ES2322240T3

ES2322240T3 - Una proteina quimerica que comprende secuencias de exotoxina a de pseudomonas no toxica y de pilina de tipo iv.

Info

Publication number: ES2322240T3
Application number: ES01997090T
Authority: ES
Inventors: David Fitzgerald
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2009-06-18
Anticipated expiration: 2021-12-20
Also published as: EP1379550B1; EP1379550A2; ATE425180T1; US20040071731A1; WO2002060935A3; US20070003578A1; DK1379550T3; JP2008237227A; CA2432731A1; JP2004528018A; WO2002060935A2; US7314625B2; WO2002060935A8; DE60137969D1

Abstract

Una proteína quimérica que comprende: A) un dominio de traslado que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 desde la posición 280 a 344 o una variante activa de la misma que es suficiente para realizar el traslado de la proteína quimérica al citosol celular; B) un dominio de retención en retículo endoplásmico que carece de actividad de ADP-ribosilación y se localiza en el extremo carboxi de la proteína quimérica y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22 o la SEC ID Nº: 23; C) una secuencia de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV bacteriana o de levadura de entre 10 y 100 aminoácidos de longitud y localizada entre el dominio de traslado y el dominio de retención en retículo endoplásmico; caracterizada por que la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y además, cuando se introduce un hospedador, la proteína quimérica es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

Description

Una proteína quimérica que comprende secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y de pilina de Tipo IV.

Antecedentes de la invención

La pilina de Tipo IV es la subunidad principal del pilus o los pili que son estructuras filamentosas que cubren muchos microorganismos que incluyen bacterias y levaduras. Entre estos microorganismos, muchas especies patógenas expresan pilinas de Tipo IV, que incluyen, por ejemplo, P. aeruginosa, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Vibrio cholerae y Pasteurella multocida. La primera etapa en la infección con estos microorganismos patógenos es la adherencia a células diana por los pili. En particular, las pilinas de Tipo IV de Pseudomonas aeruginosa se unen a receptores de asialoGM1 sobre células epiteliales (Saiman et al., J. Clin. Invest. 92 (4): 1875-80 (1993); Sheth et al., 11(4): 715-23 (1994); Imundo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(7): 3019-23 (1995); Hahn, Gene 192(1): 99-108 (1997)). Por tanto, los pili de estos microorganismos son un factor de virulencia principal y dan como resultado la colonización por microorganismos patógenos e infecciones en seres humanos.

Por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa provoca entre el 10% y el 20% de las infecciones en la mayoría de los hospitales. La infección por Pseudomonas es común entre pacientes con fibrosis quística, heridas por quemaduras, trasplantes de órganos y adicción a drogas intravenosas. Las infecciones por Pseudomonas pueden conducir a infecciones graves, tales como endoftalmitis, endocarditis, meningitis, neumonía y septicemia. En particular, la colonización de individuos con fibrosis quística (CF) por Pseudomonas aeruginosa representa un hito significativo negativo en la progresión de esta enfermedad. Una vez colonizados, los pacientes están sometidos a los efectos dañinos de diversos factores de virulencia secretados y a la respuesta inflamatoria del sistema inmune del hospedador.

Los pili de Tipo IV están compuestos por polímeros de pilina dispuestos en una estructura helicoidal con cinco subunidades por vuelta (Forest et al., Gene 192(1): 165-9 (1997); Parge, Nature 378(6552): 32-8 (1995)). La porción de la proteína de pilina responsable de la unión celular se encuentra cerca del extremo C (aminoácidos 122-148) en un bucle de giro \beta subtendido por un puente disulfuro (Campbell et al., Biochemistry 36(42): 12791-801 (1997); Campbell et al., J. Mol. Biol. 267(2): 382-402 (1997); Hazes et al., J. Mol. Biol. 299(4): 1005-1017 (2000); McInnes et al., Biochemistry 32(49): 13432-40 (1993)). Para P. aeruginosa, una secuencia de 12 ó 17 aminoácidos (dependiendo de la cepa) en este bucle interacciona con receptores sobre células epiteliales. Para individuos con CF, la superproducción del dominio R del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística mutante (CFTR) puede conducir a un nivel aumentado de asialoGM1 y, en consecuencia, una unión aumentada de P. aeruginosa (Imundo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(7): 3019-23 (1995); Saiman et al., J. Clin. Invest. 92(4): 1875-80 (1993); Bryan et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19(2): 269-77 (1998); Imundo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(7): 3019-23 (1995); Saiman et al., J. Clin. Invest. 92(4): 1875-80 (1993)). Los estudios funcionales de pilina han indicado que solamente la última subunidad de pilina (la punta) de un pilus interacciona con receptores de células epiteliales (Lee et al., Mol. Microbiol. 11 (4): 705-13 (1994)).

Hasta la fecha, los intentos de producir una vacuna anti-pilina eficaz no han sido muy exitosos. En parte, este éxito limitado se debe a que la porción con mayor capacidad inmunógena de la proteína (el centro) no genera anticuerpos que interfieren con la adhesión. Desafortunadamente, el bucle C-terminal de pilina no tiene mucha capacidad inmunógena y se han descrito respuestas de título alto solamente con el uso de estrategias que emplean copias de presentación múltiple de la secuencia de bucle (Hahn et al., Behring. Inst. Mitt. (98): 315-25 (1997)). Para pacientes con CF, las estrategias para inhibir la colonización por Pseudomonas se consideran un elemento importante para reducir la morbilidad asociada normalmente con el desarrollo de infecciones crónicas (Tang et al., Infect. Immun. 63(4): 1278-85 (1995); Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(3): 967-72 (1997); Tang et al., Infect. Immun. 63(4): 1278-85 (1995) Doig, P. et al., Infect Immun 58(1): 124-30 (1990); EI-Zaim, H. S. et al. Infect Immun 66(11): 5551-4 (1998)).

En consecuencia, existe una necesidad de desarrollar composiciones para reducir o prevenir infecciones por microorganismos patógenos que incluyen, en particular, Pseudomonas aeruginosa. Las realizaciones de esta invención abordan estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

Las realizaciones de la invención proporcionan proteínas quiméricas que comprenden una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, donde la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se localiza dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. En la presente invención, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se refiere a la secuencia que forma un bucle disulfuro intracadena en el extremo C de la pilina. Este bucle interacciona y se une a receptores sobre células epiteliales. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas se presenta en conformación prácticamente nativa y puede reaccionar con receptores sobre células epiteliales. Como resultado, la presente proteína quimérica comprende la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV que compite por la unión a estas células epiteliales y que puede reducir la adherencia de microorganismos patógenos que expresan la pilina de Tipo IV a las células epiteliales. Por lo tanto, la proteína quimérica se puede usar por sí misma o en una composición para reducir directamente la adherencia de microorganismos patógenos en un hospedador.

La presente invención también se basa, en parte, en el descubrimiento de que antisueros generados contra las proteínas quiméricas de la invención también son útiles para reducir la adherencia de microorganismos patógenos (que expresan pilinas de Tipo IV) en un hospedador. Ya que la proteína quimérica presenta el bucle de pilina de Tipo IV en conformación prácticamente nativa, las proteínas quiméricas de la invención, cuando se introducen en un hospedador, generan antisueros policlonales que se unen a la porción de bucle de pilina de las proteínas quiméricas. Los antisueros también se pueden unir a las pilinas de Tipo IV en microorganismos patógenos y, por tanto, inhibir competitivamente la unión de los microorganismos patógenos a receptores de células epiteliales. En consecuencia, la proteína quimérica se puede usar como una vacuna para generar antisueros en un hospedador que puede dar como resultado la reducción tanto de adherencia como de colonización de microorganismos patógenos en el
hospedador.

Además, ya que la proteína quimérica presenta la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica en conformación prácticamente nativa, las proteínas quiméricas de la invención, cuando se introducen en un hospedador, generan anticuerpos policlonales que se unen a la exotoxina A de Pseudomonas no tóxica así como a la exotoxina A de Pseudomonas nativa. Se conoce que la exotoxina A de Pseudomonas nativa que se secreta por Pseudomonas aeruginosa provoca citotoxicidad celular entrando en células mediante endocitosis mediada por receptor y entonces, después de una serie de etapas de procesamiento intracelulares, se traslada al citosol celular y ADP-ribosilan el factor de elongación 2. Esto da como resultado la inhibición de síntesis de proteínas y muerte celular. Los antisueros generados contra la presente proteína quimérica pueden unirse a exotoxina A liberada por Pseudomonas y pueden neutralizar la citotoxicidad celular. Por lo tanto, si números pequeños de Pseudomonas deben superar la primera línea de defensa (anticuerpos contra la secuencia de bucle de pilina evitando la colonización), el poder destructivo normal de la exotoxina A se neutralizará por anticuerpos generados contra la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica.

Las proteínas quiméricas, los polinucleótidos quiméricos y las composiciones de la presente invención pueden tener muchas otras utilidades. Por ejemplo, las proteínas quiméricas y las composiciones que comprenden proteínas quiméricas se pueden usar en ensayos de diagnóstico, tales como inmunoensayos. Tales ensayos de diagnóstico se pueden usar para detectar la presencia de microorganismos que llevan una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, tal como Pseudomonas aeruginosa, o para determinar si un hospedador tiene antisueros contra un bucle de pilina de Tipo IV debido a una infección. En otro ejemplo, las proteínas quiméricas y las composiciones que comprenden las proteínas quiméricas también se pueden usar para purificar anticuerpos contra, por ejemplo, la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV. En otro ejemplo, los anticuerpos contra la proteína quimérica se pueden usar para clonar y aislar otras secuencias de pilina de Tipo IV relacionadas.

En consecuencia, en un aspecto de la invención, la invención proporciona una proteína quimérica que comprende: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en un hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica que comprende: (a) una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que comprende el dominio Ia, dominio II y dominio III; y (b) una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, donde la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se localiza entre el dominio II y el dominio III de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína quimérica, comprendiendo la proteína quimérica: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en un hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que evitan la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína quimérica, comprendiendo la proteína quimérica: (a) una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que comprende el dominio Ia, dominio II y dominio III; y (b) una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, donde la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se localiza entre el dominio II y el dominio III de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una proteína quimérica, comprendiendo la proteína quimérica: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en un hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que evitan la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para suscitar una respuesta inmune en un hospedador, comprendiendo el método la etapa de administrar al hospedador una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que comprende una proteína quimérica que comprende: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en el hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que evitan la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para suscitar una respuesta inmune en un hospedador, comprendiendo el método la etapa de administrar al hospedador una cantidad inmunológicamente eficaz de un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una proteína quimérica, que comprende: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en el hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para generar anticuerpos específicos para una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, que comprende introducir en un hospedador una composición que comprende una proteína quimérica que comprende una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y, además, donde la proteína quimérica, cuando se introduce en el hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A ilustra en forma de dibujo la sustitución del dominio Ib con el bucle C-terminal de pilina. El inserto de pilina se corresponde a la secuencia de pilina descrita para la capa PAK de P. aeruginosa.

La Figura 1B ilustra en forma de dibujo la estructura de dominio de PE de Allured et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1320-1324 (1986). PE64 carece de la región de bucle del dominio Ib. PE64pil incluye la inserción del bucle de pilina (restos 129-142) de la cepa PAK de P. aeruginosa. La deleción de ácido glutámico 553 (indicado por un punto) elimina un resto de sitio activo (Lukac et al., Infect. Immuno. 56(12): 3095-8 (1988)) y produce las proteínas PE64A553 y PE64\Delta553pil sin actividad de ADP-ribosilación. El bucle Ib se muestra en ligero sombreado y el bucle de pilina en sombreado más intenso.

La Figura 2 ilustra análisis de SDS-PAGE (Panel A y C) y de transferencia de Western (Panel B) de proteínas PE y pilina. A. Los carriles 1-4 muestran proteínas PE sustancialmente puras (4-5 \mug de proteínas se cargaron por carril) después de cromatografía MonoQ. De izquierda a derecha, las proteínas cargadas fueron: PE64, PE64pil, PE64A553 y PE64\Delta553pil. Se añadió pilina de PAK purificada al carril 5. B. Los carriles 6-10 muestran las mismas proteínas que A pero sondadas con un anticuerpo monoclonal para el bucle de pilina. El carril 11 es PE64\Delta553pil después de cromatografía de filtración en gel. Se indican las proteínas patrón y sus masas moleculares en kDa.

La Figura 3 ilustra la toxicidad de PE64pil en comparación con PE64. Para evaluar el efecto de introducir un tercer bucle en PE se comparó la toxicidad de PE64 (\blacksquare) con PE64pil (\ding{115}). Se añadieron concentraciones crecientes de cada proteína a las células L929 y, después de una incubación durante una noche, se determinó la inhibición de síntesis proteica. Los resultados se expresan como porcentaje de control en comparación con células que no reciben toxina. Las barras de error representan una DT de la media de pocillos por triplicado.

La Figura 4 ilustra la interacción de PE64pil y PE64\Delta553pil con asialo-GM1 inmovilizada. (A). Se añadieron diversas concentraciones de PE64pil o PE64 a placas recubiertas con asialo-GM1 y se determinó la unión por reactividad con anti-PE de conejo seguido de un anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra marcado con peroxidasa. Se usó la absorbancia a 450 nm para controlar la unión. (B) y (C). Para investigar especificidad de gangliósido se consideró un ensayo de competición por el que asialo-GM1 soluble o monosialo-GM1 a 2 \mug/ml se preincubó con PE64pil (B) o PE64A553pil (C) y el porcentaje de unión residual se determinó como se ha descrito en el panel (A). Para (B) y (C), los gráficos muestran la media de un experimento por triplicado representativo. Las barras de error representan una DT. N.A. = sin adición de competidor.

La Figura 5 ilustra la adhesión de Ps. aeruginosa (cepa PAK) a células A549. Se añadieron bacterias a células a una MOI de 100 en presencia o ausencia de potenciales inhibidores. Se añadieron péptidos hasta una concentración final de 40 \muM, mientras que se añadieron proteínas hasta una concentración de 2 \muM. El gráfico indica el porcentaje de bacterias unidas a células en comparación con muestras sin inhibidor. Las barras de error representan una desviación típica de la media de tres experimentos independientes.

La Figura 6 ilustra títulos de anticuerpos post-inmunización con PE64pil con y sin adyuvante. Se recogieron sueros de cada uno de cuatro conejos (numerados de 87-90) en diversos momentos, se diluyeron 1:100 y después se añadieron a placas recubiertas con estreptavidina que se habían cargado con péptidos de pilina biotinilados. Se detectó IgG de conejo mediante la adición de un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa. Los conejos 87 y 88 recibieron adyuvante, mientras que los conejos 89 y 90, no.

La Figura 7 ilustra interferencia mediada por anticuerpos con adhesión a células a A549. (A). La cepa PAK de Ps. aeruginosa se incubó con diluciones de 1:20 a 1:100 de sueros extraídos antes de la inmunización o inmunes (tomados después de la cuarta inyección de antígeno) del conejo #87. Después se añadieron bacterias a las células y se determinó el porcentaje de adhesión mediante comparación con bacterias que se habían incubado solamente en medio (B). Se ensayó una dilución 1:20 de sueros de cada conejo, extraídos antes de la inmunización e inmunes, para interferencia mediada por anticuerpos. (C). Se incubaron diversas cepas de Ps. aeruginosa con sueros inmunes (1:20) de uno de los conejos que recibió solamente antígeno (conejo #90) y uno que recibió antígeno más adyuvante (conejo #88). Para cada panel de la Figura 7, la barra representa el número de bacterias por célula determinado examinando cien células A549. Las barras de error representan una desviación típica de la media de tres experimentos independientes.

La Figura 8 ilustra neutralización mediada por anticuerpos de toxicidad de PE. Se diluyeron sueros inmunes (\ding{115}) o sueros extraídos antes de la inmunización (\blacksquare) y se mezclaron con PE64 a 1,0 \mug/ml. Después se diluyeron las muestras hasta la concentración indicada y se añadieron a células L929 para una incubación durante una noche. Los resultados se expresan como porcentaje de control de síntesis de proteína en comparación con células que no reciben toxina. Las barras de error representan una DT de la media de pocillos por triplicado.

