biotina, que es una pareja de unión de
estreptavadina, o una secuencia de nucleótidos, que es la pareja de
unión de una secuencia complementaria, a la que puede hibridarse
específicamente. La pareja de unión puede ser en si detectable
directamente, por ejemplo, un anticuerpo puede estar marcado él
mismo con una molécula fluorescente. La pareja de unión también
puede ser indirectamente detectable, por ejemplo, un ácido nucleico
que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser
parte de una molécula de ADN ramificada que a su vez es detectable a
través de su hibridación a otras moléculas de ácido nucleico
marcadas. (Véase, por ejemplo, PD. Fahrlander y A. Klausner,
Bio/Technology (1988) 6: 1165). La cuantificación de la señal
se logra, por ejemplo, por recuento del centelleo, densitometría o
citometría de flujo.
"Ligador" se refiere a una molécula que une
otras dos moléculas, o bien covalentemente, o a través de enlaces
iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, una molécula
de ácido nucleico que se hibrida a una secuencia complementaria en
el extremo 5' y a otra secuencia complementaria en el extremo 3',
uniendo así dos secuencias no complementarias.
"Composición farmacéutica" se refiere a una
composición adecuada para uso farmacéutico en un mamífero. Una
composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente
eficaz de un agente activo y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. "Cantidad farmacológicamente eficaz" se refiere a la
cantidad de un agente eficaz para producir el resultado
farmacológico que se pretende. "Vehículo farmacéuticamente
aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos, tampones, y
excipientes farmacéuticos estándar, tales como una solución salina
tamponada con fosfato, solución acuosa al 5% de dextrosa, y
emulsiones, tales como una emulsión de aceite en agua o agua en
aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes.
Vehículos y formulaciones farmacéuticos adecuados se describen en
Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing
Co. Easton, 1995). Los vehículos farmacéuticos preferidos dependen
del modo de administración del agente activo que se pretenda. Modos
de administración típicos incluyen administración intestinal (por
ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea,
intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administración
tópica, transdérmica, o transmucosa). Una "sal farmacéuticamente
aceptable" es una sal que puede formularse en un compuesto para
uso farmacéutico que incluye, por ejemplo, sales metálicas (sodio,
potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoniaco o aminas
orgánicas.
"Molécula orgánica pequeña" se refiere a
moléculas orgánicas de un tamaño comparable a las moléculas
orgánicas que generalmente se usan en los fármacos. El término
excluye biopolímeros orgánicos (por ejemplo, proteínas, ácidos
nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían
en tamaño hasta aproximadamente 5000 Da, hasta aproximadamente 2000
Da, o hasta aproximadamente 1000 Da.
Un "sujeto" de diagnóstico o tratamiento es
un ser humano o animal no humano, que incluye un mamífero o un
primate.
"Tratamiento" se refiere a tratamiento
profiláctico o a tratamiento terapéutico.
Un "tratamiento profiláctico" es un
tratamiento que se administra a un sujeto que no muestra indicios de
una enfermedad o muestra solamente indicios tempranos con el fin de
disminuir el riesgo de desarrollar la patología.
Un "tratamiento terapéutico" es un
tratamiento que se administra a un sujeto que muestra indicios de
patología con el fin de disminuir o eliminar esos indicios.
"Diagnóstico" quiere decir identificar la
presencia o naturaleza de una afección patológica. Los
procedimientos de diagnóstico difieren en su especificidad y
selectividad. Mientras que un procedimiento diagnóstico particular
puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es
suficiente si el procedimiento proporciona una indicación positiva
que ayude al diagnóstico.
"Pronóstico" quiere decir predecir el
desarrollo probable (por ejemplo, gravedad) de una afección
patológica.
"Pluralidad" quiere decir al menos dos.
La "exotoxina A de Pseudomonas" o
"PE" es segregada por Ps aeruginosa en forma de una
proteína de 67 kD compuesta por tres dominios globulares
prominentes (la, II, y III) y un subdominio pequeño (Ib) que
conecta los dominios II y III. (A.S. Allured y cols. (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. 83: 1320-1324). El dominio Ia
de PE media en la unión celular. En la naturaleza, el dominio Ia se
une a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas
("LRP") de baja densidad, también conocido como receptor de
macroglobulina \alpha2 ("\alpha2-MR").
(M.Z. Kounnas y cols. (1992) J. Biol. Chem. 267:
12420-23). Abarca los aminoácidos
1-252. El dominio II media la translocación al
citosol. Abarca los aminoácidos 253-364. El dominio
Ib no tiene función conocida. Abarca los aminoácidos
365-399. El dominio III es responsable de la
citotoxicidad e incluye una secuencia de retención en el retículo
endoplasmático. Media la ADP-ribosilación del factor
de elongación 2, que inactiva la síntesis de proteínas. Abarca los
aminoácidos 400-613. PE es "no tóxica" si
carece de actividad de ADP-ribosilación de FE2. La
eliminación del aminoácido E553 ("\DeltaE553") del dominio
III anula la toxicidad de la molécula. La PE que tiene la mutación
\DeltaE553 se denomina en la presente memoria "PE
\DeltaE553". Las formas genéticamente modificadas de PE se
describen, por ejemplo, en Pastan y cols., patente de Estados
Unidos 5.602.095; Pastan y cols., patente de Estados Unidos
5.512.658 y Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.458,878.
Las formas alélicas de PE están incluidas en esta definición. Véase,
por ejemplo, M.L. Vasil y cols., (1986) Infect. lmmunol. 52:
538-48. La secuencia de nucleótidos (SEC. ID. N.º:
1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. N.º: 2) de
exotoxina A de Pseudomonas son:
"Bucle de cisteína a cisteína" se refiere a
un resto peptídico de un polipéptido que está definido por una
secuencia de aminoácidos flanqueado por dos restos de cisteína
unidos mediante enlaces disulfuro.
"Epítopo exógeno" se refiere a un epítopo
codificado por una secuencia de aminoácidos que no se produce de
forma natural en el dominio Ib de exotoxina A de
Pseudomonas.
Los inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de
Pseudomonas ("tipo PE") de esta invención son
polipéptidos que tienen dominios estructurales organizados, a
excepción de lo descrito en la presente memoria, en la misma
secuencia que los cuatro dominios estructurales de PE (es decir, la,
II, Ib y III), y que tienen ciertas funciones (por ejemplo,
reconocimiento celular, translocación al citosol y retención en el
retículo endoplasmático) que también poseen los dominios
funcionales de PE. Además, los inmunógenos quiméricos tipo PE de
esta invención poseen un dominio que funcionaliza un dominio de PE
para el que no se ha identificado ninguna función todavía. En
concreto, los inmunógenos quiméricos tipo PE sustituyen el dominio
Ib de PE por un dominio de epítopo exógeno funcional que actúa como
inmunógeno para provocar una respuesta inmunitaria contra el epítopo
exógeno.
Por consiguiente, los inmunógenos quiméricos
tipo PE incluyen los siguientes dominios estructurales que constan
de secuencias de aminoácidos, confiriendo los dominios funciones
particulares a la proteína quimérica: (1) un "dominio de
reconocimiento celular" que funciona como ligando para un
receptor superficial celular y que media la unión de la proteína a
una célula; (2) un "dominio de translocación" que media la
translocación desde los endosomas al citosol; (3) un "dominio de
epítopo exógeno" que contiene el epítopo exógeno inmunógeno; y,
opcionalmente, (4) un "dominio de retención en el retículo
endoplasmático ("ER")" que funciona translocando la
molécula del endosoma al retículo endoplasmático, desde el que
penetra en el citosol. Cuando se elimina el dominio de retención el
inmunógeno quimérico todavía puede mantener la función
inmunógena.
En una realización, un inmunógeno quimérico tipo
PE comprende la secuencia natural de PE, a excepción del dominio
Ib, que está diseñado para que incluya la secuencia de aminoácidos
de un epítopo exógeno. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia
de aminoácidos que codifica el epítopo exógeno en el bucle de
cisteína a cisteína del dominio Ib. Sin embargo, la relación entre
la estructura de PE y su función se ha estudiado extensamente. La
secuencia de aminoácidos de PE ha sido rediseñada para proporcionar
nuevas funciones, y se han identificado muchos aminoácidos o
segmentos peptídicos críticos y no críticos para la función de PE.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención pueden
incorporar estas modificaciones estructurales de PE.
Las quimeras de exotoxina de Pseudomonas
de esta invención comprenden una secuencia de aminoácidos que
codifica un "dominio de reconocimiento celular". El dominio de
reconocimiento celular funciona como ligando para un receptor de la
superficie celular. Media la unión de la proteína a una célula. Su
fin es dirigir la quimera a una célula que la transportará al
citosol para su procesamiento. El dominio de reconocimiento celular
puede estar localizado en la posición del dominio Ia de PE. Sin
embargo, este dominio puede salirse de la organización normal de la
secuencia. De forma más particular, el dominio de reconocimiento
celular puede estar insertado aguas arriba del dominio de retención
en el RE. De forma alternativa, el dominio de reconocimiento
celular puede estar acoplado químicamente a la toxina. También, la
quimera puede incluir un primer dominio de reconocimiento celular
en la locación del dominio Ia y un segundo dominio de reconocimiento
celular aguas arriba del dominio de retención en el RE. Tales
construcciones pueden unirse a más de un tipo celular. Véase, por
ejemplo, R.I. Kreitman y cols. (1992) Bioconjugate Chem. 3:
63-68.
Debido a que el dominio de reconocimiento
celular funciona como un asa para unir la quimera a una célula,
puede tener la estructura de cualquier polipéptido que se sepa que
se une a un receptor particular. Por consiguiente, el dominio
generalmente tiene el tamaño de ligandos polipeptídicos conocidos,
por ejemplo, entre aproximadamente 10 aminoácidos y aproximadamente
1500 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos y
aproximadamente 300 aminoácidos.
Diversos procedimientos son útiles para
identificar los dominios de reconocimiento celular funcionales para
usar en los inmunógenos quiméricos. Un procedimiento implica
detectar la unión entre una quimera que comprende el dominio de
reconocimiento celular con el receptor o con una célula que porta el
receptor. Otros procedimientos implican la detección de la entrada
de la quimera en el citosol, lo que indica que la primera etapa, la
unión a la célula, ha tenido éxito. Estos procedimientos se
describen en detalle más adelante en la sección de pruebas.
El dominio de reconocimiento celular puede tener
la estructura de cualquier polipéptido que se une a un receptor de
la superficie celular. En una realización, la secuencia de
aminoácidos es la del dominio Ia de PE, dirigiendo así la proteína
quimérica al dominio \alpha2-MR. En otras
realizaciones, el dominio Ia puede ser sustituido por: factores de
crecimiento, tales como TGF\alpha, que se une al factor de
crecimiento epidérmico ("EGF"); IL-2, que se
une al receptor IL-2; IL-6, que se
une al receptor IL-6 (por ejemplo, linfocitos B
activados y células hepáticas); CD4, que se une a células
infectadas por VIH-1); una quimioquina (por ejemplo,
Rantes, MIP-1\alpha o
MIP-1\beta), que se une a un receptor de
quimioquinas (por ejemplo, CCR5 o fusina (CXCR4)); ligandos para
los receptores de la superficie celular de leucocitos, por ejemplo,
GM-CSF, G-CSF; ligandos para el
receptor IgA; o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos a
cualquier receptor (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios contra
el receptor de transferrina humana). I. Pastan y cols. (1992)
Annu. Rev. Biochem. 61: 331-54.
En una realización, el dominio de reconocimiento
celular está localizado en el lugar del dominio Ia de PE. Puede
estar unido al otro resto de la molécula a través de un ligador. Sin
embargo, los estudios de ingeniería muestran que la exotoxina de
Pseudomonas puede dirigirse a ciertos tipos de células
mediante la introducción de un dominio de reconocimiento celular
aguas arriba de la secuencia de retención en el RE, que esté
localizada en el extremo carboxi del polipéptido. Por ejemplo,
TGP\alpha ha sido insertado en el dominio III justo antes del
aminoácido 604, es decir, aproximadamente a diez aminoácidos del
extremo carboxi. Esta proteína quimérica se une a células que
portan el receptor EGF. Pastan y cols., patente de Estados Unidos
5.602.095.
Los ligandos específicos de células que son
proteínas a menudo pueden formarse parcial o totalmente como
proteína de fusión con las quimeras de exotoxina de
Pseudomonas de la presente invención. Una "proteína de
fusión" se refiere a un polipéptido formado mediante la unión de
dos o más polipéptidos a través de un enlace peptídico formado por
el extremo amino de un polipéptido y el extremo carboxi del otro
polipéptido. La proteína de fusión puede formarse mediante el
acoplamiento químico de los polipéptidos constituyentes pero
habitualmente se expresa en forma de un único polipéptido a partir
de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de
fusión contigua única. Entre tales proteínas de fusión se incluyen
los fragmentos Fv monocatenarios (scFv). Quimeras de exotoxina de
Pseudomonas dirigidas particularmente preferidas son las
proteínas estabilizadas por puentes disulfuro que pueden formarse
en parte como proteína de fusión tal como se ejemplifica en la
presente memoria. Otros ligandos proteínicos específicos de
célu-
la pueden formarse como proteínas de fusión usando metodologías de clonado notorias para el experto en la técnica.
la pueden formarse como proteínas de fusión usando metodologías de clonado notorias para el experto en la técnica.
La unión de ligandos específicos de célula
también puede lograrse a través del uso de ligadores. El ligador
puede formar enlaces covalentes o enlaces no covalentes de afinidad
alta con ambas moléculas. Los ligadores adecuados son notorios para
los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación,
ligadores carbonados de cadena lineal o ramificada, ligadores
carbonados heterocíclicos, o ligadores peptídicos. Los ligadores
pueden estar unidos a los aminoácidos constituyentes a través de sus
grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a
cisteína).
En una realización, el dominio Ia es sustituido
por una secuencia polipeptídica para una cadena pesada de
inmunoglobulina, de una inmunoglobulina específica para la célula
diana. La cadena ligera de la inmunoglobulina puede coexpresarse
con el inmunógeno quimérico tipo PE formando un dímero de cadena
ligera-cadena pesada. En la proteína conjugada, el
anticuerpo está unido químicamente a un polipéptido que comprende
los otros dominios del inmunógeno quimérico.
El procedimiento para unir una quimera de
exotoxina de Pseudomonas a un anticuerpo u otro ligando
específico de célula variará dependiendo de la estructura química
de la toxina. Los anticuerpos contienen una variedad de grupos
funcionales; por ejemplo, grupos sulfhidrilo (-S), ácido carboxílico
(COOH) o amina libre (-NH_{2}), que están disponibles para
reaccionar con un grupo funcional adecuado de una toxina. De forma
adicional o alternativa, el anticuerpo o quimera de exotoxina de
Pseudomonas puede derivarse de forma que exponga o se una a
grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede
implicar la unión de cualquiera de un número de moléculas ligadoras
tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford
Illinois.
Un ligador bifuncional que tiene un grupo
funcional que reacciona con un grupo de la quimera de exotoxina de
Pseudomonas, y otro grupo que reacciona con un ligando
específico de célula, puede usarse para formar un conjugado
deseado. De forma alternativa, la derivatización puede implicar el
tratamiento químico de la quimera de exotoxina de
Pseudomonas o el ligando específico de célula, por ejemplo,
escisión de glicol del resto glucídico de un anticuerpo
glucoproteínico con peryodato generando grupos aldehído libres. Los
grupos aldehído libres del anticuerpo pueden hacerse reaccionar con
los grupos amina o hidrazina libres del anticuerpo uniendo la
quimera de exotoxina de Pseudomonas a ellos. (Véase J.D.
Rodwell y cols., patente de Estados Unidos n.º 4.671.958). También
se conocen procedimientos para la generación de grupo sulfhidrilo
libres en anticuerpos u otras proteínas. (Véase R.A. Nicoletti y
cols., patente de Estados Unidos n.º 4.659.839).
Los inmunógenos quiméricos tipo PE también
comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio
de translocación de PE". El dominio de translocación de PE
comprende una secuencia de aminoácidos suficiente para efectuar la
translocación de proteínas quiméricas que han sido endocitadas por
la célula al citosol. La secuencia de aminoácidos es idéntica, o
sustancialmente idéntica, a una secuencia que se selecciona del
dominio II de PE.
La secuencia de aminoácidos suficiente para
efectuar la translocación puede derivarse del dominio de
translocación de PE natural. Este dominio abarca los aminoácidos
253-364. El dominio de translocación puede incluir
la secuencia completa del dominio II. Sin embargo, no es necesaria
la secuencia completa para la translocación. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos puede contener como mínimo, por ejemplo,
los aminoácidos 280-344 del dominio II de PE. Las
secuencias de fuera de esta región, es decir, los aminoácidos
253-279 y/o 345-364, pueden
eliminarse del dominio. Este dominio también puede diseñarse con
substituciones en tanto en cuanto se mantenga la actividad de
translocación.
El dominio de translocación funciona de la forma
siguiente. Tras la unión a un receptor de la superficie celular,
las proteínas quiméricas penetran en la célula por endocitosis a
través de vesículas recubiertas de clatrina. Los restos 265 y 287
son cisteínas que forman un bucle de disulfuros. Una vez se ha
internado en los endosomas que tienen un entorno ácido, el péptido
es escindido por la proteasa furina entre Arg279 y Gly280. Después,
se reduce el enlace disulfuro. Una mutación en Arg279 inhibe la
escisión proteolítica y la subsiguiente translocación al citosol.
M. Ogata y cols. (1990) J. Biol. Chem. 265:
20678-85. Sin embargo, un fragmento de PE que
contiene la secuencia aguas abajo de Arg279 (denominada
"PE37") mantiene una capacidad sustancial de translocar al
citosol. C.B. Siegall y cols. (1989) J. Biol. Chem. 264:
14256-61. Las secuencias del dominio II a partir
del aminoácido 345 también pueden eliminarse sin inhibir la
translocación. Además, los aminoácidos de las posiciones 339 y 343
parecen ser necesarios para la translocación. C.B. Siegall y cols.
(1991) Biochemistry 30: 7154-59.
Más adelante se describen procedimientos para
determinar la funcionalidad de un dominio de translocación en la
sección de pruebas.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE también
comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio
de epítopo exógeno". El dominio de epítopo exógeno comprende la
secuencia de aminoácidos de un epítopo exógeno. El dominio funciona
conteniendo el epítopo inmunógeno exógeno para la presentación al
sistema inmunitario. El dominio de epítopo exógeno está insertado
en la localización del dominio Ib de PE, entre el dominio de
translocación (por ejemplo, el dominio II) y el dominio de retención
en el RE (por ejemplo, el dominio III). Más adelante se describen
procedimientos para determinar la capacidad inmunógena de un dominio
de translocación en la sección de pruebas.
El epítopo exógeno puede ser cualquier secuencia
de aminoácidos que sea inmunógena. El dominio de epítopo exógeno
puede tener entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente
1500 aminoácidos. Esto incluye dominios que tienen entre
aproximadamente 15 aminoácidos y aproximadamente 350 aminoácidos o
aproximadamente 15 aminoácidos y aproximadamente 50
aminoácidos.
En la exotoxina A de Pseudomonas natural,
el dominio Ib abarca los aminoácidos 365 a 399. El dominio Ib
natural está caracterizado estructuralmente por un enlace disulfuro
entre dos cisteínas en las posiciones 372 y 379. El dominio Ib no
es esencial para la actividad de unión celular, translocación,
retención en el RE o ADP-ribosilación. Por lo
tanto, puede rediseñarse completamente.
El dominio de epítopo exógeno puede ser lineal o
puede incluir un bucle cisteína-cisteína que
comprenda el epítopo exógeno. En una realización, el dominio de
epítopo exógeno incluye un bucle de cisteína a cisteína que
comprende el epítopo exógeno. Esta distribución ofrece diversas
ventajas. Primero, cuando el epítopo exógeno existe de forma
natural en un bucle de cisteína a cisteína con enlaces disulfuros, o
lo engloba, el dominio de epítopo exógeno presentará el epítopo en
una conformación casi natural. Segundo, se cree que los restos
aminoacídicos cargados en el dominio natural Ib producen una
estructura hidrófila se sobresale de la molécula hacia el
disolvente, donde está disponible para interactuar con componentes
del sistema inmunitario. Por lo tanto, introducir el epítopo
exógeno en un bucle de cisteína a cisteína produce una presentación
más eficaz cuando el epítopo exógeno también es hidrófilo. Tercero,
el dominio Ib es altamente insensible a la mutación. Por lo tanto,
aunque el bucle de cisteína a cisteína del dominio Ib natural tiene
solamente seis aminoácidos entre los restos de cisteína, pueden
insertarse secuencias mucho más largas en el bucle sin alterar la
actividad de unión celular, translocación, retención en el RE o
ADP-ribosilación.
Esta invención prevé diversas formas de insertar
el dominio de epítopo exógeno en el dominio Ib. Un procedimiento
implica insertar la secuencia de aminoácidos del epítopo exógeno
directamente en la secuencia de aminoácidos del dominio Ib, con o
sin eliminación de secuencias de aminoácidos naturales. Otro
procedimiento implica eliminar todo o parte del dominio Ib y
sustituirlo por una secuencia de aminoácidos que incluye el epítopo
exógeno entre dos restos de cisteína de forma que las cisteínas se
impliquen en un enlace disulfuro cuando la proteína se expresa. Por
ejemplo, si el epítopo exógeno existe normalmente dentro de una
estructura de bucle de cisteína a cisteína de un polipéptido, una
porción del polipéptido que incluye el bucle y el epítopo exógeno
pueden insertarse en lugar del dominio del bucle de cisteína a
cisteína.
La elección del epítopo exógeno es a discreción
del investigador. Al elegir, el investigador puede considerar lo
siguiente. Aunque el dominio de epítopo exógeno puede ser linear,
los epítopos exógenos que existen de forma natural en un bucle de
cisteína-cisteína se aprovechan de la estructura
natural del bucle Ib de la exotoxina A de Pseudomonas. Los
epítopos de agentes que son responsables de infecciones poco activas
o de antígenos específicos de cánceres son atractivos porque estos
antígenos tienden a resistir el ataque del sistema inmunitario.
También, la tecnología recombinante permite insertar rápidamente un
polinucleótido que codifica un epítopo en un vector que codifica la
proteína quimérica. Por lo tanto, es posible cambiar las secuencias
rápidamente al cambiar un epítopo exógeno. Por consiguiente, los
epítopos de agentes infecciosos que cambian muy rápidamente son
insertos atractivos.
Así, por ejemplo, los epítopos pueden elegirse a
partir de cualquier patógeno, por ejemplo, virus, bacteria y
parásitos protozoos. Las fuentes víricas de epítopos incluyen, por
ejemplo, VIH, herpes zoster, influenza, polio y hepatitis. Las
fuentes bacterianas incluyen, por ejemplo, tuberculosis, Chlamydia o
Salmonella. Las fuentes de protozoos parasíticos incluyen, por
ejemplo, Trypanosoma o Plasmodium. En particular, el
agente puede ser uno que penetre en el cuerpo a través de membranas
de mucosas epiteliales. Los antígenos específicos de cáncer útiles
incluyen los que se expresan en la superficie celular y, por lo
tanto, pueden ser diana de una respuesta de linfocitos T
citotóxicos, tales como un marcador específico de cáncer de próstata
(por ejemplo, PSA), un marcador específico de cáncer de mama (por
ejemplo, BRCA-1 o HER2), un marcador específico de
cáncer pancreático (por ejemplo, CA9-19), un
marcador de melanoma (por ejemplo, tirosinasa) o una forma mutante
específica de cáncer de EGF.
En una realización, el epítopo exógeno se deriva
del bucle neutralizador principal de un retrovirus, tal como
VIH-1 o VIH-2. En particular, el
epítopo puede derivarse del bucle V3 de la proteína gp120 de
VIH-1. Un bucle neutralizador puede identificarse
mediante anticuerpos neutralizadores, es decir, anticuerpos que
neutralizan la capacidad infecciosa del virus. Las secuencias
pueden ser de cualquier cepa, en particular, de cepas circulantes.
Tales cepas incluyen, por ejemplo, MN (por ejemplo, subtipo B) o
Thai-E (por ejemplo, subtipo E). Los bucles V3 de
diversas cepas de VIH-1 tienen aproximadamente 35
aminoácidos. Las cepas de VIH pueden ser linfocito
T-trópicas o macrófago-trópicas. En
una realización, las secuencias del bucle V3 incluyen al menos 8
aminoácidos (por ejemplo, un péptido suficientemente largo para
encajar en una zona de unión de CHM clase II) que incluye un
vértice del bucle V3. El bucle V3 de la cepa MN de VIH tiene la
secuencia: CTRPNYNKRK RIHIGPGRAF YTTKNIIGTI RQAHC (SEC. ID.
N.º: 3). El bucle V3 la cepa Thai-E de VIH tiene la
secuencia: CTRPSNNTRT SITIGPGOVF YRTGDTIGDI RKAYC (SEC. ID.
N.º: 4). El vértice del bucle V3 está subrayado. La secuencia es de
una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 26 aminoácidos
de largo. Una vacuna puede comprender una pluralidad de inmunógenos
que tengan epítopos víricos diferentes.
En otra realización, el epítopo exógeno puede
ser un epítopo expresado por una célula durante una enfermedad. Por
ejemplo, el epítopo exógeno puede ser un marcador de célula
cancerosa. Por ejemplo, ciertos cánceres de mama expresan un
receptor de EGF ("factor de crecimiento epidérmico") mutante
que resulta de una variante de procesamiento. Esta forma mutante
exhibe un epítopo único.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE también
pueden comprender una secuencia de aminoácidos que codifica un
"dominio de retención en el retículo endoplasmático". El
dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE")
funciona translocando la proteína quimérica desde el endosoma al
retículo endoplasmático, desde donde se transporta al citosol. El
dominio de retención en el RE está localizado en la posición del
dominio III en PE. El dominio de retención en el RE comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene, como extremo carboxi, una
secuencia de retención en el RE. La secuencia de retención en el RE
en PE natural es REDLK (SEC. ID. N.º: 11). La lisina puede
eliminarse (es decir, REDL (SEC. ID. N.º: 12)) sin un descenso de la
actividad. REDLK (de la SEC. ID. N.º: 1) puede sustituirse por
otras secuencias de retención en el RE, tales como KDEL (SEC. ID.
N.º: 12), o polímeros de estas secuencias. M. Ogata y cols. (1990)
J. Biol. Chem. 265: 20678-85. Pastan y
cols., Patente de Estados Unidos 5.458.878. I. Pastan y cols. (1992)
Annu. Rev. Biochem. 61: 331-54.
Las secuencias aguas arriba de la secuencia de
retención en el RE pueden ser el dominio III de PE natural
(preferiblemente inactivada), puede eliminarse completamente, o
puede sustituirse por otra secuencia de aminoácidos. Si se
sustituye por otra secuencia de aminoácidos, la secuencia puede, en
si misma, ser muy inmunógena o puede ser ligeramente inmunógena. Es
preferible un dominio de retención en el RE muy inmunógeno para usar
en la provocación de una respuesta inmunitaria humoral. Las
quimeras cuyo dominio de retención en el RE es solamente
ligeramente inmunógeno serán más útiles cuando se desee una
respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase
I.
La actividad de este dominio puede evaluarse
analizando la translocación de la proteína al citosol de la célula
diana usando los ensayos que se describen más adelante.
En PE natural, la secuencia de retención en el
RE está localizada en el extremo carboxi del dominio III. El
dominio III tiene dos funciones en PE. Muestra actividad de
ADP-ribosilación y dirige la toxina endocitada al
retículo endoplasmático. La eliminación de la secuencia de retención
en el RE de la proteína quimérica no altera la actividad de la
exotoxina A de Pseudomonas como superantígeno, pero si inhibe
su utilidad para provocar una respuesta inmunitaria mediada por
células dependiente de CHM Clase I.
La actividad de ribosilación de PE está
localizada aproximadamente entre los aminoácidos 400 y 600 de PE.
En los procedimientos de vacunar a un sujeto usando las proteínas
quiméricas de esta invención, es preferible que la proteína no sea
tóxica. Un procedimiento para lograrlo es eliminando la actividad de
ADP-ribosilación. De este modo, la proteína
quimérica puede funcionar como vector para que las secuencias de
epítopos exógenos sean procesadas por la célula y presentadas en la
superficie celular con moléculas de CHM Clase I, en lugar de cómo
toxina. La actividad de ADP-ribosilación puede
eliminarse, por ejemplo, eliminando el aminoácido E553
("\DeltaE553"). M. Lukac y cols. (1988) Infect. and
Immun. 56: 3095-3098. De forma alternativa,
puede eliminarse de la proteína la secuencia de aminoácidos del
dominio III, o porciones de ella. Por supuesto, en el extremo
carboxi debería incluirse una secuencia de retención en el RE.