Definiciones

La "exotoxina A de Pseudomonas" o "PE" se secreta por P. aeruginosa como una proteína de 67 kDa compuesta por tres dominios globulares prominentes (Ia, II y III) y un pequeño subdominio (Ib) que conecta los dominios II y III. (Allured et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1320-1324 (1986)). El dominio Ia de PE se localiza en el extremo N y media la unión celular. En la naturaleza, el dominio Ia se une a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad ("LRP"), también conocido como el receptor de \alpha2-macroglobulina ("\alpha2-MR"). (Kounnas et al., J. Biol. Chem. 267: 12420-23 (1992)). Incluye los aminoácidos 1-252. El dominio II media en el traslado al citosol. Abarca los aminoácidos 253-364. El dominio Ib no tiene función conocida. Incluye los aminoácidos 365-399. El dominio III es responsable de la citotoxicidad e incluye una secuencia de retención en retículo endoplásmico. Media en la ADP-ribosilación de factor de elongación 2 ("EF2"), que inactiva la síntesis de proteína. Incluye los aminoácidos 400-613. La secuencia de ácido nucleico de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa nativa y la secuencia de aminoácidos se muestran como la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, respectivamente. Las SEC ID Nº 1 y 2 son la forma madura de la exotoxina A, donde la secuencia señal se ha escindido. Como un factor de virulencia, PE puede inactivar PMN, macrófagos y otros elementos del sistema inmune (Pollack et al., Infect. Immuno. 19(3): 1092-6 (1978)).

Como se usa en este documento, "exotoxina A de Pseudomonas" o "PE" se refiere a las que tienen las funciones que se han descrito anteriormente e incluye la exotoxina A de Pseudomonas nativa que tiene las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos (como se muestran como la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2, respectivamente) y también variantes polimórficas, alelos, mutantes y homólogos interespecie que: (1) tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 80%, preferiblemente aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácidos del 85-90% con la SEC ID Nº 2 a lo largo de una ventana de aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente a lo largo de una ventana de aproximadamente 50-100 aminoácidos; (2) se unen a los anticuerpos generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y variantes modificadas de forma conservativa de la misma; o (3) hibridan específicamente (con un tamaño de al menos aproximadamente 500, preferiblemente de al menos aproximadamente 900 nucleótidos) en condiciones de hibridación rigurosas con una secuencia SEC ID Nº 1 y variantes modificadas de forma conservativa de la misma. Por ejemplo, se describen formas modificadas genéticamente de PE en, por ejemplo, Pastan et al., patente de Estados Unidos Nº 5.602.095; Pastan et al., patente de Estados Unidos Nº 5.512.658 y Pastan et al., patente de Estados Unidos Nº 5.458.878. Están incluidas formas alélicas de PE en esta definición. Véase, por ejemplo, Vasil et al. Infect. Immunol. 52: 538-48 (1986). "Exotoxina A de Pseudomonas no tóxica" o "PE no tóxica" se refiere a cualquier exotoxina A de Pseudomonas descrita en este documento (incluyendo variantes modificadas) que carece de actividad de ADP-ribosilación. La activación de ribosilación de PE se localiza entre aproximadamente los aminoácidos 400 y 600 de PE. Por ejemplo, la deleción del aminoácido E553 ("\DeltaE553") del dominio III destoxifica la molécula. Esta PE destoxificada se denomina "PE\DeltaE553". En otro ejemplo, la sustitución del resto de histidina de PE en 426 con un resto de tirosina también inactiva la ADP-ribosilación de PE (véase Kessler & Galloway, J. Biol. Chem. 267: 19107-11 (1992)). Otros aminoácidos dentro del dominio III se pueden modificar mediante, por ejemplo, deleción, sustitución o adición de restos aminoacídicos, para eliminar la actividad de ADP-ribosilación. El dominio III de PE no tóxica se denomina en ocasiones en este documento "dominio III destoxificado".

La expresión "una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica" se usa genéricamente para referirse a una secuencia de ácido nucleico o a una secuencia de aminoácidos de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. Como se usa en este documento, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede ser una secuencia de longitud completa o porciones de la secuencia de longitud completa. Generalmente, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica tiene uno o más dominios o porciones de dominios con determinadas actividades biológicas de una exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, tal como un dominio de reconocimiento celular, un dominio de traslado o un dominio de retención en retículo endoplásmico. Por ejemplo, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede incluir solamente el dominio II y el dominio III destoxificado. En otro ejemplo, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede incluir solamente el dominio I A, el dominio II y el dominio III destoxificado. En otro ejemplo, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede incluir todos los dominios Ia, Ib, II y III destoxificado. Por lo tanto, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede ser una secuencia contigua de la exotoxina A de Pseudomonas nativa o puede ser una secuencia que comprende subsecuencias no contiguas de la exotoxina A de Pseudomonas nativa que carece de actividad de ADP ribosilación. Aunque una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede ser porción o porciones contiguas o no contiguas menores de la PE nativa, las numeraciones de las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de PE nativa se usan para referirse a determinadas posiciones dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica (por ejemplo, deleción de Glu en la posición 553).

Una "proteína quimérica" o un "polinucleótido quimérico" es una proteína o un polinucleótido construido de forma artificial que comprende secuencias de aminoácidos heterólogas o secuencias de ácido nucleico heterólogas, respectivamente.

El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a una proteína o a un ácido nucleico indica que la proteína o el ácido nucleico comprende dos o más secuencias o subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional. Por ejemplo, en una realización, el ácido nucleico tiene un promotor de un gen dispuesto para dirigir la expresión de una secuencia codificante de un gen diferente. Por tanto, con referencia a la secuencia codificante, el promotor es heterólogo. De forma similar, una secuencia de una exotoxina A de Pseudomonas es heteróloga con referencia a una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV cuando las dos secuencias se ponen en una relación entre sí diferente de la relación de origen natural de los ácidos nucleicos en el genoma.

"Pili de Tipo IV" se refiere a estructuras filamentosas que cubren muchas bacterias gram-negativas, levaduras y otros microorganismos. Los pili en la superficie de un microorganismo se adhieren a células epiteliales. En particular, los pili de Pseudomonas o Candida se unen a células epiteliales mediante interacción específica con receptores de asialoGM1. Los pili de Tipo IV están compuestos principalmente por pilinas proteicas, que son polímeros dispuestos en un haz helicoidal. Por ejemplo, los pili de Pseudomonas aeruginosa tienen una longitud promedio de 2,5 \mum y consisten en una única proteína con una masa molecular de aproximadamente 15.000 (Paranchych et al., Am. Soc. Microbio. 343-351 (1990)).

La expresión "pilina de Tipo IV" como se usa en este documento se refiere a pilinas que contienen un dominio hidrófobo amino terminal conservado que comienza con una fenilalanina amino-terminal que está metilada después de procesamiento y la secreción de la pilina. Otro elemento característico de las pilinas de Tipo IV es que en la forma de propilina contienen péptidos líder similares de seis o siete aminoácidos de longitud, que son mucho más cortos que las secuencias señal típicas. Las pilinas de Tipo IV se expresan por varios géneros bacterianos, que incluyen Neisseria, Moraxella, Bacteroides, Pasteurella y Pseudomonas, E. coli y levaduras, tales como Candida. Las especies dentro de estos géneros que expresan pilinas de Tipo IV son, por ejemplo, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, Pasteurella multocida, M. bovis, B. nodosus. Como se usa en este documento, la expresión "pilina de Tipo IV" también incluye la pilina Tcp de Vibrio, (por ejemplo, V. cholerae), que es altamente homóloga con las pilinas de Tipo IV de otros géneros. La pilina Tcp contiene el dominio hidrofóbo amino-terminal característico y tiene un aminoácido N-terminal modificado que en este caso puede ser una metionina modificada debido a que el gen de pilina Tcp codifica un resto de metionina en la posición en la que todos los demás codifican una fenilalanina. El TcpA precursor contiene una secuencia líder mucho más larga que las propilinas de Tipo IV típicas, pero conserva homología en la región que rodea el sitio de procesamiento. Generalmente, una proteína de pilina comprende una región en el extremo N que está altamente conservada, conteniendo el resto de la proteína regiones moderadamente conservadas e hipervariables (Paranachych et al., anteriormente). Un elemento característico de todas las pilinas es un bucle disulfuro intracadena en el extremo C de la pilina.

Las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico de pilinas de Tipo IV de diversos microorganismos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, la Base de Datos de NCBI Nº de Acceso M14849, J02609 para la cepa PAK de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso AAC60462 para cepa T2A de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso M11323 para cepa PAO de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso P17837 para cepa CD de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso B31105 para cepa P1 de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso Q53391 para cepa KB7 Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso AAC60461 para cepa 577B de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso A33105 para cepa K122-4 de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso Z49820, Z69262 y Z69261 para N. meningitidis; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso X66144 y AF043648 para N. gonorrhoeae; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso U09807 y X64098 para V. cholerae; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso AF154834 para Pasteurella multocida.

Una "secuencia de bucle de pilina de Tipo IV" se refiere a la secuencia que forma un bucle disulfuro intracadena en el extremo C de la pilina. Esta región está físicamente expuesta en la punta del pilus e interacciona con receptores de células epiteliales. Una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV como se usa en este documento se puede referir a una secuencia entre los dos restos de cisteína que forman un bucle disulfuro intracadena en el extremo C de la pilina (es decir, excluyendo los restos de cisteína), o una secuencia que incluye tanto los restos de cisteína como los aminoácidos entre los dos restos de cisteína. Dependiendo de si el sitio de inserción dentro de secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica tienen restos de cisteína, la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV con o sin los restos de cisteína flanqueantes se puede usar para preparar proteínas quiméricas de la invención. Los ejemplos de la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se muestran como las SEC ID Nº: 3 a 20.

La expresión "fragmento con capacidad inmunógena del mismo" o "porción con capacidad inmunógena del mismo" se refiere a un polipéptido que comprende un epítopo que se reconoce por linfocitos T citotóxicos, linfocitos T auxiliares o células B.

"Antisueros policlonales" se refiere a sueros que comprenden anticuerpos policlonales contra un inmunógeno, sueros que se obtienen de un hospedador inmunizado con el inmunógeno (por ejemplo, una proteína quimérica de la presente invención).

Los antisueros policlonales que "reducen adherencia" de un microorganismo que expresa una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se refieren a antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 100% en comparación con un control. Un control puede ser sangre extraída antes de la inmunización o sueros que no estén expuestos a las proteínas quiméricas de la presente invención.

La expresión antisueros policlonales que "neutralizan citotoxicidad" de exotoxina A de Pseudomonas en el contexto de la presente invención se refiere a la capacidad de los antisueros de reducir la inhibición de síntesis de proteína por exotoxina A Pseudomonas. Típicamente, los antisueros policlonales pueden reducir la inhibición de síntesis de proteína por exotoxina A de Pseudomonas en al menos aproximadamente el 30%, más típicamente al menos aproximadamente el 50%, más típicamente al menos aproximadamente el 80%, incluso más típicamente al menos aproximadamente el 90%, el 95% o el 99% en comparación con un control. Un control puede ser sangre extraída antes de la inmunización o sueros que no estén expuestos a las proteínas quiméricas de la presente invención.

"Ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión incluye ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos de cadena principal o enlaces modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de un modo similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, péptido-ácido nucleico (PNA).

A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado se pueden conseguir generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados se sustituye con restos de base mixta y/o desoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). La expresión ácido nucleico se usa de forma intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos aminoacídicos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como con polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de un modo similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono \alpha que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales de péptido modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de un modo similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos se pueden denominar en este documento mediante sus símbolos de tres de letras conocidos comúnmente o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Así mismo, los nucleótidos se pueden denominar por sus códigos de letra única aceptados comúnmente.

"Variantes modificadas de forma conservativa" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes modificadas conservativamente de las mismas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, para secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cualquier posición en la que una alanina se especifique por un codón, el codón puede estar alterado hasta cualquiera de los codones correspondientes que se han descrito sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en este documento que codifica un polipéptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. El especialista reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina y TGG, que es normalmente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como para secuencias de aminoácidos, el especialista reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales en un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altere, añada o delecione un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

En la técnica se conocen bien tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Tales variantes modificadas conservativamente son adicionales a y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecie y alelos de la invención.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina, (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

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La frase "híbrida selectivamente (o específicamente)" se refiere a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula solamente con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de genoteca).

La frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Secuencias de mayor longitud hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Se encuentra una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas para ser aproximadamente 5-10ºC inferiores que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La T_{m} es la temperatura (en fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a T_{m}, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigorosas son aquellas en las que la concentración salina es inferior a ión sodio aproximadamente 1,0 M, típicamente concentración de ión sodio aproximadamente de 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden conseguir condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, opcionalmente 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden ser las siguientes: formamida al 50%, SSC 5x y SDS al 1%, incubando a 42ºC o SSC 5x, SDS al 1%, incubando al 65ºC, con lavado en SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 65ºC.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto tiene lugar, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos hibridan típicamente en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. Las "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" ejemplares incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC y un lavado en SSC 1X a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces el fondo. Los especialistas en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden utilizar condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.

Un "casete de expresión" se refiere a una molécula polinucleotídica que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a secuencia o secuencias codificantes.

Un "vector" es un replicón en el que está unido otro segmento polinucleotídico, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.

Una "secuencia de control" se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión a ribosoma y terminadores; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. La expresión "secuencias de control" tiene por objeto incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder. "Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos de este modo están en una relación que permite que funcionen de su modo pretendido. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de un modo tal que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un "ligando" es un compuesto que se une específicamente a una molécula diana.

Un "receptor" es un compuesto que se une específicamente a un ligando.

Un "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región flanqueante de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une específicamente y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon que, a su vez, definen las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígeno. Las expresiones cadena ligera variable (V_{L}) y cadena pesada variable (V_{H}) se refieren respectivamente a estas cadenas ligera y pesada.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H} 1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'_{2} se puede reducir en condiciones débiles para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de este modo el dímero de F(ab)'_{2} en un monómero de Fab'. El monómero de Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra (véase Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, el especialista entenderá que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, como se usa en este documento, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena única) o los identificados usando bibliotecas de presentación en fago (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., págs. 77-96 in Monoclonal Antobodies and Cancer Therapy (1985). Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos para polipéptidos de esta invención. Además se pueden usar ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente se puede usar la tecnología de presentación en fagos para identificar anticuerpos y fragmentos de Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados (véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779 -783 (1992)).

La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "es específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con" cuando se refiere a una proteína o un péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante para la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular al menos dos veces el fondo y no se unen sustancialmente en ninguna cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, anticuerpos policlonales generados para proteínas de fusión se pueden seleccionar para obtener solamente aquellos anticuerpos policlonales que sean específicamente inmunorreactivos con la proteína de fusión y no con componentes individuales de las proteínas de fusión. Esta selección se puede conseguir sustrayendo anticuerpos que tengan reacción cruzada con los antígenos individuales. Se puede usar una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden usar para determinar inmunorreactividad específica). Típicamente una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de fondo o interferencia y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifique un antígeno individual o una porción del mismo) o pueden comprender una variante de una secuencia de este tipo. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de tal forma que la actividad biológica de la proteína quimérica codificada no disminuya con respecto a una proteína quimérica que comprenda antígenos nativos. Las variantes muestran preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 80% y mucho más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 90% con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido nativo o una porción del mismo.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de restos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (es decir, una identidad del 70%, opcionalmente una identidad del 75%, del 80%, del 85%, del 90% o del 95% con respecto a una región especificada), cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región indicada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante alineamiento manual e inspección visual. Se dice entonces que tales secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere al cumplimiento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene al menos de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud o, de forma opcional, a lo largo de una región que tiene 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se compraran secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se indican las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se indican los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Se pueden usar parámetros por defecto del programa o se pueden indicar parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de las varias posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 25 a 500, habitualmente aproximadamente de 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en las que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de que se hayan alineado óptimamente las dos secuencias. En la técnica se conocen bien los métodos de alineamiento de secuencias para la comparación. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Programa de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos, por pares para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupación usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una con una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple comienza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación se alinea después con la siguiente secuencia más relacionada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean mediante una extensión simple del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se consigue mediante una serie de alineamientos progresivos, por pares. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia e indicando los parámetros de programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otras secuencias de ensayo para determinar la relación de porcentaje de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: ponderación de hueco por defecto (3,00), ponderación por longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales ponderados. PILEUP se puede obtener en el programa de software de análisis de secuencia de GCG, por ejemplo, versión 7.0 (Devereaux et al. Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984)).

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para realizar los análisis BLAST está disponible públicamente en el Centro Nacional para Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que coinciden o satisfacen alguna puntuación T umbral valorada positivamente cuando se alinea con una palabra con la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., anteriormente). Estas coincidencias de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP de mayor longitud que contengan las mismas. Estas coincidencias de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta el punto hasta el que se puede aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos desapareados; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa tiende a cero o cae por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de resto de puntuación negativa; o se alcanza el final de cada secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación para ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3 y una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad sumada (P (N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que ocurriría al azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad sumada en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01 y mucho más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

"Inmunógeno" se refiere a una entidad que induce producción de anticuerpos en el animal hospedador.

"Vacuna" se refiere a un agente o una composición que contiene un agente eficaz para conferir un grado terapéutico de inmunidad a un organismo mientras que provoca solamente niveles muy bajos de morbilidad o mortalidad. Las vacunas y los métodos para preparar vacunas son útiles en el estudio del sistema inmune y para prevenir y tratar enfermedad en animales o seres humanos.

Una "cantidad con capacidad inmunógena" o "cantidad inmunológicamente eficaz" es una cantidad eficaz para suscitar una respuesta inmune en un sujeto.

"Substancialmente puro" o "aislado" se refiere una especie objeto que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición) y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura se refiere a que aproximadamente del 80% al 90% o más de las especies macromoleculares presentes en la composición son la especie purificada de interés. La especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) si la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. Las especies de disolvente, moléculas pequeñas (<500 dalton), estabilizantes (por ejemplo, BSA) y especies de iones elementales no se consideran especies macromoleculares para los propósitos de esta definición.

"De origen natural" como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que el objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente la naturaleza y que no se ha modificado de forma intencionada por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Un "hospedador" se refiere a cualquier animal incluyendo animales humanos o no humanos, tales como roedores (por ejemplo, ratones o ratas), primates, ovejas, cerdos, cobayas, etc.

"Tratamiento" se refiere a tratamiento profiláctico o tratamiento terapéutico.

Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un hospedador que no muestra signos de una enfermedad o que muestra solamente signos tempranos con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patología.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un hospedador que muestra signos de patología con el propósito de disminuir o eliminar esos signos.

Descripción de las realizaciones específicas I. Proteínas quiméricas que comprenden una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV

En un aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica que comprende: una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, localizándose la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, donde la proteína quimérica es capaz de reducir la adhesión o la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y donde además, la proteína quimérica, cuando se introduce en un hospedador, es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas de la invención, cuando se introducen en un hospedador, también son capaces de generar antisueros policlonales que neutralizan la citotoxicidad de exotoxina A de Pseudomonas. En otro aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica que comprende: (a) una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que comprende dominio Ia, dominio II y dominio III; y (b) una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se localiza entre el dominio II y dominio III de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. En algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que incluye los dominios Ia, II y III en la estructura de organización nativa, excepto porque una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, parcialmente o completamente, sustituye el dominio Ib y se localiza entre el dominio II y el dominio III. Alternativamente o adicionalmente, en algunas realizaciones, la proteína quimérica comprende una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV en el dominio II, sustituyendo los aminoácidos 265 a 287. La naturaleza de secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, diversos dominios de secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, secuencias de bucle de pilina de Tipo IV y su relación física dentro de las proteínas quiméricas de la invención se describen con detalle más adelante.

A. Secuencias de Exotoxina A de Pseudomonas No Tóxica

Como se describe en la anterior sección de Definición, la exotoxina A de Pseudomonas o PE se secreta por Pseudomonas aeruginosa y comprende tres dominios prominentes (Ia, II y III) y un pequeño subdominio (Ib) que conecta los dominios II y III. En la naturaleza, el dominio Ia de PE, que incluye los aminoácidos 1-252, media la unión celular. El dominio II, que incluye los aminoácidos 253-364 media el traslado de la proteína a citosol. El dominio Ib, que incluye los aminoácidos 365-399, no tiene función conocida. El dominio III, que incluye los aminoácidos 400-613, es responsable de la citotoxicidad e incluye una secuencia de retención en retículo endoplásmico. También contiene secuencias que median en la ADP-ribosilación del factor de elongación 2 ("EF2"), que inactiva la síntesis de proteína y, por tanto, convierte la PE en tóxica para células. Por tanto, el dominio Ia o su variante que media en la unión celular se denomina un "dominio de reconocimiento de células". El dominio II o su variante que media el traslado de las proteínas al citosol se denomina un "dominio de traslado". El dominio III o su variante que funciona trasladando la proteína desde el endosoma al retículo endoplásmico se denomina "un dominio de retención en retículo endoplásmico".

Una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica se refiere a cualquier secuencia de exotoxina A de Pseudomonas que carezca de actividad de ADP-ribosilación. Generalmente, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica tiene uno o más dominios o porciones de dominios con determinadas actividades biológicas. Por ejemplo, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica puede comprender un dominio de traslado (por ejemplo, dominio II de exotoxina A de Pseudomonas) y un dominio de retículo endoplásmico (por ejemplo, dominio III destoxificado de exotoxina A de Pseudomonas sin actividad de ADP-ribosilación). En otro ejemplo, una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica se puede construir eliminando los aminoácidos 1-252 proporcionando una construcción denominada "PE40". En otro ejemplo, se puede construir una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica eliminando los aminoácidos 1-279 proporcionando una construcción denominada "PE37". (Véase Pastan et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.602.095.).

Opcionalmente, un dominio de reconocimiento de células de exotoxina A de Pseudomonas (por ejemplo, el dominio I) u otros dominios de reconocimiento de células no relacionados con exotoxina A de Pseudomonas se pueden incluir en las presentes proteínas quiméricas. Un dominio de reconocimiento de células se puede unir, directamente o indirectamente, al resto de la proteína quimérica. Por ejemplo, se pueden ligar secuencias que codifican un dominio de reconocimiento de células al extremo 5' de versiones no tóxicas de construcciones PE40 o PE37 que comprenden además una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV.

1. Dominio de Traslado

Las proteínas quiméricas de la invención comprenden una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que comprende "dominio de traslado de PE". El dominio de traslado de PE comprende una secuencia de aminoácidos suficiente para efectuar el traslado de proteínas quiméricas que se han introducido por endocitosis por la célula al citosol. La secuencia de aminoácidos es idéntica, o sustancialmente idéntica, a una secuencia seleccionada del dominio II de PE.

La secuencia de aminoácidos suficiente para efectuar el traslado se puede obtener del dominio de traslado de PE nativa. Este dominio incluye los aminoácidos 253-364. El dominio de traslado puede incluir toda la secuencia del dominio II. Sin embargo, toda la secuencia no es necesaria para el traslado. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede contener mínimamente, por ejemplo, los aminoácidos 280-344 del dominio II de PE. Las secuencias fuera de esta región, es decir, los aminoácidos 253-279 y/o 345-364, se pueden eliminar del dominio. Este dominio también se puede modificar por ingeniería genética con sustituciones siempre que se conserve la actividad de traslado.

El dominio de traslado funciona del siguiente modo. Después de unirse a un receptor sobre la superficie celular, las proteínas quiméricas entran en la célula mediante endocitosis por vesículas recubiertas con clatrina. Los restos 265 y 287 son cisteínas que forman un bucle disulfuro. Una vez internalizado en endosomas que tiene un entorno ácido, el péptido se escinde por la proteasa furina entre Arg279 y Gly280. Después se reduce el enlace disulfuro. Una mutación en Arg279 inhibe la escisión proteolítica y el traslado posterior al citosol. Ogata et al., J. Biol. Chem. 265: 20678-85 (1990). Sin embargo, un fragmento de PE que contiene la secuencia cadena debajo de Arg279 (denominada "PE37") conserva la capacidad sustancial de trasladarse al citosol. Siegall et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-61 (1989). Las secuencias en el dominio II más allá del aminoácido 345 también se pueden delecionar sin inhibir el traslado. Además, los aminoácidos en las posiciones 339 y 343 parecen ser necesarios para el traslado. Siegall et al., Biochemistry 30: 7154-59 (1991).

Los métodos para determinar la funcionalidad de un dominio de traslado se describen más adelante en la sección de ensayo.

2. Dominio de retención en RE

La proteína quimérica de la invención también puede comprender una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de retención en retículo endoplásmico" como parte de una secuencia de exotoxina A no tóxica. El dominio de retención en retículo endoplásmico ("RE") funciona trasladando la proteína quimérica desde el endosoma al retículo endoplásmico, desde donde se transporta hacia el citosol. El dominio de retención en RE se localiza en la posición del dominio III en PE. El dominio de retención en RE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, en su extremo carboxi, una secuencia de retención en RE. La secuencia de retención en RE en PE nativa es REDLK (SEC ID Nº: 21). Se puede eliminar la lisina (es decir, REDL (SEC ID Nº: 22)) sin ninguna disminución en la actividad. REDLK (de la SEC ID Nº: 21) se puede sustituir con otras secuencias de retención en RE, tales como KDEL (SEC ID Nº: 23) o polímeros de estas secuencias. Véase Ogata et al., J. Biol. Chem. 265: 20678-85 (1990); Pastan et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.458.878; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 331-54 (1992).

Las secuencias cadena arriba de la secuencia de retención en RE pueden ser el dominio III de PE nativo (preferiblemente destoxificado), se pueden eliminar completamente o se pueden sustituir por otra secuencia de aminoácidos. Si se sustituye por otra secuencia de aminoácidos, la propia secuencia puede tener alta capacidad inmunógena o puede tener ligera capacidad inmunógena. La actividad de este dominio se puede evaluar mediante el ensayo para traslado de la proteína al citosol de la célula diana usando los ensayos que se describen más adelante.

En la PE nativa, la señal de retención en RE se localiza en el extremo carboxilo dominio III. El dominio III tiene dos funciones en PE. Muestra actividad de ADP-ribosilación y dirige la toxina introducida por endocitosis al retículo endoplásmico. La eliminación de la secuencia de retención en RE de la proteína quimérica no altera la actividad de exotoxina de Pseudomonas como un superantígeno, pero inhibe su utilidad para suscitar una respuesta inmune mediada por células dependiente de MHC de clase I.

La actividad de ribosilación de PE se localiza entre aproximadamente los aminoácidos de 400 y 600 de PE. En métodos para vacunar un hospedador usando las proteínas quiméricas de esta invención, es preferible que la proteína sea no tóxica. Un método para realizar esto es eliminando la actividad de ADP-ribosilación. De este modo, la proteína quimérica puede funcionar como un vector para secuencias de bucle de pilina de Tipo IV a procesar por la célula y presentarse sobre la superficie celular con moléculas MHC de clase I, en vez de como una toxina. La actividad de ADP-ribosilación se puede eliminar, por ejemplo, delecionando el aminoácido E553 ("\DeltaE553") de la PE nativa. Véase, por ejemplo, Lukac et al. Infect. and Immun. 56: 3095-3098 (1988). En otro ejemplo, la sustitución del resto de histidina de PE en 426 con un resto de tirosina también inactiva la ADP-ribosilación de PE (véase Kessler & Galloway anteriormente). Otros aminoácidos en el dominio III se pueden modificar en la proteína para eliminar la actividad de ADP-ribosilación. Generalmente se incluye una secuencia de retención en RE en el extremo carboxi de la proteína quimérica.

En una realización, la secuencia del dominio de retención en ER es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos nativas del dominio III, o un fragmento de las mismas. En algunas realizaciones, el dominio de retención en RE es el dominio III de PE.

En otra realización se inserta un dominio de reconocimiento de células en la secuencia de aminoácidos del dominio de retención en RE (por ejemplo, en el dominio III). Por ejemplo, el dominio de reconocimiento de células se puede insertar justo cadena arriba de la secuencia de retención en RE, de tal forma que la secuencia de retención en RE se conecta directamente o dentro de diez aminoácidos del extremo carboxi del dominio de reconocimiento de células.

B. Dominio de Reconocimiento de Células

Opcionalmente, la proteína quimérica de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de reconocimiento de células". El dominio de reconocimiento de células funciona como un ligando para un receptor de superficie celular. Media en la unión de la proteína a una célula. Se puede usar para dirigir la proteína quimérica a una célula que la transportará al citosol para el procesamiento. Un dominio de reconocimiento de células puede no incluirse necesariamente en la proteína quimérica, ya que una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica se dirige a los receptores sobre células epiteliales.

El dominio de reconocimiento de células funciona uniendo la proteína quimérica a una célula diana y puede ser cualquier material adecuado, por ejemplo, un polipéptido conocido para un receptor particular en la célula diana. Por ejemplo, el dominio de reconocimiento de células tiene generalmente el tamaño de ligandos de polipéptidos conocidos, por ejemplo, entre aproximadamente 10 aminoácidos y aproximadamente 1500 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos y aproximadamente 300 aminoácidos. Varios métodos son útiles para identificar dominios de reconocimiento de células funcionales para el uso en proteínas quiméricas. Un método implica la detección de la unión entre una proteína quimérica que comprende el dominio de reconocimiento de células con el receptor o con una célula que lleva el receptor. Otros métodos incluyen detectar la entrada de la proteína quimérica al citosol, indicando que la primera etapa, la unión celular, fue exitosa. Estos métodos se describen más adelante con detalle en la sección de ensayo.

En una realización, el dominio de reconocimiento de células es el dominio Ia de PE, dirigiendo de este modo la proteína quimérica al dominio \alpha2-MR. En otras realizaciones, el dominio Ia se puede sustituir con ligandos que se unen a receptores de superficie celular o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos a receptores de superficie celular. Por ejemplo, para dirigirse a células epiteliales, un dominio de unión celular puede ser un ligando para o anticuerpos contra el receptor de EGF, receptores de transferrina, receptores de interleuquina-2, receptores de interleuquina-6, receptores de interleucina-8, o receptores de Fc o receptores de poli-IgG. Para dirigirse a células hepáticas diana, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, un ligando para o anticuerpos contra receptores de asialoglucoproteína. Para dirigirse a células T, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, un ligando para o anticuerpos contra receptores de CD3, CD4, CD8 o quimiocina. Para dirigirse a células T y células B activadas, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, un ligando para o anticuerpos contra CD25. Para dirigirse a células dendríticas, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, ligandos para o anticuerpos contra CD11B, CD11C, CD80 y CD86 de MHC de clase I y II. Para dirigirse a macrófagos, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, ligandos para o anticuerpos contra receptores de TNF alfa, receptores de quimiocina, receptores TOLL, receptores de M-CSF, receptores de GM-CSF, receptores limpiadores y receptores Fc. Para dirigirse a células endoteliales, un dominio de unión celular puede ser, por ejemplo, un ligando para o anticuerpos contra receptores de VEGF. Además, los receptores de citoquinas que se encuentran en muchos tipos celulares se pueden dirigir. Pastan et al. Ann. Rev. Biochem. 61: 331-54 (1992).

El dominio de reconocimiento celular se puede localizar en cualquier posición adecuada dentro de las presentes proteínas quiméricas. Por ejemplo, el dominio de reconocimiento de células se puede localizar en el extremo N de la proteína quimérica (por ejemplo, posición equivalente al dominio la de PE no tóxica). Sin embargo, este dominio se puede eliminar de la secuencia de organización normal de exotoxina A. Más particularmente, el dominio de reconocimiento celular se puede insertar cadena arriba del dominio de retención en RE. Alternativamente, el dominio de reconocimiento de células se puede acoplar químicamente al resto de la proteína quimérica. Además, la proteína quimérica puede incluir un primer dominio de reconocimiento de células en la localización del dominio Ia y un segundo dominio de reconocimiento de células cadena arriba del dominio de retención en RE. Tales construcciones pueden unirse a más de un tipo celular. Véase, por ejemplo, Kreitman et al. Bioconjugate Chem. 3: 63-68 (1992). Por ejemplo, se ha insertado TGFa en el dominio III justo antes del aminoácido 604, es decir, aproximadamente a diez aminoácidos del extremo carboxi. Esta proteína quimérica se une a células que llevan el receptor de EGEP. Pastan et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.602.095.

El dominio de reconocimiento de células se puede insertar o unir al resto de las proteínas quiméricas usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el dominio se puede unir al resto de la proteína quimérica directamente o indirectamente usando un enlazador. El enlazador puede formar enlaces covalentes o enlaces no covalentes de alta afinidad. Se conocen bien enlazadores adecuados por los especialistas en la técnica. En otro ejemplo, el dominio de reconocimiento celular se expresa como un único polipéptido quimérico a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína quimérica contigua única.