En una realización, la secuencia del dominio de
retención en el RE es sustancialmente idéntica a las secuencias de
aminoácidos naturales del dominio III, o a un fragmento de ellos. En
una realización, el dominio de retención en el RE es el dominio III
de PE.
En otra realización, se inserta un dominio de
reconocimiento celular en la secuencia de aminoácidos del dominio
de retención en el RE (por ejemplo, en el dominio III). Por ejemplo,
el dominio de reconocimiento celular puede insertarse justo aguas
arriba de la secuencia de retención en el RE, de forma que la
secuencia de retención en el RE esté conectada directamente o a
diez aminoácidos del extremo carboxi del dominio de reconocimiento
celular.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE
preferiblemente se producen por medios recombinantes, tal como se
describe más adelante. Esta invención también prevé la producción
de proteínas quiméricas de PE mediante síntesis química usando
procedimientos disponibles en la técnica.
Habiendo seleccionado diversas estructuras como
dominios del inmunógeno quimérico, la función de estos dominios, y
de la quimera en conjunto, puede analizarse para detectar la
funcionalidad. Las quimeras inmunógenas tipo PE pueden analizarse
para determinar el reconocimiento celular, la translocación al
citosol y la capacidad inmunógena usando ensayos rutinarios. Puede
analizarse la proteína quimérica completa, o puede analizarse la
función de diversos dominios sustituyéndolos por dominios naturales
de la toxina natural.
La función del dominio de unión celular puede
analizarse como una función de la quimera de unirse al receptor
diana o bien aislado o en la superficie celular.
En un procedimiento, la unión de la quimera a
una diana se realiza por cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la
quimera puede unirse a una matriz de una columna de afinidad, y
detectarse la unión del receptor a la matriz.
La unión de la quimera a los receptores de las
células puede analizarse, por ejemplo, marcando la quimera y
detectando su unión a las células, por ejemplo, mediante separación
de células fluorescentes, autorradiografía, etc.
Si se han identificado anticuerpos que se unen
al ligando del que se deriva el dominio de reconocimiento celular,
también son útiles para detectar la existencia del dominio de
reconocimiento celular del inmunógeno quimérico mediante
inmunoensayo, o mediante un ensayo competitivo para el receptor
cognado.
La función del dominio de translocación y del
dominio de retención en el RE puede analizarse en función de la
capacidad de la quimera de penetrar en el citosol. Debido a que la
penetración requiere primero la unión a la célula, estos ensayos
también son útiles para determinar si el dominio de reconocimiento
celular está funcionando.
En un procedimiento, la penetración en el
citosol se determina detectando la presencia física de la quimera
en el citosol. Por ejemplo, la quimera puede estar marcada y exponer
la quimera a la célula. Después, se aísla la fracción citosólica y
se determina la cantidad de marcador de la fracción. Detectar el
marcador en la fracción indica que la quimera ha penetrado en el
citosol.
En otro procedimiento, puede analizarse la
capacidad del dominio de translocación y del dominio de retención
en el RE de efectuar la translocación al citosol con una
construcción que contiene un dominio III que tiene actividad de
ADP-ribosilación. En resumen, se siembran las
células en placas de cultivo tisular y se exponen a la proteína
quimérica o a una exotoxina de PE genotecnológica que contiene el
dominio de translocación o secuencia de retención en el RE
modificados en lugar de los dominios naturales. La actividad de
ADP-ribosilación se determina en función de la
inhibición de la síntesis de proteínas, por ejemplo, controlando la
incorporación de ^{3}H-leucina.
La función del epítopo exógeno puede
determinarse determinando la capacidad inmunógena humoral o mediada
por células. La capacidad inmunógena puede analizarse mediante
diversos procedimientos. La respuesta inmunitaria humoral puede
analizarse inoculando a un animal y detectando la producción de
anticuerpos contra el inmunógeno exógeno. Las respuestas
inmunitarias citotóxicas mediadas por células pueden analizarse
inmunizando a un animal con el inmunógeno, aislando los linfocitos
T citotóxicos, y detectando su capacidad de eliminar células cuyas
moléculas de CHM Clase I portan secuencias de aminoácidos del
epítopo exógeno. Debido a que la generación de una respuesta de
linfocitos T citotóxicos requiere tanto la unión de la quimera a la
célula como la translocación al citosol, esta prueba también
analiza la actividad del dominio de reconocimiento celular, del
dominio de translocación y del dominio de retención en el RE.
Esta invención proporciona polinucleótidos
recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que
codifica los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención.
Estos polinucleótidos son útiles para preparar los inmunógenos
quiméricos tipo PE. En otro aspecto, esta invención proporciona una
plataforma de clonado de proteínas tipo PE que comprende una
secuencia de polinucleótidos recombinante que codifica un dominio de
reconocimiento celular, un dominio de translocación, un dominio de
retención en el RE y, entre el dominio de translocación y el dominio
de retención en el RE, un sitio de clonado para una secuencia de
polinucleótidos que codifica un dominio de epítopo exógeno.
Los polinucleótidos recombinantes de esta
invención se basan en polinucleótidos que codifican exotoxina A de
Pseudomonas, o sus porciones. Anteriormente se presenta una
secuencia de nucleótidos que codifica PE. El investigador puede
usar esta secuencia para preparar cebadores de PCR para aislar una
secuencia de longitud completa. La secuencia de PE puede
modificarse para diseñar un polinucleótido que codifique el
inmunógeno quimérico tipo PE o la plataforma.
Un polinucleótido que codifica PE o cualquier
otro polinucleótido que se usa en las proteínas quiméricas de la
invención puede clonarse o amplificarse mediante procedimientos
in vitro, tales como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de
amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de
replicación de secuencias automantenido (3SR) y el sistema de
amplificación de la replicasa Q\beta (QB). Por ejemplo, puede
aislarse un polinucleótido que codifica la proteína mediante la
reacción en cadena de la polimerasa de ADNc usando cebadores basados
en la secuencia de ADN de PE o una molécula de reconocimiento
celular.
Para las personas de experiencia ordinaria en la
técnica es notoria una amplia variedad de metodologías de clonación
y amplificación in vitro. Los procedimientos de PCR se
describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.º
4.683.195; Mullis y cols. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 51: 263; y Erlich, editor, PCR Technology,
(Stockton Press, NY, 1989). Los polinucleótidos también pueden
aislarse evaluando adenotecas genómicas o de ADNc con sondas que se
seleccionan de las secuencias del polinucleótido deseado en
condiciones de hibridación estrictas.
Las versiones mutadas de las proteínas pueden
prepararse mediante mutagénesis específica de sitio de otros
polinucleótidos que codifican las proteínas, o por mutagénesis
aleatoria provocada aumentando la tasa de error de la PCR del
polinucleótido original con MnCl_{2} 0,1 mM y concentraciones de
nucleótidos no equilibradas.
La eliminación de los nucleótidos que codifican
los aminoácidos 1-252 proporciona una construcción
que se denomina "PE40". La eliminación de los nucleótidos que
codifican los aminoácidos 1-279 proporciona una
construcción que se denomina "PE37". (Véanse Pastan y cols.,
patente de Estados Unidos 5.602.095). El investigador puede ligar
secuencias que codifican los dominios de reconocimiento celular en
el extremo 5' de estas plataformas para diseñar proteínas
quiméricas tipo PE que se dirigen a receptores particulares de la
superficie celular. Estas construcciones opcionalmente pueden
codificar una metionina en el extremo amino. Puede insertarse un
dominio de reconocimiento celular en tales construcciones en la
secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de retención en el
RE.
Puede introducirse un sitio de clonación para el
dominio de epítopo exógeno entre los nucleótidos que codifican los
restos de cisteína del dominio Ib. Por ejemplo, tal como se describe
en los Ejemplos, puede eliminarse una secuencia de nucleótidos que
codifica una porción del dominio Ib entre los restos que codifican
las cisteínas y sustituirse por una secuencia de nucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos y que incluye un sitio de
clonación PstI. En el vector puede insertarse un polinucleótido que
codifica el epítopo exógeno y flanquearse con secuencias PstI.
La construcción también puede diseñarse para que
codifique una secuencia secretora en el extremo amino de la
proteína. Tales construcciones son útiles para producir los
inmunógenos en células de mamífero. In vitro, tales
construcciones simplifican el aislamiento del inmunógeno. In
vivo, las construcciones son útiles como vacunas de
polinucleótidos; las células que incorporan la construcción
expresarán la proteína y la segregarán donde pueda interactuar con
el sistema inmunitario.
Esta invención también proporciona vectores de
expresión para expresar inmunógenos quiméricos tipo PE. Los
vectores de expresión son moléculas recombinantes de polinucleótidos
que comprenden secuencias de control de la expresión ligadas
operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido. Los vectores de expresión pueden adaptarse para
funcionar en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de
promotores, secuencias de replicación, marcadores, etc. adecuados
para la transcripción y traducción de ARNm. La construcción de
vectores de expresión y la expresión de genes en células
transfectadas implica el uso de técnicas de clonación molecular
también notorias en la técnica. Sambrook y cols., Molecular
Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) y Current Protocols in
Molecular Biology, F.M. Ausubel y cols., editores, (Current
Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates,
Inc. y John Wiley & Sons, Inc.). Promotores útiles para tal fin
incluyen un promotor de metalotioneína, un promotor tardío
principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV inducible
por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de MRP polIII,
un promotor de MPSV constitutivo, un promotor de CMV inducible por
tetraciclina (tal como el promotor
inmediato-temprano de CMV humano), y un promotor de
CMV constitutivo. Un plásmido de utilidad para la terapia génica
puede comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores
seleccionables, regiones de identificación, y otros genes.
Los vectores de expresión de utilidad en esta
invención dependen del uso que se pretenda. Tales vectores de
expresión deben, por supuesto, contener señales de expresión y
replicación compatibles con la célula huésped. Los vectores de
expresión de utilidad para expresar los inmunógenos quiméricos tipo
PE incluyen vectores víricos tales como retroviruses, adenoviruses
y virus adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos, y similares.
Para transfectar células de mamífero se prefieren los vectores
víricos y plasmídicos. El vector de expresión pcADN1 (Invitrogen,
San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la expresión
comprende el promotor de CMV, proporciona buenas tasas de
transfección y expresión. Los vectores víricos adenoasociados son
útiles en los procedimientos de terapia génica de esta
invención.
Hay disponibles una variedad de medios para
introducir polinucleótidos en las células que incluyen, por ejemplo,
captación directa de la molécula de una solución por una célula,
captación facilitada mediante lipofección (por ejemplo, liposomas o
inmunoliposomas), transfección mediada por partículas, y expresión
intracelular a partir de un casete de expresión que tiene una
secuencia de control de la expresión ligada operablemente a una
secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor.
Véase también Inouye y cols., Patente de Estados Unidos
5.272.065; Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press,
Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, editor) (1990) o M. Krieger,
Gen Transfer and Expression - A Laboratory Manual,
Stockton Press, Nueva York, NY, (1990). Los plásmidos de expresión
de ADN recombinante también pueden usarse para preparar los
polinucleótidos de la invención para administrar por medios
distintos de la terapia génica, aunque puede ser más económico
preparar oligonucleótidos cortos mediante la síntesis química in
vitro.
La construcción también puede contener un
marcador para simplificar el aislamiento de la proteína. Por
ejemplo, puede incorporarse un marcador de polihistidina, por
ejemplo, de seis restos de histidina, al extremo amino de la
proteína. El marcador de polihistidina permite aislar la proteína de
forma conveniente en una única etapa mediante cromatografía en
quelato de níquel.
La invención también proporciona células
recombinantes que comprenden un vector de expresión para la
expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican un
inmunógeno quimérico tipo PE de esta invención. Las células
huéspedes pueden seleccionarse para niveles de expresión elevados
para purificar la proteína. Las células pueden ser células
procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas.
Células eucariotas adecuadas incluyen células de levaduras y
mamíferos. La célula puede ser, por ejemplo, una célula recombinante
en cultivo o una célula in vivo.
E. coli se ha usado con éxito para
producir inmunógenos quiméricos tipo PE. En esta célula puede
plegarse la proteína y pueden formarse enlaces disulfuro.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles en
vacunas para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra
agentes que portan el epítopo exógeno. Una vacuna puede incluir uno
o una pluralidad (es decir una vacuna multivalente) de inmunógenos
quiméricos tipo PE diferentes. Por ejemplo, una vacuna puede incluir
inmunógenos quiméricos tipo PE cuyos epítopos exógenos provengan de
diversas cepas circulantes de un patógeno. Al ir evolucionando el
patógeno, pueden construirse nuevos inmunógenos quiméricos tipo PE
que incluyan los epítopos alterados, por ejemplo, de virus
interrecurrentes. En una realización, la vacuna comprende epítopos
de un virus linfocito T-trópico y de un virus
macrófago-trópico. Por ejemplo, una vacuna contra la
infección por VIH puede incluir inmunógenos cuyos epítopos exógenos
se deriven del bucle V3 de las cepas MN y Thai-E de
VIH. También, los epítopos pueden derivarse de cualquier péptido de
VIH que esté implicado en la fusión a la membrana, por ejemplo,
gp120 o gp41. De forma alternativa, debido a que son vacunas con
subunidades, la vacuna puede incluir inmunógenos quiméricos tipo PE
cuyos epítopos exógenos se seleccionan de diversos epítopos del
mismo patógeno.