C. Secuencias de Bucle de Pilina de Tipo IV

La proteína quimérica también comprende una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV con una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. La secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se obtiene generalmente a partir de una secuencia que forma un bucle disulfuro intracadena en el extremo C de la proteína de pilina. La secuencia de bucle de pilina de Tipo IV permite que la proteína quimérica reaccione con receptores de asialoGMl en células epiteliales. Este bucle está dominado por restos de cadena principal. Por lo tanto, las pilinas de varias cepas se unen al mismo receptor a pesar de la variación de secuencia y la diferencia de longitud (por ejemplo, para determinadas cepas de Pseudomonas, bucles de 12 y 17 aminoácidos (o de 14 a 19 aminoácidos incluyendo restos de cisteína flanqueantes)). Una secuencia de pilina de bucle de Tipo IV comprende al menos aproximadamente 5 restos aminoacídicos, típicamente entre aproximadamente 10 y 100 aminoácidos, más típicamente aproximadamente de 12 a 70 aminoácidos, incluso más típicamente aproximadamente de 12 a 20 aminoácidos. Las realizaciones de la invención pueden tener una unidad de la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV o múltiples unidades de repetición (por ejemplo, 2, 3, 4, etc.) de las misma o diferentes secuencias de bucle de pilina de Tipo IV. En algunas realizaciones, las proteínas quiméricas comprenden más de una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV en localizaciones diferentes.

Una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede obtener a partir de cualquier microorganismo que se adhiera a células epiteliales. Por ejemplo, una secuencia de pilina de Tipo IV se puede obtener de bacterias o levaduras, tales como Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, Pasteurella multocida o Candida. Los ejemplos de una secuencia de pilina de Tipo IV se muestran como las SEC ID Nº: 3 a 20.

Las secuencias de pilina de Tipo IV de diferentes cepas de Pseudomonas aeruginosa varían en términos de su secuencia así como de su longitud. Varias cepas de Pseudomonas aeruginosa tienen un corto bucle de pilina que consiste en 14 aminoácidos (de la cisteína 129 a la cisteína 142) como se muestra en la siguiente Tabla 1. Otras cepas de Pseudomonas aeruginosa tienen un largo bucle de pilina que consiste en 19 aminoácidos (de la cisteína 133 a la 151) como se muestra en la siguiente Tabla 2.

TABLA 1

1

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TABLA 2

2

Las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV de microorganismos diferentes de P. aeruginosa también se pueden incluir en las proteínas quiméricas de la invención. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV de otros microorganismos se muestran en la siguiente Tabla 3.

TABLA 3

3

El especialista en la técnica reconocerá que las secuencias de pilina de Tipo IV que se han descrito anteriormente son meramente ilustrativas y que se pueden insertar de forma sencilla otras secuencias de pilina de Tipo IV en las proteínas quiméricas de la presente invención. Por ejemplo, las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV descritas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.612.036 (Hodges et al.) también se pueden incorporar en las proteínas quiméricas proteínas de la presente invención.

La secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede localizar en cualquier posición adecuada dentro de la proteína quimérica de la invención. En una realización, la secuencia de pilina de Tipo IV se inserta entre el dominio de traslado (por ejemplo, dominio II de exotoxina A no tóxica) y el dominio de retención en RE (por ejemplo, el dominio III de exotoxina A no tóxica). En otra realización, la proteína quimérica tiene la estructura de organización básica de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que incluye dominio Ia, dominio II, dominio Ib y dominio III, excepto porque el dominio Ib se sustituye, parcialmente o completamente, por la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV. En exotoxina A de Pseudomonas nativa, el dominio Ib incluye los aminoácidos 365 a 399. El dominio Ib nativo se caracteriza estructuralmente por un enlace disulfuro entre dos cisteínas en las posiciones 372 y 379. El dominio Ib no es esencial para la unión celular, el traslado, la retención en RE o la actividad de ADP-ribosilación. Por lo tanto, se puede sustituir parcialmente o completamente por una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV. Por ejemplo, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede insertar entre las dos cisteínas en las posiciones 372 y 379, sustituyendo los 6 restos aminoacídicos entre las dos cisteínas. En otra realización, la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede insertar en el dominio Ib sin retirar ninguna de las secuencias de dominio Ib. En otra realización, la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede colocar en otra localización que forma un bucle enlazado por disulfuro cisteína-cisteína, tal como los aminoácidos 265-287 del dominio II de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. En algunas realizaciones se puede insertar más de un tipo de secuencias de bucle de pilina de Tipo IV en diferentes localizaciones dentro de la proteína quimérica.

Dependiendo de si el sitio de inserción dentro de una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica tiene restos de cisteína, se puede usar una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV con o sin restos de cisteína en los extremos N y C. Por ejemplo, si el sitio de inserción en la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica no tiene restos de cisteína, entonces se puede insertar una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV con restos de cisteína en sus extremos (por ejemplo, 14 aminoácidos mostrados en la SEC ID Nº: 3). En otro ejemplo, si se inserta una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV en el bucle cisteína-cisteína del dominio Ib nativo, sustituyendo los seis aminoácidos entre los restos de cisteína, entonces una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV puede ser una secuencia sin cisteínas terminales (por ejemplo, 12 aminoácidos entre las dos cisteínas mostrados en la SEC ID Nº: 3). Por lo tanto, un bucle de cisteína-cisteína se puede formar preferiblemente dentro de la proteína quimérica de la invención. Cuando se presenta la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica como un bucle enlazado con disulfuro cisteína-cisteína, la estructura de bucle de pilina de Tipo IV puede sobresalir del resto de la proteína quimérica, donde está disponible para interaccionar con, por ejemplo, receptores de asialoGM1 o con componentes del sistema inmune.

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II. Polinucleótidos quiméricos y expresión de polinucleótidos A. Polinucleótidos que Codifican las Proteínas Quiméricas

En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas de la invención. Se han descrito detalladamente anteriormente secuencias de aminoácidos adecuadas de secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica (por ejemplo, que comprenden un dominio de traslado y un dominio de retención en RE), dominios de reconocimiento de células y secuencias de bucle de pilina de Tipo IV y sus localizaciones físicas dentro de las presentes proteínas quiméricas. Cualquier polinucleótido que codifique estas secuencias de aminoácidos está dentro del alcance de la presente invención.

1. Identificación de Secuencias de Exotoxina A de Pseudomonas No Tóxica

Los polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica se pueden identificar, preparar y manipular usando cualquiera de una diversidad de técnicas bien establecidas. Un nucleótido que codifica exotoxina A de Pseudomonas nativa se muestra como la SEC ID Nº: 1. El facultativo puede usar esta secuencia para preparar secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica usando diversas metodologías de clonación y amplificación in vitro conocidas en la técnica. Se describen métodos de PCR, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195; Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 (1987); y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989); Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995). Estos cebadores se pueden usar, por ejemplo, para amplificar la secuencia de longitud completa, secuencias parciales o una sonda de uno a varios cientos de nucleótidos, que se usa después para explorar genotecas de ADNc o genómicas para homólogos de secuencia de ácido nucleico relacionados. Los polinucleótidos también se pueden aislar explorando genotecas genómicas o de ADNc (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa) con sondas seleccionadas a partir de las secuencias del polinucleótido deseado en condiciones de hibridación rigurosas.

Como una ilustración, para clonar una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas que comprende todos los dominios (dominio Ia, dominio II, dominio Ib y dominio III), se pueden usar los siguientes cebadores: Directo- GGCCCA
TATGCACCTGATACCCCAT (SEC ID Nº: 24); e Inverso- GAATTCAGTTACTTCAGGTCCTCG (SEC ID Nº: 25). Para clonar una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas que comprende el dominio II, dominio Ib y dominio III se pueden usar los siguientes cebadores: Directo- GGCCCATATGGAGGGCGGCAGCCTGGCC (SEC ID Nº: 26), e Inverso-GAATTCAGTTACTTCAGGTCCTCG (SEC ID Nº: 27).

Otras construcciones de exotoxina A de Pseudomonas que se pueden usar en las realizaciones de la invención también se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.602.095 (Pastan et al.). Como se describe en la patente '095, la eliminación de nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-252 proporciona una construcción denominada "PE40". La eliminación de nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-279 proporciona una construcción denominada "PE37". Las versiones no tóxicas de estas construcciones (que carecen del dominio Ia de la exotoxina A nativa) son particularmente útiles para ligar las mismas a secuencias que codifican dominios de reconocimiento de células heterólogos al extremo 5' de estas construcciones. Estas construcciones pueden codificar opcionalmente una metionina amino-terminal.

Además, la exotoxina A de Pseudomonas se puede modificar adicionalmente usando mutaciones dirigida u otras técnicas conocidas en la técnica, para alterar la molécula para una aplicación deseada particular. Los medios para alterar exotoxina A de Pseudomonas de un modo que no afecte sustancialmente a las ventajas funcionales proporcionadas por las moléculas de PE que se describen en este documento también se pueden usar y se pretende que tales moléculas resultantes estén incluidas en este documento.

Las secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica se pueden generar a partir de estas secuencias de exotoxina A de Pseudomonas modificando porciones del dominio III de tal forma que carezcan de actividad de ADP-ribosilación. La actividad de ribosilación de PE se localiza entre aproximadamente los aminoácidos 400 y 600 de exotoxina A de Pseudomonas nativa. Por ejemplo, la deleción del aminoácido E553 ("\DeltaE553") del dominio III destoxifica la molécula. Esta PE destoxificada se denomina "PE Dye553". Otros aminoácidos dentro del dominio III se pueden modificar, por ejemplo, mediante deleción, sustitución o adición de restos aminoacídicos, para eliminar actividad de ADP-ribosilación. Por ejemplo, la sustitución de resto de histidina de PE en 426 con un resto de tirosina también inactiva la ADP-ribosilación de PE (véase, Kessler & Galloway anteriormente).

En algunas realizaciones, las secuencias de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica se pueden modificar adicionalmente para alojar sitios de clonación para la inserción de una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV. Por ejemplo, un sitio de clonación para la secuencia de pilina de Tipo IV se puede introducir entre los nucleótidos que codifican la cisteínas del dominio Ib de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica una porción del dominio Ib entre los restos que codifican cisteína se puede eliminar y sustituir con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos y que incluye un sitio de clonación PstI. Este ejemplo se describe detalladamente en la sección de Ejemplos. Alternativamente se puede eliminar una porción de mayor longitud del dominio Ib o todo el dominio Ib y sustituir con una secuencia de aminoácidos que incluya un sitio o sitios de clonación.

La construcción también se puede modificar mediante ingeniería genética para codificar una secuencia secretora en el extremo amino de la proteína. Tales construcciones son útiles para producir las proteínas quiméricas en células de mamífero. In vitro, tales construcciones simplifican el aislamiento de las proteínas quiméricas. In vivo, las construcciones son útiles como vacunas polinucleotídicas; las células que incorporan la construcción expresarán la proteína y secretarán la misma cuando puede interaccionar con el sistema inmune.

2. Identificación de Secuencias de Bucle de Pilina de Tipo IV

Los polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV se pueden identificar, preparar y manipular usando cualquiera de una diversidad de técnicas bien establecidas. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de pilina de Tipo IV de diversos microorganismos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, la Base de Datos de NCBI Nº de Acceso M14849 J02609 para cepa PAK de Pseudomonas; la Base de Datos NCBI Nº de Acceso AAC60462 para cepa T2A de Pseudomonas; la Base de Datos de NCBI Nº de Acceso M11323 para cepa PAO de Pseudomonas; la Base de Datos de NCBI Nº de Acceso P17837 para cepa CD de Pseudomonas; la Base de Datos de NCBI Nº B31105 para cepa P1 de Pseudomonas; la Base de Datos de NCBI Nº de Acceso Q53391 para cepa KB7 de Pseudomonas; la Base de Datos NCBI Nº de Acceso AAC60461 para la cepa 577B de Pseudomonas; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso A33105 para cepa K122-4 de Pseudomonas; Base de Datos NCBI números de acceso Z49820, Z69262 y Z69261 para N. meningitidis; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso X66144 y AF043648 para N. gonorrhoeae; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso U09807 y X64098 para V. cholerae; Base de Datos de NCBI Nº de Acceso AF154834 para Pasteurella multocida. Los facultativos pueden clonar e identificar otras secuencias de nucleótidos y aminoácidos de pilina de otros microorganismos usando diversas metodologías de clonación y de amplificación in vitro conocidas en la técnica. Por ejemplo, para clonar otras cepas de Pseudomonas de bucle de pilina de una genoteca, se pueden usar cebadores para la amplificación del extremo 5' altamente conservado del gen de pilina y el extremo 3' del gen adyacente (Nicotinato-nucleótido pirofosforilasa) en el genoma de Pseudomonas. Los cebadores de PCR ejemplares (enumerados en la dirección 5' a 3') para secuenciar los genes de pilina son del siguiente modo: pilATG (26 nc) GAGATATTCATGAAAGCTCAAAAAGG (SEC ID Nº: 28); y nadB4 (20 nc) ATCTCCATCGGCACCCTGAC (SEC ID Nº: 29); o nadBl (21 nc) TGGAAGTGGAAGTGGAGAACC (SEC ID Nº: 30).

A partir de estos polinucleótidos de pilina de Tipo IV, la porción que forma el bucle disulfuro intracadena C-terminal (es decir, el bucle de pilina de Tipo IV) se puede identificar visualmente de forma sencilla. Los ejemplos de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV se muestran como las SEC ID Nº: 3 a 20 en las anteriores Tablas 1-3. Cualquier nucleótido degenerado que codifique estos y otros aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV se puede usar para construir los polinucleótidos quiméricos de la invención. En algunas realizaciones, para facilitar la inserción de secuencia de bucle de pilina de Tipo IV en una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, los extremos 5' y/o 3' de la secuencia de nucleótidos de bucle de pilina de Tipo IV se pueden modificar para incorporar extremos cohesivos para sitios de clonación (por ejemplo, PstI).

Como se ha descrito anteriormente, típicamente, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se inserta en el dominio Ib, o puede sustituir parcialmente o completamente el dominio Ib de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. En algunas realizaciones, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede insertar en otras localizaciones adecuadas dentro de una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. Por ejemplo, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede insertar en otra localización de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica, que forma un bucle enlazado por disulfuro cisteína-cisteína, tales como los aminoácidos 265-287 del dominio II de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica. Otras localizaciones adecuadas para la inserción se pueden ensayar de forma sencilla usando los ensayos funcionales descritos en este documento. En algunas realizaciones, más de una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se puede insertar en polinucleótidos quiméricos de la invención (por ejemplo, una primera secuencia de bucle de pilina en el dominio Ib y una segunda secuencia de bucle de pilina en el dominio II).

3. Identificación de Dominio de Reconocimiento de Células

Los polinucleótidos que codifican diversos dominios de reconocimiento de células se conocen bien en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, en una realización, el dominio de reconocimiento células es el dominio Ia de PE, dirigiendo de este modo la proteína quimérica al dominio \alpha2-MR. En esta realización, el dominio de reconocimiento de células se puede incluir de forma sencilla en los polinucleótidos quiméricos usando la SEC ID Nº: 1 como se ha descrito anteriormente. En otras realizaciones, el dominio la se puede sustituir con ligandos que se unen a receptores de superficie celular o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos a receptores de superficie celular. Los ligandos adecuados y los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se han descrito anteriormente en la anterior sección IB. Las localizaciones adecuadas para la inserción del dominio de reconocimiento de células en proteínas quiméricas y polinucleótidos quiméricos también se han descrito anteriormente en la sección IB.

El dominio de reconocimiento de células se puede insertar o unir al resto de las proteínas quiméricas usando cualquier método adecuado. Por ejemplo, el dominio se puede unir al resto de la proteína quimérica directamente o indirectamente usando un enlazador. El enlazador puede formar enlaces covalentes o enlaces no covalentes de alta afinidad. Los enlazadores adecuados se conocen bien por los especialistas en la técnica. En otro ejemplo, el dominio de reconocimiento de células se expresa como un único polipéptido quimérico a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica la única proteína quimérica contigua.

B. Casetes y Vectores de Expresión

Las realizaciones de la invención también proporcionan casetes y vectores de expresión para expresar las presentes proteínas quiméricas. Los casetes de expresión son moléculas de polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias de control de la expresión unidas operativamente a un polinucleótido que codifica la proteína quimérica. Los vectores de expresión comprenden estos casetes de expresión además de otras secuencias necesarias para la replicación en células.

Los vectores de expresión se pueden adaptar para funcionar en procariotas o eucariotas por la inclusión de promotores, secuencias de replicación, marcadores apropiados, etc., para la transcripción y traducción del ARNm. La construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células transfectadas implica el uso de técnicas de clonación molecular también bien conocidas en la técnica. Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., (Current Protocols, una sociedad conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc.). Los promotores útiles para tales propósitos incluyen un promotor de metalotioneína, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de polIII de MRP, un promotor de MPSV constitutivo, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV temprano inmediato humano) y un promotor de CMV constitutivo. Un plásmido útil para terapia génica puede comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores de selección, regiones de identificación y otros genes.

Los vectores de expresión útiles en esta invención útil dependen de uso pretendido. Tales vectores de expresión tienen que contener señales de expresión y replicación compatibles con la célula hospedadora. Los vectores de expresión útiles para expresar las proteínas quiméricas incluyen vectores víricos tales como retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados, vectores plasmídicos, cósmidos y similares. Los vectores víricos y plasmídicos se prefieren para transfectar células de mamífero. El vector de expresión pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la expresión comprende el promotor de CMV, proporciona buenas tasas de transfección y expresión. Los vectores víricos adeno-asociados son útiles en métodos de terapia génica de esta invención.

Una diversidad de medios están disponibles para suministrar polinucleótidos a células, incluyendo, por ejemplo, captación directa de la molécula por una célula de solución, captación facilitada por lipofección (por ejemplo, liposomas o inmunoliposomas), transfección mediada por partículas y expresión intracelular por un casete de expresión que tiene una secuencia de control de la expresión unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor. Véase también Inouye et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.272.065; Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D. V. Goeddel, ed.) (1990) o M. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY, (1990). También se pueden usar plásmidos de expresión de ADN recombinantes para preparar los polinucleótidos de la invención para el suministro mediante medios diferentes de la terapia génica, aunque puede ser más económico preparar oligonucleótidos cortos mediante síntesis química in vitro.

La construcción también puede contener un marcador para simplificar el aislamiento de la proteína. Por ejemplo, se puede incorporar un marcador de polihistidina de, por ejemplo, seis restos de histidina, en el extremo amino terminal de la proteína. El marcador de polihistidina permite el aislamiento cómodo de la proteína en una única etapa mediante cromatografía de quelato con níquel.

C. Células Recombinantes

La invención también proporciona células recombinantes que comprenden un casete o vectores de expresión para la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína quimérica de esta invención. Las células hospedadoras se pueden seleccionar por altos niveles de expresión para purificar la proteína. Las células pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas. Las células eucariotas útiles incluyen células de levadura y de mamífero. La célula puede ser, por ejemplo, una célula recombinante en cultivo o una célula in vivo.

E. coli se ha usado de forma exitosa para producir las proteínas quiméricas de la presente invención. La proteína puede plegarse y se pueden formar enlaces disulfuro en esta célula.

D. Purificación y Preparación de Proteína Quimérica

Una vez que se expresa una proteína quimérica recombinante, se puede identificar mediante ensayos basados en las propiedades físicas o funcionales del producto, incluyendo el marcado radiactivo del producto seguido de análisis mediante electroforesis en gel, radioinmunoensayo, ELISA, bioensayos, etc.

Una vez que se ha identificado la proteína codificada, se puede aislar y purificar mediante métodos convencionales que incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento, intercambio iónico, afinidad y cromatografía de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Véase, de forma general, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990). Las condiciones reales usadas dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobicidad, hidrofilicidad, etc., y serán evidentes para los especialistas en la técnica.

Después de la expresión biológica o la purificación, las proteínas quiméricas pueden poseer una conformación sustancialmente diferente de las conformaciones nativas de las proteínas constituyentes. En este caso, es útil desnaturalizar y reducir la proteína quimérica y después provocar que la proteína se re-pliegue hasta la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar polipéptidos e inducir el re-plegamiento se conocen bien los especialistas en la técnica (véase Debinski et al., J. Biol. Chem. 268: 14065-14070 (1993); Kreitman & Pastan, Bioconjug. Chem. 4: 581-585 (1993), y Buchner et al., Anal. Biochem. 205: 263-270 (1992)). Debinski et al., por ejemplo, describen la desnaturalización y reducción de polipéptidos de cuerpos de inclusión en guanidina-DTE. Después, el polipéptido se re-pliega en un tampón redox que contiene glutatión oxidado y L-arginina.

E. Ensayo de Propiedades Funcionales de la Proteína Quimérica

Las propiedades funcionales de la proteína quimérica en su totalidad o cada componente de la misma se realizan usando diversos ensayos rutinarios. Por ejemplo, las proteínas quiméricas se ensayan en términos de reconocimiento de células, traslado al citosol, adhesión de pilina de Tipo IV y capacidad inmunógena. Se puede ensayar toda la proteína quimérica o se puede ensayar la función de diversos dominios sustituyendo dominios nativos de la exotoxina A de tipo silvestre por los mismos.

1. Unión a Receptor/Reconocimiento de Células

Para determinar si el dominio de unión a células presente en la proteína quimérica funciona de forma apropiada, se ensaya la capacidad de la proteína quimérica de unirse al receptor diana (aislado o sobre la superficie celular) usando diversos métodos conocidos en la técnica.

En un método, la unión de la proteína quimérica a una diana se realiza mediante cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la proteína quimérica se une a una matriz en una columna de afinidad y se detecta la unión del receptor a la matriz. Alternativamente, el receptor diana se une a una matriz en una columna de afinidad y se detecta la unión de la proteína quimérica a la matriz.

La unión de la proteína quimérica a receptores sobre células se puede ensayar, por ejemplo, marcando la proteína quimérica y detectando su unión a células, por ejemplo, mediante separación de células fluorescentes, auto-radiografía, etc.

En algunas realizaciones se puede usar la versión tóxica de proteínas quiméricas (que tiene actividad de ADP-ribosilación) para ensayar si el dominio de unión a células de las proteínas quiméricas se une a su receptor diana. Por ejemplo, la versión tóxica de proteínas quiméricas se puede incubar con células que expresan los receptores diana o células que no expresan los receptores diana y se pueden determinar los efectos citotóxicos de la versión tóxica de proteínas quiméricas (por ejemplo, midiendo la inhibición de incorporación de [^{3}H]leucina).

Si se han identificado los anticuerpos que se unen al ligando del cual se obtiene el dominio de reconocimiento de células, también son útiles para detectar la existencia del dominio de reconocimiento de células en la proteína quimérica mediante inmunoensayo o mediante ensayo de competición por el receptor afín.

En los anteriores métodos de ensayo, típicamente, una reacción específica o selectiva de la proteína quimérico con una diana será al menos dos veces la señal o interferencia de fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el
fondo.

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Estos métodos se describen de forma detallada, por ejemplo, en Kreitman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 8291-5 (1990); Siegall et al. Semin. Cancer Biol. 1: 345-50 (1990); Siegall et al. Cancer Res. 50: 7786-8 (1990); FitzGerald et al., J. Cell Biol. 126(6): 1533-41 (1995).

2. Traslado al Citosol

Para determinar si el dominio de traslado y el dominio de retención en RE de la proteína quimérica funcionan apropiadamente, se ensaya la capacidad de la proteína quimérica para obtener acceso al citosol.

a) Presencia en el Citosol

En un método, el acceso al citosol se determina detectando la presencia física de la proteína quimérica en el citosol. Por ejemplo, la proteína quimérica se puede marcar y la proteína quimérica se puede exponer a la célula. Después, la fracción citosólica se aísla y se determina la cantidad de marcador en la fracción. La detección del marcador en la fracción indica que la quimera ha obtenido acceso al citosol. Este resultado se puede comparar con un control, por ejemplo, interferencia o señal de fondo. Si el marcador detectable en la fracción citosólica es al menos dos veces la señal o interferencia del fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces el fondo, entonces, este resultado indica que la proteína quimérica ha obtenido acceso al citosol.

b) Actividad de ADP-Ribosilación

En otro método, la capacidad del dominio de traslado y del dominio de retención en RE para efectuar un traslado al citosol se puede ensayar con una construcción que contiene un dominio III que tiene actividad de ADP-ribosilación. En resumen, las células se siembran en placas de cultivo tisular y se exponen a la versión tóxica de la proteína quimérica que contiene la secuencia modificada del dominio de traslado o de retención en RE. La actividad de ADP-ribosilación se determina como una función de inhibición de síntesis de proteína, por ejemplo, controlando la incorporación de ^{3}H-leucina. Este método se describe adicionalmente con detalle en FitzGerald et al., J. Bio. Chem. 273: 9951-9958 (1998). La incorporación de ^{3}H-leucina en células expuestas a la versión tóxica de la proteína quimérica se puede comparar con la de un equivalente no tóxico o con interferencia de fondo. Si la incorporación de ^{3}H-leucina en células expuestas a la versión tóxica está reducida al menos dos veces, más típicamente más de 10 a 100 veces a la del equivalente no tóxico (o en comparación con la interferencia de fondo), entonces se puede decir que la proteína quimérica ha obtenido de forma apropiada acceso al citosol.

3. Adhesión de Bucle de Pilina de Tipo IV

Si la secuencia de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica tiene una estructura que está expuesta a un disolvente y tiene una conformación prácticamente nativa, la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica debe unirse, por ejemplo, a receptores de asialoGM1 u otros receptores sobre células epiteliales y también competir con microorganismos que expresan la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV para la unión a estos receptores. Por lo tanto, si la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV está funcionando de forma apropiada o no dentro de la proteína quimérica se ensaya midiendo su capacidad de adherirse a células epiteliales o su capacidad de bloquear la adherencia de microorganismos que expresan una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV (por ejemplo, P. aeruginosa) a células epiteliales. Estos ensayos se pueden diseñar fácilmente por el especialista en la técnica.

Como un ejemplo, si una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se obtiene de P. aeruginosa o Candida, se puede realizar un ensayo de adhesión con un sustrato recubierto con asialoGM1. Se pueden ensayar diversas concentraciones de la proteína quimérica que comprende la secuencia de pilina de Tipo IV para reactividad con asialoGM1 inmovilizada. Para determinar la especificidad de esta reactividad entre la proteína quimérica y asialoGM1 se puede realizar un ensayo de competición. Por ejemplo, se puede añadir asialoGM1 soluble para interferir en la unión de la proteína quimérica a asialoGM1 inmovilizada. Este método se describe con detalle en la sección de ejemplo IIB3. Este resultado de unión se puede comparar con un control (por ejemplo, la misma proteína quimérica sin el inserto de bucle de pilina o con un inserto de secuencia de bucle de pilina manipulado). Si la cantidad de unión de la proteína quimérica a asialoGM1 inmovilizada es al menos dos veces, típicamente aproximadamente de 10 a 100 veces superior a la del control, entonces se puede decir que el inserto de bucle de pilina en la proteína quimérica está funcionando de forma apropiada.

En otro ejemplo, se puede ensayar la capacidad de la proteína quimérica para bloquear la unión de microorganismos que expresan la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales. La selección de células epiteliales depende de qué microorganismo se obtiene la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica. Por ejemplo, si la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica se obtiene de V. cholerae, entonces se pueden usar células epiteliales intestinales en ensayos de unión. Si la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica se obtiene de N. gonorrhoeae, entonces se pueden usar células epiteliales del sistema genitourinario para ensayos de unión. Si la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica se obtiene de P. aeruginosa, entonces se pueden usar células epiteliales pulmonares para ensayos de unión.

Como una ilustración, diversas cepas de Pseudomonas aeruginosa que expresan pilina de Tipo IV se pueden añadir de forma diferente a la línea celular epitelial de pulmón humano A549, lo que dará como resultado la unión de Pseudomonas aeruginosa a estas células. Después se puede añadir la proteína quimérica. Si la secuencia de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica está presente en conformación prácticamente nativa, la proteína quimérica competiría con la unión a Pseudomonas aeruginosa y daría como resultado la reducción de la adherencia de Pseudomonas aeruginosa a las células epiteliales. Este método se describe con detalle en la sección de ejemplo III más adelante. El resultado de este ensayo de competición se puede comparar con el resultado obtenido con un control (por ejemplo, la misma proteína quimérica excepto que sin el inserto de bucle de pilina o la misma proteína quimérica con un inserto de secuencia de bucle de pilina manipulado). Si la proteína quimérica puede reducir la unión de Pseudomonas al menos dos veces o típicamente aproximadamente de 10 a 100 veces mejor que el control, entonces se puede decir que el inserto de bucle de pilina en la proteína quimérica está funcionando de forma apropiada.

4. Capacidad Inmunógena

Para determinar si la proteína quimérica conserva su capacidad inmunógena con respecto a ambas partes de la proteína quimérica (es decir, una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV y una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica), se ensayan las propiedades de los antisueros generados contra la proteína quimérica.

a) Capacidad Inmunógena de Secuencia de Pilina de Tipo IV

La capacidad inmunógena de una secuencia de pilina de Tipo IV dentro de la proteína quimérica se ensaya mediante un ensayo de adhesión usando los antisueros generados contra la proteína quimérica. Un animal, tal como un ratón o un conejo, se puede inmunizar con una composición que comprende la proteína quimérica como se describe más adelante en la sección de Ejemplo IVA. Los antisueros post-inmunización del animal se pueden obtener y preparar para determinar si los antisueros pueden inhibir la unión de microorganismos que expresan la secuencia de pilina de Tipo IV a las células epiteliales. Por ejemplo, se puede añadir Pseudomonas aeruginosa a las células epiteliales y se determina la cantidad de la unión de Pseudomonas a las células epiteliales. Después, se pueden añadir los antisueros post-inmunización a las células epiteliales para determinar si los antisueros reducen la unión de Pseudomonas aeruginosa a las células epiteliales. Este ensayo se describe con detalle en la sección de Ejemplo IVB. Si la secuencia de bucle de pilina dentro de la proteína quimérica está presente en conformación prácticamente nativa, entonces se espera que los antisueros generados contra la proteína quimérica (a una dilución adecuada, por ejemplo, 1:10 o 1:100) pueden reducir la unión de Pseudomonas al menos aproximadamente el 20%, típicamente al menos aproximadamente el 30%, más típicamente al menos aproximadamente el 50%.

b) Respuesta de Neutralización de Toxina

La capacidad inmunógena de una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica dentro de la proteína quimérica se ensaya usando antisueros generados contra la proteína quimérica. Específicamente, los antisueros post-inmunización se ensayan para su capacidad de neutralizar la citotoxicidad de exotoxina A de Pseudomonas. Por ejemplo, se puede ensayar la inhibición de síntesis de proteína de exotoxina A de Pseudomonas purificada en células eucariotas en cultivo. Cuando se añade exotoxina A de Pseudomonas a células eucariotas, reduce o evita la síntesis de proteína en células, provocando la citotoxicidad celular. Para determinar si los antisueros pueden reducir o inactivar la citotoxicidad celular de exotoxina A de Pseudomonas, la exotoxina A de Pseudomonas se puede incubar con antisueros que contienen anticuerpos dirigidos contra la proteína quimérica. Esta mezcla incubada se añade a células en cultivo. Después se puede medir el efecto de los antisueros sobre la síntesis de proteínas en las células (por ejemplo, controlando la incorporación de [^{3}H] leucina). Este ensayo se describe en la siguiente sección de Ejemplo IVC y también en Ogata et al., J. Biol. Chem. 265 (33): 20678-85 (1990). Si la secuencia de exotoxina A no tóxica dentro de la proteína quimérica está presente en conformación prácticamente nativa, entonces se espera que antisueros generados contra la proteína quimérica (a una dilución adecuada, por ejemplo, 1:10 o 1:100) pueden reducir la citotoxicidad de exotoxina A de Pseudomonas al menos aproximadamente el 30%, típicamente al menos aproximadamente el 50%, más típicamente al menos aproximadamente el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 99% en comparación con un control (por ejemplo, adición de exotoxina A de Pseudomonas purificada sin antisueros).

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III. Composiciones que comprenden proteínas o polinucleótidos quiméricos

La invención también proporciona formulaciones de una o más composiciones de polipéptido o polinucleótidos quiméricos descritas en este documento en soluciones farmacéuticamente aceptables para administración a una célula o un animal, solas o en combinación con otros componentes.

A. Composiciones que Comprenden Proteínas Quiméricas

La proteína quimérica de la invención se puede administrar directamente a un sujeto como una composición farmacéutica. La administración es mediante cualquiera de las vías usadas normalmente para introducir una proteína quimérica en contacto máximo con el tejido a tratar, preferiblemente la membrana de mucosa y células epiteliales. Las composiciones que comprenden proteínas quiméricas se administran de cualquier modo adecuado, preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables. Están disponibles métodos adecuados para administrar tales moduladores y se conocen bien por los especialistas en la técnica. Aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar a menudo una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas quiméricas de la invención se pueden formular de un modo convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de los polipéptidos hasta preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración seleccionada.