La vacuna puede venir liofilizada o ya
reconstituida en solución estéril para su uso. Una dosis de
inmunización está entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente
1000 \mug, más usualmente entre aproximadamente 10 \mug y
aproximadamente 50 \mug de la proteína recombinante. Para
determinar las dosis de inmunización véase, por ejemplo, Manual
of Clinical Immunology, H.R. Rose y H. Friedman, American
Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980). Una dosis
unitaria es de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 1 ml, más
usualmente aproximadamente 0,5 ml. Una dosis preferiblemente se
administra subcutánea o intramuscularmente. Una inyección puede
venir seguida de varias inyecciones más separadas entre si de
aproximadamente 4 a aproximadamente 8 semanas. Puede seguirse con
dosis de refuerzo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 años
después. La vacuna puede prepararse en formas farmacéuticas que
contienen 1 y 50 dosis (por ejemplo, 0.5 ml a 25 ml), más usualmente
entre 1 y 10 dosis (por ejemplo, 0,5 ml a 5 ml). La vacuna también
puede incluir un adyuvante, que potencia la respuesta inmunitaria
cuando se usa junto con un antígeno. Adyuvantes útiles incluyen
alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles
para provocar una respuesta inmunitaria contra antígenos que portan
el epítopo exógeno. Provocar una respuesta inmunitaria humoral es
útil en la producción de anticuerpos que específicamente reconocen
el epítopo exógeno y en la inmunización contra células, virus u
otros agentes que portan el epítopo exógeno. Los inmunógenos
quiméricos tipo PE también son útiles para provocar respuestas
inmunitarias mediadas por células dependientes de MHC Clase I o MHC
Clase II. También son útiles para provocar una respuesta
inmunitaria secretora.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE pueden
incluir epítopos exógenos de organismos patógenos o de células
patológicas de un sujeto, tales como células cancerosas. Por
consiguiente, esta invención proporciona tratamientos profilácticos
y terapéuticos para enfermedades que implican la actividad
patológica de agentes, ya sean patógenos o células aberrantes, que
portan el epítopo exógeno. Los procedimientos implican inmunizar a
un sujeto con inmunógenos quiméricos tipo PE que portan el epítopo
exógeno. Las respuestas inmunitarias resultantes montan un ataque
contra los patógenos mismos, o contra células que expresan el
epítopo exógeno. Por ejemplo, si la patología se produce por una
infección bacteriana o de protozoos parasíticos, el sistema
inmunitario monta una respuesta contra los patógenos mismos. Si el
patógeno es un virus, las células infectadas expresarán el epítopo
exógeno en su superficie y serán la diana de una respuesta
citotóxica. Las células aberrantes, tales como las células
cancerosas, a menudo expresan epítopos anormales, y también pueden
ser objeto de una respuesta inmunitaria citotóxica.
Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles
para provocar la producción de anticuerpos contra el epítopo
exógeno por un sujeto. Los inmunógenos quiméricos tipo PE son
inmunógenos atractivos para desarrollar anticuerpos contra epítopos
exógenos presentes de forma natural en un bucle de cisteína a
cisteína. Debido a que contienen el epítopo exógeno en un bucle de
cisteína a cisteína, presentan el epítopo al sistema inmunitario en
una conformación casi natural. Los anticuerpos resultantes
generalmente reconocen el antígeno natural mejor que los que se
desarrollan contra versiones lineales del epítopo exógeno.
Los procedimientos para producir anticuerpos
policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. En
resumen, un inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado,
un polipéptido acoplado a un vehículo apropiado (por ejemplo, GST,
hemocianina de lapa californiana, etc.), o un polipéptido
incorporado a un vector de inmunización, tal como un virus vaccinia
recombinante (véase, la patente de Estados Unidos n.º 4.722.848) se
mezcla con un adyuvante. Los animales se inmunizan con la mezcla. La
respuesta inmunitaria de un animal a la preparación inmunógena se
controla extrayendo sangre para analizar y determinando la
valoración de la reactividad contra el polipéptido de interés.
Cuando se obtienen valoraciones apropiadamente elevadas de
anticuerpo contra el inmunógeno, se extrae la sangre del animal y
se preparan antisueros. Cuando se desea se realiza un
fraccionamiento adicional del antisuero para enriquecerlo en
anticuerpos reactivos contra el polipéptido. Véase, por ejemplo,
Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene,
NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboralory Manual
Cold Spring Harbor Press, NY.
En diversas realizaciones, los anticuerpos
producidos finalmente pueden ser anticuerpos monoclonales,
anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o fragmentos de
anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales se preparan a
partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos
anticuerpos se evalúan para determinar su unión a polipéptidos que
comprenden el epítopo, o se evalúan para determinar la actividad de
agonista o antagonista, por ejemplo, la actividad mediada a través
del agente que comprende el epítopo exógeno. En algunos casos, es
deseable preparar anticuerpos monoclonales de diversos huéspedes
mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos,
etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos
monoclonales se encuentra, por ejemplo, en Stites y cols. (editores)
Basic and Clinical Immunology (4ª edición) Lange Medical
Publications, Los Altos, CA, y las referencias que se citan en él;
Harlow y Lane, Referencia anterior; Goding (1986) Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice (2ª edición) Academic
Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256:
495-497.
En otra realización, los anticuerpos son
inmunoglobulinas humanizadas. Los anticuerpos humanizados se
preparan ligando las regiones CDR de anticuerpos no humanos a
regiones constantes humanas mediante técnicas de recombinación de
ADN. Véase Queen y cols., patente de Estados Unidos n.º
5.585.089.
En otra realización de la invención, se
proporcionan fragmentos de anticuerpos contra el epítopo exógeno.
Típicamente, estos fragmentos muestran unión específica al epítopo
exógeno similar a la de una inmunoglobulina completa. Los
fragmentos de anticuerpos incluyen cadenas pesadas, cadenas ligeras,
Fab, Fab' F(ab')_{2} y Fv por separado. Los fragmentos se
producen mediante técnicas de recombinación de ADN, o por separación
enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Otras técnicas adecuadas implican la selección
de adenotecas de anticuerpos recombinantes en macrófagos o vectores
similares. Véase, Huse y cols. (1989) Science 246:
1275-1281; y Ward y cols. (1989) Nature 341:
544-546.
Una estrategia para aislar secuencias de ADN que
codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión
del mismo es evaluando una adenoteca de linfocitos B humanos de
acuerdo con el protocolo general descrito por Huse y cols.,
Science 246: 1275-1281 (1989) y después
clonando y amplificando las secuencias que codifican el anticuerpo
(o fragmento de unión) de la especificidad deseada. El protocolo
descrito por Huse se hace más eficiente combinado con la tecnología
de presentación en macrófagos. Véase, por ejemplo, Dower y cols.,
documento WO 91/17271 y McCafferty y cols., documento WO 92/01047.
La tecnología de presentación en macrófagos también puede usarse
para mutar regiones CDR de anticuerpos que anteriormente se haya
demostrado que presentan afinidad por los polipéptidos de esta
invención o sus ligandos. Se seleccionan anticuerpos que tienen una
afinidad de unión mejorada.
Los anticuerpos de esta invención son útiles
para la cromatografía por afinidad para aislar agentes que portan
el epítopo exógeno. Por ejemplo se preparan columnas con los
anticuerpos ligados a un soporte sólido, por ejemplo, partículas,
tales como agarosa, Sephadex, o similares, donde un lisado celular
se pasa a través de la columna, se lava, y se trata con
concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, mediante lo
cual se liberan agentes purifica-
dos.
dos.
Se produjeron anticuerpos contra gp120 usando un
inmunógeno quimérico tipo PE que tenía el bucle V3 de gp120 como
epítopo exógeno. Los anticuerpos monoclonales selectivamente
capturaron las proteínas quiméricas solubles de MN y
Th-E, confirmando que los bucles V3 estaban
expuestos y accesibles a las sondas de los anticuerpos. También, el
suero de conejos inmunizados neutralizó la capacidad infecciosa del
VIH-1 en un ensayo in vitro.
En otro aspecto, esta invención proporciona
procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria dependiente
de CHM Clase II contra células que expresan el epítopo exógeno. Las
moléculas de CHM Clase II se unen a péptidos que tienen motivos de
aminoácidos particulares notorios en la técnica. La respuesta
dependiente de CHM Clase II implica la captación de un antígeno por
las células presentadoras de antígenos (CPA), su procesamiento, y
presentación sobre la superficie celular como parte de un complejo
de CHM Clase II y péptido antígeno. De forma alternativa, las
moléculas de CHM Clase II sobre la superficie celular pueden unirse
a péptidos que tienen el motivo apropiado.
Las células presentadoras de antígenos
interactúan con linfocitos T cooperadores positivos para CD4,
activando así los linfocitos T cooperadores. Los linfocitos T
cooperadores activados estimulan a los linfocitos B para que
produzcan anticuerpos contra el antígeno. Los anticuerpos marcan las
células que portan el antígeno sobre su superficie. Las células
marcadas son objeto de citotoxicidad mediada por células dependiente
de anticuerpos, en la que las células NK o los macrófagos que
portan receptores Fc, atacan las células marcadas.
Los procedimientos para provocar una respuesta
inmunitaria dependiente de CHM Clase II implican administrar a un
sujeto una vacuna que incluye una cantidad inmunógena de una
exotoxina quimérica de Pseudomonas que incluye un motivo de
aminoácidos que reconocen las moléculas de CHM Clase II del sujeto.
De forma alternativa, las células presentadoras de antígenos pueden
cultivarse con tales péptidos permitiendo la unión, y las células
pueden administrarse al sujeto. Preferiblemente, las células son
autólogas al sujeto.
En otro aspecto, esta invención proporciona
procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria mediada por
células dependiente de CHM Clase I contra células que expresan el
epítopo exógeno en un sujeto. Las moléculas de CHM Clase I se unen
a péptidos que tienen motivos de aminoácidos particulares notorios
en la técnica. Las proteínas que se expresan en una célula se
digieren a péptidos y se presentan en la superficie celular
asociadas a moléculas de CHM Clase I. Allí, son reconocidas por
linfocitos positivos para CD8, generando una respuesta de
linfocitos T citotóxicos contra células que expresan los epítopos
asociadas a moléculas de CHM Clase I. Debido a que los linfocitos T
positivos para CD4 infectados con VIH expresan gp120 y, así, el
dominio V3, la generación de linfocitos T citotóxicos que atacan
tales células es útil en el tratamiento profiláctico o terapéutico
de infecciones por VIH.
El motivo de unión HLA-A1
incluye un primer resto conservado de T, S o M, un segundo resto
conservado de D o E, y un tercer resto conservado de Y. Otros
segundos restos conservados son A, S o T. El primer y segundo
restos conservados están adyacentes y preferiblemente están
separados del tercer resto conservado por de 6 a 7 restos. Un
segundo motivo consiste en un primer resto conservado de E o D y un
segundo resto conservado de Y donde el primer y segundo restos
conservados están separados por de 5 a 6 restos. El motivo de unión
HLA-A3.2 incluye un primer resto conservado de L, M,
I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo resto conservado de
K, R o Y en el extremo C. Otros primeros restos conservados son C, G
o D y de forma alternativa E. Otros segundos restos conservados son
H o F. El primer y segundo restos conservados están separados
preferiblemente por de 6 a 7 restos. El motivo de unión
HLA-A11 incluye un primer resto conservado de T o V
en la posición 2 y un resto conservado en el extremo C de K. El
primer y segundo restos conservados están separados preferiblemente
por de 6 a 7 restos. El motivo de unión HLA-A24.1
incluye un primer resto conservado de Y, F o W en la posición 2 y
un resto conservado en el extremo C de F, I, W, M o L. El primer y
segundo restos conservados están separados preferiblemente por de 6
a 7 restos.
Otro procedimiento implica transfectar células
ex vivo con tales vectores de expresión, y administrar las
células al sujeto. Las células preferiblemente son autólogas al
sujeto.
Los procedimientos para provocar una respuesta
inmunitaria contra un virus en un sujeto son útiles en
procedimientos profilácticos para prevenir la infección con el
virus cuando se administra la vacuna a un sujeto que no está
infectado todavía.
Las membranas mucosas son las principales vías
de entrada de muchos patógenos infecciosos. Tales patógenos
incluyen, por ejemplo, VIH, herpes, vaccinia, citomegalovirus,
yersinia y vibrio. Las membranas mucosas incluyen la boca, nariz,
garganta, pulmón, vagina, recto y colon. Como defensa contra la
entrada, el cuerpo segrega IgA secretora sobre las superficies de
las membranas mucosas epiteliales contra patógenos. Además, los
antígenos que se presentan a una superficie mucosa pueden
desencadenar respuestas en otras superficies mucosas debido a la
circulación de las células que segregan anticuerpos entre estas
mucosas. Se ha sugerido que la estructura de IgA secretora es
crucial para su presencia sostenida y función eficaz en la
superficie del lumen de una mucosa. Tal como se usa en la presente
memoria, "IgA secretora" o "sIgA" se refiere a una
molécula polimérica que comprende dos inmunoglobulinas IgA unidas
mediante una cadena J y unidas además a un componente secretor.
Aunque la administración de antígenos a las mucosas puede generar
una respuesta de IgG, la administración parenteral de inmunógenos
ráramente produce respuestas de sIgA potentes. La generación de una
respuesta inmunitaria secretora para la defensa contra VIH es una
necesidad reconocida. (Bukawa, H., y cols.1995, Nat Med 1,
681-5; Mestecky, J., y cols., 1994, Aids Res Hum
Retroviruses 10, S11-20).
La exotoxina de Pseudomonas se une a
receptores de las membranas mucosas. Por lo tanto, los inmunógenos
quiméricos tipo PE son un vector atractivo para llevar epítopos
exógenos a una superficie mucosa. Allí, los inmunógenos provocan
una respuesta inmunitaria mediada por IgA contra el inmunógeno. Por
consiguiente, esta invención proporciona inmunógenos quiméricos
tipo PE que comprenden un epítopo exógeno de un patógeno que penetra
a través de membranas mucosas. El dominio de reconocimiento celular
puede dirigirse a cualquier receptor de las superficies mucosas.
Estos inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles para provocar una
respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra inmunógenos
que penetran en el cuerpo a través de superficies mucosas. Los
inmunógenos quiméricos tipo PE que se usan para este fin deberían
tener ligandos que se unen a receptores de las membranas mucosas
como sus dominios de reconocimiento celular. Por ejemplo, el factor
de crecimiento epidérmico se une al receptor del factor de
crecimiento epidérmico de las superficies mucosas.
Los inmunógenos pueden aplicarse a la superficie
mucosa mediante cualquiera de los medios habituales, que incluyen
las composiciones farmacéuticas en forma de líquidos o sólidos, por
ejemplo, pulverizadores, ungüentos, supositorios o polímeros
erosionables impregnados con el inmunógeno. La administración puede
implicar aplicar el inmunógeno a una pluralidad de diferentes
superficies mucosas en una serie de inmunizaciones, por ejemplo,
como inmunizaciones de refuerzo. Una inoculación de refuerzo también
puede administrarse parenteralmente por ejemplo, por vía
subcutánea. El inmunógeno puede administrarse en una dosis de
aproximadamente 1 \mug a 1000 \mug, por ejemplo, de
aproximadamente 10 \mug a 100 \mug.
Se desconoce que la inoculación subcutánea con
vacunas que comprenden un epítopo del dominio neutralizante
principal de gp120 de VIH genere IgA secretora. Por consiguiente, la
presentación a las mucosas de los inmunógenos quiméricos de esta
invención es útil para producir estos anticuerpos desconocidos hasta
la fecha. Esta invención también proporciona IgA secretora que
reconoce específicamente epítopos de otros patógenos que penetran en
el cuerpo a través de una membrana mucosa.
La respuesta de IgA es más fuerte en superficies
mucosas expuestas al inmunógeno. Por lo tanto, en una realización,
el inmunógeno se aplica a una superficie mucosa que es probable que
sea un sitio de exposición al patógeno particular. Por
consiguiente, los inmunógenos quiméricos contra las enfermedades de
transmisión sexual pueden administrarse a las superficies mucosas
vaginal, anal u oral.
La administración a las mucosas, de los
inmunógenos quiméricos de esta invención produce respuestas de
memoria potente, tanto de IgA como de IgG. Por lo tanto, cuando se
vacune con ellos, es útil proporcionar una dosis de refuerzo bien
por vía mucosa o parenteral. La respuesta de memoria puede
provocarse administrando una dosis de refuerzo más de un año
después de la dosis inicial. Por ejemplo, puede administrarse una
dosis de refuerzo aproximadamente 12, aproximadamente 16,
aproximadamente 20 o aproximadamente 24 meses tras la dosis
inicial.
Las vacunas que comprenden polinucleótidos que
codifican una proteína inmunógena, a menudo denominadas "vacunas
de ADN" ofrecen ciertas ventajas comparadas con las vacunas con
polipéptidos. Las vacunas de ADN no corren el riesgo de
contaminación con inmunógenos proteínicos indeseados. Tras la
administración a un sujeto, el polinucleótido es captado por una
célula. Se realiza la transcripción inversa del ARN a ADN. El ADN se
integra en el genoma de algún porcentaje de las células
transfectadas. Cuando el ADN se integra de forma que esté ligado
operativamente con unas secuencias de control de la expresión, o si
tales secuencias se proporcionan con el polinucleótido
recombinante, la célula expresa el polipéptido codificado. Tras la
secreción de la célula, el polipéptido actúa como inmunógeno. El
ADN desnudo, de forma preferente es captado por el hígado y por las
células musculares. Por consiguiente, el polipéptido puede
inyectarse en el tejido muscular, o administrarse, por ejemplo,
mediante inyección biolística. Generalmente, la dosis de
polinucleótido desnudo será de aproximadamente 1 \mug a 100
\mug para un paciente típico de 70 kg.
Las vacunas con polinucleótidos de esta
invención pueden incluir polinucleótidos que codifican inmunógenos
quiméricos tipo PE que se usan en las vacunas con polipéptido. Esto
incluye inmunógenos múltiples que incluyen diversas variantes de un
epítopo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, no a modo de limitación.
Para generar proteínas quiméricas, el subdominio
Ib de ntPE se sustituyó por secuencias del bucle V3 bien de una
cepa MN (subtipo B) o Thai-E subtipo de
VIH-1. La secuencia de MN proviene de una cepa
linfocito T-trópica mientras que la secuencia
Thai-E proviene de una cepa
macrófago-trópica.
PE natural (WT) está compuesto por 613
aminoácidos y tiene una masa molecular de 67.122 Da. La eliminación
de un ácido glutámico 553 (\DeltaE553)produce una versión
no tóxica de PE (Lukac, M., y cols.,1988 Infect and Immun
56: 3095-3098), que se denomina ntPE.
Se construyeron plásmidos insertando parejas de
oligonucleótidos que codificaban secuencias del bucle V3 en un
nuevo vector con base de PE que se diseñó con un sitio PstI
novedoso. Esforzándose por producir un bucle V3 de topología
similar a la que se encuentra en gp120, los insertos de 14 ó 26
aminoácidos se flanquearon con restos de cisteína (Figura 1C -
negrita). La construcción del vector novedoso produjo diversos
cambios en la secuencia de aminoácidos de ntPE cerca del punto de
inserción del bucle V3 (Figura 1C - cursiva). Las quimeras no
tóxicas, ntPE-V3MN14, ntPE-V3MN26 y
ntPE-V3Th-E26, contenían bucles V3
de 14 ó 26 aminoácidos de la cepa MN o de 26 aminoácidos de la cepa
Thai-E, respectivamente (nt = "no tóxica"). La
inserción de una secuencia de 16 aminoácidos irrelevante produjo la
construcción de una quimera de control que se denomina
ntPE-fp126. La eliminación del bucle Ib (6
aminoácidos) y la modificación de los aminoácidos que flanquean el
inserto del bucle V3 produjo un pequeño aumento de la masa molecular
comparado con PE natural (Figura 1C).
Más específicamente, el plásmido pMOA1A2VK352
(Ogata, M., y cols. 1992, J Biol Chem, 267,
25396-401), que codifica PE, se digirió con Sfi1 y
ApaI (restos 1143 y 1275, respectivamente) y después se volvió a
ligar con un dúplex que contenía un sitio PstI novedoso. La cadena
codificante del dúplex tenía la siguiente secuencia:
5'-tggccctgac cctggccgcc gccgagagcg agcgcttcgt
ccggcagggc accggcaacg acgaggccgg cgcggcaaac
ctgcagggcc-3' (SEC. ID. N.º: 5). El plásmido
resultante codificaba una versión ligeramente menor de PE y carecía
de gran parte del dominio lb. Después se usó el sitio PstI para
introducir dúplex que codificaban secuencias del bucle V3
flanqueadas por restos cisteína. Para preparar proteínas no
tóxicas, se modificaron los vectores subclonándolos en un dominio
III enzimáticamente inactivo de pVC45\DeltaE553. Fue necesario un
subclonado adicional, de pJH4 (Hwang, J., y cols., 1987,
Cell, 48, 129-136), para producir un vector que
carecía de la secuencia de señal. La inserción de los dúplex y el
subclonado de las modificaciones se verificaron inicialmente
mediante análisis por restricción mientras que las construcciones
finales se confirmaron mediante secuenciación bicatenaria
didesoxi.
Todas las proteínas quiméricas del
ntPE-bucle V3 se expresaron en E coli
SA2821/BL21(\lambdaDE3) usando un sistema de promotor de
T7 y polimerasa de T7 (Studier, F.W., y cols.; 1990, Methods
Enzymol 185, 60-89). Las células
SA2821/BL21(\lambdaDE3) se transformaron con el plásmido
apropiado y se cultivaron hasta una absorbancia de 1,0 (600 nm) en
medio que contenía ampicilina. Para inducir una expresión de
proteínas de nivel alto, se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactosida
(1 mM) al cultivo y se incubó durante 90 minutos más. Los
sedimentos de células E. coli, se volvieron a suspender en
Tris 50 mM/EDTA 20 mM, a pH 8,0 (tampón de TE) y se dispersaron
usando un Tissue Miser. El lisado de las células se logró con
lysozyme (concentración final de 200 \mug/ml; Sigma) y las
proteínas asociadas a la membrana se solubilizaron mediante la
adición de Triton X-100 al 2,5% y NaCl 0,5 M.
Las quimeras de PE-bucle V3
estaban presentes en los cuerpos de inclusión, que se recuperaron
por centrifugación. Después de lavar con TE que contenía Triton
X-100 al 0,5% y después con TE solo, los cuerpos de
inclusión se solubilizaron mediante la adición de guanidina 6 M y
ditioeritritol 65 mM. Se dejó que se realizara el plegamiento a una
concentración final de proteína de 100 \mug/ml durante un mínimo
de 24 horas a 8ºC en Tris 0,1 M (pH 8,0) que contenía
L-arginina 0,5 M (Sigma), EDTA 2 mM y glutationa 0,9
mM. Se añadió inhibitor de proteasas AEBSF (Boerhinger Mannheim) a
una concentración final de 0,5 mM. Las proteínas se dializaron con
Tris 20 mM, EDTA 2 mM y urea 100 mM, a pH 7.4. Tras la diálisis, las
proteínas se aplicaron a una columna de Q-sepharose
(Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ). Después de lavar con Tris 20 mM
(pH 8-0) que contenía NaCl 0,1 M, se eluyeron las
proteínas quiméricas con NaCl 0,3 M en el mismo tampón y se
concentraron usando dispositivos de ultrafiltración
Centriprep-30 (Amicon, Inc.; Beverly, MA). Se usó
una columna de filtración en gel de HPLC (G3000SW de Toso Haas;
Montgomeryville, PA) para aislar los productos finales. Un
rendimiento típico de proteína plegada apropiadamente por 4 l de
cultivo bacteriano era de 50-100 mg con una pureza
superior al 95%.
Las proteínas quiméricas se separaron por
SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida en gradiente
de 8-16% (Novex; San Diego, CA), y se visualizaron
tiñendo con Coomassie Blue. Para el análisis por transferencia
Western, las proteínas se transfirieron a membranas
Immobilon-P (Millipore Corp., Bedford, MA) y se
expusieron o bien a un anticuerpo monoclonal de ratón contra PE
(M40-1 (Ogata, M., y cols., 1991, Infect and
Immun 59, 407-414) o a un anticuerpo monoclonal
de ratón contra gp120 (1F12 para las secuencias MN o 1B2 para las
secuencias Thai-E; Genentech, Inc.; South San
Francisco, CA). El anticuerpo primario fue detectado mediante un
anticuerpo secundario contra ratón conjugado a peroxidasa de
rábano. Los productos reactivos se visualizaron mediante la adición
de diaminobenzadina y peróxido de hidrógeno. Se realizaron
experimentos de inmunocaptura durante 30 minutos a 23ºC usando el
anticuerpo monoclonal 1F12 contra gp120. Los complejos de
anticuerpo-proteína quimérica se recuperaron con
perlas de sepharose con proteína G (Pharmacia Biotech; Piscataway,
NJ) y se separaron usando SDS-PAGE (como
anteriormente). Las formas recombinantes de gp120 derivadas de las
cepas aisladas VIH-1-MN (120/MN;
Genentech, Inc.) y Thai subtipo E (gp120/Th-E -
Chiang Mai; Advanced Biotechnologies, Columbia MD) se usaron como
patrones.
El análisis por SDS-PAGE de
quimeras de ntPE-bucle V3 purificadas (Figura 2A)
era consistente con las masas calculadas (Figura 1C). Las
transferencias Western, usando anticuerpos monoclonales generados
contra gp120/MN (IF12) o gp120/Th-E (1B2),
mostraron reactividad específica de cepa con las quimeras de bucle
V3 de MN y de Thai-E (Figura 2B).
El análisis de los sulfhidrilos libres de las
quimeras de ntPE-bucle V3 purificadas no mostraron
cisteínas desparejadas, lo que sugiere que las quimeras de
ntPE-bucle V3 purificadas se habían vuelto a plegar
y se habían oxidado formando un enlace disulfuro en la base del
bucle V3 (Figura 1A). Se esperaba que la formación de este enlace
disulfuro produjera la exposición del bucle V3 en la superficie de
las quimeras.
Para determinar en contenido en sulfhidrilos, se
hicieron reaccionar proteínas quiméricas (15 nmols) en PBS (a pH
7,4) que contenían EDTA 1 mM con tionitrobenzoato (DTNB) 1 mM
(Pierce Chem Co, Rockford, IL) durante 15 minutos a 23ºC. La
liberación de tionitrobenzoato se controló a 412 nm. La reactividad
de DTNB se confirmó usando cisteína.
Esto se analizó directamente mediante estudios
de inmunocaptura (Figura 2C). Los anticuerpos monoclonales 1F12 y
1B2 capturaron selectivamente las proteínas quiméricas solubles de
MN y Th-E confirmando que los bucles V3 estaban
expuestos y accesibles para las sondas de los anticuerpos. A pesar
del hecho de que el anticuerpo 1F12 reaccionó con fuerza con
ntPE-V3MN14 en las transferencias Western (Fig 2B),
solamente capturó una pequeña cantidad de proteína soluble (Figura
2C, Carril 3), lo que sugiere que el epítopo reactivo no estaba
expuesto completamente cuando se insertaban únicamente 14
aminoácidos.
Para evaluar el impacto de los insertos de
aminoácidos sobre la estructura secundaria de las quimeras, se
realizaron análisis espectrales de DC en el UV cercano y lejano con
proteínas ntPEV3MN14 y ntPE-V3MN26 purificadas y
estos se compararon con los espectros de PE natural (wtPE) (Figuras
3A y 3B). Los espectros de dicroismo circular (DC) se obtuvieron en
un espectropolarímetro Aviv 60DS. Los espectros de DC en el UV
cercano (400 nm a 250 nm) se obtuvieron con incrementos de 0,2 nm
con una anchura de banda de 0,5 nm y una constante de tiempo de 5
segundos (150 lecturas/segundo promediadas) para las muestras en una
cubeta de 1 cm de recorrido. Los espectros en el UV lejano (250 nm
a 190 nm) se obtuvieron con incrementos de 0,2 nm con una anchura de
banda de 0,5 nm y una constante de tiempo de 3 segundos, en una
cubeta de 0,05 cm de recorrido. Cada espectro se refinó
digitalmente usando el algoritmo Savitsky-Golay
(Gorry, P.A. 1990, Analytical Chem 62,
570-573), se corrigió tomando en cuenta la
concentración, y se normalizó a unidades de elipticidad del peso
medio del resto (\thetaPMR) usando la siguiente relación:
\theta_{PMR} =
\frac{\theta_{obs} \ (PM_{monómero}/n_{monómero})}{10 \ (d) \
(c)}
donde \theta_{obs} es la
elipticidad observada, PM_{monómero} es el peso molecular del
monómero, n_{monómero} es el número de aminoácidos en el
monómero, d es el recorrido de la cubeta (cm), y c es la
concentración de la muestra en la cubeta
(mg/ml).
Los cálculos de la estructura secundaria (Figura
3C) sugirieron que no había diferencias significativas entre estas
proteínas y wtPE. ntPE-V3MN14 demostró una
elipticidad más negativa que ntPE-V3MN26 y wtPE, lo
que sugiere que puede haber una mayor tensión en el enlace
disulfuro en la base del inserto del bucle para esta quimera. Tanto
ntPE-V3MN14 como ntPE-V3MN26
mostraron un aparente desplazamiento a rojo a 290 nm, posiblemente
debido a los restos adicionales de tirosina de las quimeras. De
forma alternativa, este desplazamiento a rojo podría producirse por
una ligera perturbación del entorno de un resto triptófano. En
conjunto, estos resultados sugieren que los insertos del bucle V3
no produjeron grandes alteraciones en la estructura secundaria
comparando con la toxina natural y que los cambios en la estructura
terciaria eran consistentes con la presencia de los insertos de 14
y 26 aminoácidos.