Los vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se está administrando, así como por el método particular usado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden formular para administración tópica, formulaciones sistémicas, inyecciones, administración por la mucosa, administración oral, administración por inhalación/nasal, administraciones rectal o vaginal. Se describen formulaciones adecuadas para diversos métodos de administración, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985.

En resumen, para administración tópica, las proteínas se pueden formular como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc. Las formulaciones sistémicas incluyen las diseñadas para administración mediante inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como las diseñadas para administración transdérmica, por la mucosa, oral o pulmonar. Para la inyección, las proteínas se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para administración por la mucosa, se usan penetrantes apropiados para la barrera a permear en la formulación. Para administración oral, una composición se puede formular de forma sencilla combinando las proteínas quiméricas con vehículos farmacéuticamente aceptables para permitir que las proteínas quiméricas se formulen como comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares. Para administración mediante inhalación, las proteínas quiméricas para el uso de acuerdo con la presente invención se suministran de forma cómoda en forma de un pulverizador de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Las proteínas también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Otras formulaciones y métodos de administración adecuados serán fácilmente evidentes para el especialista en la técnica y se pueden aplicar a la presente invención.

B. Composiciones que Comprenden Polinucleótidos Quiméricos

La invención también proporciona composiciones que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas (denominadas en ocasiones "ácidos nucleicos quiméricos" o "polinucleótidos quiméricos"). Estos ácidos nucleicos se pueden insertar en cualquiera de varios vectores bien conocidos para la transfección de células diana o tejidos de hospedador. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se suministran como plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico que forma complejos con un vehículo de suministro tal como un liposoma. Los sistemas de suministro de vector viral incluyen virus ADN y ARN, que tienen genomas episómicos o integrados después de suministro a la célula. Para una revisión de procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon , TIBTECH 11: 167-175 (1993), Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995), Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1): 31-44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).

Los métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípido: ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN mejorada por agente. Se describe la lipofección, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.049.386, la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.787; y la Patente de Estados Unidos Nº 4.897.355 y los reactivos para lipofección están disponibles en el mercado (por ejemplo, Transfectam^{TM} y Lipofectin^{TM}). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección con reconocimiento de receptor eficaz de polinucleótidos incluyen los de Felgner, documento WO 91/17424, documento WO 91/16024. El suministro puede ser a células (administración ex vivo) o tejidos diana (administración in vivo).

C. Vacunas

En algunas realizaciones preferidas de la presente invención se proporcionan vacunas. Las vacunas comprenderán generalmente una o más composiciones farmacéuticas, tales como las que se han discutido anteriormente, en combinación con un inmunoestimulante. Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que mejore o potencie una respuesta inmune (de anticuerpos y/o mediada por células) a un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galáctido poliláctico) y liposomas (en los que se incorpora el compuesto; véase, por ejemplo, Fullerton, Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877). La preparación de vacunas se describe generalmente, por ejemplo, en Powell & Newman, eds., Vaccine Design (la estrategia de subunidades y adyuvante) (1995). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos.

Se puede emplear cualquiera de una diversidad de inmunoestimulantes en las vacunas de esta invención. Por ejemplo, se puede incluir un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno contra catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, tal como lípido A. Los adyuvantes adecuados están disponibles en el mercado, por ejemplo, como Adyuvante Incompleto y Adyuvante Completo de Freund (Difco laboratories, Detroit, MI); Merck Adyuvante 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 y derivados del mismo (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); CWS, TDM, Leif, sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados, polisacáridos derivatizados cationicamente o anionicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. Las citoquinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7 o-12, también se pueden usar como adyuvantes.

Se puede emplear cualquier vehículo conocido en la técnica en las vacunas de la invención y el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las vacunas se pueden formular para cualquier modo de administración apropiado, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Estas formulaciones y los métodos de administración se han descrito anteriormente y no se repetirán en esta sección.

Las composiciones farmacéuticas y las vacunas de la presente invención se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o multi-dosis, tales como viales sellados. Tales recipientes están preferiblemente sellados herméticamente para conservar la esterilidad de la formulación hasta el uso. En general, las formulaciones se pueden almacenar como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Alternativamente, una composición farmacéutica o vacuna se puede almacenar en un estado secado por congelación que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

D. Dosis Eficaz

La determinación de una cantidad eficaz de la proteína quimérica para inducir una respuesta inmune en un sujeto está dentro de las habilidades de los especialistas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento.

Una dosis eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para conseguir una inducción de una respuesta inmune usando técnicas que se conocen bien en la técnica. El especialista en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en datos de animales. La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente. Por ejemplo, cuando se usan como una vacuna, los polipéptidos y/o los polinucleótidos de la invención se pueden administrar aproximadamente en 1 a 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente se administran 3 dosis, a intervalos de aproximadamente 3-4 meses y se pueden administrar vacunaciones de refuerzo periódicamente después de esto. Pueden ser apropiados protocolos alternativos para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o ADN que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de generar una respuesta inmune en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente contra infecciones por microorganismos que expresan la secuencia de pilina de Tipo IV durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido o ácido nucleico presente en una dosis (o producida in situ por el ADN en una dosis) varía de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 5 mg por kg de hospedador, típicamente de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg y preferiblemente de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 \mug. El intervalo de dosis adecuado variará con el tamaño del paciente, pero típicamente variará de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.

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IV. Métodos para suscitar una respuesta inmune

Las proteínas quiméricas de la invención son útiles para suscitar una respuesta inmune en un hospedador. La suscitación de una respuesta inmune humoral es útil para la producción de anticuerpos que reconocen específicamente la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV o la secuencia de exotoxina A no tóxica y en la inmunización contra microorganismos que llevan la secuencia de pilina de Tipo IV.

A. Tratamientos Profiláctico y Terapéutico

Las proteínas quiméricas pueden incluir las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV de diversos microorganismos patógenos, que incluyen Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, etc. En consecuencia, esta invención proporciona tratamientos profilácticos y terapéuticos para enfermedades que implican la actividad patológica de patógenos que llevan las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV. Los métodos implican inmunizar un sujeto con proteínas quiméricas basadas en exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que llevan la secuencia de pilina de Tipo IV. Las respuestas inmunes resultantes generan un ataque contra los patógenos, por sí mismas. Por ejemplo, si la patología se produce como resultado de infección bacteriana o por levaduras, el sistema inmune genera una respuesta contra los patógenos.

B. Respuesta Inmune Humoral

Las proteínas quiméricas son útiles para suscitar la producción de anticuerpos contra la secuencia de pilina de Tipo IV y la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica por un sujeto. Las proteínas quiméricas son inmunógenos atractivos para preparar anticuerpos contra las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV que tienen un origen natural dentro de un bucle cisteína-cisteína: debido a que contienen las secuencias de bucle de pilina de Tipo IV dentro de un bucle de cisteína-cisteína, presentan la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV al sistema inmune en una conformación prácticamente nativa. Los anticuerpos resultantes reconocen generalmente el antígeno nativo mejor que los generados contra versiones linealizadas de la secuencia de pilina de Tipo IV.

Los especialistas en la técnica conocen métodos para producir anticuerpos policlonales. En resumen, un inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado, un polipéptido acoplado a un vehículo apropiado (por ejemplo, GST, hemocianina de lapa californiana, etc.) o un polipéptido incorporado en un vector de inmunización, tal como un virus vaccinia recombinante (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 4.722.848) se mezcla con un adyuvante. Los animales se inmunizan con la mezcla. La respuesta inmune de un animal a la preparación con capacidad inmunógena se controla tomando muestras de sangre de ensayo y determinando el título de reactividad al polipéptido de interés. Cuando se obtienen de forma apropiada altos títulos de anticuerpo para el inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Si se desea, se realiza un fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer en anticuerpos reactivos al polipéptido. Véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY (1991); y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY (1989).

En diversas realizaciones, los anticuerpos producidos finalmente pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se exploran para la unión a polipéptidos que comprenden el epítopo o se exploran para actividad agonista o antagonista, por ejemplo, actividad mediada por el agente que comprende el epítopo no nativo. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores de mamífero, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentra, por ejemplo, en Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a ed.) Lange Medical Publication, Los Altos, CA, y las referencias citadas en ese documento; Harlow y Lane, anteriormente; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2a ed.) Academic Press, Nueva York, NY y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497.

En otra realización, los anticuerpos son inmunoglobulinas humanizadas. Se preparan anticuerpos humanizados uniendo las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de ADN recombinante. Véase Queen et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089.

En otra realización de la invención, se proporcionan los fragmentos de anticuerpos contra la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV. Típicamente, esos fragmentos muestran la unión específica a la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV similar a la de una inmunoglobulina completa. Los fragmentos de anticuerpos incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, Fab, Fab' F (ab')_{2} y Fv. Los fragmentos se producen mediante técnicas de ADN recombinante o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véase, Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); y Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989).

Una estrategia para aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión del mismo es mediante la exploración de una genoteca de ADN de células B humanas de acuerdo con el protocolo general indicado por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989) y clonando y amplificando después las secuencias que codifican el anticuerpo (o el fragmento de unión) de la especificidad deseada. El protocolo descrito por Huse se convierte en más eficaz en combinación con la tecnología de presentación en fagos. Véase, por ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty et al., documento WO 92/01047. La tecnología de presentación en fagos también se puede usar para generar mutaciones en regiones CDR de anticuerpos que se ha demostrado previamente que tienen afinidad por los polipéptidos de esta invención o sus ligandos. Se seleccionan anticuerpos que tienen afinidad de unión mejorada.

Los anticuerpos de esta invención son útiles para cromatografía de afinidad para aislar agentes que llevan la secuencia de pilina de Tipo IV. Las columnas se preparan, por ejemplo, con los anticuerpos unidos a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa, Sephadex o similares, donde se pasa un lisado celular a través de la columna, se lava y se trata con concentraciones crecientes de un desnaturalizante débil, mientras que se liberan agentes purificados.

Como se describe en la sección de Ejemplos, los sueros de conejos inmunizados tenían dos reactividades: una que bloquea la adhesión y una que neutraliza la exotoxina A. Por lo tanto, mediante la introducción de la proteína quimérica como una composición (por ejemplo, una vacuna) en un sujeto, se pueden proporcionar en el sujeto anticuerpos que evitan la colonización de microorganismos que llevan secuencias de pilina de Tipo IV (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa). En particular para Pseudomonas aeruginosa, si pequeños números de estas bacterias superan esa defensa, el poder destructivo normal de la exotoxina A también se neutralizará por los antisueros.

C. Respuesta Inmune Secretora Mediada por IgA

Las membranas de mucosas son vías de entrada principales para muchos patógenos infecciosos, incluyendo los que llevan las secuencias de pilina de Tipo IV. Las membranas de mucosa incluyen, por ejemplo, la boca, nariz, garganta, pulmón, vagina, recto y colon. Como una defensa contra la entrada, el cuerpo secreta IgA secretora sobre las superficies de membranas epiteliales de la mucosa contra los patógenos. Además, los antígenos presentados en una superficie de mucosa pueden desencadenar respuestas en otras superficies de mucosa debido al tránsito de células secretoras de anticuerpos entre estas mucosas. La estructura de IgA secretora se ha sugerido que es crucial para su permanencia sostenida y función eficaz en la superficie luminal de una mucosa. Como se usa en este documento, "IgA secretora" o "sIgA" se refiere a una molécula polimérica que comprende dos inmunoglobulinas de IgA unidas por una cadena J y unidas además a un componente secretor. Aunque la administración por la mucosa de antígenos puede generar una respuesta de IgG, la administración parenteral de inmunógenos produce en raras ocasiones fuertes respuestas de sIgA.

La exotoxina A de Pseudomonas se une a receptores sobre membranas de mucosa. Por lo tanto, las proteínas quiméricas que comprenden secuencias de exotoxina A no tóxica son un vector atractivo para llevar la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV hasta una superficie de mucosa. En ese lugar, las proteínas quiméricas suscitan una respuesta inmune mediada por IgA contra las proteínas quiméricas. En consecuencia, esta invención proporciona las proteínas quiméricas basadas en exotoxina A de Pseudomonas no tóxica que comprenden una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV de un patógeno que obtiene entrada a través de membranas de mucosa. El dominio de reconocimiento de células se puede dirigir a cualquier receptor de superficie de mucosa. Estas proteínas quiméricas son útiles para suscitar una respuesta inmune secretora mediada por IgA contra inmunógenos que obtienen entrada al cuerpo a través de superficies de mucosa. Las proteínas quiméricas usadas para este propósito deben tener ligandos que se unen a receptores sobre membranas de mucosa como sus dominios de reconocimiento de células. Por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico se une al receptor de factor de crecimiento epidérmico sobre superficies de mucosa. Las proteínas quiméricas se pueden aplicar sobre la superficie de mucosa mediante cualquiera de los medios típicos, que incluyen composiciones farmacéuticas en forma de líquidos o sólidos, por ejemplo, pulverizadores, pomadas, supositorios o polímeros degradables impregnados con el inmunógeno. La administración puede implicar aplicar el inmunógeno a una pluralidad de diferentes superficies de mucosa en una serie de inmunizaciones, por ejemplo, como inmunizaciones de refuerzo. Una inoculación de refuerzo también se puede administrar por vía parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea. La proteína quimérica se puede administrar en dosis de aproximadamente 1 \mug a 1000 \mug, por ejemplo, de aproximadamente 10 \mug a 100 \mug.

La respuesta de IgA es más intensa sobre superficies de mucosa expuestas al inmunógeno. Por lo tanto, en una realización, el inmunógeno se aplica a una superficie de mucosa que probablemente está en un sitio de exposición al patógeno particular. En consecuencia, dependiendo del sitio de exposición al patógeno particular, las proteínas quiméricas se pueden administrar al pulmón, la mucosa nasal, vaginal, anal o superficies de mucosa oral, o se pueden administrar como una medicación oral. Por ejemplo, para pacientes con fibrosis quística, las proteínas quiméricas se pueden administrar al pulmón.

La administración por mucosa de la proteína quimérica de esta invención da como resultado intensas respuestas de memoria, tanto para IgA como para IgG. Por lo tanto, en la vacunación con las mismas, es útil proporcionar dosis de refuerzo por vía de la mucosa o por vía parenteral. La respuesta de memoria se puede suscitar administrando una dosis de refuerzo más de un año después de la dosis inicial. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de refuerzo aproximadamente 12, aproximadamente 16, aproximadamente 20 o aproximadamente 24 meses después de la dosis inicial.

El valor potencial de una vacuna de Pseudomonas se refiere en parte a su capacidad de proteger individuos ampliamente contra las cepas que están presentes en el entorno. Basándose en la longitud del inserto de bucle de pilina, existen dos grupos agrupamientos para Ps. aeruginosa: un grupo con una secuencia de 12 aminoácidos y una con un inserto de 17 aminoácidos. Ambos bucles se unen aparentemente a asialo-GM1 y se considera que muestran estructuras similares. Reflejando esto, se señala que la proteína de vacuna, que contiene un bucle de 12 aminoácidos de la cepa PAK, fue capaz de generar anticuerpos que no solamente eran reactivos para cepas con el bucle más corto, sino también para la cepa SBI-N, que mostró el bucle más largo. Los estudios también han proporcionado datos de secuencia adicionales para pilina y secuencias de bucle de pilina. En este documento se describen dos secuencias de bucle de pilina (las para la cepa 1071 de Ps. aeruginosa y cepa SBI-N de Ps. aeruginosa) que no se habían introducido previamente en las bases de datos (Tablas 1 y 2).