Tras la unión al receptor LRP, las quimeras de
ntPE-bucle V3 deberían endocitarse, ser escindidas
por furina y la porción del extremo C que contiene los dominios II,
el bucle V3 y III deberían translocarse al citosol de forma similar
a wtPE (Ogata, M., y cols., 1990, Biol Chem 265,
20678-85). Esto se analizó directamente produciendo
versiones enzimáticamente activas de PE-V3MN14 y 26
(que contienen ácido glutámico 553 y que tienen la capacidad de
ADP-ribosilar el factor de elongación 2) y comparar
su actividad con wtPE en ensayos de citotoxicidad.
Se sembraron células A431 humanas (carcinoma
epidermoide) en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 1 x
10^{5} células/pocillo en medio RPMI 1640 suplementado con suero
bovino fetal al 5%. Después de 24 horas, las células se trataron
durante 18 horas a 37ºC con diluciones por un factor de 4 de wtPE o
de formas tóxicas (con un resto ácido glutámico en la posición 553
y capaces de ADP-ribosilar el factor de elongación
2) de las proteínas quiméricas. La inhibición de la síntesis de
proteínas se evaluó controlando la incorporación de
^{3}H-leucina.
Cuando se ensayó para determinar su capacidad de
inhibir la síntesis de proteína, PE-V3MN26 mostró
una toxicidad similar a wtPE en células A431 humanas (Figura 4).
PE-V3MN14 también era completamente tóxico. Estos
resultados confirmaron que el tamaño y la locación de los insertos
del bucle V3 no impidieron el transporte de la toxina al citosol.
Además, estos datos sugieren que el protocolo de aislamiento,
replegado y purificación que se usó para preparar estas quimeras
dio como resultado la producción de una proteína correctamente
plegada y funcional.
Para investigar su utilidad como inmunógenos, se
inyectaron 200 \mug de cualquiera de las quimeras de MN o
Thai-E a conejos por vía subcutánea. Los conejos se
inmunizaron subcutáneamente en cuatro zonas con 200 \mug (en
total) de ntPE-V3MN26. La primera inyección se
administró con adyuvante completo de Freund. Todas las inyecciones
subsiguientes (a las 2, 4 y 12 semanas) se administraron con
adyuvante incompleto de Freund. Semanalmente se extrajo sangre
venosa después de la tercera inyección y se evaluaron por
inmunotransferencia con gp120.
En las transferencias Western, las muestras de
suero de conejos inmunizados con las proteínas
ntPE-V3MN mostraron una fuerte reactividad con
gp120/MN recombinante inmovilizada (Figura 5A). Las valoraciones de
la reactividad aumentaron en función del tiempo: a las 6 semanas se
observó reactividad a una dilución 1:200, a las 12 semanas a una
dilución de 1:5.000 y después podía detectarse la reactividad a
1:25.000. Estos sueros contra bucle V3/MN no reaccionaban con
gp120/Thai-E (Figura 5A). El suero de conejos a los
que se había inyectado PE no tóxica (es decir ntPE sin inserto) no
mostró reactividad con gp120. Los conejos a los que se había
inyectado, ntPE-V3Th-E produjeron
suero reactivo con gp120/Thai-E pero no con gp120/MN
(Figura 5A).
El suero de los conejos inmunizados con
ntPE-V3MN26 se caracterizó adicionalmente. La
reactividad con gp120/
MN inmovilizada fue absorbida cuando estos sueros se premezclaron con gp120/MN recombinante soluble (Figura 58). Esta actividad bloqueante, que era dependiente de la dosis y máxima a 50 \mug/ml indicaba que los conejos respondían principalmente a las secuencias del bucle V3 que están expuestas en la superficie de gp120.
MN inmovilizada fue absorbida cuando estos sueros se premezclaron con gp120/MN recombinante soluble (Figura 58). Esta actividad bloqueante, que era dependiente de la dosis y máxima a 50 \mug/ml indicaba que los conejos respondían principalmente a las secuencias del bucle V3 que están expuestas en la superficie de gp120.
También se encontró que el suero de los conejos
inmunizados también neutralizaba la capacidad infecciosa de
VIH-1 en un ensayo in vitro (Figura 6). Este
ensayo utilizó células MT4 como indicador de la destrucción celular
mediada por VIH-1 (Miyoshi, I., y cols., 1981,
Nature 294, 770-1). Se incubaron diluciones
seriadas de antisuero por duplicado con VIH-1/MN
cultivado en células FDA/H9 (Popovic, M., y cols., 1984,
Science 224, 497-500) y la mezcla se añadió a
las células durante 7 días. La muerte celular mediada por virus se
calculó usando un ensayo de tinción con MTT (Robertson, G.A., y
cols., 1988, J Virol Methods 20, 195-202) y
análisis espectrofotométrico a 570 nm. Se calculó la con-
centración de suero que producía una inhibición del 50% y se expresó en términos de valoración de la neutralización.
centración de suero que producía una inhibición del 50% y se expresó en términos de valoración de la neutralización.
El suero anterior a la inmunización no mostró
ninguna protección de una línea de linfocitos T humanos, MT4,
frente a la destrucción por VIH-1 MN. Aunque el
suero de la semana 5 después de la inmunización tampoco mostró
protección, los sueros de la semana 8 y de la semana 27 eran
protectores contra la exposición a virus produciéndose un 50% de
neutralización aproximadamente a una dilución de 1:400. Basándose en
el calendario de inmunización utilizado, el suero de la semana 5
reflejaba la respuesta en los animales inmunizados y con una dosis
de refuerzo, mientras que el suero de la semana 8 era de animales
con dos dosis de refuerzo y el suero de la semana 27 provenía de
animales con tres dosis de refuerzo. Los valores de supervivencia de
las células MT4 obtenidos para las diluciones de suero inferiores a
1:100 para las extracciones de la semana 8 y de la semana 27 fueron
superiores a los de las células de control no expuestas que se
usaron para la normalización. Esto era probablemente debido a la
estimulación por los factores de crecimiento presentes en el suero
de conejo. Los datos sugieren que la respuesta inmunitaria tras las
inyecciones
subcutáneas de quimeras de ntPE-bucle V3 pueden dar como resultado la producción de anticuerpos neutralizadores.
subcutáneas de quimeras de ntPE-bucle V3 pueden dar como resultado la producción de anticuerpos neutralizadores.
Se demostró que los anticuerpos que se generaron
contra el inmunógeno quimérico tenían la capacidad de neutralizar
la capacidad infecciosa de VIH-1 en ensayos de
crecimiento vírico en los que se usaba la supresión de la producción
de p24 como indicador de la neutralización de VIH. Se incubaron
cepas aisladas clínicas que correspondían al subtipo B, RVL05, y al
subtipo E, Th92009, con diluciones de suero de conejo y se
cultivaron en PBMC (células mononucleares de sangre periférica)
durante un total de 5 días.
Un ensayo utilizó células MT4 como indicadores
de la muerte celular mediada por VIH-1. I. Miyoshi y
cols. (1981) Nature 294: 710-771. Se
incubaron diluciones seriadas de antisuero por duplicado con
VIH-1/MN y se cultivaron en células FDA/H9 y la
mezcla se añadió a células MT4 durante 7 días. Popovic, M., y cols.,
1984, Science 224, 497-500. La muerte
celular mediada por virus se calculó usando un ensayo de tinción
con bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
y análisis espectrofotométrico a 570 nm. G.A. Robertson, y cols.,
1988, J Virol Methods 20, 195-202. Se calculó
la concentración de suero que producía una inhibición del 50% y se
expresó en términos de valoración de la neutralización.
Un segundo ensayo usó la producción de p24 como
indicador del crecimiento vírico. T. Wrin y cols. (1995) J.
Virol. 69: 39-48. Primero se valoró el virus
primario para determinar la cantidad que de forma reproducible
proporcionaba cantidades significativas pero submáximas de p24. Las
preparaciones de virus se incubaron durante 1 hora a 37ºC con
diversas diluciones de suero de conejo, bien inmunizado o de antes
de la exposición, y esta mezcla después se añadió por cuadruplicado
a 2,5 x 10^{5} PBMC. El cultivo continuó durante 3 días, momento
en el cual se lavaron las células y las quimeras 9952 de bucle
V3-toxina se resuspendieron en medio que contenía
interleuquina 2. La acumulación de p24 se detectó mediante un
ELISA.
Debido a que el suero extraído de los conejos
inmunizados con ntPE-V3MN26 neutralizaba los virus
en el ensayo con MT4 a una dilución de 1:400, se usó este suero
para evaluar la actividad contra las cepas clínicas aisladas. Una
muestra de suero extraída a las 24 semanas mostró actividad de
neutralización contra las cepas aisladas subtipos B y E (véase
Figura 14). No se observó actividad de neutralización con el suero
anterior a la exposición de sangre del mismo conejo.
La inoculación a las mucosas con un inmunógeno
quimérico tipo PE que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de gp120
de VIH-1 indujo una tanto respuesta inmunitaria
humoral como una mediada por células contra VIH-1.
Una versión tóxica de esta quimera fue capaz de destruir una línea
celular intestinal humana, Caco-2, cultivada en
monocapas a confluencia. Una forma no letal de la quimera se
administró a ratones bien subcutáneamente o a la superficie mucosa
vaginal, rectal, gástrica o nasal. Los refuerzos subsiguientes se
realizaron a estas diversas superficies mucosas o por
administración subcutánea. La medición de anticuerpos específicos de
MNgp120 en las muestras de saliva y suero demostraron respuestas
tanto de IgA como de IgG en cada uno de los grupos de
administración mucosa y subcutánea. Estos resultados demuestran que
los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención pueden
penetrar en las células epiteliales, circular de forma similar a una
toxina natural, transportarse a través de una barrera epitelial
intacta e inducir la producción de anticuerpos tanto IgA como
IgG.
Las quimeras tipo PE que se usan en estos
experimentos se describen en el Ejemplo I. El gen estructural que
codifica PE natural (tóxica) se modificó eliminando la región Ib y
proporcionando un único sitio PstI para la inserción de secuencias
del bucle V3 de 26 aminoácidos. Las versiones no tóxicas de quimeras
de PE-bucle V3 se prepararon sin el resto ácido
glutámico en la posición 553 (\DeltaE553) y así no presentaban
actividad de ADP-ribosilación. Todas las proteínas
quiméricas de PE-bucle V3 se expresaron en E.
coli BL21(\lambdaDE3) usando el sistema de promotor de
T7 y polimerasa de T7. Se añadió IPTG (1,0 mM durante 90 minutos)
para potenciar la expresión de proteínas. Las proteínas de
PE-bucle V3 se aislaron de los cuerpos de inclusión
y se purificaron mediante tandas sucesivas de cromatografía de
intercambio aniónico y una filtración en gel final.
Se aplicó una versión tóxica de la quimera de la
exotoxina de Pseudomonas (PE) que contenía 26 aminoácidos
del bucle V3 de MNgp120 (tPE-MN26) a la superficie
apical de mococapas concluyentes de células Caco-2
polarizadas. Las células Caco-2 se cultivaron y se
mantuvieron tal como se ha descrito anteriormente (W. Rubas y cols.
(1996) "Flux measurements across Caco-2
monolayers might predict transport in human large intestinal
tissue" J. Pharm. Sci. 85: 165-169) sobre
soportes de filtro de policarbonato recubiertos de colágeno
previamente humedecidos (PBS, 15 minutos fuera y después dentro)
(Snapwells™). El medio de cultivo se cambió cada dos días y se
usaron monocapas confluentes el día 25 después de la siembra y al
pase 30-35. Se añadieron versiones tóxicas de PE y
quimeras de PE-bucle V3 a la superficie apical en
medio de cultivo. Después de 24 horas de incubación continuada a
37ºC, las monocapas de Caco-2 se lavaron tres veces
con PBS eliminando las actividades de las ésterasas del suero y se
incubaron con homodímero de calceína AM y etidio para determinar la
proporción de células vivas/muertas (LIVE/DEAD® Eukolight kit;
Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
La quimera destruyó estas células epiteliales
intestinales con una potencia similar a la de PE auténtica (Figura
8). La viabilidad celular se midió en términos de la proporción
entre células vivas y muertas.
En todos los estudios de inmunización
subsiguientes se usó una quimera no tóxica (\Delta553)
(ntPE-V3MN26) para examinar la capacidad de
ntPE-V3MN26 de bloquear las acciones tóxicas de PE
en monocapas de Caco-2 (Figura 8). Así, los
resultados de la Figura 8 muestran que la incorporación de 26
aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 (ntPE-V3MN26)
en lugar del bucle Ib endógeno bucle de PE no altera la capacidad de
la quimera de PE de ser captada y procesada por células
epiteliales, confluentes, polarizadas. Esta capacidad de la quimera
de PE-bucle V3 de ser captada y procesada por las
células epiteliales es importante contra un patógeno tal como
VIH-1 que puede infectar y alterar la función de
las células epiteliales intestinales humanas. D.M. Asmuth y cols.
(1994) "Physiological effects of VIH infection on human
intestinal epithelial cells: an in vitro model for HIV
enteropathy" AIDS 8: 205-211.
Se obtuvieron ratones hembra
balb-c de Simonsen de 6-8 semanas de
edad y se mantuvieron en cuarentena durante 2 semanas antes del
estudio. Los animales se asignaron a uno de 6 grupos que se
inocularon 3 veces con intervalos de dos semanas. Los animales
disponían de comida y agua a voluntad. Los grupos de animales se
inmunizaron de la forma siguiente: (1) oral, oral, oral; (2)
vaginal, vaginal, vaginal; (3) rectal, rectal, rectal; (4) vaginal,
oral, oral; (5) rectal, oral, oral; y (5) subcutánea, subcutánea,
subcutánea. Cada inoculación oral usó 40 \mug de quimera de
PE-bucle V3 en 200 \mul de PBS que contenía Tween
20 al 0,05%, 1 mg/ml de BSA y NaHCO_{3} 0,2 M (a pH = 8,1). Todas
las inoculaciones vaginales, rectales y subcutáneas contenían 20
\mug de quimera de PE-bucle V3 en 20 \mul de
PBS que contenía Tween 20 al 0,05%.
Tras la inyección intraperitoneal de 0,1 mg de
pilocarpina, se recogió saliva de ratón (habitualmente 50 \mul)
usando pipetas de Pasteur de polipropileno y se introdujo en tubos
de polipropileno. Las muestras de suero (100 \mul) se obtuvieron
por sangrado periorbital usando tubos separadores de suero. Las
muestras de suero y saliva recogidas se almacenaron a -70ºC hasta
su análisis. Se realizó un ELISA específico de gp120 usando placas
Costar 9018 de E.I.A./R.I.A. recubiertas con gp120. Tras el lavado
con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y timerosol al 0,01%),
las placas se bloquearon con tampón de ensayo (PBST que contenía BSA
al 0,5%). Se realizó un lavado subsiguiente antes de la
introducción de una muestra de suero p saliva (100 \mul/pocillo).
Las inmunoglobulinas unidas se marcaron usando anticuerpos de cabra
enteros biotinilados que reconocían selectivamente IgA de ratón o
IgG de ratón (Amersham). Como control positivo para los ensayos de
IgG se usó un anticuerpo monoclonal de ratón denominado 1F12
(Genentech, Inc.). No había disponible ninguna IgA de ratón
específica de gp120 como patrón positivo. Se usaron conjugado de
ExtrAvidin® y peroxidasa (Sigma), ácido
2,2'-azino-bis(2-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)
(Sigma) y un tampón de fosfato y citrato que contenía urea y
peróxido de hidrógeno para cuantificar el anticuerpo unido a 405
nm.
Se administró PE-V3MN26 no
tóxico a ratones balb-c con combinaciones de cebado
oral, aplicación a la mucosa vaginal, aplicación a la mucosa rectal
o por inyección subcutánea. Se recogieron muestras de suero y saliva
uno, dos y tres meses después de la inoculación inicial de cada
grupo de administración y se analizaron mediante ELISA para
determinar las valoraciones de anticuerpos IgG e IgA específicos de
MNgp120. Las muestras de saliva y suero anteriores a la
inmunización no mostraron una reacción de ruido de fondo
significativa en estos ELISAS específicos de gp120. Se observaron
cantidades cuantificables de IgG específica de gp120 en el suero de
todos los grupos administrados (Figura 9). Aunque la respuesta de
IgG observada fue inicialmente mayor en el grupo de administración
subcutánea, finalmente todos grupos demostraron fuertes respuestas
de IgG en suero. Los grupos que fueron expuestos oralmente a la
ntPE-V3MN26 también parecieron obtener una respuesta
de IgG más rápido que aquellos grupos expuestos solamente en la
mucosa vaginal o rectal. Comparados con una IgG_{1} monoclonal de
ratón que reconoce selectivamente el bucle V3 de MNgp120, los
niveles más altos medidos en cada uno de los grupos de IgG
específica de Ig120 estaban entre 5-25 \mug/ml de
suero.
Los anticuerpos IgA parecen contribuir a la
resistencia contra patógenos estrictos de la mucosa y contra agentes
invasores que pasan a provocar una enfermedad sistémica tras la
colonización de las mucosas. R.I. Walker y cols. (1994) "New
strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective
immunization" Vaccine 12: 387-400. Se usó
un ELISA para determinar los niveles de IgA específica de Ig120 en
muestras de saliva recogidas como índice de la respuesta de
anticuerpos en las mucosas. Dado que no había disponible ninguna
IgA monoclonal específica de MNgp120, los valores obtenidos mediante
el ELISA solamente se compararon entre grupos y no se
caracterizaron en términos de valores absolutos. Las muestras de
saliva de los 6 grupos de administración contenían IgA específica
de gp120 (Figura 10). La respuesta más potente de IgA se observó en
animales que recibieron una dosis vaginal inicial y dosis orales
subsiguientes de quimera de PE-bucle V3. Fue
interesante que los animales que recibieron solamente inyecciones
subcutáneas demostraron niveles de IgA comparables a algunos de los
observados en grupos que solamente recibían exposición a las
quimeras en las mucosas. Esto puede estar relacionado con los
anticuerpos que se usaron en el ELISA de IgA. A pesar de todo,
estos resultados demuestran que puede inducirse tanto la inmunidad
sistémica como de las mucosas mediante inmunización de las mucosas
de forma similar a lo que se observó anteriormente con la
inmunización oral usando toxina de tos ferina. M. J. Walker, y
cols. (1992) "Specific lung mucosal and sistemic immune responses
alter oral immunization of mice with Salmonella typhimurium
aro A, Salmonella typhi Ty21a; and invasive Escherichia
coli expressing recombinant pertussis toxin S1 subunit"
Infect. Immun. 60: 4260.
Se ha reseñado que las vacunas con subunidades
de VIH-1 solamente producen una respuesta de IgG
tras la administración subcutánea (M. B. Vasudevachari y cols.
(1992) "Envelope specific antibodies in the saliva of individuals
vaccinated with recombinant VIH-1 gp160" J.
Acquir. Immune Defic. Syndr. 5: 817-821) o de
IgG e IgA tras la inyección intramuscular (G. J. Gorse y cols.
(1996) "Salivary binding antibodies induced by human
immunodeficiency virus type 1 recombinant gp120 vaccine"
Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 3: 769-773.).
Aunque esos autores sugirieron que la maximización de la producción
de anticuerpos de las mucosas será importante para una vacuna contra
VIH-1, sin embargo, no queda claro si los
anticuerpos IgA detectados eran secretores. Es probable que sIgA
fuera la forma principal de IgA en las muestras de saliva y que IgA
dimérica fuera la forma primaria en las muestras de suero en esos
así como en los presentes estudios. El reactivo de unión de IgA que
se usó en este momento se desarrolló contra IgA en suero y así
puede haber provocado un sesgo en las mediciones de IgA. Así, los
niveles de IgA medidos en suero pueden parecer mayores que los
niveles en saliva solamente debido a una menor afinidad por sIgA
que por IgA dimérico. Los valores de IgA que se proporcionan en el
presente estudio, por lo tanto, se presentan solamente en una
escala relativa.
Se ha demostrado que un número de factores
liberados por células Th1 y Th2 regulan las respuestas de IgA (J.
R. McGhee y cols. (1993) "New perspectives in mucosal immunity
with emphasis on vaccine development" Seminars in
Hematology. 30: 3-15).Por ejemplo, en presencia
de IL-5, IL-2 forma una sinergia con
TGF-\beta aumentando la síntesis de IgA, lo que
abre la posibilidad de manipular farmacológicamente la respuesta
inmunitaria. La forma de presentación de antígenos, sin embargo,
viene dictada significativamente por el destino del inmunógeno. Se
ha demostrado que las células epiteliales de las superficies
mucosas, que tienen el receptor LRP para unirse e internalizar
ntPE-V3MN26, expresan las proteínas de CHM Clase II
y la clase II puede alcanzar eficientemente la superficie de las
células para la presentación de antígenos de origen lisosómico (V.
G. Brachet y cols. (1997) "Ii chain controls the transport of
major histocompatability complex class II molecules to and from
lysosomes" J. Cell Biol. 137: 51-65).
Así, ntPE-V3MN26 puede ser presentado por las
estructuras de CHM Clase II sobre la superficie celular de las
células epiteliales. De forma alternativa, si el inmunógeno
atraviesa la barrera de la mucosa y alcanza una célula de
presentación de antígenos profesional de la lamina propria
subyacente en forma intacta, debería inducir una respuesta de Th2 y
producir como resultado una presentación de antígenos restringida a
MHC clase I.
La administración a la mucosa de
ntPE-V3MN26 produjo una respuesta de memoria
significativa caracterizada por una combinación de isotipos de IgG
en suero tanto de las rutas de Th1 como de Th2. Dado que se ha
propuesto que la respuesta de Th2 es ventajosa para neutralizar
virus y que pueden ser necesarias respuestas inmunitarias
citotóxicas asociadas a eventos de Th1 para respuestas inmunitarias
eficaces contra virus intracelulares (J.R. McGhee y cols. (1994)
Reprod. Fertil. Dev. 6: 369-379), estos
resultados sugieren que la inmunización de las mucosas con
ntPE-V3MN26 proporcionó los tipos de respuestas
deseados para la protección contra la infección por
VIH-1 (G.L. Ada y cols. (1997) AIDS Res. Hum.
Retroviruses 13: 205-210.
La estructura y preparación de las
ntPE-V3MN26 que se usan en estos estudios se
describe en la presente memoria. MNgp120 y el anticuerpo monoclonal
1F12 que reconoce el bucle V3 de MNgp120 se prepararon en Genentech,
Inc. (South San Francisco, CA). Los anticuerpos de cabra
biotinilados desarrollados contra IgG de ratón o IgA de ratón se
compraron en Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL). Los
anticuerpos de rata biotinilados que reconocen IgG_{1},
IgG_{2a}, IgG_{2b}, IgG_{3} e IgE se obtuvieron de Pharmingen
(San Diego, CA).
Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de
6-8 semanas de edad y se mantuvieron en cuarentena
durante 2 semanas antes del estudio y con comida y agua a voluntad.
Los animales se asignaron aleatoriamente a grupos (n = 6) que
recibieron combinaciones de administraciones orales, vaginales,
rectales o subcutáneas. Las inoculaciones orales se realizaron por
cebado oral de 200 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, 1
mg/ml de BSA, NaHCO_{3} 0,2 M (pH final = 8,1) y 40 \mul de
ntPE-V3MN26. Las inoculaciones vaginales, rectales,
y subcutáneas contenían 20 \mug de ntPE-V3MN26 en
20 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. La saliva de ratón
(habitualmente 50-100 \mul) se recogió durante
aproximadamente 10 minutos usando pipetas de Pasteur de
polipropileno tras la hipersalivación inducida mediante inyección
intraperitoneal de 0,1 mg de pilocarpina por animal. Las muestras
de suero (100 \mul)se obtuvieron por sangrado periorbital
usando tubos separadores de suero. Las muestras de suero y saliva
recogidas se almacenaron a -70ºC hasta su análisis.
En un estudio aparte, a los ratones se les
inyectaron por vía subcutánea 20 \mug de
ntPE-V3MN26 o 20 \mug de ntPE y se les
administraron refuerzos a las 2 y 7 semanas. A un grupo de animales
que recibió ntPE-V3MN26 (n = 3) y a los animales
que recibieron ntPE (0 = 2) se les administraron simultáneamente 40
\mul de adyuvante completo de Freund inicialmente y 40 \mul de
adyuvante incompleto de Freund las semanas 2 y 7. Un grupo de
animales (n = 3) a los que se había administrado 20 \mug de
ntPE-V3MN26 formulada en 40 \mul de solución
salina normal sirvió de control. Las muestras de suero (100 \mul)
se obtuvieron semanalmente y se almacenaron tal como se describe
anteriormente.
Se midieron los anticuerpos específicos contra
gp120 mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
En resumen, placas Costar 9018 de E.I.A./R.I.A. de 96 pocillos se
recubrieron con 1 \mug/pocillo de MNgp120, se lavaron tres veces
con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (v/v) y después se bloquearon
toda la noche 4ºC con PBS que contenía BSA al 1%. Después de lavar
con PBS/Tween 20, las placas se incubaron con diluciones de
muestras de suero o saliva (diluidas con PBS/Tween 20 que contenía
BSA al 0,1%). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura
ambiente con agitación suave, después se lavaron tres veces con
PBS/Tween 20 y se incubaron con un anticuerpo de cabra conjugado
con biotina contra IgA o IgG de ratón, para determinar las
respuestas de subclase IgG o IgE, con anticuerpo de rata conjugado
con biotina contra IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, o IgE de ratón durante
1 hora usando las mismas condiciones de incubación. Después de lavar
con PBS/Tween 20, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa
de rábano. Los anticuerpos unidos se visualizaron mediante el
conjugado de ExtrAvidin® y peroxidasa (Sigma), ácido
2,2'-azino-bis(2-etilbenzotiazolino-6-sulfónico)
(Sigma) y un tampón de fosfato y citrato que contenía urea y
peróxido de hidrógeno para cuantificar el anticuerpo unido a 405
nm.
Los animales se inocularon (n = 6/grupo) por una
variedad de vías con ntPE-V3MN26 seguido de 2
refuerzos los días 14 y 21 y después el mes 16. Los animales
recibieron ntPE-V3MN26 bien por vía oral (PO),
vaginal (V), rectal (R), vaginal y oral (V/PO), rectal y oral
(R/PO), o subcutánea (SC). Las muestras de saliva que se recogieron
a los 30, 60 y 90 días y después de nuevo a los 16,5 meses se
analizaron para determinar IgA específica de los antígenos (Figura
11). Sin un anticuerpo IgA contra el bucle V3 para estandarizar los
ensayos, las respuestas se normalizaron con una muestra muy
positiva. Los valores se expresaron en una escala arbitraria de
unidades de IgA específica de antígeno. Todos los grupos que habían
sido administrados demostraron respuestas de IgA salivar
comparables a los 30 y 60 días. A los 90 días, la respuesta más
potente de IgA salivar se observó en el grupo que recibió una dosis
inicial vaginal y refuerzos subsiguientes orales. A los 16,5 meses
los grupos de todas orales, todas vaginales y todas rectales
mostraron los niveles más elevados de IgA salivar específica de
antígeno. Las respuestas de los grupos de inoculación mucosa
combinada (vaginal/oral y rectal/oral) eran comparables a los
observados en el grupo de administración subcutánea.
Para asegurar que estas respuestas de IgA
salivar reflejaban una unión específica de antígeno y no una unión
no específica a componentes salivares, se evaluaron muestras de
saliva anteriores a la inmunización y se realizó un estudio en el
que se administraba una mezcla de péptido del bucle V3 y ntPE a los
ratones. Los estudios demostraron que las muestras de saliva no
diluidas anteriores a la inmunización no demostraron un ruido de
fondo cuantificable en el formato ELISA. También, los animales a los
que se administró simultáneamente ntPE y un bucle V3 sin conjugar
unidos por un enlace disulfuro no presentaron niveles cuantificables
de IgA específica de MNgp120. Estos resultados indican que se
produjo poca o ninguna reactividad cruzada no específica en el
ELISA.