La colonización pulmonar crónica por Ps. aeruginosa está asociada con un declive en el curso clínico de pacientes con CF. Frecuentemente, la terapia con antibióticos, incluso mediante suministro pulmonar, no consigue erradicar las infecciones por Ps. aeruginosa en estos pacientes (Steinkamp, G., B. et al. Pediatr Pulmonol 6 (2): 91-8 (1989)). Por tanto, el control de infecciones por Ps. aeruginosa, o incluso mejor, evitar las mismas, se ha convertido en una necesidad médica no cumplida crítica en el cuidado de pacientes con CF ((Bauernfeind, A. et al. Behring Inst. Mitt (98): 256-61 (1997)). Para abordar esto se han explorado varias estrategias vacunales, muchas centradas en constituyentes de membrana externa (Matthews-Greer, J. M, et al.; J Infect Dis 155 (6): 1282-91 (1987), Owen, P. Biochem Soc. Trans 20 (1): 1-6 (1992); Sawa, et al.; Nat Med 5 (4): 392-8 (1999), algunas en toxinas (Chen, T. Y., et al. J. Biomed Sci. 6 (5): 357-63 (1999), Denis-Mize, K. S., et al.; FEMS Immunol Med Microbiol 27 (2): 147-54 (2000); Gilleland, H. E., et al.; J Med Microbiol 38 (2): 79-86 (1993); Matsumoto, et al.; J Med Microbiol 47 (4): 303-8 (1988)) y algunas en una estrategia de combinación (Cryz, S. J., et al.; Antibiot Chemother 39: 249-55 (1987); Cryz, S. J., et al. Infect Immun 52 (1): 161-5 (1986); Cryz, S. J., et al.; Infect Immun 55 (7): 1547-51 (1987) y Cryz, S. J., et al. J Infect Dis 154 (4): 682-8 (1986) (Johansen, H. K., et al. APMIS 102 (7): 545-53 (1994).

Las composiciones de la presente invención en algunas realizaciones se usan para tratar personas que tienen riesgo de infección y, particularmente, infección por Pseudomonas aeruginosa. Estas personas incluyen, en particular, pacientes hospitalizados que tienen fibrosis quística, heridas por quemaduras, trasplantes de órganos, función inmune comprometida o adicción a drogas intravenosas.

Previamente se ha comparado la vía subcutánea con el suministro por mucosa de proteínas de bucle V3-toxina (Mrsny, R. et al., Vaccine 17 (11-12): 1425-33 (1999). Los resultados de la vacunación por mucosa han indicado que se podría conseguir una respuesta anti-bucle V3 más robusta con respuestas de títulos altos de anticuerpos tanto de IgG sérica como de IgA secretora. Debido a que la proteína quimérica de pilina-toxina es una vacuna candidata para evitar la colonización por Pseudomonas en CF, una realización proporciona una vacuna suministrada para dirigir las respuestas de anticuerpos de mucosa a epitelios de las vías respiratorias.

Ejemplos I. Construcción de plásmidos

Se construyeron cuatro plásmidos, pPE64, pPE64\Delta553, pPE64pil, pPE64\Delta553pil. El plásmido pPE64 codifica de forma nativa la exotoxina A de Pseudomonas, excepto que el plásmido codificaba una versión ligeramente menor de PE que carecía de gran parte del dominio Ib y tenía un nuevo sitio PstI en el dominio Ib como se describe con detalle más adelante. El plásmido pPE64\Delta553 codifica una versión no tóxica del plásmido pPE64, por lo que el plásmido pPE64 se modificó por subclonación para introducir el dominio III enzimáticamente inactivo de PE (es decir, Glu en la posición de aminoácido 553 está delecionado). Para generar una proteína quimérica de pilina basada en PE, se sintetizó un dúplex oligonucleotídico que codificaba los aminoácidos 129-142 de la cepa PAK de pilina. Después se construye el plásmido pPE64pil basándose en el plásmido pPE64, en el que se insertó una secuencia de bucle de pilina de la cepa PAK de P. aeruginosa en el sitio PstI del plásmido pPE64. Después se construye el plásmido pPE64pil basándose en el plásmido pPE64, en el que se insertó una secuencia de bucle de pilina de la cepa PAK de P. aeruginosa en el sitio PstI del plásmido pPE64. El plásmido pPE64\Delta553pil se construye basándose en el plásmido pPE64\Delta553, en el que se insertó una secuencia de bucle de pilina de la cepa PAK de P. aeruginosa en el sitio PstI del plásmido pPE64\Delta553. Todos estos vectores se construyeron sin ninguna secuencia de secreción bacteriana lo que permitió que se expresaran las proteínas recombinantes como cuerpos de inclusión.

Específicamente, los plásmidos pPE64 y pPE64\Delta553 se construyen del siguiente modo. El plásmido
pMOA1A2VK352 (Ogata et al., J. Biol. Chem. 267, 25396-401 (1992)), que codifica PE, se digirió con Sfi1 y ApaI (restos 1143 y 1275, respectivamente) y después se religó con un dúplex que contenía un nuevo sitio Pstl. La cadena codificante del dúplex tenía la siguiente secuencia: 5'-tggccctgac cctggccgcc gccgagagcg agcgcttcgt ccggcagggc accggcaacg acgaggccgg cgcggcaaac ctgcagggcc-3' (SEC ID Nº 31). El plásmido resultante codificaba una versión ligeramente menor de PE y carecía de gran parte del dominio Ib. Después, el sitio Pstl se usó para introducir dúplex que codifican secuencias de bucle de pilina flanqueadas por restos de cisteína. Para preparar proteínas no tóxicas, los vectores se modificaron mediante la subclonación en un dominio III enzimáticamente inactivo de pVC45\DeltaE553. Se necesitó una subclonación adicional, de pJH4 (Hwang et. al., Cell 48: 129-136 (1987)), para producir un vector que carecía de una secuencia señal. La construcción de los plásmidos pPE64 y pPE64\Delta553 también se describe en FitzGerald et al., J. Biol. Chem. 273 (16): 9951-8 (1998).

Los plásmidos pPE64pil y pPE64\Delta553pil con un inserto de secuencia de bucle de pilina se construyeron basándose en los plásmidos pPE64 y pPE64\Delta553, respectivamente. Un oligonucleótido con sentido de 54 pb con extremos cohesivos para PstI y que codifica el bucle de pilina de 12 aminoácidos de la cepa PAK, se híbrido con un oligonucleótido antisentido de 54 pb en Tris 10 mM/HCl, NaCl 50 mM pH 7,4. Los oligonucleótidos con sentido y antisentido tenían las siguientes secuencias: con sentido 5'-TTGTACTAGTGATCAGGATGAACAGTTTATTCCGAAAGGTTGTTCACG
TATGCA-3' (SEC ID Nº 32); antisentido 5'-TACGTGAACAACCTTTCGGAATAAACTGTTCATCCTGATCAC
TAGTACAATGCA-3' (SEC ID Nº 33). La hibridación se consiguió mediante el calentamiento a 94ºC durante 5 min seguido de enfriamiento a 25ºC a lo largo de un periodo de 40 min. Los plásmidos pPE64 y pPE64\Delta5532, que codifican PE enzimáticamente activa e inactiva respectivamente, se digirieron con PstI en el resto 1470. (FitzGerald, D. J. et al. J Biol Chem. 273 (16): 9951-8 (1998). La ligación con el oligodúplex de pilina fosforilado destruyó el sitio PstI e introdujo un único sitio SpeI. Se usó un producto de digestión doble con XhoI/SpeI para comprobar la orientación correcta del inserto. A la ligación del oligodúplex de pilina en el vector cortado con PstI siguieron por varias etapas de caracterización para confirmar la presencia del inserto de pilina en la orientación correcta. Las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de cadena doble didesoxi.

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II. Expresión y caracterización de proteínas A. Expresión y Purificación

Mediante el uso del sistema de expresión de T7 descrito por Studier et al., (Methods Enzymol. 185: 60-89 (1990)), se expresaron cuatro proteínas relacionadas con PE en E. coli. Éstas incluyeron PE64, PE64\Delta553, PE64pil y PE64\Delta553pil.

Las proteínas quiméricas se expresaron y aislaron como cuerpos de inclusión como se describe en Buchner et al., Anal. Biochem. 205 (2): 263-70 (1992). Cada proteína se expresó por separado y se purificó prácticamente hasta homogeneidad. En resumen, la cepa BL21 (\lambdaDE3) se transformó con plásmidos que alojaban un promotor de T7 cadena arriba del ATG inicial de los vectores de expresión de toxina. Los cultivos se desarrollaron en Superbroth (KD Medical, Bethesda, MD) con ampicilina (50 \mug/ml) y después se indujeron para expresión de proteína mediante la adición de IPTG (1 mM). Después de dos horas de cultivo adicional se recogieron células bacterianas mediante centrifugación. Después de la lisis celular, se recuperaron las proteínas expresadas en cuerpos de
inclusión.

Las proteínas se solubilizaron con Guanidina HCl (6,0 M), EDTA 2 mM pH 8,0 más ditioeritritol (65 mM). Después, las proteínas solubilizadas se replegaron mediante dilución en un tampón de redistribución redox (Buchner et al., Anal. Biochem. 205 (2): 263-70 (1992). Las proteínas replegadas se dializaron frente a Tris 20 mM, urea 100 mM pH 7,4, se adsorbieron sobre Q-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech), se lavaron con NaCl 150 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM pH 6,5 y se eluyeron con NaCl 280 mM, Tris 20 mM, EDTA 1 mM. Las proteínas eluídas se diluyeron 5 veces y después se adsorbieron sobre una columna MonoQ (HR 10/10, Amersham Pharmacia Biotech) y se purificaron adicionalmente mediante la aplicación de un gradiente lineal de sal (NaCl 0-0,4 M en Tris EDTA, pH 7,4). Las proteínas PE eluyeron entre NaCl 0,2 y 0,25 M. Se consiguió la purificación final usando una columna de filtración en gel (Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech) en PBS, pH 7,4.

B. Caracterización de Proteínas 1. Análisis de Transferencia de Western

El anticuerpo monoclonal de ratón PK99H y las proteínas de pilina purificadas se obtuvieron del Dr. Randall Irvin, Universidad de Alberta, Canadá. Los anticuerpos anti-IgG de ratón y anti-IgG de conejo se usaron para detectar anticuerpos primarios en transferencias de Western y ELISA (disponible en Jackson Immune Research Lab, West Grove, PA).

Las proteínas se analizaron inicialmente mediante SDS-PAGE (Figura 2 A). Se obtuvieron proteínas sustancialmente puras usando el esquema de purificación que se ha indicado anteriormente. En análisis de transferencia de Western, las proteínas PE64pil y PE64\Delta553pil reaccionaron con PK99H, un anticuerpo monoclonal para el bucle C-terminal de pilina (Figura 2 B). El mismo anticuerpo también reaccionó con preparaciones solubles de las mismas proteínas, indicando que el inserto de pilina se expuso sobre la superficie de la proteína quimérica pilina-PE. Las proteínas PE sin insertos no reaccionaron con el anticuerpo PK99H (Figura 2 B).

2. Ensayo de Citotoxicidad

Para investigar la influencia del inserto de pilina sobre la estructura y la función de la toxina se compararon las dos proteínas enzimáticamente activas, PE64 y PE64pil, en un ensayo de citotoxicidad. Se usaron los métodos de ensayo de citotoxicidad descritos en Ogata et al., J. Biol., Chem. 265 (33): 20678-85 (1990). Se añadieron concentraciones de PE64 o PE64pil que variaban de 0,002-20 ng/ml a células L929 para una incubación durante una noche. Después se determinó la citotoxicidad midiendo la inhibición de la síntesis de proteína celular (por ejemplo, controlando la incorporación de ^{3}H-leucina). Los datos indicaron que PE64 y PE64pil mostraron toxicidades similares con valores de CI_{50} en el intervalo de 0,1 ng/ml para ambas proteínas (Figura 3). Este resultado sugiere que el inserto de 14 aminoácidos no alteró de forma innecesaria la función de la toxina y, por deducción, la estructura de
toxina.

3. Reactividad con Asialo-GM1 Inmovilizada

Los resultados previos habían indicado que los péptidos sintéticos obtenidos del extremo C de pilina podrían bloquear la unión de pili a células epiteliales (Irvin et al. Infect. Immun. 57 (12): 3720-6 (1989), Yu, L. et al., Mol Microbiol 19 (5): 1107-16 (1996)). El bloqueo se atribuyó a la unión de péptido a asialo-GM1 sobre la superficie de células epiteliales. Para ensayar la funcionalidad del inserto de pilina en las proteínas PE64 se ensayaron diversas concentraciones de PE64pil para reactividad con asialo-GM1 inmovilizada.

Se recubrieron placas de 96 pocillos con asialo-GM1 o monosialo-GM1 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), que se había solubilizado en metanol. Se añadieron 100 \mul de solución de gangliósido (5 \mug/ml) a cada pocillo y se evaporó a 4ºC a sequedad. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon con gelatina de pescado PBS (BioFX, Randallstown, EEUU) durante 16 h a 4ºC. Las proteínas de ensayo en tampón de bloqueo se añadieron a diversas concentraciones. Después de la incubación durante una 1 h a 22ºC, se eliminó el sobrenadante y se detectó la proteína unida usando suero anti PE64\Delta553pil inactivado por calor (1:100) como el anticuerpo primario. Para estudios de competición, las proteínas a 0,2 \mug/ml se incubaron con 2 \mug/ml de asialo-GM1 o monosialo-GM1 durante 30 min a temperatura ambiente. Después se añadieron las muestras a placas recubiertas con asialo-GM1 como
anteriormente.

Concentraciones crecientes de PE64pil de 0,1-2,0 \mug/ml reaccionaron específicamente con asialo-GM1 inmovilizada (Figura 4A). Se usó PE64 como un control y mostró solamente un nivel bajo de unión (Figura 4A). Se realizaron estudios adicionales para confirmar la especificidad de gangliósido tanto de PE64pil como de PE64\Delta553pil. La asialo-GM1 soluble redujo la unión de PE64pil y PE64\Delta553pil a asialo-GM1 inmovilizada mientras que la adición de monosialo-GM1, no (Figuras 4B y 4C). Ningún gangliósido interfirió con el bajo nivel de unión de PE64 y PE64\Delta553 (Figuras 4B y 4C). Tomados en conjunto, estos datos confirmaron no solamente la presencia de secuencias de pilina reactiva, sino que mostraron una ganancia de función para las proteínas PE64pil.

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III. Ensayos de adhesión A. Cepas de Pseudomonas

Se usaron las siguientes cepas de Pseudomonas en ensayos de adhesión y otros ensayos: PAK, PAO1, SBN-1, 1071, M2, 82932, 82935 y 90063. Las cepas de Pseudomonas usadas para estudios de adherencia se cultivaron sobre agar LB y después en medio mínimo M9 (KD Medical, Bethesda, MD) suplementado con glucosa al 0,4% a 30ºC sin agitación. Se usaron de forma rutinaria cultivos en fase logarítmica tardía para ensayos de adhesión.

B. Cultivos Celulares

Se mantuvieron células A549 (ATCC, CCL-185), L929 (ATCC, CCL-1), WI 38, Vero y CHO en DMEM/F12 o RMPI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), glutamina 2,5 mM, Penicilina/Estreptomicina convencional (100 U/100 \mug/ml, GibcoBRL, Grand Island, EEUU) (denominado adicionalmente medio completo) en CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células se nutrieron cada 2 a 3 días y se realizaron pases cada 5 a 7 días. Para los ensayos, las células se sembraron en placas de 24 pocillos o de 96 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia.

C. Cuantificación de Adherencia Bacteriana

Para cuantificar la asociación de Pseudomonas con células A549, se siguió el ensayo de adhesión descrito por Chi et al. Infect. Immun. 59 (3): 822-8 (1991). En resumen, células A549 se cultivaron una placa de 24 pocillos (medio sin antibióticos), hasta una densidad de aproximadamente 2x10^{4} células por pocillo. Las células se lavaron tres veces en HBSS sin suero y se cubrieron con 0,5 ml de medio completo DMEM /F12 sin FBS. Se consiguió una MOI de 20 añadiendo 10 \mul de una dilución bacteriana apropiada. Las placas se incubaron durante 1 ó 2 h a 37ºC, CO_{2} al 5%.

Para retirar bacterias no unidas, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con HBSS. Después, las células se fijaron durante 1 h en paraformaldehído al 3,7%, HEPES 200 mM, pH 7,2. Las células se lavaron dos veces con solución salina y se tiñeron con Giemsa al 10% durante 10 min. Las muestras se lavaron tres veces con agua y se examinaron mediante microscopia óptica a un aumento de 400x. Las bacterias adherentes se cuantificaron recontando las bacterias asociadas con células de cien células A549.

D. Resultados

La adhesión mediada por pilina a células epiteliales permite que P. aeruginosa inicie una infección. Por lo tanto, los agentes que bloquean la adherencia reducen la carga bacteriana. Se sintetizaron los siguientes tres péptidos: un péptido C-terminal largo (péptido 1: acetil-KCTSDQDEQFIPKGCSK-NH_{2}; SEC ID Nº: 34) correspondiente a los aminoácidos 128-142 de la cepa PAK (este péptido se oxidó para permitir la formación de un enlace disulfuro), un péptido central (péptido 2: acetil-DEQFIPK-NH_{2}; SEC ID Nº: 35) correspondiente a los aminoácidos 134-140 y un péptido manipulado (péptido 3: acetil-QIDPEFK-NH_{2}; SEC ID Nº: 36) que tiene la misma composición de aminoácidos que el central pero en una secuencia mezclada. Para mejorar la estabilidad, los extremos N de estos péptidos sintéticos se acetilaron mientras que los extremos C se amidaron. Estos péptidos se sintetizaron por encargo por Sigma Genosys. Los mismos péptidos también se sintetizaron con un marcador de biotina.

Para ensayar estos péptidos funcionalmente se concibió un ensayo de adhesión por el que bacterias lavadas de la cepa PAK de P. aeruginosa se añadieron a la línea celular epitelial de pulmón humana, A549. Específicamente, los cultivos de células A549 confluentes se incubaron 60 min a 37ºC con péptido 1 40 \muM, péptido 2 40 \muM, péptido 3 420 \muM, 2 nmol/ml de proteína PAK-pilina, 2 nmol/ml de PE64, 2 nmol/ml de PE64\Delta553, 2 nmol/ml de PE64pil, 2 nmol/ml de PE64\Delta553pil y 4 nmol/ml de albúmina bovina. Una vez lavada con DMEM precalentado la cepa PAK de P. aeruginosa se añadió a una MOI de aproximadamente 50 en DMEM, FBS al 2%. Las bacterias se centrifugaron sobre las células (700 g, 5 min) y se incubaron 60 min, 37ºC, CO_{2} al 5%. La adherencia se determinó como se ha descrito anteriormente.

Los resultados fueron los siguientes. La adherencia a células A549 se redujo aproximadamente un 50% en presencia de 40 \muM de los péptidos de pilina largo o central (véase la Figura 5). El péptido manipulado no interfirió con la adherencia.

Debido a que las proteínas de PE-pilina mostraron actividad de unión a asialo-GM1, las mismas también se ensayaron. Aproximadamente a la misma concentración molar que los péptidos sintéticos, PE64pil y PE64\Delta553pil también bloquearon la adherencia bacteriana. Los efectos se debían a la presencia del inserto, debido a que las moléculas de toxina sin inserto no consiguieron competir por la adherencia.

IV. Respuesta inmune a PE64\Delta553pil A. Producción de Anticuerpos Policlonales

Para ensayar la capacidad de la proteína de pilina-toxina para generar respuestas de anticuerpos pertinentes, a cuatro conejos se inyectó la proteína PE64\Delta553pil. Dos conejos (numerados con 87 y 88) recibieron la proteína más adyuvante (completo de Freund para la primera inyección seguido de incompleto de Freund para inyecciones posteriores) y dos (numerados 89 y 90) recibieron la proteína sola. Se administraron doscientos microgramos de proteína por inyección por vía subcutánea durante un total de cuatro ciclos espaciados aproximadamente 2 semanas. Aproximadamente 12 ml de suero se aislaron quincenalmente de cada conejo. Los sueros se inactivaron por calor durante 20 min, 56ºC y se usaron diluciones de los mismos para ensayos sin purificación adicional. Se determinaron los títulos anti-pilina usando un ensayo ELISA en el que se inmovilizaron péptidos de pilina biotinilados sobre placas recubiertas con estreptavidina. A lo largo del periodo de inmunización, los títulos anti-pilina aumentaron en los cuatro animales (Figura 6). Sin embargo, la velocidad y el alcance de la respuesta fueron mayores en los dos conejos que recibieron antígeno más adyuvante. Para evitar la inactivación bacteriana mediada por complemento, los sueros inmunes se inactivaron por calor. Este tratamiento no alteró significativamente los títulos de anticuerpos en el ensayo ELISA (datos no mostrados).

B. Inhibición de Adhesión por Sueros Post Inmunización

Para evaluar la inhibición mediada por anticuerpos de la adherencia, se incubaron sueros de conejo anti-
PE64\Delta553pil a diluciones de 1:20 a 1:100 con 4x10^{5} bacterias a 22ºC durante 30 min. Después se centrifugaron las bacterias, se resuspendieron en DMEM sin suplementos y se añadieron a monocapas confluentes de células A549 a una MOI de 20 durante 1-2 h. La adherencia se determinó como se ha descrito anteriormente. Los sueros inmunes tomados después de la cuarta inyección se compararon con muestras tomadas antes de la inmunización de los mismos conejos.

1. Inhibición de P. aeruginosa (cepa PAK)

Los sueros tomados 2 semanas después de la última inyección se ensayaron para actividad de bloqueo en el ensayo de adherencia bacteriana. En comparación con las muestras extraídas antes de la inmunización, los sueros inmunes a diversas diluciones bloquearon la adherencia de la cepa PAK de Ps. aeruginosa (Figura 7A). La reducción de adherencia varió del 60% a una dilución de 1:100 al 90% a una dilución de 1:20. A una dilución de 1:20, la actividad de bloqueo se podía comparar sin tener en cuenta la presencia de adyuvante en la preparación de antígeno (Figura 7B).

2. Inhibición de P. aeruginosa (diversas cepas)

La inhibición de la adhesión de la cepa PAK confirmó que los conejos respondían a la secuencia de pilina específica que se administró en la vacuna. Sin embargo, debido a que el bucle C-terminal de pilina muestra considerable variación de secuencia, fue importante determinar la reactividad de los sueros inmunes para otras cepas de Ps. aeruginosa. Las cepas PAO1, 1071, SBI-N, 82935, 82932, 90063 1244 y M2 se ensayaron para adherencia a células A549 en condiciones similares a la cepa PAK. La unión celular específica de todas las cepas se redujo en adhesión cuando se mezclaron sueros de conejo inmunes inactivados por calor con bacterias a una dilución 1:20 (Figura 7C). La reducción en la adhesión entre las diferentes cepas estaba más o menos en el intervalo de la cepa PAK (aproximadamente el 90% de reducción).

Aunque era improbable que cualquiera de las anteriores cepas expresara la misma secuencia de bucle que la cepa PAK, fue de interés analizar variaciones en esta porción del gen de pilina. Las secuencias de pilina se determinaron generando clones de PCR de gen de pilina de cada cepa y secuenciando los mismos. Los cebadores para la amplificación fueron del extremo 5' del gen de pilina y el extremo 3' del gen adyacente (Nicotinato-nucleótido pirofosforilasa) en el genoma de Pseudomonas (a describir con más detalle en otro lugar). Los resultados mostraron lo siguiente: la mayoría de las cepas mostró un bucle de 12 aminoácidos, aunque una, SBI-N, tenía un bucle de 17 aminoácidos. Las cepas 82932 y 82935 tenían la misma secuencia de bucle que KB7 (Nº de acceso, Q53391) y 90063 tenía un bucle que coincidía con PAO1 (Nº de acceso A25023). Las cepas 1071 y SBI-N mostraron bucles con secuencias novedosas (Véase las Tablas 1 y 2). La cepa M2, un aislado de ratón, no se secuenció.

B. Respuesta Neutralizante de Toxina

La inhibición de la síntesis proteica de PE64 y PE64pil purificada en células eucariotas en cultivo se determinó como se describe en Ogata et al., J. Biol. Chem. 265 (33): 20678-85 (1990). Para inactivar la actividad citotóxica, las proteínas PE64pil se incubaron 30 min a 22ºC con sueros de conejo, que contenían anticuerpos anti-PE64\Delta553pil, antes se añadieron a células L929 o A549 en placas de cultivo tisular de 24 pocillos.

Los antisueros de conejo se evaluaron para actividad de neutralización de toxina. Los cuatro conejos inmunizados a una dilución 1:20 de sueros neutralizaron 1,0 \mug/ml de toxina completamente (Figura 8). A partir de estos resultados, se concluyó que la vacuna de pilina-PE puede generar anticuerpos con dos reactividades: una que bloquea la adhesión y una que neutraliza la exotoxina.

La presente invención proporciona materiales y métodos novedosos para proteínas quiméricas que comprenden una secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica y una de bucle de pilina de Tipo IV. Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la anterior descripción es ilustrativa y no restrictiva. Una cualquiera o más de las características de las realizaciones que se han descrito previamente se pueden combinar de cualquier modo con una o más características de cualquier otra realización en la presente invención. Además, muchas variaciones de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica después de la revisión de la memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invención no se debe determinar con referencia a la anterior descripción, sino que, sin embargo, se debe determinar con referencia a las reivindicaciones adjuntas.

SEC ID Nº: 1 La secuencia de nucleótidos de exotoxina A de Pseudomonas

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SEC ID Nº: 2 La secuencia de aminoácidos de exotoxina A de Pseudomonas

5

6

7

8

9

10

SEC ID Nº: 3 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa PAK)

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CTSDQDEQFIPKGC

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SEC ID Nº: 4 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa T2A)

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CTSTQDEMFIPKGC

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SEC ID Nº: 5 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa PAO, 90063)

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CKSTQDPMFTPKGC

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SEC ID Nº: 6 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa CD, PA103)

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CTSTQEEMFIPKGC

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SEC ID Nº: 7 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa K122-4)

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CTSNADNKYLPKTC

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SEC ID Nº: 8 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa KB7, 82932, 82935)

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CATTVDAKFRPNGC

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SEC ID Nº: 9 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa 1071)

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CESTQDPMFTPKGC

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SEC ID Nº: 10 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa 577B)

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CNITKTPTAWKPNYAPANC

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SEC ID Nº: 11 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa 1244, 9D2, P1)

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CKITKTPATAWKPNYAPANC

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SEC ID Nº: 12 Secuencia de bucle de pilina de Pseudomonas aeruginosa (cepa SBI-N)

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CGITGSPTNWICANYAPANC

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SEC ID Nº: 13 Secuencia de bucle de pilina de Neisseria meningitidis (Z49820)

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CGLPVARDDTDSATDVKADTTDNINTKHLPSTC

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SEC ID Nº: 14 Secuencia de bucle de pilina de Neisseria meningitidis (Z69262)

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CGQPVTRGAGNAGKADDVTKAGNDEKINTKHLPSTC

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SEC ID Nº: 15 Secuencia de bucle de pilina de Neisseria meningitidis (Z69261)

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CGQPVTRAKADADAAGKDTTNIDTKHLPSTC

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SEC ID Nº: 16 Secuencia de bucle de pilina de Neisseria gonorrhoeae (piIE; X66144)

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CGQPVTRTGDNDDTVADAKDGKEIDTKHLPSTC

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SEC ID Nº: 17 Secuencia de bucle de pilina de Neisseria gonorrhoeae (piIE; AF043648)

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CGQPVKRDAGAKTGADDVKADGNNGINTKHLPSTC

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SEC ID Nº: 18 Secuencia de bucle de pilina de Vibrio cholerae (U09807)

\hskip0.6cm

11

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SEC ID Nº: 19 Secuencia de bucle de pilina de Vibrio cholerae (X64098)

\hskip0.6cm

12

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SEC ID Nº: 20: Secuencia de bucle de pilina de Pasteurella multocida (AF154834)

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CNGGSEVFPAGFC

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SEC ID Nº: 21

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REDLK

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SEC ID Nº: 22

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REDL

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SEC ID Nº: 23

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KDEL

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SEC ID Nº: 24

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GGCCCATATGCACCTGATACCCCAT

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SEC ID Nº: 25

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GAATTCAGTTACTTCAGGTCCTCG

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SEC ID Nº: 26

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GGCCCATATGGAGGGCGGCAGCCTGGCC

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SEC ID Nº: 27

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GAATTCAGTTACTTCAGGTCCTCG

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SEC ID Nº: 28

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GAGATATTCATGAAAGCTCAAAAAGG

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SEC ID Nº: 29

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ATCTCCATCGGCACCCTGAC

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SEC ID Nº: 30

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TGGAAGTGGAAGTGGAGAACC

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Claims

1. Una proteína quimérica que comprende:

A): un dominio de traslado que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 desde la posición 280 a 344 o una variante activa de la misma que es suficiente para realizar el traslado de la proteína quimérica al citosol celular;

B): un dominio de retención en retículo endoplásmico que carece de actividad de ADP-ribosilación y se localiza en el extremo carboxi de la proteína quimérica y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22 o la SEC ID Nº: 23;

C): una secuencia de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV bacteriana o de levadura de entre 10 y 100 aminoácidos de longitud y localizada entre el dominio de traslado y el dominio de retención en retículo endoplásmico; caracterizada por que la proteína quimérica es capaz de reducir la adherencia de un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a células epiteliales y además, cuando se introduce un hospedador, la proteína quimérica es capaz de generar antisueros policlonales que reducen la adherencia del microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV a las células epiteliales.

2. La proteína quimérica de la reivindicación 1, donde la proteína quimérica comprende además un ligando polipeptídico para un receptor de superficie de célula epitelial.

3. La proteína quimérica de la reivindicación 2, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV comprende restos de cisteína tanto en los extremos N como C de la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV.

4. La proteína quimérica de la reivindicación 3, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV es de Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, Pasteurella multocida o Candida.

5. La proteína quimérica de la reivindicación 4, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV es de Pseudomonas aeruginosa.

6. La proteína quimérica de la reivindicación 5, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 4, la SEC ID Nº: 5, la SEC ID Nº: 6, la SEC ID Nº: 7, la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 10, la SEC ID Nº: 11 y la SEC ID Nº: 12.

7. La proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el dominio de traslado comprende los aminoácidos 280 a 364 de la SEC ID Nº 2.

8. La proteína quimérica de la reivindicación 7, en la que el dominio de traslado es el dominio II de la exotoxina A de Pseudomonas.

9. La proteína quimérica de la reivindicación 7, en la que el dominio de retención en retículo endoplásmico es el dominio III de exotoxina A de Pseudomonas excepto porque está delecionado el aminoácido Glu en la posición 553.

10. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en la que la proteína quimérica comprende más de una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV.

11. La proteína quimérica de la reivindicación 7, que comprende además un dominio de reconocimiento de células que es el dominio Ia de la exotoxina A de Pseudomonas.

12. La proteína quimérica de la reivindicación 7, que comprende un dominio de reconocimiento de células que se une al receptor de \alpha2-macroglobulina, receptor de factor de crecimiento epidérmico, receptor de transferrina, receptor de interleucina-2, receptor de interleucina-6, receptor de interleucina-8, receptor Fc, receptor poli-IgG, receptor de asialoglucoproteína, CD3, CD4, CD8, receptor de quimiocina; CD25, CD11B, CD11C, CD80, CM86, receptor de TNFalfa, receptor TOLL, receptor de M-CSF, receptor de GM-CSF, receptor limpiador, receptor de VEGF o receptor de citoquinas.

13. La proteína quimérica de la reivindicación 1, que comprende:

(a): dominio Ia, dominio II y un dominio III destoxificado de exotoxina A de Pseudomonas y

(b): una secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV se localiza entre el dominio II y el dominio III de la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica.

14. La proteína quimérica de la reivindicación 13, en la que la secuencia de exotoxina A de Pseudomonas no tóxica tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, con \DeltaE553.

15. La proteína quimérica de la reivindicación 13, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV es de Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, Pasteurella multocida o Candida.

16. La proteína quimérica de la reivindicación 13, en la que la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV es de Pseudomonas aeruginosa.

17. La proteína quimérica de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV bacteriana o de levadura tiene entre 12 y 20 aminoácidos de longitud.

18. La proteína quimérica de la reivindicación 17, en la que la secuencia de aminoácidos de bucle de pilina de Tipo IV es una secuencia bacteriana.

19. Un polinucleótido que codifica una proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19.

21. Una célula que comprende el casete de expresión de la reivindicación 20.

22. Una composición que comprende una proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y un vehículo farmacológicamente aceptable.

23. El uso de una proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de una composición para suscitar una respuesta inmune en un hospedador.

24. El uso de un casete de expresión de la reivindicación 20, en la fabricación de una composición para suscitar una respuesta inmune en un hospedador.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado por que la proteína quimérica, cuando se introduce en el hospedador, genera un antisuero policlonal que neutraliza la citotoxicidad de exotoxina A de Pseudomonas.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el hospedador es un ser humano.

27. El uso de una proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de un medicamento para tratar personas que tienen riesgo de infección por un microorganismo que expresa la secuencia de bucle de pilina de Tipo IV, en el que las personas son las que tienen fibrosis quística, una herida por quemadura, un trasplante de órganos, función inmune comprometida o una adicción a drogas intravenosas.

28. El uso de una proteína quimérica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de una vacuna.