No se observaron respuestas detectables de IgA
en suero específica de antígeno en ninguno de los grupos de
administración en los tiempos de obtención de muestras de 1, 2 ó 3
meses. Sin embargo, a los 16,5 meses, los sueros recogidos de todos
los grupos demostraron IgA específica de antígeno (Tabla 1). Es
posible que la capacidad de detectar IgA en suero en este momento
pueda haberse debido a una respuesta inmunitaria global elevada en
lugar de a una estimulación específica. De forma interesante, los
niveles relativos de IgA en suero no se correlacionaban con los
niveles de IgA salivar. Por ejemplo, las inoculaciones mediante la
combinación rectal/oral proporcionaron una de las respuestas de IgA
salivar de memoria más débil, pero la respuesta de IgA en suero de
memoria más potente (Tabla 1, Figura 11). Los grupos de todas
orales, todas vaginales o todas rectales, que proporcionaron loas
respuestas de IgA salivar más potentes a los 16,5 meses presentaban
algunas de las respuestas de IgA en suero más débiles en este
tiempo. Al contrario que la administración a las mucosas de
ntPE-V3MN26 donde los niveles opuestos en saliva y
suero eran la norma, las inoculaciones subcutáneas de
ntPE-V3MN26 produjeron una respuesta moderada de
IgA, tanto en la saliva como en el suero de los ratones (Tabla 1,
Figura 11). Fuera cual fuera el estímulo de la producción de IgA,
los niveles de IgA específica de antígeno en suero fueron
transitorios. En el muestreo a los 22 meses, sólo dos animales del
grupo rectal/oral representaban los únicos positivos de IgA que
reconocía MNgp120 en suero cuantificable. Ninguno de los otros
grupos, incluso el grupo de inyección subcutánea, mostró niveles
detectables de IgA en suero en este punto.
Calendario de inmunizaciones ^{a} | IgA en suero ^{b} (unidades arbitrarias) | IgG ^{c} salivar (\mug/ml) |
PO/PO/PO/PO | 0,233 \pm 0,074 | 10,9 \pm 2,2 |
V/V/V/V | 0,172 \pm 0,061 | 9,52 \pm 1,6 |
R/R/R/R | 0,178 \pm 0,042 | 9,93 \pm 1,7 |
V/PO/PO/PO | 0,160 \pm 0,021 | 9,90 \pm 1,3 |
R/PO/PO/PO | 0,450 \pm 0,128 | 11,0 \pm 0,49 |
SC/SC/SC/SC | 0,273 \pm 0,078 | 7,1 \pm 0,63 |
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Las inmunizaciones se realizaron los días 0, 14, 21 y el mes 16 en animales bien por vía oral (PO), vaginal (V), rectal (R) o subcutánea (SC).\end{minipage} | ||
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}Los niveles de IgA específica de MNgp120 se midieron mediante ELISA a los 16,5 meses y se normalizaron con un patrón de muestra única y se expresaron en unidades arbitrarias.\end{minipage} | ||
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}Los niveles de IgG específica de MNgp120 se midieron mediante ELISA a los 16,5 meses y se calibraron comparando con un anticuerpo monoclonal de ratón (1F12) que reconoce el bucle V3 de la proteína.\end{minipage} |
Las respuestas de IgG específica de antígeno en
suero y saliva, medidas mediante ELISA, se estandarizaron usando un
anticuerpo monoclonal de ratón (1F12) que reconoce el bucle V3 de
MNgp120. El ensayo era lineal en el intervalo de 0,05 - 2,5 \mug
para 1F12 y los sueros y salivas anteriores a la inmunización eran
negativos en el formato ELISA. Aunque la respuesta de IgG producida
por una inoculación inicial seguida de dos dosis de refuerzo fue
finalmente mayor en el grupo de inyección subcutánea, todos los
grupos de inoculación a las mucosas demostraron respuestas potentes
de IgG en suero los días 30, 60 y 90 (Figura 12). Dos semanas
después de una dosis de refuerzo con ntPE-V3MN26 el
mes 16, el grupo de inyección subcutánea tenía la respuesta de
memoria más elevada de IgG en suero. Todos los grupos de mucosas
también mostraron respuestas de memoria fuertes en este tiempo
(Figura 12). Sin embargo, para el mes 22 las valoraciones de IgG
específica de antígeno en suero habían disminuido en todos los
grupos.
Los estudios anteriores han sugerido que la IgG
en suero puede trasudarse a las superficies mucosas, posiblemente
proporcionando alguna forma de protección inmunitaria. M.B.
Vasudevachari y cols. (1992) J. Acquir. Immune Defic. Syndr.
5: 817-821. Otros no han sido capaces de demostrar
tal evento de trasudación. E. -L. Johansson y cols. (1998)
Infect. Immun. 66: 514-520. En estos
estudios, no se observó IgG específica de antígeno en muestras de
saliva en los meses 1, 2 y 3 pero aumentó a niveles detectables
después de una dosis de refuerzo el mes 16 (Tabla 1). Todos los
grupos de animales que habían sido inoculados en las mucosas tenían
respuestas de IgG salivar comparables en este tiempo que eran
superiores a las que se observaban para los animales que recibían
ntPE-V3MN26 subcutánea (Tabla 1). Esta falta de
correlación entre los niveles relativos en suero y saliva de IgG
específica de antígeno (Figura 12, Tabla 1) sugiere una separación
de las reservas de IgG en suero y salivar resultado de esta
respuesta de memoria. Así, parece que la IgG presente en saliva de
los estudios puede haber sido resultado, en un grado significativo,
de la producción local de anticuerpos en lugar de un "derrame"
de los anticuerpos circulantes en suero.
En los ratones, la inducción de una respuesta de
Th1 habitualmente conlleva la producción de IgG2a e IgG3 por los
linfocitos B mientras que una respuesta de Th2 conlleva la
producción de IgG1 y posiblemente IgE. A.K. Abbas y cols. (1996)
Nature 383: 787-793. El desarrollo de una
respuesta de Th1 o Th2 está dirigido por citoquinas específicas
tales como interferón-\gamma e
IL-4. la introducción de ntPE-V3MN26
bien sistémicamente mediante inyección subcutánea o mediante
aplicación a tejidos orales, vaginales o rectales produjo el
desarrollo de una respuesta de IgG específica de antígeno en suero.
Se investigó la población de los isotipos de IgG de estas muestras
de suero y se encontró que la respuesta específica de MNgp120 estaba
dominada (\sim55%) por IgG3. Se encontraron cantidades menores y
comparables de IgG2a específica de antígeno (\sim20%) e IgG2b
(\sim20%) junto con cantidades reducidas (\sim5%) de IgG3. No
se detectó IgE específica de antígeno. Estos resultados sugieren
que la administración subcutánea de ntPE-V3MN26
induce tanto respuestas de Th1 como de Th2 en ratones BALB/c,
dominando el fenotipo Th2.
Los adyuvantes pueden actuar facilitando la
presentación de un antígeno y/o activando la respuesta inmunitaria
en el sitio de la inoculación. F.R. Vogel y cols. (1995) A
compendium of vaccine adyuvants and excipients, páginas
141-228. EnM. F. Powell, y M. J. Newman (editores),
VACCINE DESIGN: THE SUBUNIT AND ADYUVANT APPROACH, vol. 6. Plemun
Press, Nueva York. Reconocido como uno de los adyuvantes más
potentes disponibles, el adyuvante de Freund es una mezcla de
aceite mineral, tensioactivo y Mycobacterium tuberculosis. Se
realizó un estudio para evaluar la eficacia de la inducción de IgG
en suero por ntPE-V3MN26 inyectando a los ratones
inicialmente ntPE-V3MN26 y adyuvante completo de
Freund por vía subcutánea, con dosis de refuerzo con
ntPE-V3MN26 y adyuvante incompleto después de 14 y
49 días, y después comparando las respuestas de IgG en suero con las
de los animales que recibieron ntPE-V3MN26 sin
adyuvante de Freund (Figura 13). Los animales que recibieron la
misma pauta de administración subcutánea de
ntPE-V3MN26 con solución salina normal en lugar de
adyuvante de Freund mostraron aproximadamente un tercio de la
respuesta inmunitaria específica de antígeno que se observó en los
animales que recibían esta quimera junto con adyuvante de Freund. El
nivel de respuesta a ntPEV3MN26 en este espacio de tiempo fue
similar al observado en el grupo de inyección subcutánea que se
representa en la Figura 12 a los 1, 2 y 3 meses, lo que sugiere un
resultado bastante consistente para esta forma de administración de
la quimera. Un control en el que se inyectó la pauta de adyuvante de
Freund junto con una PE no tóxica que carecía del bucle V3 de
MNgp120 demostró la especificidad de la respuesta inmunitaria que se
estaba midiendo (Figura 13).
La presente invención proporciona inmunógenos
quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas y procedimientos
de provocar una respuesta inmunitaria. Aunque se han proporcionado
ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no
restrictiva. Para las personas de experiencia en la técnica serán
obvias muchas variaciones de la invención al revisar esta memoria
descriptiva. El alcance de la invención, por lo tanto, debería
determinarse no refiriéndose a la descripción anterior, sino que
debería determinarse refiriéndose a las reivindicaciones
anexas.
Claims (40)
1. El uso un inmunógeno quimérico tipo
exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o
terapéutico de una enfermedad provocada por un patógeno que penetra
en un mamífero a través de una membrana mucosa, en el que el
medicamento es para aplicar a una superficie mucosa del mamífero
para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora
contra el patógeno, en el que además el inmunógeno comprende por
orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500
aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de mucosa;
(2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de
aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II
de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular;
(3) un dominio de epítopo que comprende una secuencia de
aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio
Ib de PE y codifica un epítopo del patógeno; y (4) una secuencia de
aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo
endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención
en el RE y en el que el dominio de retención en el RE carece de
actividad de ADP-
ribosilación.
ribosilación.
2. El uso de la reivindicación 1, en el
que dicho patógeno es un virus, bacteria o protozoo.
3. El uso de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, en el que la enfermedad es provocada por un
patógeno que se selecciona de VIH, herpes zoster, influenza, polio,
hepatitis, tuberculosis, Chlamydia, Salmonella, Trypanosoma,
Plasmodium, vaccinia, citomegalovirus, Yersinia y vibrio.
4. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de aminoácidos del
dominio de epítopo exógeno tiene de aproximadamente 15a 350
aminoácidos.
5. El uso de la reivindicación 4, en el
que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo exógeno
consiste en aproximadamente 50 aminoácidos.
6. El uso de la reivindicación 5, en el
que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo exógeno
consiste en aproximadamente 15 aminoácidos.
7. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el epítopo exógeno es un epítopo
de herpes, vaccinia, citomegalovirus, yersinia o vibrio y dicho
anticuerpo IgA secretor reconoce el epítopo exógeno.
8. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio de epítopo exógeno
comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo
exógeno.
9. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el epítopo exógeno comprende un
vértice del bucle V3 de VIH-1.
10. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el dominio de retención comprende
la secuencia REDLK.
11. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el dominio de retención comprende
la secuencia RDEL.
12. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el dominio de reconocimiento
celular es el dominio de reconocimiento celular Ia de PE.
13. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el dominio de reconocimiento
celular comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
14. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el dominio de translocación es
idéntico al menos al 95% al dominio de translocación de PE.
15. El uso de la reivindicación 14, en el
que el dominio de translocación es idéntico al menos al 98% al
dominio de translocación de PE.
16. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la superficie de la mucosa se
selecciona de boca, nariz, pulmón, intestino, vagina, colon o
recto.
17. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 que es para la fabricación de un medicamento
para la administración a diferentes superficies mucosas.
18. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17 que comprende el uso del inmunógeno
quimérico para la fabricación de medicamento(s) para la
administración inicial y de refuerzo.
\newpage
19. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18 que comprende el uso del inmunógeno
quimérico para la fabricación de un medicamento para uso como
refuerzo y para la administración parenteral.
20. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19 que comprende el uso del inmunógeno
quimérico para la fabricación de un medicamento para uso como
refuerzo, a una superficie mucosa al menos un año después de una
dosis inicial.
21. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que el medicamento se formula en
forma de un spray, ungüento, supositorio o polímero
erosionable.
22. El uso de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en el que el mamífero es un ser humano.
23. Un procedimiento no terapéutico de
producir un anticuerpo contra un epítopo diana, que comprende la
administración vía mucosa a un animal no humano de un inmunógeno
quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE")
no tóxico, en el que el inmunógeno comprende por orden: (1) un
dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos
que se une a un receptor de la superficie de células mucosas; (2) un
dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos
sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE
suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un
dominio de epítopo diana que comprende una secuencia de aminoácidos
de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio Ib de Pe y
codifica un epítopo de un patógeno que penetra en un mamífero a
través de una membrana mucosa; y (4) una secuencia de aminoácidos
que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático
("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE y en
el que el dominio de retención en el RE carece de actividad de
ADP-ribosilación.
24. El procedimiento de la reivindicación
23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
25. El procedimiento de la reivindicación
23 que además incluye la fabricación de un anticuerpo monoclonal
utilizando células que segregan anticuerpos producidas en dicho
animal mediante la administración de dicho inmunógeno.
26. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25, en el que dicho patógeno es un virus,
bacteria o protozoo.
27. El procedimiento de la reivindicación
26, en el que la enfermedad es provocada por un patógeno que se
selecciona de VIH, herpes zoster, influenza, polio, hepatitis,
tuberculosis, Chlamydia, Salmonella, Trypanosoma, Plasmodium,
vaccinia, citomegalovirus, Yersinia y vibrio.
28. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 27, en el que la secuencia de aminoácidos del
dominio de epítopo diana tiene de aproximadamente 15 a 350
aminoácidos.
29. El procedimiento de la reivindicación
28, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de
epítopo diana está formado por aproximadamente 50 aminoácidos.
30. El procedimiento de la reivindicación
28, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de
epítopo diana está formado por aproximadamente 15 aminoácidos.
31. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 25 a 30, en el que el epítopo diana es un epítopo
de herpes, vaccinia, citomegalovirus, yersinia o vibrio y dicho
anticuerpo IgA secretor reconoce el epítopo diana.
32. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 31, en el que el dominio de epítopo diana
comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo
diana.
33. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 32, en el que el epítopo exógeno comprende un
vértice del bucle V3 de VIH-1.
34. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 32, en el que el dominio de retención
comprende la secuencia REDLK.
35. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 32, en el que el dominio de retención
comprende la secuencia RDEL.
36. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 35, en el que el dominio de reconocimiento
celular es el dominio de reconocimiento celular Ia de PE.
37. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 35, en el que el dominio de reconocimiento
celular comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
38. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 37, en el que el dominio de translocación es
idéntico al menos al 95% al dominio de translocación de PE.
39. El procedimiento de la reivindicación
38, en el que el dominio de translocación es idéntico al menos al
98% al dominio de translocación de PE.
40. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 30 que además comprende preparar un anticuerpo
humanizado.
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